JPS59225195A - インタ−ロイキン２の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−２（以下、、ＩＬ−２と略す。）は
、ヒト、ネズミ等のＴ細胞の産生ずる免疫伝達因子であ
シ、生体内で、ＴリンＡ？球の増′殖、キラーＴ細胞の
活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化等の作用を持ち
、抗腫湯薬、免疫不全症治療薬。

診断試薬等の応用が期待されている。

また、Ｔ細胞の組織培養全行う際、ＩＬ−２を添加する
ことによシ、長期継代培養が可能となることが知られて
いる。これらの理由により、ＩＬ−２の有用性は、広く
認識されている。

ヒ）ＩＬ−２は、例えばヒトの末梢血中のリンパ球、リ
ン・や腫細胞等の培養細胞を用いて産生さレルが、この
ようにして得られる粗ＩＬ−２は、一般に低濃度であｊ
ｏ、ＩＬ−２の他に多くの夾雑物を含んでいる為、特に
医薬としての実用に供する為には、ＩＬ−２を精製する
ことが不可欠といえる。

ヒ）ＩＬ−２の精製に関しては、これまでにいくつかの
報告がある。ガロらは、ヒト末梢血由来＋７）ＩＬ−２
ｉイオン交換クロマトグラフイー、グルろ過、　５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動によって精製し、精製度
８００倍、回収率０．８チという結果を得ている。（Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、　、　１２８　、１１２２（
１９８２））。

また〜オッベンハイムらは、フェニルセファローズクロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、）ｌ
Ａルろ過９等電点電気泳動によシ、ヒト末梢血由来のＩ
Ｌ−２を精製し、精製度６０倍、回収率１．９％という
結果を得ている（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　。

１２８．１６２０（１９８２））。これらの方法は、い
ずれも最終段階に電気泳動法を用いている為、火星の処
理には適さず、又、ＳＤＳやアンホライン等の除去が必
要であシ、回収率も極めて低い。一方、ムーブらは、イ
オン交換クロマトグラフィー、ダルろ過、及び、２種の
色素結合アガロースによるクロマトグラフィーによυ、
精製度３７０００倍、収率１９チという結果を得ている
が（Ｊ、ｅｘｐ、Ｍｅｄ、＋１５６．４５４（１９８２
））、最終精製物が純粋なＩＬ−２であるという根拠に
は乏しい。又、これらの報告では、精製を容易ならしめ
る為、ＩＬ−２産生に際しては、血清を用いておらず、
通常、細胞培養に用いられる濃度で血清を用いた場合の
精製効果には疑問が持たれる。

本発明者らは、ＩＬ−２就中、ヒトＩＬ−２の効率のよ
い鞘製法を確立すべく鋭意研究を行なった結果、アルキ
ル基、アロアルキル基或いはアリール基を結合基とする
化学結合型シリカダルを充填剤とする高速液体クロマト
グラフィーを用いると、極めて高純度なヒ）ＩＬ−２が
高回収率でしかも簡便な操作で得られ、また必要に応じ
て適宜な前処理としての粗鞘製法とも組合わせて使える
など、極めて有効な方法であることを見出し、本発明を
完成した。

本方法に用いるアルキル基、アロアルキル基或いはアリ
ール基金結合基とする化学結合型シリカゲルとしては、
シリカダルにオクタデシル・オクチル、ジメチル、ジフ
ェニル、アルキルニトリル。

シクロヘキシル、ブチル、プロピル、エチル、ジクロロ
フェニル、フェニルメチルなど結合基とするものが知ら
れている。また、担体であるシリカゲルは、ポアサイズ
が大きく、望ましくは３００Ｘ程度のものがよく、又、
置換されていないシラノール基が少ないものが望ましい
。このような条件を満すものとして、Ｕｌｔｒａｐｏｒ
ｅ　ＲＰＳＣ（ペックマン社）　、　Ｐｒｏｔｅｓｉｌ
　３００　Ｄｌｐｈｅｎｙｌ　（ワットマン社）。

Ｂｌｏ−８ｉｌ　ＲＰ　３０４　（バイオラッド社）等
が挙げられる。

本発明に供しうるヒ）ＩＬ−２の種類は、正常ヒト末梢
血Ｔ細胞等の正常Ｔ細胞やＩＬ−２産生能力を有するヒ
ト悪性化細胞ＡＴＣＣＣＲＬ　８１２９等のヒ）　Ｔ　
ＩＪンノ！腫細胞またはヒ）Ｔ白血病細胞、そのクロー
ン化（亜株化）細胞及び胸腺腫細胞の如きＴ細胞由来肺
癌細胞を用いたヒトＴ細胞由来の融合細胞株等、ヒ）Ｉ
Ｌ−２の産生細胞として知られるいずれの細胞由来のも
のでもよい。また、組換えＤＮＡ技法によって生産され
たものでもよい。

用いられる培地も、血清培地ちるいは無血清培地でもよ
い。

本方法は、単独で用いてもよいが、他の生体高分子着製
法、即ち、イオン交換クロマドグ２フイー、ダル濾過疎
水性クロマトグラフィー、多孔質がラスビーズによる吸
着クロマトグラフィー、金属キレート樹脂によるクロマ
トグラフィー等によって、あらかじめ粗精製されたＩＬ
−２を用いることによシ、よシ効率的かつ大量に、純粋
なＩＬ−２を得ることが出来る。

本発明による精製の詳細を以下に述べる。

まず、例えば、夾雑蛋白質を含む粗ヒ）ＩＬ−２溶液を
アルキル基、アロアルキル基、或いはアリール基を結合
基とする化学結合型シリカケ°ルを充填した高速液体ク
ロマトグラフィー用カラムに通液し、ＩＬ−２ｉ当該ク
リカダルに吸着させる。

このときの水溶液の一■はいずれでもよいが、化学結合
型シリカダルは一般に高いＰＨ領領域は不安定である為
、中性もしくはそれ以下とすることが望ましい。粗ヒ）
ＩＬ−２水溶液の液量はいずれでもよいが、含まれる総
蛋白質量は、あらかじめ測定したカラムの容量を越えて
はならない。

上記によシ吸着させたＩＬ−２は、ｐＨが中性以下の緩
衝液を通液することにより、カラムを洗浄した後に、緩
衝液中の有機溶媒の濃度を徐々に高めることによυ溶離
される。このとき、用いられる有機溶媒は、水と自由に
混じるものであればいずれでもよいが、例えば、１−プ
ロノｅノール、２−プロパノ〜ル、アセトニトリル等が
用いられる。

溶離に際し、有機溶媒の濃度を徐々に高めると同時に、
緩衝液中の塩濃度を徐々に下げることによシ１ヒ）ＩＬ
−２の溶離の効率、従って、回収率をよシ上昇させるこ
とが出来る。これは、塩濃度を下げることによシ、ヒト
Ｉ　Ｌ−，２と樹脂との疎水的吸着が弱められたことに
よるものと思われる。

ヒ）ＩＬ−２は溶離液をそのまま或いは必要に応じて透
析等の通常の脱塩操作を施した後に、凍結乾燥すること
により活性を損うことなく回収することが出来る。

このようにして得られたヒ）ＩＬ−２の例では、後記実
施例に示すように、蛋白質１　ｍ９あたシ５×１０７ユ
ニツト前後の活性を示した。

なお、ＩＬ−２活性の測定は、以下のごとくに行なう。

検体１００μｔを９６穴マイクロクイタープレートの１
列目に入れ、５ｑ６ＦＢＳを含有するダルベツコ変法イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ　）で２倍希釈を繰り返して９６
八マイクロプレート上において各１００μｔの希釈系列
を作成する。そこにギリスら（ネーチャー　（Ｎａｔｕ
ｒｅ　）　２６８巻１５４頁（１９７７））によって教
示された方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株：４
ｘｘｏｓ個／１００μｔの細胞密度とし、１００μを充
容くぼみに添加する。３７℃、５チ炭酸ガスインキユベ
一ター中２０時間培養後、トリチウムチミジン０．５μ
Ｃｌヲ加え、４時間パルスをおこなった後、この分野で
良く知られた方法に従って細胞をハーベストし、細胞内
に取シ込まれた放射線量を測定する。ＩＬ−２活性の高
い培養上清はど活性化Ｔリンフや球内に取シ込まれるト
リチウムチミジン量が多いことがら培養上清中のＩＬ−
２産生量を容易に知ることが出来る。

この場合、ｃｏｎＡ刺激ラットう臓細胞培養液（肺細胞
ｌＸ１０ａ個／７ｎｔＳＣｏｎ　Ａ　５ｔｔｌ／／ｍｌ
添加４８時間培養）中の核ＩＬ−２産生量を１単位／ｍ
ｌと規定し、相対値よシ活性単位を算出する。（ギリス
らジャーナル・オブ・イムノロジ＝（Ｊ・Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、）１２０巻２０２７頁（１９７８）参照）。

上の値は、従来、報告されているいずれの活性値よシも
高い。また、得られたヒ）ＩＬ−２は、５ＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動で単一のバンドを示し、ダンシル
法にょるＮ末端残基の分析の結果、単一のアミノ酸が検
出されるのみであった。

以上の理由から、本発明の方法にょシ得られるヒ）ＩＬ
−２は、極めて高純度なものであると考えてよい。

本発明方法は、池の方法に比較して、極めて精製効率が
高い為、ヒ）ＩＬ−２の産生に際して除去が困難である
とされている血清由来の蛋白質が存在しても問題にはな
らない。また、特別な添加物を用いないため、得られた
ヒ）ＩＬ−２は、広い用途に用いることが可能であシ、
又、溶離に際して揮発性の緩衝液を用いれば、ヒ）ＩＬ
−２を溶離後、凍結乾燥等の操作によ多塩類等の夾雑物
を全く含まないヒ）ＩＬ−２標品が得られる。

実施例１ 牛胎児血清１％を含むＲＰＭＩ培地中でＡＴＣＣＣＲＬ
８１２９細胞（ヒトＴリンフ４球白血病細胞）をコンカ
ナバリンＡで刺激することによってヒトＩＬ−，２を産
生させて得た培養上清２ｙ（総蛋白質量９６０μ、！９
１　ＩＬ−２活性１，６００ユニツト、比活性１、７　
Ｘ　１０３ｕ／ｎ＋９　）を日立６３８−３０高速液体
クロマトグラフィー装置（日立製作新製）′ｆ：用いて
、あらかじめｐＨ４，Ｏの０．５Ｍ酢酸−トリエチルア
ミン緩衝液で平衡化したＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣ
を充填した高速液体クロマトグラフィー用カラム（４，
６ｗ径Ｘ　７５　ｍｍ、　Ｂｅｃｋｍａｍ社製）に０．
５　ｍ／！／ｍｉｎの流速で通液した。

上記の緩衝液（以下、Ａとする。）で引き続き、１０分
間洗浄した後、Ｂ　□％Ｖ／Ｖ　１−プロパツール水溶
液（以下、Ｂとする。）を用いて、Ｂの割合を毎分１．
２５　％づつ上昇させながら、８０分間グラジェント溶
出を行なった。なお、この方法によれば溶離液中の１−
プロ・七ノール含量は毎分１チづつ上昇し、酢酸−トリ
エチルアミン濃度は毎分６．２５ｒｎＪｉ’Ｉづつ減少
する。

ＩＬ−２活性は、Ｂの含量が約６０俤となったところで
溶出され、回収率は定量的であった。また）このときの
蛋白質量は検出限界以下であった。

得られたＩＬ−２画分を凍結乾燥して他の夾雑物を含ま
ないヒトＩＬ−２を得た。

実施例２ 実施例１と同様にして得た培養上清１２ｔに固型硫安を
加え、７０チ飽和とし、−夜静置後遠心分離によシ沈澱
を集めた。分離した沈澱ｅｐｌ（が７．７であ、？、０
．２Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍトリスヒドロキ
シアミンメタン−塩酸緩衝液４００ｍ１に溶解し、多孔
質ガラスピーズ（ＣＰＧ　−１０、孔径３５０Ｘ、１２
０−２００メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ　−Ｎｕｃｌｅｏ
ｎｉｃｓ社製）８４ＦＩｌｌ’ｅ充填した力２ム（３２
ｍ径×１１０ｔｎＭ）に通液し、ヒトＩＬ−２を吸着さ
せた。なお、上記樹脂はあらかじめ上記の緩衝液で平衡
化しておいた。その後ｐＨ７，７の０．１　Ｍ　）リス
ヒドロキシメタン−塩酸緩衝液２００ｍ１で洗浄し、ｐ
Ｈ７，７テあシ、０．７５ＭのＦ−オシアン酸カリウム
金含む６．１　Ｍ）リスヒドロキシアミノメタン−塩酸
緩衝液２５０ｍ１で吸ＮＩＬ−２を溶離させた。

得られたヒ）ＩＬ−２溶′離液２００　Ｔｌｅに飽和硫
安水溶液６００ｍ１を加え、−夜靜置後、生じた沈澱を
遠心分離によって集め、ｐｔｔ５．Ｑの０．０７Ｍ酢酸
−酢酸す）　ＩＪウム緩衝液８４ｍ１に溶解し、同じ緩
衝液に対して４８時間透析を行なった。透析中に生じた
沈＃を遠心分離によシ除去した後、同じ緩衝液で平衡化
したＣＭ−セファデックスＣ−２５フアルマシア社製）
６９ｍｌを充填したカラム（２２祁径Ｘ　８　ｃｍ　）
に通液し、ヒ）ＩＬ−２を吸着させた。引き続き同じ緩
衝液１２０ｍ１で洗浄後、−Ｉ６．０の０．５Ｍ酢酸−
酢酸ナトリウム緩衝液２００―で吸着ＩＬ−２を溶離さ
せた。

得られた溶離′ｔｉ、１５０　ｍｌに固型硫安を加えて
８０俤飽和とし、−夜靜置後、遠心分離によって生じた
沈澱を集め、ｐＨ７，０であシ、１．２５Ｍの塩化ナト
リウムを含む０．０５　Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩
衝液６　ｍｌに溶解し、同じ緩衝液によって平衡化Ｌ　
ｆｃセファデックスＧ−７５スーパーフアイン（ファル
マシア社製）７００ｍｌを用いてグル濾過（３２ｆｉ径
Ｘ　９０　ｃｍ　）　を行なった。ヒトＩＬ−２は、分
子量１５，０００〜２０，０００ダルトンに、単一の活
性ピークとして溶出された。ＩＬ−２含有画分は、ａｏ
ｍｌであった。

ダル済過によシ得られたヒ）ＩＬ−２画分１　ｍｌ（総
蛋白質量１４０μＥｌ、Ｉｔ、−２活性９．５Ｘ１０４
Ｕ　）比活性６．８Ｘ１０’ｕＡｖを実施例１における
と同じ高速液体クロマトグラフィー装置、同じ緩衝液で
平衡化した同じシリカゲルを充填した同じ高速液体クロ
マトグラフィー用充填カラムに同じ流速で通液した後、
上記緩衝液とｓ　ｏ　ｔｓ　ｖ、／’Ｖ　１−グロパノ
ール水溶液を用いて、図１に示した条件で１−プロパツ
ール濃度を上げると同時にトリエチルアミン−酢酸塩濃
度を下げながらグラジェント溶出を行なった。図−１に
おいて横軸は試料通液開始からの時間（分）を示し、左
縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度、右縦軸は、溶媒Ｂの
割合（ｑ６）？。

示す。なお、蛋白質の検出は、日立６３８−４１波長可
変型紫外吸光度モニター（日立製作新製）を用い、２８
０ｎｍにおける吸光度測定によった。

図１に示したように、ヒ）ＩＬ−２は単一のピークとし
て溶離され、回収率は定量的であった。

ここに得られたＩＬ−２は蛋白質ＩＩｎｙ当、９５ｘ１
０７ユニツトの活性を示し、培養上清からの比較では約
３０，０００倍、グル濾過後のＩＬ−２画分（６，８Ｘ
　１０’　ｕ／ｍ９　）からの比較では約７４倍の精製
度の向上が見られた。

また、１２．５％の均一ポリアクリルアミドグルを用い
た５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ファルマシア
製、ＧＥ−４１１）では、分子量約１７，０００ダルト
ンに単一のバンドとして検出された。

実施例３ 実施例２において得られたケ゛ル濾過によって得られた
ヒトＩＬ−２画分２７ｍ１にグルコースを最終濃度ＩＭ
となるように加え、ＰＩ（７，０であシ、１、２５　Ｍ
の塩化ナトリウム及び１Ｍグルコースを含む０．０５Ｍ
リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡化し
たフェニルセファローズＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）
　４　ｍｌ　ｆ：充標したカラム（８ｍ径×５ｍ）にそ
れを通液し、ヒトＩＬ−２を吸着させた。その後、同じ
緩衝液１０　ｎｔｌでカラムを洗浄し、３０ｍ１のＰＨ
７，０であシ、０，１Ｍ塩化ナトリウム及び１Ｍグルコ
ースを含む０．０５Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液
で溶離した。

得られたヒ）ＩＬ−２溶離液２７ｍ１のうち、１ｍ１（
総蛋白質量５０μ、ＦＸ　ＩＬ−２活性９．８Ｘ１０４
ｕ　１比活ａ　２．　ＯＸ　１０’　ｕ／１１１７　）
を、実施例２に示したものと同様の方法で、Ｕｌｔｒａ
ｐｏｒｅ　ＲＰＳＣを充填した高速液体クロマドグ２フ
イー用充填カラムを用いて精製全行なった。

図２に示したようにヒ）ＩＬ−２は単一のピークとして
溶離され、回収率は定量的でおった。ここに得られたＩ
Ｌ−２は蛋白質１ｍｇ尚シ５Ｘ１０７ユニツトの活性全
庁し、培養上清からの比較では約３０，０００倍、フェ
ニルセファロースカラムからの溶離液（２，０Ｘ　１０
’　ｕ／ｍ９）からの比較では約２５倍の精製度の向上
が見られた。

また、実施例２に示したものと同一のＳＤＳ　−ｓｒリ
アクリルアミド電気泳動により、単一のノ々ンドを示し
た。

実施例４ 実施例３　Ｋ　記したフェニルセファロースカラムから
のヒ）ＩＬ−２溶離散２５麻に尿素を最終濃度ＩＭとな
るように加え、ｐｉ（７，０でちり、ＩＭのグルコース
及びＩＭの尿素を含む０．０５ＭＩＪン酸−リン酸ナト
リウム緩衝液であらかじめ平衡化した銅キレート樹脂１
．□　ｍｌを充填したカラム（５咽径Ｘ　２　ｃｍ　）
に通液して、ヒ）ＩＬ−２を吸着させた。なお、銅キレ
ート樹脂は、ポーラスらの方法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎ　２
５８．５９８（１９７５）に従って調製した。同じ緩衝
液５ゴで洗浄した後、Ｐ＋ｉ　２．８でおシ、１Ｍグル
コース及び、１Ｍ尿素を含む０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ム−塩酸緩衝液６　ｍｌでヒ）ＩＬ−２′ｆ：溶離した
。

得られたヒトＩＬ−２溶離液５　ｍｌのうちＱ、　ｌ　
ｍｉ（総蛋白量１２μ９、ＩＬ−２活性５ｘｌＯ’ｕｓ
比活性３．８　Ｘ　１０’　ｕ／Ｉｔｊｇ　）　？：実
施例２に示したものと同様の方法で、Ｕｌｔｒａｐｏｒ
ｅ　ＲＰＳＣを充填した高速液体クロマトグラフィー用
充填カラムを用いて精製を行なった。

図３に示したように、ヒ）ＩＬ−２は単一のピークとし
て溶離され、回収率は定量的であった。

ここに得られたＩＬ−２は蛋白’ｊｔ　１　ｍｙ当Ｄ５
ｘｌ□ｙユニットの活性を示し、培養上清からの比較で
は約３ｏ、ｏｏｏ倍、銅キレートカラムからの溶Ｆ４ｉ
ｆｆｌ液（３，８Ｘ　１０”　ｕ、Ａｎ９）からの比較
では約１３倍の精製度の向上が見られたー 得られたヒトＩＬ−２は５ＤＳ−ポリアクリルアミドダ
ル電気泳動で単一のバンドを示し、常法に従ってダンシ
ル法によるＮ末端残基の分析を行なった結果Ｎ末端アミ
ノ酸として、アラニンのみが検出された。また、ウニイ
ナーらの方法（Ｊ−ｎｌｏｘ、Ｃｈｅｍ、２４７　３２
４２（１９７２乃に従って、ダンシル−エドマン法によ
シ、Ｎ末端領域のアミノ酸配列を調べた結果、Ｎ末端よ
シＡｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−５ｅｒ−の配列を持
つことが判った。

実施例５ 実施例２の操作′！１−Ｕｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣ
の代シに、Ｐｒｏｔｅｓｌｌ　３００　Ｄｉｐｌｘｅｎ
ｙｌ　　（１０μｍ、４．６ｍｍ径Ｘ　２５０Ｗｒｍ％
ワットマン社製）を用いて行なった。

その結果、ヒ）ＩＬ−２活性は図４に示したように溶媒
Ｂの割合が８０チ付近で溶出され、工り一２活性回収率
は、ｔｌは定量的であった。また得られたＩＬ−２の比
活性は、約５　Ｘ　１０７ｕ／ｍ９であり、高速液体ク
ロマトグラフ（−に供する前に比べ約１２５倍の精製度
の向上が見られた。

実施例６ 実施例２の操作をＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣの代り
にＵｎｌｓｉｌ　Ｑ　ＰＨ（１０μｍ１４．６−径Ｘ２
５０ｍｍ、ガスクロ工業社製）を用いて行なった。

その結果、ヒ）ＩＬ−２活性は１−ゾロパ／　−ル濃度
７０％付近で溶出され、ＩＬ−２活性回収率は約５０％
であった。また得られたＩＬ−２の比活性は約１×１０
７ｕ／ｍ９であシ、高速液体クロマトグラフィーに供す
る前に比べ約２５倍の精製度の向上が見られた。

実施例７ 実施例２の操作を、Ｕｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣの代
りに、Ｕｎｉｓｉｌ　Ｑ　ＣＮ　（１０μｍ１４．６ｍ
ｍ径Ｘ２５０ｗｎ、ガスクロ工業社製）を用いて行なっ
た。

その結果、ヒ）ＩＬ−２活性は１−グロパノール濃度４
５％付近で溶出され、ＩＬ−２活性回収率は約８０％で
あった。また、得られたＩＬ−２の比活性は約５Ｘ１０
’ｕ／）ψであシ、高速液体クロマトグラフィーに供す
る前に比べ約８倍の精製度の上昇が見られた。

実施例８ 遺伝子組み換え法によって構築されたプラスミへゴｊ＞
ｃｙ　Ｉ　ｌ ドを有する大腸菌エシェリヒア・コリ口＝３（ＦＥＲＭ
　−ＢＰ　２４７　）を２５μｇ２んアンピシリンおよ
び２５μ９２況ストレプトマイシンを含有する１ｔのＬ
培地（１００μ！！２血のジアミノピメリン酸、５０μ
Ｖ−のチミジン、１チドリブトフアン、０．５ｑ６酵母
エキス、０．５　ｆｒ　ＮａＣ２および０．１％のグル
コースを含む）に接種し培養した。６５０　ｎｚｌの０
．Ｄ、が約０．５に達した時イソプロピル−β−ローチ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ　）を１ｍＭの濃度で
加え、１時間後に菌体を集め３０　ｍＭ　ＮａＣＬを含
む２０ｍＭ）リス　塩酸（ｐ”　７．５　）で洗浄し、
同じ緩衝液３６ｍｔ中に再び懸濁した。次に１ｏ　ｍｇ
／ｍｌのリゾチーム溶液４ｍ１１更に０．５　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ　（ｐＨ８，０）のＱ、　４　ｍｌを添加ののち、
０℃にて２０分間放置し、引き続き一５０℃と３７℃で
の凍結融解を３回行うことによ、ＤＩＬ−２を菌体から
抽出し、３０．Ｑ　００　ｒｐｍ３０分間の超遠心分離
を行って菌体抽出液を得た。

得られた菌体抽出液のうち３９　ｍｅ　（総蛋白量２４
０　ｍ？、ＩＬ−２活性８　ｘ　１０’　ｕ１ｍｃ比活
性１ｔ１０’　ｕ／ｍｌ　）　”ｔ　ｐＨ７，７，０，
２Ｍｏ塩化す）　ＩＪ　ラムｆ含ｂ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　）　
ＩＪスヒドロキシアミノメタンー塩酸緩衝液であらかじ
め平衡化した多孔質ガラスピーズ（ＣＰＧ　−１０、孔
径３５０Ｘ、１２０−２００メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
　−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ社３１）５ｍｌｆ充填した力
ジム（１０＋ｎｍ径×６５調）に通液し、ヒトＩＬ−２
を吸着させた〇 その後、上記の緩衝液１０ｍ１で洗浄しＰｔ＋　７．７
．０．７５Ｍのチオシアン酸カリウムを含む０，１μト
リスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝液２０ｍ１で吸
着ＩＬ−２を溶離させた。

得られたＩＬ−２溶離液１５ｍ４を、ｐＨ６，０の０．
０７Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に対して４８時間透
析を行なった後同じ緩衝液であらかじめ平衡化したＣＭ
−セフアゾ、リスＣ−２５（ファルマシア社製）４ｍＡ
！を充填したカラム（１０ｖｎ径ｘ４０ｍ＋）に通液し
、ＩＬ−２を吸着させた。

引き続き、同じ緩衝液１０ｍ１で洗浄後、ｐｌＩ　６．
０の０．５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液１０ｒｎｌで
吸着ＩＬ−２を溶離させた。

得られた溶離液Ｂｖｔｉに固型硫安を加えて８０％飽和
とし、−夜静置後、遠心分離によって生じた沈澱を集め
、ｐ）Ｉ　７．　Ｏであシ、１．２５　Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む０．０５Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液
２ｍｌに溶解し、同じ緩衝液によって平衡化したセファ
デックスＧ−７５スーツ’？−ファイン（ファルマシア
社製）１００ｍＪを用いてグルシ過（１６胴径Ｘ　５０
　ｃｍ　）を行なった。ＩＬ−２は分子量１３，０００
〜１６，０００ダルトンに単一の活性ピークとして溶出
された。

得られたＩＬ−２画分８ｍ１（総蛋白量７２０μｙ１１
Ｌ−２活性１．７５ｘ１０＋１ユニツト、比活性２．４
Ｘ１０’ｕ％？）のうち０．５　ｍ＃を、実施例２に示
したものと同様の方法でＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣ
ｉ充填した高速液体クロマ′トゲラフイー用充填カラム
を用いて精製を行なった。

ＩＬ−２は図−５に示したように単一のピークとして溶
離され回収率は定量的でちった。ここに得られたＩＬ−
２は蛋白質１　ｍｇ当シ、５Ｘ１０７ユニツトの活性を
示し、菌体抽出液からの比較では約５，０００倍、グル
ｐ過によるＩＬ−２画分からの比較では約２１倍の精製
度の向上が見られた。

また実施例２に示したものと同一条件のＳＤＳ　−ポリ
アクリルアミド電只泳動によシ分子量約１６．０００ダ
ルトンに単一のバンドとして検出された０

【図面の簡単な説明】

図１１図２１図３１図４および図５は、それぞれ実施例
２．実施例３．実施例４．実施例５および実施例８に記
載した高速液体クロマトグラフィー操作における溶出曲
線で、実線は２００ｎｍにおける吸光度を示し、その目
盛シを左縦軸に示す。 折れ線は溶媒Ｂの溶離液中の割合を示し、その目盛シを
右縦軸に示す。横軸は、試料の通液開始からの時間経過
（分）ｆ：示す。矢印はＩＬ−２活性に対応するピーク
を示す。 特許出願人　味の素株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. インターロイキン２を含む溶液をアルキル基、アロアル
   キル基或いはアリール基を結合基とする化学結合型シリ
   カダルを充填剤とするカラムに通液してインターロイキ
   ン２を吸着させ、次いで有機溶媒の濃度を高めることに
   よシ、インターロイキン２を溶出１回収することｆ、特
   徴とするインターロイキン２の精製法