KR0131204B1

KR0131204B1 - 암 면역치료용 보조제

Info

Publication number: KR0131204B1
Application number: KR1019890000931A
Authority: KR
Inventors: 마사끼 다찌바나; 히로시 다자끼
Original assignee: 수야마 다다가즈; 가부시끼가이샤 미도리 쥬지; 오오노 아끼라; 모리나가 뉴교 가부시끼가이샤
Priority date: 1988-01-29
Filing date: 1989-01-28
Publication date: 1998-04-17
Also published as: EP0326149B1; EP0326149A2; ES2043901T3; DE68908426T2; DE68908426D1; EP0326149A3; JPH01193227A; CA1336399C; KR890011612A; US5254534A

Abstract

내용없음

Description

암 면역치료용 보조제

본 발명은 활성 성분으로서 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor)를 함유하며, 면역활성제와 함께 암 면역치료에 사용하기 위한 보조제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역활성제와 혼합하여 사용할 경우 상기 면역활성제의 효능을 증가시킬 수 있는 암 면역치료용 보조제에 관한 것이다.

콜로니 자극 인자(이후 CSF라 약칭한다)는 과립구 및 대식구의 증식 및 분화를 촉진하는 내인성 인자이다. CSF는 골수과립구 및 대식구계의 간세포(stem cell)에 작용하며(GM=CFUs), 예를 들면, 1) 과립구를 형성시키는 G-CSF(과립구 CSF), 2) 단구 대식구를 형성시키는 M-CSF(대식구 CSF) 및 3) 과립구 및 대식구 둘 모두를 형성시키는 GM-CSF로 분류된다. M-CSF에 속하며 GM-CFUs에 직접 작용하지 않고 혈액중의 단구에 작용하여 GM-CSF의 분비를 촉진하고 대식구 및 과립구를 간접적으로 증식시키는 CSF도 사람의 요로부터 정제하여 왔다(이후 CSF-HU라 약칭한다).

면역활성제는 암 면역치료 수단으로 사용되어 왔는데, 이의 구체적인 예에는 피시바닐(Picibanil)(OK-432), 크레스틴(Krestin)(PSK), 렌티난(lentinan) 및 스크조필란(schizophyllan)이 포함된다. 피시바닐은 페니실린으로 미리 처리한 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus piogenes) A-Ⅲ-Su의 균주를 동결 건조시켜 제조한 건조분말 형태의 폴리사카라이드이다(쭈가이(Chugai)제품). 크레스틴은 단백질-결합 폴리사카라이드를 주로 함유하는 크리올루스 베르시콜로르(Criolus versicolor) 균사의 열수(hot water) 추출물이다(쿠레하-상교(Kureha-Sankyo)사 제품). 렌티난은 레우티누스 에보데스(Leutinus ebodes)의 과실체로부터 추출한 β-1,3-글루칸이다[아지노모또-모리시따-야마노우찌(Ajinomoto-Morishita-Yamanouchi)제품). 스키조필란은 스키조필름 콤무네(Schizophyllum commune)의 배양배지로부터 유도된 주쇄로서 β-1,3-글루칸 및 부쇄로 β-1,6-글루칸을 함유하는 폴리사카라이드이다[참조 : GANN, 60, 137-144(1969)].

이러한 면역활성제의 기작은 면역활성제가 임파구에 작용하여 내인성 TNF(Tumor Necrosis Factor; 종양 괴사 인자) 또는 TNF와 유사한 물질을 분비하게 하여 생체내 TNF 활성을 증가시켜, 결과적으로, 항종양 효과를 나타내도록 하는 것으로 생각된다.

이러한 면역활성제는 심각한 부작용을 일으키지 않고 항종양제로서 유용함에도 불구하고, 이들의 활성은 그리 강력한 것이 못되어 항상 만족스런 효과를 얻을 수는 없다.

면역활성제의 활성을 높이기 위해 광범위하게 조사한 결과, 본 발명자들은 면역활성제와 CSF를 혼합 사용하면 생체내 TNF 활성이 증가될 수 있다는 것을 최초로 밝혀내었다.

또한 본 발명자들은 CSF가 면역활성제의 항종양 효과를 현저하게 향상시키기 때문에 상기 CSF가 면역활성제를 사용하는 암 면역치료에서 보조제, 즉, 면역활성제를 위한 상승제로서 유용하다는 것을 발견하였다. 즉 본 발명은 이러한 사실을 근거로 완성된 것이다.

(1) CSF

본 발명에 따라 사용되는 CSF는 특정한 종에만 한정되는 것이 아니라 과립구와 대식구의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있는 어떤 단백질성 인자도 포함될 수 있다.

이러한 CSF의 예로는 무엇보다도 공지된 G-CSF, M-CSF(CSF-HU 포함) 및 GM-CSF를 들 수 있다. 본 발명에는 M-CSF를 사용하는 것이 바람직하다.

CSF는, 예를 들면, 사람의 요로부터 정제시키거나 CSF-생성 세포를 배양시켜서, 또는 유전 공학 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

더욱 구체적으로 말하면 무엇보다도 다음을 들 수 있다 :

미합중국 특허 제4,275,056호에 기술된 CSF(이후 CSF(ⅰ)라 약칭한다);

JP-A-63-54398(JP-A란 심사되지 않고 공개된 일본국 특허원이다)에 기술된 CSF(이후 CSF(ii)라 약칭한다);

JP-A-63-290900에 기술된 CSF(DLGN CSF(ⅲ)라 약칭한다); 및

JP-A-63-250400에 기술된 CSF(DLGN CSF(ⅳ)라 약칭한다).

(ⅰ) CSF(ⅰ)

CSF(ⅰ)은 다음과 같은 물리화학적 특성을 지닌 당단백질이다.

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 75,000 내지 90,000;

(b) 용해도 : 수-용해성이고, 클로로포름에 약한 용해성을, 에틸 알콜 및 아세톤에는 불용성을 나타낸다;

(c) 비선광도 :

(0.25% 수용액)

(d) pH : 1중량% 수용액에 대해 5.0 내지 6.0;

(e) 등전점 : pH 4.7±0.2;

(f) 온도 안정성 : 60℃±0.5℃에서 30분간 가열시 1중량% 수용액은 사람의 과립구 증식 및 분화 촉진 능력을 상실한다;

(g) 전기영동 : 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동으로 측정한 이의 분자량은 85,000이다;

(h) 자외선 흡수 : 다음과 같은 특이한 흡수(cm^-1)를 나타낸다 : 3600 내지 3200(강), 1700 내지 1600(강), 1550(중), 1430 내지 1380(중), 1150 내지 1000(넓음)

(i) 색반응 : α-나프톨-황산 반응, 인돌-황산 반응, 안트론-황산 반응 및 페놀-황산 반응에서 양성 당색반응; 염산으로 가수분해시킨후 로우리-폴린(Lowry-Folin)반응 및 닌히드린 반응에서 양성 펩타이드 결합 및 아미노산 색반응;

(j) 단백질 잔기중의 구성 아미노산 : 프롤린, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 골리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 리신, 히스티딘, 트립토판 및 아르기닌;

(k) 색 및 외관 : 거의 백색이며 무정형;

(l) 당 잔기중의 구성 탄수화물 : 중성 탄수화물(글루코스로서) 10.0 내지 13.0중량%, 시알산 3.0 내지 7.0중량%, 아미노당 1중량% 이하;

(m) 단백질과 탄수화물의 비 : 단백질 75 내지 85중량%, 당 13.0 내지 20.0중량%;

(n) 원소분석 :

탄소 : 42.3 내지 47.3%

수소 : 5.7 내지 7.8%

질소 : 9.6 내지 14.3%

황 : 0.2% 이하;

(o) 이는 사람의 골수세포에 작용하여 과립구의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

상기 당단백질을 제조하는 몇가지 방법이 미합중국 특허 제4,275,056호 및 제4,230,697호 및 GB-A-2016 477에 기술되어 있다. 제조실시예 하나를 하기한다.

더욱 구체적으로, 예를 들면, 사람의 요를 규소-함유 흡착제와 접촉시켜 흡착된 활성 물질을 수성 알칼리 용액으로 용출시키고 중성염을 사용하여 농축시켜 생성된 침전된 분획을 수집한후, 상기 분획으로부터 10⁴미만의 분자량을 갖는 물질을 제거하고, 이렇게 수득한 분자량 10⁴이상인 물질을 함유하는 분획을 무기염 완충 용액에 용해시키고, 이 용액을 양이온 교환기와 접촉시켜 불순물을 상기 이온 교환기에 흡착시켜 제거하고, 유출물 및 용출물을 음이온 교환기와 접촉시키고 상기 이온 교환기상에 흡착된 활성 물질을 1리터당 0.1 내지 0.3몰의 농도를 갖는 무기염 용액을 사용하여 용출시키고, 수득한 용출물을 물 흡수성이 10 내지 20ml/g인 고가교결합된 중합성 겔로 채운 컬럼에 적용하여, 상기 용출물중의 활성 물질을 1리터당 0.05 내지 0.1몰의 농도를 갖는 염 완충 용액을 사용하여 전개시키고, 상대 용출 용량 1.11 내지 1.60의 분획을 수집하여, 이렇게 수집한 분획을 pH 6.0 내지 8.0에서 친당성 흡착제와 접촉시켜, 활성 물질을 20 내지 100mM의 당을 함유하는 1.0 내지 2.0M 염-부가 완충 용액(pH 6.0 내지 8.0)을 사용하여 용출시키고, pH 7.0 내지 9.0에서 예비 전기영동시키고, 활성 물질을 묽은 염 용액을 사용하여 용출시킨 다음 활성 성분을 회수함을 특징으로 하여 CSF(ⅰ)을 수득하는 방법을 들 수 있다.

활성 물질은 필요한 경우, 50 내지 70℃ 및 pH 5 내지 9에서 약 8 내지 30시간 동안 열처리할 수도 있다.

(ⅱ) CSF(ⅱ)

CSF(ⅱ)는 다음과 같은 특성을 갖는 당단백질이다.

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 약 70,000;

(b) 등전점 : pH 약 4.7;

(c) N-말단 아미노산 서열;

(상기 서열에서, -는 문제의 아미노산 잔기를 확인할 수 없음을 의미한다.)

(d) 이는 골수세포에 작용하여 과립구계 간세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

(e) 단백질과 탄수화물의 비 : 탄수화물 함량 약 13 내지 20%, CSF(ⅱ)를 생성시키는 방법은, 예를 들면, JP-A-63-54398에 기술되어 있다. 더욱 구체적으로, 하기 방법을 예로 들 수 있다.

A. 출발물질

사람 요 등, 특히 사람의 요로부터 A280(280nm에서 흡광도) 당 약 1,000 내지 3,000단위 이상으로 부분 정제시켜 유도한 사람의 CSF 활성을 갖는 용액을 사용할 수 있다. 부분정제는 공지된 방법, 예를 들면, 미합중국 특허 제4,275,506호에 기술된 방법(규소-함유 흡착제를 사용한 처리, 양이온 교환기 및 음이온 교환기 및 겔 여과에 의한 정제) 또는 JP-A-59-58629에 기술된 방법(농축, 가열 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 음이온 교환기를 사용한 처리에 의한 정제)으로 수행할 수 있다.

B. 정제 및 분리

정제 및 분리는 부분 정제된 CSF를 PEG 분별, 에탄올 분별, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피 및 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)의 배합에 적용시켜 수행할 수 있다.

(ⅲ) CSF(ⅲ)

CSF(ⅲ)는 단량체 당단백질로서 다음과 같은 특성을 지닌다.

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 약 70,000; 비환원 및 환원 조건하에서 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)으로 측정시 약 34,000;

(b) N-말단 아미노산 서열 :

(상기 서열에서, X는 문제의 아미노산 잔기가 아직 확인되지 않았음을 의미한다.)

(c) 이는 골수세포에 작용하여 과립구계 간세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

CSF(ⅲ)을 생성시키는 방법은, 예를 들면, JP-A-63-290900에 기술되어 있다.

(ⅳ) CSF(ⅳ)

JP-A-63-250400에 기술된 CSF(ⅳ)는 다음과 같은 물리화학적 특성을 지닌 당단백질이다.

(a) 분자량 :

이는 2개의 동일한 서브유니트로 구성된 단독 이량체(homodimer)로서, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 측정시, 이의 분자량은 70,000 내지 90,000달톤(dalton)이다. 환원제를 사용한 분리로부터 초래된 생물학적 활성을 지니지 않는 서브유니트의 분자량은 SDS-PAGE로 측정시 35,000 내지 45,000달톤이다.

(b) 서브유니트의 아미노산 서열 :

단독이량체를 구성하는 서브유니트 단백질은 하기와 같은 214 내지 238개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 서열을 갖는다. 122번 및 140번 아미노산(아스파라긴) 잔기는 각각 아스파라긴(Asn)-X-트레오닌(Thr)/세린(Ser)(여기에서, X는 임의로 선택된 아미노산 잔기이다)으로 나타낼 수 있는 전형적인 N-글리코시드 결합 부위를 갖는다.

(c) 등전점 :

폴리아크릴아미드 겔 등전 포커싱(focusing) 및 슈크로즈 밀도 구배 등전 포커싱 기술로 측정시 등전점(pI)은 3.1 내지 3.7이다.

(d) 당쇄-구성 성분인 모노사카라이드 :

하기 당쇄-구성 성분인 모노사카라이드는 가수분해후 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인되었다 : 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민 및 N-아세틸뉴르아민산.

(e) 원형 이색성 분광법

원형 이색성 분산 계기로 기록한 원자외선 CD 스텍트럼은 파장 208 및 222nm에서 최소 피크를 가져, α-나선형(helix) 구조가 내포되어 있다는 것을 알 수 있다.

(f) 열 안정성 :

60±0.5℃에서 60분간 가열해도 생물학적 활성을 잃지 않는다.

(g) 적외선 흡수 :

적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 특이한 흡수(cm^-1)를 나타낸다 : 3250, 2900, 1640, 1520, 1410, 1180, 1120, 1040.

(h) 생리적 활성 :

이는 포유동물의 단구-대식구계 세포에 대해 콜로니 자극 활성을 갖는다.

CSF(ⅳ)를 생성시키는 전형적인 방법은 사람의 요를 pH 8 내지 9로 조정하여 불용성 물질을 침전시키고, 상등액을 한외여과막을 사용하여 탈염시키고, 이를 약 200회 이상 농축시키고, 농축물의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하고, 이를 60℃에서 10시간 동안 가열한 다음, 원심분리하여 생성된 침전물을 제거하고, 활성 물질이 음이온 교환기에 흡착되도록 하고, 이를 0.2 내지 0.4M 완충액으로 용출시키고, 용출물을 1 내지 4M 완충액중에서 겔 여과시켜, 분자량 70,000이상인 분획을 회수하고, 상기 분획을 소수 친화 물질에 흡착되도록 하고, 활성 물질을 0.5 내지 1M 완충액을 사용하여 용출시키고, 용출물을 고속 액체 겔 여과시켜, 분자량 70,000 내지 150,000달톤인 분획을 회수하고, 상기 분획을 pH 1 내지 2로 조정하여, 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피시킨 다음 활성 성분을 용출시킴을 포함한다. 이렇게 수득한 CSF는 단백질 1mg당 약 100,000 내지 20,000,000단위의 특이 활성을 갖도록 하는 순도를 갖는다.

전술한 방법으로 생성시킨 CSF는 바이알 중에서 무균적으로 동결건조하여 분말 형태로 그속에 밀봉한다. 또한 사람의 혈청 알부민(CSF 안정제로서) 및 아미노산 또는 당(용해 보조제로서)을 함유하는 수용액을 동결건조시키기 전에 CSF에 가하여 각각 1 내지 10중량/용량%, 0.1 내지 5중량/용량% 및 1 내지 10중량/용량%의 최종 농도로 만들어 혼합물을 멸균 여과시킨 다음 무균 조건하에서 동결건조시키는 것도 추천될 수 있다.

생물학적 활성 측정에 있어서, 시험관내 마우스 골수세포의 콜로니 형성을 활성 측정 파라미터로 사용할 수 있다. 이처럼, 송아지 태 혈청 20%로 보충시키고 당단백질 농도를 10%로 조정한 샘플 0.1ml, 한천 0.3% 및 7.5×10⁴개의 마우스 골수세포를 함유하는 맥코이(McCoy) 5A 배지율 직경 35mm의 플라스틱 배양 접시에 가하고, 한천 0.3%를 함유하는 맥코이 5A 배지를 사용하여 총 용량을 1ml로 조정하여, 접시의 내용물을 CO₂5%를 함유하는 습한 공기중 37℃에서 7일간 항온처리(incubation)시킨다. 그런 후에는, 50개 이상의 세포로 구성되는 세포집합체를 역상(invert) 현미경하에서 계수한다.

형성된 하나의 콜로니를 한 단위로 계산한다.

본 발명의 실시에서, 상기 당단백질의 펩타이드 단편 또는 과립구 분화 및 증식 촉진 활성을 지니는 이러한 단편의 유도체를 또한 활성 성분으로서 사용할 수 있다. 단편화 방법은, 예를 들면, 공지된 효소로 처리함에 의한 당 제거법이거나 분해성 단편화 처리일 수 있다. 과립구 분화 및 증식 촉진 활성을 갖는 유전 공학적으로 처리된 펩타이드 단편도 또한 사용할 수 있다.

(2) 면역활성제

본 발명의 실시에 사용된 면역활성제는 면역활성제로서 작용하여 단구, 과립구 및 임파구에 영향을 미쳐 TNF 활성을 증가시킴으로써 항종양 효과를 생성하는 한 특정의 종에 한정되지는 않는다.

구체적인 예로는 피시바닐[(OK-432), 크레스틴(PSK), 렌티난 및 스키조필란(SPG)]등이 있다.

(3) 용량(dose) 및 투여량(dosage)

CSF는 CSF 농도가 10³내지 10⁶단위/ml인 주사용의 생리식염수, 멸균수등의 액체형태로, 정맥내, 근육내 또는 피하주사 또는 정맥내 적주등으로 투여된다.

용량은 일반적으로 체중 1kg당 1,000 내지 150,000단위이며 이를 1일 1회 또는 수회 분할하여 투여하나 용량은 증상에 따라 적당하게 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

면역활성제는 제조자에 의해 권장되는 투여량에 따라 투여할 수 있다. 피시바닐은 1 내지 10KE 범위의 용량으로 주당 수회 근육내, 피하, 정맥내 등으로 투여할 수 있다. 크레스틴은 1일 3g의 용량으로 수회 분할하여 경구투여할 수 있다. 권장량의 렌티난의 권장되는 투여량은 정맥내 주사 또는 정맥내 적주로 주당 2mg이다.

CSF 및 면역활성제는 동시 투여하거나 따로 투여할 수 있다.

CSF와 면역활성제를 동시에 사용한 경우 면역활성제 단독으로 사용한 경우에 비해 생체내에서 TNF 활성을 증가시킨다는 것이 확인되었으므로, CSF를 사용하여 TNF 항종양 효과를 강화시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 암의 면역치료에 매우 유용하다.

하기 시험실시예 및 적용실시예는 본 발명을 더욱 상세히 기술한 것으로서 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.

시험실시예 1(독성)

다음 실시예 1에서 제조하는 당단백질을 문헌[참조 : Richard et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol 90, page 99, 1949]의 방법에 따라 수컷 C57BL 마우스의 급성독성을 평가한다.

수득된 결과를 표 1에 기재하였다.

시험실시예 2

단구 및 피시바닐(OK-432)+CSF의 혼합배양에 의한 TNF 활성의 유도

(1) 단구를 헤파린화된 말초혈액으로부터 피콜-히파쿼(Ficoll-Hypaque) 구배 원심분리를 사용하여 분리하고 10% 사람 알부민-보충된 RPMI를 사용하여 단구 현탄액(3.25×10개의 세포/10ml)을 제조한다.

(2) 단구 현탄액에 피시바닐 0.01KE/ml 및 실시예 4에서 수득된 사람의 요로부터 유도된 CSF(표 2에 기재된 바와 같은 특정농도)를 동시에 가한다.

(3) 5% CO대기하, 37℃에서, 72시간동안 항온처리한다.

(4) 일정한 시간 간격으로 상등액의 TNF 활성에 대해 검정한다. TNF 활성은 크리스탈 바이올렛 흡광도면에서 L929 세포에 대한 세포파괴 활성을 측정하여 결정한다. 이렇게 하여 수득한 결과는 표 2에 기재한다.

주의 : 1KE는 피시바닐 건조분말 2.8mg에 상당한다.

표 2에 기재된 자료로부터, 다음 사실을 발견하였다.

(1) CSF 자체가 TNF 활성을 나타내게 하지는 않으며(ND는 검출되지 않음을 의미한다);

(2) TNF 활성은 피시바닐과 CSF를 혼합사용함으로써 증가되며;

(3) 피시바닐과 CSF를 혼합하여 사용할 경우, TNF 활성이 장기간 유지된다.

반면, CSF는 단구계수에는 영향을 주지 않는다는 것이 확인되었다.

[실시예 1]

건강한 사람으로부터 수집된 신선한 요(400ℓ)의 pH를 10% 수산화나트륨을 사용하여 pH 8로 조정한다음 불용성 물질을 0℃에서 냉각시키면서 연속 원심분리기상에서 15,000r.p.m으로 원심분리하여 제거한다.

이렇게 수득된 상등액의 pH를 10% 염산을 사용하여 pH 7로 조정하고 실리카 겔로 충전된 컬럼(10×80cm)에 적용한다. 실리카 겔상에서 흡착된 분획을 5% 암모니아수 40ℓ를 사용하여 용출시킨다.

수득된 용출물의 pH를 1N 황산을 사용하여 pH 7.5로 조정하고, 황산암모늄 분말을 가하여 70% 포화도(saturation)가 되게하고 생성된 혼합물을 0℃에서 밤새 정치한 다음 생성된 침전물을 여과수집한다.

침전물을 5% 암모니아수 2ℓ중에 용해시키고, 용액을 투석튜브[비스킹(Visking)]에 넣어 0.05M 인산염 완충액(pH 6.5)에 대해 충분히 투석하고, 상기 언급된 것과 동일한 완충액을 투석물에 가해 총용적이 10ℓ가 되게 한 다음, 희석된 투석물을 0.05M 인산염 완충액(pH 6.5)으로 미리 평형시킨 CM 세파덱스(Sephadex)C-50 이온 교환 컬럼(4.0×40cm)을 통해 통과시켜 이온교환수지상에 불순물을 흡착시킨다.

용출물(10ℓ)을 디아플로(Diaflow) 중공 섬유농축기[아미콘(Amicon) 모델 DO-30]를 사용하여 농축시키고, 농축물을 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)에 대하여 5℃에서 밤새 투석한 다음, 동일한 완충액을 투석물에 가해 총용량이 3ℓ 되게한다. 이로써, 당단백질-함유 조 수용액을 수득한다.

상기 용액을 먼저 동일한 완충액을 사용하여 평형시키고 활성화시킨 DEAE-셀룰로우즈 컬럼(4.0×40cm)에 적용한다. 컬럼을 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)을 사용하여 충분히 세척한후, 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액0.1M(pH 7.0)을 사용하여 용출시킨다. 과립구 분화 및 증식 촉진 활성을 갖는 분획을 수집하여 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)에 대해 투석한다.

수득된 투석물을 동일한 완충액으로 미리 평형시키고 활성화시킨 DEAE-셀룰로우즈 컬럼에 재적용시킨다. 0.1 내지 0.3M 염화나트륨을 사용하여 선형농도구배 용출기술에 의해 용출시켜 과립구 분화 및 증식 촉진활성을 갖는 분획을 수집하고, 이들 분획(합한 형태)에 황산암모늄 분말을 70% 포화도가 될때까지 가하고, 생성된 침전물을 수집하여, 소량의 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)에 용해시킨다음 완충액에 대해 투석하여 투석물을 수득한다.

그 다음에, 상기 투석물 20ml을 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)을 사용하여 미리 평형시킨 세파덱스 G-150컬럼(4.0×60cm)상에서 전개시키고, 용출계수가 1.11 내지 1.45인 분획을 수집하고 증류수에 대해 투석한 다음, 투석물을 동결건조시켜 분말 약 500mg을 수득한다.

그 다음에 , 상기 분말 200mg을 1.0M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)중에 용해시키고, 용액을 동일한 완충액으로 미리 평형시킨 콘카나발린-A-세파로우즈 4B[파인 케미칼 래보러토리스(Fine Chemical Laboratories)] 100ml을 함유하는 컬럼에 적용시키고, 컬럼을 1.0M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하여 충분히 세척한 다음, 50mM α-메틸-D-글루코사이드 및 1.0M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하여 용출하며, 과립구 분화 및 증식 촉진 활성을 갖는 분획을 수집하고, 증류수에 대해 투석한 다음, 투석물을 동결건조시킨다.

추가로, 수득된 동결건조된 분말 약 50mg을 10% 글리세린을 함유하는 0.125M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 6.8) 1ml중에 용해시킨다음 10mA의 전류에서 제조용 전기영동 장치[LKB 모델 유니폴크(Unifork 900)]중의 8% 아크릴 아미드겔(pH 8.9; 25mm×10mm)상에서 냉각수가 상기 장치를 통해 통과 되도록 하면서 전기영동시킨다. 상대적인 이동율이 0.46인 분획을 0.025M 트리스-글리신 완충액(pH 8.3)을 사용하여 회수하고 증류수에 대하여 투석한 다음, 투석물을 동결건조시켜 본 발명의 실시에 유용한 당단백질 약 10mg을 수득한다.

상기 방법을 반복하여 당단백질 약 1g을 수득한다. 이렇게 수득-정제된 당단백질 1g에 물 10ml을 가하여 당단백질을 완전히 용해시키고, 10% 수성 수산화나트륨을 가하여 pH 를 6.8로 조정한다.

그후 용액을 60℃에서 10시간동안 가열하고, 급속히 빙수로 냉각시키고 멸균수를 가함으로써 10배 희석시키고, 희석물을 막여과기(기공크기 0.45μ)가 장착된 여과멸균 장치[밀리포어(Millipore)]를 사용하여 여과멸균시키고 여액을 180℃에서 2시간동안 건조 공기로 미리 멸균시킨 유리 바이알내에 1ml 분량씩 무균적으로 분배시키고, 바이알 내용물을 무균적으로 동결건조시킨 다음 바이알을 밀봉한다. 각각 이렇게하여 열-처리된 당단백질 1mg을 함유하는 약 97개의 바이알을 수득한다. 정제된 당단백질은 특이활성이 단백질 1mg당 1×10단위이다.

[실시예 2]

건강한 사람으로부터 수집된 신선한 요 1000ℓ로부터 당단백질을 함유하는 조 수용액 2.5ℓ를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 수득한다. 본 수용액에 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0) 25ℓ를 가하고, 혼합물을 충분히 교반한 다음 디아플로 중공 섬유 고속농축기에서 약 1/25로 농축시킨다. 그후, 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0) 5ℓ 및 미리 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)으로 평형시킨 DEAE-셀룰로우즈 분산액(무수 기제상 DEAE 200g을 함유) 5ℓ를 농축액에 가하고, 혼합물을 30분동안 교반하고 정치한 다음, 상기 셀룰로우즈를 흡인여과시켜 수집한다. 여과에 의해 수집된 상기 셀룰로우즈에 세척용의 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0) 10ℓ를 가하고, 상기 셀룰로우즈를 흡인여과에 의해 재수집하고, 0.05M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0) 10ℓ를 사용하여 세척한 다음 흡인여과시켜 수집한다. 이렇게 여과분리된 셀룰로우즈에 0.3M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0) 10ℓ를 가하고, 혼합물을 교반하여 당단백질-함유 분획을 상기 DEAE-셀룰로우즈로부터 용출시킨다. 용출물을 증류수를 사용하여 반복희석하고 디아플로 중공 섬유 고속 농축장치(모델 DC-30)를 사용하여 재농축시킴으로써 탈염시킨다음 동결건조시켜 분말 약 15g을 수득한다. 이렇게 수득된 동결건조된 분말을 증류수 150mℓ중에 용해시키고, 용액을 0.1M 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형시킨 세파덱스 G-150 컬럼(6.0×80cm)에 적용시킨 다음 용출계수가 1.11 내지 1.60인 상응하는 당단백질 함유 분획을 수집한다. 상기 분획을 증류수에 대해 충분히 투석하고, 투석물을 디아플로 중공 섬유 농축장치(모델 DC2)를 사용하여 농축시켜 조 당단백질 약 9g을 함유하는 농축물 100mℓ을 수득한다.

본 농축물에 0.1M 시트르산-인산나트륨 완충액을 가하고, pH를 6.1로 조정하며, 용액을 실시예 1과 동일한 방법으로 열처리하고, 멸균여과시키며, 무균조건하에 바이알내로 2.5mℓ 분량씩 분배시키고 무균조건하에 동결건조시킨 다음, 바이알을 밀봉한다.

이렇게 수득된 바이알 40개는 각각 열-처리된 당단백질 약 3.8mg을 함유한다. 정제된 당단백질은 특이활성이 단백질 1mg당 1×10단위이다.

[실시예 3]

건강한 사람으로부터 수집된 요(200ℓ)의 pH를 8.5로 조정하고, 생성된 침전물을 여과시켜 제거하며, 여액을 농축시킨 다음 한외여과막[아미콘(Amicon); H10×50 : 차단 분자량 : 50,000달톤]을 사용하여 탈염시킨다. 그후, 농축물의 pH를 7.0으로 조정하고 60℃에서 10시간동안 밀봉된 용기내에서 가열하여 멸균시킨다. 이후, 생성된 침전물을 원심분리(5,000×g,30분)하여 제거한 다음 상등액을 0.02M 인산염 완충액(pH7.2)으로 평형시킨 DEAE-셀룰로우즈와 혼합하여 흡착시킨다. 0.02M 인산염 완충액 및 이어서 0.05M 염화나트륨이 보충된 0.02M 인산염 완충액(pH 7.2)을 사용하여 DEAE-셀룰로우즈를 세척한 후, 염화나트륨(pH 7.2)이 보충된 0.25M 인산염 완충액을 사용하여 DEAE-셀룰로우즈를 처리하여 용출시킨다. 용출물을 한외여과막(아미콘 : HIP10)을 사용하여 농축시킨 다음 1M 황산암모늄이 보충된 완충액(pH 7.2)로 세파크릴 S-300[파마시아(Pharmacia), ψ4×80cm]를 사용하여 겔 여과에 적용한다. 상기 겔 여과에서 수득한 70,000 내지 150,000달톤 범위의 분자량에 상당하는 분획을 합하여 1M 황산암모늄이 보충된 전술한 완충액으로 평형시킨 페닐-세파로즈 4B 컬럼(파마시아, ψ2×20㎝)에 적용하여 흡착시킨다. 0.5M 황산암모늄이 보충된 완충액(pH 7.2)을 사용하여 용출시킨다. 용출물을 한외여과막[아사히 케미칼 인더스트리(Asahi Chemicaℓ Industry), NM-3]을 사용하여 축물을 TSKG-3,000 SW 컬럼[토소 코포레이션(Tosoh Corporation), ψ4×600mm×2]을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피에 적용하여 분자량이 70,000 내지 150,000달톤 범위인 분획을 수득한다. 이 분획을 재농축시키고 선형 아세토니트릴 농축구배(0 내지 100%, pH 2.0)상의 역-상 하이-포어(Hi-Pore) RP-804[바이오래드(Bio-Rad), ψ4×150mm]컬럼상에서 수행되는 고성능 액체 크로마토그래피에 적용한다. 용출물은 0.1M 트리플루오로아세트산을 함유한다. 용출정제된 CSF의 특이활성은 단백질 1mg당 1.4×10단위이다.

[실시예 4]

CSF를 실시예 3에서와 동일한 방법으로 분리하고 정제하되, 각각 세파크릴 S-300 및 페닐-세파로오즈 4B로 처리하는 대신에 TSKG-3,000 SW(토소 코포레이션 HℓC-837) 및 페닐-5pw(토소 코포레이션)로 고성능 액체 크로마토그래피를 수행한다. 생성된 CSF의 특이활성은 단백질 1mg당 1.5×10단위이다.

[실시예 5]

(1) CSF의 물리화학적 특성

실시예 3에서 수득된 CSF의 물리화학적 특성을 하기에 기술한 바와 같이 측정한다.

(a) 분자량

환원제의 부재하에 램리(Laemmli, Nature, vol, 227, pages 680-685, 1970)의 방법으로 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 측정한 분자량은 70,000 내지 90,000달톤이다.

동일한 방법으로 분자량을 측정하지만, 0.2M 머캅토-에탄올로 환원시킨 결과 CSF가 각각 35,000 내지 45,000달톤의 분자량을 갖는 서브유니트로 분해되는 것으로 나타났다.

(b) 서브유니트 단백질의 아미노산 서열

정제된 CSF를 증기상 아미노산 서열분석기를 사용하여 통상의 방법으로 NM-말단 아미노산 서열에 대해 분석한다. 그다음 정제된 CSF를 6M 구아니딘으로 변성시키고 모노요오드 아세트산으로 알킬화시킨다음, 탈염시킨 후, 트립신으로 분해시키고 이어서, 시아노겐 브로마이드로 분해시킨다. 트립신-분해-시아노겐 브로마이드-분해 생성물(펩타이드 혼합물)을 바이댁(Vydac) C-18을 사용하여 역-상 고성능 액체 크로마토그래피로 분획화시킨다. 분리된 펩타이드 분획을 각 펩타이드 단편의 아미노산 서열 결정용 증기상 아미노산 서열 분석기로 각각 분석한다. 각 트립신 분해 -시아노겐 브로마이드 분해 생성물 펩타이드 단편의 아미노산 서열 및 본 발명에 의해 클로닝시킨 mRNA의 염기 서열에 의거하여, 서브유니트 단백질의 1차 아미노산 구조를 결정한다. 서열분석의 결과를 표 3에 나타내었다.

NH-말단 아미노산(글루탐산)으로부터 149번 아미노산(글루탐산)까지의 서열은 공지된 CSF인 CSF-1의 것과 동일하지만, 150번부터 214번 내지 238번 아미노산(65 내지 89개의 아미노산)까지의 서열은 공지된 CSF의 것과 매우 다르다.

COO-말단 아미노산으로서, 서브유니트 단백질의 분자량에 따라 분석한 결과 프롤린은 214번 아미노산으로 리신은 238번 아미노산으로 나타났다. 122번 및 140번 아미노산(아스파라긴)은 각각 Asn-X-Ser/Thr(X는 임의의 아미노산이다)의 전형적인 N-글리코시드 결합 구조를 가지며 이들 부위는 당쇄 결합 부위로 고려된다.

(c) 등전점

폴리아크릴아미드 겔 등전 포커싱 및 슈크로오즈 밀도 구배 등전 포커싱 기술로 측정한 등전점(pI)은 3.1 내지 3.7이다.

(d) 당쇄-구성 모노사카라이드

폴리펩타이드에 결합된 당쇄중에 포함된 구성성분인 모노사카라이드를 가수분해에 의해 분리시켜 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한다. 알도오스 및 시알산을 음이온 교환 칼럼상에서, 헥소스아민은 양이온 교환 컬럼상에서 붕산염 완충액 농도 구배 용출방법으로 용출시켜 분획화시킨다. 구성성분을 시아노아세트아미드 또는 아르기닌으로 후-컬럼(post-column)표지(labelling)시키고 형광법으로 확인한다. CSF 분자에 포함되는 당쇄는 다양하기 때문에 정량하기 어렵지만, 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민 및 N-아세틸뉴르아민산이 구성성분인 모노사카라이드로 확인된다.

(e) 원형 이색성 스펙트럼

원형 이색성 분산 계기[자스코(JASCO) 모델 J-600]를 사용하여 원자외선 영역의 CD 스펙트럼을 측정한다. 208nm 및 222nm의 파장에서 최소 피크가 관찰된다. 따라서, α-나선형 구조를 함유하는 CSF의 2차 구조를 측정할 수 있다.

(f) 열 안정성

CSF를 묽은 완충액(pH 7.0)에 1μg/mℓ의 농도로 용해시키고, 상기 용액을 60±0.5℃에서 60분 동안 가열시킨 다음 콜로니 자극 활성을 측정한다(이후 본 명세서에서 언급함).

(g) 적외선 흡수 스펙트럼

푸우리에-변환 적외선 분광광도계(Fourier-transform infrared spectrophotometer, Nocoℓet 모델 5DXC)를 사용하여 투과법(KBr window)으로 동결건조된 분말형태인 CSF의 적외선 흡수 스펙트럼을 측정한다.

CSF는 1650cm^-1, 1201cm^-1및 1133cm^-1에서 강한 흡광 및 1537cm^-1, 1432cm^-1및 1068cm^-1에서 중간 흡광을 나타낸다.

(2) CSF의 생물학적 특성

실시예 3에서 수득한 CSF의 콜로니 자극 활성을 단층 연질 아가 겔 상에서 마우스 골수 세포의 콜로니 형성을 포함하는 방법으로 측정한다. 따라서, CSF 샘플을 아가 0.3%, 송아지 태 혈청(FCS) 20% 및 마우스 골수세포 1×10⁵개를 함유하는 맥코이 5A 배지 1mℓ과 혼합시킨다. CO₂7.5%-함유 기체의 스트림하에 통과시키면서 37℃에서 7일동안 항온처리한다. 그후, 50개 이상의 세포로 이루어진 세포 집합체를 콜로니로 판단하여 계수한다. 콜로니 자극 활성을 단위로 표시한다. 하나의 단위를 하나의 콜로니 형성에 필요한 CSF의 양으로 정의한다. 특이활성은 CSF 단백질 1mg당 형성된 콜로니의 수(단위)로 나타낸다. 그 결과 본 발명에 따르는 CSF의 특이활성은 단백질 1mg당 1.4×10⁸단위인 것으로 밝혀졌다. 형성된 콜로니를 형태학적 분류를 위해 헤마톡실린-에오신으로 염색한다. 이로써 형성된 콜로니중 95% 이상이 단구-대식구 콜로니인 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 이의 특정 양태를 참고하여 상세하게 기술되었지만, 본 발명의 범주를 벗어나지 않는한 여러가지 변화 및 수정을 할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 명백할 것이다.

Claims

피시바닐, 크레스틴, 렌티난 및 스키조필란으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 면역활성제와의 혼합물로 하기(ⅰ) 내지 (ⅳ)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 콜로니 자극 인자를 포함하는 암 면역치료용 약제학적 조성물.

(ⅰ) 다음과 같은 특성을 갖는 CSF :

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 75,000 내지 90,000;

(b) 용해도 : 수-용해성이고, 클로로포름에 약한 용해성을, 에틸 알콜 및 아세톤에는 불용성을 나타낸다;

(c) 비선광도 :
(0.25% 수용액);

(d) pH : 1중량% 수용액에 대해 5.0 내지 6.0;

(e) 등전점 : pH 4.7±0.2;

(f) 온도 안정성 : 60℃±0.5℃에서 30분간 가열시 1중량% 수용액은 사람으 과립구 증식 및 분화 촉진 능력을 상실한다;

(g) 전기영동 : 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동으로 측정한 이의 분자량은 85,000이다;

(h) 자외선 흡수 : 다음과 같은 특이한 흡수(cm^-1)를 나타낸다 : 3600 내지 3200(강), 1700 내지 1600(강), 1550(중), 1430 내지 1380(중), 1150 내지 1000(넓음)

(i) 색반응 : α-나프톨-황산 반응, 인돌-황산 반응, 안트론-황산 반응 및 페놀-황산 반응에서 양성 당색반응; 염산으로 가수분해시킨후 로우리-폴린(Lowry-Folin)반응 및 닌히드린(ninhydrin) 반응에서 양성 펩타이드 결합 및 아미노산 색반응;

(j) 단백질 잔기중의 구성 아미노산 : 프롤린, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 리신, 히스티딘, 트립토판 및 아르기닌;

(k) 색 및 외관 : 거의 백색이며 무정형;

(l) 당 잔기중의 구성 탄수화물 : 중성 탄수화물(글루코스로서) 10.0 내지 13.0 중량%, 시알산 3.0 내지 7.0중량%, 아미노당 1중량%이하;

(m) 단백질과 탄수화물의 비 : 단백질 75 내지 85중량%, 당 13.0 내지 20.0중량%;

(n) 원소분석 :

탄소 : 42.3 내지 47.3%

수소 : 5.7 내지 7.8%

질소 : 9.6 내지 14.3%

황 : 0.2% 이하;

(o) 이는 사람의 골수세포에 작용하여 과립구의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

(ⅱ) 다음과 같은 특성을 갖는 CSF :

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 약 70,000;

(b) 등전점 : pH 약 4.7;

(c) N-말단 아미노산 서열 :

(상기 서열에서, "-"는 문제의 아미노산 잔기를 확인할 수 없음을 의미한다.)

(d) 이는 골수세포에 작용하여 과립구계 간세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

(e) 단백질과 탄수화물의 비 : 탄수화물 함량 약 13 내지 20%

(ⅲ) 다음과 같은 특성을 갖는 CSF :

(a) 분자량 : 겔 여과법으로 측정시 약 70,000; 비환원 및 환원 조건하에서 SDS-PAGE(나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)으로 측정시 약 34,000;

(b) N-말단 아미노산 서열 :

(상기 서열에서, "X"는 문제의 아미노산 잔기가 아직 확인되지 않았음을 의미한다.)

(c) 이는 골수세포에 작용하여 과립구계 간세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다.

(iv) 다음과 같은 특성을 갖는 CSF :

(a) 분자량 : 이는 2개의 동일한 서브유니트로 구성된 단독 이량체(homodimer)로서, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 측정시, 이의 분자량은 70,000 내지 90,000달톤(dalton)이다. 환원제를 사용한 분리로부터 초래된 생물학적 활성을 지니지 않는 서브유니트의 분자량은 SDS-PAGE로 측정시 35,000 내지 45,000달톤이다.

b) 서브유니트의 아미노산 서열 : 단독이량체를 구성하는 서브유니트 단백질은 하기와 같은 214 내지 238개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 서열을 갖는다. 122번 및 140번 아미노산(아스파라긴) 잔기는 각각 아스프라긴(Asn)-X-트레오닌(Thr)/세린(Ser)(여기에서, X는 임의로 선택된 아미노산 잔기이다)으로 나타낼 수 있는 전형적인 N-글리코시드 결합 부위를 갖는다.

(c) 등전점 :

폴리아크릴아미드 겔 등전 포커싱(focusing) 및 슈크로즈 밀도 구배 등전 포커싱 기술로 측정시 등전점(pI)은 3.1 내지 3.7이다.

(d) 당쇄-구성 성분인 모노사카라이드 :

하기 당쇄-구성 성분인 모노사카라이드는 가수분해후 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인되었다 : 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민 및 N-아세틸뉴르아민산.

(e) 원형 이색성 분광법

원형 이색성 분산 계기로 기록한 원자외선 CD 스펙트럼은 파장 208 및 222nm에서 최소 피크를 가져, α-나선형(helix) 구조가 내포되어 있다는 것을 알 수 있다.

(f) 열 안정성 :

60±0.5℃에서 60분간 가열해도 생물학적 활성을 잃지 않는다.

(g) 적외선 흡수 :

적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 특이한 흡수(cm^-1)를 나타낸다 : 3250, 2900, 1640, 1520, 1410, 1180, 1120, 1040.

(h) 생리적 활성 :

이는 포유동물의 단구-대식구계 세포에 대해 콜로니 자극 활성을 갖는다.
제1항에 있어서, 콜로니 자극 인자가 골수 과립구 및 대식구계 세포의 간세포(stem cell)에 작용하는 조성물.
제1항에 있어서, 콜로니 자극 인자가 과립구 및 대식구의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있는 단백질성 인자인 조성물.
제1항에 있어서, 콜로니 자극 인자의 양이 1,000 내지 150,000단위/kg 체중인 조성물.