JPS63250400A - コロニ−刺激因子及びその製造法 - Google Patents
コロニ−刺激因子及びその製造法Info
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- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野〕
本発明は人尿から分離され、哺乳動物の単球−マクロフ
ァージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。
ァージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。
[従来の技術]
コロニー刺激因子(以下C8Fと略記する)は、1?I
i !PL動物の造血組織、例えば骨髄などに存在する
造血9?111胞の分化・増殖を刺mする造血因子であ
り、多くのC3Fは糖蛋白質から成っている。これまで
、単球−マクロファージ系幹細胞に作用する因子(M−
C8F又はC3F−1)、顆粒球−m球系幹細胞に作用
する因子(GM−C8F)、顆粒球系幹細胞に作用する
因子(G−C3F)、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨
核球に共通な多能性幹細胞に作用する因子(Mu 1℃
1−C3F、インターロイキン−3又はIL−3>の4
種が知られている。
i !PL動物の造血組織、例えば骨髄などに存在する
造血9?111胞の分化・増殖を刺mする造血因子であ
り、多くのC3Fは糖蛋白質から成っている。これまで
、単球−マクロファージ系幹細胞に作用する因子(M−
C8F又はC3F−1)、顆粒球−m球系幹細胞に作用
する因子(GM−C8F)、顆粒球系幹細胞に作用する
因子(G−C3F)、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨
核球に共通な多能性幹細胞に作用する因子(Mu 1℃
1−C3F、インターロイキン−3又はIL−3>の4
種が知られている。
Multi −C8Fを除く上記3種の人由来C8Fは
、それぞれのアミノ酸配列をコードする遺伝子cDNA
がクローニングされており、蛋白質構造が明らかにされ
ている[G、 G、 Mongら、 5cience
。
、それぞれのアミノ酸配列をコードする遺伝子cDNA
がクローニングされており、蛋白質構造が明らかにされ
ている[G、 G、 Mongら、 5cience
。
228巻、810〜815頁、1985年;[、S、K
awasak iら、 5cience 、 230
巻、291−296頁、1985年; S、 Naga
taら、 Nature。
awasak iら、 5cience 、 230
巻、291−296頁、1985年; S、 Naga
taら、 Nature。
319巻、415−418頁、1986年]。
人尿中に存在するC8Fとしては、単球−マクロファー
ジ系細胞に作用する因子(C3F−1又はM−C8F)
[3,に、 DaS & E、 R,5tan+cy
。
ジ系細胞に作用する因子(C3F−1又はM−C8F)
[3,に、 DaS & E、 R,5tan+cy
。
Journal of Biological Che
mistry 、 257巻。
mistry 、 257巻。
13679〜13684頁、1982年]、顆粒球コロ
ニーを刺激するHGI−糖蛋白質[特公昭60−302
91号公報]及びC3F−HU [に。
ニーを刺激するHGI−糖蛋白質[特公昭60−302
91号公報]及びC3F−HU [に。
Hotoyoshiら、 Bfood 、 52巻、1
012〜1020頁、1978年及びBfood 、
60巻、1378〜1386頁、1982年]が報告さ
れている。
012〜1020頁、1978年及びBfood 、
60巻、1378〜1386頁、1982年]が報告さ
れている。
それらのうち、単球−マクロファージ系18胞に作用す
る上記C3F−1は完全に純化され、またその蛋白質を
コードするcDNAがクローニングされている(上記、
E、 S、にawasakiら)。
る上記C3F−1は完全に純化され、またその蛋白質を
コードするcDNAがクローニングされている(上記、
E、 S、にawasakiら)。
純化C3F−1の構造は、糖鎖を含む二本のポリペプチ
ドがジスルフィド結合により、生物学的に活性なホモ2
M体を形成している。この2伍体はジスルフィド結合を
還元剤により切断することにより同一の2個のサブユニ
ットを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の
、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳
動法により測定した分子量は、45.000〜60,0
00ダルトンである。また2量体を形成するポリペプチ
ドサブユニットの糖鎖を除いた分子量(ま14.000
〜17,000ダルトンである。このC3F−1サブユ
ニツトのアミノ酸配列をコードしていると考えられるc
DNAから推定されたアミノ酸数は224個、分子量2
6,000ダルトンのポリペプチドである。
ドがジスルフィド結合により、生物学的に活性なホモ2
M体を形成している。この2伍体はジスルフィド結合を
還元剤により切断することにより同一の2個のサブユニ
ットを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の
、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳
動法により測定した分子量は、45.000〜60,0
00ダルトンである。また2量体を形成するポリペプチ
ドサブユニットの糖鎖を除いた分子量(ま14.000
〜17,000ダルトンである。このC3F−1サブユ
ニツトのアミノ酸配列をコードしていると考えられるc
DNAから推定されたアミノ酸数は224個、分子量2
6,000ダルトンのポリペプチドである。
[発明が解決しようとする問題点]
本発明者らは人尿中に、C3F−1と同様に作用するが
、理化学的にC3F−1とは区別される従来知られてい
なかった新規な糖蛋白C8Fが存在することを見い出し
てこれを単離し、その理化学的及び生物学的性質を明ら
かにすることにより本発明を完成した。
、理化学的にC3F−1とは区別される従来知られてい
なかった新規な糖蛋白C8Fが存在することを見い出し
てこれを単離し、その理化学的及び生物学的性質を明ら
かにすることにより本発明を完成した。
本発明の目的は、抗ガン剤化学療法による白血球減少症
、免疫不全及びJR髄移植等に治療効果がある新規なC
3Fとその製造法を提供することにある。
、免疫不全及びJR髄移植等に治療効果がある新規なC
3Fとその製造法を提供することにある。
即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ哺乳
動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なC8Fを提供する。
動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なC8Fを提供する。
a)分子量
C3F−1と同様に還元剤により同一のサブユニット2
個に解離されるホモ2ffi体であり、ドデシル硫酸ナ
トリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した
分子量が70,000〜90゜000ダルトンであって
、還元剤で解離させ、生物活性を消失させたサブユニッ
トについてドデシル@酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で測定した分子量は35.000〜45
,000ダルトンである。
個に解離されるホモ2ffi体であり、ドデシル硫酸ナ
トリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した
分子量が70,000〜90゜000ダルトンであって
、還元剤で解離させ、生物活性を消失させたサブユニッ
トについてドデシル@酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で測定した分子量は35.000〜45
,000ダルトンである。
0 サブユニットのアミノ酸配列
ホモ2吊体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
214個乃至238gのアミノ酸配列を有し、 122番目及び140番目のアスパラギン(Asn)は
それぞれアスパラギン(Asn>−X−スレオニン(T
hr)又はセリン(Ser)で表わされる典型的なN−
グリコシド結合部位を有する。ただしXは任意のアミノ
酸を表わす。
214個乃至238gのアミノ酸配列を有し、 122番目及び140番目のアスパラギン(Asn)は
それぞれアスパラギン(Asn>−X−スレオニン(T
hr)又はセリン(Ser)で表わされる典型的なN−
グリコシド結合部位を有する。ただしXは任意のアミノ
酸を表わす。
C)等電点
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点(pI
)は3.1〜3.7である。
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点(pI
)は3.1〜3.7である。
dl&’l鎖の構成単糖
加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析し、糖鎖
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、N−ア
セデルグルコサミン及びN−アセチルノイラミン酸が同
定された。
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、N−ア
セデルグルコサミン及びN−アセチルノイラミン酸が同
定された。
e)円二色性スペクトル
円二色性分散系による遠紫外部C’Dスペクトルは波長
208 nm及び222nmにそれぞれ極少ピークがあ
り、α−へソックス構造を含んでいる。
208 nm及び222nmにそれぞれ極少ピークがあ
り、α−へソックス構造を含んでいる。
f)熱安定性
60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。
れない。
g)赤外線吸収スペクトル
第3図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。
以上の理化学的性質を有することを特徴とするコロニー
刺激因子を含む人尿をpH8〜9に調整し、不溶物を沈
澱せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも
200倍以上に濃縮した後、pl+を6.5〜7.5に
調整し、60℃で10時間加熱処理し、生ずる沈澱物を
遠心除去後、陰イオン交換体へ吸着させ、0.2〜0.
4M緩衝液で溶出させ、次いで1〜4M!i衝液中でゲ
ル濾過して分子量70.000ダルトン以上の画分を回
収し、該画分を疎水性親和体に吸着させて0.5〜1M
の緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲル濾過にか
け、分子量70.000〜150.000ダルトンの画
分を回収し、該画分をp111〜2に調整して逆相高速
液体クロマトグラフィーにかけ、有効成分を溶出せしめ
ることを特徴とするコロニー刺激因子の製造法である。
刺激因子を含む人尿をpH8〜9に調整し、不溶物を沈
澱せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも
200倍以上に濃縮した後、pl+を6.5〜7.5に
調整し、60℃で10時間加熱処理し、生ずる沈澱物を
遠心除去後、陰イオン交換体へ吸着させ、0.2〜0.
4M緩衝液で溶出させ、次いで1〜4M!i衝液中でゲ
ル濾過して分子量70.000ダルトン以上の画分を回
収し、該画分を疎水性親和体に吸着させて0.5〜1M
の緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲル濾過にか
け、分子量70.000〜150.000ダルトンの画
分を回収し、該画分をp111〜2に調整して逆相高速
液体クロマトグラフィーにかけ、有効成分を溶出せしめ
ることを特徴とするコロニー刺激因子の製造法である。
[発明の詳細な説明]
(1)C8Fの製造
本発明のC8Fは次のようにして製造される。
健康人の尿をpH8,0〜9.0に調整し、尿中の粘性
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子量10゜000〜
50.000ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子量10゜000〜
50.000ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。
少なくとも200倍以上に濃縮(蛋白質1度として1%
(W/V)以上)しだ後pHを6.5〜7.5に調整し
、60℃で10時間加熱処理(ウィルス等の不活化)す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばDEAE−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。
(W/V)以上)しだ後pHを6.5〜7.5に調整し
、60℃で10時間加熱処理(ウィルス等の不活化)す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばDEAE−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。
次に0.05〜0.1Mの緩衝液(pH6,5〜7.5
)で該イオン交換体を洗浄した後0.2〜0.4Mの緩
衝液(pH6,5〜7.5)で有効成分を溶出する。該
溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、1M〜4Mの
塩類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液(D116
.5〜7.5)で平衡化させたゲルll!f過剤、例え
ば5ephacryloS −300(Pharmac
ia ?LH)でゲル濾過し、分子量範囲が70.00
0〜150.000ダルトンの画分を回収する。次に該
画分を上記1M〜4M塩含有緩衝液で平衡化させた疎水
性親和体、例えばPhenyl−8epharose”
(Phar鴎acia社製)に吸着させ、0.5〜1
.0Mの塩含有緩衝液(pH16,5〜7.5)で溶出
する。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾
過カラム、例えばTSKG−3000SW (東洋11
Jj) でゲルW1”14し、分子量範囲が70.00
0〜150,000ダルトンの画分を回収する。該画分
を再度、濃縮し、0.1%トリフルオロ酢M(TFA)
溶液(pH1〜2)で平衡化した高速液体逆相カラム、
例えば、旧−PoreoRP −304(バイオラド社
製)に吸着させ、0.1%TFAを含む溶剤、例えばア
セトニトリル又はインプロパツールの直線濃度勾配溶出
法により溶出する。このようにして得られたC8Fは、
比活性1×108単位/η・蛋白質以上を有する純粋な
物質である。
)で該イオン交換体を洗浄した後0.2〜0.4Mの緩
衝液(pH6,5〜7.5)で有効成分を溶出する。該
溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、1M〜4Mの
塩類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液(D116
.5〜7.5)で平衡化させたゲルll!f過剤、例え
ば5ephacryloS −300(Pharmac
ia ?LH)でゲル濾過し、分子量範囲が70.00
0〜150.000ダルトンの画分を回収する。次に該
画分を上記1M〜4M塩含有緩衝液で平衡化させた疎水
性親和体、例えばPhenyl−8epharose”
(Phar鴎acia社製)に吸着させ、0.5〜1
.0Mの塩含有緩衝液(pH16,5〜7.5)で溶出
する。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾
過カラム、例えばTSKG−3000SW (東洋11
Jj) でゲルW1”14し、分子量範囲が70.00
0〜150,000ダルトンの画分を回収する。該画分
を再度、濃縮し、0.1%トリフルオロ酢M(TFA)
溶液(pH1〜2)で平衡化した高速液体逆相カラム、
例えば、旧−PoreoRP −304(バイオラド社
製)に吸着させ、0.1%TFAを含む溶剤、例えばア
セトニトリル又はインプロパツールの直線濃度勾配溶出
法により溶出する。このようにして得られたC8Fは、
比活性1×108単位/η・蛋白質以上を有する純粋な
物質である。
(2)C8Fの理化学的性状
以上のようにして製造された本発明のC8Fは次のよう
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、実施例1の方、法により純化したC3Fを用
いた。
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、実施例1の方、法により純化したC3Fを用
いた。
(2) 分子量
還元剤の非存在下に、Laellll i (Nat
ure、 227巻、680−685頁、1970年)
の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分子mを測定すると、70,000
〜90,000ダルトンであった。
ure、 227巻、680−685頁、1970年)
の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分子mを測定すると、70,000
〜90,000ダルトンであった。
次に、0.2Mメルカプトエタノールで還元し、同様の
方法で測定すると、分子量35,000〜45.000
ダルトンのサブユニットに解離した(第1図)。
方法で測定すると、分子量35,000〜45.000
ダルトンのサブユニットに解離した(第1図)。
第1図は、本発明のC8Fのドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド電気泳動の泳動図であり、A〜Eは
非還元(2量体)、F、Gは分子量マーカー蛋白質、H
−Lは還元(ナブユニット)を示し、縦軸の数字は分子
1(x103ダルトン)を示す。
ポリアクリルアミド電気泳動の泳動図であり、A〜Eは
非還元(2量体)、F、Gは分子量マーカー蛋白質、H
−Lは還元(ナブユニット)を示し、縦軸の数字は分子
1(x103ダルトン)を示す。
■ サブユニット蛋白質のアミノ酸配列NH2−末端ア
ミノ酸配列は、純化C3Fを気相アミノ酸シーケンサ−
で常法により分析した。
ミノ酸配列は、純化C3Fを気相アミノ酸シーケンサ−
で常法により分析した。
次に純化C3Fを6Mグアニジンで変性させ、モノヨー
ド酢酸でアルキル化した後、脱塩し、トリプシン消化及
び臭化シアン分解を行なった。トリプシン消化及び臭化
シアン分解ペプチドをVydacC−18逆相高速液体
クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分
を得、各画分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンサ−で分
析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。トリプ
シン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配
列と本発明者らがクローニングしたmRNAの塩基配列
から、サブユニット蛋白質のアミノ酸−次構造を決定し
た。その結果は表1に示すとおりである。
ド酢酸でアルキル化した後、脱塩し、トリプシン消化及
び臭化シアン分解を行なった。トリプシン消化及び臭化
シアン分解ペプチドをVydacC−18逆相高速液体
クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分
を得、各画分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンサ−で分
析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。トリプ
シン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配
列と本発明者らがクローニングしたmRNAの塩基配列
から、サブユニット蛋白質のアミノ酸−次構造を決定し
た。その結果は表1に示すとおりである。
NH2−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から149
番目のグルタミンまでは、公知のC3F−1と同一であ
るが、150番目から214番目乃至238掻目までの
65個乃至89個のアミノ酸は、公知のそれと全く異な
っていた。
番目のグルタミンまでは、公知のC3F−1と同一であ
るが、150番目から214番目乃至238掻目までの
65個乃至89個のアミノ酸は、公知のそれと全く異な
っていた。
また、C0o−末端のアミノ酸としては、サブ]、ニッ
ト蛋白質の分子量に応じ214番目句プロリンが、そし
て238番目にリジンが検出された。
ト蛋白質の分子量に応じ214番目句プロリンが、そし
て238番目にリジンが検出された。
122番目と140番目のアスパラギンは、Asn−X
−3er/Thrの典型的なN−グリコシド結合構造を
有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定された
。ここにXは任意のアミノ酸を示す。
−3er/Thrの典型的なN−グリコシド結合構造を
有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定された
。ここにXは任意のアミノ酸を示す。
(へ) 糖鎖の構成単糖
ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解してMIllさせた後、高速液体クロマトグラフィー
で分析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラ
ム、ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液
濃度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギ
ニンによるポストカラム標識した後、ケイ光法により同
定した。本C3F分子に含有される糖鎖は不均一であり
、定恒することは困難であったが、構成単糖としてマン
ノース、ガラクトース、N〜ルアセチルグリコサミンN
−アセチルガラクトサミン及びN−アセチルノイラミン
酸が同定された。
解してMIllさせた後、高速液体クロマトグラフィー
で分析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラ
ム、ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液
濃度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギ
ニンによるポストカラム標識した後、ケイ光法により同
定した。本C3F分子に含有される糖鎖は不均一であり
、定恒することは困難であったが、構成単糖としてマン
ノース、ガラクトース、N〜ルアセチルグリコサミンN
−アセチルガラクトサミン及びN−アセチルノイラミン
酸が同定された。
(ロ) 等電点
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、p■は3.1〜3.7であった。
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、p■は3.1〜3.7であった。
(e) 円二色性(CD)スペクトル円二色性分散計
(JASCO社製J−600)で遠紫外部に於けるCD
スペクトルを測定したく第2図)。
(JASCO社製J−600)で遠紫外部に於けるCD
スペクトルを測定したく第2図)。
第2図は本発明のC8FのCDスペクトルを示し、横軸
は波長(ni)、縦軸は楕円率(mdeg )を示す。
は波長(ni)、縦軸は楕円率(mdeg )を示す。
波長208 nm及び222 nlにおいて穫少ピーク
がみとめられ、本C3Fの二次構造にα−ヘリックス構
造が含まれているものと推定された。
がみとめられ、本C3Fの二次構造にα−ヘリックス構
造が含まれているものと推定された。
(f’) 熱安定性
木C3Fを1μg/11!1!の濃度で、希薄緩衝液(
oH7,0)に溶解し、60±0.5℃で60分間加熱
し、そのコロニー刺激活性(侵述)を測定したが、活性
の低下はほとんど認められなかった。
oH7,0)に溶解し、60±0.5℃で60分間加熱
し、そのコロニー刺激活性(侵述)を測定したが、活性
の低下はほとんど認められなかった。
(ロ) 赤外線吸収スペクトル
本C8Fの凍結乾燥粉末について透過測定法(KBr窓
)によりツーり工変換赤外分光装置(Nicolet社
製5DXc)を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは
第3図に示すとおりであつ″た。
)によりツーり工変換赤外分光装置(Nicolet社
製5DXc)を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは
第3図に示すとおりであつ″た。
第3図の横軸は波数(u−1)を縦軸は透過率を示す。
本C8Fは1650α 、1201n−’及び1133
ctli に強い吸収、1537a 、1432G−
1及び1068crR−’に中程度の吸収を示した。
ctli に強い吸収、1537a 、1432G−
1及び1068crR−’に中程度の吸収を示した。
+31csFの生物学的活性
(20コロニー刺激活性及び比活性
本発明のC8Fのコロニー刺激活性は、マウス骨髄細胞
による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。C3F試料を0.3%寒天、20%牛脂児血清(F
e2)及びマウス骨髄細胞1×105個を含むHCCO
V’S 5 A培地11Ilと混合し、7.5%CO2
通気下、37℃で7日間培養した。培養後、50個以上
の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数
を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、1単位
は1コロニーを形成させるに必要なC8Ffftと規定
した。
による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。C3F試料を0.3%寒天、20%牛脂児血清(F
e2)及びマウス骨髄細胞1×105個を含むHCCO
V’S 5 A培地11Ilと混合し、7.5%CO2
通気下、37℃で7日間培養した。培養後、50個以上
の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数
を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、1単位
は1コロニーを形成させるに必要なC8Ffftと規定
した。
また比活性は、C8F蛋白質1穆当り形成されるコロニ
ー数(単位)で表わした。その結果、本発明のC8Fは
、1.4×108単位/1119・蛋白質の比活性を有
していた。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−
エオシン染色して形態学的に分類したところ、95%以
上のコロニーが単球−マクロファージから形成されてい
た。
ー数(単位)で表わした。その結果、本発明のC8Fは
、1.4×108単位/1119・蛋白質の比活性を有
していた。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−
エオシン染色して形態学的に分類したところ、95%以
上のコロニーが単球−マクロファージから形成されてい
た。
ti in vitro及びin vivoでのマウ
ス骨髄単球−マクロファージ系V?細胞(CFU−M)
の増殖に及ぼす促進作用 b−1) in vitro試験 C5,BLマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着
骨11i11111胞とし、20%FC8を含むHCC
oy“S5A培地へ1×106個/dの濃度に添加し、
本発明のC8FをO(対照)、100単位/d、500
単位/d、1.000単位/Id及び2.0OO11位
/dlの割合でそれぞれ加え、7.5%CO2通気下、
24時聞、37℃で培養した。培養後、各4!#髄細胞
を遠心法で洗浄した後、同じ培地で5倍に希釈し、各群
4枚のシ5ヤーレに、それぞれC3F1.000単位、
0.3%寒天及び20%FC8を含むHcCoy’s
5A培地1mに対して0.1−添加し、7.5%CO2
通気下、37℃で7日間培養した。培養後、50個以上
の細胞集塊を単球−マクロファージ系幹細II! (C
FU−M)と判定し、形成されたCFU−M数を計測し
た。その結果は表2に示すとおりであった。
ス骨髄単球−マクロファージ系V?細胞(CFU−M)
の増殖に及ぼす促進作用 b−1) in vitro試験 C5,BLマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着
骨11i11111胞とし、20%FC8を含むHCC
oy“S5A培地へ1×106個/dの濃度に添加し、
本発明のC8FをO(対照)、100単位/d、500
単位/d、1.000単位/Id及び2.0OO11位
/dlの割合でそれぞれ加え、7.5%CO2通気下、
24時聞、37℃で培養した。培養後、各4!#髄細胞
を遠心法で洗浄した後、同じ培地で5倍に希釈し、各群
4枚のシ5ヤーレに、それぞれC3F1.000単位、
0.3%寒天及び20%FC8を含むHcCoy’s
5A培地1mに対して0.1−添加し、7.5%CO2
通気下、37℃で7日間培養した。培養後、50個以上
の細胞集塊を単球−マクロファージ系幹細II! (C
FU−M)と判定し、形成されたCFU−M数を計測し
た。その結果は表2に示すとおりであった。
表2 in vitroのCFU−M増殖?進作用(
注)8及び0は、それぞれ5%及び1%の危険率で有意
の差があることを示す。
注)8及び0は、それぞれ5%及び1%の危険率で有意
の差があることを示す。
表2に示すようにC3Fの添加濃度に依存して、マウス
骨髄細胞中のCFU−M数は増加した。
骨髄細胞中のCFU−M数は増加した。
b−2) in vivo試験
C57Bシマウス(5匹/群)に対して体tt 1 K
g当り0(生理食塩液)、80X10’単位、160×
10 単位及び320X10’単位C8Fを1日1回、
連続3日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マ
ウスにより大腿骨骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌城
中の単球−マクロファージ系幹細胞(CFU−M)数を
、1.000単位のC8Fを刺激因子とする前記軟寒天
平板法によるコロニー形成試験で測定した。その結果は
表3及び表4に示すとおりであった。
g当り0(生理食塩液)、80X10’単位、160×
10 単位及び320X10’単位C8Fを1日1回、
連続3日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マ
ウスにより大腿骨骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌城
中の単球−マクロファージ系幹細胞(CFU−M)数を
、1.000単位のC8Fを刺激因子とする前記軟寒天
平板法によるコロニー形成試験で測定した。その結果は
表3及び表4に示すとおりであった。
表3 マウス骨髄CFU−M増殖促進作用(注)**は
1%の危険率で有意の差のあることを示す。
1%の危険率で有意の差のあることを示す。
表4 マウス牌臓CFU−M増殖促進作用(注)**は
1%の危険率で有意の差のあることを示す。
1%の危険率で有意の差のあることを示す。
表3及び表4に示す如(,80X10’単位/幻体重の
C3F投与により、骨髄及び牌臓でのCFU−Mの増加
が認められ、160X104単位/Ky体重以上の投与
では顕著な増加が認められた。
C3F投与により、骨髄及び牌臓でのCFU−Mの増加
が認められ、160X104単位/Ky体重以上の投与
では顕著な増加が認められた。
以上のような理化学的性質及び生物学的活性を有する本
発明のC8Fを公知の類似した物質と比較すると次のと
おりである。
発明のC8Fを公知の類似した物質と比較すると次のと
おりである。
本発明のC3Fは、C3F−1と同様に糖鎖を含む二本
のポリペプチドがジスルフィド結合し、生物学的に活性
なホモ2吊体から構成されていて分子量は、70.00
0〜90.000ダルトンであり、C3F−1のそれよ
りも大きい。更に、本発明のC8Fを構成しているサブ
ユニットのポリペプチドは、少なくとも214個乃至2
38個のアミノ酸を有し、分子124.000〜26゜
500ダルトンであり、C3F−1のそれの14゜00
0〜17,000ダルトンよりも大ぎい。また、サブユ
ニットのアミノ酸配列をC3F−1と比較すると、NH
2−末端の1番から149番目までのアミノ酸配列は同
じであったが、150番から214番目乃至238番目
までのアミノ酸配列はC3F−1のcDNAから推定さ
れるものと異なっており、C3F−1遺伝子上にコード
されていなかった。従って、本発明のC8Fは、一部C
3F−1と共通性を有するが、遺伝子的にも、構造的に
も、公知のC3F−1とは別個な因子であることが判明
した。また、前記公知の1−IGI−糖蛋白質及びCS
F −1−I Uとは、生物学的活性及び理化学的性
状が全く異なっている。
のポリペプチドがジスルフィド結合し、生物学的に活性
なホモ2吊体から構成されていて分子量は、70.00
0〜90.000ダルトンであり、C3F−1のそれよ
りも大きい。更に、本発明のC8Fを構成しているサブ
ユニットのポリペプチドは、少なくとも214個乃至2
38個のアミノ酸を有し、分子124.000〜26゜
500ダルトンであり、C3F−1のそれの14゜00
0〜17,000ダルトンよりも大ぎい。また、サブユ
ニットのアミノ酸配列をC3F−1と比較すると、NH
2−末端の1番から149番目までのアミノ酸配列は同
じであったが、150番から214番目乃至238番目
までのアミノ酸配列はC3F−1のcDNAから推定さ
れるものと異なっており、C3F−1遺伝子上にコード
されていなかった。従って、本発明のC8Fは、一部C
3F−1と共通性を有するが、遺伝子的にも、構造的に
も、公知のC3F−1とは別個な因子であることが判明
した。また、前記公知の1−IGI−糖蛋白質及びCS
F −1−I Uとは、生物学的活性及び理化学的性
状が全く異なっている。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
健常人の尿2001をD118.5に調整し、沈澱物を
濾過除去し、分画分子型50.000ダルトンの限外濾
過膜(アミコン社、H10X50)で濃縮と脱塩を行っ
た。次に、濃縮液をpH7,0に調整し、密封容器中で
60℃、10時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離(5
,0OOxa 30分間)して沈澱物を除去した後、
0.02Mリン酸緩衝液(pH7,2>で平衡化したD
EAE−セルロースと混合し、吸着させた。DEAE−
セルロースを0.02Mリン酸緩衝液、0.05M食塩
添加0.02Mリン酸緩衝液(D117.2)で洗浄し
た後、0.25M食塩添加緩衝液(pH7,2)で溶出
させた。溶出液を限外濾過膜(アミコン社H1P10)
1”濃縮して、5ephacryi S −300(フ
ァルマシア社、φ4 x 80 rs )を用い、1M
硫安添加緩衝液(pH7,2)でゲル濾過した。ゲル濾
過での分子量範囲70.000〜150.000ダルト
ンの画分を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化したphe
nyl−3epharose 4 Bカラム(ファルマ
シア社製、φ2 x 20 as、 )に吸着させ、次
いで0.5M硫安添加緩衝液(pH7,2)で溶出さけ
た。溶出液を限外濾過膜(層化成製、NM−3)で濃縮
して、TSKG−3,0OO8Wカラム(東洋四速製、
φ4X600mX2)で高速液体クロマ]−グラフィー
にかけ、分子量範囲70,000・〜150,000ダ
ルトンの画分を得た。こノ画分ヲ再度濃縮し、旧−Po
re RP −304(バイオラド社製、φ4X15
0mg+)の逆相カラムで0.1%トリフルオロ酢酸を
含む、アセトニトリル0−100%(pH2,o)の直
線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、
C3Fを溶出し、精製された比活性1.4×108単位
/句・蛋白質のC8Fを得た。上記製造工程の各ステッ
プにおけるC8Fの精製度は表5に示すとおりであった
。
濾過除去し、分画分子型50.000ダルトンの限外濾
過膜(アミコン社、H10X50)で濃縮と脱塩を行っ
た。次に、濃縮液をpH7,0に調整し、密封容器中で
60℃、10時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離(5
,0OOxa 30分間)して沈澱物を除去した後、
0.02Mリン酸緩衝液(pH7,2>で平衡化したD
EAE−セルロースと混合し、吸着させた。DEAE−
セルロースを0.02Mリン酸緩衝液、0.05M食塩
添加0.02Mリン酸緩衝液(D117.2)で洗浄し
た後、0.25M食塩添加緩衝液(pH7,2)で溶出
させた。溶出液を限外濾過膜(アミコン社H1P10)
1”濃縮して、5ephacryi S −300(フ
ァルマシア社、φ4 x 80 rs )を用い、1M
硫安添加緩衝液(pH7,2)でゲル濾過した。ゲル濾
過での分子量範囲70.000〜150.000ダルト
ンの画分を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化したphe
nyl−3epharose 4 Bカラム(ファルマ
シア社製、φ2 x 20 as、 )に吸着させ、次
いで0.5M硫安添加緩衝液(pH7,2)で溶出さけ
た。溶出液を限外濾過膜(層化成製、NM−3)で濃縮
して、TSKG−3,0OO8Wカラム(東洋四速製、
φ4X600mX2)で高速液体クロマ]−グラフィー
にかけ、分子量範囲70,000・〜150,000ダ
ルトンの画分を得た。こノ画分ヲ再度濃縮し、旧−Po
re RP −304(バイオラド社製、φ4X15
0mg+)の逆相カラムで0.1%トリフルオロ酢酸を
含む、アセトニトリル0−100%(pH2,o)の直
線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、
C3Fを溶出し、精製された比活性1.4×108単位
/句・蛋白質のC8Fを得た。上記製造工程の各ステッ
プにおけるC8Fの精製度は表5に示すとおりであった
。
実施例2
実施例1の方法で5cphacryl S −300を
TSKG−3,0OO8W (東洋曹達、HLC−83
7) 、Dhcnyl −5epharosc 4 B
をTSKphcnyl −5p w (東洋曹達)にか
えて、全て高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。得られたC3Fは、比活性1.5X108単位/qで
あり、回収率も実施例1と同等であった。
TSKG−3,0OO8W (東洋曹達、HLC−83
7) 、Dhcnyl −5epharosc 4 B
をTSKphcnyl −5p w (東洋曹達)にか
えて、全て高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。得られたC3Fは、比活性1.5X108単位/qで
あり、回収率も実施例1と同等であった。
第1図は本発明のC8FのドデシルliiltMナトリ
ウム・ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE
)の泳動図であり、第2図及び第3図はそれぞれ本発明
C8Fの遠紫外部CDスペクトル及び赤外線吸収スペク
トルを示す。 第1図において、
ウム・ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE
)の泳動図であり、第2図及び第3図はそれぞれ本発明
C8Fの遠紫外部CDスペクトル及び赤外線吸収スペク
トルを示す。 第1図において、
Claims (2)
- (1)哺乳類動物の単球−マクロファージ系細胞のコロ
ニー形成刺激作用を有し、次の理化学的性質を有するこ
とを特徴とするコロニー刺激糖蛋白質。 a)分子量 同一のサブユニット2個から成るホモ2量体であつて、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が70,000〜90,000ダ
ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、35
,000〜45,000ダルトンである。 b)サブユニットのアミノ酸配列 ホモ2量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
214個乃至238個のアミノ酸配列を有し、122番
目及び140番目のアスパラギン(Asn) 【アミノ酸配列があります】 はそれぞれアスパラギン(Asn)−X−スレオニン(
Thr)/セリン(Ser)で表わされる典型的なN−
グリコシド結合部位を有する、ここでXは任意のアミノ
酸を示す。 c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点(pI
)は3.1〜3.7である。 d)糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラ
クトサミン及びN−アセチルノイラミン酸である。 e)円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長2
08nm及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、
α−ヘリックス構造を含んでいる。 f)熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。 g)赤外線吸収スペクトル 第3図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。 - (2)人尿をpH8〜9に調整し、不溶物を沈殿せしめ
、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも200倍
以上に濃縮した後、pHを6.5〜7.5に調整し、6
0℃で10時間加熱処理し、沈殿物を遠心除去後、陰イ
オン交換体に吸着させ、0.2〜0.4M緩衝液で溶出
させ、次いで1〜4M緩衝液中でゲル濾過して分子量7
0,000ダルトン以上の画分を回収し、該画分を疎水
性親和体に吸着させ、0.5〜1Mの緩衝液で溶出させ
、該溶出物を高速液体ゲル濾過にかけ、分子量70,0
00〜150,000ダルトンの画分を回収し、該画分
をpH1〜2に調整して逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、有効成分を溶出せしめることを特徴とする哺
乳類動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー刺激
性糖蛋白因子の製造法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62083037A JPS63250400A (ja) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
EP87310739A EP0276551B1 (en) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Colony-stimulating factor and method for preparation thereof |
AT87310739T ATE73825T1 (de) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
DE8787310739T DE3777623D1 (de) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
AU82181/87A AU606099B2 (en) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Colony-stimulating factor and method for preparation thereof |
KR1019880003849A KR960005731B1 (ko) | 1986-12-07 | 1988-04-06 | 군락-자극 인자 및 그의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62083037A JPS63250400A (ja) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63250400A true JPS63250400A (ja) | 1988-10-18 |
Family
ID=13791016
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62083037A Pending JPS63250400A (ja) | 1986-12-07 | 1987-04-06 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63250400A (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61291294A (ja) * | 1985-06-18 | 1986-12-22 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 水中物の引上げ方法およびその装置 |
-
1987
- 1987-04-06 JP JP62083037A patent/JPS63250400A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61291294A (ja) * | 1985-06-18 | 1986-12-22 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 水中物の引上げ方法およびその装置 |
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