JPH0731482A - 組換ヒト単球成長因子、及びこれをコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト単球末梢血単球の分化・増殖を誘導する
組換ヒト単球成長因子、その部分的アミノ酸配列、及び
これをコードするＤＮＡ配列。ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ
−３０Ｌｕから得られたｃＤＮＡよりヒト単球成長因子
の全ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が決定されたものであ
り、ヒトフェリチンＨ鎖と同じＤＮＡ配列及びアミノ酸
配列を有する。また組換ヒト単球成長因子の製造方法を
併せて提供する。 【効果】 単球の関与する生体防御反応を促進する薬剤
としての用途が期待できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト末梢血単球の分化・
増殖を誘導する組換ヒト単球成長因子、その部分的アミ
ノ酸配列、及びこれをコードするＤＮＡ配列に関するも
のである。また本発明は組換ヒト単球成長因子の製造方
法に関する。

【０００２】

【発明の背景】血液幹細胞は分化して、いろいろな機能
を持った細胞になる。このような細胞は多能性幹細胞と
よばれ、その増殖や分化には特定の増殖因子や分化因子
を必要とする。血液幹細胞から顆粒球やマクロファージ
への分化には以下の４つのＣＳＦ（colony stimulating
factor:コロニー刺激因子）が必要であることが知られ
ている。１つ目は、インターロイキン３（interleukin
3: IL3) として知られる多能性（multi)−ＣＳＦであ
り、顆粒球、マクロファージ及びそれらの前駆細胞を分
化・増殖させる。２つ目は、顆粒球を分化・増殖させる
顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、３つ目は、マクロファー
ジを分化・増殖させるマクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）、４つ目は、顆粒球とマクロファージの両方の細胞
系列の増殖を促進する顆粒球・マクロファージＣＳＦ
（ＧＭ−ＣＳＦ）である。

【０００２】これら４つのＣＳＦは、マウスのものにつ
いてはその構造も、ＤＮＡ配列も明らかになっている
（Metcalf.D., Science,229,16,(1985);岡部哲郎ほか：
医学の歩み,135,1037,(1985))。ヒト由来のＣＳＦもその
殆んどは、マウスのＣＳＦと同様の機能、構造を有す
る。しかし、ヒトマクロファージを刺激するようなヒト
由来のＭ−ＣＳＦは見い出されていない。例えば、ヒト
由来のＭ−ＣＳＦはマウスＭ−ＣＳＦと相同で免疫的に
も交叉反応を示し、マウスの骨髄細胞に対しＣＳＦ活性
を有する。しかしヒトの骨髄細胞にはＣＳＦ活性を示さ
ない（臨床科学, 22,255,(1986), Dao.S.K.et al.,Bloo
d, 58,630,(1981)) 。

【０００３】一方、ヒト末梢血液の単球は分裂・増殖し
ない細胞と一般に考えられていたものであるが、発明者
らはレクチンで刺激したリンパ球細胞の培養液中にヒト
単球を増殖・分化させる液性因子を見出し、末梢血液の
単球も分裂・増殖することを明らかにしている（Bioche
m.Biophys.Res.Commun.,125,705-711,(1985)）。この液
性因子はリンパ球細胞培養液中の分子量25,000と60,000
の２つの分画に存在し、また抗Ｍ−ＣＳＦ抗体や抗ＧＭ
−ＣＳＦ抗体でその活性が部分的に吸収される。従って
この液性因子はＭ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどの種々の
液性因子の混合物であって、その機構は不明であるが、
これらの共働作用によってヒト単球の増殖・分化を刺激
するものと考えられる。

【０００４】このような状況下において、発明者の一人
は、ヒト末梢血液の単球の増殖・分化を起す蛋白性因子
をヒト肺ガン細胞株の培養液中に見出し，これを単独物
質として純化し、その生理活性を調べたところ、既知の
ＣＳＦやγ−インターフェロンとも異なる新規生理活性
物質であることを確認した（特開平3-145499、Okabeet
al., Cancer Research, 5,pp3863-3865,(1990) ）。

【０００５】この新規生理活性物質すなわちヒト単球成
長因子（ＭｏＧＦ）は、ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３０
Ｌｕからその培養液中に産生されるの蛋白性因子であ
り、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動により単一バンド
を示す単独物質であった。その分子量は電気泳動上、1
2.5％アクリルアミドゲル濃度で約21,000ダルトン、20
％アクリルアミドゲル濃度で約24,000ダルトンであっ
た。このヒト単球成長因子は単球の関与する生体防御反
応を促進する薬剤としての用途が期待でき、種々の感染
防御、免疫機能亢進、マクロファージの関与するガン免
疫の亢進などの作用を有する薬剤としての用途を提供す
るものである。

【０００６】発明者らはさらに、ｃＤＮＡクローニング
を試みた。すなわち、このヒト単球成長因子の部分的ア
ミノ酸配列の解析から、ヒト単球成長因子とヒトフェリ
チンＨ鎖との相同性を見いだし、ヒトフェリチンＨ鎖の
ＤＮＡ配列からプライマー配列を選択してｃＤＮＡクロ
ーニングを行った。その結果、ヒト単球成長因子の全ア
ミノ酸配列と、これをコードする核酸配列を明らかにす
ることに成功した。

【０００７】

【発明の目的】従って本発明の目的は、ヒト末梢血単球
の分化・増殖を誘導する組換ヒト単球成長因子、その部
分的アミノ酸配列、及びこれをコードするＤＮＡ配列を
提供することにある。また本発明の目的は組換ヒト単球
成長因子の製造方法を提供することにある。

【０００８】

【発明の構成】本発明の組換ヒト単球成長因子は図１に
示される１８３個のアミノ酸からなる部分的アミノ酸配
列を有する。

【０００９】また本発明の組換ヒト単球成長因子をコー
ドするＤＮＡ配列は図２に示される５４９塩基である。
ただし本発明のＤＮＡ配列では図２のＤＮＡ配列に限ら
れず、図１に示した部分的アミノ酸配列をコードし得る
ＤＮＡ配列をすべて含むものである。図２に示したＤＮ
Ａ配列は、後述するように、ヒト単球成長因子（ＭｏＧ
Ｆ）を産生するヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕのｍ
ＲＮＡより得たｃＤＮＡ配列である。

【００１０】さらに、ヒト単球成長因子をコードするＤ
ＮＡで形質転換された宿主細胞を、発現可能な条件下で
培養し、産生されたヒト単球成長因子を採取することに
より、組換ヒト単球成長因子の製造することができる。
ヒト単球成長因子をコードするＤＮＡは適当なプロモー
タ、ターミネータ、シグナル配列など、さらに必要に応
じて適当なマーカー遺伝子をつけてベクターに組み込む
ことができる。ベクターは宿主培養細胞で機能するもの
であればどのような種類のものでもよい。これらの発現
ベクターの構築、細胞内発現などは全て慣用技術で行う
ことができる（参考、Maniatis et al, "Molecular Clo
ning: A laboratory manual" Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))。

【００１１】

【実施例１】ヒト単球成長因子の精製 特開平3-145499記載の方法に従って、ヒト肺ガン細胞株
Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕの培養濾液（conditioned medium）を
集めて本因子を精製した。ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３
０Ｌｕは、発明者らにより肺の大細胞ガン（large cell
carcinoma）から樹立された細胞株であり、発明者の研
究室において継代培養させたものであり、この細胞株が
本発明のヒト単球成長促進因子を産生する。この細胞株
は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（受託番号：微工研条寄第３１２０号（FERM BP-312
0）。

【００１２】Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞を10％ＦＢＳ（胎児
牛血清）添加Ｆ−１０培地でコンフルエント（confluen
t)に成長させた後、培地を無血清培地（Dulbecco変法Ea
gle培地(DMEM)：Ｆ−１０培地＝３：１）に交換した。
１週間ごとに新鮮無血清培地と交換し、その培養濾液
（conditioned medium）１２２０Ｌを集めた。以下１２
０Ｌずつ以下の処理を行った。

【００１３】この培養濾液を、まずホローファイバーフ
ィルターSEP-1013（旭化成社製；分子量3000）で低分子
量成分を除去し、50倍に濃縮した。この濃縮培養液をpH
7.5で硫安分画した。30〜60％の飽和硫安による沈澱を
遠心（35,000g,30分間）により集めた。この沈澱を50mM
Tris-HCl(pH7.5 ）に溶解後、遠心して不溶成分を除去
し、遠心上清をホローファイバーＩ５Ｐ（旭化成社製、
分画分子量 6,000）で限外濾過し、１０倍に濃縮した。

【００１４】この濃縮液200 μｌをスーパーロース１２
カラム（HR 10/30, Pharmacia LKBBiotechnology 社製)
にてゲル濾過した。このカラムをＦＰＬＣ（fast perf
ormance liquid chromatography; Pharmacia LKB Biote
chnology 社製）に装着し、50mM Tris-HCl(pH 7.5）を
流速１ml/ 分で流し、ＭｏＧＦ活性を有する分画を集め
た。集めた分画は、ホローファイバーＳＥＰ００１３
（旭化成社製、分画分子量 3,000）にて１０倍に濃縮
し、遠心（30,000g, 30 分, 4 ℃）で不溶成分を除去し
た後、モノ−Ｑカラム（HR 5/5, Pharmacia LKB Biotec
hnology 社製) に直接アプライしてイオン交換クロマト
グラフィーを行なった。カラムは50mM Tris-HCl （pH7.
5 ）で、溶出開始後15分までは 0-200mMのNaClの直線濃
度勾配をつけ、15分から30分までは200 mM NaCl, 30 分
から45分までは200-400mM NaClの濃度勾配をつけて流速
１ml/ 分で溶出した。ＭｏＧＦ活性が認められる分画
（約280mM NaClにより溶出される分画）を集めた。

【００１５】次に、この活性画分を逆相ＨＰＬＣでさら
に精製した。東洋曹達社製ＨＬＣ−８０３Ｄ ＨＰＬＣ
システムに装着したVydac C₄カラム（4.6 ×250mm ；Th
e Separations Group 社製）にモノ−Ｑカラムの活性分
画を直接アプライした。0.1%トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）を10分間流してカラムを洗浄した後、0.1%ＴＦＡに
対して30分間で０−90％アセトニトリルで直線濃度勾配
により流速0.5ml/分で溶出し、0.5 mLづつ分画した。Ｍ
ｏＧＦ活性を有する分画（65％アセトニトリルで溶出さ
れた分画）を集め、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動
（アクリルアミド濃度２０％）で分析したところ、単一
バンドを示し、その分子量は約24,000であった。

【００１６】

【実施例２】ヒト単球成長因子の部分的アミノ酸配列の解析 実施例１で得られたヒト単球成長因子（ＭｏＧＦ）精製
品（逆相ＨＰＬＣの活性分画）を、Cleveland et al
(J. Biol. Chem., 252, pp1102-1106 (1977)) の方法に
従い、電気泳動ゲル内で限定分解し、得られた分解物の
アミノ酸配列を解析した。

【００１７】すなわち、まず逆相ＨＰＬＣの活性分画を
凍結乾燥し、ゲル濃度20％でSDS-ポリアクリルアミド電
気泳動を行った。このゲル濃度ではヒト単球成長因子
（ＭｏＧＦ）は約２４ＫＤの位置に泳動される。この２
４ＫＤのバンド（約１５μｇの蛋白を含有）を切出し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの緩衝液で１時間平衡化した。平衡化
したゲルは、第２のＳＤＳ電気泳動ゲルのレーンに載
せ、さらにそのレーンにＶ８プロテアーゼを３０μｇ加
えた。電気泳動を開始して、色素の先端がスタッキング
・ゲルの１／２の位置まで泳動された時点で、通電を止
め、そのまま３７℃１時間インキュベートした。これに
よりスタッキング・ゲル内で、蛋白限定分解が行われ
る。その後再び通電して電気泳動を行い、分解産物を分
離した。

【００１８】第２のＳＤＳ電気泳動ゲル上の分解産物
は、Towbin et alの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
6, pp4350-4354, (1979))に従ってエレクトロ・ブロッ
トにより、polyvinylidene difluoride 膜へ転写した。
分解産物は分子量２．５ＫＤ〜１２ＫＤにわたって１４
本のバンドに別れていた。この１４本のバンドをそれぞ
れ切出し、各バンド中の分解産物のアミノ酸配列を、ア
ミノ酸自動分析装置（ABI477A Protein Sequencer, 120
A Analyzer; Applied Biosystems 社製）を用いて、そ
れぞれＮ末端より順次解析した。解析結果を表１、２に
示す。表中「xxx 」は不明のアミノ酸残基である。該当
箇所に複数のアミノ酸残基の可能性があるものについて
はその全てを各該当箇所の下に列記した。

【００１９】

【表１】 ─────────────────────────────────── Ｎ末端よりのアミノ酸配列 ─────────────────────────────────── No.1 Val Ile Leu Pro Asn Asn Asp Arg His Gln Ile ・・ Pro Asn No.2 Val Ile Leu Pro Asn Asn Asp Arg ・・・ Pro No.3 Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu xxx xxx Tyr Ala ・・・・ Asp Asp Asp Glu No.4 xxx Ala Leu xxx Leu Glu Lys ・・・・・ Ile Ile Glu His Ile No.5 Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu ・・ No.6 Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys ・・ No.7 xxx Ala Leu His Ala Glu Lys Asn Val Asn Gln xxx Leu ・・・・ Pro Leu Val Lys ───────────────────────────────────

【００２０】

【表２】 ─────────────────────────────────── Ｎ末端よりのアミノ酸配列 ─────────────────────────────────── No.8 xxx Ile Pro His Glu Glu Lys Asn ・・・・・ Leu Leu Phe Lys Leu No.9 Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn ・・ Pro Glu Asn Tyr Pro No.10 Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu xxx Asp − Ile Asp Asn − Phe Ile Glu・・・ Tyr Pro Pro Val Glu No.11 Val Ile Leu Pro ・・・ No.12 Val Ile Leu Pro ・・・ No.13 Val Ile Leu Pro ・・・ No.14 Val Ile Leu Pro ・・・ ───────────────────────────────────

【００２１】得られた各バンドのアミノ酸配列を、デー
タベースを使用して、既知たんぱく質のアミノ酸配列と
比較した。バンドNo. １，２，１１〜１４は蛋白限定分
解に使用したＶ８プロテアーゼのＮ末端部に対応するも
のであり、Ｖ８プロテアーゼ由来の断片と考えられた。
一方、バンドNo. ３〜１０の８つの分画断片はいずれ
も、図３に示すヒトフェリチンＨ鎖（Ferritin Heavy C
hain) のアミノ酸配列（Boyd et al., J. Biol. Chem.
260, pp 11755-11761, (1985) ）と極めてよい一致を見
た。

【００２１】すなわち、バンドNo. ３の分解産物は図３
に示すヒトフェリチンＨ鎖の１９位のアラニン以降のア
ミノ酸配列と一致していた。またバンドNo. ４とバンド
No.７の分解産物はフェリチンＨ鎖の１０３位のシステ
イン以降のアミノ酸配列とよく一致していた。バンドN
o. ５、６、９、１０の分解産物はフェリチンＨ鎖の１
１８位のロイシン以降のアミノ酸配列とよく一致してい
た。バンドNo. ８の分解産物はフェリチンＨ鎖の１０３
位のシステイン以降のアミノ酸配列と相同性が見られ
た。

【００２２】以上の結果からヒト単球成長因子（ＭｏＧ
Ｆ）はヒトフェリチンＨ鎖と同一のものであることが強
く示唆された。そこで、ＭｏＧＦ産生細胞であるヒト肺
ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３０ＬｕからヒトフェリチンＨ鎖の
ｃＤＮＡクローニンを行い、得られるヒトフェリチンＨ
鎖にＭｏＧＦ活性があるかどうかを以下検証した。

【００２３】

【実施例３】ヒトフェリチンＨ鎖のｃＤＮＡクローニング ：Ｔ３Ｍ−
３０Ｌｕ細胞の全ｍＲＮＡを鋳型にして、以下のよう
に、ヒトフェリチンＨ鎖のｃＤＮＡを得て、これをＰＣ
Ｒ（Polymerase Chain Reaction ）により増幅した。

【００２４】Hentze et al（ Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
83, pp7226-7230 (1986) ）により明らかにされている
ヒトフェリチンＨ鎖遺伝子のＤＮＡ配列（図４参照）か
ら、５’末端側の２０塩基をプライマー１に、その相補
鎖の５’末端２０塩基をプライマー２に採用し、ＰＣＲ
に使用する各20mer のプライマーを合成した。

【００２５】

【表３】 ────────────────────────── プライマー１ 5' TCTCCTTAGTCGCCGCCATG 3' プライマー２ 3' GTTCCGTCACGTACGTACAA 5' ──────────────────────────

【００２６】Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞の培養物から、常法
（Analytical Biochemistry, 162,pp156-159 (1987)）
に従って、全ｍＲＮＡ（11.3μg ）を調製した。これを
鋳型にして、Amersham社製ｃＤＮＡ合成システム「プラ
スファーストストランドｃＤＮＡ合成」表３のプライマ
ー２をＤＮＡプローブとして使用し逆転写酵素によりｃ
ＤＮＡの第１鎖を合成した。反応系はAmersham社製ｃＤ
ＮＡ合成システム「プラスファーストストランドｃＤＮ
Ａ合成」の１μｇｍＲＮＡの系を使用した。

【００２７】得られたｃＤＮＡを鋳型としてプライマー
１、２を用いて、ｔＴＨポリメラーゼを使用してＰＣＲ
反応を行い、両プライマー間の塩基配列を有するｃＤＮ
Ａを増幅した。すなわち、先のｃＤＮＡ合成反応の反応
液２０μL のうち５μL を取り、これに、１０×ＰＣＲ
バッファーを１０μL 、５ｍＭｄＮＴＰｓを４μL 、各
プライマーは２０ OD/mL の濃度で１μL ずつ、ｔＴＨ
ポリメラーゼ（TOYOBO社製）を１μL 、Perfect mathch
（TOYOBO社製）を１μL 、蒸留水を７７μL 加えて反応
させた。反応は９５℃で５分間行った後、９５℃で１分
間、５５℃で５分間、７５℃で３分間のサイクルで４０
サイクル行った。ＰＣＲ反応終了後、反応液をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、ヒトフェリチンＨ鎖遺伝子の塩
基数に相当する泳動位置のバンドを切出し、ヒトフェリ
チンＨ鎖遺伝子をアガロースゲルから抽出した。

【００２８】得られたヒトフェリチンＨ鎖ｃＤＮＡを、
クローニングベクターであるBlue Script SK+ (Stratag
en:TOYOBO 社製）のマルチクローニングサイト（ＭＣ
Ｓ）にあるＥcoＲＶ部位（平滑末端である）に挿入し、
サブクローニングを行った（図５参照）。得られた２３
クローン中、６クローンのｃＤＮＡインサートについて
ＤＮＡ配列を確認したところ、２クローンがヒトフェリ
チンＨ鎖ｃＤＮＡを有していた。そのうちのひとつのク
ローンpBS(Ferritin H)36 を、以下の発現ベクターの構
築に使用した。

【００２９】

【実施例４】発現ベクターの構築 ：大腸菌用発現ベクターとして、ヒ
トフェリチンＨ鎖と菌体タンパクとの分離を容易にする
ため、アフニティ精製が可能なヒュージョン蛋白を発現
するｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia 社製； Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 83, 8703,(1986)及びNature,338, 585, (19
89) を参照）を使用した。このｐＧＥＸ−２Ｔはグルタ
チオンＳトランスフェラーゼ（以下ＧＳＴという）との
融合蛋白質を発現するベクターである。ベクターｐＧＥ
Ｘ−２ＴをＳmaＩ、ＥcoＲＩで処理して、マルチクロー
ニングサイト（ＭＣＳ）にあるＳmaＩ−ＥcoＲＩ領域を
取り除いて、ベクターを開いた。一方、先に得られたｃ
ＤＮＡクローンpBS(Ferritin H)36 をＨagＩで処理後、
Klenow断片で平滑末端とし、その後ＥcoＲＩで消化し
た。得られた断片をベクターｐＧＥＸ−２ＴのＳmaＩ−
ＥcoＲＩ領域に挿入した（図６参照）。得られた発現ベ
クターｐＧＥＸ(Ferritin H)３のＤＮＡ挿入部位のフレ
ームはＤＮＡ配列解析により確認したところ、図７に示
すものであった。

【００３０】

【実施例４】ヒトフェリチンＨ鎖の発現 ：大腸菌JM109 を発現ベクタ
ーｐＧＥＸ(Ferritin H)３でトランスフォーメーション
して発現用菌株を得た。この菌株をＬＢ培地で一晩増殖
させた後、１００倍量のＬＢ培地に加え、さらに３７℃
で振盪培養した。培養液の吸光度（Ａ₆₀₀ ）が０．５と
なった時点で、ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D(-)-thiogala
ctopyranoside ）を終濃度１ｍＭとなるように加え、そ
の後さらに４時間培養を続けた。なおＩＰＴＧはＧＳＴ
融合蛋白質を発現させるために加えるものである。

【００３１】ヒトフェリチンＨ鎖の精製：７Ｌの培養液
を遠心（8000 rpm, 10分, ４℃）して、菌体を集めた。
得られた菌体は、700 mLの20mM燐酸緩衝液(pH7.2)、 150
mM NaCl 、１％Triton X-100に懸濁した後、ソニケーシ
ョンにより菌体を破砕し、発現物を可溶化させた。1000
0rpm, 10 分, ４℃の条件で遠心して固型夾雑物を取り
除いた後、得られた上清に20mLのグルタチオン・セファ
ロース４Ｂビーズ（Glutathion Sepharose 4B beads: P
harmacia社製）を懸濁させ、４℃で１時間静かに攪拌し
た。これによりグルタチオン・セファロース４Ｂビーズ
に融合蛋白質を吸着させた。軽く遠心して回収したゲル
・ビーズを100mL のＰＢＳで３回洗浄した。その後10mL
の50mM Tris-HCl(pH8.0),15mM グルタチオン溶液で数回
溶出し、ＧＳＴと融合している融合蛋白質を得た。

【００３２】得られた溶出液に、CaCl₂ を終濃度2.5mM
となるように加えた後、溶出液中の蛋白質の１／３０量
のトロンビンを加え、２５℃で１時間半処理した。これ
により、融合蛋白質をＧＳＴ部分とクローン蛋白（すな
わちヒトフェリチンＨ鎖）部分とに切断した。ＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸）を終濃度１０ｍＭ加えてト
ロンビン消化を停止した後、４℃下でＰＢＳで透析し
た。透析後の溶液は約７５ｍＬであり、その蛋白濃度は
約１００μｇ／ｍＬであった。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけたところ、ヒトフェリチンＨ鎖相当蛋白質の純度
は約２０％であった。

【００３３】ヒトフェリチンＨ鎖以外の夾雑蛋白を除去
するため、透析後の溶液を７５℃で５分間熱処理し、夾
雑蛋白を熱変性・沈澱させた。遠心（10000 g,５分）に
より沈澱した蛋白を除去してサンプルＡを得た。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで確認したところ、主バンド（ヒトフェリチ
ンＨ鎖に相当する蛋白質）は９５％以上となった。この
主バンドを切出し、その蛋白のＮ末端領域についてアミ
ノ酸配列解析を前記方法と同じようにして行ったとこ
ろ、その配列は既報のヒトフェリチンＨ鎖アミノ酸配列
（図３）と一致していた。従って、サンプルＡは純度９
５％以上のヒトフェリチンＨ鎖を含有することが確認で
きた。続いてサンプルＡを用いてＭｏＧＦ活性のアッセ
イを行い、ヒトフェリチンＨ鎖にＭｏＧＦ活性があるか
どうかを調べた。

【００３４】なお比較例として、ヒトフェリチンＨ鎖遺
伝子を挿入していないベクターｐＧＥＸ−２Ｔを用い
て、大腸菌JM109 を形質転換し、以下その発現、その後
の精製（すなわちグルタチオン・セファロース４Ｂビー
ズによる融合蛋白質の吸着及び溶出、トロンビン処理、
熱処理など）を、上記ｐＧＥＸ(Ferritin H)の場合と全
く同様に操作してサンプルＢを得た。このサンプルＢに
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほとんど蛋白は存在しなかった
が、比較のためのこのサンプルＢについてもＭｏＧＦ活
性のアッセイを行った。

【００３５】

【実施例５】ＭｏＧＦ活性のアッセイ（１）： 単球成長因子（ＭｏＧ
Ｆ）活性は、培養プレート（Falcon 3047)に播種１２日
後の単球の生存率を計数することにより測定した。

【００３６】ヒト末梢血の単核細胞は、健康成人血液よ
りFicoll液を用いて採取した（P.Edelson, Z.A. Cohe
n,"In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Imm
unity"(B.R.Bloom and J.R. David編),p333, (1976) Ac
ademic Press, New York)。この単核細胞をハム（Ham'
s)Ｆ−10培地（１％自己血清添加）に懸濁し、 1×10⁶
細胞／ウェルの割合で培養プレート（Falcon 3047)に播
種し、５％炭酸ガス培養器内で４時間培養した。その
後、各ウェルをＦ−10培地で洗浄し、非付着細胞を除去
した。ウェルに付着した細胞の95％以上が、α−ナフチ
ル−ブチレート−エステラーゼ陽性で、ラテックス粒子
に対する貪食能を示す単球であった。

【００３７】このウェル付着細胞を５％炭酸ガス培養器
内で１２日間培養した。培地にはＦ−１０培地（１％自
己血清添加）を使用し、培養開始の翌日に測定試料１０
０μｌ（終濃度は表４に示すとおり）を各ウェルに添加
した。

【００３８】単球の細胞数の測定は、Nakagawara and Na
thanの方法（J.Immunol.Method, 56,261,(1983) ）に従
い、核を計数することにより行なった。すなわちヒト単
球を３７℃で５％炭酸ガス培養器内で１２日間培養後、
各ウェルから培地を取り除き、ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄
した後、0.1 ％クエン酸、0.05％ナフトールブルーブラ
ック、１％臭化セチルトリメチルアンモニウム（cetylt
rimethylammonium bromide）溶液を１００μL 添加し、
３７℃で３０分間処理し、ピペット操作により細胞の核
を浮遊させた。この浮遊した核を血球計数板により、位
相差顕微鏡下で計数して細胞数とした。単球播種１日後
にウェルに付着していた細胞数の数を１．０として、培
養１２日後のウェルに付着していた細胞数の割合を単球
生存率として計測した。なお測定はデュプリケートで行
い、平均値をとった。結果を以下の表４に示す。

【００３９】

【表４】 単球生存率： ────────────────────────────────── 試料濃度（終濃度） 2000 500 125 31 8 2 0.5 （ng/mL) ────────────────────────────────── 1) サンプルＡ 0.33 0.40 0.72 0.61 0.70 0.51 0.25 pGEX(Ferritin H)３ ────────────────────────────────── 2) サンプルＢ 0.27 0.22 0.21 0.24 0.23 0.21 0.20 pGEX-2T ────────────────────────────────── コントロールの単球生存率 3) スーパーロース活性分画 ： 0.70 （フェリチンＨ鎖換算で終濃度10 ng/mL） 4) 試料未添加（自己血清のみ） ： 0.33 ──────────────────────────────────

【００４０】表４に示すように、試料未添加の場合（表
中の2)）では、１２日培養によりウェル付着単球は培養
１日目から０．３３まで減少するのに対し、ヒトフェリ
チンＨ鎖発現物であるサンプルＡでは、終濃度２〜500n
g/mLの範囲で生存率が増大していた。ヒトフェリチンＨ
鎖を発現していないサンプルＢでは生存率の増大は見ら
れなかった。なおコントロールの3)は、Ｔ３Ｍ−３０Ｌ
ｕ細胞培養液からＭｏＧＦを精製する過程（実施例１）
のスーパーロース１２カラムで得られたＭｏＧＦ活性分
画であり、この場合の単球生存率は０．７０まで回復し
ていた。

【００４１】

【実施例６】ＭｏＧＦ活性のアッセイ（２）： 単球成長因子（ＭｏＧ
Ｆ）活性は、特開平3-145499と同様のアッセイにより単
球の分裂能（mitoic activity ：³H−チミジン uptake
）でも確認した。すなわち実施例５と同様にして得た
ヒト単球（ウェル付着細胞）を５％炭酸ガス培養器内で
３日間培養した。培地にはＦ−１０培地（１％自己血清
添加）を使用し、培養開始３日目に測定試料１０μｌを
各ウェルに添加した。

【００４２】試料添加４日目の細胞に、0.1 μCi／ウェ
ルの割合で10μｌの ³Ｈ−チミジン(New England Nucle
ar社製，比活性：6.7 μCi／mmol）でパルスラベルし培
養した。20時間培養後、各ウェルの培地を捨てて、10％
ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）１ml添加し20分間放置した。
ＴＣＡ溶液を廃棄して、ＴＣＡ不溶分画をメタノール／
エーテル(3:1) で２回洗浄し、1N NaOH 溶液 200μｌを
添加して37℃で60分間放置して可溶化した。これを 200
μｌの1N HClで中和し、シンチレーター（アクアゾール
-2）を4.5ml 添加して液体シンチレーションカウンター
で放射能を計測した。この ³Ｈ−チミジン取込み量を、
単球のＤＮＡ合成能即ち、単球の分裂能の尺度とした。
なお測定はトリプリケートで行なった。試料は実施例５
と同じ、サンプルＡ、Ｂ及びスーパーロース活性分画
（コントロール）を用いた。

【００４３】

【表５】 ────────────────────────────────── 試料 ³ Ｈ−チミジン取込み量 ────────────────────────────────── 1) サンプルＡ： pGEX(Ferritin H)3 フエリチンＨ鎖相当濃度 1.6 ng/mL 6733 dpm 0.3 ng/mL 4530 dpm 0.0 ng/mL 1046 dpm 2) サンプルＢ： pGEX-2T フエリチンＨ鎖相当濃度 1.6 ng/mL 1587 dpm 0.3 ng/mL 1225 dpm ────────────────────────────────── 3) スーパーロース活性分画（ＭｏＧＦ） 3653 dpm （フェリチンＨ鎖換算で終濃度10 ng/mL） ──────────────────────────────────

【００４４】表５に示すように、ヒトフェリチンＨ鎖発
現物であるサンプルＡ（すなわち組換ＭｏＧＦ）では、
ヒト単球の ³Ｈ−チミジン取込みが見られ、ＭｏＧＦ活
性が認められた。一方ヒトフェリチンＨ鎖を発現してい
ないサンプルＢでは有意の ³Ｈ−チミジン取込みは見ら
れなかった。試料3)は、Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞培養液か
らＭｏＧＦを精製する過程（実施例１）のスーパーロー
ス１２カラムで得られたＭｏＧＦ活性分画（すなわち天
然ＭｏＧＦ）であり、この場合 ³Ｈ−チミジン取込みが
見られ、ＭｏＧＦ活性が認められた

【００４５】

【実施例７】サンプルＡの組換ヒトフェリチンＨ鎖（す
なわち組換ＭｏＧＦ）を添加したヒト単球の形態学的変
化を顕微鏡により調べた。図８は天然ＭｏＧＦ（実施例
１のスーパーロース活性分画）を添加後培養８日目の単
球の顕微鏡写真図、図９は組換ＭｏＧＦ（実施例４のサ
ンプルＡ：pGEX(Ferritin H)3 発現物）を添加後培養８
日目の単球の顕微鏡写真図、図１０は試料未添加（１％
自家血清のみ）の場合（すなわちコントロール）の培養
８日目の単球の顕微鏡写真図、図１１は実施例４のサン
プルＢ（ pGEX-2T発現物）を添加後培養８日目の単球の
顕微鏡写真図である。

【００４６】コントロール（図１０；培養８日目）に比
べ、組換ＭｏＧＦ添加によりヒト単球細胞のサイズが大
きくなり又細胞質も増大していた（図９）。この形態学
的変化は天然ＭｏＧＦを添加した場合と同様であった
（図８参照）。一方、ヒトフェリチンＨ鎖を発現してい
ないサンプルＢ（図１１）では、このような形態学的変
化は認められず、コントロール（図１０）と同様であっ
た。

【００４７】また組換ＭｏＧＦを添加した場合、ヒト単
球のクラスターも認められた。このようなクラスターは
単球やマクロファージが異物を攻撃する際に見られるも
のと同様なものである。異物が存在しなくても、ＭｏＧ
Ｆ添加によりヒト単球がこのようなクラスターを形成す
ることから、本発明の組換ＭｏＧＦは、特開平3-145499
に開示の天然ＭｏＧＦ同様、ヒト単球の増殖を促進する
だけでなく、ヒト単球を生体防御反応に即応し得る状態
に機能分化させる誘導作用があることが示唆された。

【００４８】

【発明の効果】以上のように、ヒト単球成長因子とヒト
フェリチンＨ鎖とはアミノ酸配列上も、ＭｏＧＦ活性上
も同一の物質であることが確認できた。得られた組換ヒ
ト単球成長因子の全アミノ酸配列は図１に示される１８
３個のアミノ酸配列であり、これをコードする核酸配列
は図２に示される５４９塩基である。従って、この５４
９塩基をＤＮＡ配列を含む発現ベクターを適宜の方法に
より構築し、これを発現させれば、１８３個のアミノ酸
配列を生産することができる。

【００４９】本発明の組換ヒト単球成長因子は単球の関
与する生体防御反応を促進する薬剤、例えば、細胞性免
疫機能の亢進、マクロファージの関与するガン免疫の亢
進などの作用を有する薬剤としての用途が広く期待でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の組換ヒト単球成長因子の全アミノ酸配
列図である。

【図２】本発明の組換ヒト単球成長因子をコードする全
ＤＮＡ配列図である。

【図３】既報のヒトフェリチンＨ鎖のアミノ酸全配列図
である。

【図４】既報のヒトフェリチンＨ鎖遺伝子の全ＤＮＡ配
列図である。

【図５】Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞から得たフェリチンＨ鎖
ｃＤＮＡを挿入したベクターｐＢＳ(Ferritin H)36の構
築説明図である。

【図６】発現ベクターｐＧＥＸ(Ferritin H)３の構築説
明図である。

【図７】発現ベクターｐＧＥＸ(Ferritin H)３の構造を
示す図である。

【図８】天然ＭｏＧＦ（実施例１のスーパーロース活性
分画）を添加した場合のヒト単球細胞の顕微鏡像を示す
写真図である。

【図９】本発明の組換ＭｏＧＦ（実施例４のサンプル
Ａ：pGEX(Ferritin H)3 発現物）を添加した場合のヒト
単球細胞の顕微鏡像を示す写真図である。

【図１０】試料未添加（１％自家血清のみ）の場合（す
なわちコントロール）の場合のヒト単球細胞の顕微鏡像
を示す写真図である。

【図１１】サンプルＢ（ pGEX-2T発現物）を添加した場
合のヒト単球細胞の顕微鏡像を示す写真図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の部分的アミノ酸配列を有し、ヒト
   単球の分化・増殖を誘導する組換ヒト単球成長因子： Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
2. 【請求項２】 ヒト単球の分化・増殖を誘導する組換ヒ
   ト単球成長因子をコードする核酸配列を有するＤＮＡ配
   列。
3. 【請求項３】 ヒト単球の分化・増殖を誘導する組換ヒ
   ト単球成長因子をコードする核酸配列が以下の核酸配列
   である請求項２記載のＤＮＡ配列： ATG ACGACCGCGT CCACCTCGCA GGTGCGCCAG AACTACCACC AGGACTCAGA GGCCGCCATC AACCGCCAGA TCAACCTGGA GCTCTACGCC TCCTACGTTT ACCTGTCCAT GTCTTACTAC TTTGACCGCG ATGATGTGGC TTTGAAGAAC TTTGCCAAAT ACTTTCTTCA CCAATCTCAT GAGGAGAGGG AACATGCTGA GAAACTGATG AAGCTGCAGA ACCAACGAGG TGGCCGAATC TTCCTTCAGG ATATCAAGAA ACCAGACTGT GATGACTGGG AGAGCGGGCT GAATGCAATG GAGTGTGCAT TACATTTGGA AAAAAATGTG AATCAGTCAC TACTGGAACT GCACAAACTG GCCACTGACA AAAATGACCC CCATTTGTGT GACTTCATTG AGACACATTA CCTGAATGAG CAGGTGAAAG CCATCAAAGA ATTGGGTGAC CACGTGACCA ACTTGCGCAA GATGGGAGCG CCCGAATCTG GCTTGGCGGA ATATCTCTTT GACAAGCACA CCCTGGGAGA CAGTGATAAT GAAAGC
4. 【請求項４】 請求項１記載の部分的アミノ酸配列をコ
   ードする核酸配列を有するＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 ヒト単球の分化・増殖を誘導するヒト単
   球成長因子をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細
   胞を、発現可能な条件下で培養して請求項１記載の組換
   ヒト単球成長因子を産生させ、これを採取することを特
   徴とする組換ヒト単球成長因子の製造方法。