JP2846331B2 - 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 - Google Patents
骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法Info
- Publication number
- JP2846331B2 JP2846331B2 JP1046420A JP4642089A JP2846331B2 JP 2846331 B2 JP2846331 B2 JP 2846331B2 JP 1046420 A JP1046420 A JP 1046420A JP 4642089 A JP4642089 A JP 4642089A JP 2846331 B2 JP2846331 B2 JP 2846331B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- csf
- cells
- protein
- medium
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、哺乳動物の骨髄白血球前駆細胞に作用し
て、マクロフアージへの分化増殖を促進する新規な物質
（以下、Ｍ−CSFという）に関し、Ｍ−CSF産生細胞の大
量培養によるＭ−CSF工業的量産法を確立し、それによ
つて得られたＭ−CSFを抗癌剤、放射線照射等による白
血球減少症あるいは種々の感染症の治療剤としての医薬
への応用ならびに白血球減少症、再生不良性貧血糖の疾
病の診断に応用することを目的とする。
て、マクロフアージへの分化増殖を促進する新規な物質
（以下、Ｍ−CSFという）に関し、Ｍ−CSF産生細胞の大
量培養によるＭ−CSF工業的量産法を確立し、それによ
つて得られたＭ−CSFを抗癌剤、放射線照射等による白
血球減少症あるいは種々の感染症の治療剤としての医薬
への応用ならびに白血球減少症、再生不良性貧血糖の疾
病の診断に応用することを目的とする。
CSFは、２層軟寒天培養法で骨髄白血球前駆細胞を培
養するとき、その前駆細胞を分化および増殖せしめ、成
熟血液細胞（好中球系顆粒や単球−マクロフアージ）か
らなるコロニーを形成するのに必要な因子である（Ichi
kawa Y.et.al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 56巻、p.448、
1966年、Metcalf D.:Eup.Hematol.1巻、p.185、1973
年）。
養するとき、その前駆細胞を分化および増殖せしめ、成
熟血液細胞（好中球系顆粒や単球−マクロフアージ）か
らなるコロニーを形成するのに必要な因子である（Ichi
kawa Y.et.al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 56巻、p.448、
1966年、Metcalf D.:Eup.Hematol.1巻、p.185、1973
年）。
CSFには、さまざまなタイプの活性体が知られてお
り、顆粒球コロニー形成を誘導するＧ−CSF、単球／マ
クロフアージコロニー形成を誘導するＭ−CSF、両方の
コロニー形成を誘導するGM−CSF、好酸球、肥満細胞、
巨核球、赤芽球を含むさまざまな細胞からなるコロニー
形成を誘導するMULTI−CSF（多機能型CSF）などがあげ
られ、本発明は、ヒトＭ−CSFに関するものである。
り、顆粒球コロニー形成を誘導するＧ−CSF、単球／マ
クロフアージコロニー形成を誘導するＭ−CSF、両方の
コロニー形成を誘導するGM−CSF、好酸球、肥満細胞、
巨核球、赤芽球を含むさまざまな細胞からなるコロニー
形成を誘導するMULTI−CSF（多機能型CSF）などがあげ
られ、本発明は、ヒトＭ−CSFに関するものである。
ヒトＭ−CSFは、すい臓癌細胞（MIA PaCa）、肺癌細
胞、腎癌細胞等の培養液や人尿にその活性が認められ、
現在、MIA PaCa細胞及び人尿より分離されたＭ−CSFが
研究に用いられている。ヒト尿Ｍ−CSFの研究によれ
ば、ヒト末梢血単球をＭ−CSFで前処理することによ
り、Ｇ−CSFやGM−CSFの産生を誘導する作用を持つこと
が認められる（元吉：日本血液学会雑誌50巻、p.1557
1987年）。一方、ヒト末梢血単球をγ−インターフエロ
ン、GM−CSF、Tumor Necrosis Factor（TNF）やPhorbol
Myristate Acetate（PMA）で処理するとＭ−CSFを産生
することも認められている（J.Horiguchi et.al.:Blood
69巻、p.1259、1987年、W.Oster et.al.:Blood 70巻、
p.1700、1987年、A.Rambaldi et.al.:Blood 69巻、p.14
09、1987年）。
胞、腎癌細胞等の培養液や人尿にその活性が認められ、
現在、MIA PaCa細胞及び人尿より分離されたＭ−CSFが
研究に用いられている。ヒト尿Ｍ−CSFの研究によれ
ば、ヒト末梢血単球をＭ−CSFで前処理することによ
り、Ｇ−CSFやGM−CSFの産生を誘導する作用を持つこと
が認められる（元吉：日本血液学会雑誌50巻、p.1557
1987年）。一方、ヒト末梢血単球をγ−インターフエロ
ン、GM−CSF、Tumor Necrosis Factor（TNF）やPhorbol
Myristate Acetate（PMA）で処理するとＭ−CSFを産生
することも認められている（J.Horiguchi et.al.:Blood
69巻、p.1259、1987年、W.Oster et.al.:Blood 70巻、
p.1700、1987年、A.Rambaldi et.al.:Blood 69巻、p.14
09、1987年）。
また、癌化学療法や骨髄移植後の顆粒球減少症に対し
て、ヒト尿Ｍ−CSF投与により、顆粒球数の回復の促進
も認められ始めている（元吉:Med Immunol.12巻、p.36
1986年）。一方、Ｍ−CSFは、単球やマクロフアージ
の長期生存と機能維持に努めているとも報告されている
（Susanne Becker:J.Immunol.139巻、p.3703 1987
年）。妊娠中に、子宮内のＭ−CSF濃度が、1,000倍以上
にも上昇していること（Bartocci A.:J.Exp.Med.164
巻、p.956、1986年）及び妊娠において、血清中Ｍ−CSF
量が上昇していることから（T.Hamamura et.al.:Blood
72巻、p.886、1988年）、胎盤発達や胎児発育過程に何
らかの役割を演ずると思われ（Pollard J.et.al.:Natur
e,330巻、p.484、1987年）、新しい生理作用を持つこと
も予想される。
て、ヒト尿Ｍ−CSF投与により、顆粒球数の回復の促進
も認められ始めている（元吉:Med Immunol.12巻、p.36
1986年）。一方、Ｍ−CSFは、単球やマクロフアージ
の長期生存と機能維持に努めているとも報告されている
（Susanne Becker:J.Immunol.139巻、p.3703 1987
年）。妊娠中に、子宮内のＭ−CSF濃度が、1,000倍以上
にも上昇していること（Bartocci A.:J.Exp.Med.164
巻、p.956、1986年）及び妊娠において、血清中Ｍ−CSF
量が上昇していることから（T.Hamamura et.al.:Blood
72巻、p.886、1988年）、胎盤発達や胎児発育過程に何
らかの役割を演ずると思われ（Pollard J.et.al.:Natur
e,330巻、p.484、1987年）、新しい生理作用を持つこと
も予想される。
将来、Ｍ−CSFとモノクロナール抗体との併用により
マクロフアージを活性化し、抗体依存性細胞障害作用
（ADCC）を患者の体内に再現する幅広いガン治療の可能
性、Ｍ−CSFのガンに対する直接効果、肺炎などの感染
症治療に期待がかけられている。以上のように、ヒトＭ
−CSFの医薬品や診断剤としての価値がかなり注目され
る。
マクロフアージを活性化し、抗体依存性細胞障害作用
（ADCC）を患者の体内に再現する幅広いガン治療の可能
性、Ｍ−CSFのガンに対する直接効果、肺炎などの感染
症治療に期待がかけられている。以上のように、ヒトＭ
−CSFの医薬品や診断剤としての価値がかなり注目され
る。
しかしながら、現在、公知のＭ−CSF産生細胞の生産
性は、ヒト腎癌細胞では、培養液1ml当り300単位（特公
昭63−14947号公報）、ヒト肺癌組織細胞では、培養液1
ml当り350単位（特公昭63−18470号公報）、ヒト白血病
Ｔ細胞由来株化細胞では、培養液1ml当り307単位である
（特開昭59−169489号公報）。このように、細胞培養で
のＭ−CSFの生産性は、極めて低く、工業的生産は、難
しいのが現状である。また、ヒト尿を原料として、Ｍ−
CSFが単離されている（特開昭63−198700号公報、特開
昭63−250400号公報）が、原尿中のＭ−CSF量は約30単
位/mlと低く、そのうえ原料に制限があり、常に一定の
Ｍ−CSF活性を有する標品を安定的に大量製造すること
は、困難である。
性は、ヒト腎癌細胞では、培養液1ml当り300単位（特公
昭63−14947号公報）、ヒト肺癌組織細胞では、培養液1
ml当り350単位（特公昭63−18470号公報）、ヒト白血病
Ｔ細胞由来株化細胞では、培養液1ml当り307単位である
（特開昭59−169489号公報）。このように、細胞培養で
のＭ−CSFの生産性は、極めて低く、工業的生産は、難
しいのが現状である。また、ヒト尿を原料として、Ｍ−
CSFが単離されている（特開昭63−198700号公報、特開
昭63−250400号公報）が、原尿中のＭ−CSF量は約30単
位/mlと低く、そのうえ原料に制限があり、常に一定の
Ｍ−CSF活性を有する標品を安定的に大量製造すること
は、困難である。
正常人中に存在する天然型Ｍ−CSF（元吉：組織培
養、14巻、p.242、1988年、T.Hanamura et.al.:Blood 7
2巻、p.886、1988年）の取得手段として、尿以外に正常
単球から生産させることも考えられるが、末梢血より正
常単球を大量採取し、天然型Ｍ−CSFを得ることは、尿
から得るよりさらに困難である。
養、14巻、p.242、1988年、T.Hanamura et.al.:Blood 7
2巻、p.886、1988年）の取得手段として、尿以外に正常
単球から生産させることも考えられるが、末梢血より正
常単球を大量採取し、天然型Ｍ−CSFを得ることは、尿
から得るよりさらに困難である。
大量にＭ−CSFを産生させる方法として、遺伝子組換
え技術による生産が行われているが、メチオニン付加や
天然のＭ−CSFとは、異なる糖鎖が結合したCSFが生じる
ことから、抗原性等の問題が生じる可能性がある。
え技術による生産が行われているが、メチオニン付加や
天然のＭ−CSFとは、異なる糖鎖が結合したCSFが生じる
ことから、抗原性等の問題が生じる可能性がある。
そこで天然由来のＭ−CSFと同一の生理作用を有する
Ｍ−CSFを高い濃度で産生する細胞株及び産生方法の開
発が強く望まれている。
Ｍ−CSFを高い濃度で産生する細胞株及び産生方法の開
発が強く望まれている。
本発明は、骨髄細胞に作用して単球−マクロフアージ
の分化増殖を促進させる糖蛋白質からなり、下記理化学
性質を有する骨髄細胞分化増殖因子である。
の分化増殖を促進させる糖蛋白質からなり、下記理化学
性質を有する骨髄細胞分化増殖因子である。
（ａ） 分子量が、非還元条件下でSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定すると38000±5000ダルト
ンであり、非還元条件下ゲルロ過法で測定すると56000
±9000ダルトンであり、 （ｂ） 逆相HPLCにおいて単一のピークとして移動し、 （ｃ） 比活性が少なくとも１×108単位/mg蛋白質であ
り、 （ｄ） 蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、 （以下、アミノ酸配列〔Ａ〕とする。） （以下、アミノ酸配列〔Ｂ〕とする。） である。
ミドゲル電気泳動により測定すると38000±5000ダルト
ンであり、非還元条件下ゲルロ過法で測定すると56000
±9000ダルトンであり、 （ｂ） 逆相HPLCにおいて単一のピークとして移動し、 （ｃ） 比活性が少なくとも１×108単位/mg蛋白質であ
り、 （ｄ） 蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、 （以下、アミノ酸配列〔Ａ〕とする。） （以下、アミノ酸配列〔Ｂ〕とする。） である。
また、本発明は、ヒト骨髄性白血病細胞から分離され
た細胞のクローンであつて、血清を含む組織培養培地で
増殖し、化学試薬により誘導後、無血清培地、または無
蛋白培地中に多量の骨髄細胞分化増殖因子を長時間産生
する性質を有することを特徴とする上記の骨髄細胞分化
増殖因子産生細胞である。
た細胞のクローンであつて、血清を含む組織培養培地で
増殖し、化学試薬により誘導後、無血清培地、または無
蛋白培地中に多量の骨髄細胞分化増殖因子を長時間産生
する性質を有することを特徴とする上記の骨髄細胞分化
増殖因子産生細胞である。
さらに、本発明は、下記特徴を有する本発明細胞由来
Ｍ−CSFの製法である。
Ｍ−CSFの製法である。
上記のヒト骨髄性白血病細胞を無蛋白（または無血
清）条件下で培養し、 の培養上清を濃縮後、pH2.5〜5.0の条件下で前処
理し、不溶画分を分離し、 の処理液をpH5.0〜7.5の条件下で陰イオン交換体
と接触させ、有用物質を該イオン交換体に吸着させた
後、0.05〜0.3M無機塩溶液にて溶出される分画を集め、 の分画を1.0〜1.5Mの無機塩濃度に調整し、pH6.0
〜8.0の条件下で疎水性吸着体に吸着させた後、0.1〜0.
5Mの無機塩溶液により溶出される分画を集め、 の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相対溶出
液量が1.5〜1.8の分画を取得し、 の溶出液を逆相イオンクロマトグラフイー操作を
行う。
清）条件下で培養し、 の培養上清を濃縮後、pH2.5〜5.0の条件下で前処
理し、不溶画分を分離し、 の処理液をpH5.0〜7.5の条件下で陰イオン交換体
と接触させ、有用物質を該イオン交換体に吸着させた
後、0.05〜0.3M無機塩溶液にて溶出される分画を集め、 の分画を1.0〜1.5Mの無機塩濃度に調整し、pH6.0
〜8.0の条件下で疎水性吸着体に吸着させた後、0.1〜0.
5Mの無機塩溶液により溶出される分画を集め、 の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相対溶出
液量が1.5〜1.8の分画を取得し、 の溶出液を逆相イオンクロマトグラフイー操作を
行う。
本発明者等は、天然型Ｍ−CSFを大量かつ容易に取得
するための手段について、検討をかさね、骨髄性白血病
細胞からまつたくアルブミン等の蛋白を含まない無蛋白
培地1ml培養液当り、約10,000単位のＭ−CSFを長時間産
生する細胞の取得に成功した。この細胞をDK−２と命名
した。
するための手段について、検討をかさね、骨髄性白血病
細胞からまつたくアルブミン等の蛋白を含まない無蛋白
培地1ml培養液当り、約10,000単位のＭ−CSFを長時間産
生する細胞の取得に成功した。この細胞をDK−２と命名
した。
このDK−２細胞の大きな特徴は、誘導後、Ｍ−CSFを
産生させる場合、産生培地中に血清が含まれると、Ｍ−
CSFの産生がないか、或は産生されても弱く、血清を含
まない培地においてＭ−CSFの高産生が持続した。誘導
剤は、Ｍ−CSF産生培地、即ち無蛋白（或は無血清）培
地存在下で、数日間培養することにより、安全に大量の
細胞を取り扱うことができ、かつ高生産のＭ−CSFを取
得でき、数日後は、誘導剤非存在下の新しい無蛋白培地
で培養しても、Ｍ−CSFの高生産が続き、数日間毎の培
地交換で数回産生させることを可能とした。この培養液
25リツトルは、３×108単位のＭ−CSF量を含有し、これ
は、尿の約10トン分に相当する。
産生させる場合、産生培地中に血清が含まれると、Ｍ−
CSFの産生がないか、或は産生されても弱く、血清を含
まない培地においてＭ−CSFの高産生が持続した。誘導
剤は、Ｍ−CSF産生培地、即ち無蛋白（或は無血清）培
地存在下で、数日間培養することにより、安全に大量の
細胞を取り扱うことができ、かつ高生産のＭ−CSFを取
得でき、数日後は、誘導剤非存在下の新しい無蛋白培地
で培養しても、Ｍ−CSFの高生産が続き、数日間毎の培
地交換で数回産生させることを可能とした。この培養液
25リツトルは、３×108単位のＭ−CSF量を含有し、これ
は、尿の約10トン分に相当する。
このように天然型Ｍ−CSFを均質な状態で、安価に大
量生産することを可能とし、得られた天然型Ｍ−CSFの
製造的特性及び理化学的特性を解明し、この物質を同定
することに成功し、かつ、この物質が従来にない構造特
性をもち、極めて高水準のＭ−CSF活性を有することを
解明し、本発明を完成するに至つた。
量生産することを可能とし、得られた天然型Ｍ−CSFの
製造的特性及び理化学的特性を解明し、この物質を同定
することに成功し、かつ、この物質が従来にない構造特
性をもち、極めて高水準のＭ−CSF活性を有することを
解明し、本発明を完成するに至つた。
以下、本発明細胞の樹立及び細胞学的特性について、
詳述する。
詳述する。
本発明者等は、ヒトＭ−CSF産生能を有する細胞株の
検索につき種々の研究を重ねる過程において、ヒト骨髄
性白血病患者より株化された細胞に、他の検索細胞より
高いＭ−CSF活性が認められるのを見いだし、更に選別
培養を繰り返した結果、Ｍ−CSF産生能を有する細胞を
新たに単離することに成功し、これを培養株化細胞とし
て確立し、DK−２と命名し、この細胞を微工研に寄託し
た（微工研条寄第2277号）。
検索につき種々の研究を重ねる過程において、ヒト骨髄
性白血病患者より株化された細胞に、他の検索細胞より
高いＭ−CSF活性が認められるのを見いだし、更に選別
培養を繰り返した結果、Ｍ−CSF産生能を有する細胞を
新たに単離することに成功し、これを培養株化細胞とし
て確立し、DK−２と命名し、この細胞を微工研に寄託し
た（微工研条寄第2277号）。
細胞株の樹立 急性骨髄性白血病患者の末梢血から、ヘパリン加デイ
スポーザブル注射器にて採血し、遠心し、白血球を分取
し、赤血球除去用トリス緩衝液を添加し、遠心した。RP
MI1640（GIBCO社）で洗浄後、50μg/mlカナマイシン
（シグマ社）及び20（v/v）％牛胎児血清（FCS）を含む
RPMI1640に懸濁し、24ウエルプレート（フアルコン社）
で37℃、５％炭酸ガス及び95％空気のインキユベーター
内で培養する。２〜３日毎に半分培地交換を行う。約７
ケ月後、親株として、10％FCSを含むRPMI1640で、さら
に継代培養し、後に、上記培地中で限界希釈法により細
胞のクローン化を行い、高いＭ−CSF産生を示す株を選
択して、株化細胞DK−２を取る。
スポーザブル注射器にて採血し、遠心し、白血球を分取
し、赤血球除去用トリス緩衝液を添加し、遠心した。RP
MI1640（GIBCO社）で洗浄後、50μg/mlカナマイシン
（シグマ社）及び20（v/v）％牛胎児血清（FCS）を含む
RPMI1640に懸濁し、24ウエルプレート（フアルコン社）
で37℃、５％炭酸ガス及び95％空気のインキユベーター
内で培養する。２〜３日毎に半分培地交換を行う。約７
ケ月後、親株として、10％FCSを含むRPMI1640で、さら
に継代培養し、後に、上記培地中で限界希釈法により細
胞のクローン化を行い、高いＭ−CSF産生を示す株を選
択して、株化細胞DK−２を取る。
細胞学的特性 このようにして、樹立したCSF産生細胞（DK−２）の
細胞学的特性は、下記のとおりである。
細胞学的特性は、下記のとおりである。
１） 細胞の形態：ほぼ球形、単球細胞様 ２） 染色体数 ：染色体数75本のモーダル・ナンバー
を示すことを特徴とする染色体数の分布モード ３） 継代培養 ：無限な継代培養可能 ４） 機能的特徴：誘導後、マクロフアージ様（付着細
胞）に変わり、無蛋白及び無血清培地中に持続してＭ−
CSFの高生産がある。
を示すことを特徴とする染色体数の分布モード ３） 継代培養 ：無限な継代培養可能 ４） 機能的特徴：誘導後、マクロフアージ様（付着細
胞）に変わり、無蛋白及び無血清培地中に持続してＭ−
CSFの高生産がある。
５） 細胞増殖性：懸濁状態で良く増殖する。世代倍加
時間は21.1時間である。
時間は21.1時間である。
６） 血清の要求性:10％のFCSを含むRPMI1640培地で増
殖。
殖。
本発明では、上記のＭ−CSF産生細胞株DK−２を血清
培地中で増殖させ、細胞を回収し、血清除去を行い、誘
導剤添加無蛋白培地又は無血清培地中で培養することに
より、Ｍ−CSFを産生する。Ｍ−CSF産生用無蛋白培地と
しては、RPMI1640培地やＥ−RDF培地（極東製薬社）が
のぞましい。また、Ｍ−CSF産生用無血清培地として
は、ASF培地（味の素社：登録商標）やセルグロツサー
Ｈ（住友製薬社：登録商標）等が市販されて利用できる
が、RPMI1640培地やＥ−RDF培地を基本培地とし、これ
に牛血清アルブミン10〜100mg/、インシユリン5mg/
、トランスフエリン5mg/、エタノールアミン1.53mg
/、亜セレン酸ナトリウム0.0043mg/、カナマイシン
50μg/を含む無血清培地が望ましい。
培地中で増殖させ、細胞を回収し、血清除去を行い、誘
導剤添加無蛋白培地又は無血清培地中で培養することに
より、Ｍ−CSFを産生する。Ｍ−CSF産生用無蛋白培地と
しては、RPMI1640培地やＥ−RDF培地（極東製薬社）が
のぞましい。また、Ｍ−CSF産生用無血清培地として
は、ASF培地（味の素社：登録商標）やセルグロツサー
Ｈ（住友製薬社：登録商標）等が市販されて利用できる
が、RPMI1640培地やＥ−RDF培地を基本培地とし、これ
に牛血清アルブミン10〜100mg/、インシユリン5mg/
、トランスフエリン5mg/、エタノールアミン1.53mg
/、亜セレン酸ナトリウム0.0043mg/、カナマイシン
50μg/を含む無血清培地が望ましい。
次に、本発明細胞からのＭ−CSFの産生方法について
述べる。
述べる。
Ｍ−CSF高産生株DK−２のＭ−CSFの誘導剤として、ホ
ルボール12−ミリステート13アセテート（PMA）やメゼ
レイン等のホルボールエステル類、ルチノイツクアシツ
ド（RA）、ジメチルスルホキサイド（DMSO）を使用でき
るが、PMAが誘導能が高く好適に使用できる。
ルボール12−ミリステート13アセテート（PMA）やメゼ
レイン等のホルボールエステル類、ルチノイツクアシツ
ド（RA）、ジメチルスルホキサイド（DMSO）を使用でき
るが、PMAが誘導能が高く好適に使用できる。
通常、細胞濃度は、0.5〜２×106個/mlまで増殖させ
ることができ、細胞を遠心分離法により回収して、カル
シウム・マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で洗浄し、除血清を行い、細胞濃度１〜２×106
個/mlに調製し、誘導剤であるPMAを直接、産生培地に添
加し、24〜96時間培養し、Ｍ−CSF産生工程とする。後
は、一定時間毎に培地を交換すればよい。誘導剤は、最
初の数日間のみ添加するだけでよいが、その後の産生培
地にも添加してもよい。
ることができ、細胞を遠心分離法により回収して、カル
シウム・マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で洗浄し、除血清を行い、細胞濃度１〜２×106
個/mlに調製し、誘導剤であるPMAを直接、産生培地に添
加し、24〜96時間培養し、Ｍ−CSF産生工程とする。後
は、一定時間毎に培地を交換すればよい。誘導剤は、最
初の数日間のみ添加するだけでよいが、その後の産生培
地にも添加してもよい。
このようにして、回収された培養上清は、補助的蛋白
質が含まれないため、製造コストが安価であり、かつ精
製コストも経済的である。
質が含まれないため、製造コストが安価であり、かつ精
製コストも経済的である。
本発明に係わる細胞株は、誘導後、付着性細胞となる
ため培養容器から培養上清の分離は、容易である。
ため培養容器から培養上清の分離は、容易である。
更に、本発明細胞産生Ｍ−CSFの分離精製について、
詳記する。
詳記する。
Ｍ−CSFの分離精製 培養上清の精製方法としては下記の手段が用いられ
る。
る。
細胞培養上清を0.22μ無菌フイルターで処理し、限
外ロ過膜方式で濃縮し、それをpH2.5〜5.0に調整し低温
静置により析出物を遠心分離機で分離した培養濃縮原液
を調製する。
外ロ過膜方式で濃縮し、それをpH2.5〜5.0に調整し低温
静置により析出物を遠心分離機で分離した培養濃縮原液
を調製する。
で得られた溶出液のpHを調製し、同じpH領域の緩
衝液で緩衝化した陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロ
ースと接触させ、吸着物を無機塩、例えば塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液（pH6〜８）を用いて塩濃度を連続的に
高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ、塩濃度
の緩衝液により溶出される分画を集める。
衝液で緩衝化した陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロ
ースと接触させ、吸着物を無機塩、例えば塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液（pH6〜８）を用いて塩濃度を連続的に
高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ、塩濃度
の緩衝液により溶出される分画を集める。
の分画液に無機塩、例えば硫酸アンモニウムを添
加し、pHを調製してから、あらかじめ無機塩、例えば硫
酸アンモニウムを含む緩衝液で緩衝化させた疎水性クロ
マトグラフイー用樹脂、例えばフエニルセフアロースCL
−4B（登録商標）、またはオクチルセフアロース（登録
商標）などに接触させ、次いで、吸着物を1Mから0.1Mの
無機塩、例えば硫酸アンモニウムを含む緩衝液（pH6〜
８）を用いて高い塩濃度から低い塩濃度へと塩濃度を変
化させる直線濃度勾配溶出法により溶出させ、塩濃度の
緩衝液により溶出される分画を集める。
加し、pHを調製してから、あらかじめ無機塩、例えば硫
酸アンモニウムを含む緩衝液で緩衝化させた疎水性クロ
マトグラフイー用樹脂、例えばフエニルセフアロースCL
−4B（登録商標）、またはオクチルセフアロース（登録
商標）などに接触させ、次いで、吸着物を1Mから0.1Mの
無機塩、例えば硫酸アンモニウムを含む緩衝液（pH6〜
８）を用いて高い塩濃度から低い塩濃度へと塩濃度を変
化させる直線濃度勾配溶出法により溶出させ、塩濃度の
緩衝液により溶出される分画を集める。
の溶出液を分子篩クロマトグラフイーの目的でゲ
ルロ過剤、例えばセフアデツクスＧ−150（登録商
標）、バイオゲルＰ−100（登録商標）または無機系ゲ
ルロ過剤などを充填したカラムに通液して溶液中のＭ−
CSFを充填剤に吸着させた後、無機塩緩衝液にて溶出せ
しめて相対溶出液量が1.5〜1.8である分画を集め、脱
塩、濃縮する。
ルロ過剤、例えばセフアデツクスＧ−150（登録商
標）、バイオゲルＰ−100（登録商標）または無機系ゲ
ルロ過剤などを充填したカラムに通液して溶液中のＭ−
CSFを充填剤に吸着させた後、無機塩緩衝液にて溶出せ
しめて相対溶出液量が1.5〜1.8である分画を集め、脱
塩、濃縮する。
なお、相対溶出液量とはVe/Voで表される数値である
（Veはカラムに通液する試料液がカラムから溶出する液
量を示し、Voはカラム内のゲル粒子外部の溶液量を示
す）。
（Veはカラムに通液する試料液がカラムから溶出する液
量を示し、Voはカラム内のゲル粒子外部の溶液量を示
す）。
また、この操作は以下の高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）システムを用いても実施できる。
（HPLC）システムを用いても実施できる。
まず前工程からの濃縮液を0.15Mの無機塩を含む緩衝
液（pH7.4）で平衡化する。これをHPLC用ゲルロ過カラ
ム、例えばスーパーローズ12カラム（フアルマシア社：
登録商標）またはTSK−G3000SW（東洋曹達社：登録商
標）或いはこれらに相当する充填カラムに通液し、Ｍ−
CSF活性を有する分画を集める。
液（pH7.4）で平衡化する。これをHPLC用ゲルロ過カラ
ム、例えばスーパーローズ12カラム（フアルマシア社：
登録商標）またはTSK−G3000SW（東洋曹達社：登録商
標）或いはこれらに相当する充填カラムに通液し、Ｍ−
CSF活性を有する分画を集める。
の分画を、逆相型イオンクロマトグラフイー操
作を行うことにより実質的に不純物を含まない純粋なＭ
−CSFを取得できる。これを非極性の充填剤に、対イオ
ンを含む溶離液を用いて、イオン成分を中性物質と交換
し、分配平衡の差を利用して分離する高速液体クロマト
グラフイーの１種であり、この目的のための充填剤とし
ては、TSKゲルODS−120A（東洋曹達社：登録商標）、日
立ゲル3050（日立社：登録商標）、マイクロ ボンダパ
ツクC18、C4（ウォーターズ社：登録商標）、ゾルボツ
クスODS（デュポン社：登録商標）等が知られている。
作を行うことにより実質的に不純物を含まない純粋なＭ
−CSFを取得できる。これを非極性の充填剤に、対イオ
ンを含む溶離液を用いて、イオン成分を中性物質と交換
し、分配平衡の差を利用して分離する高速液体クロマト
グラフイーの１種であり、この目的のための充填剤とし
ては、TSKゲルODS−120A（東洋曹達社：登録商標）、日
立ゲル3050（日立社：登録商標）、マイクロ ボンダパ
ツクC18、C4（ウォーターズ社：登録商標）、ゾルボツ
クスODS（デュポン社：登録商標）等が知られている。
例えば、マイクロ ボンダパツクC18カラムの場合、
カラムを0.1％トリフルオロ酢酸で平衡化しておき、こ
れに工程で得たＭ−CSF活性を有する分画を通液して
吸着後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む０％から100％の
アセトニトリルによる直線濃度勾配溶出法により溶出さ
せ、Ｍ−CSF活性を有する分画を中和後、透析すること
により、純Ｍ−CSFを得ることができる。
カラムを0.1％トリフルオロ酢酸で平衡化しておき、こ
れに工程で得たＭ−CSF活性を有する分画を通液して
吸着後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む０％から100％の
アセトニトリルによる直線濃度勾配溶出法により溶出さ
せ、Ｍ−CSF活性を有する分画を中和後、透析すること
により、純Ｍ−CSFを得ることができる。
以上の精製法において本発明物質の確認追跡は、Ｍ−
CSF活性をマーカーとして行う。
CSF活性をマーカーとして行う。
Ｍ−CSFの理化学的特性 かくして得られたＭ−CSF活性物質は、分子量56000±
9000ダルトンであり、２−メルカプトエタノール処理に
より23000±5000ダルトンになる。蛋白質部分のアミノ
酸構成はモル％で、 アスパラギン酸（Asp）及び アスパラギン（Asn） 6.94 グルタミン酸（Glu）及び グルタミン（Gln） 15.62 セリン（Ser） 8.14 グリシン（Gly） 1.97 ヒスチジン（His） 2.72 アルギニン（Arg） 2.98 スレオニン（Thr） 5.13 アラニン（Ala） 3.71 プロリン（Pro） 2.63 チロシン（Tyr） 3.36 バリン（Val） 6.84 メチオニン（Met） 1.20 システイン（Cys） 1.21 イソロイシン（Ile） 6.23 ロイシン（Leu） 13.50 フエニルアラニン（Phe） 7.68 リジン（Lys） 10.15 である。シヨ糖密度勾配等電点電気泳動法により測定し
た等電点は4.4〜4.8であり、Ｎ末端のアミノ酸配列は、
〔Ａ〕および〔Ｂ〕である。
9000ダルトンであり、２−メルカプトエタノール処理に
より23000±5000ダルトンになる。蛋白質部分のアミノ
酸構成はモル％で、 アスパラギン酸（Asp）及び アスパラギン（Asn） 6.94 グルタミン酸（Glu）及び グルタミン（Gln） 15.62 セリン（Ser） 8.14 グリシン（Gly） 1.97 ヒスチジン（His） 2.72 アルギニン（Arg） 2.98 スレオニン（Thr） 5.13 アラニン（Ala） 3.71 プロリン（Pro） 2.63 チロシン（Tyr） 3.36 バリン（Val） 6.84 メチオニン（Met） 1.20 システイン（Cys） 1.21 イソロイシン（Ile） 6.23 ロイシン（Leu） 13.50 フエニルアラニン（Phe） 7.68 リジン（Lys） 10.15 である。シヨ糖密度勾配等電点電気泳動法により測定し
た等電点は4.4〜4.8であり、Ｎ末端のアミノ酸配列は、
〔Ａ〕および〔Ｂ〕である。
以上の特性から、本発明により得られるＭ−CSFは新
規物質であり、生化学用、薬理学用試薬として用いても
よく、また医薬品として用いる場合には医薬品製造の慣
用的技術に従つて製剤化できる。Ｍ−CSF活性の測定はB
radley等の方法で行う（T.R.Bradley et.al.:Aust.J.Ex
p.Biol.Med.Sci.,44巻、p.287、1966年）。即ち、直径3
5mmのプラスチツク培養皿に20％馬血清、各濃度のＭ−C
SF試料、0.3％の寒天及び１×105個のマウス骨髄細胞を
含むMcCoy′s 5A培値1mlを加え７日間37℃で５％CO2を
含む飽和水蒸気下で培養する。培養後、倒立顕微鏡下で
検鏡し、50個以上の細胞集塊をコロニーの数とする。
規物質であり、生化学用、薬理学用試薬として用いても
よく、また医薬品として用いる場合には医薬品製造の慣
用的技術に従つて製剤化できる。Ｍ−CSF活性の測定はB
radley等の方法で行う（T.R.Bradley et.al.:Aust.J.Ex
p.Biol.Med.Sci.,44巻、p.287、1966年）。即ち、直径3
5mmのプラスチツク培養皿に20％馬血清、各濃度のＭ−C
SF試料、0.3％の寒天及び１×105個のマウス骨髄細胞を
含むMcCoy′s 5A培値1mlを加え７日間37℃で５％CO2を
含む飽和水蒸気下で培養する。培養後、倒立顕微鏡下で
検鏡し、50個以上の細胞集塊をコロニーの数とする。
また、Ｍ−CSFの活性はコロニーを１個形成させる活
性を１単位（Ｕ）とし、比活性を次式により算出する。
性を１単位（Ｕ）とし、比活性を次式により算出する。
なお蛋白質の定量はブラツドホールド法（M.M.Bradfo
ld:Anal.Biochem.,72巻、1976年）による。
ld:Anal.Biochem.,72巻、1976年）による。
実施例中、特に断わらない限り％は重量％を表わす。
実施例１ （１） DK−２細胞の樹立 急性骨髄性白血病患者の末梢血10mlをあらかじめフイ
コール・パツク液（フアルマシア社）10ml入れた試験管
に重層し、400gで30分、遠心し、中間層の白血球液1ml
を得た。これを、シグマコート（シグマ社）処理した小
ガラス試験管に移し、PBS5mlを入れ、400g、５分遠心
し、その上清を捨て、細胞沈渣にPBS5ml加え、混和後、
遠心した。次に、この細胞沈渣に0.87％塩化アンモニウ
ムを含むトリス緩衝液3ml入れ、よく混和し、溶液操作
を行つた。遠心後、RPMI1640培地5mlで２回遠心操作に
より、洗浄し、最後にRPMI1640＋20％FCS培地1mlに細胞
を懸濁し、細胞数をトリパンブルー染色で、顕微鏡下、
カウントした。細胞数は２×107個であり、培地を加
え、２×106個/mlとし、24−ウエル−プレートに1ml/ウ
エルでまき、37℃５％炭酸ガスインキユベーター内で静
置培養した。最初の１週間は毎日、培養液0.5mlを静か
に抜取り、同量のRPMI1640＋20％FCS培地を加えた。そ
の後は、２〜３日毎に半分培地交換を行い、培地交換時
に顕微鏡での観察を続けた。
コール・パツク液（フアルマシア社）10ml入れた試験管
に重層し、400gで30分、遠心し、中間層の白血球液1ml
を得た。これを、シグマコート（シグマ社）処理した小
ガラス試験管に移し、PBS5mlを入れ、400g、５分遠心
し、その上清を捨て、細胞沈渣にPBS5ml加え、混和後、
遠心した。次に、この細胞沈渣に0.87％塩化アンモニウ
ムを含むトリス緩衝液3ml入れ、よく混和し、溶液操作
を行つた。遠心後、RPMI1640培地5mlで２回遠心操作に
より、洗浄し、最後にRPMI1640＋20％FCS培地1mlに細胞
を懸濁し、細胞数をトリパンブルー染色で、顕微鏡下、
カウントした。細胞数は２×107個であり、培地を加
え、２×106個/mlとし、24−ウエル−プレートに1ml/ウ
エルでまき、37℃５％炭酸ガスインキユベーター内で静
置培養した。最初の１週間は毎日、培養液0.5mlを静か
に抜取り、同量のRPMI1640＋20％FCS培地を加えた。そ
の後は、２〜３日毎に半分培地交換を行い、培地交換時
に顕微鏡での観察を続けた。
１カ月後10ウエル中１ウエルに持続的な細胞の増殖が
認められたが、増殖が極めて悪く、さらに、培地交換を
１カ月行つた。後に直径35mmのシヤーレ（フアルコン
社）にスケールアツプをし、凍結保存をした。１ケ月
後、その凍結保存チユーブ１本を解凍し、20％FCS含有R
PMI1640培地で増殖することを確かめ、２ケ月を要し、2
5cm2の50mlフラスコ（フアルコン社）で10mlの継代培養
を可能とした。次に、10％FCS含有RPMI1640培地で馴化
を行つた。
認められたが、増殖が極めて悪く、さらに、培地交換を
１カ月行つた。後に直径35mmのシヤーレ（フアルコン
社）にスケールアツプをし、凍結保存をした。１ケ月
後、その凍結保存チユーブ１本を解凍し、20％FCS含有R
PMI1640培地で増殖することを確かめ、２ケ月を要し、2
5cm2の50mlフラスコ（フアルコン社）で10mlの継代培養
を可能とした。次に、10％FCS含有RPMI1640培地で馴化
を行つた。
10％FCS含有RPMI1640培地馴化株につき、限界希釈法
により、クローニングを行つた。即ち、96−ウエル・プ
レート（フアルコン社）を用い、0.5個／ウエル入るよ
うに培地で希釈し、フイーダー細胞として、マイトマイ
シンＣ（協和発酵社）25μg/mlで30分処理した馴化株５
×104個／ウエルとなるように入れ、0.2ml/ウエルずつ
まいた。CO2インキユベーターで培養開始後、20日目に
クローン株が出現し、24−ウエル−プレートへ移し、増
殖させ、50ng PMA/ml含有RPMI1640培地で３日間培養し
その、その培養上清のＭ−CSF活性を測定した。ここで
選択したクローン株について、さらにクローニングを実
施し、Ｍ−CSF産生及び増殖性が良い株を選択し、DK−
２と命名した。
により、クローニングを行つた。即ち、96−ウエル・プ
レート（フアルコン社）を用い、0.5個／ウエル入るよ
うに培地で希釈し、フイーダー細胞として、マイトマイ
シンＣ（協和発酵社）25μg/mlで30分処理した馴化株５
×104個／ウエルとなるように入れ、0.2ml/ウエルずつ
まいた。CO2インキユベーターで培養開始後、20日目に
クローン株が出現し、24−ウエル−プレートへ移し、増
殖させ、50ng PMA/ml含有RPMI1640培地で３日間培養し
その、その培養上清のＭ−CSF活性を測定した。ここで
選択したクローン株について、さらにクローニングを実
施し、Ｍ−CSF産生及び増殖性が良い株を選択し、DK−
２と命名した。
（２） DK−２細胞の細胞学的性質 １） 染色体数 本細胞培養フラスコ（４×105個/ml）10mlに100ng/ml
濃度のコルセミドを入れ、５％炭酸ガスインキユベータ
ーで６時間培養した後、低張液（0.075M塩化カリウム）
で37℃下に15分間処理し、固定液（酢酸：エタノール＝
1:3）で室温下に固定した後遠心し、細胞を回収し0.5ml
の固定液で細胞を懸濁し、その液２滴をスライドガラス
に落し、乾燥させ、ギムザ染色を行つて、本細胞の分裂
中期における核染色体数を100個の細胞について計数し
た。その結果、各細胞の核染色体数は、第１標に示す通
り69〜82の間に分布し、ピークは約75にあつた。
濃度のコルセミドを入れ、５％炭酸ガスインキユベータ
ーで６時間培養した後、低張液（0.075M塩化カリウム）
で37℃下に15分間処理し、固定液（酢酸：エタノール＝
1:3）で室温下に固定した後遠心し、細胞を回収し0.5ml
の固定液で細胞を懸濁し、その液２滴をスライドガラス
に落し、乾燥させ、ギムザ染色を行つて、本細胞の分裂
中期における核染色体数を100個の細胞について計数し
た。その結果、各細胞の核染色体数は、第１標に示す通
り69〜82の間に分布し、ピークは約75にあつた。
２） 細胞化学染色 本細胞株は、ペルオキシダーゼ及びスーダンブラツク
Ｂに対し陰性であり、α−ナフチルブチレートエステラ
ーゼに対し陽性であつた。
Ｂに対し陰性であり、α−ナフチルブチレートエステラ
ーゼに対し陽性であつた。
３） ロゼツト形成 未感作ヒツジ赤血球、lgG抗体感作ヒツジ赤血球及びl
gM抗体ヒト補体感作ヒツジ赤血球（EAC）におけるロゼ
ツト形成を調べた結果、１％以下、約20％及び約10％が
陽性であつた。
gM抗体ヒト補体感作ヒツジ赤血球（EAC）におけるロゼ
ツト形成を調べた結果、１％以下、約20％及び約10％が
陽性であつた。
４） 細胞表面マーカー 本細胞浮遊液0.2mlを小試験管にとり、リン酸緩衝食
塩水（pH7.2）を加え400g、５分間遠心を行い洗浄し
た。下記のモノクロナール抗体0.1mlを加え、時々撹拌
しながら30分間氷中に放置した。次に400g、５分間の遠
心により２回、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、FITC標識抗
マウス免疫グロブリン抗体0.1mlを加え、氷中で30分間
放置した。その後、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、細
胞をスライドグラスに載せ、螢光顕微鏡で観察した。そ
の結果、抗末梢Ｔリンパ球抗体〔OKT3〕、に対しては陰
性、抗HLA−DR抗体〔OKI al〕に対して陽性であつた。
使用したモノクロナール抗体は、Ortho Diagnostic,Rar
itan,NJ社から得た。
塩水（pH7.2）を加え400g、５分間遠心を行い洗浄し
た。下記のモノクロナール抗体0.1mlを加え、時々撹拌
しながら30分間氷中に放置した。次に400g、５分間の遠
心により２回、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、FITC標識抗
マウス免疫グロブリン抗体0.1mlを加え、氷中で30分間
放置した。その後、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、細
胞をスライドグラスに載せ、螢光顕微鏡で観察した。そ
の結果、抗末梢Ｔリンパ球抗体〔OKT3〕、に対しては陰
性、抗HLA−DR抗体〔OKI al〕に対して陽性であつた。
使用したモノクロナール抗体は、Ortho Diagnostic,Rar
itan,NJ社から得た。
実施例２ 大量培養 骨髄性白血病細胞DK−２をRPMI1640＋10％FCS培地に
て、約１×105個/mlの細胞濃度に調製し、その10を14
ジヤーフアーメンター（N.B.S.社）にて、37℃で培養
し、約１×106個/mlの細胞濃度に到達するまで約５日間
培養した。その時の増殖変化を第２表に示した。
て、約１×105個/mlの細胞濃度に調製し、その10を14
ジヤーフアーメンター（N.B.S.社）にて、37℃で培養
し、約１×106個/mlの細胞濃度に到達するまで約５日間
培養した。その時の増殖変化を第２表に示した。
実施例３ 培養液の大量調製 骨髄性白血病細胞DK−２を、10％FCSを含むRPMI培地
にて、１×105個/mlの細胞濃度に調製し、その11を、
14ジヤーフアーメンター（N.B.S.社）に37℃で培養
し、1.6×106個/mlまで培養した。
にて、１×105個/mlの細胞濃度に調製し、その11を、
14ジヤーフアーメンター（N.B.S.社）に37℃で培養
し、1.6×106個/mlまで培養した。
次いで、培養された11容の細胞を連続遠心機（IEC
社）にて回収し、PBS15で細胞を洗浄し、血清を完全
に除去した。回収した細胞のうち、１×109個とRPMI164
0培地（無蛋白培地）500mlを培養表面積850cm2のローラ
ーボトル（フアルコン社）に入れ、17本のローラーボト
ルを仕込んだ。各々のローラーボトルに誘導剤、PMAを5
0ng/mlとなるように添加し、回転数1/2R.P.M.、37℃で
培養し、３日目に、誘導剤無添加のRPMI1640培地を１ロ
ーラーボトル当り500mlの割合で交換し、培養液を合計
8.5回収した。同様の操作を繰り返し、合計３回の回
収を行い、合計約25の回収液を得た。その回収時の活
性値を第３表示した。
社）にて回収し、PBS15で細胞を洗浄し、血清を完全
に除去した。回収した細胞のうち、１×109個とRPMI164
0培地（無蛋白培地）500mlを培養表面積850cm2のローラ
ーボトル（フアルコン社）に入れ、17本のローラーボト
ルを仕込んだ。各々のローラーボトルに誘導剤、PMAを5
0ng/mlとなるように添加し、回転数1/2R.P.M.、37℃で
培養し、３日目に、誘導剤無添加のRPMI1640培地を１ロ
ーラーボトル当り500mlの割合で交換し、培養液を合計
8.5回収した。同様の操作を繰り返し、合計３回の回
収を行い、合計約25の回収液を得た。その回収時の活
性値を第３表示した。
得られた培養上清のＭ−CSF活性は、11,000単位/mlで
あつた。
あつた。
実施例４ Ｍ−CSFの分離・精製 （１） 第１工程 上記工程で回収した培養上清25全量を濃縮装置（ペ
リコンカセツト、PM10膜使用、ミリポア社）により250m
lに濃縮した。この濃縮液をpH4.5に調整し、４℃で１晩
静置した。生成した沈澱を遠心分離器で分別し、上清を
回収しpH7.5に調整した。
リコンカセツト、PM10膜使用、ミリポア社）により250m
lに濃縮した。この濃縮液をpH4.5に調整し、４℃で１晩
静置した。生成した沈澱を遠心分離器で分別し、上清を
回収しpH7.5に調整した。
（２） 第２工程 次に、この液全量を、0.02M−リン酸緩衝液（pH7.4）
で平衡化したDE52（ワツトマン社）カラム（直径5cm×
高さ45cm）に通液し、吸着後0.015Mと0.5Mの食塩を含む
0.02Mリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて塩濃度を連続的に
高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ、0.10〜
0.18Mの塩濃度で溶出した分画660mlを集めた。溶出部の
結果を第１図に示す。
で平衡化したDE52（ワツトマン社）カラム（直径5cm×
高さ45cm）に通液し、吸着後0.015Mと0.5Mの食塩を含む
0.02Mリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて塩濃度を連続的に
高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ、0.10〜
0.18Mの塩濃度で溶出した分画660mlを集めた。溶出部の
結果を第１図に示す。
（３） 第３工程 第２工程で得た分画濃縮液150mlに粉末状硫酸アンモ
ニウムを1M濃度になるように添加し、pH7.4に調整した
後、0.15M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で平
衡化されたフエニルセフアロースCL−4B（フアルマシア
社）カラム（直径2.6cm×高さ60cm）に通液し吸着後、1
M硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）
及び硫酸アンモニウムを含まない0.01Mリン酸緩衝液（p
H7.4）を用いて塩濃度を連続的に下げていく直線濃度勾
配溶出法により溶出させ0.5〜0.2Mの塩濃度の緩衝液に
より溶出した分画300mlを集めた。この溶出部の結果を
第２図に示す。
ニウムを1M濃度になるように添加し、pH7.4に調整した
後、0.15M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で平
衡化されたフエニルセフアロースCL−4B（フアルマシア
社）カラム（直径2.6cm×高さ60cm）に通液し吸着後、1
M硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）
及び硫酸アンモニウムを含まない0.01Mリン酸緩衝液（p
H7.4）を用いて塩濃度を連続的に下げていく直線濃度勾
配溶出法により溶出させ0.5〜0.2Mの塩濃度の緩衝液に
より溶出した分画300mlを集めた。この溶出部の結果を
第２図に示す。
（４） 第４工程 上記第３工程溶出液を限外ロ過法（PM10膜、アミコン
社）を用いて濃縮し1mlとした。その中の200μを、0.
15M食塩、0.05％PEG及び0.02％Tween20を含む、0.02Mリ
ン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したスーパーローズ12
（フアルマシア社）カラム（直径1cm×高さ60cm）に通
液し相対溶出液量が1.5〜1.8の分画2.0mlを得た。この
工程を繰り返し、同分画10mlを集めた。このゲルロ過パ
ターンを第３図に示す。
社）を用いて濃縮し1mlとした。その中の200μを、0.
15M食塩、0.05％PEG及び0.02％Tween20を含む、0.02Mリ
ン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したスーパーローズ12
（フアルマシア社）カラム（直径1cm×高さ60cm）に通
液し相対溶出液量が1.5〜1.8の分画2.0mlを得た。この
工程を繰り返し、同分画10mlを集めた。このゲルロ過パ
ターンを第３図に示す。
（５） 第５工程 上記溶出液全量をFPLCシステム（フアルマシア社）に
装着し、0.1％トリフルオロ酢酸で平衡化した逆相分配
クロマト用C4カラム（直径4.6mm×高さ25cm、山村化学
社）に通液し吸着後0.1％トリフルオロ酢酸を含む０％
〜100％のアセトニトリルによる直線濃度勾配溶出法に
より溶出させ、アセトニトリル濃度53〜58％で溶出する
分画4.0mlを集めた。
装着し、0.1％トリフルオロ酢酸で平衡化した逆相分配
クロマト用C4カラム（直径4.6mm×高さ25cm、山村化学
社）に通液し吸着後0.1％トリフルオロ酢酸を含む０％
〜100％のアセトニトリルによる直線濃度勾配溶出法に
より溶出させ、アセトニトリル濃度53〜58％で溶出する
分画4.0mlを集めた。
次に、この分画を中和後、透析し、凍結乾燥を行い、
比活性1.0×108単位/mg蛋白質の本発明物質Ｍ−CSFを得
た。
比活性1.0×108単位/mg蛋白質の本発明物質Ｍ−CSFを得
た。
この物質を用いてマウス骨髄細胞を培養した際に形成
されたコロニーは単球／マクロフアージ系コロニーであ
つた。この工程での溶出部の結果を第４図に示す。
されたコロニーは単球／マクロフアージ系コロニーであ
つた。この工程での溶出部の結果を第４図に示す。
実施例５ Ｍ−CSFの理化学的性質 （１） SDS−電気泳動法による分子量測定 本発明物質３μｇをそのまま、及び２−メルカプトエ
タノール（２−ME）で処理した後、0.1％SDSを含む10％
ポリアクリルアミドゲルに付与し、0.1％SDSを含む25mM
トリス/192mMグリシン緩衝液（pH8.3）でそれぞれ電気
泳動を行つた。フアルマシア社標準分子量キツト（ホス
ホリラーゼｂ、分子量94,000:アルブミン、分子量67,00
0:オブアルブミン、分子量43,000:カルボニツクアンヒ
ドラーゼ、分子量30,000:トリプシンインヒビター、分
子量20,100:α−ラクトアルブミン、分子量14,400）を
用いて分子量検量線を作成し、活性評価と銀染色（バイ
オラツド社キツト）により分子量を測定した。
タノール（２−ME）で処理した後、0.1％SDSを含む10％
ポリアクリルアミドゲルに付与し、0.1％SDSを含む25mM
トリス/192mMグリシン緩衝液（pH8.3）でそれぞれ電気
泳動を行つた。フアルマシア社標準分子量キツト（ホス
ホリラーゼｂ、分子量94,000:アルブミン、分子量67,00
0:オブアルブミン、分子量43,000:カルボニツクアンヒ
ドラーゼ、分子量30,000:トリプシンインヒビター、分
子量20,100:α−ラクトアルブミン、分子量14,400）を
用いて分子量検量線を作成し、活性評価と銀染色（バイ
オラツド社キツト）により分子量を測定した。
本発明物質の分子量は38000±5000ダルトンであり、
また２−ME処理により分子量23000±5000ダルトンであ
つた。
また２−ME処理により分子量23000±5000ダルトンであ
つた。
（２） ゲルロ過法による分子量測定 以下の条件でゲルロ過のHPLCを行つた。
カラム：スーパーローズ12、直径1cm×60cm（フアルマ
シア社） 溶離液:0.05％PEG、0.02％Tween20及び含有0.02Mナトリ
ウムリン酸緩衝液（pH7.4）流速:0.5ml/分 フラクシヨン容積:0.5ml/チユーブ／分 また、分子量マーカーとして、γ−グロブリン（158,00
0）、フオスフオリラーゼｂ（94,000）、牛血清アルブ
ミン（67,000）、オブアルブミン（43,000）を用いた。
シア社） 溶離液:0.05％PEG、0.02％Tween20及び含有0.02Mナトリ
ウムリン酸緩衝液（pH7.4）流速:0.5ml/分 フラクシヨン容積:0.5ml/チユーブ／分 また、分子量マーカーとして、γ−グロブリン（158,00
0）、フオスフオリラーゼｂ（94,000）、牛血清アルブ
ミン（67,000）、オブアルブミン（43,000）を用いた。
上記マーカーの分子量を基準とすれば、本発明物質は
分子量56000±9000ダルトンであつた。
分子量56000±9000ダルトンであつた。
（３） 等電点 シヨ糖密度勾配等電点電気泳動法により等電点を測定
した。すなわち、40％両性担体フアルマライト３−10
（フアルマシア社:pH3〜10:登録商標）を3.8％含む50w/
v％シヨ糖溶液と同１％を含む水溶液とを用いて、冷却
用ジヤケツトを装着した内径1cm、長さ25.6cmのガラス
カラム内に段階的名密度勾配を作製したところ本発明物
質20μｇはこの密度勾配のほぼ中央にあつた。
した。すなわち、40％両性担体フアルマライト３−10
（フアルマシア社:pH3〜10:登録商標）を3.8％含む50w/
v％シヨ糖溶液と同１％を含む水溶液とを用いて、冷却
用ジヤケツトを装着した内径1cm、長さ25.6cmのガラス
カラム内に段階的名密度勾配を作製したところ本発明物
質20μｇはこの密度勾配のほぼ中央にあつた。
陽極側に１％リン酸−50％シヨ糖溶液、陰極側に1.6
％エチレジアミン溶液を用い、４℃の冷却水を循環させ
ながら500Vで22時間泳動させた。泳動終了後0.5mlずつ
分取し、氷水冷却下でpHを測定した後、各分画を0.05％
PEGを含む緩衝生理食塩水に対して透析し、各分画につ
いて活性を評価した。
％エチレジアミン溶液を用い、４℃の冷却水を循環させ
ながら500Vで22時間泳動させた。泳動終了後0.5mlずつ
分取し、氷水冷却下でpHを測定した後、各分画を0.05％
PEGを含む緩衝生理食塩水に対して透析し、各分画につ
いて活性を評価した。
本発明物質の等電点はpH4.4〜4.8であつた。
（４） アミノ酸組成 PICO・TAGTMアミノ酸分析システム（ウオーターズ
社）により蛋白質部分のアミノ酸組成を分析した。本発
明物質20μｇを70℃、窒素ガス流通下で乾固し、6N塩酸
により110℃で21時間PICO・TAGTM法により加水分解を行
つた。加水分解物にフエニルイソチオシアン酸塩を加え
てフエニルチオカルバミルアミノ酸を生成させ、内径3.
9mm、長さ15cmのPICO・TAGTMアミノ酸分析カラムを用い
て、酢酸ナトリウム／アセトニトリル／トリエチルアミ
ン及び水／アセトニトリル／トリエチルアミンを溶離液
としたクロマトグラフイーによりフエニルチオカルバミ
ルアミノ酸を分離分析した。
社）により蛋白質部分のアミノ酸組成を分析した。本発
明物質20μｇを70℃、窒素ガス流通下で乾固し、6N塩酸
により110℃で21時間PICO・TAGTM法により加水分解を行
つた。加水分解物にフエニルイソチオシアン酸塩を加え
てフエニルチオカルバミルアミノ酸を生成させ、内径3.
9mm、長さ15cmのPICO・TAGTMアミノ酸分析カラムを用い
て、酢酸ナトリウム／アセトニトリル／トリエチルアミ
ン及び水／アセトニトリル／トリエチルアミンを溶離液
としたクロマトグラフイーによりフエニルチオカルバミ
ルアミノ酸を分離分析した。
また、アミノ酸標準液（ピアス社:Type H）を同様に
フエニルチオカルバミル化して分析して作成した検量線
により蛋白質部分のアミノ酸組成を求めた。
フエニルチオカルバミル化して分析して作成した検量線
により蛋白質部分のアミノ酸組成を求めた。
得られた結果をモル％で示すと下記の通りであつた。
アスパラギン酸（Asp）及び アスパラギン（Asn） 6.94 グルタミン酸（Glu）及び グルタミン（Gln） 15.62 セリン（Ser） 8.14 グリシン（Gly） 1.97 ヒスチジン（His） 2.72 アルギニン（Arg） 2.98 スレオニン（Thr） 5.13 アラニン（Ala） 3.71 プロリン（Pro） 2.63 チロシン（Tyr） 3.36 バリン（Val） 6.84 メチオニン（Met） 1.20 システイン（Cys） 1.21 イソロイシン（Ile） 6.23 ロイシン（Leu） 13.50 フエニルアラニン（Phe） 7.68 リジン（Lys） 10.15 なお、一般に上記分析条件下においては、システイン
及びトリプトフアンの分解回収率が低いことが知られて
いる。
及びトリプトフアンの分解回収率が低いことが知られて
いる。
（５） Ｎ末端アミノ酸配列 本発明物質の純度検定及び部分構造解明のため、本発
明物質約20μｇを用い、気相式プロテインシーケンサー
（477A型、ABI社）にかけ得られたPTH（フエニルヒダン
トイン）アミノ酸をHPLC（120A型、ABI社）にて分析
し、アミノ酸を同定定量した。その結果50番目までアミ
ノ酸配列を決定することができた。また、Ｎ末端アミノ
酸として確認できたのは２種類であり、電気泳動の結果
とも合わせて純度はほぼ100％である事を確認した。
明物質約20μｇを用い、気相式プロテインシーケンサー
（477A型、ABI社）にかけ得られたPTH（フエニルヒダン
トイン）アミノ酸をHPLC（120A型、ABI社）にて分析
し、アミノ酸を同定定量した。その結果50番目までアミ
ノ酸配列を決定することができた。また、Ｎ末端アミノ
酸として確認できたのは２種類であり、電気泳動の結果
とも合わせて純度はほぼ100％である事を確認した。
決定したアミノ酸配列は〔Ａ〕および〔Ｂ〕であつ
た。
た。
（１） 本発明のヒト細胞は、血清を含まない無蛋白培
地で、Ｍ−CSFの高産生が持続する。
地で、Ｍ−CSFの高産生が持続する。
（２） 本発明のヒト細胞は、天然型Ｍ−CSFの生産性
が高く、臨床応用可能量の高純度Ｍ−CSFを取得でき
る。本発明の方法によつて得られた新規Ｍ−CSFは、白
血球減少症治療剤、制癌剤等医薬品又は診断薬としての
用途が期待される。
が高く、臨床応用可能量の高純度Ｍ−CSFを取得でき
る。本発明の方法によつて得られた新規Ｍ−CSFは、白
血球減少症治療剤、制癌剤等医薬品又は診断薬としての
用途が期待される。
（３） 工業的製造が可能であり、製造コストが安価で
ある。
ある。
第１図〜第４図は、各々実施例による方法でのイオン交
換クロマトグラフイーの溶出部の結果、フエニルセフア
ロースクロマトグラフイーの溶出部の結果、スーパーロ
ーズ12によるゲルロ過の結果、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー（RP−HPLC）の結果を示すものである。
換クロマトグラフイーの溶出部の結果、フエニルセフア
ロースクロマトグラフイーの溶出部の結果、スーパーロ
ーズ12によるゲルロ過の結果、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー（RP−HPLC）の結果を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 朝倉 淳 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 中田 晃世 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 鈴木 弘康 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社総合研究所内 審査官 吉住 和之 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/02 C12N 5/08 C07K 14/535 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】骨髄細胞に作用して単求−マクロファージ
の分化増殖を促進させる糖蛋白質からなり、下記理化学
的性質を有する骨髄細胞分化増殖因子。 （ａ） 分子量が、非還元条件下でSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定すると38000±5000ダルト
ンであり、非還元条件下ゲルロ過法で測定すると56000
±9000ダルトンであり、 （ｂ） 逆相HPLCにおいて単一のピークとして移動し、 （ｃ） 比活性が少なくとも１×108単位/mg蛋白質であ
り、 （ｄ） 蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、 である。 - 【請求項２】ヒト骨髄性白血病細胞から分離された細胞
のクローンであって、血清を含む組織培養培地で増殖
し、化学試薬により誘導後、無血清培地、または無蛋白
培地中に多量の請求項（１）記載の骨髄細胞分化増殖因
子を長時間産生する性質を有することを特徴とする骨髄
細胞分化増殖因子産生細胞DK−２。 - 【請求項３】 請求項（２）記載の骨髄細胞分化増殖
因子産生細胞を無蛋白（または無血清）条件下で培養
し、 の培養上清を濃縮後、pH2.5〜5.0の条件下で前処
理し、不溶画分を分離し、 の処理液をpH5.0〜7.5の条件下で陰イオン交換体
と接触させ、有用物質を該イオン交換体に吸着させた
後、0.05〜0.3M無機塩溶液にて溶出される分画を集め、 の分画を1.0〜1.5Mの無機塩濃度に調整し、pH6.0
〜8.0の条件下で疎水性吸着体に吸着させた後、0.1〜0.
5Mの無機塩溶液により溶出される分画を集め、 の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相対溶出
液量が1.5〜1.8の分画を取得し、 の溶出液逆相イオンクロマトグラフィー操作を行
うことにより、得ることを特徴とする請求項（１）記載
の骨髄細胞分化増殖因子の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1046420A JP2846331B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1046420A JP2846331B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02227089A JPH02227089A (ja) | 1990-09-10 |
| JP2846331B2 true JP2846331B2 (ja) | 1999-01-13 |
Family
ID=12746661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1046420A Expired - Fee Related JP2846331B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2846331B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2142453A1 (en) * | 1992-09-09 | 1994-03-17 | Tomio Morino | Novel physiologically active substance nk175203, process for production thereof and pharmaceutical use thereof |
-
1989
- 1989-03-01 JP JP1046420A patent/JP2846331B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02227089A (ja) | 1990-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4490289A (en) | Homogeneous human interleukin 2 | |
| Grabstein et al. | Purification to homogeneity of B cell stimulating factor. A molecule that stimulates proliferation of multiple lymphokine-dependent cell lines. | |
| EP0433827B1 (en) | Cytotoxic lymphocyte maturation factor | |
| CA2117953C (en) | Human stromal derived factor 1 alpha and 1 beta and dnas encoding the same | |
| EP2479277B1 (en) | Use of MGD-CSF in a method of treatment of Alzheimer's disease. | |
| US4675291A (en) | Human cultured cell line | |
| AU590543B2 (en) | Purification of native colony stimulating factor-1 | |
| JPH09508524A (ja) | Ｉｌ−３変種造血融合蛋白 | |
| JPH029394A (ja) | ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 | |
| JPS58190397A (ja) | インターリューキン−２およびその純化方法 | |
| JP4004088B2 (ja) | 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 | |
| US7355014B2 (en) | Interferon-γ inducing polypeptide, pharmaceutical composition thereof, monoclonal antibody thereto, and methods of use | |
| JP2846331B2 (ja) | 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 | |
| JP2559035B2 (ja) | 細胞生長調節因子 | |
| CA1330768C (en) | Monoclonal anti-human granulocyte colony stimulating factor antibody | |
| JP3122963B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPH03127993A (ja) | マクロファージ活性化因子及びその製造方法 | |
| JP2001275679A (ja) | マクロファージ遊走阻止因子を含有する造血幹細胞増殖剤 | |
| JPS63150297A (ja) | 新規ｂ細胞分化因子蛋白標品 | |
| JPH11209399A (ja) | 高比重リポ蛋白質を有効成分とする医薬組成物 | |
| JPH01135800A (ja) | 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法 | |
| JPH11240898A (ja) | ポリペプチド | |
| JPS62169731A (ja) | 細胞分化誘導剤 | |
| JPH02138199A (ja) | 免疫抑制因子ｉ及び２，その製造法及びそれを有効成分とする免疫抑制剤 | |
| JPS62123126A (ja) | 細胞ｄｎａ合成抑制因子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |