JPS62169731A

JPS62169731A - 細胞分化誘導剤

Info

Publication number: JPS62169731A
Application number: JP61010764A
Authority: JP
Inventors: Munehiro Noda; 宗宏野田; Yoichi Itoi; 糸井　要一; Yutaka Morise; 森勢　裕; Hirobumi Arimura; 有村　博文
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-01-21
Filing date: 1986-01-21
Publication date: 1987-07-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ヒト癌壊死因子（以下ＴＮＦと記す）の新規
な医薬用途に関し、さらに詳しくは、分子量が３６，０
００±１　、５００のＴＮＦを主成分とする細胞分化誘
導剤に関する。

〔従来技術〕

癌の治療において従来の抗癌剤による化学療法は、正常
の細胞、組織に対する細胞毒性という副作用の問題があ
り、それが大きな障害となっている。そこで最近、新し
い癌治療の一つの方法として分化誘導による脱癌の研究
が注目されるようになってきた。白血病細胞をはじめ種
々の悪性腫瘍細胞およびそれらの樹立培養株細胞が分化
能を保持しており、ｉｎνｉ　ｔｒｏ実験系で分化誘導
が可能であることが示されたためであり、適当な分化誘
導物質にて白血病細胞等が分化誘導することによって形
態的にも機能的にも正常な成熟細胞に類似した細胞に分
化し、細胞の増殖性や造腫瘍性が低下あるいは喪失する
ことが明らかにされたからである。

細胞分化を誘導する既知物質としてＴＰＡ　（Ｔｅｔｒ
ａ−ｄｅｃａｎｏｙｌ　　１３．−ｐｈｏｒｂｏｌ　ａ
ｃｅｔａｔｅ）　、ＤＭＳＯ（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｓｕ
ｌｆｏｘｉｄｅ）などが知られている〔プロシーデイン
ダス　オプ　ザ　ナショナル　アカデミーオブ　サイエ
ンシーズ　オプ　ザ　ニー、ニス。

ニー、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ）、副、２７７９−２７８３　１．１９７
９、　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）、互、２４５Ｂ−２４６７，１９
７Ｂ、、　）。一方、分化を誘導する生体内物質として
、ビタミンＡ　　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＳ７７、　２９３６−２
９４０．１９８０）　、ビタミンＤ　　（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａ目、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ％　７８．４９
９０−４９９４．１９８１）がある。また、前骨髄性白
血病細胞（ＨＬ−６０）の分化をｉｔするタンパク性の
分化誘導因子の報告もある〔ジャーナル　オブザ　ナシ
ョナル　キャンサー　インスト（Ｊ、　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）　、６７．１２２５−１２
３０．１９８１）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者等は、上記先行知見を認識し、よりすぐれた細
胞分化誘導物質を得るべく研究を重ねてきた。

その結果、ＴＮＦを一定量以上に投与した場合に、ＴＮ
Ｆはヒト単核性白血球に対して優れた細胞分化誘導活性
を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕本発明は、分子量が３６，０００±１，５００のヒト癌
壊死因子を主成分とする細胞分化誘導剤を提供するもの
である。

＋１）　Ｔ　Ｎ　ＦＴＮＦとしては、ヒト由来のものが使用され、通常次の
ような物理的・化学的性状を有する。

■　分子内に１つのＳ−Ｓ結合を有する。

■　分子量１７　Ｋ　（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）モノマーが
天然状態ではダイマーまたはオリゴマーとして存在して
いる。

■　等電点（ｐｒ）　５．３〜５．６ ■　安定性ｐＨ２（４℃、−夜）　−９０％以上失活加熱（５６℃
、３０分）　−−８０％以上残存■　その塩基およびア
ミノ酸配列の例としては次のものがあげられる。

〔以下余白〕

Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ’　
Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａ
ｌ＾ｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　
Ｐｒ。

Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅａ　Ａｓｎ３〇八ｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　ＧｌｙＶａ
ｌ　　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｉ
ｎ　　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ｖａ１Ｇｌｎ　Ｖａｔ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ
　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｔｈｒ旧ｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ｌｉｅＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉ
ｌｅ　Ｉｌｅ　＾Ｉａ　Ｌｅｕ当該ＴＮＦの製造方法と
しては、遺伝子組み換え技術による手法が各種開示され
ている（特開昭６０−１８５７９９　、Ｆ！ｌ’−１５
８２８６、特開昭６Ｏ−２３２０９７）が、広くこれら
を応用して調製できる。細胞培養による方法としては、
後記参考例に示すように、株化リンパ系細胞をセンダイ
ウィルス等で刺激することによって得られる。

（２］　Ｔ　Ｎ　Ｆの作用（イ）ＴＮＦによる細胞分化誘導活性細胞株として、ヒトの骨髄性白血病細胞株ＭＬ−１（細
胞数３　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ　／ｍｌ）を用い、培地
として非動化した１０％牛脂児血清を含むＲＰ旧１６４
０培地を用いることによって３日間培養した。

この培養系に、ＴＮＦを０．１　μｇ／ｍｌ添加し、３
日間培養後に、形態変化、生死細胞数、Ｆｃリセプター
活性、ＮＢＴ還元能、亥食能を測定し、その結果を後記
表１に示した。

さらに、α−ナフチルアセテートエステラーゼ活性や細
胞表面に対する種々のモノクローナル抗体による解析か
ら単球／マクロファージ系へ分化していることが示唆さ
れた。

かくして本発明細胞分化誘導剤が細胞分化活性を有する
ことがｉ認された。

表Ｉ　　ＴＮＦの分化誘導活性注）＊ＴＮＦ無添加（ロ）ＴＮＦの分化誘導作用の増幅本発明の細胞分化誘導剤は、特定の第三成分の添加によ
ってその細胞分化誘導作用が増強される。

たとえば、インターフェロン、特にインターフェロン−
Ｔ１ダウノマイシン、シトシン　アラビノサイド（Ａｒ
ａ　Ｃ）、アクチノマイシン等のＤＮＡ合成阻害剤とＴ
ＮＦとを併用することによって、たとえば、ＴＮＦ単独
では細胞分化誘導作用を示さない量においても、上記第
三成分との併用によってその作用が発現される。当該第
三成分の添加割合は、インターフェロン−γの場合、Ｔ
ＮＦの１μｇに対して１　、０００〜１００．０００単
位程度である。

インターフェロンおよびＤＮＡ合成阻害剤がＴＮＦの細
胞分化誘導作用の増幅作用を有することは、次の実験か
らも明らかである。

これらの実験はいずれもＮＢＴ　にトロブルーテトラゾ
リウム）還元能〔ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、Ｖｏｌ、６
３、階３．５１０−５１７．１９８４）を測定すること
によって行った。

（３）投与方法及び投与量本発明からなる製剤は、通常非経口投与によって供与さ
れる。特に、製剤化の工夫により静脈投与を行うことが
より好適である。

本発明の目的におけるＴＮＦの投与量は、患者の体重、
性別、年令、症状等によって異なるが、通常の癌壊死の
必要とされる量の１０〜５００倍量が適当である。

（４）　　急性毒性ＴＮＦは、ウサギから得られた製剤及び遺伝子組み換え
によって得られた製剤共に臨床使用されているが、投与
による特別な毒性はみられていない。ＴＮＦのＬＤｓｏ
は静脈注射で雄マウス４３８×１０５単位／ｋｇ、雌マ
ウス３４６Ｘ１０”単位／ｋｇである。

（５１７Ｎ　Ｆの製造例０．１％ヒト血清アルブミン加ＲＩＴＣ−５６−２無血
清培地を用いて、ヒト培養リンパ芽球ナマルバ細胞を容
量７０１規模で、ステンレス製タンクＣＮＢ５社製５ｅ
ｅｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌ）にて培養した。

植え込み細胞数３０〜５０Ｘ１０４細胞／ｍ＋にて培養
を開始し、４〜５日後に細胞数は２００〜３００×１０
４細胞／ｍｌになった。そこへインデューサーであるセ
ンダイウィルス（ＨＶＪ）を５０ｍ、ｏ、ｉ。

の割合にて添加し、更に２０〜２４時間培養した。

遠心操作により細胞と培養上清を分離した。

培養上清を分子量１万カツトのペリコンカセットシステ
ム（ミリボア社製）を用いて濃縮する。

濃縮液を透析用チューブ（三光純薬社製）を用い、５０
〜１００倍量の０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
）で４℃の温度で一晩透析した。透析液をｐｌ＋８の０
．０２Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−
セファロース６Ｂを充填したカラム（径５ｃＩ１１×長
さ２０ａｎ）に通し、ＴＮＦを吸着させた後、上記緩衝
液に塩化ナトリウムで０．０２５〜０．２５Ｍの連続的
濃度勾配をつけて溶離し、ＴＮＦの活性画分を回収した
。

一方、ＴＮＦで予め免疫しておいたマウスＢＡＬＢ−ｃ
の肺臓細胞とマウスミエローマ細胞ヲポリエチレングリ
コールにより融合させたハイブリドーマのうち、ＴＮＦ
に対する抗体産生の高いクローンを選択した。この融合
細胞の培養液から、抗ＴＮＦモノクローナル抗体を回収
した。このモノクローナル抗体をＣＮＢ　ｒ活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを、０．４Ｍ　ＮａＣ１
含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＦＩ７．ｏ）で平衡化し
、これに前記のＴＮＦを含有する溶出液を接触した。

０．４Ｍ　ＮａＣ１含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）でカラムを洗浄した後、吸着していたＴＮＦを３
．５Ｍチオシアン酸カリウム＋０．５Ｍ塩化ナトリウム
（ｐＨ８）で溶出させた。溶出液をＰＢＳ（−）に対し
て透析し除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が少なくと
も１．２Ｘ　１０７ＬＵ／ｍｇの高度精製ＴＮＦを得た
。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量１７，０００の１本の帯を示した
。

（６）製剤化法ＴＮＦの精製は、自体既知の手段にて行われ、１またとえば、ゲル濾過、抗体力ラムアフィニティクロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の方法を
組み合わせて高度精製できる。

本発明の製剤を医薬品として用いる場合には医薬品製造
の通例技術にしたがって、要すれば加熱処理、除菌濾過
、凍結乾燥、分注、製剤化を行えばよい。かくして新規
な細胞分化誘導物質を含有する医薬が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】

分子量が３６，０００±１，５００のヒト癌壊死因子を
主成分とする細胞分化誘導剤。