JPH0629194B2 - 悪性腫瘍性貧血治療剤 - Google Patents
悪性腫瘍性貧血治療剤Info
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- JPH0629194B2 JPH0629194B2 JP61022928A JP2292886A JPH0629194B2 JP H0629194 B2 JPH0629194 B2 JP H0629194B2 JP 61022928 A JP61022928 A JP 61022928A JP 2292886 A JP2292886 A JP 2292886A JP H0629194 B2 JPH0629194 B2 JP H0629194B2
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- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヒトエリスロポエチン（以下「ヒトＥＰＯ」と
いう）を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。
いう）を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。
本願明細書においてヒトＥＰＯとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペプタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯ」という）、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯ」
という）、ヒト腎癌細胞の組織培養物から得られるも
の、あるいはヒトＥＰＯ産生能を有するヒト由来の細胞
株を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られ
るもの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下「Ｅ
ＰＯ」という）という場合、それはヒトに限らず、種々
の動物において骨ずいに存在する赤芽球系幹細胞に働い
て、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を
示す微量生理活性物質をいう。
酸配列を有するポリペプタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯ」という）、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯ」
という）、ヒト腎癌細胞の組織培養物から得られるも
の、あるいはヒトＥＰＯ産生能を有するヒト由来の細胞
株を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られ
るもの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下「Ｅ
ＰＯ」という）という場合、それはヒトに限らず、種々
の動物において骨ずいに存在する赤芽球系幹細胞に働い
て、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を
示す微量生理活性物質をいう。
ヒト尿ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。
近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており［例えば、ＭｉｌｌｅｒＡ等；ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）３５巻１２４８頁（１９５
６年）を参照］、特に重度の貧血は臨床的に患者の治療
上重要な問題となっている。
認められており［例えば、ＭｉｌｌｅｒＡ等；ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）３５巻１２４８頁（１９５
６年）を参照］、特に重度の貧血は臨床的に患者の治療
上重要な問題となっている。
貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、脾の関与、ＥＰＯ産生障害、
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中ＥＰＯ値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ
等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５３巻１１３
２頁（１９７４年）、Ｄｏｕｇｌａｓ ＳＷ等；ブラッ
ド（Ｂｌｏｏｄ）４５巻５５頁（１９７５年）、Ｆｉｒ
ａｔ Ｄ等；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．）３１巻１３５５頁（１９７１年）、Ｗａｒｄ Ｈ
Ｐ等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲ
ーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５０巻３３
２頁（１９７１年）及びＤｅＧｏｗｉｎ ＲＬ等；ジャ
ーナル オブ ラボラトリーアンド クリニカル メデ
イシン（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）９４巻３０
３頁（１９７９年）等を参照］。
鉄ブロック、鉄放出障害、脾の関与、ＥＰＯ産生障害、
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中ＥＰＯ値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ
等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５３巻１１３
２頁（１９７４年）、Ｄｏｕｇｌａｓ ＳＷ等；ブラッ
ド（Ｂｌｏｏｄ）４５巻５５頁（１９７５年）、Ｆｉｒ
ａｔ Ｄ等；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．）３１巻１３５５頁（１９７１年）、Ｗａｒｄ Ｈ
Ｐ等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲ
ーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５０巻３３
２頁（１９７１年）及びＤｅＧｏｗｉｎ ＲＬ等；ジャ
ーナル オブ ラボラトリーアンド クリニカル メデ
イシン（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）９４巻３０
３頁（１９７９年）等を参照］。
しかしながら、血中ＥＰＯ値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｎｃｋｅｒ Ｓ 等；ジャー
ナル オブ クリニカル インベスティゲーション
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５３巻１１３２頁
（１９７４年）を参照］。
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｎｃｋｅｒ Ｓ 等；ジャー
ナル オブ クリニカル インベスティゲーション
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５３巻１１３２頁
（１９７４年）を参照］。
従って悪性腫瘍性貧血患者にヒトＥＰＯを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
ヒト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはな
い。
れているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはな
い。
本発明者等は高純度に精製したヒト尿ＥＰＯおよびヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒトｒＥＰＯを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰ
Ｏが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係
るものである。
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒトｒＥＰＯを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰ
Ｏが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係
るものである。
すなわち本発明はヒトＥＰＯを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤である。
悪性腫瘍性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトＥＰＯは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿（血清を含む）から抽出す
ることにより得ることができる［Ｔ．ＭＩＹＡＫＥ等、
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂ．Ｃ．）、２５２巻５５５８頁（１９７７
年）；Ｊ．Ｐ．Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボ
ラトリー アンド クリニカル メディシン（Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）、６６巻９８７頁（１９６５
年）］。
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿（血清を含む）から抽出す
ることにより得ることができる［Ｔ．ＭＩＹＡＫＥ等、
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂ．Ｃ．）、２５２巻５５５８頁（１９７７
年）；Ｊ．Ｐ．Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボ
ラトリー アンド クリニカル メディシン（Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）、６６巻９８７頁（１９６５
年）］。
またヒトｒＥＰＯは例えばヒトＥＰＯのアミノ酸配列に
対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、
そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで
適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。［例えば、Ｓ
ＹＬＶＩＡ Ｌ．Ｈ．等；プロシーディングス オブ
ザナショナル アカデミー オブ ザ ユー エスエー
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
８１巻２７０８頁（１９８４年）を参照］。
対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、
そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで
適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。［例えば、Ｓ
ＹＬＶＩＡ Ｌ．Ｈ．等；プロシーディングス オブ
ザナショナル アカデミー オブ ザ ユー エスエー
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
８１巻２７０８頁（１９８４年）を参照］。
前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は哺乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げるこ
とができる。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製
造する方法［特開昭５４−５５７９０］、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１］、ヒト細胞株を細胞融
合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等に
よっても製造することができる。
が好ましくはヒト又は哺乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げるこ
とができる。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製
造する方法［特開昭５４−５５７９０］、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１］、ヒト細胞株を細胞融
合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等に
よっても製造することができる。
これらの方法によって得られたヒトＥＰＯは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。
得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾
燥、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存するこ
とができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩
類もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出さ
せ、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。
また所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衡液に溶解した
後、ミリポアフィルター等で無菌ろ過して注射剤とする
ことができる。
燥、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存するこ
とができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩
類もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出さ
せ、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。
また所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衡液に溶解した
後、ミリポアフィルター等で無菌ろ過して注射剤とする
ことができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトＥＰＯの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常９×１04ц／mgヒトＥＰＯとし
て成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ましくは５〜１
００μｇのヒトＥＰＯを含有する製剤を１週間に１〜７
回投与することができる。
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常９×１04ц／mgヒトＥＰＯとし
て成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ましくは５〜１
００μｇのヒトＥＰＯを含有する製剤を１週間に１〜７
回投与することができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、ヒトＥＰＯの１重量部
にたいして０．１１〜１００００重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。
にたいして０．１１〜１００００重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。
これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とpHの水
溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０．
１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．２
である。水溶液のpHは５．０〜９．０に調整し、特にpH
６〜８に調整するのが好ましい。
溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０．
１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．２
である。水溶液のpHは５．０〜９．０に調整し、特にpH
６〜８に調整するのが好ましい。
また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。
を添加してもよい。
参考例１ ヒト尿ＥＰＯの製造 Ｓｔｅｐ １）人尿からの部分精製 ＭＩＹＡＫＥ．Ｔ．等の方法［ジャーナル・オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂ．Ｃ．）５２巻５５
５８頁（１９７７年）］に従って再生不良性貧血患者尿
から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０による脱塩 ２）
ＤＥＡＥセルロースによるバッッチ吸着 ３）エタノー
ル沈殿 ４）ＤＥＡＥアガロースカラムクロマトグラフ
ィーを用いて部分精製されたヒト尿ＥＰＯを得た。
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂ．Ｃ．）５２巻５５
５８頁（１９７７年）］に従って再生不良性貧血患者尿
から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０による脱塩 ２）
ＤＥＡＥセルロースによるバッッチ吸着 ３）エタノー
ル沈殿 ４）ＤＥＡＥアガロースカラムクロマトグラフ
ィーを用いて部分精製されたヒト尿ＥＰＯを得た。
Ｓｔｅｐ ２）逆相クロマトグラフィー 得られた部分精製ヒト尿ＥＰＯを２４％プロパノール
（和光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａ
ｌｄｒｉｃｈｉ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣ
による精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立６３８−５０
型を用い２８０nmと２２０mmの紫外部吸収により検出を
行った。
（和光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａ
ｌｄｒｉｃｈｉ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣ
による精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立６３８−５０
型を用い２８０nmと２２０mmの紫外部吸収により検出を
行った。
２４％ｎ−プロパノールを含んだ０．１％トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（６mm×
３０cm山村化学社製）に上記で得られた試料を注入し、
前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後、ｎ
−プロパノールの濃度を２６％に高めて溶出させた。Ｅ
ＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０
０（Ａｍｉｃｏｎ社商品名）を用いた限外ろ過法によ
り、０．１〜０．２ｍに濃縮した。
酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（６mm×
３０cm山村化学社製）に上記で得られた試料を注入し、
前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後、ｎ
−プロパノールの濃度を２６％に高めて溶出させた。Ｅ
ＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０
０（Ａｍｉｃｏｎ社商品名）を用いた限外ろ過法によ
り、０．１〜０．２ｍに濃縮した。
Ｓｔｅｐ ３）高速分子篩クロマトグラフィー 上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパノールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７．８mm×６０cm東洋曹達社製）に注入し、前記
平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３００００の
位置にＥＰＯ活性を有するピークが得られたので、この
部分を集めて凍結乾燥した。比活性は約９×１０４ц／
mgであった。
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７．８mm×６０cm東洋曹達社製）に注入し、前記
平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３００００の
位置にＥＰＯ活性を有するピークが得られたので、この
部分を集めて凍結乾燥した。比活性は約９×１０４ц／
mgであった。
各ステップに於ける比活性を表Ｉに示す。
参考例 ２ ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯの製造 １２月２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質
転換のための補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９
−２８１８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰ
Ｏのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラス
ミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）
で形質発現させることによってヒトｒヒトＥＰＯを得
た。要約すると以下の如くである。
転換のための補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９
−２８１８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰ
Ｏのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラス
ミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）
で形質発現させることによってヒトｒヒトＥＰＯを得
た。要約すると以下の如くである。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＯＰＥＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
Ｉフラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒトＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒト
ｒＥＰＯを産生させた。最終的な培養上清中のヒトｒＥ
ＰＯの活性は２０ц／ｍであった。
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＯＰＥＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
Ｉフラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒトＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒト
ｒＥＰＯを産生させた。最終的な培養上清中のヒトｒＥ
ＰＯの活性は２０ц／ｍであった。
ＣＨＯ細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰＯはＫｒｙｓｔａｌ等の方法
［ジャーナル オブ ラボラトリー アンド クリニカ
ル メディスン（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）９
７巻１４４頁（１９８１年）］により６６００ц／ｍ
の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰＯはＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰＯはＫｒｙｓｔａｌ等の方法
［ジャーナル オブ ラボラトリー アンド クリニカ
ル メディスン（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）９
７巻１４４頁（１９８１年）］により６６００ц／ｍ
の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰＯはＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。
得られたヒトｒＥＰＯに０．１％ＢＳＡを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。
塩水にて透析した後、実験に供した。
＜実施例＞悪性腫瘍性貧血に対するヒトＥＰＯの 貧血治療効果 １．担癌マウスの作成 ６週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫瘍株の
小片（１〜２mm角）を移植後、１２〜１６日のちに背中
足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロ
ビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコールタ
ーカウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。（表
II） 表IIに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
小片（１〜２mm角）を移植後、１２〜１６日のちに背中
足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロ
ビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコールタ
ーカウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。（表
II） 表IIに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
２．ヒトＥＰＯによる貧血治療効果 ａ）Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ 移植マウスモデル １と同様な方法で６週令の雄性ＢＤＦＩ系マウス（日本
チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍の
生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３
群（各群７匹）に分けた。移植後９日目より各々の群に
ヒト尿ＥＰＯ（１０ц／マウス／日）、ＣＨＯ細胞由来
ヒトｒＥＰＯ（１０ц／マウス／日）および溶媒（０．
１％ＢＳＡ液を含むＲＰＭＩ １６４０培地の透析後
０．５ｍ／マウス／日）を隔日にて、７回皮下投与し
た。
チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍の
生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３
群（各群７匹）に分けた。移植後９日目より各々の群に
ヒト尿ＥＰＯ（１０ц／マウス／日）、ＣＨＯ細胞由来
ヒトｒＥＰＯ（１０ц／マウス／日）および溶媒（０．
１％ＢＳＡ液を含むＲＰＭＩ １６４０培地の透析後
０．５ｍ／マウス／日）を隔日にて、７回皮下投与し
た。
移植後１６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量にして１mg／マウ
ス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
ス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
対照群をして同系の非担癌マウス（７匹）を用いた。
赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図１、図２に示す。
変化について、それぞれ図１、図２に示す。
ｂ）Ｃ３ＭＣ２ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ 搬移植マ
ウスモデル １と同様な方法で６週令の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス
（日本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて３群（各群７匹）に分けた。移植後２９日目より
各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ц／マウス）、ＣＨＯ細
胞由来ヒトｒＥＰＯ（１０ц／マウス／日）および溶媒
（０．１％ＢＳＡ液を含とＲＰＭＩ １６４０培地の透
析液、０．５ｍ／マウス／日）を隔日にて７回皮下投
与した。移植後３６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量、１ｍｇ
／マウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行
った。
ウスモデル １と同様な方法で６週令の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス
（日本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて３群（各群７匹）に分けた。移植後２９日目より
各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ц／マウス）、ＣＨＯ細
胞由来ヒトｒＥＰＯ（１０ц／マウス／日）および溶媒
（０．１％ＢＳＡ液を含とＲＰＭＩ １６４０培地の透
析液、０．５ｍ／マウス／日）を隔日にて７回皮下投
与した。移植後３６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量、１ｍｇ
／マウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行
った。
対照群として同系の非担癌マウスを用いた。
赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図３、図４に示す。図１〜４に
しめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、担癌後の日
数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに対し、ヒト
ＥＰＯ投与担癌マウス群では明らかに貧血が改善され
た。
変化について、それぞれ図３、図４に示す。図１〜４に
しめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、担癌後の日
数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに対し、ヒト
ＥＰＯ投与担癌マウス群では明らかに貧血が改善され
た。
またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例１ ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯ １重量部 ヒト血清アルブミン １００重量部 注射用蒸留水にて全量 １０００００重量部 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。
し、凍結乾燥し密封した。
実施例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
実施例３ １００ｍ中にマンニトール５ｇ、ヒト尿ＥＰＯ１mg、
ヒト血清アルブミン１００mg、アセチルトリプトファン
ナトリウム２．１５４mg、カプリル酸ナトリウム１．３
３mgを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
ヒト血清アルブミン１００mg、アセチルトリプトファン
ナトリウム２．１５４mg、カプリル酸ナトリウム１．３
３mgを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
実施例４ pH７．０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ中にヒト
尿ＥＰＯ１mg、ポリエチレングリコール４０００ ５０
０mg、エチレンオキサイドプロピレオンオキサイド共重
合体３０mg、塩化ナトリウム８００mgを含む水溶液を無
菌的に調整し、１ｍずつアルプルに分注熔閉する。
尿ＥＰＯ１mg、ポリエチレングリコール４０００ ５０
０mg、エチレンオキサイドプロピレオンオキサイド共重
合体３０mg、塩化ナトリウム８００mgを含む水溶液を無
菌的に調整し、１ｍずつアルプルに分注熔閉する。
実施例５ pH７．０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ中にＣＨＯ
細胞由来ヒトｒＥＰＯ０．５mg、グリシン１ｇ、ソルビ
トール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、０．５ｍ
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に０．
１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ずつアンプに分注し、溶解用溶液密閉する。
細胞由来ヒトｒＥＰＯ０．５mg、グリシン１ｇ、ソルビ
トール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、０．５ｍ
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に０．
１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ずつアンプに分注し、溶解用溶液密閉する。
実施例６ １００ｍ中にヒトｒＥＰＯ１mg、ヒト血清アルブミン
５００mg、マンニトール５００mgを含む水溶液を無菌的
に調整し、１ｍずつバイアルに分注し凍結乾燥し密封
する。
５００mg、マンニトール５００mgを含む水溶液を無菌的
に調整し、１ｍずつバイアルに分注し凍結乾燥し密封
する。
別に３００ｍ中にグリコン酸第二鉄３ｇ、ＮａＣ１
２．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍずつア
ンプルに分注し、熔封する。
２．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍずつア
ンプルに分注し、熔封する。
上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。
で）静注する。
図１はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血赤血球数（Ｒ
ＢＣ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血赤血球数（ＲＢ
Ｃ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量
（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いて○−○は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群▲−▲はヒト尿ＥＰＯ投与担癌マ
ウス群、□−□はＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯ投与担癌
マウス群を示す。 又図中に表示した＊印は、溶媒投与担癌マウス群に対す
る有意水準を示しており、＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜
０．０１ ＊＊＊ｐ＜０．００１を意味する。
ＢＣ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血赤血球数（ＲＢ
Ｃ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量
（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いて○−○は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群▲−▲はヒト尿ＥＰＯ投与担癌マ
ウス群、□−□はＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯ投与担癌
マウス群を示す。 又図中に表示した＊印は、溶媒投与担癌マウス群に対す
る有意水準を示しており、＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜
０．０１ ＊＊＊ｐ＜０．００１を意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ，51（1983） Ｐ．1101〜 1106 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，31 （1971） Ｐ．1353〜1359 Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．, 109（1983） Ｐ．269〜272 「新版 日本血液学全集３ 貧血Ｉ」 （昭55−10−30）丸善 Ｐ．577〜578 Ｓｃｉｅｎｃｅ，125（1957） Ｐ. 1085〜1086 Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａｅｍ．，５ （1968） Ｐ．415〜424
Claims (6)
- 【請求項１】ヒトエリスロポエチンを有効成分として含
有する、血中エリスロポエチン濃度の低下していない悪
性腫瘍性貧血に対する治療剤。 - 【請求項２】ヒトエリスロポエチンが人尿由来のもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の悪性
腫瘍性貧血に対する治療剤。 - 【請求項３】ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエ
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で
形質発現させて得たものであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の悪性腫瘍性貧血に対する治療剤。 - 【請求項４】宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物
の細胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の悪性腫瘍性貧血に対する治療剤。 - 【請求項５】宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細
胞であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
悪性腫瘍性貧血に対する治療剤。 - 【請求項６】宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴と
する特許請求の範囲第３項記載の悪性腫瘍性貧血に対す
る治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-21163 | 1985-02-06 | ||
| JP2116385 | 1985-02-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6230A JPS6230A (ja) | 1987-01-06 |
| JPH0629194B2 true JPH0629194B2 (ja) | 1994-04-20 |
Family
ID=12047242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61022928A Expired - Lifetime JPH0629194B2 (ja) | 1985-02-06 | 1986-02-06 | 悪性腫瘍性貧血治療剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4745099A (ja) |
| JP (1) | JPH0629194B2 (ja) |
| FR (1) | FR2576791B1 (ja) |
| GB (1) | GB2171303B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5246726A (en) * | 1986-03-21 | 1993-09-21 | Efamol Ltd. | Iron-containing composition and method for treatment of cancer |
| GB8607137D0 (en) * | 1986-03-21 | 1986-04-30 | Efamol Ltd | Compositions |
| JP2651909B2 (ja) * | 1987-01-29 | 1997-09-10 | ヤマハ発動機株式会社 | スクータのシート支持構造 |
| US4835260A (en) * | 1987-03-20 | 1989-05-30 | Genetics Institute, Inc. | Erythropoietin composition |
| JP2858752B2 (ja) * | 1987-04-10 | 1999-02-17 | オーソ・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン | 正常な哺乳動物のヘマトクリツト値の増大方法 |
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| US5128449A (en) * | 1988-07-05 | 1992-07-07 | The University Of Tennessee Research Corporation | Polypeptide and a method for its production |
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| US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
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| US4254895A (en) * | 1979-05-30 | 1981-03-10 | Norfield Manufacturing Co. | Apparatus for automatic alignment and attachment of a doorjamb and stop |
| JPS5653696A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Isolation of erythropoietin by adsorption |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS57149228A (en) * | 1981-03-11 | 1982-09-14 | Ajinomoto Co Inc | Novel erythropoietin and its preparation |
| JPH0686480B2 (ja) * | 1983-02-21 | 1994-11-02 | 雪印乳業株式会社 | エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 |
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-
1986
- 1986-02-03 US US06/825,223 patent/US4745099A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1986-02-06 JP JP61022928A patent/JPH0629194B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 FR FR868601639A patent/FR2576791B1/fr not_active Expired - Fee Related
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| US4745099A (en) | 1988-05-17 |
| FR2576791A1 (fr) | 1986-08-08 |
| GB2171303B (en) | 1989-09-06 |
| GB8602787D0 (en) | 1986-03-12 |
| GB2171303A (en) | 1986-08-28 |
| JPS6230A (ja) | 1987-01-06 |
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