JPS6231A - 腎性貧血治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 て含有する腎性貧血治療剤に関する。

エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記することもある）
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を仔する体液性造血因子として知られている
。

ヒ）ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが入手で
きる純粋なヒトＥＰＯの量に制約があること等からヒ）
ＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については未
だ不明である。

近年、腎不全患者の多くは合併症として貧血を有し、特
に透析患者．に於ける心不全による死亡の原因の多くは
、重度の貧血によるものと考えられている。

貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄捕促、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエチン産生
障害、溶血、造血幹細胞異常などが考えられているが、
腎性貧血の場合はエリスロポエチン産生部位である腎が
機能しないことや血中ＥＰＯ値が正常より低いこと［例
えばＥｒ５ｌｅｖＡＪ　　等　；　ブリティシュ　ジャ
ーナル　オブ　ヘマトロジ−（Ｂｒｉｔ、Ｊ、Ｈｅｍａ
ｔｏｌ、）ＡｆＬ巻　６５頁（１９８０）。

（：ａｒｏ、　Ｊ−等　；　ジャーナル　オブ　ラボラ
トリ−アンドクリニカル　メディシ７（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ
ｌ１ｎ、Ｍｅｄ、）１−巻　４４９頁　（１９７９）、
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　　Ｊ　８等ニブラッド（Ｂ　ｌ　ｏ
　ｏ　ｄ）　　旦圭巻　８８５頁　（１９７９）。

Ｒａｇｅ　　ＡＢ等　；　ジャーナル　オブ　ラボラト
リ−アンドクリニカル　メディシン（Ｊ、Ｌａｂ、ＣＩ
　ｉｎ、Ｍｅｄ、）Ｌｍ巻　８２９頁　（１９８２）な
どを参照コなどから腎の内分泌機能の荒廃によるエリス
ロポエチン産生の低下と排泄機能の荒廃による尿毒症性
物質の蓄積に基づく骨髄の造血抑制が主な原因となって
生ずるとされている。

しかしながら一方では、測定感度が鋭敏な　ＩｎＶｉｔ
ｒｏ　バイオアッセイ、あるいはラジオイムノアッセイ
による測定で末期慢性腎不全患者の血中ＥＰＯ値は、通
常の貧血患者の血中ＥＰＯ値に比べると低値ではあるが
その値は健康人と同程度か、あるいはそれより高いとの
報告もあり、（例えば、Ｃａｒｏ、　　Ｊ　　等　；　
ジャーナル　オブ　ラボラトリ−アンド　クリニカル　
メディシン（Ｊ、　　Ｌａｂ、　　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｅｄ、）１巻　４４９頁（１９７９）、Ｒａｄｔｋｅ
、Ｈ，Ｗ等；ネフ０７　（Ｎｅｐｈｒｏｎ、）　　２２
−巻　３６１頁　（１９７８）　＋　Ｃｈ　ａ　ｎ　ｄ
　ｒ　ａ　−Ｍ等　；　キドニー　インターナショナル
（Ｋｉｄｎｅｙ、　　　Ｉｎｔ、）　　−２」−巻　２
２８頁　（１９８２）などを参照）、このことは腎機能
が廃絶に近くなってもエリスロポエチンの産生増加とい
うメカニズムは働いていることを示していると考えられ
ることから、腎性貧血がエリスロボエチン産生の低下に
起因しているのかどうかは未だ不明のままである。

従って腎性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与しても腎性貧血
治療に有効であるか否かは疑わしい限りであったＯ ヒトＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告され
ているが腎性貧血の治療薬として有効であることをヒト
又は動物に実際に投与することによって実証したものは
ない。

本発明者等は人尿中から高純度に精製したヒトＥＰＯお
よびヒトＥＰＯをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒ）ＥＰＯを用いて腎疾患動物モデルに
ついて貧血治療効果を調べたところ、ヒ）ＥＰＯが顕著
な貧血治療効果を示したことから腎性貧血治療薬として
有効であることを見い出し本発明を完成した。本発明は
新規な腎性貧血治療剤の提供に係るものである。

すなわち本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分とし
て含有する腎性貧血治療剤である。

本発明に用いられるヒトエリスロポエチンとは、前述の
如き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をつかさどる微量
生理活性物質として規定される。

ヒトＥＰＯは種々の手段によって得られることが知られ
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿（血清を含む）から抽出する方法［Ｔ、　　ＭＩ
ＹＡＫＥ等　；　ジャーナル　オブ　バイｔｏジカル　
’ｙ−ミｘトＵ−（Ｊ、Ｂ、Ｃ，）　　２旦ｚ巻　５５
５８頁（１９７７）＋　Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等　；　ジ
ャーナル　オブ　ラボラトリ−アンド　クリニカル　メ
ディシン（Ｊ、　　Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎ、　　　Ｍｅｄ、）　　旦旦巻　９８７頁　（
１９６５）］、ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造する
方法［特開昭５４−５５７９０コ、ヒトエリスロポエチ
ン産生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造
する方法［特開昭５７−４０４１１］等の他、ヒトリン
パ球やヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブリドー
マを培養して得る方法やヒトＥＰＯのメッセンジ＋−Ｒ
ＮＡ　（ｍＲＮＡ）を採取することにより、そのｍＲＮ
Ａを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、適当な宿主細胞（
例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類、植物又は動物の
細胞株等）で生産させるような、所謂、遺伝子工学的方
法によっても得られる［例えば、５ＹＬＶＩＡＬ、Ｈ，
等　；　プロシーディング　オブザナンヨナルアカデミ
ー　オブ　サイエンシーズ　オブ　ザ　ニーニスニー（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　
ｆｌ１巻２７０８頁　（１９８４）　　を参照コ。前記
の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができるが好
ましくは・ヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり、
例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げることがで
きる。

これらの方法によって得られたヒ）ＥＰＯは腎性貧血の
治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有する成
熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使用され
得る。

上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法・濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合わせて用いてもよい。

得られたヒ）ＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒ）ＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。

本発明の腎性貧血治療剤は場合によりその他の貧血治療
剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２　製剤、男性ホルモン
剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合すること
ができ、該鉄剤として乾燥硫酸ｉ　−鉄、フマール酸鉄
、グルコン酸鉄、クルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙
げられる。

本発明の腎性貧血治療剤に含まれるヒ）ＥＰＯの投与量
、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めるこ
とができるが通常、成人−人当たり０、１〜５００μｇ
好ましくは５〜１００μｇのヒトエリスロポエチンを含
有する製剤を１週間に１〜７回投与することができる。

本発明の腎性貧血治療剤は安定化物質を含んでいてもよ
く、該安定化物質として、例えば、ポリエチレングリコ
ール、タンパク質、糖類、アミノ酸。

無機塩、有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの
１つ又は２つ以上を含有してもよい。

これらの安定化物質の添加量は、エリスロポエチンの１
重量部にたいして０．１１〜１００００　重量部の割合
で配合することが好ましい。なお、２つ以上の安定化物
質を混合して使用する場合においてもそれらの総量が上
記範囲以内であればよい。

これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２　である。水溶液のｐＨは５、０〜９．０　に調整し
、特にｐＨ６〜８に調整するのが好ましい。また本発明
の腎性貧血治療剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。

ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法［ジャーナル　オブ　バイ
オロジｈル　ケＬストＩＪ　　　（Ｊ、Ｂ、Ｃ，）　　
２旦ｚ巻　５５５Ｂ頁（１９７７）　］に従って再生不
良性貧血患者法から１）ＳｅＥ）ｈａｄｅｘＧ５０によ
る脱塩２）　ＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着３）
エタノール沈殿４）ＤＥＡＥ　　アガロースカラムクロ
マトグラフィーを用いて部分精製されたヒトＥＰＯを得
た。

得られた部分精製ヒトＥＰＯを２４％プロパツール（和
光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸　（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣによ
る精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立８３８−５０型を
用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出を
行った。

′　クロマト　ラフ　− ２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１　　％トリフル
オロ酢酸溶液で予め平衡化したＭＭＣ−Ｃ８カラム（８
ｍｍＸ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を
注入し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させ
た。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
−１００（ＡｍｉＣｏｎ　社製商品名）を用いた限外ろ
過により　０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。

一゛　　　　　ロマト　ラフ　− 上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカラ
ム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、前
記平衡液で溶出させた。

分子量２５０００〜３００００の位置にＥＰＯ活性を宵
するピークが得られ、たので、この部分を集めて凍結乾
燥した。

比活性は約９Ｘ１０４■／ｍｇであった。

各ステップに於ける比活性を表■に示す。

表Ｉ ＊アッセイ法　　１ｓｃｏｖｅ　　Ｎ、Ｎ等　；　ジャ
ーナル　オブセルラー　フィジオロジ−（Ｊ、Ｃｅ　ｌ
　１．Ｐｈ１ｓ　ｉｏｌ、）１１巻　３０９頁　（１９
７４）の方法に従った。

参考例２　　　　　　に　　ヒト　　　の−１°１１２
月２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換
のための補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−　
２８１８６２号）に開示された方法に従ってヒトＥＰＯ
をコードする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニー
ズ／１ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質発現させ
ることによってヒトＥＰＯを得た。要約すると以下の如
くである。

ヒト胎児肝細胞から得られたヒ）ＥＰＯをコードする遺
伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３クローンからの
ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ＥＰＯをコードする遺
伝子を含む小さなＲ１フラグメントを取り出しプラスミ
ドＲＫＩ−４のＥｃｏＲ１部位へ挿入した。このＥＰＯ
遺伝子を組込んだプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ欠損
ＣＨＯ細胞に組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核
酸を欠如したアルファ媒地中で培養することによって少
なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した
後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくこと
によってヒトＥＰＯを産生させた。

最終的な培養上清中のヒトＥＰＯの比活性は２０ｕ／ｍ
ｌであった。得られたヒ）ＥＰＯを含む培養液は０．１
　％ＢＳＡを含む生理食塩水にて透析した後、実験に供
した。

柴田ら［ラボラトリ−インベスティゲーシロン（Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒＹ、Ｉｎｖｅｓｔ、）　　２．Ｌ巻　４５
７頁（１９７２）］の報告に従い、ラット腎皮質より腎
炎惹起物質を精製し、体重９０ｇ〜１１０ｇの雄ウィス
ター系ラット（静岡実験動物農業共同組合製）の後足足
随にフロイントインコンプリートアジュバント（ディフ
コ社製）トエマルジョンを形成した腎炎惹起物質を投与
した。

腎炎発症の指標として、尿蛋白を測定し、尿中の蛋白排
泄量が１００ｍｇ／ｄａＹ以上の個体を腎炎う、トとし
た。腎炎を発症したラットは以後定期的に採血を行い、
赤血球数へマトクリント値、ヘモグロビン値をコールタ
−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。腎炎
惹起物質投与後、２８０８０日目点の測定値がそれぞれ
赤血球数８００万／　ｍ　ｍ　＋　へマドクリット値４
０％、ヘモグロビン値１５ｇ／ｄｉ以下の貧血ラットを
選び実験を行った。

ヒ　　　　　　　　　　　の　　　　　　４　　　　　
　−１、で得られた貧血ラットを２群（１群５匹）に分
け１群に人尿由来ヒトＥＰＯ（３０ｕ／ラット７日）を
別の群に溶媒（０，１％ＢＳＡ０．５ｍｌ／ラット／日
）を、隔日にて尾静脈投与した。

投与後２１日目に於ける赤血球数、ヘマトクリット値、
ヘモグロビン値の変化を表Ｉに示す。

対照としては無処置ラット（５匹）群を用いた。

表中＊は溶媒投与群に対するヒトＥＰＯ投与群の有意水
準である。

表１人尿由来ヒ）ＥＰＯの貧血治療効果＊ｐ＜０．０１ ヒ　　　　　　　　　　　　の　　　　　　１、で得ら
れた貧血ラットを２群（１群５匹）に分け１群にＣＨＯ
細胞由来ヒトＥＰＯ（１０ｕ／ラット／日）を別の群に
溶媒（０，１％ＢＳＡを含むＲＰＭ１１８４０培地の透
析液（０，５ｍｌ／ラット７日））を、隔日にて尾静脈
投与した。投与後２１日目に於ける赤血球数、ヘマトク
リット値、ヘモグロビン値の変化を表■に示す。

対照としては無処置ラット（５匹）群を用いた。

表中＊は溶媒投与群に対するヒトＥＰＯ投与群の仔意水
準である。

表ＩＩＣＨＯ細胞由来の貧血治療効果 木ｐ＜０．０１ 表■、■に示される如く溶媒投与腎炎ラット群では日数
の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対し、ヒ）Ｅ
ＰＯ投与腎炎ラッう群では明らかに貧血が改善されたこ
とが認められた。

またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかったＯ 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。

実施例１ エリスロポエチン　　　　　　　１重量ｇヒト血清アル
ブミン　　　１００重量部注射用蒸留水にて全量　１０
００００重量部上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バ
イアル瓶に分注し、凍結乾燥し密封した。

実施例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。

実施例３ １００ｍｌ中にマンニトール５ｇ、エリスロポエチン１
　ｍ　ｇ　＋　　ヒト血清アルブミン１００ｍｇ。

アセチルトリプトファンナトリウム２．１５４ｍｇカプ
リル酸ナトリウム　１．３３ｍｇ　を含む水溶液を無菌
的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。

実施例４ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にエ
リスロポエチン１　ｍ　ｇ　＋　ポリエチレングリコー
ル４０００５００ｍｇ、　　エチレンオキサイドプロピ
レンオキサイド共重合体３０　ｍ　ｇ　＋塩化ナトリウ
ム８００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌず
つアンプルに分注し溶閉する。

実施例５ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中（こエ
リスロポエチン　Ｑ　、　５　ｍ　ｇ　＋グリシン１ｇ
。

ソルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、０．
５ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別
に０．１　％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し
、１ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。

実施例６ １００ｍ１中にエリスロポエチン１　ｍ　ｇ　＋　ヒト
血清アルブミン５０ｍｇ、マンニトール５００ｍｇを含
む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注
し凍結乾燥し密封する。

別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ、ＮａＣｌ２
．７　ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、３ｍｌずつア
ンプルに分注し、溶封する。

上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。

手続補正書（自発） 昭和６１年４月２５日 特許庁長官　　　宇　賀　　道　部　殿１、事件の表示 昭和６１年特許願第２２９２９号 ２、発明の名称 腎性貧血治療剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都北区浮間５丁目５番１号 明細書全文 特許部 置　（０３）９８７−７１１１（大代表）明　　　細　
　　書 １、発明の名称 腎性貧血治療剤 ２、特許請求の範囲 （１）　ヒトエリスロボエチンを有効成分として含有す
る腎性貧血治療剤。

（２）　ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の腎性貧血
治療剤。

（３）　ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエチン
μ７ｔ／＠［Ｊ＋をコードする遺伝子を宿主細胞内で形
質発現させて得たものであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の腎性貧血治療剤。

（４）　宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の腎性貧血治療剤。

（５）　宿主細胞がチャイニーズハムスターＩＬ％細胞
であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の腎
性貧血治療剤。

（６）　宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第３項記載の腎性貧血治療剤。

３、発明の詳細な説明 本発明はヒトエリスロポエチン（以下「ヒトＥＰＯＪと
いう）を有効成分として含有する腎性貧血治療剤に関す
る。

本願明細書においてヒトＥＰＯとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯＪという）、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯＪ
という）、ヒト胃癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒトＥＰＯ産生能を有するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下ｒＥＰ
ＯＪという）という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨すいに存在する赤芽球系幹細胞に働いて
、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示
す微量生理活性物質をいう。

ヒト尿ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが入手
できる純粋なヒトＥＰＯの量に制約があること等からヒ
トＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。

近年、腎不全患者の多（は合併症として貧血を有し、特
に透析患者に於ける心不全による死亡の原因の多くは、
重度の貧血によるものと考えられてい・る。

貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄補足、鉄放出障害、牌の関与、ＥＰＯ産生障害、溶血
、造血幹細胞の異常などが考えられているが、腎性貧血
の場合はＥＰＯ産生部位である腎が機能しないことや血
中ＥＰＯ値が正常より低いこと［例えばＥｒ５ｌｅｖ　
　ＡＪ等；ブリティッシュ　ジャーナル　オブ　ヘマト
ロジー（Ｂｒｉｔ、Ｊ、Ｈｅｍａｔｏｌ、）４５巻６５
頁（１９８０年）、Ｃａｒｏ、Ｊ、等；ジャーナルオブ
　ラボラトリ−アンド　クリニカル　メディシン（Ｊ、
Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ、）９３巻４４９頁（１９
７９年）　、ＳｈｅｒｗｏｏｄＪＢ等；ブラッド（Ｂｌ
ｏｏｄ、）５４巻８８５頁（１９７９年）　、Ｒｅｇｅ
、　ＡＢ等；ジャーナル　オブ　ラボラトリ−アンド　
クリニカルメディシン（Ｊ、Ｌａ、ｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍ
ｅｄ、）１００巻８２９頁（１９８２年）などを参照コ
などから腎の内分泌機能の荒廃によるエリスロポエチン
産生の低下と排泄機能の荒廃による尿毒症性物質の蓄積
に基づく骨髄の造血抑制が主な原因となって生ずるとさ
れている。

しかしながら一方では、測定感度が鋭敏な１ｎｖｉｔｒ
ｏバイオアツセイ、あるいはラジオイムノアッセイによ
る測定で末期慢性腎不全患者の血中ＥＰＯ値は゛、通常
の貧血患者の血中ＥＰＯ値に比べると低値ではあるがそ
の値は健康人と同程度か、あるいはそれより高いとの報
告もあり、［例えば、Ｃａｒｏ、Ｊ等；ジャーナル　オ
ブ　ラボラトリー　アンド　クリニカル　メディシン（
Ｊ。

Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ、）９３巻４４９頁（１９
７９年）、Ｒａｄｔｋｅ、Ｈ，Ｗ等；ネフｏ７　（Ｎｅ
ｐｈｒｏｎ）２２巻３６１頁（１９７８年）、Ｃｈａｎ
ｄｒａ、Ｍ等；キドニー　インターナショナル（Ｋｉｄ
ｎｅＹ　　Ｉｎｔ、）２１巻２２８頁（１９８２年）な
どを参照コ、このことは腎機能が廃絶に近くなってもＥ
ＰＯの産生増加というメカニズムは働いていることを示
していると考えられることから、腎性貧血がＥＰＯ産生
の低下に起因しているのかどうかは未だ不明のままであ
る。

従って腎性貧血患者にヒトＥＰＯを投与しても腎性貧血
治療に有効であるか否かは疑わしい限りであった。

ヒト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒ）ＥＰＯが腎
性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は動物に
実際に投与することによって実証したものはない。

本発明者等は人尿中から高純度に精製したヒト尿ＥＰＯ
およびヒトＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
宿主細胞内で形質発現させて得たヒトｒＥＰｏを用いて
腎疾患動物モデルについて貧血治療効果を調べたところ
、ヒトＥＰＯが顕著な貧血治療効果を示したことから腎
性貧血治療薬として有効であることを見い出し本発明を
完成した。本発明は新規な腎性貧血治療剤の提供に係る
ものである。

すなわち本発明はヒトＥＰＯを有効成分として含宵する
腎性貧血治療剤である。

本発明に用いられるヒ１−ＥＰＯは種々の手段によって
得ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再
生不良性貧血患者の尿又は血漿（血清を含む）から抽出
することにより得ることができる［Ｔ、ＭＩＹＡＫＥ等
；ジャーナル　オブバイオロジカル　ケミストリー（Ｊ
、Ｂ、Ｃ，）、２５２巻６５５８頁（１９７７年）、Ｊ
、　Ｐ、　Ｌｅｗｉｎ等；ジャーナル　オブ　ラボラト
リ−アンド　クリニカルメディシン（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１
１ｎ、Ｍｅｄ、）、８８巻９８７頁（１９８５年）コ。

またヒトｒＥＰｏは例えばヒトＥＰＯのアミノ酸配列に
対応するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を採取し
、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次い
で適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる［例えば、５Ｙ
ＬＶＩＡＬ、Ｈ，等；プロシーディンゲス　オブザ　ナ
ショナル　アカデミ−オブ　サイエンシーズオブ　ザ　
ニー　ニス　ニー　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８１巻２７０８
頁（１９８４年）を参照］。前記の動物細胞株は種々の
細胞株を用いることができるが好ましくはヒト又は哺乳
動物由来の培養細胞株であり、例えばＣＯＳ細胞、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細ね、マウスＣ−１
２７細胞などを挙げることができる。この他、ヒト腎癌
細胞の組織培養物から製造する方法［特開昭５４−５５
７９０コ、ヒトＥＰＯ産生能を宵するヒト由来のリンパ
芽球様細胞から製造する方法［特開昭５７−４０４１１
］、ヒトリンパ球やヒト細胞株を細胞融合して得られる
ハイブリドーマを培養して得る方法等によっても製造す
ることができる。

これらの方法によって得られたヒトＥＰＯは腎性貧血の
治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有する成
熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使用され
得る。

上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えハ、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合せて用いてもよい。

得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とかできる。

本発明の野性貧血治療剤は場合によりその他の貫層治療
剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホルモン剤
等を処方的に配合するかまたは使用時に混合することが
でき、該鉄剤の例として乾燥硫酸第一鉄、フマール酸鉄
、グルコン酸鉄、デキストラン鉄、グルクロン酸鉄、オ
ロチン酸鉄等が挙げられる。

本発明の腎性貧血治療剤に倉まれるヒ）ＥＰＯの投与量
、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めるこ
とができるが通常、９Ｘ１０”口／ｍｇヒトＥＰＯとし
て成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ましくは５〜１
００μｇのヒトＥＰ０を含有する製剤を１週間に１〜７
回投与することができる。

本発明の腎性貧血治療剤は安定化物質を含んでいてもよ
く、該安定化物質として、例えば、ポリエチレングリコ
ール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有機塩お
よび含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２つ以上
を含有してもよい。

これらの安定化物質の添加量は、ヒ）ＥＰＯの１重量部
にたいして０．１１〜１００００重量部の割合すること
が好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合して使
用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以内であ
ればよい。

これらの安定化物質は相当する量を適当な濃度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０に調整し、特
にｐＨ６〜８に調整するのが好ましい。また本発明の腎
性貧血治療剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添
加してもよい。

参鷹例１　ヒト　　　　のり圧 ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法［ジャーナル　オブ　バイ
オロジカル　ケミストリー　（Ｊ、Ｂ。

Ｃ、）２５２巻５５５８頁（１９７７年）］に従って再
生不良性貧血患者尿から　１）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０
による脱塩　２）ＤＥＡＥ　　セルロースによるバッチ
吸着　３）エタノール沈殿　４）ＤＥＡＥ　　アガロー
スカラムクロマトグラフィーを用いて部分精製されたヒ
ト尿ＥＰＯを得た。

′　　クロマト　ラフ　− 得られた部分精製ヒト尿ＥＰＯを２４％プロパツール（
和光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣによ
る精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立６３８−５０型を
用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出を
行った。

２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１％トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（８ｍｍ
Ｘ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させた
。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−
１００（Ａｍｉｃｏｎ社製商品名）を用いた限外ろ過に
より０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。

−゛　　　　　ロマトグラフ　− 上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ８０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。

分子量２５０００〜３００００の位置にＥＰＯ活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。

比活性は約９Ｘ１０’ｕ／ｍｇであった。

各ステップに於ける比ＥＰＯ活性を表工に示す。

表ｌ ５ｔｅｐ　　　　　　　　　　比活性本（■／ｍｇ）＊
アッセイ法　ｌ５ｃｏｖｅ　　Ｎ、Ｎ等［ジャーナル　
オブ　セルラー　フィジオ ロジー（Ｊ、Ｃｅ　ｌ　１．Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、）８３巻３０９頁（１９ ７４年）コの方法に従った。

参考例　２　　　　　　　　ヒ　　　　　の　゛昭゛和
５９年１２月２７日に出願された発明の名称「真核細胞
の形質転換のための補助ＤＮＡを含むベクター」　（特
願昭５９−２８１８６２号）に開示された方法に従って
ヒ）ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組込ん
だプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ細胞）で形質発現させることによってヒトｒＥＰｏを
得た。

要約すると以下の如くである。

ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
１フラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒトＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒト
ｒＥＰｏを産生させた。

最終的な培養土清中のヒ）ｒＥＰｏの活性は２０ＬＩ／
ｍｌであった。

ＣＨＯ細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒ）ｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒ）ｒＥＰｏはＫｒ７ｓｔａ１等の方法［
ジャーナル　オブ　ラボラトリ−アンド　クリニカル　
メディスン（Ｊ、　Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ、）９
７巻１４４頁（１９８１年）コにより６６００　ｕ／ｍ
　ｌの活性を有していた。またこのヒトｒＥＰｏはＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバン
ドであることが確認された。

得られたヒトｒＥＰｏに０．１％ＢＳＡを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。

集口ら［ラボラトリ−インベスティゲーション（Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒＹ　　Ｉｎｖｅｓｔ、）１２７巻４５７頁
（１９７２年）コの報告に従い、ラット腎皮質より腎炎
惹起質を精製し、体重９０ｇ〜１１０ｇの雄ウィスター
系ラット（静岡実験動物農業共同組合製）の後足足蹟に
フロイントインコンプリードアシュバンド（ディフコ社
製）とエマルジョンを形成した腎炎惹起物質を投与した
。

腎炎発症の指標として、尿蛋白を測定し、尿中の蛋白排
泄量が１００ｍｇ／ｄａＶ以上の固体を腎炎ラットとし
た。腎炎を発症したラットは以後定期的に採血を行い、
赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビン値をコール
タ−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。腎
炎惹起物質投与後、２８０８０日目点の測定値がそれぞ
れ赤血球数８００万／ｍｍ３、ヘマトクリット値４０％
、ヘモグロビン値１５ｇ／ｄｉ以下の貧血ラットを選び
実験を行った。

ヒ　ト　　　　　　の　　　゛　　　　−１、で得られ
た貧血ラットを２群（１群５匹）に分け１群にヒト尿Ｅ
ＰＯ（３０■／ラット／日）を、別の群に溶媒（０，１
％ＢＳＡ０．５ｍｌ／ラット７日）を、隔日にて尾静脈
投与した。

投与後２１日目に於ける赤血球数、ヘマトクリ。

ト値、ヘモグロビン値の変化を表■に示す。

対照としてしは無処置ラット（５匹）群を用いた。

表中＊は溶媒投与群に対するヒト尿ＥＰＯ投与群の有意
水準である。

、　　　　　　　　　　　　ヒ　ト　　　　　　の　　
　゛　　　　　−１，で得られた貧血ラットを２群（１
群５匹）に分け１群にＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰｏ（１
０■／ラット７日）を、別の群に溶媒［０，１％ＢＳＡ
を含むＲＰＭ１１６４０培地の透析液（０゜５ｍ１／ラ
ツト７日）］を、隔日にて尾静脈投与した。投与後２１
日目に於ける赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビ
ン値の変化を表■に示す。

対照としては無処置ラット（５匹）群を用いた。

表中＊は溶媒投与群に対するヒ）ｒＥＰｏ投与群の有意
水準である。

／″ 表■、■に示される如く溶媒投与腎炎ラット群では日数
の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対し、ヒトＥ
ＰＯ投与腎炎うット群では明らかに貧血が改善されたこ
とが認められた。

またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。

実施例１ 上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。

実施例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。

実施例３ １００ｍｌ中にマンニトール５ｇ、ヒト尿ＥＰ０１　ｍ
　ｇ　％ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチルトリ
プトファンナトリウム２．１５４ｍｇ。

カプリル酸ナトリウム１．３３ｍｇを含む水溶液を無菌
的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。

実施例４ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にヒ
ト尿ＥＰＯ１ｍｇ１ポリエチレングリコロール４０００
　５００ｍｇ１工チレンオキサイドプロビレオンオキサ
イド共重合体３０　ｍ　ｇ　ｓ塩化ナトリウム８００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍｌずつアンプル
に分注し溶閉する。

実施例５ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にＣＨ
Ｏ細胞由来ヒトｒＥＰｏ　　Ｏ，５ｍｇ。

グリシン１ｇ１ソルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的
に調整し、０−５ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥
し密封する。別に０．１％メチルセルロース水溶液を無
菌的に調整し、１ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶
液とする。

実施例６ １００ｍ１中にヒト尿ＥＰＯ１ｍｇ１ヒト血清アルブミ
ン５０　ｍ　ｇ　１マンニト一ル５００ｍｇを含む水溶
液を無菌的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結
乾燥し密封する。

別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ１Ｎａｃ１２
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍｌずつアン
プルに分注し、溶封する。

上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有する
   腎性貧血治療剤。
2. （２）ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第 １項記載の腎性貧血治療剤。
3. （３）ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエチンを
   コードする遺伝子を宿主細胞内で 形質発現させて得たものであることを特徴 とする特許請求の範囲第１項記載の腎性貧 血治療剤。
4. （４）宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細胞
   株のいずれかであることを特徴と する特許請求の範囲第３項記載の腎性貧血 治療剤。
5. （５）宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞であ
   ることを特徴とする特許請求の範 囲第３項記載の腎性貧血治療剤。
6. （６）宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の腎性貧 血治療剤。