JPS62149624A

JPS62149624A - 巨核球・血小板系増加剤

Info

Publication number: JPS62149624A
Application number: JP61191542A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kawakita; 河北　誠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1986-08-15
Publication date: 1987-07-03
Anticipated expiration: 2009-10-19
Also published as: JPH0681730B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は巨核球・血小板系増加剤に関する。更に詳述す
るならば、ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有
する新規な巨核球・血小板系増加剤に関するものである
。

従来技術血小板は、血液凝固作用を有する血液中の微細な原形質
小体であり、前駆細胞である巨核球から産生されること
が明らかとなってきたが、その産生の機構は未だ明らか
ではない。

ヒト生体内に存在する造血ホルモン因子とじては、従来
、骨髄中の赤芽球系幹細胞に働いて赤血球細胞への分化
増殖を促進する作用を有するエリスロポエチン（ＥＰ○
）および骨髄中の顆粒球系幹細胞に働いて単球および好
中球細胞への分化増殖を促進する作用を有するコロニー
刺激因子の存在が知られている。ここに、エリスロボエ
チンとは、成人の腎臓および肝臓、哺乳動物の胎児およ
び新生児の肝臓で産生される、分子量約３９．０００の
糖蛋白である。

更に、ヒト生体内には上記赤血球増殖因子、コロニー刺
激因子以外に、巨核球細胞の分化増殖を刺激し、血小板
産生を促進する作用を有する因子も存在することが報告
されている〔ケレメン（Ｋｅｌｅｍｅｎ、　Ｂ、　）等
、アクタ　ヘマトロジ力（ＡｃｔａＨａｅ＋ｒ＋ａｔｏ
ｌｏｇｉｃａ）、　２９．１６（１９６３）　〕。

しかしながら、上記した巨核球・血小板増殖因子の性状
、その増殖機構については未だ解明されておらず、その
ための各種の研究が現在も続けられている。これまでに
例えば、マウス血小板増殖因子に関しては、抗血小板抗
体投与したマウス血清から、電気泳動的に均一な両分が
得られ、これが分子！２５．０００の糖蛋白であったと
いう報告〔声涙等、アクタ　ヘマトロジー　ジャパン（
Ａｃｔａ　Ｈａｅｍ。

Ｊａｐ、　）、賂、　４８３　（１９７９）：］やヒド
ロキシウレアを投与したラットの血清から得た部分精製
物が分子量４８、０００のエリスロポエチンに類似した
糖蛋白であったという報告　〔ダッシン（Ｄａｓｓｉｎ
）等、アクタヘマトロジ力　（Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔ
ｏｌｏｇｉｃａ）、　６９．２４９（１９８３）　］等
がある。また、ヒト由来の血小板増殖因子に関しては、
再生不良性貧血患者の尿から得た粗精製物をノイラミニ
ダーゼ処理すると、混在するエリスロポエチン活性は低
下したのに対し、血小板産生活性は変化しなかったと報
告している〔エノモト（Ｂｎｏｍｏｔｏ）　　等、プリ
ティシュ　ジャーナル　オン　ヘマトロジ−（Ｂｒ、　
Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、）。

４５、５５１（１９８０）　）。更には、赤血球増殖が
エリスロポエチンによって支配され、血小板増殖はトロ
ンボポエチンと称される上記エリスロボエチンとは異な
る因子によって支配されているとする報告も多い〔例え
ば、ニッパ（８ｂｂｅ、　Ｓ、）、　　ブラッド（Ｂｌ
ｏｏｄ）、　４４．６０５〜６０８　（１９７４）等を
参照のこと〕。

このように、巨核球・血小板産性を促進する因子は未だ
単離されておらず、血小板産生の機構も明らかではない
。

発明が解決すべき問題点以上詳しく説明したように、巨核球・血小板増殖因子は
未だ単離・精製されておらず、その正体も明らかではな
い。そこで、このような巨核球・血小板増殖因子が何で
あるかを解明し、更にこのような巨核球・血小板増殖因
子を有効成分として含有する巨核球・血小板系増加剤を
開発することが、骨髄巨核球の分化増殖機能の低下に伴
う血小板減少、および血小板増殖機能の低下に伴う諸疾
患の治療の面からも待望されている。

そこで本発明の目的も、巨核球・血小板系の産生を促進
する因子を見い出し、該因子を有効成分として含有する
巨核球・血小板系増加剤を提供することにある。

問題点を解決するための手段本発明者は、このような上記した目的を達成すべく種々
研究、検討した結果、ヒトエリスロポエチンが、骨髄細
胞から巨核球コロニーを生成する強力な活性を有してい
ること、および未熟な巨核球〔スモール　アセチルコリ
ンエステラーゼＭ　性細胞（Ｓｍａｌｌ　Ａｃｅｔｙｌ
ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ　Ｐｏ５ｉｔｉｖｅ　Ｃ
ｅ１ｌ）　；以下５ＡｃｈＥ”という〕の割合を増加さ
せる作用を持つことを見出し、この結果に基づき本発明
を完成した。

即ち、本発明の巨核球・血小板系増加剤は、ヒトエリス
ロポエチンを有効成分として含有することを特徴とする
。

本発明において有効成分として用いることのできるヒト
エリスロポエチンは、人尿、特に鉤虫による貧血患者や
再生不良性貧血患者の尿から単離精製することができる
。

即ち、尿中から抽出し、熱処理、エタノール沈殿、ゲル
濾過等の工程を組み合せて部分精製し、更に逆相系高速
液体クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、エリスロポ
エチンのモノクローナル抗体を用いるアブィニティクロ
マトグラフィー等の方法によって精製することができる
。

更に本発明の巨核球・血小板系増加剤の有効成分である
ヒトエリスロポエチンは、このヒトエリスロポエチンを
コードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させて得たも
のを精製して利用することもできる。人尿中のエリスロ
ポエチンの量が極く微量であり、大量に得ることが困難
であるところから、上記方法によってエリスロポエチン
を製造することは工業的観点から極めて有利である。

このようなエリスロポエチンは以下の方法によって得る
ことができる。即ち、ヒトエリスロポエチンをコードす
る遺伝子を、真核生物或いは原核生物内で複製できるレ
プリコンを含むベクターと結合させて組み換えＤＮＡ体
とした後、適当な宿主細胞内で該組み換えＤＮＡ体を形
質発現させて、その培養液中から単離することによって
得ることができる。

組み換えＤＮＡの作製は公知の遺伝子工学的手法によっ
て行うことができる。即ち、エリスロポエチン（ＥＰＯ
）遺伝子を含むクローンをヒト胎児肝臓ライブラリーか
ら作製し、該クローンからのＤＮＡをＥ。ｏＲＩ等の制
限酵素で分解して、ＥＰＯ遺伝子を含むフラグメントを
得、該フラグメントをベクターであるプラスミドのＥ。

ｏＲＩ切断部位に連結させることによって組み換えＤＮ
Ａ体を得ることができる。上記ベクターは、以下に詳し
く述べるように、宿主細胞と適合しうる種由来のレプリ
コンおよび調節配列を含んでいるプラスミドベクターで
ある。

なお、本発明において使用するヒ）ＥＰＯの蛋白質部分
は以下のアミノ酸配列を有している。

八ｌａ　　　Ｐｒｏ　　　Ｐｒｏ　　　八ｒｇ　　　Ｌ
ｅｕ　　　Ｉｌｅ　　　Ｃｙｓ　　　八ｓｐ　　　Ｓｅ
ｒ　　　Ａｒｇ”Ｖａｌ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇｌｕ　　
　Ａｒｇ　　　Ｔｙｒ　　　Ｌｅｕ　　　Ｌｅｕ　　　
Ｇｌｕ　　　Ａｌａ　　　ＬｙｓＶａｔ　　Ｐｒｏ　　
Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　
Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　ＡｌａＴｒｐ　　　Ｌｙｓ　　　
Ａｒｇ　　　Ｍｅｔ　　　Ｇｌｕ　　　Ｖａｌ　　　Ｇ
ｌｙ　　　Ｇｌｎ　　　Ｇｉｎ　　　ＡｌａＶａｌ　　
Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　
Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ＬｅｕＳｅｒ　　　Ｇ
ｌｕ　　　Ａｌａ　　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　　Ａｒｇ
　　　Ｇｌｙ　　　Ｇｌｎ　　　Ａｌａ　　　Ｌｅｕし
ｅｕ　　　Ｖａｌ　　　Ａｓｎ　　　Ｓｅｒ　　　Ｓｅ
ｒ　　　Ｇｉｎ　　　Ｐｒｏ　　　Ｔｒｐ　　　Ｇｌｕ
　　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　　Ｇｌｎ　　　Ｌｅｕ　　　Ｈｉｓ　　　Ｖ
ａｔ　　　Ａｓｐ　　　Ｌｙｓ　　　Ａｌａ　　　Ｖａ
ｌ　　　５ｅｒＧｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ
　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　　ＡｒｇＡｌａ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇａｙ　　　Ａｌ
ａ　　　Ｇｉｎ　　　Ｌｙｓ　　　Ｇｌｕ　　　Ａｌａ
　　　Ｉｌｅ　　　５ｅｒＰｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ
　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ａｌａ
　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＡｒｇ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　
Ｔｈｒ　　Ａｈａ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　
Ａｒｇ　　、ＬｙｓＬｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　Ｖ
ａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌ
ｅｕ　　Ａｒｇかくして得られる組み換えＤＮＡ体を、
次いで公知の方法によって宿主細胞内に組み込む。

本発明において使用することのできる宿主細胞は、細菌
類等の原核生物および酵母、を推動物等の真核生物であ
る。

原核生物宿主細胞としては、例えば、エシェリヒアコリ
（Ｉｌｉ、ｃｏｌｉ）、バチルスズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような桿菌、サルモネラ
ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ）、　　セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　のような腸内細
菌および各種のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕ
ｓ）等を利用することができる。真核生物宿主細胞とし
ては例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓ
ｅｓ）等の酵母およびＶＥＲＯ細胞、ｔｌｅｌａ細胞、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯ８細
胞、Ｗ　１３８細胞等のを推動物由来の宿主細胞を用い
ることができるが、薬効を確認できる系が確立している
点においてＣＨ○細抱を用いることが好ましい。

次に、このような宿主細胞中でヒ）ＥＰ○遺伝子を形質
発現させるためには、宿主と適合しうる種由来のレプリ
コンおよび調節配列を含んでいるプラスミドベクターを
用いて、宿主細胞を形質転換させればよい。

上記ベクターは、形質転換細胞に表現形質の選択性を付
与することができる標識化配列と複製部位を持つもので
なければならない。

例えば、宿主細胞に町ｃｏｌｉを用いる場合には。

Ｅ、ｃｏｌｉ種由来のベクターであるｐＢＲ３２２プラ
スミド〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ）等、ジー７　（Ｇ
ｅｎｅ）　。

２　、９５　（１９７７）　）を用いることができ、該
ｐＢＲ３２２プラスミドは、テトラサイクリン耐性とア
ンピシリン耐性とを併せ持つので、これらを利用するこ
とによって外来ＤＮＡの不活性化を起こすことなく、形
質転換コロニーの選択を行うことができる。

その際、上記ｐ　Ｂ　Ｒ３２２プラスミドやその他の微
生物プラスミドは、その微生物が自分自身の蛋白質を発
現するのに必要なプロモーターを含んでおり、該プロモ
ーターとして、例えばβ−ラクタマーゼやラクトースプ
ロモーター系〔チャン（Ｃｈａｎｇ）等、ネーチ＋　−
（Ｎａｔｕｒｅ）、　２７５．６１５（１９７８）：　
ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）等、ネーチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、　２８１゜５４４　（１９７９）　〕およびト
リプトファンプロモーター系〔ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ）等、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、　８．４０５７（１９
８０）　）を挙げることができ、いずれのプロモーター
も本発明のヒトＥＰＯの産生に使用することができる。

また宿主細胞が酵母である場合のベクターとしては、例
えばプラスミドＹＲｐ７［ステインチコーム（Ｓｔｉｎ
ｃｈｃｏｍｂ）等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２
８２゜３９　（１９７９）　）を挙げることができる。

このプラスミドは、トリプトファンを産生ずる能力を欠
く酵母株に対する選択マーカーとなるｔｒｐ　ｌ遺伝子
を有しており、トリプトファンの非存在下で発育させる
ことによって形質転換体を選択することができる。この
ような酵母ベクター中のプロモーターとしては、３−ホ
スホグリセレートキナーゼ〔ヒッツエマン（Ｈｉｔｚｅ
ｍａｎ）等、ジャーナルオンバイオロジカル　ケミスト
リー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　　２５５
゜２０７３　（１９８０））や、他の解糖酵素〔ホラン
ド（Ｈｏｌｌａｎｄ）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　　１７．　４９００（１９７
８）’）等を挙げることができる。

更に、宿主細胞がを推動物である場合のベクターとして
は、複製起源、発現しようとする遺伝子の前に位置する
プロモーター、リポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス
部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列等を含んでい
るものを使用することができる。また哺乳動物細胞を形
質転換させるベクターの発現調節機能は、ウィルス由来
のものを用いることもでき、例えば、ポリオーマ、アデ
ノウィルス２、シアミンウィルス４０　（Ｓ　Ｖ２Ｏ）
　’Ｑプロモーターを挙げることができる。

ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合には、フィー　
ルス（Ｆｉｅｒｓ）等の方法〔ネーチ＋　−（ｌｌａｔ
ｕｒｅ）　。

２７３、１１３（１９７８））に従って、ウィルスの複
製起源を含むフラグメントとして簡単に得ることができ
る。また複製起源にはＳＶ４０以外のウィルス（例えば
ポリオーマ、アデノ、■Ｓ■、ＢＰＶ等）由来のものを
用いることもできる。

次いで、上記組み換えＤＮＡ体を宿主細胞内で形質発現
させるが、その方法は公知のいずれの方法も使用するこ
とができる。例えば、宿主細胞がＥ、　ｃｏｌｉ　のよ
うな原核生物である場合には、該宿主細胞が対数増殖し
ている時期にＣａＣｌ２を添加すればよい。また、宿主
細胞が真核生物である場合には、ＤＮＡをリン酸カルシ
ウム沈殿として感染させる方法、マイクロインジェクシ
ョン法、赤血球細胞或いはりボゾームにプラスミドを包
括して挿入する方法、リゾフォスファチジルコリンのよ
うな試薬によって細胞を処理する方法あるいはウィルス
ベクターを用いる方法等によって、上記組み換えＤＮＡ
体を宿主細胞内に導入して所定の培養条件で培養して宿
主細胞を形質転換させればよい。

このようにして、目的遺伝子たるヒトＥＰ○遺伝子を宿
主細胞内で形質発現させた後、得られた形質転換体を培
養し、培養液から目的の蛋白質を分離、精製することに
よって本発明の巨核球・血小板系増加剤に１吏用するヒ
トＥＰ○を得ることができる。

このようにしてｆＩられたヒトＥＰ○は、既に述ベたア
ミノ酸配列によって表わされる蛋白質部分を有している
が、本発明において使用することのできるヒトＥＰ○は
、これのみでなく、ヒトインターフェロン遺１云子〔大
野等、プロシーディングズ　オン　ザ　ナショナル　ア
カデミ−オンサイエンス　オフサ　　ニー　ニス　ニー
（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ３　ＬＩＳＡ）、　１９８
１．７７、５３０５Ｅなどにおいて知られているような
、形質転換の過程における多形現象によって生じるもの
も含む。即ち、多形現象によって生じた、前記アミノ酸
配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプ
チド、例えば１６６番目に位置するＡｒｇを欠いたもの
或いは１個またはそれ以上のアミノ酸が、１個またはそ
れ以上の他のアミノ酸で置換されたポリペプチドであっ
ても、エリスロポエチン活性を有している限り、本発明
の範囲に含まれる。

上記の方法に於いて、培養上清中に含まれているヒトＥ
Ｐ○は、所望により通常の単離・精製法によってさらに
濃縮・精製することができる。例えば、安息香酸、エタ
ノール、アセトン、タンニン酸等の有（幾溶媒による沈
殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析性、
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトクラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種ク
ロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等
の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でま
たは適宜組合わせて用いることができる。

得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒ）ＥＰ○を適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌濾過して注射剤とするこ
とができる。

本発明の巨核球・血小板系増加剤に含まれるヒ１−ＥＰ
Ｏの投与量、投与回数は対象となる疾患、患者の病状等
を考慮して個々に決めることができるが、通常成人１人
当たり０．１〜５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇ
のヒトエリスロポエチンを含有する製剤を１週間に１〜
７回、経口剤或いは注射剤等として投与する。

本発明の巨核球・血小板系増加剤は安定化物質を含んで
いてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレ
ングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、
有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は
２つ以上を含有してもよい。

これらの安定化物質の添加量は、ヒトエリスロポエチン
の１重量部にたいして０．１１〜１０．０００重量部の
割合で配合することが好ましい。なお、２つ以上の安定
化物質を混合して使用する場合においてもそれらの総量
が上記範囲内であればよい。これらの安定化物、質は対
応する量を適当な濃度とｐＨの水溶液として調製して使
用する。この水溶液の浸透圧比は０．１〜３．０の範囲
、より好ましくは０．８〜１，２の範囲内である。水溶
液のｐＨは５．０〜９．０、特に６〜８に調整すること
が好ましい。

また本発明の巨核球・血小板系増加剤を調製するにあた
っては、吸着防止剤を添加してもよく、該吸着防止剤と
してはヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、レシ
チン、デキストラン、エチレンオキサイド／プロピレン
オキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、
メチルセルローズ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、
ポリエチレングリコールなどの蛋白質、高分子、あるい
は糖、界面活性剤等が挙げられ、これ等は単独でまたは
２種以上の混合物として添加することができる。

作用既に詳しく述べたように、巨核球細胞の分化増殖を刺激
して血小板産生を促進する因子の存在は以前から知られ
ており、分子量２５．０００の糖蛋白、分子量４８．０
００のＥＰＯ類似の糖蛋白、あるいはトロンボポエチン
と呼ばれる因子であるなどの諸説があった。

しかしながら、本発明者の研究によれば、以下の実施例
で明らかにされるように、ヒトＥＰ○がマウスの骨髄細
胞を用いたインビトロ試験で、顕著な巨核球コロニー刺
１（Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ）活性、即ちマウス骨髄細胞から巨
核球コロニーを生成する強力な活性を有すること並びに
該ヒ）ＥＰＯを正常ラットに投与することにより骨髄中
の５ＡｃｈＥ”の割合が増大することがわかった。

即ち、骨髄巨核球の分化増殖機能の低下は血小板減少と
密接な関係を有しており、また骨髄５ＡｃｈＥ”は成熟
過程を経て巨核球となり、更に血小板へと変化していく
ものであることから、これら巨核球および／または５Ａ
ｃｈＥ“の分化増殖能の亢進を図ることができれば、こ
れら細胞の分化増殖機能低下に伴う諸疾患の治療が可能
となるものと考えられる。

従って、ヒトＥＰＯは骨髄巨核球の分化増殖機能の低下
に伴う血小板織少、血小板増殖機能の低下等に伴う諸疾
患の治療のために利用することができ、しかもヒトＥＰ
Ｏは生体関連物質であることから、一般の合成医薬品に
みられるような副作用の問題がないので、最近の医薬に
みられる動向に沿うものである。

このヒ１−ＥＰＯは尿から濃縮精製することも可能であ
るが、その量には自ら限界があり、また高価なものとな
る可能性が高い。しかしながら、この問題はヒト胎児肝
細胞から得られる、ヒ１−ＥＰ○をコードする遺伝子を
宿主細胞に組み込んで形質発現させることにより、量産
できる可能性がありそれ程大きな問題とはならない。

かくして、本発明によれば副作用の恐れがない生体関連
物質を有効成分として含有する巨核球・血小板系増加剤
を提供することができ、この巨核球・血小板系増加剤は
血小板の前駆体である巨核球細胞の増殖を促進するばか
りでなく更にその前駆体とみられる５ＡｃｈＥ＋をも増
加させる作用を有するものであり、上記各疾患の治療の
ために有利に使用できる。

実施例以下に本発明の巨核球・血小板系増加剤を参考例および
実施例によって更に詳しく説明するが、本発明の範囲は
これによって何ら制限されることはない。

参考例Ｉ　　　ＣＨＯ細胞によるヒ）ＥＰＯの産生特願
昭５９−２８１８６２号明細書に開示された方法に従っ
て、ヒ）ＥＰＯをコードする遺伝子を組み込んだプラス
ミドをＣＨＯ細胞で形質発現させることによってヒ）Ｅ
ＰＯを得た。

即ち、ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯをコード
する遺伝子を組み込んだラムダ）ＩＢＰ［］ＦＬ１３ク
ローンからのＤＮＡを制限酵素ＥＣ，ＲＩで切断し、ヒ
）ＥＰＯをコードする遺伝子を含む小さなＲＩフラグメ
ントを取り出し、プラスミドＲＫＩ−４（ΔＴＣＣへの
寄託番号第３９．９４０号）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入し
た。該プラスミドをジヒドロ葉酸還元酵Ｓ　（ＤＨＦＲ
）−欠損ＣＨＯ細胞に組入れて形質転換させた。該形質
転換されたＣＨ○細胞（ΔＴＣＣＣＲＬ　　８６９５）
を、核酸の欠如したアルファ培地中で培養することによ
って、少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を
選択した後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めて
ゆくことによってヒ）ＥＰＯを産生させた。

参考例２　　ヒトＥＰＯの精製上記参考例１で得たヒ）ＥＰＯの培養液（１，２，Ａ　
）を排除限界分子量１万の限外濾過膜を有するミＩＪボ
アー　ペリカン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃａ
ｎ、ミリポア社製）により６００ｍ１まで濃縮した。該
濃縮液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
＞にて透析した後、遠心分離（１１，０００ｇ、３０分
）した。得られた上清に５０％酢酸を加えてｐＨ５，５
に調整した後、生成した沈殿を遠心分離（１３，０００
ｇ　、３０分）して除去したものを用いて以下の精製を
行った。

工程１：ＣＭ−セファロースクロマトグラフィー１０＋
ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）で予め平衡化
したＣＭ−セファロースカラム（ファンしマシア社製）
に上記操作で得られた試料を注入し、前記平衡液で洗浄
した後、ｌ　Ｑ　ｍ　！Ａのリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，５）で溶出させた。ＥＰＯ活性を有するフラク
ションを集めアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　ＹＭ　−１
０（アミコン社製）を用いた限外濾過により２ｍｌに濃
縮した。

工程２：逆相系高速液体クロマトグラフィ一工程１で得
られた試料を６５５Ａ１２型高速液体クロマトグラフィ
ーにかけた。使用したカラムはヒタチ（ＨＩＴＡＣＨＩ
）　３０６３カラム（孔径３０〇人）（日立製作所社製
）（直径３ｍｍｘ長さ２５０ｍｍ）で溶出液Ａ　（０，
１％トリフルオロ酢酸）と溶出液日（９０％エタノール
／ＬＭグアニジン塩酸塩溶液）の連続濃度勾配をかけ、
１．５ｍｌ　／分の速度で溶出を行い、試験管１本当り
３．Ｏｍｌずつ分画した。

溶出液Ｂの比率が約７５〜７８％の画分にエリスロポエ
チンの活性が検出された。

この活性画分を更にヒタチ（ＨＩＴＡＣＩＩＩ）　３０
６３カラム（直径４　ｍｍ　Ｘ長さ２５０ｍｍ）を用い
、溶出液として上記と同じものを用い、溶出速度０．５
ｍｌ　／分で、試験管１本当りＯ，１ｍｌずつ分画する
という条件で再クロマトを行った結果、溶出液Ｂの比率
が約７１〜７３％の画分にエリスロポエチン活性に一致
する単一なビークが得られた。

工程３：高速分子篩クロマトグラフィ一工程２で得られ
た両分を更に分子篩カラムＴＳＫ−Ｇ−３０００ＳＷ　
（東洋曹達社製）を用いた高速分子篩クロマトグラフィ
ーにかけた。溶出液として２０％エタノールを含む１０
ｍＭ　’Ｊン酸緩衝液１０．２ＭＮａＣ１（ｐＨ７，５
）を用い、溶出速度は０．５ｍｌ　／分とした。この結
果、エリスロポエチンの活性と一致する明確な蛋白ピー
クが得られた。得られたヒトＥＰＯの比活性は８　ＸＩ
Ｏ’　Ｕ　７ｍｇであった。なお：比活性の測定法はイ
スコブ（Ｉ　５ｃｏｖｅ）等の方法〔ジャーナル　オン
　セル　フィジオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ）、　８３．３０９　（１９７４）］に
従った。

実施例１　目抜球コロニー刺激（Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ）活性参考例２で得られた精製と）ＥＰＯの目抜９球コロニー
刺激（Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ）活性をＣ５７ＢＬ　／６Ｊマウ
スの骨髄細胞を用いて、溝目等の方法〔エクスペリメン
タル　へマトロジー（ＢＸｐ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、）
。

７　、３４５　（１９７９）　）に従って以下のように
測定した。

適宜希釈した試料０．０４ｍ１およびｌＸ１０３個のマ
ウス骨髄細胞を含む合計０．４ｍｌを血漿凝固法で７日
間培養した後、アセチルコリンエステラーゼ染色陽性の
コロニー数をカウントした。

Ｍｅｇ−Ｃ５Ｆ活性は１　ｃｍのキュベツト中の２７８
ｎｍにおける吸光単位当たりのコロニー数として表わし
た。

更に、比較例として、再生不良性貧血患者の尿からミャ
ケ（Ｍｉｙａｋｅ）等の方法〔シュテムセル（Ｓｔｅｍ
　Ｃｅ１ｌ）、　２．１２９（１９８２）　］に従って
粗精製した人尿エキス画分についても同様の方法でＭｅ
ｇ−Ｃ３Ｆ活性を測定した。即ち、人尿をセファデック
スＧ−５０カラムクロマトグラフイーおよびＤＢＡＥ−
セルロースクロマトグラフィーに付シて０．１５　ＭＮ
ａＣＩを含む０．０５　Ｍ　ＮａＪＰＬを溶出液として
得た蛋白画分を人尿エキス画分とした。

得られた結果を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、本発明による、遺伝子組み換え技術によって得られ
たヒ）ＥＰＯは、ＥＰＯの濃度に比例した顕著なＭｅｇ
−Ｃ３Ｆ活性を示した。また、人尿から得られた人尿エ
キス画分も同様にＭ　ｅ　ｇ　−ＣＳ　Ｆ活性を有して
いた。

ＥＰＯとしてヒト尿由来の純化ＥＰＯ（１，８ＸＩＯ’
Ｕ／ＡＵ）を０．１％牛血清アルブミンを含む生理食塩
水で希釈して用い、骨髄中のＳ　Ａ　ｃ　ｈ　Ｅ”の割
合の増加を調べた。対照として０．１％牛血清アルブミ
ンを含む生理食塩水を使用した。

６週令のＳＤ系オスラットを一群あたり５匹とし、ＥＰ
Ｏ２０Ｕを１日１回、５日間連続して皮下投与した。投
与前および投与後、１．２．３．４．５．７．１０およ
び１４日後に眼窩静脈叢より採血し、血小板数をコール
タ−カウンターにて算定した。また、骨髄細胞を３．５
　％ポリビニルピロリドンを含むリン酸緩衝塩類溶液（
ＰＢＳ）に浮遊させ、１．５　Ｘ１０３個の細胞をサイ
トスピンでスライドグラス上に固定し、アセチルコリン
エステラーゼ（Ａｃｈ８　）染色を行い、細胞径が１８
μｍ以下のＡｃｈＥ陽性細胞を５ＡｃｈＢ”細胞とし、
それ以上を成熟巨核球とし、それぞれの比率を算定した
。得られた結果を第２図に示す。

第２図より明らかなように、末梢血血小板数はＥＰＯの
投与により変化しなかったが、骨髄では、５ＡｃｈＢ＋
細胞の比率が経時により対照（約１０％）に対して投与
後２〜７日の範囲で大幅に増大していることがわかる。

発明の効果以上、詳しく説明したように、ヒトエリスロポエチンは
顕著な目抜球コロニー刺激活性および骨髄中５ＡｃｈＢ
＋の割合を増加させる作用を有している。即ち、ヒトエ
リスロポエチンは、赤血球を増加させるばかりでなく、
目抜球・血小板系への作用を有していることが今や明ら
かとなった。

更に、本発明において記載した遺伝子組み換え技術およ
び精製法を用いることによって、このような目抜球・血
小板系増加作用を有するヒトエリスロポエチンを大量に
且つ高純度に得ることが可能となった。

従って、本発明による目抜球・血小板系増加剤は、骨髄
巨核球の分化増殖機能の低下に伴う血小板減少、および
血小板増殖機能の低下に伴う諸疾患に有効であることが
期待される。例えば、白血病、再生不良性貧血、血管向
凝固症候群の他に、伝染病や薬剤による血小板減少症、
放射線障害、保存血大量輸血に伴う血小板減少、体外循
環、血小板無力症、肝不全や腎不全等の疾患のために血
小板の輸血が必要な場合等に、注射剤、経口剤等の投与
手段によって投与することができ、新規な目抜球・血小
板系増加剤として、その応用範囲は極めて広い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるヒ）ＥＰＯの目抜球コロニー刺
激活性を示す図である。第２図はＥＰＯ投与による血小板および骨髄５Ａｃｈｌ
Ｅ＋の変化を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有する
巨核球・血小板系増加剤。
（２）上記ヒトエリスロポエチンがヒト尿由来のもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の巨
核球・血小板系増加剤。
（３）上記ヒトエリスロポエチンが、ヒトエリスロポエ
チンをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させて
得たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の巨核球・血小板系増加剤。
（４）上記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞
であることを特徴とする特許請求の範囲第３（５）上記
ヒトエリスロポエチンを、成人に対し、単位用量当たり
０．１〜５００μｇ含有していることを特徴とする特許
請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の巨
核球・血小板系増加剤。