JPH02108627A

JPH02108627A - 貧血治療剤

Info

Publication number: JPH02108627A
Application number: JP63262322A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Ejima; 大輔江島; Yuzuru Eto; 譲江藤; Hiroshiro Shibai; 柴井　博四郎
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1988-10-18
Filing date: 1988-10-18
Publication date: 1990-04-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、貧血治療剤に関する。

従来の技術貧血の治療薬としては、貧血の原因によシ薬物が異るが
、一般的に鉄欠乏性貧血には鉄剤、悪性貧血にはビタミ
ンＢ、２．葉酸、男性不良性、溶血性貧血にはコルチコ
イド等の副腎皮質ステロイドが使われている。この内ス
テロイドホルモンは、造血促進効果が確認されておシ有
効な治療薬ではあるが、もつとも問題になるのは強い副
作用であル、長期投与には問題が有るといわれている。

近年、赤血球生成に深く関与し貧血を改善する生体物質
としてエリスロポエチンが注目されている。エリスロポ
エチンは腎臓で産生され、α−グロブリン画分に存在す
る分子量４５，０００の糖蛋白であシ造血幹細胞に作用
して赤芽球細胞への分化及び赤芽球生成を促進させる体
液性調節因子と定義され、新しい貧血治療剤として期待
されている。

しかしながら、原料が人尿であり又含量も極めて少ない
ため大量に供給することが困難である。−方、遺伝子組
換法による生産も研究されているが、いまだ開発研究途
上にある。

本発明の課題は種々のヒト細胞を用いて、貧血の治療に
役立つ有効因子を見つけだし、その化学的本体を明らか
にすると共に新規な貧血治療剤を提供することに°有る
。

本発明者等は斜上の課題を解決するため種々のヒト細胞
の生産物について貧血改善作用物質を検索した結果、ポ
リ（プチドＥＵＦ　−４、もしくはＢＵＦ　−５がマウ
スの貧血を改善する作用を有するととを見出し、本発明
を完成するに至った。すなわち、本発明の貧血治療剤は
下記の理化学的性質を有するポリペプチドＢＵＦ　−４
もしくはＢＵＦ−５のうち少くとも１種類以上の物質を
有効成分として含有することを特徴とする。

（１）／す（プチドＢＵＰ−４（以下ＢＵＦ　−４とす
る）の理化学的性質（＆）構　造：単量体Ａ及び単量体Ｂ（第２図参照）の
ヘテロダイマー（ｂ）　　分子量：単量体Ａ及び単量体Ｂともに１６±
１ｋｄ（１，０［メルカプトエタノール非在下、５ＤＳ
−電気泳動法）ヘテロダイマーとして２５±１　ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下、５Ｄ８−電気泳動法）（ｃ）　　等電点：ｐｌ７．３±０．５（等電点電気泳
動法）（ｄ）　　Ｐ）（安定性：ｐｌ（２，０〜１０．
０の範囲で安定（・）　熱安定性＝６５℃、６０分の加
熱で安定（ｆ）　　有機溶媒安定性：低級アルコール、
アセトニトリルに対し安定 ω　グロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活す
る（ｈ）　　アミノ酸配列：単量住人のアミノ酸配列は第
１図に、単量体Ｂの７２ノ酸配列は第２図に示す。

（２）　　ポリペプチドＢＵＦ　−５（以下ＢＵＦ　−
５とする）の理化学的性質（１）　　構　造：単量体Ｂのホモダイマー構造伽）　
分子量：単量体として１６±１ｋｄ（１，０％メルカプ
トエタノール存在下、５ＤＳ− 電気泳動法）ホモダイマーとして２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在５ＤＳ−電気泳動法）（ｃ）　　等電点：ｐｌ７．３±０．５（等電点電気泳
動法）（ｄ）　　ｐＨ安定性：ｐＨ２，０〜１０．０の
範囲で安定（・）　熱安定性：６５℃、６０分の加熱で
安定（ｆ）　　有機溶媒安定性：低級アルコール、アセ
トニトリルに対し安定０）′ｆロチアーゼ耐性：ゾロナーゼ処理で完全に失活
する。

（ｈ）　　アミノ酸配列：単量体Ｂのアミノ酸配列は第
２図に示す。

本発明に係るＢＵＦ　−４及び５は第１図、第２図に示
すアミノ酸配列と全く同一のアミノ酸配列を有しなくと
も貧血治療作用を有すれば、その物質は本発明のＢＵＦ
　−４及び５に含有される。

即ち、第１図又は第２図に示すアミノ酸配列中の１個若
しくは複数のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した構造を
有する物質並びに当該配列において１個もしくは複数個
のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端に付加された構造を有す
る物質、更には、描該配列ＯＮ末端又はＣ末端よ９１個
もしくは複数のアミノ酸が欠損し、かつ連続しているア
ミノ酸配列よシなる構造を有する物質も本発明のＢＵＦ
−４及び５に含まれる。

一方はＢＵＦ　−４が卵胞刺激ホルモン分泌作用を有す
ることは従に報告されている（Ｖａｌ・、Ｗ、。

Ｒ１ｖ＠ｒ　、Ｊａ　、Ｖａｕｇｈａｎ、Ｊ、　、Ｍｃ
Ｃｌｉｎｔｏｅｋ、Ｒ，。

Ｃｏｒｒｌｇａｎ　、Ａｌｌ　、Ｗｏｏ　、ｗ＠、ＪＣ
ａｒｒ　、Ｄａ　ａｎｄ　８ｐ１ｅｍｓ　。

Ｊ、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１．７７６−７７
７尚、ＢＵＦ　−４はアクチビン（ＡｃＨｖｉｎ　）と
も称されるが１本発明においてＢＵＦ　−４という名称
を用いることにする。

更にＢＵＦ　−５は特開昭６３−１１９６７９号公報に
開示されている物質である。

本発明の貧血治療剤は赤血球産生の低下によシ生ずる貧
血の予防、治療に有効でアシ、マウス及びヒトの培養細
胞へ毒性を示さず、ヒトの貧血の予防、治療に有効であ
る。

本発明の貧血治療剤はＢＵＦ　−４及びＢＵＦ　−５の
内掛なくとも１種類以上の物質を有効成分として含有す
るものであるから、上記有効成分を単独で含有するもの
でもよいし、また２種類以上を組み合亡て含有するもの
でもよい。

さて、前記有効成分の投与量であるが、ＢＵＦ−４又は
ＢＵＦ　−５のいずれか１つの物質のみを単独で用いる
場合はいずれの物質を用いる場合でも通常成人１日あた
シ約０．０１■〜１００１ｖであり、これを１回又は数
回に分けて投与すれば良い。

また２ｓ類以上を組み合せて投与する場合（すなわち、
ＢＵＦ　−４とＢＵＦ−５）も、各物質の薬効はほぼ等
しいことよシ、通常成人１日あたシ約ｏ、　ｏ　ｉ　ｑ
〜１００■を１回又は数回に分けて投与すれば良い。

もちろん、投与量は患者の貧血の程度、患者の体重及び
当業者が認める他の因子によって変化するので、上記投
与量を厳守する必要はなく、臨機応変に決定すればよい
。

本発明に使用するＢＵＦ　−４、及び／又はＢＵＦ−５
の製剤化は通常の方法によって行われ、主として注射剤
とされるが、他にカプセル剤、錠剤等の剤型へ製剤化さ
れる。

注射剤を調製する場合には主薬のＢＵＦ　−４、及び／
又はＢＵＦ　−５に必要によシ声詞整剤、緩衝剤。

安定化剤、保存剤などを添加し常法によシ靜脈内、皮下
、筋肉内用注射剤とすればよい、又、経口用製剤を調製
する場合は生薬のＢＵＦ　−４及び／又はＢＵＦ　−５
に賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、着色
剤等を加え常法によシ錠剤、カプセル剤等とする。

次に貧血治療作用を有するＢＵＦ　−４及びＢＵＦ−５
の製造法について簡単に説明する。

ＢＵＦ　−４、及びＢＵＦ　−５の生産は組換えＤＮＡ
法によシ行われるので、以下にその概要を記載する。

ＢＵＦ　−４を生成せしめる方法は、ＢＵＦ　−４をコ
ードする遺伝子、すなわち単量偉人及び単量体Ｂを含有
するプラスミドによシ形質転換された真核生物を、ま７
’ｊ　ＢＵＦ　−５を生成せしめる方法はＢＵＦ−５を
コードする遺伝子、すなわち単量体Ｂを含有するプラス
ミドによシ形質転換された真核生物細胞を培養液中で培
養し培養液中にＢＵＦ　−４もしくはＢＵＦ　−５を製
造せしめるという方法をもちいる（特開昭６３−１１９
６７９　）。

さて、このように生産されたＢＵＦ　−４もしくはＢＵ
Ｆ　−５の精製は通常のポリペプチドの精製法に準じて
行われる。例えば培養液を限外濾過法で濃縮し、この＠
給液から４リペプチドを塩析し、透析後陰イオン交換体
を使用するイオン交換クロマドグ２フイーを行うことに
よシ粗ポリペグチド標品が得られる。この粗標品につい
て疎水クロマトグラフィー又はクロマトフオーカシング
法によシ殆んどの夾雑蛋白が除去される。又この両者を
組合せると更に精製倍率を向上することができる。

このようＫして精製した標品について逆相高速液体クロ
マトｌ”５７４−（ＨＰＬＣ）又ｉ；ｌ）スーパーロー
ズ又はＭｏｎｏＱＨＲ５／　５カラムを装備し九ＦＰＬ
Ｃ（）７　、Ａｙ　マシア製Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｐ＊ｐｔｌｄ＠Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｌｉ
ｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）システム
による高性能グル濾過法又はイオン交換クロマトグラフ
ィーを行うことによシ精製することができる。

また、上述のようなポリペプチドの一般的精製法とは別
Ｋ、本発明者等が開発した所定の濃度の有機酸を含む有
機溶媒を駆使する精製法（特願昭６３−１３１２６８　
）を用いて精製してもかまわない。

ＢＵＦ　−４、もしくはＢＵＦ　−５、もしくはそれら
の混合物を貧血状態のマウスに投与するとマウスの貧血
が改善される。マウスフレンドウィルス誘発白血病細胞
をマウスに移植するとマウスのヘマトクリ、ト値（赤血
球容積率を表わし、赤血球数よシも正確に貧血の程度を
表わす数値）は次第に低下しマウスは１〜２週間で貧血
状態を呈する。

これら対照に比較して移植後ＢＵＦ　−４、もしくはＢ
ＵＦ　−５、もしくはそれらの混合物を静脈円建投与す
るとマウスのへマドクリット値は殆んど低下せず２１日
目処は明らかな有意差が認められる。

又移植後１週間目に貧血状態を呈するマウスにＢＵＮ’
　−４、もしくはＢＵＦ　−５、もしくはそれらの混合
物を投与するとヘマトクリット値の低下が抑えられ２，
３日後に値の上昇が認められ明らかな貧血治療効果が認
められる。

以下、本発明を実施例に従って具体的に説明する。

実施例１ｄｄＹマウス（雄、５週令、東京実験動物■）を用い、
１群５匹を被験動物として用いた。上記マウスに、同マ
ウスの腹水中で継代培養したマウスフレンド白血病細胞
５−５を２　Ｘ　１０’個づつマウスの腹腔内に移植し
た。ＢＵＦ−４（凍結乾燥標品）を滅菌した生理食塩水
に溶解し５０００Ｕ／ｍｔの注射用薬剤を調製した。Ｂ
ＵＦ−４投与群には、Ｆ５−５細胞を移植した翌日よｌ
）３日間上記注射薬を０、２　ａｄ　（１００ＯＵ　）
宛腹腔内及び静脈内投与した。

Ｆ５−５細胞移植後１４日目及び２１日０に尾靜脈よシ
ヘマトクリ、ト管に採血し１２．００　Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で５分間遠心分離しヘマトクリット値を常法によシ測定
した。対照群には生理食塩水を投与した。

その結果を第１表に示す。

第１表対照群　　　　４２．５　　３０．１　　２７．６静脈
内投与群　　　４３．６　　　３８．０　　　４２．１
腹腔内　１　　　　４５．２　　　４３，０　　　３９
．５これと併行して別のマウス１群を用いＦ５−５細胞
移植後１４日目に静脈内に０．２４投与し、２１日０に
ヘマトクリ、ト値を測定した。その結果、ヘマトクリッ
ト値は４２．１であシ明らかなヘマトクリット値の上昇
が確認された。

一方、正常マウスにＢＵＦ　−４を５０／ｊ、９（２，
５ダ／ｋｇ）静脈内投与して２ケ月間飼育して毒性を調
べたが、マウスは正常であシ何ら異常は認められなかっ
た。

実施例２ｄｄＹマウス（雄、５週令、東京実験動物■）を用い、
１群５匹を被験動物として用いた。上記マウスに、同マ
ウスの腹水中で継代培養したマウスフレンド白血病細胞
Ｆ５−５を２　Ｘ　１０’個づつマウスの腹腔内に移植
した。ＢＵＦ−５（凍結乾燥標品）を滅菌した生理食塩
水に溶解し５０００Ｕ　／ｄの注射用薬剤を調製した。

ＢＵＦ−５投与群には、Ｆ５−５細胞を移植した翌日よ
り３日間上記注射薬を０．２ｄ（１００ＯＵ）宛腹腔内
及び静脈内投与した。Ｆ５−５細胞移植後１４日目及び
２１日０に尾靜脈よシヘマトクリ、ト管に採血し１２，
０００ｒｇｐｍｍｓで５分間遠心分離しヘマトクリット
値を常法によシ測定した。対照群には生理食塩水を投与
した。その結果を第２表に示す。

第２表移植前　　１４日目処　２１日０に照群　　　　４５．１　　３０．１　　２９．０静脈
内投与群　　　４４．７　　　４Ｑ、０　　．４２．２
腹腔内　１　　　　４４．１　　　４２．１　　３９．
５値はすべて平均値これと併行して別のマウス１群を用いＦ５−５細胞移植
後１４日目に静脈内ＫＯ９２−投与し、２１日０にヘマ
トクリット値を測定した。その結果、ヘマトクリット値
は４２．２であり明らかなヘマトクリット値の上昇が確
認された。

一方、正常マウスにＢＵＦ　−５を５０μｇ（２，５ダ
／に９）静脈内投与して２ケ月間飼育して毒性を調べた
が、マウスは正常であシ何ら異常は認められなかった。

発明の効果本発明の貧血治療剤はフレンド白血病によって生ずる貧
血を予防、及び治療する効果を有する。

従って本発明の貧血治療剤は白血病、多発性骨髄腫、リ
ンパ腫等の悪性腫瘍によって起る赤血球。

ヘモグロＶン低下に起因する貧血症等に使用できる。

Claims

【特許請求の範囲】

ポリペプチド、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の内、少なく
とも１種類以上物質を有効成分として含有する血糖低下
剤。