JPS6232A - 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 - Google Patents
慢性関節リウマチ性貧血治療剤Info
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- JPS6232A JPS6232A JP61022930A JP2293086A JPS6232A JP S6232 A JPS6232 A JP S6232A JP 61022930 A JP61022930 A JP 61022930A JP 2293086 A JP2293086 A JP 2293086A JP S6232 A JPS6232 A JP S6232A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
て含何する慢性関節リウマチ性貧血治療剤に関する。
エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記することもある）
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
ヒ）ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、入手
できる純粋なヒトＥＰＯの量に制約があること等からヒ
）ＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
できる純粋なヒトＥＰＯの量に制約があること等からヒ
）ＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
近年、慢性関節リウマチ患者に於ける合併症として、貧
血症が島頻度で認められており（例えば、Ｎｉｌｓｓｏ
ｎ Ｆ ； アクタ メデイカ スカンジナビ力
すプリメンタム （Ａｃｔａ．Ｍｅｄ． Ｓｃａｎｄ
。
血症が島頻度で認められており（例えば、Ｎｉｌｓｓｏ
ｎ Ｆ ； アクタ メデイカ スカンジナビ力
すプリメンタム （Ａｃｔａ．Ｍｅｄ． Ｓｃａｎｄ
。
Ｓｕｐｐｌ． ２ＵｆＬ巻 １９３頁（１９４８Ｌ
ＲｏｂｅｒｔｓＦＤ等 ； ブラッド（Ｂｌｏｏｃｌ
）ｎ１巻 ４７０頁（１９６３）等を参照コ、特に重度
の貧血は臨床的に患者の治療上重要な問題となっている
。
ＲｏｂｅｒｔｓＦＤ等 ； ブラッド（Ｂｌｏｏｃｌ
）ｎ１巻 ４７０頁（１９６３）等を参照コ、特に重度
の貧血は臨床的に患者の治療上重要な問題となっている
。
貧血の機序としては、一般的に鉄代謝異常による網内系
に於ける鉄補足、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエ
チン産生障害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられ
るが、慢性関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性
低色素性貧血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度
が低下していること、骨髄中の赤芽球が減少しているこ
と、赤血球中の遊離プロトポルフィリンが増加している
などの事実から［例えば、Ｗｉｎｔ ｒｏｂｅ ＭＭ
：クリニカルヘマトロジー （ＣｌｉｎｉｃａｌＨｅｍ
ａｔｏｌｏＪｌ’） ８７１頁 リー アンド フェ
ビガーロンド７ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ
Ｌｏｎｄｏｎ）（１９７４）を参照コ鉄代謝異常に
よる赤血球内の鉄不足に起因して貧血が起こると考えら
れている。
に於ける鉄補足、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエ
チン産生障害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられ
るが、慢性関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性
低色素性貧血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度
が低下していること、骨髄中の赤芽球が減少しているこ
と、赤血球中の遊離プロトポルフィリンが増加している
などの事実から［例えば、Ｗｉｎｔ ｒｏｂｅ ＭＭ
：クリニカルヘマトロジー （ＣｌｉｎｉｃａｌＨｅｍ
ａｔｏｌｏＪｌ’） ８７１頁 リー アンド フェ
ビガーロンド７ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ
Ｌｏｎｄｏｎ）（１９７４）を参照コ鉄代謝異常に
よる赤血球内の鉄不足に起因して貧血が起こると考えら
れている。
しかしながら、慢性関節リウマチ患者に於ける血中ＥＰ
Ｏ値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこ
とが報告されており（例えば、ＷａｒｄＨＰ等 ； ジ
ャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカルメデ
ィ’／７ＣＪ、 Ｌ ａ ｂ、 ＣＩ ｉ
ｎ、Ｍｅ ｄ、 ヱ圭巻９３頁 （１９８９）、Ｐａ
ｖｌｏｖｉｃ−ＫｅｎｔｅｒａＶ等； スカンジナビア
ン ジャーナル オブ ヘマトロジー（Ｓｃａｎｄ、Ｊ
、Ｈａｅｍａｔｏｌ、）ｉ１巻１４１頁（１９７９）な
どを参照コ、この事は慢性関節リウマチ性貧血にエリス
ロポエチン産生障害も関与している可能性を示唆してい
るか、慢性関節リウマチ患者に於いてはＥＰＯの産生臓
器である腎や甲状腺等での異常が観察されていない事か
ら実際にエリスロポエチン産生障害が生じているか否か
は不明である。従って血中ＥＰＯ値が上昇しない理由と
して、その他、ＥＰＯに対する骨髄での感受性が低下し
ていることや、ＥＰＯのインヒビターが産生されている
可能性が考えられている。
Ｏ値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこ
とが報告されており（例えば、ＷａｒｄＨＰ等 ； ジ
ャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカルメデ
ィ’／７ＣＪ、 Ｌ ａ ｂ、 ＣＩ ｉ
ｎ、Ｍｅ ｄ、 ヱ圭巻９３頁 （１９８９）、Ｐａ
ｖｌｏｖｉｃ−ＫｅｎｔｅｒａＶ等； スカンジナビア
ン ジャーナル オブ ヘマトロジー（Ｓｃａｎｄ、Ｊ
、Ｈａｅｍａｔｏｌ、）ｉ１巻１４１頁（１９７９）な
どを参照コ、この事は慢性関節リウマチ性貧血にエリス
ロポエチン産生障害も関与している可能性を示唆してい
るか、慢性関節リウマチ患者に於いてはＥＰＯの産生臓
器である腎や甲状腺等での異常が観察されていない事か
ら実際にエリスロポエチン産生障害が生じているか否か
は不明である。従って血中ＥＰＯ値が上昇しない理由と
して、その他、ＥＰＯに対する骨髄での感受性が低下し
ていることや、ＥＰＯのインヒビターが産生されている
可能性が考えられている。
従って慢性関節リウマチ性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与
しても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒ
）ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告されて
いるが慢性関節リウマチ性貧血の治療薬として有効であ
ることをヒト又は動物に実際に投与することによって実
証した者はない。
しても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒ
）ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告されて
いるが慢性関節リウマチ性貧血の治療薬として有効であ
ることをヒト又は動物に実際に投与することによって実
証した者はない。
本発明者等は人尿中から高純度に精製したヒトＥＰｏお
よびヒ）ＥＰＯをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトＥＰＯを用いて慢性関節リウマチ疾
患の動物モデルについて貧血治療効果を調べたところ、
ヒトＥＰｏが顕著な貧血治療効果を示したことから慢性
関節リウマチ性貧血治療薬として有効であることを見い
出し本発明を完成した。
よびヒ）ＥＰＯをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトＥＰＯを用いて慢性関節リウマチ疾
患の動物モデルについて貧血治療効果を調べたところ、
ヒトＥＰｏが顕著な貧血治療効果を示したことから慢性
関節リウマチ性貧血治療薬として有効であることを見い
出し本発明を完成した。
本発明は新規な慢性関節リウマチ性貧血治療剤の提供に
係るものである。
係るものである。
すなわち本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分とし
て含宵する慢性関節リウマチ性貧血治療剤である。
て含宵する慢性関節リウマチ性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトエリスロポエチンとは前述の如
き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をっがさ°どる微量
生理活性物質として規定される。
き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をっがさ°どる微量
生理活性物質として規定される。
ヒトＥＰＯは種々の手段によって得られることが知られ
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿（血清を含む）がら抽出する方法 ［Ｔ、ＭＩＹ
ＡＫＥ等； ジャーナル オブ バイオロジカルケミス
） ＩＪ−（Ｊ、Ｂ、Ｃ，） ２１２巻 ５５５８頁
（１９７７）＋ Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等； ジャーナ
ル オブ ラボラトリ−７７ド クリニカル メディシ
ン（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ。
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿（血清を含む）がら抽出する方法 ［Ｔ、ＭＩＹ
ＡＫＥ等； ジャーナル オブ バイオロジカルケミス
） ＩＪ−（Ｊ、Ｂ、Ｃ，） ２１２巻 ５５５８頁
（１９７７）＋ Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等； ジャーナ
ル オブ ラボラトリ−７７ド クリニカル メディシ
ン（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ。
■巻９８７頁 （１９Ｅｔ５）］、ヒ ト腎癌細胞の組
織培養物から製造する方法［特開昭５４−５５７９０コ
、ヒトエリスロポエチン産生能を何するヒト由来のリン
パ芽球様細胞から製造する方法［特開昭５７−４０４１
１］等の他、ヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブ
リドーマを培養して得る方法やヒトＥＰＯのメツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取することにより、その
ｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、適当な宿主
細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類。
織培養物から製造する方法［特開昭５４−５５７９０コ
、ヒトエリスロポエチン産生能を何するヒト由来のリン
パ芽球様細胞から製造する方法［特開昭５７−４０４１
１］等の他、ヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブ
リドーマを培養して得る方法やヒトＥＰＯのメツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取することにより、その
ｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、適当な宿主
細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類。
植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所謂、
遺伝子工学的方法によっても得られる［例えば、 ５Ｙ
ＬＶＩＡ Ｌ、Ｈ，等 ； プロシーディング オブ
ザ ナシ式ナル アカデミ−オブ サイエンシーズ オ
ブ ザユーエスｘ−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ
、Ｓｃ ｉ。
遺伝子工学的方法によっても得られる［例えば、 ５Ｙ
ＬＶＩＡ Ｌ、Ｈ，等 ； プロシーディング オブ
ザ ナシ式ナル アカデミ−オブ サイエンシーズ オ
ブ ザユーエスｘ−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ
、Ｓｃ ｉ。
ＵＳＡ ｌ−巻 ２７０８頁 （１９８４） を参照
コ。
コ。
前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が、好ましくはヒト又は吐乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、ｃｏｓ細胞。
が、好ましくはヒト又は吐乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、ｃｏｓ細胞。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ
−１２７細胞などを挙げることができる。
−１２７細胞などを挙げることができる。
これらの方法によって得られたヒトＥＰＯは慢性関節リ
ウマチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬
機能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本
発明に使用され得る。
ウマチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬
機能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本
発明に使用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の何機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合わせて用いてもよい。
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の何機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合わせて用いてもよい。
得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含宵水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、゛得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含宵水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、゛得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。
また所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した
後、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とする
ことができる。
後、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とする
ことができる。
本発明の貧血治療剤は場合によりその他の貧血治療剤、
例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホルモン剤等を
処方的に配合するかまたは使用時に混合することができ
、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一鉄、フマール酸鉄、
グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げ
られる。
例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホルモン剤等を
処方的に配合するかまたは使用時に混合することができ
、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一鉄、フマール酸鉄、
グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げ
られる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤に含まれるヒ）
ＥＰＯの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配
慮して決めることができるが通常成人１人当たり ０．
１〜５００μｇ好ましくは５〜１００μｇのエリスロポ
エチンを含有する製剤を１ａ間に１〜７回投与すること
ができる。
ＥＰＯの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配
慮して決めることができるが通常成人１人当たり ０．
１〜５００μｇ好ましくは５〜１００μｇのエリスロポ
エチンを含有する製剤を１ａ間に１〜７回投与すること
ができる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤は安定化物質を
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質。
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質。
糖類、アミノ酸、無機塩、何機塩および含硫還元剤が挙
げられ、これらの１つ又は２つ以上を含有してもよい。
げられ、これらの１つ又は２つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、エリスロポエチンの１
重量部にたいして０．１１〜１ｏｏｏｏ重量部の割合で
配合することが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質
を混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記
範囲以内であればよい。
重量部にたいして０．１１〜１ｏｏｏｏ重量部の割合で
配合することが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質
を混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記
範囲以内であればよい。
これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０ の範囲とし、より好ましくは０．８〜１
．２ である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０に調整
し、特にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。また本発
明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤を調整するにあたっ
ては、吸着防止剤を添加してもよい。
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０ の範囲とし、より好ましくは０．８〜１
．２ である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０に調整
し、特にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。また本発
明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤を調整するにあたっ
ては、吸着防止剤を添加してもよい。
ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，λ江５５５
８（１９７７））に従って再生不良性貧血患者圧から１
）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０による脱塩２）ＤＥＡＥセル
ロースによるバッチ吸着３）エタノール沈殿４）ＤＥＡ
Ｅアガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精
製されたヒトＥＰＯを得た。得られた部分精製ヒ）ＥＰ
Ｏを２４％プロパツール（和光純薬社製）を含む０．１
％トリフルオロ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）溶液に
溶解せしめたのちＨＰＬＣによる精製を行った。ＨＰＬ
Ｃ装置は日立６３８−５０型を用い２８０ｎｍと２２０
ｎｍの紫外部吸収により検出を行った。
８（１９７７））に従って再生不良性貧血患者圧から１
）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０による脱塩２）ＤＥＡＥセル
ロースによるバッチ吸着３）エタノール沈殿４）ＤＥＡ
Ｅアガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精
製されたヒトＥＰＯを得た。得られた部分精製ヒ）ＥＰ
Ｏを２４％プロパツール（和光純薬社製）を含む０．１
％トリフルオロ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）溶液に
溶解せしめたのちＨＰＬＣによる精製を行った。ＨＰＬ
Ｃ装置は日立６３８−５０型を用い２８０ｎｍと２２０
ｎｍの紫外部吸収により検出を行った。
゛ ロマトグラフ −
２４％ｎ−プロパツールを含んり０．１ ％トリフル
オロ酢酸溶液で予め平衡化したＭＭＣ−Ｃ８カラム（６
ｍｍＸ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を
注入シ、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させ
た。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉ
ｃｏｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社製商品名）を用いた限
外ろ過により ０．１ 〜０．２ ｍｌに１縮した。
オロ酢酸溶液で予め平衡化したＭＭＣ−Ｃ８カラム（６
ｍｍＸ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を
注入シ、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させ
た。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉ
ｃｏｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社製商品名）を用いた限
外ろ過により ０．１ 〜０．２ ｍｌに１縮した。
−゛ ロマトグラフ −
上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む ０．１
％ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３０００
０の位置にＥＰＯ活性を宵するピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
％ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３０００
０の位置にＥＰＯ活性を宵するピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
比活性は約９ Ｘ １０’ｕ ／ ｍ ｇであった。
各ステップに於ける比活性を表■に示す。
表１
＊アッセイ法 １ｓｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ等 ［ジャー
ナル オブセルラー フィジオロジ−（Ｊ、 Ｃｅ ｌ
１． ｐｈｙＳ ｉ ｏ １． ）Ｕ巻 ３０９頁
（１９７４）］の方法に従った。
ナル オブセルラー フィジオロジ−（Ｊ、 Ｃｅ ｌ
１． ｐｈｙＳ ｉ ｏ １． ）Ｕ巻 ３０９頁
（１９７４）］の方法に従った。
参考例２ ′ に ヒト の１′１２月２
７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８１
８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質発現させることに
よってヒトＥＰＯを得た。要約すると以下の如（である
。
７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８１
８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質発現させることに
よってヒトＥＰＯを得た。要約すると以下の如（である
。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯをコードする遺
伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３クローンからの
ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ＥＰｏをコードする遺
伝子を含む小さなＲ１フラグメントを取り出しプラスミ
ドＲＫＩ−４のＥｃ。
伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３クローンからの
ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ＥＰｏをコードする遺
伝子を含む小さなＲ１フラグメントを取り出しプラスミ
ドＲＫＩ−４のＥｃ。
Ｒ１部位へ挿入した。このＥＰＯ遺伝子を組込んだプラ
スミドＲＫＩ、−４をＤＨＦＲ＝欠損ＣＨＯ細胞に組入
れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如したアル
ファ媒地中で培養することによって少なくとも１つのＤ
ＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的にメト
トレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒトＥＰ
Ｏを産生させた。最終的な培養上清中のヒトＥＰＯの比
活性は２０ ｕ／ｍ ｌであった。得られたヒトＥＰＯ
を含む培養液は０．１ ％ＢＳＡを含む生理食塩水に
て透析した後実験に供した。
スミドＲＫＩ、−４をＤＨＦＲ＝欠損ＣＨＯ細胞に組入
れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如したアル
ファ媒地中で培養することによって少なくとも１つのＤ
ＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的にメト
トレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒトＥＰ
Ｏを産生させた。最終的な培養上清中のヒトＥＰＯの比
活性は２０ ｕ／ｍ ｌであった。得られたヒトＥＰＯ
を含む培養液は０．１ ％ＢＳＡを含む生理食塩水に
て透析した後実験に供した。
８週令の雌性ＬＥＷ／Ｃｒｊラット（日本チャールスリ
バー社より購入）にアジュバント（Ｗ山Ｂ株５０ｍｇ／
ｍ１）０．０５ ｍｌをラット尾部に皮下投与した。投
与後２７日目のアジュバント処理ラットについて関節炎
の生起を確認した後、種々の赤血球パラメーターを測定
した。（表工）〈測定項目〉 ・ヘモグロビン量：眼か採血ののち分光光度計（ＲａＢ
Ａ ｓ ｕ １） ｅ ｒ発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：へマドクリット管により眼か採血
ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼か採血した血液を希釈液（ＩＳＯＴＯＮ
（コールタ−エレクトロニクス社商品名））で希釈し
コールタ−カウンターＭ ｏ ｄ ｅ ＩＺＢＩにて測
定した 表１アジュバントラットにおける赤血球パラメーターの
変化 ＊＊ｐ＜ｏ、 ｏｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ感作 ２７日目測定 各群 ４匹 表Ｉに示す如くアジュバント処理ラットは、赤血球パラ
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して仔
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
バー社より購入）にアジュバント（Ｗ山Ｂ株５０ｍｇ／
ｍ１）０．０５ ｍｌをラット尾部に皮下投与した。投
与後２７日目のアジュバント処理ラットについて関節炎
の生起を確認した後、種々の赤血球パラメーターを測定
した。（表工）〈測定項目〉 ・ヘモグロビン量：眼か採血ののち分光光度計（ＲａＢ
Ａ ｓ ｕ １） ｅ ｒ発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：へマドクリット管により眼か採血
ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼か採血した血液を希釈液（ＩＳＯＴＯＮ
（コールタ−エレクトロニクス社商品名））で希釈し
コールタ−カウンターＭ ｏ ｄ ｅ ＩＺＢＩにて測
定した 表１アジュバントラットにおける赤血球パラメーターの
変化 ＊＊ｐ＜ｏ、 ｏｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ感作 ２７日目測定 各群 ４匹 表Ｉに示す如くアジュバント処理ラットは、赤血球パラ
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して仔
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
アジ バント ：ラントに司 。
１のアジュバント処理ラットについてアジュバント注射
後１８日月から７日間人尿由来ヒ）ＥＰＯ（２５ｕ／ラ
ット／日）を腹腔内に連日投与した群と無投与群との赤
血球パラメーターを比較した。
後１８日月から７日間人尿由来ヒ）ＥＰＯ（２５ｕ／ラ
ット／日）を腹腔内に連日投与した群と無投与群との赤
血球パラメーターを比較した。
（表■）
表■ 人尿由来ヒ）ＥＰＯの貧血治療効果１のアジュバ
ント処理ラットについてアジュバント注射後１８日月か
ら７日間ＣＨＯ細胞由来ヒトＥＰ。
ント処理ラットについてアジュバント注射後１８日月か
ら７日間ＣＨＯ細胞由来ヒトＥＰ。
（１０ｕ／ラット７日）を腹腔内に連日投与した詐き無
投与群との赤血球パラメーターを比較した。
投与群との赤血球パラメーターを比較した。
（表■）
表ＩＩＩ ＣＨＯ細胞由来ヒトＥＰＯの貧血治療効果表
■、■に示される如くアジュバントラット群に比べてヒ
）ＥＰＯ投与群ではへマドクリット値、ヘモグロビン量
、赤血球数の仔意な改善効果が見られたことから貧血治
療に有効であることがわかった。
■、■に示される如くアジュバントラット群に比べてヒ
）ＥＰＯ投与群ではへマドクリット値、ヘモグロビン量
、赤血球数の仔意な改善効果が見られたことから貧血治
療に有効であることがわかった。
またこれ等の実験条件下に於いて毒性は認められなかっ
た。
た。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例１
エリスロポエチン １重量部ヒト血清アル
ブミン １００重量部注射用蒸留水にて全量 ｔｏ
ｏｏｏｏ重量部上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バ
イアル瓶に分注し、凍結乾燥し密封した。
ブミン １００重量部注射用蒸留水にて全量 ｔｏ
ｏｏｏｏ重量部上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バ
イアル瓶に分注し、凍結乾燥し密封した。
実施例２
実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００ｆｆｉｆｆｉ部用い、同様にて凍結乾
燥製剤を作製した。
ラン４０を１００ｆｆｉｆｆｉ部用い、同様にて凍結乾
燥製剤を作製した。
実施例３
１００ｍｌ中にマンニトール５ｇ、エリスロポエチン１
ｍ ｇ ＋ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチ
ルトリプトファンナトリウム ２．１５４ｍｇ。
ｍ ｇ ＋ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチ
ルトリプトファンナトリウム ２．１５４ｍｇ。
カプリル酸ナトリウム １．３３ｍｇを含む水溶液を無
菌的に調製し、１ ｍ ｌずつバイアルに分注し凍結乾
燥し密封する。
菌的に調製し、１ ｍ ｌずつバイアルに分注し凍結乾
燥し密封する。
実施例４
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にエ
リスロポエチン１ ｍ ｇ ｖ ポリエチレングリコー
ル４０００ ５００ｍｇ、 エチレンオキサイドプロピ
レンオキサイド共重合体３０ ｍ ｇ ＋塩化ナトリウ
ム８００ｍｇを含む水溶液に無菌的に調製し、１ｍｌず
つアンプルに分注し溶閉する。
リスロポエチン１ ｍ ｇ ｖ ポリエチレングリコー
ル４０００ ５００ｍｇ、 エチレンオキサイドプロピ
レンオキサイド共重合体３０ ｍ ｇ ＋塩化ナトリウ
ム８００ｍｇを含む水溶液に無菌的に調製し、１ｍｌず
つアンプルに分注し溶閉する。
実施例５
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にエリ
スロポエチン０．５ｍｇ、グリシン１ｇ。
スロポエチン０．５ｍｇ、グリシン１ｇ。
ンルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に襄製し、０．
５ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別
に０．１ ％メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し
、１ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
５ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別
に０．１ ％メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し
、１ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
実施例６
１００ｍ１中にエリスロポエチン１ｍｇ、ヒト血清アル
ブミン５０ ｍ ｇ ＋ マンニトール５００ｍｇを
含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分
注し凍結乾燥し密封する。
ブミン５０ ｍ ｇ ＋ マンニトール５００ｍｇを
含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分
注し凍結乾燥し密封する。
別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ、ＮａＣｌ２
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、３ｍｌずつアン
プルに分注し、溶封する。
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、３ｍｌずつアン
プルに分注し、溶封する。
上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。
で）静注する。
手続補正書（自発）
昭和６１年４月２５日
特許庁長官 宇 賀 道 部 殿１、事件の表示
昭和６１年特許願第２２９３０号
２、発明の名称
慢性関節リウマチ性貧血治療剤
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
東京都北区浮間５丁目５番１号
４、 補正の対象
明細書全文
５、 補正の内容 別紙の通り
（注）書類送付先及び連絡先
特許部
置 （０３１９８７−７１１１（大代表）明 細
書 １、発明の名称 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 ２、特許請求の範囲 （１） ヒトエリスロポエチンを有効成分として含佇す
る慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
書 １、発明の名称 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 ２、特許請求の範囲 （１） ヒトエリスロポエチンを有効成分として含佇す
る慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
（２） ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の慢性関節
リウマチ性貧血治療剤。
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の慢性関節
リウマチ性貧血治療剤。
（３） ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロボエチン
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たものであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たものであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
（４） 宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。
（５） 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞で
あることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の慢性
関節リウマチ性貧血治療剤。
あることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の慢性
関節リウマチ性貧血治療剤。
（６） 宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治
療剤。
特許請求の範囲第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治
療剤。
３、発明の詳細な説明
本発明はヒトエリスロボエチン（以下「ヒトＥＰＯＪと
いう）を有効成分として含有する慢性関節リウマチ性貧
血治療剤に関する。
いう）を有効成分として含有する慢性関節リウマチ性貧
血治療剤に関する。
本願明細書においてヒトＥＰＯとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは育さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯＪという）７、ヒトＥＰＯの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発
現させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯ
Ｊという）ヒト腎癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒトＥＰＯ産生能を育するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下ｒＥＰ
ＯＪという）という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨髄に存在する赤芽球系幹細胞に働いて、
赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示す
微量生理活性物質をいう。
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは育さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯＪという）７、ヒトＥＰＯの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発
現させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯ
Ｊという）ヒト腎癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒトＥＰＯ産生能を育するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下ｒＥＰ
ＯＪという）という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨髄に存在する赤芽球系幹細胞に働いて、
赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示す
微量生理活性物質をいう。
ヒト尿ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。
近年、慢性関節リウマチ患者に於ける合併症として、貧
血症が高頻度で認められており［例えば、Ｎｉ１ｓｓｏ
ｎ Ｆ；アクタ メゾイカ スカンジナビ力 サプリ
メンタム（Ａｃｔａ Ｍｅｄ。
血症が高頻度で認められており［例えば、Ｎｉ１ｓｓｏ
ｎ Ｆ；アクタ メゾイカ スカンジナビ力 サプリ
メンタム（Ａｃｔａ Ｍｅｄ。
５ｃａｎｄ、５ｕｐｐ１．）２１０巻１９３頁（１９４
８年）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＦＤ等；ブラッド（Ｂｌｏ
ｏｄ）２１巻４７０頁（１９Ｅ３３年）などを参照コ、
特に重度の貧血は臨床的に患者の治療上重要な問題とな
っている。
８年）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＦＤ等；ブラッド（Ｂｌｏ
ｏｄ）２１巻４７０頁（１９Ｅ３３年）などを参照コ、
特に重度の貧血は臨床的に患者の治療上重要な問題とな
っている。
貧血の機序としては、一般的に鉄代謝以上による網内系
に於ける鉄補足、鉄放出障害、牌の関与、ＥＰＯ産生障
害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられるが、慢性
関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性低色素性貧
血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度が低下して
いること、骨髄中の赤芽球が減少していること、赤血球
中の遊離プロトポルフィリンが増加しているなどの事実
から［例えば、Ｗｉｎｔｒｏｂｅ ＭＭ；クリニカル
ヘマトロジ−（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍ゛ａｔｏ
ｌｏｇＹ）６７１頁、リー アンド フェビガー ロン
ドン（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌ。
に於ける鉄補足、鉄放出障害、牌の関与、ＥＰＯ産生障
害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられるが、慢性
関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性低色素性貧
血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度が低下して
いること、骨髄中の赤芽球が減少していること、赤血球
中の遊離プロトポルフィリンが増加しているなどの事実
から［例えば、Ｗｉｎｔｒｏｂｅ ＭＭ；クリニカル
ヘマトロジ−（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍ゛ａｔｏ
ｌｏｇＹ）６７１頁、リー アンド フェビガー ロン
ドン（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌ。
ｎｄｏｎ）（１９７４年）を参照コ鉄代謝異常による赤
血球内の鉄不足に起因して貧血が起こると考えられてい
る。
血球内の鉄不足に起因して貧血が起こると考えられてい
る。
しかしながら、慢性関節リウマチ患者に於ける血中ＥＰ
Ｏ値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこ
とが報告されており［例えば、Ｗａｒｄ ＨＰ等；ジ
ャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル メ
デイシン（Ｊ、Ｌａｂ。
Ｏ値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこ
とが報告されており［例えば、Ｗａｒｄ ＨＰ等；ジ
ャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル メ
デイシン（Ｊ、Ｌａｂ。
ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、）７４巻９３頁（１９８９年）、
Ｐａｖｌｏｖｉｃ−Ｋｅｎｔｅｒａ Ｖ等；スカンジ
ナビアン ジャーナル オブ ヘマトロジ−（Ｓｃａｎ
ｄ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、）２３巻１４１頁（１９７
９年）などを参照コ、この事は慢性関節リウマチ性貧血
にＥＰＯ産生障害も関与している可能性を示唆している
が、慢性関節リウマチ患者に於いてはＥＰＯの産生臓器
である腎や甲状腺等での異常が観察されていない事から
実際にＥＰＯ産生障害が生じているか否かは不明である
。従って血中ＥＰＯ値が上昇しない理由として、その他
、ＥＰＯに対する骨髄での感受性が低下していることや
、ＥＰＯのインヒビターが産生されている可能性が考え
られている。
Ｐａｖｌｏｖｉｃ−Ｋｅｎｔｅｒａ Ｖ等；スカンジ
ナビアン ジャーナル オブ ヘマトロジ−（Ｓｃａｎ
ｄ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、）２３巻１４１頁（１９７
９年）などを参照コ、この事は慢性関節リウマチ性貧血
にＥＰＯ産生障害も関与している可能性を示唆している
が、慢性関節リウマチ患者に於いてはＥＰＯの産生臓器
である腎や甲状腺等での異常が観察されていない事から
実際にＥＰＯ産生障害が生じているか否かは不明である
。従って血中ＥＰＯ値が上昇しない理由として、その他
、ＥＰＯに対する骨髄での感受性が低下していることや
、ＥＰＯのインヒビターが産生されている可能性が考え
られている。
従って慢性関節リウマチ性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与
しても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒ
ト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告され
ているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが慢性
関節リウマチ性貧血の治療薬として有効であることをヒ
ト又は動物に実際に投与する９とによって実証した者は
ない。
しても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒ
ト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告され
ているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが慢性
関節リウマチ性貧血の治療薬として有効であることをヒ
ト又は動物に実際に投与する９とによって実証した者は
ない。
本発明者等は高純度に精製したヒト尿ＥＰＯおよびヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ）ｒＥＰ。
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ）ｒＥＰ。
を用いて慢性関節リウマチ疾患の動物モデルについて貧
血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰＯが顕著
な貧血治療効果を示したことから慢性関節リウマチ性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。
血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰＯが顕著
な貧血治療効果を示したことから慢性関節リウマチ性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。
本発明は新規な慢性関節リウマチ性貧血治療剤の提供に
係るものである。
係るものである。
すなわち本発明はヒトＥＰＯを有効成分として含有する
慢性関節リウマチ性貧血治療剤である。
慢性関節リウマチ性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトＥＰＯは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿から抽出することにより得ることが
できる［：Ｔ、ＭＩＹＡＫＥ等、ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂ、 Ｃ，）、２
５２巻５５５８頁（１９７７年）；Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ
等、ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカ
ルメディ’ｉ７ （Ｊ、Ｌａｄ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、
）６６巻９８７頁（１９８５年）コ。
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿から抽出することにより得ることが
できる［：Ｔ、ＭＩＹＡＫＥ等、ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂ、 Ｃ，）、２
５２巻５５５８頁（１９７７年）；Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ
等、ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカ
ルメディ’ｉ７ （Ｊ、Ｌａｄ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、
）６６巻９８７頁（１９８５年）コ。
またヒトｒＥＰｏはヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応す
るメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取し、壱の
ｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作製し、次いで適当
な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類、植
物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所謂、遺
伝子工学的方法によって得られる。［例えば、５ＹＬＶ
ＩＡ Ｌ。
るメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取し、壱の
ｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作製し、次いで適当
な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類、植
物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所謂、遺
伝子工学的方法によって得られる。［例えば、５ＹＬＶ
ＩＡ Ｌ。
Ｈ，等；プロシーディンゲス オブ ザ ナシロナル
アカデミ−オブ サイエンシーズ オブザ ニー −
”ス ：ｒ−−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
アカデミ−オブ サイエンシーズ オブザ ニー −
”ス ：ｒ−−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ）８１巻 ２７０８頁（１９
８４年）を参照。コ 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製造
する方法［特開昭５４−５５７９０］ 、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１１ 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。
８４年）を参照。コ 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製造
する方法［特開昭５４−５５７９０］ 、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１１ 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。
これらの方法によって得られたヒトＥＰＯは慢性関節リ
ウマチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬
機能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本
発明に使用され得る。
ウマチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬
機能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本
発明に使用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合せて用いてもよい。
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノ
ール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法
、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電
気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまたは
適宜組合せて用いてもよい。
得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含何水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含何水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤は場合によりそ
の他の貧血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、
男性ホルモン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に
混合することができ、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一
鉄、フマール酸鉄、グルコン酸鉄、デキストラン鉄、グ
ルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げられる。
の他の貧血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、
男性ホルモン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に
混合することができ、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一
鉄、フマール酸鉄、グルコン酸鉄、デキストラン鉄、グ
ルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げられる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤に含まれるヒ）
ＥＰＯの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配
慮して決めることができるが通常９Ｘ１０’ｕ／ｍｇヒ
トＥＰＯとして成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ま
しくは５〜１００μｇのヒ）ＥＰＯを含有する製剤を１
週間に１〜７回投与することができる。
ＥＰＯの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配
慮して決めることができるが通常９Ｘ１０’ｕ／ｍｇヒ
トＥＰＯとして成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ま
しくは５〜１００μｇのヒ）ＥＰＯを含有する製剤を１
週間に１〜７回投与することができる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤は安定化物質を
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無
機塩、有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１
つ又は２つ以上を含有してもよい。
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無
機塩、有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１
つ又は２つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、ヒ）ＥＰＯの１重量部
にたいして０．１１〜１ｏｏｏｏ重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。
にたいして０．１１〜１ｏｏｏｏ重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。
これらの安定化物質は相当する量を適当な濃度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５゜０〜９．０に調整し、特
にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。また本発明の慢
性関節リウマチ性貧血治療剤を調整するにあたっては、
吸着防止剤を添加してもよい。
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５゜０〜９．０に調整し、特
にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。また本発明の慢
性関節リウマチ性貧血治療剤を調整するにあたっては、
吸着防止剤を添加してもよい。
参考例１ ヒト の１゛
ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法［ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー （Ｊ、Ｂ。
オロジカル ケミストリー （Ｊ、Ｂ。
Ｃ，）２５２巻５５５８頁（１９７７年）コに従って再
生不良性貧血患者床から、１）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０
による脱塩、２）ＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着
、３）エタノール沈殿、４）ＤＥＡＥアガロースカラム
クロマトグラフィーを用いて部分精製されたヒト尿ＥＰ
Ｏを得た。
生不良性貧血患者床から、１）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０
による脱塩、２）ＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着
、３）エタノール沈殿、４）ＤＥＡＥアガロースカラム
クロマトグラフィーを用いて部分精製されたヒト尿ＥＰ
Ｏを得た。
° ロマト ラフ −
得られた部分精製ヒト尿ＥＰＯを２４％プロパツール（
和光紬薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣによ
る精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立８３８−５０型を
用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出を
行った。
和光紬薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣによ
る精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立８３８−５０型を
用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出を
行った。
２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１％トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（８ｍｍ
Ｘ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させた
。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉｃｏ
ｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社製商品名）を用いた限外ろ
過により、０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。
酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（８ｍｍ
Ｘ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させた
。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉｃｏ
ｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社製商品名）を用いた限外ろ
過により、０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。
ロマト ラフ −
上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液を予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。
ＴＦＡ溶液を予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。
分子量２５０００〜ａｏｏｏｏの位置にＥＰＯ活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約９Ｘ１０４ｕンｍｇであった。
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約９Ｘ１０４ｕンｍｇであった。
各ステップに於けるヒトＥＰＯ活性を表Ｉに示す。
＊アッセイ法 ｌ５ｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ等［ジャーナル
オブ セルラー フィジオ ロジ−（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ１ｓ ｉｏｌ、）８３巻３０９頁（１９ ７４年）コの方法に従った。
オブ セルラー フィジオ ロジ−（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ１ｓ ｉｏｌ、）８３巻３０９頁（１９ ７４年）コの方法に従った。
参考例 ２ ヒ の″昭和５９
年１２月２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形
質転換のための補助ＤＮＡを含むベクター」 （特願昭
５９−２８１８６２）に開示された方法に従って、ヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプ
ラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細
胞）で形質発現させることによってヒトｒＥＰｏを得た
。
年１２月２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形
質転換のための補助ＤＮＡを含むベクター」 （特願昭
５９−２８１８６２）に開示された方法に従って、ヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプ
ラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細
胞）で形質発現させることによってヒトｒＥＰｏを得た
。
要約すると以下の如くである。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
１フラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒ）ＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少な（とも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒト
ｒＥＰｏを産生させた。
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
１フラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒ）ＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少な（とも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒト
ｒＥＰｏを産生させた。
最終的な培養上清中のヒトｒＥＰｏの活性は２０ｕ／ｍ
ｌであった。
ｌであった。
ＣＨＯ細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰｏはＫｒｙｓｔａｌ等の方法［
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン（Ｊ、 Ｌａｂ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、）９
７巻１４４頁（１９８１年）コにより６８００ ｕ／ｍ
１の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰｏはＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバン
ドであることが確認された。
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰｏはＫｒｙｓｔａｌ等の方法［
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン（Ｊ、 Ｌａｂ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、）９
７巻１４４頁（１９８１年）コにより６８００ ｕ／ｍ
１の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰｏはＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバン
ドであることが確認された。
得られたヒトｒＥＰｏに０．１％ＢＳＡを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。
塩水にて透析した後、実験に供した。
８週令の雌性ＬＥＷ／Ｃｒ ｊラット（日本チャールス
リバー社より購入）にアジュバント（青山Ｂ株５０ｍｇ
／ｍ１）０．０５ｍ１をラット尾部に皮下投与した。投
与後２７日口のアジュバント処理ラットについて関節炎
の生起を確認した後、種々の赤血球パラメーターを測定
した。（表Ｉ）く測定項目ジ 拳ヘモグロビン量：眼から採血ののち分光光度計（Ｒａ
ＢＡ ５ｕｐｅｒ発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：へマドクリット管により眼から採
血ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼から採血した血液を希釈液［ｌ５ＯＴＯ
Ｎ （コールタ−エレクトロニクス社商品名）コで希釈
しコールタ−カウンターＭｏｄｅＩＺＢＩにて測定した
。
リバー社より購入）にアジュバント（青山Ｂ株５０ｍｇ
／ｍ１）０．０５ｍ１をラット尾部に皮下投与した。投
与後２７日口のアジュバント処理ラットについて関節炎
の生起を確認した後、種々の赤血球パラメーターを測定
した。（表Ｉ）く測定項目ジ 拳ヘモグロビン量：眼から採血ののち分光光度計（Ｒａ
ＢＡ ５ｕｐｅｒ発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：へマドクリット管により眼から採
血ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼から採血した血液を希釈液［ｌ５ＯＴＯ
Ｎ （コールタ−エレクトロニクス社商品名）コで希釈
しコールタ−カウンターＭｏｄｅＩＺＢＩにて測定した
。
＊＊ｐ＜０．０１
Ａｄｊｕｖａｎｔ感作
２７日目測定 各群 ４匹
表Ｈに示す如くアジュバント処理ラットは、赤血球パラ
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して有
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して有
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
アジ パン さう・・トに・番 ヒト１のアジュバ
ント処理ラットについてアジュバント注射後１８日月か
ら７日間ヒト尿ＥＰＯ（２５ｕ／ラット／日）を腹腔内
に連日投与した群と無投与群との赤血球パラメーターを
比較した。
ント処理ラットについてアジュバント注射後１８日月か
ら７日間ヒト尿ＥＰＯ（２５ｕ／ラット／日）を腹腔内
に連日投与した群と無投与群との赤血球パラメーターを
比較した。
（表■）
表■ ヒト尿ＥＰＯの貧血治療効果
測定項目 アジュバントラフト ＥＰＯ
投与ラフト各群７匹 Ｘ京ｐ ＜０
．０１１のアジュバント処理ラットについてアジュバン
ト注射後１８日月から７日間ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰ
ｏ（１０ｕ／ラット７日）を腹腔内に連日投与した群と
無投与群との赤血球パラメーターを比較した。（表■） 表■、■に示される如くアジュバントラット群に比べて
ヒトＥＰＯ投与群ではへマドクリット値、ヘモグロビン
量、赤血球数の有本な改善効果が見られたことから貧血
治療に宵効であることがわかった。
投与ラフト各群７匹 Ｘ京ｐ ＜０
．０１１のアジュバント処理ラットについてアジュバン
ト注射後１８日月から７日間ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰ
ｏ（１０ｕ／ラット７日）を腹腔内に連日投与した群と
無投与群との赤血球パラメーターを比較した。（表■） 表■、■に示される如くアジュバントラット群に比べて
ヒトＥＰＯ投与群ではへマドクリット値、ヘモグロビン
量、赤血球数の有本な改善効果が見られたことから貧血
治療に宵効であることがわかった。
またこれ等の実験条件下に於いて毒性は認められなかっ
た。
た。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例１
上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。
し、凍結乾燥し密封した。
実施例２
実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
実施例３
１００ｍｌ中にマンニトール５ｇ１ヒト尿ＥＰ０ １ｍ
ｇ１ヒト血清アルブミン１００ｍｇ１アセチルトリプト
ファンナトリウム２．１５４ｍｇ１カプリル酸ナトリウ
ム１； ３３ｍｇを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ｌずつバイアルに分注し凍結乾燥示し密封する。
ｇ１ヒト血清アルブミン１００ｍｇ１アセチルトリプト
ファンナトリウム２．１５４ｍｇ１カプリル酸ナトリウ
ム１； ３３ｍｇを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ｌずつバイアルに分注し凍結乾燥示し密封する。
実施例４
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にヒ
ト尿ＥＰ０１ｍｇ、ポリエチレングリコロール４０００
５００ｍｇ１工チレンオキサイドプロピレンオキサイド
共重合体３０ ｍ ｇ １塩化ナトリウム８００ｍｇを
含む水溶液に無菌的に調整し、１ｍＩずつアンプルに分
注溶閉する。
ト尿ＥＰ０１ｍｇ、ポリエチレングリコロール４０００
５００ｍｇ１工チレンオキサイドプロピレンオキサイド
共重合体３０ ｍ ｇ １塩化ナトリウム８００ｍｇを
含む水溶液に無菌的に調整し、１ｍＩずつアンプルに分
注溶閉する。
実施例５
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にＣＨ
Ｏ細胞由来ヒトｒＥＰＯｏ、５ｍｇ、グリシン１ｇ１ソ
ルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、ｏ−５
ｍ１ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
０．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１
ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
Ｏ細胞由来ヒトｒＥＰＯｏ、５ｍｇ、グリシン１ｇ１ソ
ルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、ｏ−５
ｍ１ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
０．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１
ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
実施例６
１００ｍ１中にヒト尿ＥＰＯ１ｍｇ１ヒト血清アルブミ
ン５０ ｍ ｇ ％マンニトール５００ｍｇを含む水溶
液を無菌的に調整しｓ １ｍｌ！、ずつバイアルに分注
し凍結乾燥し密封する。
ン５０ ｍ ｇ ％マンニトール５００ｍｇを含む水溶
液を無菌的に調整しｓ １ｍｌ！、ずつバイアルに分注
し凍結乾燥し密封する。
別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ１ＮａｃＩ
２．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍｌずつ
アンプルに分注し、溶封する。
２．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍｌずつ
アンプルに分注し、溶封する。
上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２、〜３
分で）静注する。
分で）静注する。
Claims (6)
- （１）ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有する
慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - （２）ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第 １項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - （３）ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエチンを
コードする遺伝子を宿主細胞内で 形質発現させて得たものであることを特徴 とする特許請求の範囲第１項記載の慢性関 節リウマチ性貧血治療剤。 - （４）宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細胞
株のいずれかであることを特徴と する特許請求の範囲第３項記載の慢性関節 リウマチ性貧血治療剤。 - （５）宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞であ
ることを特徴とする特許請求の範 囲第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治 療剤。 - （６）宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする特
許請求の範囲第３項記載の慢性関 節リウマチ性貧血治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2116585 | 1985-02-06 | ||
| JP60-21165 | 1985-02-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232A true JPS6232A (ja) | 1987-01-06 |
| JPH0672103B2 JPH0672103B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=12047297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61022930A Expired - Lifetime JPH0672103B2 (ja) | 1985-02-06 | 1986-02-06 | 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4732889A (ja) |
| JP (1) | JPH0672103B2 (ja) |
| FR (1) | FR2576792B1 (ja) |
| GB (1) | GB2171304B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000015241A1 (fr) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preparation d'une solution proteinique et son procede de stabilisation |
| JP2001513510A (ja) * | 1997-08-08 | 2001-09-04 | ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | リウマチ疾患の治療のための組合せ医薬製剤の製造のためのエリトロポイエチン製剤と鉄分製剤との利用 |
| US11788165B2 (en) | 2016-10-19 | 2023-10-17 | Jfe Steel Corporation | Hot-band annealing equipment, hot-band annealing method and descaling method for Si-containing hot rolled steel sheet |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin |
| GB2177914B (en) * | 1985-06-04 | 1989-10-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A pharmaceutical composition containing human erythropoietin and a surface active agent for nasal administration for the treatment of anemia |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| JP2858752B2 (ja) * | 1987-04-10 | 1999-02-17 | オーソ・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン | 正常な哺乳動物のヘマトクリツト値の増大方法 |
| US4987121A (en) * | 1988-05-27 | 1991-01-22 | Center For Innovative Technology | Erythropoietic factor |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5912015A (en) | 1992-03-12 | 1999-06-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Modulated release from biocompatible polymers |
| US5716644A (en) * | 1992-06-11 | 1998-02-10 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US5674534A (en) * | 1992-06-11 | 1997-10-07 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US20030035845A1 (en) * | 1992-06-11 | 2003-02-20 | Zale Stephen E. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| US5548064A (en) * | 1993-05-24 | 1996-08-20 | Biotech Australia Pty Limited | Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions |
| EP0784480B1 (en) | 1994-11-03 | 2003-10-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Use of erythropoietin in the treatment of rheumatoid arthritis |
| EP0850051A2 (en) * | 1995-08-31 | 1998-07-01 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of an agent |
| DE19539574A1 (de) * | 1995-10-25 | 1997-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren |
| US5906978A (en) | 1996-08-14 | 1999-05-25 | Hemocleanse, Inc. | Method for iron delivery to a patient by transfer from dialysate |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| US6696411B1 (en) * | 1998-04-22 | 2004-02-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| JP2002512039A (ja) * | 1998-04-22 | 2002-04-23 | コーネル リサーチ ファンデーション インク． | イヌエリスロポエチン遺伝子および組換えタンパク質 |
| MXPA01011429A (es) * | 1999-05-11 | 2003-09-10 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Modelado farmacocinetico y farmacodinamico de administracion de eritropoyetina. |
| AU6875900A (en) | 1999-09-08 | 2001-04-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein solution preparation and method of stabilizing the same |
| AU2005225151B2 (en) * | 2000-05-15 | 2008-05-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | New pharmaceutical composition |
| WO2001087329A1 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate |
| EP1295604B1 (en) | 2000-06-30 | 2009-09-30 | Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology | Preventives and remedies for diseases in association with demyelination |
| DE10234192B4 (de) | 2002-07-26 | 2009-11-26 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Verwendung von Erythropoetin |
| US20040198663A1 (en) * | 2003-04-04 | 2004-10-07 | Baker John E. | Method of treating cardiac ischemia by using erythropoietin |
| US8614204B2 (en) | 2003-06-06 | 2013-12-24 | Fibrogen, Inc. | Enhanced erythropoiesis and iron metabolism |
| US7772182B2 (en) * | 2004-08-05 | 2010-08-10 | Alza Corporation | Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists |
| AT500929B1 (de) * | 2004-11-09 | 2007-03-15 | Medizinische Uni Wien Muw | Pharmazeutische zubereitung die erythropoietin enthält |
| WO2008024858A2 (en) * | 2006-08-22 | 2008-02-28 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods and compounds regulating the erythroid response to iron deficiency |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4254095A (en) * | 1978-04-27 | 1981-03-03 | Research Corporation | Radioimmunoassay for erythropoietin |
| JPS5653696A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Isolation of erythropoietin by adsorption |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS57149228A (en) * | 1981-03-11 | 1982-09-14 | Ajinomoto Co Inc | Novel erythropoietin and its preparation |
| JPH0686480B2 (ja) * | 1983-02-21 | 1994-11-02 | 雪印乳業株式会社 | エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| EP1486052B1 (en) * | 2002-03-21 | 2006-08-23 | Nokia Corporation | Mobile electronic device having a pivoted display |
-
1986
- 1986-02-03 US US06/825,222 patent/US4732889A/en not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY=1984 * |
| J. LAB.&CLIN. MED.=1969 * |
| POSTGRADUATE MEDICAL JOURNAL=1983 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001513510A (ja) * | 1997-08-08 | 2001-09-04 | ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | リウマチ疾患の治療のための組合せ医薬製剤の製造のためのエリトロポイエチン製剤と鉄分製剤との利用 |
| JP2008133290A (ja) * | 1997-08-08 | 2008-06-12 | Roche Diagnostics Gmbh | リウマチ疾患の治療のための組合せ医薬製剤の製造のためのエリトロポイエチン製剤と鉄分製剤との使用 |
| JP2012012410A (ja) * | 1997-08-08 | 2012-01-19 | Roche Diagnostics Gmbh | リウマチ疾患の治療のための組合せ医薬製剤の製造のためのエリトロポイエチン製剤と鉄分製剤との使用 |
| WO2000015241A1 (fr) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preparation d'une solution proteinique et son procede de stabilisation |
| US11788165B2 (en) | 2016-10-19 | 2023-10-17 | Jfe Steel Corporation | Hot-band annealing equipment, hot-band annealing method and descaling method for Si-containing hot rolled steel sheet |
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