DE69935345T2

DE69935345T2 - Methoden und zusammensetzungen zur prävention und behandlung der anämie

Info

Publication number: DE69935345T2
Application number: DE69935345T
Authority: DE
Inventors: Joan C. Newbury Park EGRIE; Steven G. Newbury Park ELLIOTT; Jeffrey K. Camarillo BROWN
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2019-10-19
Also published as: HUP0103920A3; ES2283139T3; JP2010248207A; DE69935345D1; AU1124100A; AU774989B2; HK1040944B; HUP0103920A2; ATE477270T1; ATE355303T1; KR20010075661A; EP1123313B2; JP5558213B2; CN1346369B; PT1813624E; EP1123313A2; SI1123313T1; CA2345882A1; HK1040944A1; DE69942680D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf eine Erhöhung des Hämatokrits in einem Säugetier durch die Verwendung hyperglykosylierter Analoga von Erythropoetin. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine weniger häufige Dosierung eines hyperglykosylierten Analogons im Vergleich zu rekombinantem humanem Erythropoetin, um den Hämatokrit zu erhöhen und aufrechtzuerhalten und eine Anämie zu behandeln. Die Verabreichung geringerer Mengen eines hyperglykosylierten Analogons im Vergleich zu rekombinantem humanem Erythropoetin bei einer vergleichbaren Dosierungsfrequenz, um den Hämatokrit zu erhöhen und aufrechtzuerhalten und eine Anämie zu behandeln, wird ebenso beschrieben. Neue hyperglykosylierte Analoga von Erythropoetin werden ebenso beschrieben.
Hintergrund der Erfindung
Erythropoetin (Epo) ist ein Glykoproteinhormon, das für die Ausreifung erythroider Vorläuferzellen in Erythrozyten notwendig ist. Es wird in den Nieren produziert und ist unverzichtbar bei der Regulation der Konzentration der roten Blutkörperchen im Kreislauf. Bedingungen, die durch eine niedrige Konzentration von Gewebssauerstoff gekennzeichnet sind, verursachen eine verstärkte Produktion von Epo, das wiederum die Eryhtropoese stimuliert. Ein Verlust der Nierenfunktion, wie er z. B. bei chronischem Nierenversagen beobachtet wird, führt typischerweise zu einer verminderten Produktion von Epo und einer gleichzeitigen Reduktion der roten Blutkörperchen.
Humanes Epo aus dem Urin wurde durch Miyake et al. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) von Patienten mit aplastischer Anämie aufgereinigt. Jedoch war die Menge des gereinigten Epo Proteins, das aus dieser Quelle gewonnen wurde, unzureichend für eine therapeutische Anwendung. Die Identifikation und das Klonieren des Gens, das für humanes Epo kodiert und die Expression des rekombinanten Proteins wurden im US-Patent Nr. 4,703,008 von Lin offenbart, dessen Offenbarung hierin als Referenz eingeschlossen ist. Ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem humanem Erythropoetin aus Zellmedium ist im US-Patent Nr. 4,667,016 von Lai et. al. offenbart, das hierin als Referenz eingeschlossen ist. Die Herstellung von biologisch aktivem Epo aus Säugetierzellen hat zum ersten Mal Mengen an Epo zur Verfügung gestellt, die für therapeutische Anwendungen geeignet waren. Außerdem haben die Kenntnis der Gensequenz und die zunehmende Verfügbarkeit von gereinigtem Protein zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise dieses Proteins geführt.
Sowohl humanes Epo, das aus dem Urin gewonnen wurde (Miyake et al., siehe oben), als auch rekombinantes humanes Epo, das in Säugetierzellen exprimiert wurde, enthält drei N-verknüpfte und eine O-verknüpfte Oligosaccharidkette(n), die zusammen etwa 40% des Gesamtmolekulargewichtes des Glykoproteins ausmachen. N-verknüpfte Glykosylierung findet an Asparaginresten an den Positionen 24, 38 und 83 statt, während O-verknüpfte Glykosylierung an einem Serinrest an der Position 126 stattfindet (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Es wurde gezeigt, dass die Oligosaccharidketten durch terminate Sialinsäurereste modifiziert wurden, wobei N-verknüpfte Ketten typischerweise bis zu vier Sialinsäuren pro Kette und O-verknüpfte Ketten bis zu zwei Sialinsäuren aufweisen. Ein Epo Polypeptid kann daher bis zu insgesamt 14 Sialinsäuren Platz bieten.
Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Veränderungen der Epo Kohlenhydratketten die biologische Aktivität beeinflussen können. Jedoch führte in einer Studie die Entfernung N-verknüpfter oder O-verknüpfter Oligosaccharidketten, einzeln oder zusammen, durch Mutagenese der Asparagin- oder Serinreste, die Glykosylierungsstellen darstellen, zu einer deutlichen Reduktion der in vitro Aktivität des veränderten Epo, das in Säugetierzellen hergestellt wird. (Dube et. al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)). Jedoch berichteten DeLorme et al. (Biochemistry 31, 9871–9876 (1992)), dass das Entfernen N-verknüpfte Glykosylierungsstellen in Epo die biologische in vivo, aber nicht die in vitro Aktivität reduziert.
Die Beziehung zwischen dem Gehalt an Sialinsäuren des Epo und der biologischen in vivo Aktivität wurde durch die Bestimmung der in vivo Aktivität von isolierten Epo Isoformen offenbart. Es wurde festgestellt, dass eine schrittweise Anhebung des Sialinsäuregehaltes pro Epo Molekül einen entsprechenden schrittweisen Anstieg der biologischen in vivo Aktivität ergab, die als Fähigkeit äquimolarer Konzentrationen der isolierten Epo Isoformen, den Hämatokrit normaler Mäuse anzuheben, gemessen wurde. (Egrie et al. Glycoconjugate J. 10, 263 (1993)). Jene Epo Isoformen, die einen höheren Gehalt an Sialinsäuren haben, zeigten ebenso eine längere Halbwertszeit im Serum, jedoch eine verminderte Affinität zum Epo Rezeptor. Dies deutet darauf hin, dass die Halbwertszeit im Serum ein wichtiger Faktor der biologischen in vivo Aktivität ist.
Die Einführung neuer Glykosylierungsstellen in das Epo Polypeptid kann zur Produktion von Molekülen mit zusätzlichen Kohlenhydratketten führen. Siehe PCT-Publikationen Nr. WO 91/05867 und WO 95/05465. Epo Glykosylierungsanaloga, die mindestens eine zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratkette und/oder mindestens eine zusätzliche O-verknüpfte Kohlenhydratkette haben, werden offenbart. Es wurde festgestellt, dass ein Glykosylierungsanalogon, das eine zusätzliche N-verknüpfte Kette hat, eine längere zirkulierende Halbwertszeit im Vergleich zu rekombinantem humanem Epo (rHuEpo) (Isoformen 9–14) und zu einer gereinigten Isoform des rHuEpo mit 14 Sialinsäuren pro Molekül hat.
Die Verabreichung von rekombinantem humanem Erythropoetin (rHuEpo) ist wirksam zur Erhöhung der Konzentration der roten Blutkörperchen in anämischen Patienten mit Nierenerkrankung im Endstadium (Eschbach et al. New Eng. J. Med. 316, 73–38 (1987)). Nachfolgende Studien konnten zeigen, dass die Behandlung mit rHuEpo Anämien korrigieren kann, die mit einer Vielzahl anderer Zustände assoziiert sind. (Fisch) et al. New Eng. J. Med. 322, 1488–1493 (1990); Laupacis, Lancet 341, 1228–1232 (1993). Behördliche Zulassungen wurden für den Gebrauch von rHuEpo bei der Behandlung von Anämien in Verbindung mit chronischem Nierenversagen, Anämien in Verbindung mit einer Therapie mit AZT (Zidovudin) in HIV-infizierten Patienten, Anämien in Patienten mit nicht-myeloiden Malignomen, die Chemotherapie erhalten und bei Anämien von Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff unterziehen, erteilt, um den Bedarf von allogenen Bluttransfusionen zu reduzieren. Die derzeitige Therapie für alle zugelassenen Indikationen (außer der chirurgischen Indikation), beinhaltet eine Startdosis zwischen 50–150 Einheiten/kg, dreimal wöchentlich (TIW), die entweder als intravenöse (i.v.) oder subkutane (s.c.)-Injektion verabreicht werden kann, um einen empfohlenen Hämatokrit-Zielwert zu erreichen. Bei der chirurgischen Indikation wird rHuEpo täglich ab 10 Tage vor dem chirurgischen Eingriff, am Tag des Eingriffs und vier Tage danach verabreicht (EPOGEN^® Packungsbeilage, 12/23/96). Im Allgemeinen können die derzeitigen empfohlenen Startdosen von rHuEpo den Hämatokrit zwischen sechs bis acht Wochen in den Zielbereich erhöhen. Sobald der Hämatokrit-Zielwert erreicht wurde, wird eine Erhaltungsdosis ermittelt, die abhängig von dem Patienten variiert, jedoch typischerweise dreimal wöchentlich bei anämischen Patienten mit chronischem Nierenversagen beträgt.
Die Verabreichung von rHuEpo, die oben beschrieben wurde, ist ein effektives und gut toleriertes Verfahren der Behandlung der Anämie.
Es wäre wünschenswert, ein Therapeutikum mit größerer Potenz als rHuEpo zu haben. Ein Vorteil eines solchen Moleküls wäre, dass es weniger häufig und/oder in einer geringeren Dosis verabreicht werden kann. Derzeitige Behandlungen von Patienten, die unter Anämie leiden, erfordern die Verabreichung von EPOGEN^® dreimal wöchentlich und bei chirurgischen Patienten eine tägliche Verabreichung. Ein Schema mit weniger häufigen Dosierungen wäre sowohl für den Art als auch für den Patienten angenehmer, vor allem für solche Patienten, die nicht regelmäßig den Arzt oder eine Klinik aufsuchen oder solche, die ihr Epo selbst injizieren. Ein weiterer Vorteil eines potenteren Moleküls ist, dass dem Patienten weniger Arzneimittel für einen vergleichbaren Anstieg des Hämatokrits verabreicht wird.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, wirksamere Moleküle für die Behandlung von Anämien zu identifizieren, die ein Schema mit einer weniger häufigen Dosierung erlauben. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Moleküle zur Verfügung zu stellen, die den Hämatokrit erhöhen und in Bereichen aufrechterhalten, die vergleichbar mit denen von Epo sind, wenn es in geringerer Dosis verabreicht wird. Es ist außerdem ein Ziel der Erfindung, dass diese Moleküle, die für einen weniger häufige Dosierung ausgewählt wurden, mindestens ebenso verträglich sind wie rHuEpo und von manchen Patienten potenziell besser toleriert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass ein hyperglykosyliertes Epo Analogon, genannt N47 (Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ Epo), eine längere Serumhalbwertszeit und eine höhere in vivo Aktivität hat als rekombinantes humanes Erythropoetin (rHuEpo), wenn es in der gleichen Dosis und Frequenz wie rHuEpo verabreicht wird. Außerdem wurde gezeigt, dass das Analogon, wenn es einmal pro Woche verabreicht wird, den Hämatokrit in Mäusen vergleichbar erhöht wie die dreimalige Verabreichung von rHuEpo. Die Pharmakokinetiken des Epo Analogons N47 waren ähnlich, wenn sie Mäusen und Menschen verabreicht wurden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung und Aufrechterhaltung des Hämatokrits in einem Säugetier zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines hyperglykosylierten Epo Analogons in einer phannazeutischen Zusam mensetzung umfasst, wobei das Analogon weniger häufig verabreicht wird als eine äquivalente molare Menge rHuEpo, um einen vergleichbaren Zielwert für Hämatokrit zu erreichen. Die Dosierungsfrequenz der vorliegenden Erfindung, um einen optimalen Hämatokritbereich eines Patienten zu erreichen, beträgt weniger als dreimal pro Woche. Dosierungsfrequenzen können zweimal pro Woche, einmal pro Woche oder weniger als einmal pro Woche, wie z. B. einmal alle zwei Wochen, einmal monatlich oder einmal alle zwei Monate sein. Die erforderliche Dosierungsfrequenz, um den Hämatokrit-Zielwert eines Patienten aufrechtzuerhalten, ist weniger als dreimal pro Woche. Dosierungsfrequenzen können zweimal pro Woche, einmal pro Woche oder weniger als einmal pro Woche, wie z. B. einmal alle zwei Wochen, einmal monatlich oder einmal alle zwei Monate sein.
Außerdem werden pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die hyperglykosylierte Epo Analoga umfassen, wobei die Zusammensetzungen für eine Dosierungsfrequenz von weniger als dreimal pro Woche geeignet sind. Die Zusammensetzungen werden pharmazeutisch annehmbare Adjuvanzien beinhalten, die für den Gebrauch mit hyperglykosylierten Epo Analoga geeignet sind.
Die Erfindung kann bei jedem Zustand angewendet werden, der zu einer Verminderung der roten Blutkörperchen führt, wie z. B. Anämien in Verbindung mit einer Verschlechterung oder einem Verlust der Nierenfunktion (chronisches Nierenversagen), myelosuppressive Therapie, Krebs, virale Infektion, chronische Erkrankung und massivem Verlust von Blut während chirurgischer Eingriffe. In einer Ausführungsform erfolgt die Behandlung einer Anämie als Folge eines chronischen Nierenversagens mit einer Gabe einmal pro Woche oder weniger häufig.
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen Erythropoetins.
2 zeigt eine Westemblot-Analyse von rHuEpo und hyperglykosylierten Epo Analoga einer CHO-Zell-Expression in serumfreiem Medium. Die Herstellung der Analoga N53 und N61 ist in Beispiel 1 beschrieben. Die Anzahl der N-verknüpften Kohlenhydratketten an jedem Analogon ist gekennzeichnet.
3 vergleicht die Aktivität von rHuEpo, der Epo Analoga N4, N18 und N50 (diese enthalten vier N-verknüpfte Kohlenhydratketten), N47 (dieses enthält fünf N-ver knüpfte Kohlenhydratketten) und N53 (dieses enthält sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten) in dem posthypoxischen polyzytämischen Maus-Bioassay. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 3 beschrieben. Jeder Punkt stellt die durchschnittliche Antwort von fünf Tieren dar. Die Analoga N4, N18 und N47 wurden vorher in WO 95/05464 beschrieben.
4 vergleicht die Serumhalbwertszeit von rHuEpo und dem Epo Analogon N47, wenn sie normalen Ratten durch eine intravenöse Injektion (i.v.) verabreicht werden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt (±SD) für jede Gruppe.
5 vergleicht die Serumhalbwertszeit von rHuEpo und dem Epo Analogon N47, die Beagle-Hunden durch eine intravenöse Injektion (i.v.) verabreicht wurden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt (±SD) für jede Gruppe.
6 zeigt den Anstieg des Hämatokrits bei Mäusen als Antwort auf verschiedene Dosierungen von rHuEpo oder dem Epo Analogon N47, die durch intraperitoneale Injektion (i.p.) dreimal pro Woche (TIW) über sechs Wochen verabreicht wurden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel s beschrieben. Die gezeigten Ergebnisse sind der Gruppendurchschnitt (±SD) der Änderung des Hämatokrits für jede Dosisgruppe.
7 vergleicht die relative Potenz bei Mäusen von rHuEpo und dem Epo Analogon N47, die in einer Frequenz von einmal wöchentlich (QW) oder dreimal pro Woche (TIW) entweder über intraperitoneale (i.p.) oder intravenöse (i.v.) Wege injiziert wurden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 5 beschrieben. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt (±SD) der Daten von verschiedenen Experimenten wie folgt dar: N47, i.p., TIW (n = 5); N47, i.v., TIW (n = 1); N47, i.p., QW (n = 2); N47, i.v., QW (n = 3); rHuEpo, i.p., TIW (n = 5); rHuEpo, i.v., QW (n = 2). Jedes Experiment verwendete 7–13 Mäuse pro Dosis.
8 zeigt den Anstieg des Hämatokrits bei Mäusen als Antwort auf verschiedene Dosen von rHuEpo oder dem Epo Analogon N47, die durch intravenöse (i.v.) Injektion einmal pro Woche (QW) über etwa sechs Wochen verabreicht wurden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 5 beschrieben. Die gezeigten Ergeb nisse sind der Gruppendurchschnitt (±SD) der Änderung des Hämatokrits für jede Dosisgruppe.
9 zeigt den Anstieg des Hämatokrits bei Mäusen in Antwort auf verschiedene Dosen des Epo Analogons N47, die durch intravenöse (i.v.) Injektion einmal pro Woche (QW) oder einmal jede zweite Woche (EOW) über etwa sechs Wochen verabreicht wurden. Die experimentellen Methoden sind in Beispiel 5 beschrieben. Die gezeigten Ergebnisse sind der Gruppendurchschnitt (±SD) der Änderung des Hämatokrits für jede Dosisgruppe.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung und Aufrechterhaltung des Hämatokrits zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines hyperglykosylierten Analogons von Erythropoetin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst. Das Analogon wird weniger häufig verabreicht als eine äquivalente molare Menge rHuEpo, um einen vergleichbaren Hämatokrit-Zielwert zu erreichen. Die Zusammensetzung kann auf intravenösem, subkutanem oder intraperitonealem Weg verabreicht werden.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass das Analogon N47, ein hyperglykosyliertes Epo Analogon, das in WO 95/05465 beschrieben wird, wenn es einmal pro Woche verabreicht wurde, einen Anstieg des Hämatokrits erreichen konnte, der vergleichbar war zu dem, der beobachtet wurde, wenn rHuEpo dreimal pro Woche gegeben wurde. Das Analogon N47 hat die folgenden Aminosäureaustausche: Ala zu Asn bei 30; His zu Thr bei 32; Pro zu Val bei 87; Trp zu Asn bei 88; und Pro zu Thr bei 90, was das Anfügen von zwei N-verknüpften Kohlenhydratketten an den Asparaginresten 30 und 88 zur Folge hat. Das Analogon wurde in chinesischen Hamsterovarialzellen (CHO) exprimiert (wie in Beispiel 1 beschrieben) und gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben, um Isoformen von 17 bis 22 Sialinsäuren zu ergeben. Bei der intravenösen Injektion in Ratten und Beagle-Hunden zeigte das Analogon N47 eine längere Serumhalbwertszeit als rHuEpo (4 und 5). Wenn N47 dreimal pro Woche intraperitoneal injiziert wurde, induzierte es bei niedrigeien Konzentrationen zu rHuEpo vergleichbare Anstiege des Hämatokrits von normalen Mäusen (6). Es wurde gezeigt, dass die Potenz von N47 etwa 3- bis 4fach höher ist als rHuEpo, wenn es dreimal pro Woche verabreicht wird (6 und 7). Wenn es in ähnlichen Dosen einmal pro Woche gegeben wird, zeigte rHuEpo eine geringe Stimulation des Hämatokrits in normalen Mäusen, während N47 einen deutlichen Anstieg ergab (8). Die Potenz von N47 war etwa 14 fach höher als rHuEpo bei einer Verabreichung einmal pro Woche (7). Bedeutenderweise ist die Hämatokritantwort auf das einmal pro Woche gegebene Analogon N47 vergleichbar zu der Antwort auf rHuEpo, wenn dieses dreimal pro Woche gegeben wird. Sogar wenn es jede zweite Woche gegeben wurde, erzeugte N47 noch einen deutlichen Anstieg des Hämatokrits von normalen Mäusen (9). Zusammengenommen zeigten die Daten, dass hyperglykosylierte Epo Analoga und insbesondere das Analogon N47 vorteilhaft genutzt werden können, um durch eine weniger häufige Dosierung als bei der gängigen Behandlung mit rHuEpo den Hämatokrit anzuheben.
Es wurde außerdem gezeigt, dass die oben beschriebenen Ergebnisse, die in Mäusen gewonnen wurden, auf Menschen übertragen werden können. Die pharmakokinetischen Parameter für die Verabreichung von rHuEpo und dem Analogon N47 an 11 Patienten mit kontinuierlicher ambulanter Peritonealdialyse (CAPD) zeigen, dass das Analogon N47 eine dreifach längere Halbwertszeit hat als rHuEpo (Beispiel 6 und Tabelle 5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei Menschen hyperglykosylierte Epo Analoga eine weniger häufige Dosierung erlauben als rHuEpo.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "hyperglykosyliertes Epo Analogon" auf Epo, das mindestens eine zusätzliche Glykosylierungsstelle mit einer zusätzlichen Kohlenhydratkette, die an die Stelle angefügt wurde, umfasst. Glykosylierungsstellen können entweder für N-verknüpfte oder O-verknüpfte Kohlenhydratketten sein. Neue N-verknüpfte Glykosylierungsstellen werden durch Veränderungen der DNA-Sequenz angefügt, so dass die Konsensusstelle für N-verknüpfte Kohlenhydrat-Additionen (die Aminosäuren Asn-X-Ser/Thr) in der Polypeptidkette kodiert wird, während neue O-verknüpfte Stellen durch Veränderungen der DNA-Sequenz angefügt werden, so dass ein Serin- oder ein Threoninrest kodiert wird. Die Analoga werden durch Mutagenesemethoden hergestellt, um Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten hinzuzufügen, die die Stellen im Epo Polypeptid, die für die Glykosylierung verfügbar sind, vermehren oder verändern. DNA, die ein hyperglykosyliertes Epo Analogon kodiert, wird in eukaryotische Wirtszellen transfiziert, und das exprimierte Glykoprotein wird auf das Vorhandensein von zusätzlichen Kohlenhydratketten untersucht.
Hyperglykosylierte Epo Analoga haben eine in vitro Aktivität gezeigt, die vergleichbar oder sogar geringer war als die für rHuEpo ermittelte, was darauf hindeutet, dass die Bindung an den Epo Rezeptor durch das Anfügen von Kohlenhydratketten nicht gesteigert wird und in manchen Fällen vermindert werden kann. Jedoch kann Hyperglykosylierung typischerweise die Serumhalbwertszeit verlängern und möglicherweise zu einem Anstieg der biologischen in vivo Aktivität führen. Ein Epo Analogon mit einer zusätzlichen N-verknüpften Kohlenhydratkette an der Position 88 zeigte eine verminderte Affinität zu dem Rezeptor im Vergleich zu rHuEpo (Isoformen 9–14) oder zu einer gereinigten Isoform von rHuEpo mit 14 Sialinsäuren pro Molekül und zeigte dennoch eine längere zirkulierende Halbwertszeit und erhöhte in vivo Aktivität im Vergleich entweder zu einer Mischung der Epo Isoformen 9–14 oder zur isolierten Epo Isoform 14.
Die hyperglykosylierten Epo Analoga, die entsprechend der vorliegenden Erfindung verabreicht werden können, werden mindestens eine zusätzliche N-verknüpfte oder O-verknüpfte Kohlenhydratkette haben. In einer Ausführungsform werden die Analoga zwei zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten haben. In weiteren Ausführungsformen werden die Analoga drei, vier oder mehr zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten haben. Beispielsweise werden die Analoga gemäß der Erfindung mindestens eine zusätzliche N-verknüpfte Kette an einem oder mehreren Aminosäureresten der Positionen 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 und 138 der humanen Sequenz von Epo haben. In einer Ausführungsform hat das Analogon zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten an den Resten 30 und 88 des humanen Epo. Die Nummerierung der Aminosäurereste des humanen Epo ist wie in 1 und SEQ ID NR. 1 gezeigt. 1 zeigt ein vohergesagtes reifes Epo Polypeptid mit 166 Aminosäuren, während rekombinant hergestelltes Epo 165 Aminosäuren hat, nachdem der C-terminale Argininrest entfernt wurde. Es versteht sich, dass rHuEpo und hyperglykosylierte Epo Analoga entweder 165 oder 166 Aminosäuren haben können.
Die Analoga gemäß der Erfindung werden mindestens vier N-verknüpfte Kohlenhydratketten haben. Von den vier Ketten können sich drei an den natürlich vorkommenden Stellen an Positionen 24, 38 und 83 befinden. Jedoch wird erwogen, dass manche Analoga gemäß der Erfindung Veränderungen an einer oder mehr der natürlich vorkommenden Glykosylienangsstellen haben können, so dass eine oder mehr der Stellen deletiert und durch eine neue Stelle substituiert wird/werden. Solche Analoga werden durch die Erfindung ebenfalls zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel kann eine der Stellen an den Positionen 24, 38 und 83 deletiert und durch eine Stelle an Position 88 ersetzt werden. Optional können die Analoga eine O-verknüpfte Stelle an Position 126 haben.
Die Erfindung stellt außerdem neue hyperglykosylierte Epo Analoga zur Verfügung, die mindestens eine zusätzliche Kohlenhydratkette haben. Es wurde festgestellt, dass eine zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratkette an einer der Positionen 52, 53, 55, 86 und 114, die modifiziert wurden, um eine Glykosylierungsstelle zu sein, hinzugefügt wurde. Spezielle Ausführungsformen umfassen die Analoga N49 bis N61, wie in Tabelle 1 beschrieben. Die neuen Analoga werden mindestens eine neue N-verknüpfte Glykosylierungsstelle an einer der Positionen 52, 53, 55, 86 und 114 haben und können ferner zusätzliche N-verknüpfte oder O-verknüpfte Kohlenhydratketten an anderen Stellen umfassen. Die Analoga können eine, zwei, drei oder vier zusätzliche Kohlenhydratketten haben oder mehr als vier zusätzliche Ketten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Analoga drei zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten haben (sechs N-verknüpfte Ketten insgesamt). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Analoga vier zusätzliche N-verknüpfte Ketten haben (sieben N-verknüpfte Ketten insgesamt). Die Analoga, die drei oder vier oder mehr als vier zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten haben, können eine zusätzliche Kette an einer der Positionen 52, 53, 55, 86 und 114 haben, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es wurde übenaschenderweise festgestellt, dass ein hyperglykosyliertes Analogon mit drei zusätzlichen N-verknüpften Ketten an den Positionen 30, 53 und 88 (sechs N-verknüpfte Ketten insgesamt) eine größere in vivo Aktivität aufweist als das Analogon N47 mit zwei zusätzlichen Ketten (fünf insgesamt). Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Es ist deutlich, dass die in vivo Aktivität der Analoga direkt von der Anzahl der N-verknüpften Kohlenhydratketten abhängig ist. Diese Ergebnisse können auf den therapeutischen Rahmen extrapoliert werden, wobei die Analoga mit mehreren N-verknüpften Kohlenhydratketten als N47 noch weniger häufig verabreicht werden können.
Die Analoga können durch eine Vielzahl von Mutagenesemethoden hergestellt werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, einschließlich der ortsgerichteten Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese (Zoller et al. Meth. Enz. 100, 468–500 (1983); Higuchi, in PCR Protocols, S. 177–183 (Academic Press, 1990); Wells et al. Gene 34,315–323 (1985)). Beispiel 1 beschreibt die Verwendung der PCR-Mutagenesemethoden, um neue hyperglykosylierte Epo Analoga herzustellen.
Eine Epo DNA-Sequenz, die einer Mutagenese unterzogen wurde, wird unter Verwendung von Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, wobei der Vektor geeignet ist, um in Wirtszellen von Säugetieren aufrechterhalten zu werden. Der Vektor wird typischerweise die folgenden Elemente enthalten: Promotor und andere "upstream"-Regulationselemente, Replikationsursprung, ribosomale Bindungsstelle, Transkriptionsterminierungsstelle, Polylinkerstelle und auswählbare Marker, die für den Gebrauch in Wirtszellen von Säugetieren kompatibel sind. Vektoren können außerdem Elemente enthalten, die die Propagation und Aufrechterhaltung in prokaryotischen Wirtszellen zulassen.
Geeignete Zellen oder Zelllinien beinhalten alle mit Ursprung aus Säugetieren, einschließlich solche menschlichen Ursprungs. Beispiele beinhalten COS-7 (ATCC-Zugangsnr. CRL 1651), Human 293, Säuglingshamsterniere (BHK, ATCC-Zugangsnr. CCL 10), chinesische Hamsterovarialzellen (einschließlich Dihydrofolatreduktase (DHFR)-defiziente Zellen, Urlab et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980)). Andere geeignete Zelllinien von Säugetieren beinhalten, HeLa, murine L-929 und 3T3, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden DHFR-defiziente CHO-Zellen verwendet.
Vektoren, die die Sequenzen umfassen, die hyperglykosylierte Epo Analoga kodieren, werden durch Standardtransformations- und Transfektionsmethoden in Wirtszellen eingefügt. Die Kultivierung, Amplifizierung und das Screening der transformierten oder transfizierten Wirtszellen wird durch die Verwendung öffentlich zugänglicher Verfahren erreicht (Gething et al. Nature 293, 620–625 (1981); Kaufman et al. Mol Cell. Biol. 5, 1750–1759 (1985); US-Patent Nr. 4,419,446). Wirtszellen, die die DNA-Sequenzen, die die hyperglykosylierten Epo Analoga kodieren, beinhalten, werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der Analoga erlauben. Die Analoga werden aus dem Zellmedium gewonnen und unter Verwendung von Methoden gereinigt, die im Wesentlichen vorher beschrieben wurden (WO 94/09257) und jenen in Beispiel 2. Die Reinigungsmethoden erlauben die Isolation von Epo Isoformen mit höherem Sialinsäuregehalt, der aus dem Hinzufügen zusätzlicher Kohlenhydratketten resultiert.
Die hyperglykosylierten Epo Analoga können zusätzlich zu neuen Glykosylierungsstellen Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, die keine neuen Glykosylierungsstellen schaffen und die biologische Aktivität der hyperglykosylierten Analoga nicht wesentlich verändern. Solche individuellen Stellen oder Regionen von Epo, die verändert werden können, ohne die biologische Aktivität zu beeinflussen, können durch die Untersuchung der Struktur des Epo-Epo Rezeptorkomplexes ermittelt werden, wie in Syed et. al. Nature 395, 511 (1998) beschrieben. Die Untersuchung der Struktur des Epo-Epo Rezeptorkomplexes offenbart solche Reste, die mit der Rezeptorbindungsstelle von Epo interagieren oder sich in unmittelbarer Nähe befinden und die vermieden werden sollten, wenn Veränderungen in der Epo Aminosäuresequenz vorgenommen werden. Alternativ kann man solche Regionen, die Aminosäuresubstitutionen tolerieren würden, durch Alanin-Scanning-Mutagenese ermitteln (Cunningham et al. Science 244, 1081–1085 (1989). Bei diesem Verfahren werden ausgewählte Aminosäurereste individuell durch eine neutrale Aminosäure (z. B. Alanin) ersetzt, um die Effekte auf die biologische Aktivität zu ermitteln.
Es ist allgemein anerkannt, dass konservative Aminosäureaustausche die geringste Wahrscheinlichkeit haben, die Struktur und/oder Funktion eines Polypeptids zu beeinflussen. Entsprechend umfasst die Erfindung eine oder mehrere konservative Aminosäureaustausche innerhalb eines hyperglykosylierten Epo Analogons. Konservative Aminosäureaustausche umfassen im Allgemeinen die Substitution einer Aminosäure durch eine andere, die in Struktur und/oder Funktion ähnlich ist (z. B. Aminosäuren, deren Seitenketten ähnlich in Größe, Ladung und Form sind). Die Art dieser Austausche ist dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und in Tabelle 1 unten zusammengefasst. Solche konservativen Substitutionen werden unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Ebenso betrachtet werden substanziellere Austausche ("Beispielsubstitutionen"), die ebenfalls eingefügt werden können. Einem Fachmann wird bewusst sein, dass die Stellen anfänglich durch Substitution in einer relativ konservativen Weise verändert werden sollten. Wenn solche Austausche eine Beibehaltung der biologischen Aktivität ergeben, können substanziellere Austausche (Beispielsubstitutionen) eingefügt werden und/oder andere Additionen/Deletionen können durchgeführt und die entstehenden Produkte gescreent werden. Tabelle 1: Aminosäuresubstitutionen
Ebenso werden Deletionen oder Additionen von Aminosäuren in einem hyperglykosylierten Epo Analogon beschrieben, die die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen. Solche Additionen und Deletionen können sich am N-Terminus oder C-Terminus des Polypeptids oder innerhalb davon befinden. Im Allgemeinen sie es weniger wahrscheinlich, relativ kleine Deletionen oder Additionen die Struktur und/oder Funktion von Epo oder einem hyperglykosylierten Analogon beeinflussen. In einer Ausführungsform können die Deletionen oder Additonen im Bereich von 5–10 Resten sein, alternativ im Bereich von 2–5 Aminosäureresten oder im Bereich von 1–2 Resten.
Die Bezeichnung "molare Menge" bezieht sich auf eine Menge eines hyperglykosylierten Analogons oder rHuEpo, die auf dem Molekulargewicht des entsprechenden Erythropoetinpolypeptids ohne Glykosylierung basiert. Äquivalente Mengen von rHuEpo und dem Analogon beziehen sich auf Mengen, die gleich sind, wenn normale Variationen im Verfahren, das zur Bestimmung der Menge verwendet wird, berücksichtigt werden. Es ist notwendig, äquivalente Mengen auf diese Weise zu bestimmen, da das Molekulargewicht von rHuEpo und den Analoga in Abhängigkeit von der Anzahl der Kohlenhydratketten variieren wird. Für rHuEpo wird das Molekulargewicht des Erythropoetinpolypeptids auf Grundlage der Aminosäurereste 1–165, wie in 1 und SEQ ID NR. 1 gezeigt, berechnet. Für hyperglykosylierte Analoga wird das Molekulargewicht in Abhängigkeit der Aminosäureänderungen innerhalb der Reste 1–165 der 1 und SEQ ID NR. 1 angepasst.
Die Dosierungshäufigkeit eines hyperglykosylierten Analogons wird abhängig von dem zu behandelnden Zustand und dem Zielwert für Hämatokrit variieren, wird im Allgemeinen aber weniger als dreimal pro Woche sein. Die Dosierungshäufigkeit wird etwa zweimal pro Woche, etwa einmal pro Woche sein. Die Dosierungshäufigkeit kann auch weniger als etwa einmal pro Woche sein, z. B. etwa einmal alle zwei Wochen (etwa einmal alle 14 Tage), einmal pro Monat oder einmal alle zwei Monate. Es wird verstanden, dass die tatsächlich verwendete Dosierungshäufigkeit aufgrund von Variationen bei der Antwort auf die Epo Analoga von unterschiedlichen Individuen etwas von den hierin angegeben Häufigkeiten abweichen kann; mit der Bezeichnung "etwa" wird beabsichtigt, solche Variationen auszudrücken.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" auf eine Menge eines hyperglykosylierten Analogons, die einen Anstieg des Hämatokrits auf einen Hämatokrit-Zielwert zeigt oder auf einen Zielbereich des Hämatokrits, der dem Patienten einen Nutzen bringt oder, alternativ, einen Patienten auf einem Hämatokrit-Zielwert oder innerhalb eines Zielbereiches des Hämatokrits hält. Die Menge wird von einem Individuum zu einem anderen variieren und von etlichen Faktoren abhängen, einschließlich des Allgemeinzustandes des Patienten, dem Ausmaß und der zugrunde liegenden Ursache der Anämie und dem endgültigen Hämatokrit-Zielwert für den individuellen Patienten. Ein Zielwert von Hämatokrit ist typischerweise mindestens etwa 30% oder liegt in einem Bereich von 30%–38%, bevorzugt oberhalb 38% und bevorzugter 40%–45%. Allgemeine Richtlinien bezüglich des Zielbereiches des Hämatokrits für rHuEpo finden sich außerdem in der EPOGEN^®-Packungsbeilage vom 23.12.1996 und betragen 30%–36% oder alternativ 32%–38%, wie dort angegeben. Es wird verstanden, dass solche Zielwerte von einem Individuum zu einem anderen variieren werden, so dass ärztliches Ermessen angemessen sein kann, um den eigentlichen Hämatokrit-Zielwert für jeden Patienten zu bestimmen. Nichtsdestotrotz liegt die Bestimmung des Hämatokrit-Zielwertes im Bereich der Möglichkeiten eines Fachmanns.
Eine therapeutisch wirksame Menge der vorliegenden Zusammensetzung kann leicht durch einen Fachmann ermittelt werden. Beispiel 6 legt ein klinisches Protokoll dar, dessen Ziel es ist, die therapeutisch wirksame Menge des Analogons N47 sowohl in einer Dosierung einmal pro Woche als auch dreimal pro Woche zu ermitteln. Ein Dosisbereich für eine Verabreichung einmal pro Woche liegt in einem Bereich von etwa 0,075 bis etwa 4,5 μg Erythropoetinpeptid pro kg pro Dosis. Ein Dosisbereich für eine Verabreichung dreimal pro Woche liegt in einem Bereich von 0,025 bis 1,5 μg Erythropoetinpeptid pro kg pro Dosis. Dieser Dosisbereich kann mit einigen Anpassungen an den Dosisbereich für andere hyperglykosylierte Epo Analoga angewendet werden, was für einen Fachmann eine Routine darstellt.
Ein bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit, das Ausmaß der Hyperglykosylierung entweder mit einer Dosismenge oder mit einem Dosierungsintervall zu korrelieren, die es erlaubt, ein Epo Analogon für eine bestimmte Dosis oder ein bestimmtes Verabreichungsprotokoll "maßzuschneidem". Auf Grundlage der ansteigenden in vivo Aktivitäten der Epo Analoga mit ein, zwei oder drei zusätzlichen Kohlenhydratketten, wie in 3 gezeigt, kann der behandelnde Arzt ein Analogon auswählen, das geeignet und angenehm für den zu behandelnden anämischen Zustand ist. Zum Beispiel kann bei Patienten, die akut anämisch sind und eine hohe wirksame Dosis benötigen oder bei Patienten, die eine länger währende Behandlung benötigen, die Verabreichung von hyperglykosylierten Analoga mit drei oder vier oder sogar mehr zusätzlichen Kohlenhydratketten bevorzugt sein. Bei anderen Patienten, die eine weniger ausgeprägte Anämie aufweisen oder eine Behandlung für eine relativ kurze Zeit benötigen, kann ein Analogon mit ein oder zwei zusätzlichen Kohlenhydratketten bevorzugt sein. Die Analoga der vorliegenden Erfindung stellen dem Arzt eine beträchtliche Flexibilität zur Verfügung, Anämien vorzubeugen und zu behandeln, die aus einer großen Anzahl von zugrunde liegenden Zuständen resultieren können.
Die Erfindung sieht außerdem die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Eisen vor, um die gesteigerte Erythropoese während der Therapie aufrechtzuerhalten. Die Menge, die verabreicht werden soll, kann auf Grundlage der Therapie mit rHuEpo von einem Fachmann leicht ermittelt werden.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Produktion roter Blutkörperchen zu stimulieren und eine Anämie zu vermeiden und zu behandeln. Die Zustände, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Anämien ein, die mit einer Verschlechterung oder einem Verlust der Nierenfunktion (chronisches Nierenversagen) assoziiert sind; Anämien, die mit myelosuppressiver Therapie, wie z. B. Chemotherapie oder antivirale Medikamente (z. B. AZT) assoziiert sind; Anämien, die mit der Progredienz von nicht-myeloiden Krebsarten assoziiert sind; Anämien, die mit viralen Infektionen (z. B. HIV) assoziiert sind und Anämien aufgrund chronischer Erkrankungen. Ebenso sind Zustände behandelbar, die zu Anämien in ansonsten gesunden Individuen führen, wie z. B. ein vorhersehbarer Verlust von Blut während chirurgischer Eingriffe. Im Allgemeinen kann jeder Zustand, der mit rHuEpo behandelt werden kann, auch mit den hyperglykosylierten Epo Analoga gemäß der Erfindung behandelt werden.
Außerdem werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die eine therapeutisch wirksame Menge eines hyperglykosylierten Epo Analogons mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger, Lösungsmittel, Emulgator, Konservierungsmittel und/oder Adjuvans umfassen. Die Zusammensetzung wird für ein Dosierungsschema von weniger als dreimal pro Woche geeignet sein. Die Zusammensetzung kann in einer flüssigen oder lyophilisierten Form sein und umfasst ein Verdünnungsmittel (Tris-, Citrat-, Acetat- oder Phosphatpuffer) mit verschiedenen pH-Werten und ionischen Ladungen, Lösungsmittel, wie z. B. Tween oder Polysorbat, Träger wie z. B. humanes Serumalbumin oder Gelatine, Konservierungsmittel wie z. B. Thimerosal, Paraben, Benzylalkoniumchlorid oder Benzylalkohol, Antioxidantien wie z. B. Ascorbinsäure oder Natriummetabisulfit und andere Komponenten wie z. B. Lysin oder Glycin. Die Auswahl einer bestimmten Zusammensetzung wird von etlichen Faktoren abhängig sein, einschließlich dem zu behandelnden Zustand, dem Verabreichungsweg und den gewünschten pharmakokinetischen Parametern. Ein ausführlicherer Überblick über geeignete Komponenten für pharmazeutische Zusammensetzungen findet sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg. Mack, Easton, PA (1980). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die glykosylierten Epo Analoga gemäß der Erfindung in flüssiger Form in einer isotonischen Natriumchlorid/Natriumcitrat gepufferten Lösung mit Humanalbumin formuliert und enthalten wahlweise Benzylalkohol als Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen beinhalten vorzugsweise Analoga mit einer, zwei, drei, vier oder mehr zusätzlichen Kohlenhydratketten.
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung werden vorzugsweise durch Injektion, entweder subkutan oder intravenös, verabreicht. Der Verabreichungsweg wird schließlich abhängig von etlichen Faktoren ausgewählt und kann von einem Fachmann ermittelt werden.
Die folgenden Beispiele werden beschrieben, um die Erfindung vollständiger darzustellen, sollten jedoch nicht als deren Umfang limitierend betrachtet werden.
Beispiel 1
Herstellung hyperglykosylierter Epo Analoga
Herstellung von cDNAs, die für hyperglykosylierte Epo Analoge kodieren
Epo Analoge wurden durch in vitro Mutagenese unter Verwendung mehrerer verschiedener Verfahren hergestellt. Die Analoge N49 und N50 wurden wie in WO 95/05465 beschrieben hergestellt. Analoga wurden ebenfalls durch Variationen der Overlap-PCR (Polymerasekettenreaktion)-Verfahren hergestellt. Der grundsätzliche Verfahrensablauf beinhaltete zwei aufeinander folgende Schritte. Im ersten Schritt wurden zwei Reaktionen (PCR1 und PCR2) mit der Epo oder Epo Analogon Template-DNA unter Verwendung von insgesamt vier Oligonukleotiden durchgeführt: einem 5' (Formard)-Primer, einem mutagenisierendem Reverse-Primer, einem mutagenisierendem Forward-Primer (üblicherweise komplementär zu dem mutagenisierendem Reverse-Primer) und einem 3' (Reverse)-Primer. Die mutagenisierenden Primer enthielten sowohl die gewünschten Nukleotidänderungen als auch 6–14 exakt übereinstimmende Nukleotide auf jeder Seite dieser Veränderungen. PCR1 verwendete den 5' (Forward)-Primer und den mutagenisierenden Reverse-Primer. PCR2 verwendete den 3' (Reverse)-Primer und den mutagenisierenden Forward-Primer. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Kleine Stücke der Agarose, die die DNA-Fragmente mit der korrekten Größe beinhalteten, wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA-Fragmente der PCR1 und PCR2 wurden vereinigt, und eine dritte PCR-Reaktion unter ausschließlicher Verwendung der 5'-Forward- und 3'-Reverse-Primer wurde durchge führt. Auf diese Art wurde ein Gesamtlängen-DNA(full length)-Segment, das die gewünschten Mutationen beinhaltete, amplifiziert. In mehreren Fällen wurden zwei oder drei Mutationen durch das Einfügen einer neuen Substitution in die DNA, die bereits eine Veränderung enthielt, unter Verwendung derselben PCR-Methode kombiniert. Um diese Analoga mit multiplen Glykosylierungsstellen herzustellen, wurden Einfach-, Doppel- oder Dreifachstellenanaloga (hergestellt, wie oben beschrieben) als PCR-Template genutzt, und eine zusätzliche Glykosylierungsstelle wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese mit den entsprechenden Primern eingefügt.
Die Epo Analoga N51, N52 und N53 wurden durch das Overlap-PCR (Polymerasekettenreaktion)-Verfahren 1 hergestellt. Eine zusätzliche N-Glykosylierungsstelle wurde in jedem Falle eingefügt. N56 fügte der nativen Sequenz HuEpo eine Glykosylierungsstelle (N114, T116) durch Verwendung von pDSRa2 Epo als PCR-Template hinzu, N51 fügte dem N47 Epo eine O-verknüpfte Glykosylierungsstelle (Thr125) durch Verwendung von pDSRa2 Epo N47-Template (Asn30, Thr32, Val87, Asn88, Thr90) hinzu, und Analogon N59 fügte dem Analogon N47 eine Glykosylierungsstelle (Asn53) unter Verwendung des pDSRa2 EpoN47-Templates hinzu.
Die Polymerasekettenreaktionen für Verfahren 1 wurden unter Verwendung eines Protokolls durchgeführt, das von Cheng et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)) adaptiert wurde. Der 3' (Reverse)-Primer enthielt Sequenzen, die ein Stoppkodon einfügten, gefolgt von einer Xba I Schnittstelle:
ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEQ ID NR.: 2).
Der 5'-Forward-Reaktionsprimer:
GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEQ ID NR.: 3)
wies eine Hind III Schnittstelle auf, gefolgt von einer Kozak-Sequenz stromaufwärts des Epo Startkodons (ATG). Die typische PCR-Reaktionsmischung enthielt: jeweils 4 μl des Forward- und Reverse-Primers (5 pmol/μl), 1 μl Template (25 ng), 10 μl eines 5fach LP-Puffers (100 mM Tricin pH 8,7/25% Glycerol/425 mM KOAc), 10 μl dNTP-Stammlösung (1 mM jeweils von dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,8 μl rtTh-Polymerase (Perkin Elmer; 2,5 U/μl) und 2 μl Vent-Polymerase (NEB; 0,01 U/μl nach 1:100-Verdünnung in 1 × LP-Puffer). H₂O wurde hinzugefügt, um das endgültige Volumen auf 50 μl zu bringen. Alle Komponenten wurden in der gezeigten Reihenfolge zusammengegeben, und die PCR wurde durch Hinzufügen von 1 μl eines 50 mM MgOAc gestartet, wenn die Temperatur während des ersten Zyklus über 60°C lag. Typische Reaktionsbedingungen waren: 2 Zyklen von 94°C, 10 s/50°C, 1 min/68°C, 5 min, gefolgt von 25 Zyklen von 94°C, 10 s/55°C, 1 min/68°C, 5 min. Die amplifizierten Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das DNA-Fragment mit der korrekten Größe unter Verwendung eines Geneclean^TM-Kit und nach Methoden, die von dem Hersteller (Bio 101, Inc.) geliefert wurden, gereinigt. Die gereinigte DNA wurde mit Hind III und Xba I verdaut, danach wurde es erneut unter Verwendung des Geneclean-Kits gereinigt. Das Fragment wurde danach in einen mit Hind III und Xba I geschnittenen pDSRα2 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde mit 2 Volumen Ethanol in 0,3M NaOAc pH 5,2 in Gegenwart einer Träger-tRNA präzipitiert und in E. coli transformiert. Epo Analoga wurden mit Hilfe eines Restriktionsverdaus der Mini-DNA-Präparationen untersucht. Plasmide der positiven Klone wurden daraufhin präpariert, und die Insertion wurde sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Mutationen zu bestätigen und sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Aminosäureänderungen eingefügt wurden.
Die Analoga N54 bis N61 wurden unter Verwendung des Overlap-PCR-Strategieverfahrens 2 hergestellt. Der 3' (Reverse)-Primer enthielt Sequenzen, die ein Stoppkodon einfügten, gefolgt von einer XbaI Schnittstelle:
GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEQ ID NR.: 4).
Der 5'-Forward-Reaktionsprimer:
CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG (SEQ ID NR.: 5)
hatte eine HindIII Schnittstelle, gefolgt von einer Kozak-Sequenz stromaufwärts des Epo Startkodons (ATG). Eine hochpräzise PCR-Strategie wurde unter Verwendung der Perkin Eimer UITma-DNA-Polymerase und der beigefügten Reagenzien durchgeführt; 10 μl 10 × PCR-Puffer, 3 μl 1 mM dNTPs, 5 pmol von jedem Primer und Wasser in einem endgültigen Volumen von 100 μl. 0,5 Einheiten der UITma-Polymerase wurde hinzugefügt, nachdem das PCR-Gemisch eine Temperatur von 94°C erreichte. PCR-Reaktionen wurden danach für 5 Zyklen mit 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden durchgeführt. Anschließend wurden 25 Zyklen mit 94°C für 30 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden durchgeführt. Produktbanden mit der korrekten Größen wurden nach einer Elektrophorese aus einem Agarosegel ausgeschnitten.
Die resultierenden PCR-Produkte für jedes Analogon wurden unter Verwendung des Qiagen Gelextraktions-Kits gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in einem 100 μl-Restriktionsverdau mit HindIII und XbaI Restriktionsenzymen (Boehringer Mannheim) bei 37°C für 1 Stunde verdaut. Die Verdaue wurde erneut auf einem Gel gereinigt und die verdauten Fragmente anschließend in einen mit HindIII und XbaI verdauten pDSRa2-Vektor ligiert.
Die ligierte DNA wurde mit 2 Volumen Ethanol in 0,3M NaOAc pH 5,2 in Gegenwart einer Träger-tRNA präzipitiert und in E. coli transformiert. Epo Analoga wurden zunächst durch Kolonie-PCR getestet, um Klone zu identifizieren, die die DNA-Insertionen der korrekten Größe und Art enthalten. Mit dieser Methode wurden Zellen, die Plasmide enthalten, in PCR-Reaktionsgefäße in Gegenwart eines Epo Forward- und Rerverse-Primers gegeben. Mit dem Gemisch wurde dann eine PCR unter Verwendung der oben beschriebenen Reaktionsbedingungen durchgeführt. Plasmide aus positiven Klonen wurden danach präpariert, und die Epo Analogon-Insertion wurde sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Mutationen zu bestätigen und sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Aminosäureänderungen eingefügt wurden.
Tabelle 1 Erythropoetin-Analoga mit Stellen für N-verknüpfte Kohlenhydratketten
Analyse der Kohlenhydrataddition
Die Konstrukte für die hyperglykosylierten Epo Analoga, die in den Expressionsvektor pDSRα2 insertiert wurden, wurden in COS-Zellen transfiziert. Die Überstände der transfizierten COS-Zellen wurden mittels Westernblot analysiert, um zu bestimmen, ob das exprimierte und sezernierte Epo Analogon zusätzliche Kohlenhydrate enthielt. Die Proben wurden direkt in die Vertiefungen eines SDS-PAGE-Gels gegeben und danach durch Immunblot unter der Verwendung des monoklonalen Antikörpers 9G8A (Elliott et al. (1996) Blood 87: p2714) analysiert. Die Wanderungsgeschwindigkeiten der Proben der Analoga wurden verglichen mit den Wanderungsgeschwindigkeiten der Proben, die rHuEpo enthielten. 1 zeigt eine verringerte Wanderungsgeschwindigkeit der Analoga N53 und N61, im Vergleich zu den Analoga N4 (vier Kohlenhydratketten) und N47 (fünf Kohlenhydratketten). Die Wanderungsgeschwindigkeit ist in Übereinstimmung mit dem Vorhandensein von sechs Kohlenhydratketten bei dem Analogon N53 und sieben Kohlenhydratketten bei dem Analogon N61. Die Daten für alle hyperglykosylierten Analoga sind in Tabelle 2 gezeigt.
In vitro Bioassays
Durch COS- oder CHO-Zellen, die rHuEpo oder Analoga exprimieren, konditioniertes Medium wurde auf Stimulation der 3H-Thymidinaufnahme durch UT7-Epo Zellen untersucht (Komatsu et al., Blood 82,456). UT7-Epo Zellen sprechen auf Epo an und exprimieren humane Epo Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche. UT7-Epo Zellen wurden in Wachstumsmedium (1 × Iscove's Modified Dulbecco's Medium mit L-Glutamin, 25 mM HEPES-Puffer und 3024 mg/l Natriumbicarbonat, aber ohne α-Thioglycerol und β-Mercaptoethanol (GIBCO)/10% v/v fötales Rinderserum/1% v/v L-Glutamin-Penicillin-Streptomycinlösung (Irvine Scientific)/1 Unit/ml rHuEpo) bis zum Erreichen von etwa 3 × 10⁵ Zellen/ml kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (etwa 500 × G) gesammelt, zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und in Assay-Medium (1 × RPMI-Medium 1640 ohne L-Glutamin (Gibco)/1% L-Glutin/4% fötales Rinderserum) auf 5 × 10⁴-Zellen/ml resuspendiert. 100 μl der Proben oder des Epo Standards (rHuEpo) in Assaymedium mindestens 5fach verdünnt, wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte zugefügt. 50 μl der suspendierten Zellen wurden dann hinzugefügt (5000 Zellen/Vertiefung), und die Platten wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach 72 Stunden wurden 50 μl Methyl-³H-Thymidin (1 mCi/ml; 20 Ci/mmol), das 1:100 in einem Assaymedium verdünnt war, hinzugefügt. Die Zellen wurden für weitere 4 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Markierte Zellen wurden auf Glasfaserfiterrnatten gewonnen, mit deionisiertem Wasser, gefolgt von 2-Propanol, gewaschen, getrocknet und gezählt. Die Aktivität wurde durch Vergleichen der Antwort, die für jedes Analogon ermittelt wurde, mit der Antwort des rHuEpo Standards bestimmt. Die spezifische biologische Aktivität wurde dann durch Division der in vitro Aktivität durch die Konzentration jedes Analogons, wie sie durch ein Immunassay bestimmt wurde (Elliott et al. (1996) Blood 87: p2714), bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

* enthält 1–2 O-verknüpfte Ketten
** die in vitro Aktivität ist relativ zur rHuEpo Aktivität dargestellt
+++ die Aktivität ist äquivalent zu rHuEpo
++ die Aktivität beträgt 25–75% von rHuEpo
NT Nicht getestet

Beispiel 2
Präparation des rekombinanten humanen Erythropoetins und der hyperglykosylierten Eryhtropoetin-Analoga
Das rekombinante humane Erythropoetin (rHuEpo), das in den hierin beschriebenen Experimenten verwendet wurde, wurde in chinesischen Hamsterovarialzellen (CHO) exprimiert, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert waren, das das humane Erythropoetingen enthält. Das rekombinante Produkt wurde aus dem konditionierten Medium gewonnen und wie im Wesentlichen durch Lai et al. beschrieben gereinigt (siehe oben). Die resultierende rHuEpo Präparation besitzt überwiegend Isoformen mit 9 bis 14 Sialinsäuren, wie durch isoelektrische Fokussierung bestimmt wurde.
Rekombinante hyperglykosylierte Erythropoetin Analoga wurden in CHO-Zellen exprimiert, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert wurden, das das Epo Analogongen trägt, wie in WO 91/05867 und WO 94/09257 beschrieben, welche hiermit durch Referenz eingeschlossen werden. Die hyperglykosylierten Analoga wurden wie unten beschrieben aus den Überständen der Kulturen gereinigt.
Konzentration und Diafiltration des konditionierten Mediums
Konditioniertes Medium (serumfrei) von drei aufeinander folgenden Ernten (jeweils 5–8 Tage) der transfizierten CHO-Zelllinie wurde gesammelt, durch einen 0,45 μm-Filter gefiltert, etwa dreißigfach konzentriert und unter der Verwendung eines Tangentialfluss-Ultrafiltrationssystems (Millipore) mit einer Membran mit einem Cutoff von einem Molekulargewicht von 10.000 in 10 mM Tris, 20 μM CuSO₄, pH 7,0 diafiltriert. Das diafiltrierte Medium (DFM) wurde ein zweites Mal filtriert (0,45 μm) und bis zur Verwendung zur Aufreinigung bei –20°C gelagert.
Aufreinigung
Alle Methoden wurden bei 2 bis 8°C durchgeführt.
Anionaustauschchromatografie (1O)
Das klare DFM wurde auf eine Q-Sepharose Schnellflusssäule (Fast Flow column) (Pharmacia, 6 cm × 18 cm) gegeben, in 10 mM Bistrispropan (BTP), pH 7,0 äquilibriert und mit zwei Säulenvolumen von 10 mM BTP gewaschen, um sämtliche nicht-bindenden Spezies zu eluieren. Die folgenden Gradienten wurden abhängig davon durchgeführt, ob das hyperglykosylierte Analogon vier, fünf oder sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten besaß. Alle in diesem Stadium verwendeten Puffer enthalten 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Urea, 5 μg/ml Leupeptin und 1 μg/ml Pepstatin. Für Analoga mit vier N-verknüpften Kohlenhydratketten betrug der Gradient 10 mM Essigsäure, 0,1 mM NaCl zu 500 mM Essigsäure, 5 mM NaCl über 49 Säulenvolumina mit zwei Säulenvolumen, die auf Hochsalzbedingungen gehalten wurden. Für Analoga mit fünf N-verknüpften Kohlenhydratketten war der Gradient 0,7 M Essigsäure, 7 mM NaCl zu 1,0 M Essigsäure, 12 mM NaCl über 30 Säulenvolumen mit zwei Säulenvolumen, die auf Hochsalzbedingungen gehalten wurden. Für Analoga mit sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten war der Gradient 1,0 M Essigsäure, 10 mM NaCl bis 1,5 M Essigsäure, 20 mM NaCl über 50 Säulenvolumen mit zwei Säulenvolumen, die auf hohe Salzkonzentrationen gehalten wurden. Nach dem Gradienten wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina von 10 mM BTP, pH 7,0 gewaschen und die hohen Isoformfraktionen wurden mit 0,6 M NaCl, 100 mM BTP, pH 7,0 eluiert.
Reverse Phase-Chromatografie (C4)
Das Hochsalzeluat der Q-Sepharosesäule (1Q) wurde auf eine Vydac C4-Reverse Phase-Säule gegeben (30 μ-Partikel, 4 cm × 18 cm), in 20% Ethanol, 10 mM BTP, pH 7,0 äquilibriert und mit einem dreißig Säulenvolumina-Gradienten auf 94% Ethanol, gepuffert in 10 mM BTP, pH 7,0 von der Säule eluiert. Der vereinigte Produkt-Peak, eluiert in etwa 60% Ethanol, wurde mit vier Volumen von 10 mM BTP, pH 7,0 verdünnt, um die Möglichkeit der Aggregation in Gegenwart von Ethanol zu minimieren.
Anionaustauschchromatografie (2O)
Das verdünnte Eluat der Reverse Phase-Säule wurde auf eine zweite Q-Sepharose Schnellflusssäule (Pharmacia, 3 cm × 9 cm), die mit 10 mM BTP, pH 7,0 äquilibriert war, gegeben. Die Säule wurde mit Äquilibrationspuffer gewaschen, und das hyperglykosylierte Epo Analogon wurde mit 0,6 M Natriumchlorid, 20 mM Natriumcitrat, pH 6,0 eluiert.
Das gereinigte Protein wurde in 20 mM NaPO₄, pH 6,0, 140 mM NaCl mittels Centricon (Cutoff von einem Molekulargewicht von 10.000) ausgetauscht, gefolgt von der Gabe durch einen 0,2 μm-Filter und Lagerung bei 2–8°C.
Beispiel 3
In vivo Bioaktivität von rHuEpo und rHuEpo Analoga, die vier, fünf und sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthalten
Die in vivo Aktivität von Epo Analoga, die vier, fünf und sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthalten, wurde mit der von rHuEpo in dem posthypoxischen polyzythämischen Maus-Bioassay verglichen. Dieser Assay quantifiziert die Aufnahme von ⁵⁹Fe in neu synthetisierte rote Blutkörperchen als eine Maßeinheit für den Anstiegs der Eryhtropoese in Mäusen als Antwort auf eine exogen verabreichte Testprobe. Der Assay, der wie unten beschrieben durchgeführt wurde, ist eine Modifikation des Verfahrens von Cotes und Bangham (Nature 191, 1065 (1961)).
In diesem Assay werden weibliche BDF₁-Mäuse zuerst durch Exposition gegenüber niedrigen Sauerstoffbedingungen in einer hypobaren Kammer (0,4–0,5 atm.) für etwa 18 Stunden pro Tag über 14 Tage präkonditioniert. Um die niedrigen Sauerstoffbedingungen zu kompensieren, reagieren die Mäuse mit einer Stimulation der Erythropoese, um die Anzahl der roten Blutkörperchen zu erhöhen und dadurch die relative Sauerstoff-Bindungskapazität zu erhöhen. Nach Abschluss der letzten hypobaren Exposition wird den Mäusen gestattet, für etwa 72 Stunden bei Umgebungsdruck zu verbleiben, bevor die Test-Proben durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden. Bei Umgebungsdruck sind die Mäuse relativ polyzythämisch und antworten mit einer abfallenden endogenen Erythropoetinproduktion und Rate der Erythropoese. Fünf Tage nach Verabreichung der Test-Probe werden 0,2–0,3 μCi von ⁵⁹FeCl₃ in 0,2 ml intravenös in die Schwanzvene injiziert. Achtundvierzig Stunden später werden die Tiere getötet, und der Anstieg der Erythropoese, der durch die Test-Probe bewirkt ist, wird durch die Messung der Menge von aufgenommenem ⁵⁹Fe in einer Probe von 0,5 ml Vollblut bestimmt.
Ein Beispiel der erhaltenen Ergebnisse, wenn rHuEpo und fünf verschiedene Epo Analoga mit vier, fünf oder sechs N-verknüpften Kohlenhydratketten in diesem Assay getestet wurden, ist in 3 gezeigt. Jede Probe wurde in sechs oder sieben verschiedenen Verdünnungen innerhalb eines geeigneten Konzentrationsbereiches getestet. Alle Proben wurden in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, die 0,5% bovines Serumalbumin enthält, und 0,4 ml von jeder Verdünnung wurden an fünf präkonditionierte Mäuse verabreicht. Achtundvierzig Stunden nach der Verabreichung von ⁵⁹Fe wurde die Menge, die in 0,5 ml Blut aufgenommen wurde, durch Gammazählung gemessen. Die Ergebnisse für jede der Proben sind als Prozente des aufgenommenen ⁵⁹Fe gegen den Logarithmus der verabreichten Dosis aufgetragen.
Wie in 3 gezeigt, waren alle fünf der in diesem Assay getesteten hyperglykosylierten Epo Analoga potenter als rHuEpo. Außerdem war die Potenz von jedem Analogon direkt von der Anzahl der N-verknüpften Kohlenhydratketten abhängig, wobei solche Analoga, die eine erhöhte Anzahl von Kohlenhydratketten haben, eine höhere Aktivität aufweisen. Folglich war Analogon N53, das sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten besitzt, das potenteste Analogon. Analogon N47, das fünf N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthält, war entsprechend potenter als solche Analoga, die vier N-verknüpfte Ketten enthalten. Die Potenzen der drei Analoga, die vier N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthalten (N4, N18 und N50), war etwa vergleichbar hoch und höher als die von rHuEpo.
In diesem Experiment betrug die Dosis von rHuEpo und den Analoga, die vier, fünf oder sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthalten, um eine Aufnahme von 40% ⁵⁹Fe zu erreichen, 10.700 ng, 640 ng, 140 ng bzw. 38 ng. Auf Grundlage der Menge von Material, die benötigt war, um diesen Spiegel der Erythropoese zu erreichen, sind die Epo Analoga, die vier, fünf oder sechs N-verknüpfte Kohlenhydratketten enthalten, 17fach, 77fach und 280fach potenter als rHuEpo.
Beispiel 4
i.v. Pharmakokinetiken von rHuEpo und Epo Analogon N47 in Ratten und Beagle-Hunden
Zwei getrennte Studien in Ratten und Hunden wurden durchgeführt, um die phannakokinetischen Parameter des Epo Analogons N47 und rHuEpo zu vergleichen.
In den Ratten-Studien wurde 1 μCi (∼0,1 μg Peptid/kg) entweder des ¹²⁵I-Epo N47-Analogons oder des ¹²⁵I-rekombinanten humanen Erythropoetins (Amersham) intravenös in eine chirurgisch implantierte Karotidkanüle in normale männliche Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 314–363 g wogen, injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung wurden 0,3 ml Blut entnommen, und das Serum wurde durch Zentrifugation präpariert. Die Konzentration von ¹²⁵I-rHuEpo oder des ¹²⁵I-Epo N47-Analogons in 0,1 ml von jeder Serumprobe wurde dann nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C mit 90% Ethanol bestimmt. Das Ethanol-präzipitierte Protein in jeder Serumprobe wurde durch Zentrifugation gesammelt und die Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen. Die sich ergebenden pharmakokinetischen Kurven, die die Serumkonzentration gegen die Zeit zeigen, sind in 4 gezeigt. Jeder Punkt repräsentiert einen Gruppendurchschnitt von fünf Ratten in der N47-Analogongruppe und sechs Ratten in der rHuEpo Gruppe. Die pharmakokinetischen Parameter wurden unter Verwendung einer PCNONLIN 4.0 nichtlinearen Regressionsanalyse (Statistical Consultants, 1992) für jede Ratte bestimmt und die Ergebnisse für jede Gruppe gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Vergleich der i.v.-pharmakokinetischen Parameter von N47 und rHuEpo in Ratten

a Die Ergebnisse sind als Gruppendurchschnitt ± Standardabweichung für fünf Ratten in der N47-Gruppe und sechs Ratten in der r-HuEpo Gruppe dargestellt.

In den Hunde-Studien erhielten normale Beagle-Hunde, die zwischen 7,8–9,5 kg wogen, eine intravenöse Bolusinjektion von ∼29 ∼Ci von entweder ¹²⁵I-rHuEpo oder ¹²⁵I-N47 (–0,1 µg Peptid/kg) in die Vena cephalica. Zu verschiedenen Zeitpunkten während der 24 Stunden nach der Verabreichung wurden etwa 1 bis 2 ml Blut entnommen und das Serum präpariert. Die Konzentration von ¹²⁵I-rHuEPo und ¹²⁵I-N47 in 0,1 ml Serum wurde bestimmt und die pharmakokinetischen Parameter wie oben beschrieben berechnet. Die pharmakokinetischen Kurven der Hunde-Studien, die die Serumkonzentration gegen die Zeit zeigen, sind in 5 gezeigt. Die Zeitpunkte sind die Gruppendurchschnitte von zwei Tieren in jeder Gruppe. Die pharmakokinetischen Parameter sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4 Vergleich der i.v.-pharmakokinetischen Parameter von N47 und rHuEpo in Hunden

a Die dargestellten Ergebnisse sind die Durchschnittsparameter für die zwei Hunde in jeder Gruppe.

Sowohl in den Ratten- als auch in den Hunde-Studien zeigten rHuEpo und das Epo N47-Analogon eine biphasische Serum-Clearance. Die Clearance von rHuEpo in Ratten war etwa 3,7fach schneller als die des Epo Analogons N47, und die β-Halbwertszeit des Epo Analogons N47 war etwa 2,8fach länger als die von rHuEpo. Die pharmakokinetischen Parameter in den Hunde-Studien waren im Allgemeinen in Übereinstimmung mit denen, die bei Ratten beobachtet wurden. In Hunden war die Clearance von rHuEpo 3,5fach schneller als die des Epo Analogons N47, und die β-Halbwertszeit des Epo Analogons N47 war 3,5fach länger im Vergleich mit der von rHuEpo.
Beispiel 5
Dosisantwort des Hämatokrits nach Verabreichung von rHuEpo und dem Epo Analogon N47.
Hämatokrit-Dosisantwortstudien bei drei Verabreichungen pro Woche (TIW)
Die biologischen in vivo Effekte von rHuEpo und des Epo Analogons N47 in normalen Mäusen wurden nach Verabreichung eines Dosisbereiches durch entweder intraperitoneale oder intravenöse Injektion dreimal pro Woche für bis zu sechs Wochen verglichen. Hämatokrit-Bestimmungen wurden zweimal wöchentlich durch retroorbitale Blutentnahme bestimmt.
Normalen CD1-Mäusen, die etwa 30 g wogen (10–13 Mäuse pro Gruppe), wurde dreimal pro Woche für insgesamt sechs Wochen entweder rHuEpo (über den Dosisbereich von 0,625–10 µg Peptid/kg/Dosis), das Epo Analogon N47 (über einen Dosisbereich von 0,156–1,25 µg Peptid/kg/Dosis) oder eine Vehikelkontrolle intraperitoneal injiziert. Die Vehikelkontrolle und das Verdünnungsmittel für die verschiedenen rHuEpo- und Epo Analogon N47-Dosierungspräparationen war phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), die 0,025% Mausserumalbumin enthielt. Die Hämatokritwerte aller Mäuse wurden als Ausgangswert und danach zweimal wöchentlich durch retroorbitale Blutentnahme bestimmt. Am Ende des Experiments wurden die Seren aller Tiere gesammelt und durch ein Lösungsradioimmunopräzipitations-Assay auf Antikörper gegen das injizierte Produkt getestet. Die Hämatokritdaten der Tiere, die negativ für neutralisierende Antikörper gewertet wurden, wurden für die nachfolgende Analyse genutzt.
Wie in 6 gezeigt, erzeugen sowohl rHuEpo als auch das Epo Analogon N47 einen dosisabhängigen Anstieg des Hämatokrits in der Sechs-Wochen-Studie, obwohl das Analogon N47 bei einer bestimmten Konzentration zu einem stärkeren Anstieg des Hämatokrits führt im Vergleich zu rHuEpo. In diesem Experiment ist das Epo Analogon N47 etwa 3- bis 4fach potenter, wenn es dreimal pro Woche durch intraperitoneale Injektion verabreicht wird.
Dosisantwortstudien von rHuEpo und dem Analogon N47 wurden unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie denen bei der intraperitonealen Injektion mit intravenöser Injektion dreimal pro Woche durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen der intraperitonealen Verabreichung und bestätigen insbesondere die Untersuchungen, dass das Epo Analogon N47 eine größere Potenz als rHuEpo hat, wenn es dreimal pro Woche verabreicht wird.
Um die biologische Aktivität von rHuEpo und dem Epo Analogon N47 beim Erhöhen des Hämatokrits von normalen Mäusen besser zu vergleichen und zu quantifizieren, wurden die Ergebnisse der Experimente auch durch Plots der relativen Potenz analysiert. Für jedes Experiment wurde die Aktivität von rHuEpo oder dem Analogon N47 bei jeder Dosierung durch Zusammenzählen des Anstiegs des Hämatokrits über die ersten 38 Tage der Studie durch trapezoide Summation bestimmt, um die Fläche unter der Kurve (area under the curve, AUC) zu erhalten. Diese wurde dann gegen die logarithmische Dosis in µg/Peptid/kg/Woche aufgetragen. Die Unterschiede der Potenz zwischen Verbindungen, die über die gleiche oder andere Wege der Verabreichung oder Dosierungsfrequenzen gegeben wurden, können durch Ausmessen der Distanz zwischen den relevanten logarithmischen Dosisantwortlinien bestimmt werden. 7 fasst die relativen Potenzdaten für alle durchgeführten Experimente zusammen, um die Aktivität von rHuEpo und dem Epo Analogon N47, die über zwei unterschiedliche Wege (intrapertoneal und intravenös) zu zwei unterschiedlichen Dosierungsschemata verabreicht wurden, zu vergleichen.
Wie in 7 gezeigt, hat das Epo Analogon N47 jeweils die gleiche Potenz, wenn es dreimal wöchentlich entweder intravenös oder intraperitoneal injiziert wurde und war 3,6fach potenter als rHuEpo, wenn es dreimal wöchentlich intraperitoneal injiziert wurde.
Hämatokrit-Dosisantwortstudien bei einer Verabreichung einmal pro Woche (QW) Vergleiche von rHuEpo und dem Epo Analogon N47 beim Erhöhen des Hämatokrits in normalen Mäusen wurden bei einmal wöchentlicher Dosierung entweder über intraperitonealen oder intravenösen Weg der Verabreichung über sechs Wochen durchgeführt.
Normalen CD1-Mäusen, die etwa 30 g wogen (8–10 Mäuse pro Gruppe), wurden einmal wöchentlich für insgesamt sechs Wochen unterschiedliche Konzentrationen entweder rHuEpo oder das Epo Analogon N47, die in PBS zubereitet wurden, das 0,025% Mausserumalbumin enthielt, oder eine Vehikelkontrolle (PBS mit 0,025% Mausserumalbumin) intravenös injiziert. Die Analogondosis variierte von 6,25–25 µg Peptid/kg/Dosis und die Dosis von rHuEpo variierte von 25–200 µg/kg/Dosis. Die Hämatokritwerte aller Mäuse wurden als Ausgangswert und anschließend zweimal wöchentlich durch retroorbitale Blutentnahme bestimmt. Am Ende des Experiments wurden die Seren aller Tiere gesammelt und durch ein Lösungsradioimmunopräzipitations-Assay auf Antikörper gegen das injizierte Produkt getestet. Die Daten der Tiere, die negativ für neutralisierende Antikörper gewertet wurden, wurden für die nachfolgende Analyse genutzt.
Wie in 8 gezeigt, können sowohl rHuEpo als auch das Analogon N47 den Hämatokrit von normalen Mäusen erhöhen, wenn sie einmal wöchentlich verabreicht werden. Die Dosis von rHuEpo, die erforderlich ist, um eine Antwort zu erzeugen, war signifikant höher als die des Analogons N47. Zum Beispiel erhöhten in diesem Experiment 25 µg Peptid/kg/Woche von N47 den Hämatokrit der Mäuse um 41,2 Punkte in sechs Wochen, während die gleiche Dosis von rHuEpo nur einen Anstieg des Hämatokrits von 12,5 Punkten erzeugte.
Dosisantwortstudien von rHuEpo und dem Analogon N47 wurden mit intraperitonealer Injektion einmal wöchentlich unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie denen, die oben beschrieben wurden, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse waren in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der intravenösen Verabreichung und bestätigten zusätzlich die größere Potenz des Analogons N47 im Vergleich zu rHuEpo, wenn es einmal pro Woche verabreicht wird.
Um die Unterschiede der Aktivität zwischen rHuEpo und dem Analogon N47 zu vergleichen, wenn sie jeweils einmal wöchentlich verabreicht werden, wurden Plots der relativen Potenz von allen relevanten Experimenten erzeugt, wie oben beschrieben. Wie in
7 gezeigt, hat das Analogon N47 die gleiche Potenz, wenn es einmal wöchentlich intravenös oder intraperitoneal injiziert wird. Das Analogon N47 ist etwa 14 mal potenter als rHuEpo, wenn beide jeweils einmal wöchentlich verabreicht werden.
Zusätzlich zeigen die logarithmischen Dosisantwortpunkte in 6 folgendes: (1) eine bestimmte Dosis des Analogons N47, die einmal wöchentlich verabreicht wird (QW) ist etwa genauso wirksam wie die gleiche wöchentliche Gesamtdosis von rHuEpo, die in drei getrennten Dosen gegeben wird (TIW); (2) eine bestimmte Dosis von rHuEpo, die einmal wöchentlich (QW) verabreicht wird, ist nur etwa 2% so wirksam wie die wöchentliche Gesamtdosis des Analogons N47, die in drei getrennten Dosen gegeben wird (TIW); (3) das Analogon N47 ist etwa 4fach potenter in Mäusen, wenn es TIW verabreicht wird im Vergleich zu QW.
Hämatokrit-Dosisantwortstudien bei Verabreichung einmal alle zwei Wochen (EOW)
Experimente wurden auch durchgeführt, um die Fähigkeit des Analogons N47 beim Erhöhen des Hämatokrits von Mäusen zu untersuchen, wenn es einmal alle zwei Wochen injiziert wird. Normalen CD-1-Mäusen (10 Mäuse pro Gruppe) wurden entweder einmal wöchentlich oder einmal alle zwei Wochen für insgesamt etwa sechs Wochen verschiedene Konzentrationen des Epo Analogons N47, das in PBS, das 0,025% Mausserumalbumin enthält, intravenös injiziert. Das Analogon N47 wurde entweder als 200, 100 oder 25 µg/kg/Dosis jeder zweite Woche oder als 12,5 µg/kg/Dosis einmal wöchentlich verabreicht. Die Hämatokritwerte von allen Mäusen wurden als Ausgangswert und danach zweimal wöchentlich durch retroorbitale Blutentnahme bestimmt.
Wie in 9 gezeigt, kann das Analogon N47 den Hämatokrit von normalen Mäusen in einer dosisabhängigen Weise sogar erhöhen, wenn es zweimal im Monat verabreicht wird. Wie erwartet, wird eine größere Menge des Analogons N47 benötigt, um den Hämatokrit zu erhöhen, wenn es weniger häufig verabreicht wird. Eine Dosis von 200 µg/kg des Analogons N47, die jede zweite Woche verabreicht wird, hob den Hämatokrit in etwa der gleichen Weise in sechs Wochen an, wie dies 12,5 µg/kg taten, wenn sie wöchentlich verabreicht wurden.
Beispiel 6
i.v. Pharmakokinetiken des Epo Analogons N47 und rHuEpo in Patienten mit kontinuierlicher ambulanter Peritonealdialyse (CAPD)
Angesichts des deutlichen Anstiegs der Serumhalbwertszeit des Epo Analogons N47 im Vergleich zu rHuEpo bei Ratten und Beagle-Hunden, war es von Interesse, zu bestimmen, ob ein Anstieg auch in Menschen beobachtet werden kann.
Eine doppelblinde, randomisierte Studie im Cross-over-Design von elf stabilen CAPD-Patienten (7 männliche, 4 weibliche, 27–75 Jahre) wurde durchgeführt. Eine Patientengruppe erhielt 100 U/kg rHuEpo (äquivalent zu 0,5 µg Peptid/kg), während eine zweite Patientengruppe 0,5 µg Peptid/kg des Epo Analogons N47 erhielt. Beide wurden als einfache Bolusinjektion intravenös verabreicht. Venöse Blutproben (3 ml) wurden über eine Verweilkanüle gewonnen und vor der Verabreichung sowie 5, 10, 15, 30 Minuten und 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 und 96 Stunden nach dem intravenösen Bolus entnommen. Nach einer Auswaschperiode von 28 Tagen erhielt die erste Patientengruppe eine einfache intravenöse Dosis des Epo Analogons N47, während die zweite Gruppe eine einfache intravenöse Dosis rHuEpo erhielt. Blutproben wurden wie in dem ersten Zyklus der Behandlung entnommen. Die Konzentrationen von rHuEpo und dem Epo Analogon N47 wurden im Serum durch ELISA nach Subtraktion der endogenen Epo Grundkonzentration bestimmt. Die pharmakokinetischen Parameter (Durchschnitt ±SE), die nach Anpassung der Cross-Over-Design Effekte errechnet wurden, sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Serumkonzentration AUC wurde unter Verwendung der linearen Trapezoidsummation berechnet. t1/2_z ist definiert als: log (2)/K_z, wobei K_z als Steigung des terminalen Anteils der In (Serumkonzentration)-Zeitkurve berechnet wird. Die Clearance (Cl) ist definiert als: Dosis/AUC. Das Verteilungsvolumen (V_d) ist definiert als: CI/K. Tabelle 5
Die durchschnittliche Serumhalbwertszeit des Epo N47-Analogons (25,3 Std.) war dreimal länger als die für rHuEpo (8,5 Std.), und die Clearance von rHuEpo war 2,5fach schneller als die des Analogons N47.
Beispiel 7
Eine Phase 11 Dosisfindungs- und Dosisschema-Studie des Epo Analogons N47 Multizentrische, randomisierte, sequenzielle Dosis-Eskalationsstudien wurden eingeleitet, um die optimale Dosis und das optimale Verabreichungsschema für das Analogon N47 zu untersuchen, wenn es durch subkutane oder intravenöse Injektion Patienten mit dialysepflichtigem chronischen Nierenversagen (CRF) verabreicht wird.
Das Dosierungsschema ist wie folgt:
Dosierung einmal pro Woche: 0,075; 0,225; 0,45; 0,75; 1,5 und 4,5 µg Peptid/kg/Dosis.
Dosierung dreimal pro Woche: 0,025; 0,075; 0,15; 0,25; 0,5 und 1,5 µg Peptid/kg/Dosis.
Die Studien werden in zwei Teilen durchgeführt: der erste Teil ist eine Dosis-Eskalationsstudie, die entworfen wurde, um die Dosis des Analogons N47 zu evaluieren, die den Hämoglobinwert in einer optimalen Rate über vier Wochen erhöht (mehr als oder genau 1 g/dl, aber weniger als 3 g/dl), wenn es entweder einmal oder dreimal pro Woche gegeben wird. Der zweite Teil jeder Studie wurde entworfen, um die Dosen zu ermitteln, die notwendig sind (wenn sie einmal oder dreimal pro Woche entweder über intravenöse oder subkutane Wege der Verabreichung verabreicht werden), um den Hämatokrit in einem therapeutischen Zielbereich zu halten.
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass eine einmal wöchentliche Dosierung des Analogons N47 verwendet werden kann, um den Hämatokrit von anämischen CRF-Patienten sowohl zu erhöhen als auch aufrechtzuefialten. Anfängliche Ergebnisse deuten an, dass die bevorzugten Dosen 0,15 und 0,25 µg/Peptid/kg/Dosis für beide Wege der Verabreichung sind, um die Therapie mit einem dreimal wöchentlichen Verabreichungsschema einzuleiten. Bei einem einmal wöchentlichen Verabreichungsschema sind die bevorzugten Dosen 0,45 und 0,75 µg/Peptid/kg/Dosis für beide Wege der Verabreichung. Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines hyperglykosylierten Analogons von Erythropoietin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung und Aufrechterhaltung von Hämatokrit in einem Säuger, wobei das Analogon weniger häufig verabreicht werden soll als eine äquivalente molare Menge eines rekombinanten humanen Erythropoietins, um einen vergleichbaren Zielwert von Hämatokrit zu erreichen, und wobei das Analogon an einer der Positionen 30 und 88 der Sequenz des humanen Erythropoietins wenigstens eine zusätzliche Glykosylierungsstelle im Vergleich zu humanem Erythropoietin umfasst, so dass das Analogon wenigstens eine zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratkette umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das hyperglykosylierte Analogon von Erythropoietin etwa zweimal pro Woche verabreicht werden soll.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das hyperglykosylierte Analogon von Erythropoietin etwa einmal pro Woche verabreicht werden soll.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das hyperglykosylierte Analogon von Erythropoietin etwa einmal alle zwei Wochen verabreicht werden soll.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das hyperglykosylierte Analogon von Erythropoietin etwa einmal pro Monat verabreicht werden soll.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das hyperglykosylierte Analogon von Erythropoietin, das verabreicht werden soll, in einer Menge von etwa 0,075 bis 4,5 µg pro Erythropoietinpeptid pro kg pro Dosis vorliegt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Zielwert von Hämatokrit wenigstens etwa 30% beträgt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Säugers bestimmt ist, der an Anämie leidet, die mit einer Verschlechterung oder einem Verlust der Nierenfunktion einhergeht.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Säugers bestimmt ist, der an Anämie leidet, die mit einer myelosuppressiven Therapie verbunden ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die myelosuppressive Therapie chemotherapeutische oder antivirale Arzneimittel umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Säugers bestimmt ist, der an Anämie leidet, die mit einem starken Blutverlust einhergeht.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin eine therapeutisch wirksame Menge an Eisen umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon Asn30 Th32 Val87 Asn88 Thr90 Epo ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon zwei zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon drei zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon vier zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratketten umfasst.