ES2237574T5 - Composición farmacéutica líquida que contiene un derivado de eritropoyetina - Google Patents

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Description

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La EPO humana contiene nueve grupos amino libres, el grupo amino terminal amino y los grupos -amino de 8 restos lisina. Cuando el reactivo de pegilación se combina con un compuesto SBA de la fórmula II, se observa que a pH 7,5 se produce una proporción de proteína:PEG de 1:3 y cuando la temperatura de reacción se sitúa entre 20 y 25 ºC se produce una mezcla de especies mono-, di-pegilada y trazas de la especie tri-pegilada. Cuando el reactivo 5 de pegilación es un compuesto SPA de la fórmula II, en las mismas condiciones salvo que la proporción proteína:PEG es de 1:2, se produce una especie básicamente mono-pegilada. La EPO pegilada puede administrarse en forma de mezcla o en forma de especie pegilada diferente, separada por cromatografía de intercambio catiónico. Variando las condiciones de reacción (p.ej. la proporción entre los reactivos, el pH, la temperatura, la concentración de proteína, el tiempo de reacción, etc.), pueden lograrse diferentes cantidades relativas de las distintas especies
10 pegiladas.
Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden contener además una proteína eritropoyetina como la que se ha definido anteriormente, provista por lo menos de un grupo amino libre y provista de una actividad biológica “in vivo” que aumenta la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos en la médula ósea y elegida entre 15 el grupo formado por la eritropoyetina humana y análogos de la misma que tengan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glicosilación; dicha glicoproteína está unida por enlace covalente con grupos (alcoxi de bajo peso molecular)-polietilenglicol en un número de uno a tres, cada grupo polietilenglicol está unido mediante enlace covalente a la glicoproteína mediante un engarce de la fórmula -C(O)-X-S-Y-, formando el C(O) del engarce o eslabón un enlace amida con uno de dichos grupos amino, X es -(CH2)k-o
20 CH2(O-CH2-CH2)k-, k es un número de 1 a 10, Y es
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el peso molecular medio de cada fracción polietilenglicol se sitúa entre 20 kilodaltón y 40 kilodaltón y el peso molecular del conjugado se sitúa entre 51 kilodaltón y 175 kilodaltón.
30 Esta especie eritropoyetina puede representarse también con la fórmula (III)
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III)
35 en la que R puede ser cualquier alquilo inferior, entendiendo por tal un grupo alquilo lineal o ramificado que tenga de uno de seis átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, etc. Un alquilo preferido es el metilo. X puede ser -(CH2)k-o -CH2(O-CH2-CH2)k-, en los que k es un número de 1 a 10. k es con preferencia un número de 1 a 4, k es con mayor preferencia todavía el número 1 o 2. X es con mayor preferencia -(CH2).
40 En la fórmula 1, Y es
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o
con preferencia
con mayor preferencia
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10 En la fórmula (III), el número m se selecciona de tal manera que el conjugado resultante de la fórmula (III) tenga una actividad fisiológica similar a la de la EPO sin modificar, dicha actividad puede suponer un valor igual, superior a, o una fracción de la actividad correspondiente de la EPO sin modificar. m significa el número de restos óxido de etileno existentes en la unidad PEG. Una subunidad PEG (polietilenglicol) de -(OCH2CH2)-tiene un peso molecular
15 de 44 daltón. De este modo, el peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) dependerá del número m. Un peso molecular de “aproximadamente” un cierto número significa que es un valor comprendido dentro de un intervalo razonable en torno a dicho número, tal valor es el resultado de aplicar técnicas analíticas convencionales. m es un número entero entre aproximadamente 450 y aproximadamente 900 (equivalente a un peso molecular entre 20 y 40 kDa), m se sitúa con preferencia entre 550 y 800 (entre 24 y 35 kDa) y con mayor
20 preferencia m se sitúa entre 650 y 700 (entre 29 y 31 kDa).
En la fórmula (III), el número n es el número de grupos -amino existentes en un aminoácido lisina en una proteína eritropoyetina unida con enlace covalente a la unidad PEG mediante un enlace amida. Un conjugado de esta invención puede tener una, dos o tres unidades PEG por cada molécula de EPO. n es un número entero de 1 a 3, n
25 es con preferencia el número 1 o 2 y, con mayor preferencia, n es el número 1.
Las proteínas eritropoyetina preferidas de la fórmula (III) se representan en las fórmulas siguientes:
y
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35 Los productos glicoproteínicos eritropoyetina más preferidos se representan mediante la fórmula:
imagen11
En esta forma de ejecución, el reactivo bifuncional es con preferencia el S-acetiltiopropionato de N-succinimidilo o el S-acetiltioacetato de N-succinimidilo, Z es con preferencia la N-hidroxi-succinimida y el derivado polietilenglicol activado W-[OCH2CH2]m-OR se selecciona con preferencia del grupo formado por yodo-acetil-metoxi-PEG, metoxiPEG-vinilsulfona y metoxi-PEG-maleimida.
5 Más en concreto, las proteínas eritropoyetina de la fórmula (III) pueden obtenerse por enlace covalente de grupos tiol con EPO (“activación”) y unión de la EPO activada resultante con un derivado de polietilenglicol (PEG). La primera etapa de la obtención de la EPO pegilada de acuerdo con la presente invención consiste en crear el enlace covalente entre los grupos tiol y los grupos NH2 de la EPO. La activación de la EPO se efectúa con reactivos
10 bifuncionales que llevan un grupo tiol protegido y un grupo reactivo adicional, por ejemplo, los ésteres activos (p.ej. ésteres de succinimidilo), los anhídridos, los ésteres de ácidos sulfónicos, los halogenuros de ácidos carboxílicos y de ácidos sulfónicos, respectivamente. El grupo tiol se protege con grupos conocidos en la técnica, p.ej. grupos acetilo. Estos reactivos bifuncionales son capaces de reaccionar con los grupos -amino de los aminoácidos lisina formando un enlace amida. La primera etapa de la reacción se representa como sigue:
15
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EPO, n y X tienen los significados definidos anteriormente y Z es un grupo reactivo conocido en la técnica, p.ej. un sustituyente N-hidroxi-succinimida (NHS) de la fórmula
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En una forma preferida de ejecución, la activación de los grupos -amino de la lisina se efectúa por reacción con reactivos bifuncionales que tengan una fracción succinimidilo. Los reactivos bifuncionales pueden llevar diferentes
25 especies de espaciadores, p.ej. segmentos -(CH2)k-o -CH2(O-CH2-CH2)k-, en los que k es un número de 1 a 10, con preferencia de 1 a 4 y con mayor preferencia 1 o 2, y con preferencia especial el número 1. Son ejemplos de estos reactivos el S-acetiltiopropionato de N-succinimidilo (SATP) y el S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA).
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éster NHS de ácido 2-acetiltio-(etoxi)k-acético teniendo k el significado definido anteriormente.
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90 minutos. Para la modificación con PEG, la proporción entre EPO activada y alcoxi-PEG-maleimida debería situarse entre 1:3 y 1:6, con preferencia en 1:4. La reacción puede interrumpirse por adición de cisteína y reacción de los grupos tiol (-SH) remanentes con N-metilmaleimida o bien otro compuesto capaz de formar enlaces disulfuro. Debido a la reacción de los grupos tiol activos remanentes con un grupo protector, por ejemplo, la N-metilmaleimida
o cualquier otro grupo protector idóneo, las glicoproteínas EPO de los conjugados de esta invención pueden contener tales grupos protectores. En general, el procedimiento descrito en el presente documento generará una mezcla de moléculas provistas de tioles en diferentes cantidades y protegidos por números distintos de grupos protectores, en función del número de grupos tiol activados que tenga la glicoproteína que no estén conjugados con la PEG-maleimida.
La N-metilmaleimida forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se emplea para bloquear los grupos tiol restantes de la proteína pegilada, en cambio los compuestos disulfuro, por una reacción de intercambio intermolecular sulfuro/disulfuro, conducen a una unión de puente disulfuro con el agente bloqueante. Los agentes bloqueantes preferidos para este tipo de reacción de bloqueo son las glutationas oxidadas (GSSG), las cisteínas y las cistaminas. En el caso de las cisteínas no se introduce carga neta adicional en la proteína pegilada, mientras que el uso de reactivos bloqueantes GSSG o cistamina implica una carga negativa o positiva adicional.
La purificación posterior de los compuestos de fórmula (III), incluida la separación de las especies EPO mono-, di-y tri-pegiladas, puede realizarse por métodos técnicos ya conocidos, p.ej. cromatografía de columna.
Una composición que comprende derivados de eritropoyetina pegilada llevará con preferencia por lo menos un noventa por ciento de conjugados mono-PEG, es decir, en ellos n es 1, esta composición puede prepararse con arreglo al ejemplo 5. Normalmente los conjugados mono-PEG de las glicoproteínas eritropoyetina son deseables porque suelen tener una actividad mayor que los conjugados di-PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG y la proporción entre las especies mono-y di-PEG puede controlarse cargando fracciones más abundantes en torno al pico de elución para disminuir el porcentaje de mono-PEG o bien fracciones más escasas para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Los conjugados con un noventa por ciento de mono-PEG constituyen un buen equilibrio entre rendimiento y actividad. A veces puede ser deseable obtener composiciones en las que por ejemplo por lo menos el noventa y dos por ciento o por lo menos el noventa y seis por ciento de los conjugados sean especies mono-PEG (n igual a 1). En una forma de ejecución de esta invención, el porcentaje de conjugados en los que n es 1 se sitúa entre el noventa y el noventa y seis por ciento.
Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden contener de 10 a 10.000 µg de una proteína eritropoyetina por ml, tal como se ha definido anteriormente. Las composiciones contienen con preferencia de 10 a
1.000 µg, p.ej. 10, 50, 100 o 400 µg por ml.
Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden contener además de 10 a 10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, de 10 a 200 mmol/l de sulfato, de 10 a 50 mmol/l de fosfato, pH de 6,0 a 6,5. Esta composición puede contener metionina hasta 20 mM, del 1 al 5 % de un poliol (p/v), hasta el 0,1 % de Pluronic F68 (p/v) y opcionalmente CaCl2 hasta 1 mM. Un ejemplo de esta composición contiene de 10 a 10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, 40 mmol/l de sulfato, 10 mmol/l de fosfato, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v), pH 6,2.
En otra forma de ejecución de la presente invención, la composición puede contener de 10 a 10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, de 10 a 100 mmol/l de NaCl, de 10 a 50 mmol/l de fosfato pH 6,0 -7,0, opcionalmente del 1 al 5 % (p/v) de un poliol. Esta composición puede contener además metionina hasta 20 mM, hasta un 0,1 % de Pluronic F68 (p/v) y opcionalmente 7,5 µmol/l de CaCl2. En concreto, esta composición puede contener de 10 a
10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, 100 mmol/l de NaCl, metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v) y 10 mmol/l de fosfato, pH 7,0.
La presente invención se refiere además a la composición anterior que comprende de 10 a 10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, de 10 a 50 mmol/l de arginina, de pH 6 a pH 6,5, de 10 a 100 mmol/l de sulfato sódico. Además, la composición puede contener metionina hasta 20 mM, hasta un 0,1 % de Pluronic F68 (p/v), opcionalmente hasta 1 mmol/l de CaCl2 y opcionalmente del 1 al 5 % (p/v) de un poliol. La composición puede contener en especial de 10 a 10.000 µg de proteína eritropoyetina por ml, 40 mmol/l de arginina, pH 6,2, 30 mmol/l de sulfato sódico, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v) y opcionalmente 1 mmol/l de CaCl2.
Una forma preferida de ejecución de la presente invención se refiere a composiciones que comprende de 10 a
10.000 µg/ml de eritropoyetina, con preferencia de 25 a 500 µg/ml de eritropoyetina y
a) fosfato sódico/potásico 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0 o b) fosfato sódico 10 mM, sulfato sódico 120 mM, pH 6,2 o c) fosfato sódico 10 mM, sulfato sódico 40 mM, un 3 % de manitol (p/v), pH 6,2 o d) fosfato sódico 10 mM, sulfato sódico 40 mM, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v), pH 6,2 o
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e) arginina 40 mM, sulfato sódico 30 mM, un 3 % de manitol (p/v), pH 6,2 o f) arginina 40 mM, sulfato sódico 30 mM, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v), pH 6,2.
En la forma más preferida de ejecución, las composiciones contienen una cantidad de proteína eritropoyetina de 50, 100 o 400 µg/ml. Las composiciones más preferidas contienen ya sea fosfato sódico 10 mM, sulfato sódico 40 mM, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v), pH 6,2, ya sea arginina 40 mM, sulfato sódico 30 mM, un 3 % de manitol (p/v), metionina 10 mM, un 0,01 % de Pluronic F68 (p/v), pH 6,2.
También se desvelan composiciones en forma de polvo secado por atomización.
Además, se desvela una composición que es un liofilizado o un polvo secado por atomización de las composiciones anteriormente descritas. La composición puede reconstituirse para generar una solución líquida por adición de un disolvente, p.ej. agua, o aplicarse directamente p.ej. con un dispositivo de inhalación o con un dispositivo de aplicación transdermal.
La invención se refiere además a un procedimiento de preparación de una composición tal como se ha descrito anteriormente, que comprende mezclar una proteína eritropoyetina con una solución que comprende un anion de carga negativa múltiple y opcionalmente uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables, como los definidos anteriormente.
La presente invención se refiere además al uso de composiciones como las definidas anteriormente para fabricar medicamentos útiles para el tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes de deficiencia renal crónica (CRF), sida y/o para el tratamiento de pacientes de cáncer sometidos a quimioterapia. Incluye un método para el tratamiento y prevención de enfermedades que implican anemia en pacientes con deficiencia renal crónica (CRF), sida y pacientes de cáncer que se someten a quimioterapia, tal método comprende la etapa de administración de una composición definida anteriormente a un paciente.
Otra forma de ejecución de la presente invención se refiere a dispositivos para la liberación persistente, local y sistémica, que comprende una composición definida anteriormente. Tal dispositivo puede ser cualquier tipo de implantado que proporcione una cesión controlada de eritropoyetina y que comprende la composición descrita anteriormente. La composición descrita anteriormente puede suministrarse también en forma de jeringuilla prerrellena o en forma de cualquier otro dispositivo de aplicación, p. ej. un dispositivo de inyección sin aguja o un dispositivo de inhalación.
La composición de esta invención puede estar presente como una dosis unitaria para inyectable o administración intravenosa. Por otra parte, la composición de este invento puede guardarse en forma líquida o sólida y luego dividirse en formas de dosificación unitaria para administración intravenosa o inyectable. Por consiguiente, la composición líquida de este invento puede estar presente en cantidades tan reducidas como de 0,3 ml para uso como una forma de dosificación simple para administración. Por otra parte, el volumen de la composición reivindicada puede ser tan grande como de 60 litros cuando se almacena anteriormente de la distribución en una forma de dosificación envasada. En vista de su estabilidad mejorada la composición de este invento puede guardarse en grandes contenedores para poderse disponer luego en medios de envasado apropiados para distribución a doctores, pacientes y hospitales.
La solución inyectable de este invento puede administrarse con medios de inyección convencionales tales como jeringas que en general permiten la administración de 0,3 ml a 20 ml de esta composición en forma de dosis unitaria simple. Por otra parte, la composición de este invento puede administrarse mediante inyección utilizando ampollas que contengan esta composición como un liofilizado o como un polvo secado por pulverización que se reconstituye luego en forma convencional antes de la inyección. Por otra parte, debido a la estabilidad de las composiciones de este invento las composiciones pueden suministrarse en forma de dosificación unitaria tal como viales que contengan entre alrededor de 0,3 ml y alrededor de 10 ml de esta composición. En adición, las composiciones de este invento pueden administrarse por vía intravenosa utilizando bolsas intravenosas. Estas bolsas contienen entre alrededor de 20 ml y alrededor de 500 ml de la solución dependiendo del periodo en el que ha de administrarse la solución a un paciente. De conformidad con este invento la solución líquida de este invento puede guardarse en contenedores de almacenamiento de los que puede separarse en pequeños envases de forma de dosificación para distribución a doctores, hospitales y pacientes. Debido a la estabilidad de las composiciones de este invento estas composiciones pueden almacenarse en contenedores de almacenamiento durante largos periodos de tiempo antes de la administración.
La obtención de la eritropoyetina como ingrediente para composiciones como las descritas anteriormente o como material de partida para la obtención de derivados de eritropoyetina descritos anteriormente se describe con detalle por ejemplo en las patentes US n.º 5,547,933 y 5,621,080, EP-B-0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 2708-2712, EP-B-0 205 564, EP-B-0 209 539 y EP-B-0 411 678 así como en Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 3116-3121, y Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. La eritropoyetina para fines
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terapéuticos puede obtenerse por medios recombinantes (EP-B-0 148 605, EP-B-0 209 539 y Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986), Immunobiol. 72: 213-224).
Los métodos de expresión y obtención de la eritropoyetina en medio sin suero se describen por ejemplo en WO 96/35718, de Burg, publicada el 14 de noviembre de 1996 y en la publicación de patente europea n.º 513 738, de Koch, publicada el 12 de junio de 1992. Además de las publicaciones recién mencionadas, se conoce que puede efectuarse una fermentación sin suero de células CHO recombinantes que contiene un gen EPO. Tales métodos se describen por ejemplo en EP-A-0 513 738, EP-A-0 267 678 y en forma general en Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983), 445-453, EP-A-0 248 656, Kowar, J. y Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986), 277292, Bavister, B., Enzymology 271 (1981), 45-51, EP-A-0 481 791, EP-A-0 307 247, EP-A-0 343 635, WO 88/00967.
En el documento EP-A-0 267 678 se describen la cromatografía de intercambio iónico en S-Sepharose, una cromatografía HPLC preparativa de fase inversa en una columna C8 y la cromatografía de filtración a través de gel para utilizarlas en la purificación de la EPO producida en cultivo sin suero después de diálisis. En este contexto se puede sustituir la cromatografía de filtración a través de gel por la cromatografía de intercambio iónico a través de S-Sepharose con flujo rápido. Se ha propuesto también realizar una cromatografía de colorante a través de una columna de Blue Trisacryl antes de proceder a la cromatografía de intercambio iónico.
Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990), 352-359, describen un proceso de purificación de la EPO recombinante. En este proceso se trata la EPO con una solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida, pepstatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico antes de realizar las etapas de purificación. Existen publicaciones, incluida la WO 96/35718, de Burg, publicada el 14 de noviembre de 1996, que describen un procedimiento de obtención de eritropoyetina en un proceso de fermentación sin suero (EPOsf).
La actividad específica de la EPO o de conjugados de EPO con arreglo a esta invención puede determinarse mediante varios ensayos ya conocidos en la técnica. La actividad biológica de proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la administración de la proteína EPO por inyección a pacientes humanos se traduce en un aumento de la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos en la médula ósea con respecto a grupos de sujetos de control no inyectados. La actividad biológica de las proteínas EPO o de fragmentos de las mismas, obtenidas y purificadas con arreglo a esta invención, puede comprobarse mediante métodos propuestos por Annable et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972), 47:99-112 y Pharm. Europa edición especial Erythropoietin BRP Bio 1997(2). En el ejemplo 6 se describe otro ensayo biológico para determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo del ratón normocitémico.
Esta invención se comprenderá mejor con los ejemplos siguientes que ilustran, pero no limitan la invención descrita en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1: Fermentación y purificación de la EPO humana
a) Preparación y fermentación del inóculo
De la fase gaseosa del tanque de almacenaje en nitrógeno líquido se toma un vial del Banco de Trabajo Celular (Working Cell Bank), que se abastece de una línea celular CHO productora de EPO (puede utilizarse un ATCC CRL8695, publicado en EP-411 678 (Genetics Institute)). Se trasladan las células a frascos rotativos de vidrio y se cultivan en un medio tamponado con hidrogenocarbonato en un incubador humidificado de CO2. Los medios típicos sin suero utilizados para la obtención y fermentación del inóculo se publican en la solicitud de patente europea 513 738, de Koch, publicada el 12 de junio de 1992, o en WO 96/35718, de Burg, publicada el 14 de noviembre de 1996 y contienen por ejemplo como medio el DMEM/F12 (p.ej. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, producto n.º 57-736) y además hidrogenocarbonato sódico, L+glutamina, D+glucosa, insulina recombinante, selenita sódica, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro (II), asparagina, ácido aspártico, serina y estabilizador para células de mamíferos, p.ej. alcohol polivinílico, metilcelulosa, polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68, poligelina expansionadora de plasma (HEMACCEL®) o polivinilpirrolidona (WO 96/35718).
Se comprueba a nivel microscópico la ausencia de microorganismos contaminantes en los cultivos y de determinan las densidades celulares. Los ensayos se realizan en cada etapa de división.
Después del período de crecimiento inicial se diluye el cultivo celular en medio fresco hasta la densidad celular de partida y se somete a otro ciclo de crecimiento. Se repite el procedimiento hasta lograr un volumen de cultivo de aproximadamente 2 l por frasco rotatorio de vidrio. Después de unas 12 duplicaciones se dispone de 1 a 5 litros de este cultivo que se utiliza seguidamente como inóculo para el fermentador de 10 l.
Pasados de 3 a 5 días, el cultivo del fermentador de 10 l puede utilizarse como inóculo para el fermentador de 100 l.
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Pasados otros 3-5 días de fermentación, el cultivo del fermentador de 100 l puede utilizarse como inóculo para el fermentador de producción de 1000 l.
b) Recolección y separación de las células
Se utiliza un procedimiento de realimentación de partidas, es decir, una vez se alcanza la densidad celular deseada se recoge aproximadamente el 80 % del cultivo. Se rellena el cultivo restante con medio fresco de cultivo y se cultiva hasta la recolección siguiente. Un ciclo productivo consiste en un máximo de 10 recolecciones consecutivas: 9 recolecciones parciales y 1 recolección final al término de la fermentación. La recolección tiene lugar cada 3-4 días.
Se traslada el volumen recolectado determinado a un reactor refrigerado. Se eliminan las células por centrifugación
o filtración y se descartan. El líquido sobrenadante de la etapa de centrifugación que contiene la EPO se filtra en línea y se recoge un segundo reactor refrigerado. Cada cosecha se procesa por separado durante la purificación.
Un proceso típico de purificación de la proteína EPO se publica en WO 96/35718, de Burg, publicada el 14 de noviembre de 1996. El proceso de purificación se explica a continuación.
a) Cromatografía a través de Blue Sepharose
El Blue Sepharose (Pharmacia) consiste en perlas de Sepharose sobre cuya superficie se ha fijado el colorante Cibacron blue por enlace covalente. La EPO se une al Blue Sepharose con mayor fuerza que la mayoría de contaminantes no proteináceos, algunas impurezas proteináceas y el PVA, por consiguiente, la EPO puede aumentar de concentración durante esta etapa. La elución a través de la columna de Blue Sepharose se lleva a cabo aumentando la concentración de sal y el pH.
Se rellena la columna con 80-100 l de Blue Sepharose, regenerada con NaOH y equilibrada con tampón (cloruro sódico/cálcico y acetato sódico). Se carga el líquido sobrenadante del fermentador acidificado y filtrado. Una vez finalizada la carga se lava la columna primero con un tampón similar al tampón de equilibrado que contiene una mayor concentración de cloruro sódico y a continuación con un tampón basado en Tris. Se eluye el producto con un tampón basado en Tris y se recoge en una sola fracción con arreglo al perfil maestro de elución.
b) Cromatografía a través de Butyl Toyopearl
El Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) es una estructura basada en poliestireno, sobre ella se unen con enlaces covalentes restos butilo alifáticos. La EPO se une a este gel con mayor fuerza que la mayoría de impurezas y el PVA, por lo tanto, tiene que eluirse con un tampón que contenga isopropanol.
Se rellena la columna con 30-40 l de Butyl Toyopearl 650 C, regenerador con NaOH, se lava con un tampón basado en el Tris y se equilibra con un tampón basado en Tris que contenga isopropanol.
El líquido eluido a través de Blue Sepharose se ajusta a la concentración del isopropanol dentro del tampón de equilibrado de la columna y se carga en la columna. Se lava la columna con tampón de equilibrado con una mayor concentración de isopropanol. Se eluye el producto con tampón (tampón basado en Tris con contenido alto de isopropanol) y se recoge en una sola fracción con arreglo al perfil maestro de elución.
c) Cromatografía a través de Ultrogel de hidroxiapatita
El Ultrogel de hidroxiapatita (Biosepra) consiste en hidroxiapatita que se incorpora a una estructura (matriz) de agarosa para mejorar sus propiedades mecánicas. La EPO tiene poca afinidad con la hidroxiapatita y por tanto puede eluirse empleando concentraciones de fosfato menores que para el caso de impureza de proteína.
Se rellena la columna con 30-40 l de Ultrogel de hidroxiapatita y se regenera con un tampón de fosfato potásico/cloruro cálcico y NaOH y después con un tampón basado en Tris. A continuación, se equilibra con un tampón basado en Tris que contenga una pequeña cantidad de isopropanol y cloruro sódico.
Después de la cromatografía a través de Butyl Toyopearl, el líquido eluido que contiene la EPO se carga en la columna. Seguidamente se lava la columna con tampón de equilibrado y tampón basado en Tris sin isopropanol ni cloruro sódico. Se eluye el producto con un tampón basado en Tris que contenga una concentración baja de fosfato potásico y se recoge una solución fracción con arreglo al perfil maestro de elución.
d) Cromatografía HPLC de fase inversa con Vydac C4
El Vydac C4 (Vydac), material de la cromatografía HPLC en fase inversa, consiste en partículas de gel de sílice cuya superficie lleva cadenas de alquilo C4. La separación de la EPO de las impurezas proteináceas se basa en las diferencias existentes en su fuerza de interacción hidrófoba. La elución se realiza con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético diluido.
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La cromatografía HPLC se lleva a cabo utilizando una columna de acero inoxidable (relleno: de 2,8 a 3,2 litros de gel de sílice Vydac C4). El líquido eluido a través de Ultrogel de hidroxiapatita se acidifica por adición de ácido trifluoracético y se carga en la columna de Vydac C4. Para el lavado y la elución se emplea un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético diluido. Se recogen las fracciones y se neutralizan inmediatamente con tampón fosfato. Se reúnen las fracciones de EPO comprendidas dentro de los límites IPC.
e) Cromatografía a través de DEAE Sepharose
El material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste en grupos dietilaminoetilo (DEAE) unidos a la superficie de las perlas de Sepharose mediante enlaces covalentes. La unión entre la EPO y los grupos DEAE se debe a interacciones iónicas. El acetonitrilo y el ácido trifluoracético pasan por la columna sin ser retenidos. Una vez han salido estas sustancias, se eliminan las impurezas existentes en cantidades de trazas por lavado de la columna con tampón acetato a pH bajo. A continuación, se lava la columna con tampón fosfato neutro y se eluye la EPO con un tampón que tengan mayor fuerza iónica.
Se rellena la columna con DEAE Sepharose de flujo rápido. Se ajusta el volumen de la columna para asegurar una carga de EPO dentro del margen de 3 a 10 mg de EPO por ml de gel. Se lava la columna con agua y tampón de equilibrado (fosfato sódico/potásico). Se reúnen las fracciones de líquido eluido de la HPLC y se carga en la columna, lavando esta con tampón de equilibrado. A continuación, se lava la columna con tampón de lavado (tampón de acetato sódico) y después con tampón de equilibrado. A continuación, se eluye la EPO de la columna con tampón de elución (cloruro sódico, fosfato sódico/potásico) y se recoge una sola fracción con arreglo al perfil maestro de elución.
Se ajusta el líquido eluido a través de la columna de DEAE Sepharose a la conductividad especificada. Se filtra en condiciones estériles la sustancia farmacológica resultante, se envasa en frascos de Teflon y se almacena a -70 ºC.
Ejemplo 2: Pegilación de la EPO con mPEG-SBA
La EPO purificada con arreglo al procedimiento sin suero del ejemplo 1 (EPOsf) es homogénea según se determina por métodos analíticos y presenta los patrones típicos que consisten en 8 isoformas. Tiene una actividad biológica específica de 190.000 IU/mg según se determina por el ensayo del ratón normocitémico. El reactivo de pegilación empleado es el metoxi-PEG-SBA, que es un compuesto de la fórmula II en la que R es metilo; x es 3; y m es un número de 650 a 750 (promedio en torno a 680, equivalente a un peso molecular medio de unos 30 kDa).
Reacción de pegilación
A cien miligramos de EPOsf (9,71 moles de material que contiene 10,3 mg/ml de EPOsf, 5,48 µmol) se le añaden 10 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,5, que contiene 506 mg de metoxi-PEG-SBA de 30 kDa (16,5 µmol) (adquirido a la empresa Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama), y se mezclan a temperatura ambiente (2023 ºC) durante 2 h. La concentración final de proteína es de 5 mg/ml y la proporción entre proteína y reactivo PEG es de 1:3. Pasadas dos horas se interrumpe la reacción ajustando el pH a 4,5 con ácido acético glacial y se almacena a -20 ºC hasta quedar listo para la purificación.
Purificación
1.
Mezcla de conjugado: En una columna de vidrio AMICON (2,2 x 7,5 cm) se introducen 28 ml de relleno SP-SEPHAROSE FF (resina sulfopropilo de intercambio catiónico) y se equilibra con 20 mM de tampón acetato, pH 4,5 con un caudal de 150 ml/h. Se diluyen seis mililitros de la mezcla reaccionante que contienen 30 mg de proteína 5 veces con el tampón de equilibrado y se cargan a la columna. Los materiales no adsorbidos se eliminan por lavado con el tampón y la mezcla de conjugados PEG adsorbidos se eluyen de la columna con NaCl 0,175 M en el tampón de equilibrado. La EPOsf sin modificar que continúa dentro de la columna se eluye con NaCl 750 mM. Se reequilibra la columna con el tampón inicial. Se analizan las muestras por SDS-PAGE y se determina su grado de pegilación. Se encuentra que el líquido eluido con NaCl 0,175 M contiene especies mono-y di-pegiladas así como trazas de especies tri-pegiladas, mientras que el líquido eluido con NaCl 750 mM contiene EPOsf sin modificar.
2.
EPOsf mono-PEG y di-PEG: Se diluye 4 veces con el tampón la mezcla purificada de conjugados eluida de la columna en la etapa anterior, se vuelve a cargar en la columna y se lava del modo descrito. Se eluyen por separado la EPOsf di-PEG y la EPOsf mono-PEG empleando como eluyente NaCl 0,1 M y NaCl 0,175 M, respectivamente. La elución se realiza además con NaCl 750 mM con el fin de eluir toda la EPOsf sin modificar que pudiera quedar en la columna. Como alternativa se diluye la mezcla reaccionante 5 veces con tampón acetato y se carga en la columna de SP-Sepharose (~0,5 mg de proteína/mg de gel). Se lava la columna y se eluyen la EPOsf mono-PEG, la EPOsf-di-PEG y la EPOsf sin modificar que estaban adsorbidas del modo descrito en la sección anterior.
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Resultados
Se sintetiza la EPOsf-PEG por conjugación química con una molécula lineal de PEG de peso molecular medio de 30 kDa. La EPOsf-PEG se deriva de la reacción entre los grupos amino primarios de la EPOsf con el derivado éster succinimidilo de un ácido butírico-PEG de 30 kDa, resultando de tal reacción un enlace amida.
Los resultados se resumen en la tabla 1. La mezcla de conjugados purificados contiene EPOsf mono-y di-PEG y está libre de EPOsf sin modificar, según se determina por análisis SDS-PAGE. La mezcla de conjugados forma 23,4 mg o el 78 % del material de partida. La separación por cromatografía de intercambio catiónico de las EPOsf monoy di-PEG indica que la proporción entre conjugados mono-y di-PEG dentro de la mezcla se sitúa casi en 1:1. Una vez finalizada la reacción, la proporción entre los componentes individuales mono:di:sin modificar se sitúa en
40:38:20 (%). El rendimiento global es casi cuantitativo.
Tabla 1: Resumen de resultados de pegilación de EPOsf
Muestra
Proteína (mg) Rendimiento (%)
mezcla reaccionante
30 100
mono
12,0 40
di
11,4 38
sin modificar
6,0 20
mezcla conjug.
23,4 78
Ejemplo 3: Pegilación de EPO con mPEG-SPA
Una parte alícuota diferente de la EPOsf utilizada en el ejemplo 2 se hace reaccionar con 30 kDa de metoxi-PEG-SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Se realiza la reacción con una proporción entre proteína y reactivo de 1:2 y se emplean técnicas de purificación con arreglo al ejemplo 2. Se obtiene básicamente una especie mono-pegilada.
Ejemplo 4: Unión covalente de los grupos tiol con la EPO
Este ejemplo ilustra la determinación de las condiciones de reacción para lograr una unión covalente de los grupos tiol con la EPO. Para determinar las condiciones se añaden diferentes cantidades de un reactivo que contiene un grupo tiol bloqueado, en este caso SATA o SATP (disuelto en DMSO a razón de 10 mg/ml), a la solución de EPO, en este caso 1 ml de 5 mg/ml de EPO en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,3. Se agita la reacción durante 30 minutos (25 ºC) y se interrumpe por adición de una solución 1 M de lisina hasta alcanzar una concentración de 10 mM. Las cantidades en exceso de SATA o SATP se eliminan por diálisis frente a fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM, pH 6,2. Una vez eliminado el grupo acetilo protector con hidroxilamina se determina fotométricamente con ditiodipiridina el número de grupos tiol unidos a la EPO con enlace covalente según el método descrito por Grasetti, D.R. y Murray, J.F. en J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, pág. 41-49 (1967).
El número de grupos tiol unidos por enlace covalente a la molécula de EPO se muestra seguidamente.
Proporción molar EPO:SATA o EPO:SATP
Moles de grupos tiol/mol de EPO
EPO:SATA = 1:3
1,5
EPO:SATA = 1:5
2,4
EPO:SATA = 1:6
3,2
EPO:SATP = 1:3
1,3
EPO:SATP = 1:4
2,5
EPO:SATP = 1:6
3,7
Ejemplo 5: Modificación de EPO activada con metoxi-PEG-maleimida
A) Activación de la EPO
Se activan 100 mg de EPO producida según el ejemplo 1 (190.000 IU/mg, determinado por el ensayo del ratón normocitémico) con SATA (proporción molar EPO/SATA = 1/5) según el ejemplo 2. La EPO resultante (“EPO activada”) lleva grupos tiol bloqueados, unidos mediante enlace covalente, se separa por diálisis de los productos secundarios del tipo N-hidroxi-succinimida y SATA no reaccionado, tal como se describe en el ejemplo 1. Se obtiene una solución de 4,5 mg/ml de EPO activada en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2.
B) Pegilación de la EPO activada
Se disuelven 380 mg de metoxi-PEG-maleimida que tienen la estructura “más preferida” ilustrada anteriormente (peso molecular 30.000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, Estados Unidos)) en la solución anterior que contiene 95 mg de EPO activada (4,5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2). La
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proporción molar resultante entre EPO activada y la metoxi-PEG-maleimida en la solución es de 1:4. Añadiendo una solución acuosa 1 M de hidroxilamina hasta alcanzar una concentración de 30 mM, pH 6,2, a la solución anterior, se desbloquean los grupos tiol bloqueados y unidos por enlace covalente con la EPO activada. La EPO activada resultante de la mezcla reaccionante en solución contiene grupos tiol (-SH) libres. Después del desbloqueo de los grupos tiol se efectúa inmediatamente la reacción de unión de la EPO activada, provista ahora de grupos tiol (-SH) libres, con la metoxi-PEG-maleimida durante 90 minutos (agitación a 25 ºC). Se interrumpe la reacción de unión añadiendo a la mezcla reaccionante una solución acuosa 0,2 M de cisteína hasta alcanzar una concentración de 2 mM. Pasados 30 minutos, el exceso de grupos tiol libres de la EPO activada, que no hayan reaccionado con la metoxi-PEG-maleimida, se bloquean añadiendo una solución 0,5 M de N-metilmaleimida en DMSO hasta alcanzar una concentración de 5 mM. Pasados 30 minutos, la mezcla reaccionante obtenida, que ahora contiene especies EPO pegiladas, se dializa con fosfato potásico 10 mM, pH 7,5 durante  15 horas.
C) Purificación de especies EPO pegiladas
Para separar las especies EPO pegiladas de la mezcla reaccionante se efectúa el siguiente proceso de purificación: Se equilibra una columna de 50 ml de Q-Sepharose FF con fosfato potásico 10 mM, pH 7,5. Se carga en la columna la mezcla reaccionante obtenida en la etapa B) (caudal: 3 volúmenes de columna (VC) por hora). Con el fin de separar el reactivo metoxi-PEG-maleimida que no haya reaccionado se lava la columna con 5 VC de fosfato potásico 10 mM, pH 7,5. Se separa la especie EPO pegilada por elución con un gradiente de sal creciente que consiste en 5 VC de tampón A (fosfato potásico 10 mM, pH 7,5) y 5 VC de tampón B (fosfato potásico 10 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) con un caudal de 3 VC por hora. Basándose en el gradiente de NaCl se eluyen en primer lugar las especies EPO pegiladas (especies EPO tri-, di-y mono-pegiladas), después se eluyen las especies EPO no pegiladas. La fracción de líquido eluido que contiene las especies EPO pegiladas (especies EPO tri-, di-y mono-pegiladas) se reúne y se filtra (filtración estéril a través de un filtro 0,2 µm).
El contenido y la pureza de las especies EPO tri-, di-y mono-pegiladas se evalúa con geles SDS-PAA teñidos con colorante Coomassie (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)), mientras que las concentraciones de proteína se determinan a 280 nm según la ley de Beer-Lambert. Los pesos moleculares aparentes de las especies EPO se determinan por electroforesis SDS-PAA y se sitúan en torno a 68 kDa (especie EPO mono-pegilada), en torno a 98 kDa (especie EPO di-pegilada) y en torno a 128 kDa (especie EPO tri-pegilada).
La ulterior separación de las especies EPO tri-, di-y mono-pegiladas puede llevarse a cabo por cromatografía, p.ej. por cromatografía de exclusión de tamaños (Superdex, pg 200; Pharmacia). La determinación de la actividad biológica “in vivo” de los líquidos eluidos que contienen las especies tri-, di-y mono-pegiladas se realiza por el método descrito posteriormente.
Ejemplo 6: Actividad “in vivo” de la EPO pegilada, determinada por el ensayo del ratón normocitémico
El ensayo biológico del ratón normocitémico ya es conocido en la técnica (Pharm. Europa, edición especial: Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) así como un método de la monografía de la eritropoyetina de la Ph. Eur. BRP. Se diluyen las muestras en BSA-PBS. A los ratones de salud normal, de 7-15 semanas de edad, se les administran por vía subcutánea 0,2 ml de la fracción de EPO que contiene la EPO no pegilada o las EPO tri-, di-o mono-pegiladas del ejemplo 2 o 3. Durante un período de 6 días se extrae sangre por punción de la vena caudal y se diluye de tal manera que 1 µl de sangre esté presente en 1 ml de una solución colorante anaranjada de acridina 0,15 µmolar. El período de tintura es de 3 a 10 minutos. El recuento de reticulocitos se efectúa por microfluorimetría en un citómetro de flujo por análisis del histograma de fluorescencia roja. El número de reticulocitos se expresa en forma de figuras absolutas (por cada 30.000 células sanguíneas analizadas). En cuanto a los datos presentados, cada grupo consta de 5 ratones por día y se extrae sangre de los ratones solamente una vez.
En ensayos separados se administran a los ratones una dosis única de EPO sin modificar (25 ng de EPO), la mezcla PEG(SBA)-EPO del ejemplo 2 (10 ng de conjugado), las EPO mono-y di-pegiladas del ejemplo 2 (10 ng de conjugado), la EPO PEG(SPA) del ejemplo 3 (10 ng de conjugado) y la solución tampón. Los resultados se recogen en la tabla 2. Los resultados confirman la actividad superior y la prolongada vida media de las especies EPO pegiladas, que se ponen de manifiesto con las cantidades significativamente mayores de reticulocitos y por el aumento del número máximo de reticulocitos utilizando la misma dosis por ratón (10 ng), por comparación con la dosis de 25 ng de EPO sin modificar.
Tabla 2 15
EPO modif.)
(no SPA PEG 30 kDa Mono 30K SBA Di 30K SBA PEG-EPO SBA Mezcla de conjugados Control tampón
72 h
1000 1393 1411 994 1328 857
96 h
500 1406 1501 926 1338 697
120 h
~200 1100 1182 791 944 701
144 h
~0 535 607 665 660 708
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Ejemplo 7: Obtención de EPO predominantemente mono-PEG
Reacción de pegilación
Partiendo de 100 mg (5,48 µmol) de EPOsf en tampón fosfato potásico 100 mM, pH 7,5, obtenida con arreglo al ejemplo 1, se añaden 329 mg (10,96 µmol) de reactivo PEG-SBA 30 kDa disuelto en 3 ml de HCl 1 mM. Se añade tampón fosfato potásico 100 mM, pH 7,5, suficiente para que el volumen de la mezcla reaccionante alcance los 20 ml. La concentración final de proteína es de 5 mg/ml y la proporción entre proteína y reactivo PEG se sitúa en 1:2. Se mezcla la masa reaccionante durante 2 h a temperatura ambiente (20-22 ºC). Pasadas 2 h se interrumpe la reacción ajustando el pH a 4,5 con ácido acético glacial y almacenando el material congelado a -20 ºC hasta que esté listo para la purificación.
Purificación
Se diluye la mezcla reaccionante de la etapa anterior en proporción 1:5 con acetato sódico 10 mM, pH 4,5, y se carga en una columna de 4,2 x 19 cm, cuyo relleno son 300 ml de SP-Sepharose FF (resina sulfopropilo de intercambio catiónico). La columna se equilibra previamente con el mismo tampón. Los líquidos eluidos de la columna se controlan a 280 nm con un monitor Gilson UV y se traza la gráfica correspondiente en un registro Kipp & Zonen. Se lava la columna con 300 ml o con 1 volumen de columna de tampón de equilibrado para eliminar el exceso de reactivos, productos secundarios de la reacción y EPO-PEG oligomérica. Después se lava con 2 volúmenes de columna de NaCl 100 mM para eliminar la EPO di-PEG. A continuación, se eluye la EPO mono-PEG con NaCl 200 mM. Durante la elución de la EPO mono-PEG se descartan los primeros 50 ml del pico de proteína, recogiéndose la EPO mono-PEG en forma de fracción de 150 ml. La EPOsf sin modificar que permanece en la columna se eluye con NaCl 750 mM. Todos los tampones de elución se preparan del tampón de equilibrado. Todas las muestras eluidas se analizan por SDS-PAGE y por cromatografía de exclusión de tamaños de alta resolución (SEC). El conjunto de EPO mono-PEG obtenida de la fracción de 150 ml, que no contiene EPOsf sin modificar detectable, se concentra hasta ~4,5-7,5 mg/ml y se diafiltra en el tampón de almacenaje, fosfato potásico 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. La concentración/diafiltración se efectúa a temperatura ambiente en un sistema Millipore Labscale TFF, equipado con una membrana Millipore Pellicon XL Biomax 50 de corte en 50 kDa. La EPO mono-PEG concentrada se filtra en condiciones estériles y se almacena congelada a -20 ºC.
Aproximadamente el 75 % de la EPOsf está pegilada. Después de la purificación, el rendimiento total es de ~30 % de EPO mono-PEG con una cantidad no detectable de EPOsf sin modificar y en torno al 25 % de EPO di-PEG. Los oligómeros y la EPOsf sin pegilar se cuentan como proteína restante. El conjunto de EPO mono-PEG obtenida a partir de la fracción de 150 ml contiene aproximadamente un 90 % de EPO mono-PEG y aproximadamente un 10 % de EPO di-PEG.
Ejemplo 8: Termoestabilidad de la EPO y de la EPO pegilada en varias formulaciones: análisis DSC (calorimetría de escaneo diferencial)
Se acepta en general que la temperatura de transición de desnaturalización térmica, medida por calorimetría de escaneo diferencial, es un indicador válido de la termoestabilidad de las proteínas. Se analizan soluciones de eritropoyetina o de eritropoyetina pegilada con concentraciones comprendidas entre 0,6 y 1,2 mg/ml en diversos tampones con o sin estabilizadores mediante la nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, Estados Unidos), calentando a razón de 2 K/min. Un aumento de la temperatura de transición indica un aumento de la estabilidad térmica de la proteína. Los valores de temperatura medidos no deben tomarse como valores absolutos sino como diferencias de estabilidad entre las distintas formulaciones individuales entre sí.
Con el fin de definir el pH óptimo de la formulación se estudia la desnaturalización térmica de la eritropoyetina pegilada en función del pH en el intervalo comprendido entre 4 y 9. Se analizan muestras de proteína en Na2HPO4 30 mM, citrato sódico 30 mM, borato 30 mM. La figura 3 muestra una meseta de temperatura máxima de transición entre pH 6 y pH 9 y un fuerte descenso por debajo de pH 5,5. Esto indica que el pH óptimo para una estabilidad térmica máxima se sitúa por encima de pH 5,5 (figura 3).
Con el fin de investigar el efecto de la fuerza iónica se determina la desnaturalización térmica en función de la concentración de fosfato. La figura 4 demuestra que la estabilidad térmica aumenta cuando aumenta la fuerza iónica de la formulación.
Se investiga también con la DSC la influencia que tiene la sustancia tampón. De la figura 5 se deriva que los tampones o aditivos más idóneos para conseguir una estabilidad térmica elevada son el sulfato, el citrato o el fosfato. La glicina que se utiliza como tampón en las formulaciones convencionales (ver antes) no es muy indicada.
La figura 6 demuestra que el sulfato es también un tampón/aditivo idóneo para pH bajo (p.ej. pH 6,2), mientras que el fosfato es menos indicado para pH 6,2 que para pH 7,5. Esto indica que el sulfato mantiene alta la estabilidad térmica, incluso a pH bajo. Estos resultados hacen viables las formulaciones a un pH comprendido entre 6,0 y 6,5, sin pérdidas graves de estabilidad térmica de la eritropoyetina.
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