BRPI0110914B1

BRPI0110914B1 - 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'

Info

Publication number: BRPI0110914B1
Application number: BRPI0110914A
Authority: BR
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2016-03-01
Also published as: AU784091B2; EP1311285B2; KR20030001509A; PL219131B1; ES2237574T5; PL361341A1; DE60109625D1; WO2001087329A1; BR0110914A; MXPA02011303A; ECSP024352A; WO2001087329A8; JO3404B1; CN1309416C; KR100758044B1; HRP20020880A2; AR035034A1; TWI288644B; ZA200208500B; DE60109625T2

Abstract

"composição farmacêutica líquida, conjugado, processo para preparação e utilização de uma composição, processo para o tratamento e prevenção de enfermidades que envolvem anemia e dispositivo para liberação local e sistêmica sustentada de uma composição". a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica líquida que compreende uma proteína de eritropoetina, um ânion inorgânico carregado múltiplo em um amortecedor aceitável farmaceuticamente adequado para manter o ph da solução na faixa de cerca de 5,5 até cerca de 7,0, e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. esta composição especialmente útil para a profilaxia e tratamento de enfermidades relacionadas com a eritropoese.

Description

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA LÍQUIDA, PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA MESMA E USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA" A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica liquida que compreende uma proteína de eritropoietina (ou eritropoetina), um ânion inorgânico de carga múltipla em um tampão farmaceuticamente aceitável adequado para manter o pH da solução na faixa de cerca de 5,5 a cerca de 7,0, e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Esta composição é especialmente útil para a profilaxia e o tratamento de enfermidades relacionadas à eritropoiese. A eritropoiese consiste na produção de células vermelhas do sangue que ocorre para compensar a destruição das células. A eritropoiese é um mecanismo fisiológico controlado que permite que células vermelhas do sangue fiquem disponíveis para oxigenação do tecido apropriada. A eritropo-íetina humana que se apresenta naturalmente (hEPO) é produzida no rim e é o fator de plasma humoral que estimula a produção das células vermelhas do sangue (Carnot, P. e Deflandre, C. (1906); C.R. Acad. Sei. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E., Freid, W. e Plzak, LF (1957), Nature 179: 6331-4). A EPO que se apresenta naturalmente estimula a divisão e a diferenciação de progenitores eri- tróides encarregados na medula óssea e exerce sua atividade biológica pela ligação a receptores em precursores eritróides (Krantz, BS (1991) Blood 77:419). A eritropoetina tem sido manufaturada bi-ossinteticamente utilizando-se tecnologia de DNA recom-binante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) e é o produto de um gene de EPO humano clonado inserido e espremido nas células do tecido ovariano do hamster chinês (células CHO) . A estrutura principal da forma de hEPO predominante, plenamente processada, encontra-se ilustrada na SEQ ID N0:1. . Existem duas ligações de bissulfureto entre Cys7-Cys161 e Cys29-Cys33. 0 peso molecular da cadeia de polipeptidio da EPO humana sem as metades de açúcar é 18.236 Da. Na molécula de EPO intacta, aproximadamente 40% do peso molecular é responsável pelos grupos de carboidratos que promovem a glicosilação da proteína nos locais de glicosilação na proteína (Sasa-ki, H, Bothner, B, Dell, A e Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Uma vez que a eritropoetina é essencial na formação das células vermelhas do sangue, o hormônio é de utilidade no tratamento de distúrbios sangüíneos caracterizados por uma produção de células vermelhas do sangue baixa ou defeituosa. Clinicamente, a EPO é utilizada no tratamento de, por exemplo, anemia em pacientes de deficiência renal crônica (CRF)(Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al (1987) NEJM 316: 73-78; Es- chbach, JW, Abdulhadi, MH, Brownw, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. In-tern. Med. 110: 108-114) e em pacientes de AIDS e câncer submetidos a quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abeis, RI In: MB, Garnick, ed. Erytropoietin in Clinicai Applications - An International Perspective. New York, NY: Marcei Dekker; 1990: p. 301-324).

As composições farmacêuticas conhecidas têm pelo menos uma das seguintes desvantagens: - elas são constituídas de liofilizados. Além do procedimento de manufatura complicado, os liofilizados têm a desvantagem de terem de ser reconstituídos antes da injeção em seres humanos. Isto torna necessário manuseio adicional por pessoal clínico, o que é inconveniente e apresenta o risco de um manuseio incorreto do produto farmacêutico; - elas contêm albumina de soro humano como um aditivo. Uma vez que a albumina de soro humano é um produto derivado de fluido de corpo humano, existe um risco de infecções virais por agentes de contaminação no preparado da albumina. Além disso, são possíveis reações alérgicas; - todas as composições de eritropoetina que presentemente se encontram comercialmente disponíveis são instáveis a temperaturas elevadas, isto é, acima da temperatura de refrigerador que se situa usualmente entre 2 e 8°C. Conseqüentemente, elas têm de ser armazenadas em um refrigerador a (2-8°C) e não podem ser armazenadas à temperatura ambiente (em torno de 20°C) . Isto dá origem a custos aumentados, provocados pelo armazenamento e transporte a baixa temperatura e também ocasiona inconveniência no manuseio do produto. Instável neste contexto significa que armazenamento a temperaturas elevadas, por exemplo, 25°C durante um período de tempo prolongado (isto é, vários meses, ou mais de 6 meses) conduz à degradação da proteína. A degradação neste contexto descreve alterações físicas (por e-xemplo, agregação ou desnaturação) e alterações químicas (por exemplo, oxidação ou modificação das ligações químicas em geral) da molécula de proteína que são sabidas o-correrem preferentemente a temperaturas e-levadas (superiores a 8°C). AQ incubação de uma proteína próxima ou acima da sua temperatura de transição (que também é chamada de temperatura de fusão) conduz a desdobramento da proteína, isto é, perdem-se a estrutura nativa e a atividade biológica do polipeptidio. A temperatura de transição encontra-se fortemente relacionada com a estabilidade de temperatura da proteína e é dependente do ambiente da proteína (por e-xemplo, pH, sais, resistência iônica, substância amortecedora, e assemelhados). Por exemplo, a desnaturação pode conduzir à a-gregação das moléculas de eritropoetina, isto é, formação de dímeros (covalentes ou não covalentes) , agregados de ordem mais alta e ainda particulados. Isto conduz a potência reduzida da droga e poderá induzir efeitos colaterais indesejáveis depois da injeção em seres humanos. 0 problema subjacente da presente invenção consiste, portanto, em proporcionar uma composição que é capaz de reduzir ao mínimo ou suprimir as desvantagens mencionadas anteriormente. 0 problema é solucionado, de acordo com a presente invenção, pela provisão de uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de eritropoetina, um ânion inorgânico carregado múltiplo em uma solução amortecedora de pH de cerca de 5,5 até cerca de 7,0, e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Constatou-se surpreendentemente que a formulação de uma eritropoetina nesta composição aperfeiçoa a sua estabilidade a temperaturas superiores às temperaturas de refrigerador (2-8°C) , especialmente a temperatura ambiente )isto é, abaixo de 25°C) e ainda sob temperaturas mais elevadas, por exemplo, 40°C) . Isto significa que a composição pode ser armazenada sem refrigeração durante período de tempo prolongado, sem perder capacidade de atividade significativa e sem degradação significativa. A não ser que de outro modo indicado, as definições seguintes são expostas para ilustrarem e definirem o significado e escopo dos vários termos utilizados para descreverem a invenção neste contexto. 0 Termo "ânion inorgânico carregado múltiplo" refere-se a um ânion inorgânico dotado de duas ou mais cargas negativas por molécula, por exemplo, sulfato S042~, ou um ânion de fosfato, isto é, hidrogenfosfa-to HP042-. 0 ânion inorgânico carregado múltiplo pode ser adicionado na forma de um sal correspondente, por exemplo, o sal de sódio o sal de potássio e as suas misturas, e/ou na forma de substâncias amortecedoras, por exemplo, amortecedor de fosfato. 0 termo "isoosmolar ou isotônica" refere-se a uma solução que pode ser misturada com fluidos corpóreos sem afetar os seus constituintes. As soluções que são isotônicas com o sangue, tais como cloreto de sódio 0,9%, têm a mesma pressão osmótica que o soro e elas não afetam as membranas das células vermelhas do sangue. De uma maneira geral, as soluções que são isotônicas com o sangue são cerca de 290 mosm/kg H20. 0 termo "ácido inorgânico forte" Refere-se aos ácidos orgânicos gue mostram a de 20 a 100% dissociação em uma solução IN, por exemplo, H2S04.

Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o amortecedor ou os sais são aceitáveis sob o ponto de vista de toxicidade. O termo "diluente" significa um ingrediente em um preparado medicinal ao qual falta atividade farmacológica, mas que é farmaceuticamente necessário ou desejável. Por exemplo, um diluente pode ser um liquido para o dissolvimento da(s) droga(s) a ser injetada, por exemplo, água. O termo "solventes" refere-se a um liquido que mantém uma outra substância em solução, isto é, dissolve a mesma, por exemplo, água. 0 termo "preservativos" refere-se a uma substância adicionada a uma composição farmacêutica para evitar o crescimento bacteriano, por exemplo, cloreto de benzalcônio ou álcool benzílico. O termo "poliol" refere-se a qualquer substância com diversos grupos hidroxila, incluindo ál-coois poliidricos e carboidratos. Os álcoois poliídri-cos incluem compostos tais como sorbitol, manitol e glicerol. Os carboidratos são moléculas ciclicas que poderão ter um grupo ceto ou aldeido, como, por exemplo, sacarina ou trealose. 0 termo "eritropoetina" ou "proteína de eritropoetina" refere-se a uma proteína com a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue e selecionada a partir do grupo que consiste de eritropoetina humana e análogos que se encontram definidos adiante. 0 termo "eritropoetina pegilada (Peg-EPO ou PEG-EPO)" refere-se a uma proteína de eritropoetina que é encadeada covalentemente com um a três derivados de polietileno conforme descritos adiante. 0 termo "dispositivo" significa um expediente para um propósito específico. Na presente invenção o propósito é possibilitar, suportar ou facilitar a administração dà composição farmacêutica líquida.

Descrição dos Desenhos: Figura 1: Estrutura de EPO humana principal (165 aminoácidos) (SEQ ID N0:1).

Figura 2: Estrutura de EPO humana principal (166 aminoácidos) (SEQ ID N0:2).

Figura 3: Influência de pH na estabilidade térmica. A temperatura de transição é marcada contra o pH.

Figura 4: Influência de resistência iônica na estabilidade térmica. A temperatura de transição está marcada contra a concentração de fosfato.

Figura 5: Dependência de estabilidade térmica na substância amortecedora. A Figura 6 mostra que o sulfato também é amortecedor/aditivo adequado sob um baixo pH (por exemplo, pH 6,2), enquanto que o fosfato é menos adequado sob pH 6,2 em comparação com o pH 7,5. Isto mostra que o sulfato mantém a estabilidade térmica elevada, mesmo sob baixo pH.

Figura 7: Dependência da agregação peg-EPO no pH. As amostras peg-EPO depois de tensão térmica (tal como descritas anteriormente) foram analisadas por SDS-PAGE. As proteínas foram manchadas com prata. Faixa 1: padrão de peso molecular. Faixa 2: pH 5. Faixa 3: pH 5, reduzido. Faixa 4: pH 6. Faixa 5: pH 6, reduzido. Faixa 6: pH 6,5. Faixa 7: pH 6,5, reduzido. Faixa 7: pH 7. Faixa 9: pH 7, reduzido. Faixa 10: peg-EPO, não sob tensão. A Figura 8 mostra que o uso de 1 mg/ml de acetilcisteína como um antioxidante impede a formação de agregados sob tensão térmica. Agregação de peg-EPO sob tensão térmica (20 min. 80°C): Faixa 1: peg-EPO sob pH 7,5, não sob tensão; Faixa 2: peg-EPO sob pH 7,5, sob tensão; Faixa 3: peg-EPO sob pH 6,2, sob tensão; Faixa 4: peg-EPO sob pH 6,2, sob tensão, reduzido; Faixa 5: peg-EPO sob pH 7,5, + 1 mg/ml N-acetil-cisteína, sob tensão; Faixa 6: peg-EPO sob pH 7,5, +1 mg/ml N-acetil-cisteína, sob tensão, reduzida.

Figura 9: Teor de ácido siálico (NANA) de amostras de peg-EPO em novas formulações, armazenadas durante seis meses a várias temperaturas.

Figura 10: Ensaio de amostras de peg-EPO de bioatividade em rato, depois de armazenamento em fosfato de sódio 10 mM, sulfato de sódio 40 mM, manitol 3% (p/v), pH 6,2 durante 6 meses sob diversas temperaturas .

Figura 11: Cromatograma de exclusão de dimensão de sobreposição de amostras de peg-EPO armazenadas durante 6 meses em fosfato de sódio 10 mM, sulfato de sódio 40 mM, manitol 3% (p/v), pH 6,2 (de baixo para cima: amortecedor, material de partida, 4°C, 25°C, 30°C e 40°C).

De uma maneira mais detalhada, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica liquida a qual compreende uma proteína de eritropoetina, um ânion inorgânico de múltipla carga em um amortecedor farmaceuticamente aceitável adequado para manter o pH da solução na faixa de cerca de 5,5 até cerca de 7,0 e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com uma concretização preferida, a composição compreende uma solução líquida, por exemplo, uma solução aquosa. De acordo com uma concretização preferida da invenção, as composições farmacêuticas são soluções isotônicas. O ânion é preferentemente selecionado a partir de ânions de ácidos inorgânicos fortes, tais como H2S04, H3PO4 ou ácido cítrico. Conseqüentemente, os ânions preferidos são selecionados a partir do grupo que consiste de sulfato, fosfato e citrato, preferente- mente sulfato ou fosfato, e com maior preferência sulfato. A concentração do ânion de múltipla carga pode variar entre 10 e 200 mmol/1, por exemplo, para o ânion de sulfato entre 10 e 200 mmol/1. O amortecedor a ser usado na presente invenção para manter o pH na faixa de cerca de 5,5 até cerca de 7,0, de preferência na faixa de 5,8 a 6,7, com maior preferência na faixa de 6,0 a 6,5 e ainda com maior preferência a cerca de pH 6,2, pode compreender os amortecedores convencionais de ácidos orgânicos ou inorgânicos (por exemplo, amortecedor de fosfato, amortecedor de arginina/H2S04/Na2S04, ou qualquer outro sistema amortecedor farmaceuticamente aceitável). Em uma concretização preferida, a composição compreende um a-mortecedor de fosfato ou um amortecedor de argini-na/H2S04/Na2S04, com maior preferência um amortecedor de fosfato de 10 a 50 mmol/1. Naturalmente, combinações destes sistemas amortecedores são igualmente partes da presente invenção. 0 valor de pH poderá ser ajustado com uma base correspondente, por exemplo, NaOH no sistema de amortecedor de fosfato e um ácido correspondente, por exemplo, ácido sulfúrico no sistema amortecedor de arginina, respectivamente.

As composições da presente invenção poderão compreender um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Estes excipientes farmaceuticamente a-ceitáveis podem ser selecionados a partir de sais, di-luentes e/ou solventes e/ou preservativos e outros far- maceuticamente aceitáveis, por exemplo, agentes de to-nicidade (agentes de preparo isotônico), polióis, anti-oxidantes ou detergentes não-iônicos. Exemplos destas substâncias compreendem cloreto de sódio, cloreto de cálcio, sorbitol, manitol, glicerol, sacarose, trealo-se, acetilcisteina, polissorbato 20, polissorbato 80, ou pluronic F68.

De acordo com uma concretização preferida da presente invenção as composições farmacêuticas poderão conter um poliol selecionado a partir do grupo que consiste de manitol, sorbitol, glicerol, trealose e sacarose, preferencialmente manitol. A concentração do poliol poderá variar entre 1 e 10% (p/v).

Exemplos de antioxidantes são cisteina, metionina, acetilcisteina ou ácido ascórbico, preferen-temente metionina. Os antioxidantes podem usualmente ser adicionados em uma concentração entre 0,01 e 0,5% (p/v) ou, por exemplo, no caso de metionina, em uma concentração de 1-20 mM.

Da mesma maneira, as composições descritas anteriormente poderão compreender opcionalmente um a-gente de preparo isotônico de cerca de 0,01 ac 0,9% p/p. Estes compostos são conhecidos na técnica; exemplos destes agentes são cloreto de sódio ou sulfato de sódio. Em uma concretização preferida da presente invenção as composições são soluções isotônicas. A composição mencionada acima poderá conter também um detergente não-iônico, tal como polissorbato 20, polissorba- to 80 ou pluronic F68, preferencialmente Pluronic F68, por exemplo, até 1% (p/v) , com maior preferência até 0,1% (p/v), por exemplo, 0,001 a 0,01% (p/v). A composição exposta anteriormente poderá conter igualmente sais adicionais, por exemplo, até 1 mmol/1 CaCl2. A presente invenção é especialmente útil para o preparo de composições farmacêuticas que compreendem eritropoetina como ingrediente farmaceuticamente ativo. O termo "eritropoetina" ou "proteína de eritropoetina" ou "EPO" é o seguinte: particularmente os termos referem-se a uma glicoproteína, por exemplo, a eritropoetina humana, por exemplo, tendo a seqüência de aminoácidos exposta em (SEQ ID NO: 1) ou (SEQ ID NO: 2) ou uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga às mesmas, cujas propriedades biológicas relacionam-se com o estímulo da produção de células vermelhas do sangue na medula óssea. Da maneira que são utilizados por todo este contexto, estes termos incluem proteínas modificadas deliberadamente, tal como, por exemplo, mediante mutagênese orientada ao local ou acidentalmente através de mutações. Estes termos também incluem análogos dotados de 1 a 6 locais adicionais para glicosilação, análogos que têm pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminal carboxilo da glicoproteína, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um local de glicosilação, e análogos dotados de uma seqüência de aminoácidos que incluem uma reordenação de pelo menos um local para glicosilação. Estes termos incluem eritropoetina humana tanto natural quanto produzida de forma recombinante.

Tal como estabelecido mais adiante, a preparação e a purificação da EPO são amplamente conhecidas na técnica. Por eritropoetina entende-se a proteína natural ou recombinante, preferentemente humana, conforme obtida a partir de qualquer fonte convencional tal como tecidos, síntese de proteína, cultura de células com células naturais ou recombinantes. Qualquer proteína seja dotada da atividade de eritropoetina, tais como muteínas ou proteínas de outro modo modificadas, estão abrangidas. A EPO recombinante pode ser preparada por meio de expressão nas linhas de células CHO-, BHK- ou HeLa, por tecnologia de DNA recombinante ou por ativação de genes endógenos. A expressão de proteínas, incluindo por ativação de genes endógenos, é amplamente conhecida na técnica e encontra-se exposta, por exemplo, nas patentes U.S. N°s 5.733.761, 5.641.670 e 5.733.746, e nas publicações de patentes internacionais Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 e WO 91/09955, ficando o conteúdo de cada uma delas incorporado neste contexto por referência. As espécies de EPO preferidas para a preparação de produtos de glicoproteína de eritropoetina são as espécies de EPO humana. Com maior preferência, a espécie de EPO é a EPO humana que tem a seqüência de aminoácidos exposta na (SEQ ID NO:l) ou na (SEQ ID NO: 2) ; com maior preferência, a EPO humana que tem a se-qüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1).

Além disso, a eritropoetina poderá ser um análogo de glicoproteina dotado de 1 a 6 locais adicionais para glicosilação. A glicosilação de uma proteína, com um ou mais grupos de oligossacarídeos, ocorre em locais específicos ao longo de uma espinha dorsal de polipeptídios e afeta enormemente as propriedades físicas da proteína, tais como estabilidade da proteína, secreção, localização subcelular, e atividade biológica. A glicosilação é usualmente de dois tipos. Os o-ligossacarídeos de ligação "0" são presos aos resíduos de serina ou treonina e os oligossacarídeos de ligação "N" são presos aos resíduos de asparagina. Um tipo de oligossacarídeo encontrado nos oligossacarídeos de ligação "N" e de ligação "O" é o ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), que é uma família dos amino açúcares que contêm 9 ou mais átomos de carbono. 0 ácido siálico é usualmente o resíduo terminal dos oligossacarídeos de ligação "N" e de ligação "0" e, porque ele comporta uma carga negativa, confere propriedades ácidas à glicoproteina. A eritropoetina humana, dotada de 165 aminoácidos, contém três cadeias de oli-gossacarídeos de três ligações "N" e uma ligação "0" que compreendem cerca de 40% do peso molecular total da glicoproteina. A glicosilação de ligação "N" ocorre nos resíduos de asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83, e a glicosilação de ligação "0" ocorre em um resíduo de serina localizado na posição 126. As cadeias de oligossacarídeos são modificadas com resíduos de ácido siálico terminais. A remoção enzimática de todos os resíduos de ácido siálico a partir da eritropoetina glicosilada resulta na perda de atividade in vivo, mas não na atividade in vitro porque a sialilação da eritropoetina impede a sua aglutinação, e subseqüente liberação, pela proteína de aglutinação hepática. 0 termo "eritropoetina" da presente composição farmacêutica inclui análogos da eritropoetina humana com uma ou mais mudanças na seqüência de aminoáci-dos da eritropoetina humana, que resultam em um aumento no número de locais para fixação de ácido siálico. Estes análogos de glicoproteína podem ser gerados por mu-tagênese orientada ao local dotada de adições, remoções, ou substituições de resíduos de aminoácidos que aumentam ou alteram locais que se encontram disponíveis para glicosilação. Análogos de glicoproteínas dotados de níveis de ácido siálico maiores do que aqueles encontrados na eritropoetina humana são gerados pela adição de locais de glicosilação que não perturbam a conformação secundária ou terciária requerida para atividade biológica. As glicoproteínas da presente invenção também incluem análogos dotados de níveis de fixação de carboidratos aumentados em um local de glicosilação que usualmente envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos em estreita proximidade com um local de ligação de "N" ou ligação de "0". As glicoproteínas da presen- te invenção também incluem análogos que são dotados de um ou mais aminoácidos que se estendem a partir da extremidade terminal de carboxilo da eritropoetina e que proporcionam pelo menos um local de carboidrato adicional . As proteínas de eritropoetina da presente composição também incluem análogos que são dotados de uma seqüência de aminoácidos que inclui a reorganização de pelo menos um local para glicosilação. Essa reorganização de local de glicosilação envolve a remoção de um ou mais locais de glicosilação na eritropoetina humana e a adição de um ou mais locais de glicosilação que se apresentam não naturalmente. 0 aumento do número de cadeias de carboidratos na eritropoetina e, conseqüen-temente, o número de ácidos siálicos por moléculas de eritropoetina podem conferir propriedades vantajosas, tais como solubilidade aumentada, uma maior resistência à proteólise, imunogenicidade reduzida, semivida de soro aumentada, e atividade biológica aumentada. Os análogos de eritropoetina com locais de glicosilação adicionais encontram-se expostos de uma maneira mais detalhada no pedido de patente européia 640.619, de Elliot, publicado em 1 de março de 1995.

De acordo com uma concretização preferida, a composição farmacêutica da presente invenção compreende proteínas de eritropoetina com uma seqüência de aminoácidos que inclui pelo menos um local adicional para glicosilação tal como, sendo que não se fica limitado às mesmas, eritropoetinas que compreendem a se- qüência da eritropoetina humana modificada por uma mo dificação selecionada a partir das seguintes: Asn30Thr32;

Asn51Thr53, Asn57Thr59;

Asn69;

Asn69Thr71;

Ser68Asn69Thr71;

Val87Asns8Tlir90;

Ser^Asn^hr90;

Ser87Asn88Gly89Thr90;

Ser87Asn88Thr90Thr92;

Ser87Asn88Thi90Aia162;

Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;

Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; ΑβΛίΛΤιτ91;

Ser87Asn89Ile90Thr91;

AsnI36Thr138;

Asnl38Thr140;

Tbr125; e Pro124Thr125. A notação utilizada neste contexto para modificação da seqüência de aminoácidos significa que a (s) posição(ões) da(s) proteína(s) não modificada(s) correspondente (s) (por exemplo, hEPO da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2) indicada pelos números sobrescritos é alterada para o(s) aminoácido(s) que imediatamente prece- dem o(s) número(s) sobrescrito (s) respectivo. A proteína de eritropoetina também pode ser um análogo que tem pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminal carboxílica da glicoproteí-na, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um local de glicosilação. 0 aminoácido adicional poderá compreender um fragmento de peptídeo derivado da extremidade terminal carboxílica da gonadotropina coriônica humana. De preferência, a glicoproteína é um análogo selecionado a partir do grupo que consiste de (a) eritropoetina humana que tem a seqüência de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro (SEQ ID NO: 3), que se estende a partir do término car-boxílico; (b) o análogo em (a) compreendendo ainda Ser87 Asn88 Thr90 EPO; e (c) o análogo em (a) compreendendo ainda Asn30 Thr32 Vai87 Asn88 Thr90 EPO. A proteína de eritropoetina humana também poderá ser dotada de uma seqüência de aminoácidos que inclui uma reordenação de pelo menos um local para glicosilação. A reordenação pode compreender uma supressão de qualquer um dos locais de carboidratos de ligação "N" na eritropoetina humana e uma adição de um local de carboidrato de ligação "N" na posição 88 da seqüência de aminoácidos da eritropoetina humana. De preferência, a glicoproteína está na forma de um análogo selecionado a partir do grupo que consiste de Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; e Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.

Mais particularmente, a proteína de eri-tropoetina da presente composição farmacêutica tal como descrita anteriormente poderá incluir igualmente os seus derivados pegilados. Os derivados pegilados da eritropoetina e a sua preparação são conhecidos na técnica e encontram-se descritos, por exemplo, na EP-A-539.167, EP-A-605.963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, patente U.S. N° 5.56, EP-A-584.876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, patentes U.S. N°s 5.359.030 e 5.681.811, patente U.S. N° 4.179.337, patente japonesa, WO 98/32466, patente U.S. N° 5.324.650. Uma concretização preferida das espécies de eritropoetina pegilada refere-se aos derivados conforme descritos mais adiante.

Consequentemente, a presente invenção refere-se igualmente a um conjugado de eritropoetina, o dito conjugado compreendendo uma glicoproteína de eritropoetina tal como descrito anteriormente dotado de pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoetina humana e seus análogos que têm a seqüência de eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordena-ção de pelo menos um local de glicosilação, sendo a dita eritropoetina ligada covalentemente a "n" grupos po- li-(etileno glicol) da fórmula —CO-(CH2)x-(OCH2)m-OR com o -CO (isto é, carbonilo) de cada grupo de poli (etileno glicol) formando uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; em que R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m varia de cerca de 450 a cerca de 900; n varia de 1 a 3; e n e m são selecionados de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicopro-teína de eritropoetina varia de 20 quilodáltons a 100 quilodáltons. A invenção proporciona, outrossim, composições farmacêuticas as quais contêm os conjugados descritos neste contexto, em que a percentagem de conjugados em que n é 1 compreende pelo menos noventa por cento, de preferência pelo menos noventa e dois por cento, ou preferencialmente noventa e seis por cento de todos os conjugados da composição.

Mais especificamente, os conjugados descritos anteriormente podem ser representados pela fórmula (I) (I) em que P é o resíduo de uma proteína de eritropoetina tal como descrita neste contexto, (isto é, sem o grupo amino ou os grupos amino que formam uma ligação de amida com o carbonilo ilustrado na Fórmula I), tendo a a-tividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue; e em que R é alquila infe- rior; x é 2 ou 3; m varia de 450 até cerca de 900; n varia dela3, enem são selecionados de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteina de eritropoetina seja de 20 quilodáltons a 100 quilo-dáltons.

Da maneira que é utilizado neste contexto, "alquila inferior" significa um grupo alquila linear ou ramificada que é dotada de uma seis átomos de carbono. Exemplos de grupos de alquila inferior incluem metilo, etilo e isopropilo. De acordo com esta invenção, R é qualquer alquila inferior. Preferem-se os conjugados em que R é metilo. 0 símbolo "m" representa o número de resíduos de óxido de etileno (OCH2CH2) no grupo de poli (óxido de etileno). Uma única subunidade de PEG (po-lietileno glicol)de óxido de etileno é dotada de um peso molecular de cerca de 44 dáltons. Assim, o peso molecular do conjugado (excluindo-se o peso molecular da EPO) depende do número "m". Nos conjugados desta invenção "m" varia entre cerca de 450 até cerca de 900 (correspondente a um peso molecular de cerca de 20 kDa até cerca de 40 kDa), preferencialmente entre cerca de 650 até cerca de 750 (correspondente a um peso molecular de cerca de 30 kDa) . 0 número m é selecionado de uma maneira tal que o conjugado resultante desta invenção possui uma atividade fisiológica comparável à EPO não modificada, atividade essa que pode representar a mesma, maior do que, ou uma fração da atividade corres- pondente da EPO não modificada. Um peso molecular de "cerca de" um determinado número significa que se encontra dentro de uma faixa razoável desse número conforme determinado por técnicas analíticas convencionais. O número "m" é selecionado de maneira tal que o peso molecular de cada grupo de poli(etileno glicol) ligado covalentemente à glicoproteína de eritropoetina varia entre cerca de 20 kDa até cerca de 40 kDa, e compreende preferentemente cerca de 3- kDa.

Nos conjugados desta invenção, o número "n" é o número de grupos de poli(etileno glicol) ligados covalentemente aos grupos amino livres (incluindo os grupos ε-amino de um aminoácido de lisina e/ou do grupo amino terminal) de uma proteína de eritropoetina Por intermédio de ligações de amida. Um conjugado desta invenção poderá ter um, dois ou três grupos PEG por molécula de EPO. "n" é um inteiro que varia de 1 a 3, pref erentemente "n" é 1 ou 2, e com maior preferência "n" é 1. Um conjugado preferido dos conjugados descritos anteriormente compreende compostos em que x é 2, m varia de 650 a 750, n é 1 e R é metilo. O composto da fórmula (I) pode ser preparado a partir de material polimérico conhecido: 00 em que R e m são tais como descritos anteriormente, pela condensação do composto da Fórmula (II) com a glico-proteína de eritropoetina. Os compostos da fórmula (I-I) em que x é 3, compreende os ésteres de succinimidil de poli(etileno glicol) de ácido butirico alcoxilo alfa- inferior, (alcoxilo inferior-PEG-SBA). Os compostos da fórmula (II) em que x é 2 compreende os ésteres de succinimidil de poli(etileno glicol) de ácido propiôni-co alcoxilo alfa-inferior, (alcoxilo inferior-PEG-SPA). Poderá ser utilizado qualquer processo convencional para se fazer reagir um éster estimulado com uma amina para se formar uma amida. Na reação descrita anteriormente, o éster de succinimidil exemplificado é um grupo residual que provoca a formação da amida. 0 uso de ésteres de succinimidil tais como os compostos da fórmula II para produzirem conjugados com proteínas encontra-se exposto na patente U.S. N° 5.672.662, concedida em 30 de setembro de 1997 (Harris, et al.). A EPO humana contém nove grupos amino livres, o grupo amino amino-terminal mais os grupos ε-amino de 8 resíduos de lisina. Quando o reagente de pegilação foi combinado com um composto SBA da Fórmula II, constatou-se que sob pH 7,5, uma relação proteína: PEG de 1:3, e uma temperatura de reação de 20-25°C, foram produzidas uma mistura de mono-, di- e quantidades residuais das espécies tri-pegiladas. Quando o reagente de pegilação foi o composto SPA da Fórmula II, sob condições semelhantes com a exceção de que a rela- ção proteína:PEG foi de 1:2, produz-se principalmente a espécie mono-pegilada. A EPO pegilada pode ser administrada como uma mistura, ou como a espécie pegilada diferente separada por cromatografia de permuta catiô-nica. Pela manipulação das condições de reação (por exemplo, relação de reagentes, pH, temperatura, concentração de proteínas, tempo de reação e outros), as quantidades relativas das diferentes espécies pegiladas poderão ser variadas.

As composições farmacêuticas, tais como descritas anteriormente, poderão conter também uma proteína de eritropoetina tal como definida anteriormente que é dotada de pelo menos um grupo amino livre e que é dotada da atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reti-culócitos e de células vermelhas do sangue, e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoetina humana e seus análogos que têm a estrutura principal da eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação; sendo a dita glicoproteína ligada covalentemente a de um a três grupos de poli (etileno glicol) alcoxilo inferior, com cada grupo de poli(etileno glicol) sendo ligado covalentemente à glicoproteína por intermédio de um ligante da fórmula -C(0)-X-S-Y-, com o C(0) do ligante formando uma aglutinação de amida com um dos referidos grupos amino, X é -(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-, em que k varia de 1 até cerca de 10, Y é o peso molecular médio de cada metade de poli(etileno glicol) varia de cerca de 20 quilodãltons até cerca de 40 quilodãltons, e o peso molecular do conjugado varia de cerca de 51 quilodãltons até cerca de 175 quilodál-tons.

Esta espécie de eritropoetina também pode ser representada pela fórmula (III) (III) em que R poderá ser qualquer alquila inferior, pelo que se entende um grupo de alquila linear ou ramificada dotada de um a seis átomos de carbono tais como metilo, etilo, isopropilo, e outros. Uma alquila preferida é metilo. X poderá ser -(CHahr ou -CH2(0-CH2-CH2)k-/ em que k varia de 1 até cerca de 10. De preferência, k varia de 1 até cerca de 4, com maior preferência k é 1 ou 2. Com maior preferência X é -(CH2).

Na fórmula I, Y ê de preferência, com maior preferência, Na Fórmula (III), o número m é selecionado de maneira tal que o conjugado resultante da fórmula (III) possui uma atividade fisiológica comparável à da EPO não modificada, atividade essa que pode representar a mesma, mas do que, ou uma fração da atividade correspondente da EPO não modificada. O m representa o número de resíduos de óxido de etileno na unidade PEG. Uma única sub-unidade PEG de - (OCH2CH2) - tem um peso mole- cular de cerca de 44 dáltons. Desta maneira, o peso molecular do conjugado (excluindo-se o peso molecular da EPO) depende do número m. Um peso molecular de "a-proximadamente" um certo número significa que se encontra dentro de uma faixa razoável desse número, conforme determinado por meio de técnicas analíticas convencionais. 0 m é um inteiro que varia entre cerca de 450 até cerca de 900 (correspondente a um peso molecular de 20 a 40 kDa), de preferência m varia entre cerca de 550 até cerca de 800 (cerca de 24 a 35 kDa) , e com maior preferência, m varia entre cerca de 650 até cerca de 700 (cerca de 29 até cerca de 31 kDa).

Na fórmula (III), o número n é o número de grupos ε-amino de um aminoácido de lisina em uma proteína de eritropoetina aglutinada covalentemente a uma unidade PEG por intermédio de uma ligação de amida. Um conjugado desta invenção poderá ser dotado de uma, duas, ou três unidades PEG por molécula de EPO. O n é um inteiro que varia de 1 a 3, de preferência n é 1 ou 2, e com maior preferência, n é 1.

As proteína de eritropoetina da fórmula (III) são representados pelas fórmulas: Os produtos de glicoproteína de eritropoe-tina de maior preferência são representados pela fórmula: em que nas fórmulas expostas anteriormente n é um inteiro de 1 a 3; m é um inteiro de 450 a 900; R é alqui-la inferior; X é -(Chfejk- ou -CH2(0-CH2-CH2)i<-, e P é o resíduo da glicoproteína de eritropoetina sem o grupo a-mino ou grupos que formam uma ligação de amida com X.

Outros produtos de glicoproteína de eritropoetina preferidos encontram-se representados pelas fórmulas: Os produtos de glicoproteína de eritropoe-tina de maior preferência encontram-se representados pela fórmula: Estas proteína de eritropoetina podem ser preparadas por: (a) fazendo reagir covalentemente um grupo ε-amino de um ácido amino de lisina de uma proteína de eritropoetina representado pela fórmula, P-[NH2]nr com um reagente bifuncional representado pela fórmula, Z-CO-X-S-Q, para formar um intermediário com uma ligação de amida representada pela fórmula: em que P é uma proteína de eritropoetina menor do que o grupo amino que forma uma ligação de alida; n é um inteiro que varia de 1 a 3; Z é um grupo reativo, por e- xemplo, um éster carboxí lico-NHS; X é -(CH2)k- ou -CH2 (0-CH2-CH2) em que k varia de 1 até cerca de 10; e Q é um grupo de proteção, tal como alcanoíla, por exemplo, acetil. (b) fazer reagir covalentemente o intermediário com uma ligação de amida proveniente da etapa (a) com um derivado de polietileno glicol ativado, representado pela fórmula, W-fOCHhChhlm-OR, para formar um produto de glicoproteina de eritropoetina representado pela fórmula: em que W é uma forma reativa sulfidrilica de Y; m é um inteiro que varia entre cerca de 450 até cerca de 900; R é alquila inferior; e Y é tal como se encontra definido anteriormente.

Nesta concretização, o reagente bifuncio-nal é preferentemente N-succinimidil-S-acetiltiopropi-onato ou N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z é preferentemente N-hidróxi-succinimida, e o derivado de polietileno glicol ativado W-[OCH2CH2]m-OR é selecionado preferentemente a partir do grupo que consiste de iodo-acetil-metóxi-PEG, metóxi-PEG-vinilsulfona, e metóxi-PEG-maleimida.

De uma maneira mais detalhada, as protei- nas de eritropoetina da fórmula (III) podem ser preparadas pela ligação covalente de grupos tiol à EPO ("a-tivação") e acoplamento da EPO ativada resultante com um derivado de poli(etileno glicol)(PEG). A primeira etapa para a preparação da EPO pegilada de acordo com a presente invenção compreende a ligação covalente de grupos tiol com grupos NH2 de EPO. Esta ativação de EPO é realizada com reagentes bifuncionais que transportam um grupo tiol protegido e um grupo reativo adicional, tais como ésteres ativos (por exemplo, um éster de succinimidil), anidridos, ésteres de ácidos sulfôni-cos, halogenetos de ácidos carboxilicos e ácidos sulfô-nicos, respectivamente. 0 grupo tiol é protegido por grupos conhecidos na técnica, por exemplo, grupos ace-til. Estes reagentes bifuncionais são capazes de reagir com os grupos ε-amino dos ácidos amino lisina pela formação de uma ligação de amida. A primeira etapa da reação encontra-se exposta em seguida: EPO, n e X são tais como definidos anteriormente e Z é um grupo reativo conhecido na técnica, por exemplo, um substituinte de N-hidróxi-succinima (NHS) com a fórmula : De acordo com uma concretização preferida, a ativação dos grupos de ε-amino lisina é realizada mediante reação com reagentes bifuncionais que são dotados de uma metade succinimidil. Os reagentes bifuncionais podem transportar diferentes espécies de espaçado-res, por exemplo, metades -(CH2)r ou -CH2-(0-CH2-CH2-)k-, em que k varia de 1 até cerca de 10, de preferência de 1 até cerca de 4, e com maior preferência, 1 ou 2, e com maior preferência, 1. Exemplos destes reagentes são N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) e N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) . Éster de -NHS-acetiltioalquil-carboxílico, tal como Éster -NHS- de ácido 2-(acetiltio)-(etóxi)k-acético, em que k é tal como ficou definido anteriormente. A preparação dos reagentes bifuncionais é conhecida na técnica. Os precursores de ésteres -NHS-de ácido 2- (acetiltio)-(etóxi)k-acético encontram-se descritos na DE-3924705, enquanto a derivação para o composto acetiltio encontra-se descrita por March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. 0 SATA encontra-se disponível comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA e Pierce, Rockford, IL). 0 número de grupos tiol a serem adicionados a uma molécula EPO pode ser selecionado pela ajus-tagem dos parâmetros de reação, isto é, a concentração da proteína (EPO) e a relação proteína/reagente bifun-cional. De preferência, a EPO é ativada mediante ligação covalente de 1 a 5 grupos tiol por molécula de EPO, com maior preferência, de 1,5 a 3 grupos tiol por molécula de EPO. Estas faixas referem-se à distribuição estatística do grupo tiol sobre a população de proteínas de EPO.

A reação é realizada, por exemplo, em uma solução amortecedora aquosa, pH 6,5-8,0, por exemplo, em 10 mM fosfato de potássio, 50 mM NaCl, pH 7,3. O reagente bifuncional pode ser adicionado em DMSO. Depois que foi concluída a reação, de preferência após 30 minutos, a reação é sustada mediante adição de lisina. O excesso de reagente bifuncional pode ser separado por meio de processos conhecidos na técnica, por exemplo, mediante diálise ou filtragem de coluna. O número médio de grupos tiol adicionados à EPO pode ser determinado por meio de processos fotométricos, descritos, por exemplo, por Grasetti, D.R. e Murray, J.F., em J. Appl. Brochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967). A reação supra é seguida pelo acoplamento covalente de um derivado de polietileno glicol (PEG) ativado. Os derivados de PEG adequados são moléculas de PEG ativadas com um peso molecular médio entre cerca de 20 até cerca de 40 kDa, com maior preferência, entre cerca de 24 até cerca de 35 kDa, e com maior preferência, cerca de 30 kDa.

Os derivados de PEG ativados são conhecidos na técnica e encontram-se descritos, por exemplo, Morpurgo, M. et al., J. Bioconj . Chem. (1996) 1_, página 363 ff para PEG-vinilsulfona. As espécies de PEG de cadeia linear e de cadeia ramificada são adequadas para a preparação dos compostos da Fórmula 1. Exemplos de reagentes de PEG reativos são iodo-acetil-metóxi-PEG e metóxi-PEG-vinilsulfona: 0 uso destas substâncias ativadas por iodo é conhecido na técnica e encontra-se descrito, por e-xemplo, por Hermanson, G.T. em Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p, 147-148.

Com maior preferência, as espécies de PEG são ativadas por maleimida utilizando-se (alcóxi-PEG-maleimida), tal como metóxi-PEG-maleimida (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). A estrutura da alcóxi-PEG-maleimida é a seguinte: em que R e m são tais como foram definidos anteriormente, preferencialmente. A reação de acoplamento com alcóxi-PEG-maleimida ocorre depois de separação in situ do grupo de proteção de tiol em uma solução de amortecimento a-quosa, por exemplo, 10 mM fosfato de potássio, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. A separação do grupo de pro- teção pode ser realizada, por exemplo, com hidroxilami-no em DMSO a 25°C, pH 6,2 durante cerca de 90 minutos. Para a modificação do PEG, a relação molar de E-PO/alcóxi-PEG-maleimida ativada deverá ser de cerca de 1:3 até cerca de 1:6, e de preferência 1:4. A reação poderá ser sustada mediante a adição de cisteina e a reação dos grupos tiol (-SH) remanescentes com N-metilmaleimida ou outros compostos apropriados capazes de formarem aglutinações de bissulfureto. Por causa da reação de quaisquer grupos tiol ativos remanescentes com um grupo de proteção, tais como N-metilmaleimida ou outro grupo de proteção adequado, as glicoproteinas de EPO nos conjugados desta invenção podem conter esses grupos de proteção. De uma maneira geral o procedimento descrito neste contexto produzirá uma mistura de moléculas que são dotadas de números variáveis de tióis protegidos por diferentes números do grupo de proteção, na dependência do número dos grupos tiol ativados na glicoproteina que não foram conjugados ao PEG-maleimida.

Considerando-se que N-metilmaleimida forma o mesmo tipo de aglutinação covalente quando usada para bloquear os restantes grupos tiol da proteína pegilada, compostos de bissulfureto conduzirão a uma reação de permuta sulfureto/bissulfureto intermolecular para um acoplamento ligado de bissulfureto do reagente de bloqueio. Os reagentes de bloqueio preferidos para esse tipo de reação de bloqueio são a glutationa oxidada (GSSG), a cisteina e a cistamina. Enquanto que com a cisteina nenhuma carga liquida é introduzida na proteína pegilada, com o uso de reagentes de bloqueio GSSG ou cistamina resulta em uma carga negativa ou positiva a-dicional. A maior purificação dos compostos da Fórmula 1, incluindo a separação das espécies de EPO mono-, di- e tri-pegiladas, poderá ser realizada por meio de processos conhecidos na técnica, por exemplo, cromato-grafia de coluna.

Uma composição que compreende derivados de eritropoetina pegilados preferentemente contém pelo menos noventa por cento de conjugados mono-PEG, isto é, em que n é 1, podem ser preparados conforme ilustrado no Exemplo 5. Usualmente conjugados mono-PEG de glico-proteínas de eritropoetina são desejáveis porque eles tendem a ter atividade mais alta do que os conjugados di-PEG. A percentagem dos conjugados mono-PEG bem como a relação das espécies mono- e di-PEG pode ser controlada pelo agrupamento de frações mais amplas em torno do pico de eluição, para diminuir a percentagem de frações mono-PEG ou mais estreitas para aumentar a percentagem de mono-PEG na composição. Cerca de noventa por cento de conjugados mono-PEG constitui um bom equilíbrio de rendimento e atividade. Por vezes composições em que, por exemplo, pelo menos noventa por cento ou pelo menos noventa e seis por cento dos conjugados são espécies mono-PEG (n igual a 1) poderão ser desejadas.

Em uma concretização desta invenção, a percentagem de conjugados onde n é 1 varia de noventa por cento a noventa e seis por cento.

As composições de acordo com a presente invenção poderão compreender de 10 a 10000 pg de uma proteína de eritropoetina por ml, tal como se definiu anteriormente. Preferentemente, as composições compreendem de 10 a 1000 pg, por exemplo, 10, 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg por mol.

Além disso, as composições acordo com a presente invenção poderão compreender de 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 10-200 mmol/1 sulfato, 10 a 50 mmol/1 de fosfato, pH 6,0 a 6,5. Esta composição também pode compreender até 20 mM de metio-nina, 1-5 % de um poliol (p/v) , até 0,1% de pluronic F68 (p/v) e opcionalmente até 1 mM de CaCl2. Um exemplo desta composição compreende 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 40 mmol/1 de sulfato, 10 mmol/1 de fosfato, 3% de manitol (p/v), 10 mM de me-tionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2.

Em uma outra concretização da presente invenção, a composição poderá compreender 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 10 a 100 mmol/1 de NaCl, 10 a 50 mmol/1 de fosfato, pH 6,0 a 7,0, opcionalmente 1-5% (p/v) de um poliol. Além disto, esta composição poderá compreender até 20 mM de metionina, até 0,1% de pluronic F68 (p/v) e opcionalmente 7,5 pmol/1 de CaCl2. Especificamente, esta composição po- derá compreender de 10 pg a 10000 pg de proteína de e-ritropoetina por ml, 100 mmol/1 de NaCl2, 10 mM de me-tionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), e 10 mmol/1 de fosfato, pH 7,0. A presente invenção também se refere à composição mencionada anteriormente que compreende 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 10 a 50 mmol/1 de arginina, pH 6,0 a 6,5, 10 a 100 mmol/1 de sulfato de sódio. Além disto, esta composição poderá compreender até 20 mM de metionina, até 0,1% de pluronic F68 (p/v) , opcionalmente até 1 mmol/j de CaCl2 e opcionalmente 1-5% (p/v) de um poliol. Especifica- mente, esta composição poderá compreender de 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 40 mmol/1 de arginina, pH 6,2, 30 mmol/1 de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v) e opcionalmente 1 mmol/1 de CaCl2.

Uma concretização preferida da presente invenção refere-se às composições que compreendem de 10 a 10000 pg/ml de eritropoetina, de preferência 25 a 2500 pg/ml de eritropoetina, e a) 10 mM de sódio/fosfato de potássio, 100 mM de NaCl, pH 7,0 ou b) 10 mM de fosfato de sódio, 120 mM de sulfato de sódio, pH 6,2 ou c) 10 mM fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), pH 6,2 ou d) 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfa- to de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2 ou e) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3$ de manitol (p/v), pH 6,2 ou f) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% pluronic F68 (p/v) pH 6,2.

Na concretização de maior preferência, as composições compreendem uma quantidade de proteína de eritropoetina de 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg/ml. As composições de maior preferência compreendem ou 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2, ou então 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2.

As composições da presente invenção poderão estar na forma de um pó secado por pulverização.

Além disso, a invenção refere-se a uma composição que é um liofilizado ou um pó secado por pulverização das composições descritas anteriormente. A composição poderá ser reconstituída para formar uma solução líquida pela adição de um solvente, por exemplo, água, ou aplicada diretamente, por exemplo, por meio de um dispositivo de inalação ou um dispositivo de aplicação transdérmica. A invenção também compreende um processo para a preparação de uma composição tal como descrita anteriormente, o qual compreende misturar uma proteína de eritropoetina com uma solução que compreende um múltiplo ânion carregado negativamente e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como definidos anteriormente.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição tal como definida anteriormente para a preparação de medicamentos de utilidade para o tratamento e prevenção de enfermidades relacionadas com anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF), AIDS e/ou para o tratamento de pacientes de câncer submetidos a quimioterapia. Isto inclui um processo para o tratamento e a prevenção de enfermidades que envolvem anemia em pacientes com deficiência renal crônica (CRF) , AIDS e em pacientes com câncer submetidos a quimioterapia que compreende a etapa de administrar a um paciente uma composição tal como definida anteriormente.

Uma outra concretização da presente invenção refere-se a dispositivos para liberação local e sistêmica sustentada que compreendem uma composição tal como se definiu anteriormente. Este poderá ser qualquer espécie de implante que proporcione uma liberação controlada de eritropoetina que compreende a composição descrita anteriormente, tais como, por exemplo, micro- ou nanopartículas baseadas em polímero. A composição descrita anteriormente também pode ser proporcionada como uma seringa pré-enchida ou em qualquer outro dispositivo de aplicação, tal como, por exemplo, um dispositivo de injeção desprovido de agulha ou então um dispositivo de inalação. A composição desta invenção poderá estar presente como uma dose unitária para administração injetável ou intravenosa. Por outro lado, a composição desta invenção poderá ser armazenada seja na forma liquida ou forma sólida e depois disso dividida em formas de dosagem unitária para administração intravenosa ou injetável. Consequentemente, a composição liquida desta invenção poderá estar presente em quantidades tão reduzidas quanto 0,3 ml para o uso como uma forma de dosagem única para administração. Por outro lado, o volume da composição reivindicada poderá ser tão grande quanto 60 litros quando o mesmo é armazenado antes da distribuição em uma forma de dosagem acondicionada. Em vista da sua estabilidade aumentada, a composição desta invenção pode ser armazenada em grandes recipientes de maneira a ser posteriormente colocada em meios de acon-dicionamento adequados para a distribuição para médicos, pacientes e hospitais. A solução injetável desta invenção pode ser administrada por meio de disposições de injeção convencionais, tais como seringas que permitirão de uma maneira geral a administração de 0,3 ml a 20 ml desta composição como uma única dose unitária. Por outro lado, a composição desta invenção poderá ser administrada mediante injeção utilizando-se ampolas que contêm esta composição seja como um liofilizado ou como um pó secado por aspersão que é então reconstituído de uma maneira convencional antes da injeção. Por outro lado, em decorrência da estabilidade das composições desta invenção, as composições poderão ser distribuídas na forma de dosagem unitária, tais como frascos, que contêm cerca de 0,3 ml até cerca de 10 ml desta composição. Adicionalmente, as composições desta invenção poderão ser administradas intravenosamente utilizando-se bolsas intravenosas. Estas bolsas contêm cerca de 20 ml até cerca de 500 ml da solução, na dependência do período em que a solução deverá ser administrada a um paciente. De acordo com esta invenção, a solução líquida desta invenção poderá ser armazenada em recipientes de armazenamento a partir dos quais elas poderão ser ainda separadas em embalagens na forma de pequena dosagem para a distribuição a médicos, hospitais e pacientes. Em decorrência da estabilidade das composições desta invenção, estas composições poderão ser armazenadas em tais recipientes de armazenamento durante longos períodos de tempo antes da administração. A preparação de eritropoetina como ingrediente para as composições tais como descritas anteriormente ou como ponto de partida para a preparação de derivados de eritropoetina tais como descritos anteriormente, encontra-se descrita de maneira detalhada, por exemplo, nas patentes U.S. N°s 5.547.933 e 5.621.080, ΕΡ-Β 0.148.605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0.205.564, EP-B 0.209.539 e EP-B 0.411.678, bem como Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, an Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. A eritropoetina para u-sos terapêuticos pode ser produzida por meios recombi-nantes (EP-B 0.148.605, EP-B 0.209.539 e Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) .

Processos para a expressão e preparação de eritropoetina em meio isento de soro encontram-se descritos, por exemplo, em WO 96/35718, de Burg publicado em 14 de novembro de 1996, e na publicação de patente européia No. 513.738, de Koch publicada em 12 de junho de 1992. Adicionalmente às publicações mencionadas anteriormente, é sabido que pode ser realizada uma fermentação isenta de soro das células CHO recombinantes que contêm um gene de EPO. Tais processos encontram-se descritos, por exemplo, na EP-A 0.513.738, EP-A 0.267.678 e de uma forma geral por Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0.248.656, Kowar, J. and Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0.481.791, EP-A 0.307.247, EP-A 0.343.635, WO 88/00967.

Na EP-A 0.267.678 encontram-se descritas uma cromatografia de permuta iônica em S-Sepharose, uma HPLC de fase inversa preparatória em uma coluna de Cs e uma cromatografia de filtragem de gel, para a purificação de EPO produzida em cultura isenta de soro depois de diálise. Sob este aspecto, a etapa de cromatografia de filtragem de gel pode ser substituída por cromato-grafia de permuta iônica em fluxo rápido de S-Sepharose. Encontra-se igualmente proposto gue uma cromatografia de corante em uma coluna de Blue Trisacr-yl, poderá ser realizada antes da cromatografia de permuta iônica.

Um processo para a purificação de EPO re-combinante encontra-se descrito por Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Neste processo, a EPO é tratada, entretanto, com uma solução de Tween® 20, fluoreto de fenilmetilsulfonil, etilmaleimida, pepsta-tin A, sulfato de cobre e ácido oxâmico antes das etapas de purificação. Publicações, incluindo WO 96/35718, de Burg publicado em 14 de novembro de 1996, expõe um processo para a preparação de eritropoetina em um processo de fermentação isento de soro (EPOsf). A atividade específica da EPO ou conjugados de EPO de acordo com a presente invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das proteínas de EPO purificadas desta invenção é tal que a administração da proteína de EPO por injeção a pacientes humanos resulta em as células da medula óssea aumentarem a produção de reticuló-citos e das células vermelhas do sangue em comparação com os grupos de pacientes não injetados ou de contro- le. A atividade biológica das proteínas de EPO, ou fragmentos das mesmas, obtidas e purificadas de acordo com esta invenção, pode ser testada por meio de processos de acordo com Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47:99-112 e Pharm. Europa Spec. Issue Eryt-hropoietin BRP Bio 1997 (2) . Um outro ensaio biológico para se determinar a atividade da proteína de EPO, o ensaio de rato normocitótico, encontra-se descrito no Exemplo 6. A invenção será melhor compreendida pela referência aos exemplos seguintes que ilustram, mas não limitam, a invenção descrita neste contexto.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Fermentação E Purificação de EPO Humana a) Preparação e Fermentação de Inóculo Um frasco do Working Cell Bank, originário de uma linha de células CHO produtoras de EPO (pode ser usada ATCC CRL8695, exposta em EP 411.678 (Genetics Institute)) é recolhido da fase gasosa do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. As células são transferidas para balões de rotor de vidro e cultivadas em um meio amortecido por carbonato de hidrogênio em uma incubadora de C02 umedecido. Os meios isentos de soro típicos utilizados para a preparação e fermentação em coluna encontram-se expostos no Pedido de Patente Européia 513.738, de Koch, publicado em 12 de junho de 1992, ou WO 96/35718, de Burg, publicada em 14 de no- vembro de 1996, por exemplo, contém como meio DMEM/F12 (por exemplo, JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Den-ver, US, ordem No. 57-736) e adicionalmente hidrogen-carbonato de sódio, L+glutamina, D+glicose, insulina recombinante, selenita de sódio, diaminobutano, hidro-cortisona, sulfato de ferro(II), asparagina, ácido as-pártico, serina e um estabilizador para células de mamífero tal como, por exemplo, álcool de polivinil, me-til celulose, polidextran, polietileno glicol, Pluronic F68, poligelina expansora de plasma (HEMACCEL®) ou polivinil pirrolidona (WO 96/35718).

As culturas são checadas microscopicamente quanto à ausência de microorganismos de contaminação, e determinam-se as densidades de células. Estes testes são desempenhados em cada etapa de divisão celular.

Depois do período de crescimento inicial, a cultura de células é diluída com meio fresco para a densidade de células de partida e submetida a um outro ciclo de crescimento. Repete-se este procedimento até ser obtido um volume de cultura de aproximadamente 21 por balão de rotor de vidro. Depois de aproximadamente 12 duplicações, ficam disponíveis de 1 a 5 litros desta cultura, a qual é então usada como inóculo para o fermentado r de inóculo de 10 1.

Depois de 3 - 5 dias, a cultura no fermen-tador de 10 1 pode ser usada como inóculo para o fermentado r de inóculo de 100 1.

Após 3-5 dias adicionais de cultivo, a cultura no fermentador de 100 1 pode ser utilizada como inóculo para o fermentador de produção de 1000 1. b) Colheita e Separação das Células Utiliza-se um processo de realimentação de batelada, isto é, quando a densidade de células desejada é alcançada, aproximadamente 80% da cultura é colhida. A cultura restante é reabastecida com meio de cultura fresco e cultivada até à colheita seguinte. Uma corrida de produção consiste de um máximo de 10 colheitas subseqüentes: 9 colheitas parciais e uma colheita global no final da fermentação. A colheita ocorre a cada 3-4 dias. 0 volume de colheita determinado é transferido para um vaso refrigerado. As células são removidas por centrifugação ou filtragem e descartadas. 0 sobrenadante que contém EPO da etapa de centrifugação é filtrado em linha e coletado em um segundo vaso refrigerado. Cada colheita é processada separadamente durante a purificação.

Um processo típico para a purificação da EPO-proteína encontra-se exposto na WO 96/35718, de Burg, publicada em 14 de novembro de 1996. O processo de purificação é exposto de maneira exemplificativa em seguida. a) Cromatografia de Blue Sepharose A Blue Sepharose (Pharmacia) consiste de glóbulos Sepharose, à superfície dos quais o corante azul Cibaron é aglutinado covalentemente. Uma vez que a EPO aglutina-se mais fortemente à Blue Sepharose do que a maior parte dos contaminantes não proteínicos, algumas impurezas proteinicas e PVA, a EPO pode ser enriquecida nesta etapa. A eluição da coluna Blue Sepharose é realizada por meio do aumento da concentração de sal, bem como do pH. A coluna é preenchida com 80 - 100 1 de Blue Sepharose, regenerada com NaOH e equilibrada com amortecedor de equilíbrio (cloreto de sódio/cálcio e acetato de sódio). O sobrenadante do fermentador aci-dulado e filtrado é então carregado. Depois da conclusão da carga, a coluna é lavada, primeiro com um amortecedor semelhante ao amortecedor de equilíbrio que contém uma concentração de cloreto de sódio mais alta, e consecutivamente com um amortecedor tribásico. 0 produto é então eluído com um amortecedor tribásico e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição principal. b) Cromatografia de Butyl Toyopearl 0 Butyl Toyopearl 650 C (TosoHaas) é uma matriz baseada em polistireno à qual resíduos de butilo alifático são acoplados covalentemente. Uma vez que a EPO aglutina-se mais fortemente a este gel do que a maioria das impurezas e PVA, ela tem de ser submetida a eluição com um amortecedor que contém isopropanol. A coluna é acondicionada com 30 - 40 1 de Butyl Toyopearl 650 C, regenerada com NaOH, lavada com um amortecedor tribásico e equilibrada com um amortece- dor tribásico que contém isopropanol. 0 produto de eluição de Blue Sepharose é ajustado para a concentração de isopropanol no amortecedor de equilíbrio de coluna e carregado na coluna. Então, a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio com concentração de isopropanol aumentada. O produto é submetido a eluição com amortecedor de eluição (amortecedor tribásico com alto teor de isopropanol) e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição principal. c) Cromatografia de Hydroxyapatite Ultrogel A Hydroxyapatite Ultrogel (Biosepra) consiste de hidroxiapatita a qual é incorporada em uma matriz de agarose, para permitir aperfeiçoar as propriedades mecânicas. A EPO é dotada de uma baixa afinidade com a hidroxiapatita e pode, conseqüentemente, ser elu-ída sob concentrações de fosfato mais baixas do que as impurezas de proteína. A coluna é preenchida com 30 - 40 1 de Hydroxyapatite Ultrogel e regenerada com um amortecedor de fosfato de potássio/cloreto de cálcio e NaOH, seguido por um amortecedor tribásico. Então, é equilibrada com um amortecedor tribásico que contém uma baixa quantidade de isopropanol e cloreto de sódio. 0 produto de eluição que contém EPO da cromatografia de Butyl Toyopearl é carregado na coluna. Subseqüentemente, a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio e um amortecedor tribásico sem isopropanol e cloreto de sódio. 0 produto é submetido a eluição com um amortecedor tribásico que contém uma baixa concentração de fosfato de potássio e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição principal. d) HPLC de Fase Inversa em Vydac C4 0 material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílica, cujas superfícies carregam cadeias de alquila-C4. A separação da EPO em relação às impurezas proteínicas é baseada nas diferenças na resistência das interações hidrófobas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. 0 HPLC de preparação é realizado utilizando-se uma coluna de aço inoxidável (preenchida com 2,8 a 3,2 litros de sílica gel Vydac C4). 0 produto de e- luição de Hydroxyapatita Ultrogel é acidulado mediante adição de ácido trifluoroacético e carregado na coluna Vydac C4. Para lavagem e eluição utiliza-se um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. Frações são coletadas e imediatamente neutralizadas com amortecedor de fosfato. As frações de EPO que ficam dentro dos limites de IPC são reunidas. e) Cromatografia de DEAE Sepharose 0 material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de dietilaminoetil (DEAE) os quais são aglutinados covalentemente à superfície de contas de Sepharose. A aglutinação da EPO aos grupos de DEAE é mediada por interações iônicas. Acetonitrilo e ácido trifluoroacé- tico passam através da coluna sem serem retidos. Depois destas substâncias terem sido removidas por lavagem, as impurezas residuais são removidas mediante lavagem da coluna com amortecedor de acetato sob um baixo pH. Então, a coluna é lavada com amortecedor de fosfato neutro e a EPO é eluida com um amortecedor com resistência iônica aumentada. A coluna é acondicionada com DEAE Sepharo-se de fluxo rápido. 0 volume da coluna é ajustado a fim de assegurar uma carga de EPO na faixa de 3 - 10 mg EPO/ml de gel. A coluna é lavada com água e amortecedor de eguilibrio (sódio/fosfato de potássio). As frações agrupadas do eluido de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com amortecedor de equilíbrio. Então, a coluna é lavada com amortecedor de lavagem (amortecedor de acetato de sódio) seguida por lavagem com amortecedor de equilíbrio. Subseqüentemente, a EPO é submetida a eluição a partir da coluna com amortecedor de eluição (cloreto de sódio, sódio/fosfato de potássio) e coletada numa única fração de acordo com o perfil de eluição principal. O produto de eluição da coluna de DEAE Se-pharose, é ajustado para a condutividade específica. A substância da droga resultante é filtrada em uma condição estéril para frascos de Teflon e, então, armazenado a -70°C.

EXEMPLO 2: Pegilação da EPO com mPEG-SBA EPO purificada de acordo com o procedimen- to isento de soro do Exemplo 1 (EPOsf) apresentou-se homogênea conforme determinado por processos analíticos e exibiu o padrão isoforma típico que consiste de 8 i-soformas. Ela tinha atividade biológica específica de 190.000 IU/mg conforme determinado pelo ensaio de rato normocitótico. O reagente de pegilação utilizado foi um metóxi-PEG-SBA, que é um composto da Fórmula II em que R é metilo; x é 3; em varia de 650 a 750 (média cerca de 680, correspondente a um peso molecular de cerca de 30 kDa).

Reação de Pegilação A cem miligramas de EPOsf (9,71 ml de um material de EPOsf 10,3 mg/ml, 5,48 μιιιοί), adicionaram-se 10 ml de amortecedor de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5, contendo 506 mg de 30 kDa metóxi-PEG-SBA (16,5 μπιοί) (obtido a partir da Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) e misturaram-se durante 2 horas à temperatura ambiente (20-23°C). A concentração de proteínas final foi de 5 mg/ml e a relação de reagente proteína: PEG foi de 1:3. Depois de duas horas, a reação foi sustada pela ajustagem do pH para 4,5 com ácido acético glacial e armazenada a -20°C, até ficar pronta para purificação.

Purificação 1. Mistura de Conjugado: Aproximadamente 28 ml de SP-SEPHAROSE FF (resina permutadora iônica de sulfo-propil) foram acondicionados em uma coluna de vidro AMICON (2,2 x 7,5 cm) e equilibrada com 20 mM de amortecedor de acetato, pH 4,5, sob uma velocidade de fluxo de 150 ml/hora. Seis mililitros da mistura de reação contendo 30 mg de proteína foram diluídos 5 vezes com o amortecedor de equilíbrio e aplicados à coluna. Os materiais não absorvidos foram removidos por lavagem com o amortecedor e a mistura de conjugado PEG adsorvida foi eluída da coluna com NaCl 0,175 M no amortecedor de equilíbrio. EPOsf não modificada que permaneceu ainda na coluna foi eluída com 750 mM de NaCl. A coluna foi reequilibrada no amortecedor de partida. Amostras foram analisadas por SDS-PAGE e os seus graus de pegilação foram determinados. constatou-se que o agente de eluição 0,175M NaCl continha, mono-bem como di- e quantidades residuais das espécies tri-pegiladas, enquanto que o agente de e-luição 750 mM NaCl continha EPOsf não modificada . 2. Di-PEG e Mono-PEG-EPOsf: A mistura de conjugado purificada eluída a partir da coluna na etapa anterior foi diluída 4 vezes com o amortecedor e re-aplicada sobre a coluna e lavada conforme descrito. Di-PEG-EPOsf e mono-PEG-EPOsf foram submetidas a eluição separadamente a partir da coluna com 0,1M NaCl e 0,175M NaCl, respectivamente. A eluição também foi realizada com 750 mM NaCl para promover a eluição de qualquer EPOsf não modificada ' remanescente .

Alternativamente, a mistura de reação foi diluída 5 vezes com o amortecedor de acetato e aplicada à coluna de SP-Sepharose (~0,5 mg proteína/ml gel). A coluna foi lavada e mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf e EPOsf não modificada adsorvidas foram submetidas a eluição conforme descrito na seção anterior. Resultados A PEG-EPOsf foi sintetizada pela conjugação química de uma molécula de PEG linear com um número de peso molecular médio de 30 kDa. A PEG-EPOsf foi derivada a partir da reação entre os grupos amino principais da EPOsf e o derivado de éster de succinimidil de um PEG-ácido butírico 30 kDa, resultando em uma aglutinação de amida.

Os resultados encontram-se sumariados na Tabela 1. A mistura de conjugados purificada compreendia mono- e di-PEG-EPOsf e apresentou-se isenta de E-POsf não modificada, tal como determinado por análise SDS-PAGE. A mistura de conjugados respondeu por 23,4 mg ou 78% do material de partida. A separação cromato-gráfica de permuta catiônica de mono- e di-PEG-EPOsf indicou que a relação de mono- para di-PEG na mistura de conjugados foi de quase 1:1. Depois da conclusão da reação, a relação dos componentes individuais de Mo-no:Di:Não modificado foi de 40:38:20 (%). O rendimento global foi quase quantitativo. TABELA 1: Sumário de resultados da pegilação de EPOsf Amostra Proteína (mg) Rendimento (%) Mist. Rxn. 30 100 Mono- 12,0 40 Di- 11,4 38 Não Modif. 6,0 20 Mist. Conjugados 23,4 78 EXEMPLO 3: Pegilação de EPO com mPEG-SPA

Fez-se reagir uma alíquota diferente da EPOsf utilizada no Exemplo 2 com 30 kDa metóxi-PEG-Spa (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). A reação foi realizada numa relação de proteína:reagente de 1:2 e as técnicas de purificação foram de acordo com 0 Exemplo 2. Produziram-se principalmente as espécies mono-pegiladas.

EXEMPLO 4: Ligação Covalente de grupos tiol à EPO

Este exemplo expõe a determinação das condições de reação para a ligação covalente de grupos tiol à EPO. Para se determinarem as condições, diferentes quantidades de um reagente que contém um grupo tiol bloqueado, aqui SATA ou SATP (dissolvido em DMSO a 10 mg/ml) foram adicionados à solução de EPO, neste caso a 1 ml de 5 mg/ml EPO em 10 mM fosfato de potássio, 50 mM NaCL, pH 7,3. A reação foi submetida a agitação durante cerca de 30 minutos (25°C) s sustada mediante adição de solução de lisina 1 M a 10 mM. As quantidades excedentes de SATA e SATP foram removidas por meio de diá-lise contra 10 mM de fosfato de potássio, 50 mM NaCl e 2 mM EDTA, pH 6,2. Depois da remoção do grupo acetilo de proteção com hidroxilamino, o número de grupos tiol ligados covalentemente à EPO foi determinado fotometri-camente com ditiopiridina, de acordo com o processo descrito por Grasetti, D.R. e Murray, J. F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, página 41-49 (1967). 0 número de grupos tiol ligados covalentemente por molécula de EPO encontra-se ilustrado em seguida : EXEMPLO 5: Modificação de EPO ativada com metóxi-PEG-maleimida A) Ativação de EPO: 100 mg de EPO produzida de acordo com o Exemplo 1 (190.000 IU/mg, quando determinada pelo en- saio de rato normocitêmico) foram ativados com SATA (relação molar: EPO/SATA = 1/5) de acordo com o Exemplo 2. A EPO resultante ("EPO ativada") carregando grupos tiol bloqueados ligados covalentemente, foi separada de subprodutos, tais como N-hidróxi-succinimida e SATA não reagida mediante diálise conforme descrita no Exemplo 1. Obteve-se então uma solução de 4,5 ml/ml de EPO a-tivada em 10 mM de fosfato de potássio, 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6,2. B) Pegilação de EPO ativada: 380 mg de metóxi-PEG-maleimida tendo a estrutura "de maior preferência" ilustrada anteriormente (MW 30.000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Ala-bama, USA)), foram dissolvidos na solução supra contendo 95 mg de EPO ativada (4,5 mg/ml em 10 mM de fosfato de potássio, 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6,2). A relação molar resultante entre a EPO ativada e metóxi-PEG-maleimida na solução foi de 1:4. Pela adição de solução de hidroxilamino aquosa 1 M, 30 mM, pH 6,2 à solução anterior, os grupos tiol bloqueados ligados co-valentemente da EPO ativada foram desbloqueados. A EPO ativada resultante na mistura de reação da solução continha grupos tiol (-SH) livres. O desbloqueio dos grupos tiol foi seguido imediatamente pela reação de acoplamento entre a EPO ativada contendo agora grupos tiol (-SH) livres e metóxi-PEG-maleimida durante 90 minutos (agitação, 25°C) . A reação de acoplamento foi sustada pela adição de solução de cisteina aquosa 0,2M, 2 mM, à mistura de reação. Depois de 30 minutos, os grupos tiol livres excedentes da EPO ativada que não reagiram com a metóxi-PEG-maleimida foram bloqueados pela adição de solução de N-metilmaleimida 0,5 M em DMSO para al- cançarem uma concentração de 5 mM. Depois de um período de 30 minutos, a mistura de reação resultante, contendo agora espécies EPO pegiladas, foi submetida a di-álise contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,5 durante > 15 horas. C) Purificação de espécies de EPO pegiladas: Para se separarem as espécies de EPO pegiladas em relação à mistura de reação, realizou-se o seguinte processo de purificação: Uma coluna de 50 ml de Q-Sepharose ff foi equilibrada com 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,5. A mistura de reação que se obteve na etapa B) foi carregada na coluna (velocidade de fluxo: 3 volumes de coluna (CV) por hora). A fim de se separar o metóxi-PEG-maleimida não reagido, a coluna foi lavada com 5 CV de 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,5. As espécies de EPO pegiladas foram separadas mediante eluição com um gradiente salino crescente que consistiu de 5 CV de amortecedor A (10 mM de fosfato de potássio, pH 7,5) e 5 CV de amortecedor B (10 mM de fosfato de potássio, 500 mM de NaCl, pH 7,5) com uma velocidade de fluxo de 3 CV por hora, Com base no gradiente de NaCl, as espécies de EPO pegiladas (espécies de EPO tri-, bi- e mono-pegiladas) foram eluidas em primeiro lugar, seguidas pelas espécies de EPO não pegiladas. A fração do produto de eluição que continha as espécies de EPO pegiladas (espécies de EPO tri-, bi-e mono-pegiladas) foi agrupada e filtrada (filtragem estéril com um filtro de 0,2 pm) . 0 teor e pureza das espécies de EPO tri-, bi- e mono-pegiladas foram avaliados em géis Coomassie-stained SDS-PAA (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)) enguanto as concentrações de proteínas foram medidas a 280 nm de acordo com a lei Beer-Lambert. Os pesos moleculares aparentes das espécies de EPO determinados por eletroforese SDS-PAA. foram da ordem de cerca de 68 kDa (espécies de EPO mono-pegiladas) , cerca de 98 kDa (espécies de EPO bi-pegiladas) e cerca de 128 kDa (espécies de EPO tri-pegiladas).

Maior separação das espécies de EPO tri-, bi- e mono-pegiladas pode ser obtida por meio de croma-tografia, por exemplo, mediante cromatografia de exclusão de dimensão (Superdex, pg 200; Pharmacia). A determinação da atividade biológica in vivo do produto de eluição que continha as espécies de EPO tri-, bi- e mono-pegiladas foi realizada por meio do processo descrito adiante. EXEMPLO 6: Atividade in vivo da EPO pegilada, determinada pelo ensaio em rato normocitótico O bioensaio em rato normocitótico é conhecido na técnica (Pharm. Europa Spec. Issue Erytropoie-tin BRP Bio 1997(2)) e um processo na monografia de e-ritropoetina de Ph. Eur. BRP. As amostras foram diluídas com BSA-PBS. Ratos saudáveis normais, 7-15 semanas de idade, foram administrados s.c. 0,2 ml da fração de EPO que contém EPO não pegilada ou EPO tri-, bi- e mo-no-pegilada, provenientes do Exemplo 2 ou 3. Durante um período de 6 dias, sangue foi retirado por perfuração da veia da cauda e diluído de maneira tal que 1 μΐ de sangue encontrava-se presente em 1 ml de uma solução de coloração laranja de acridina 0,15 μιηοΐ. O tempo de coloração foi da ordem de 3 a 10 minutos. As contagens de reticulócitos foram realizadas microfluorometrica-mente, em um citômetro de fluxo mediante análise do histograma de fluorescência vermelha. As contagens de reticulócitos foram dadas em termos de números absolutos (por 30.000 células sangüíneas analisadas). Para os dados apresentados, cada grupo consistia de 5 ratos por dia, e os ratos foram sangrados somente uma vez.

Em experiências separadas, uma única dose de EPO não modificada (25 ng de EPO), a mistura PEG(SBA)-EPO proveniente do Exemplo 2 (10 ng de conjugado) , EPOs mono- e bi-pegiladas provenientes do Exemplos 2 (10 ng de conjugado), a PEG(SPA)-EPO proveniente do Exemplo 3 (10 ng de conjugado), e solução amortece-dora, foram administradas a ratos. Os resultados encontram-se expostos na Tabela 2. Os resultados mostram a atividade superior e o semiperíodo prolongado das espécies das EPO pegiladas indicaram as quantidades de reticulócitos significativamente aumentadas e a mudança do máximo de contagem de reticulócitos utilizando-se a mesma dose por rato (10 ng), em comparação com uma dose de 25 ng de EPO não modificada. EXEMPLO 7: Preparação de predominantemente monômero- PEG-EPO

Reação de Pegilação Iniciando-se com 100 mg (5,48 ymol) de E-POs em amortecedor de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,5, preparado de acordo com o Exemplo 1, adicionaram-se 329 mg (10,96 pmol) de reagente PEG-SBA 30 kDa dissolvidos em 3 ml de 1 mM HC1. Amortecedor de fosfato de potássio 100 mM suficiente, pH 7,5, foi adicionado para levar o volume da mistura de reação para 20 ml. A concentração de proteínas final foi de 5 mg/ml e a relação de proteína:reagente PEG foi de 1:2. A mistura de reação foi submetida a agitação durante 2 horas à temperatura ambiente (20 - 22°C). Depois de 2 horas, sustou-se a reação mediante ajustagem do pH para 4,5 com ácido acético glacial e armazenou-se congelada a -20°C até ficar pronta para purificação.

Purificação A mistura de reação proveniente da etapa exposta anteriormente foi diluída na proporção de 1:5 com acetato de sódio 10 mM, pH 4,5 e aplicada a 300 ml de SP-Sepharose FF (resina de permuta catiônica de sul-fopropil) , acondicionada em uma coluna de 4,2 x 19 cm. A coluna foi previamente equilibrada com o mesmo amortecedor. Os efluentes de coluna foram monitorados a 280 nm com um monitor de UV Gilson e registrados por meio de um registrador Kipp and Zonen. A coluna foi então lavada com 300 ml, ou um 1 volume de leito de a-mortecedor de equilíbrio, para se removerem os reagen-tes excedentes, os subprodutos de reação e os PEG-EPO oligoméricos. Esta foi seguida por lavagem com 2 volumes de leito de 100 mM NaCl para se remover a di-PEG-EPO. A mono-PEG-EPO foi então eluída com NaCl 200 mM. Durante a eluição da mono-PEG-EPO, os primeiros 50 ml do pico de proteína foram descartados e a mono-PEG-EPO foi coletada como uma fração de 150 ml. A EPOsf não-modificada remanescente na coluna foi eluída com 750 mM NaCl. Todos os amortecedores de eluição foram preparados no amortecedor de equilíbrio. Todas as amostras submetidas a eluição foram analisadas por SDS-PAGE e por Cromatografia de Exclusão de Dimensão (SEC) de alto desempenho. O agrupamento mono-PEG-EPO obtido a partir da fração de 150 ml, que tinha EPOsf não modificados não detectáveis, foi então concentrado para ~4,5 - 7,5 mg/ml e diafiltrado no amortecedor de armazenamento, 10 mM fosfato de potássio, 100 mM NaCl, pH 7,5. A concen-tração/Diafiltragem foi realizada com Millipore Labsca-le™ TFF System equipado com membrana Millipore Pelli-con XL Biomax 50 de corte 50 kDa, sob temperatura ambiente. A mono-PEG-EPO concentrada foi filtrada estéril e armazenada congelada a -20°C.

Aproximadamente 75% de EPOsf foram submetidos a pegilação. Depois da purificação, o rendimento total foi da ordem de ~30% de mono-PEG-EPO com EPOsf não-modifiçada não detectável e em torno de 25% de di-PEG-EPO. Oligômeros e EPOsf não pegilados foram responsáveis pela proteína remanescente. O grupamento mono-PEG-EPO obtido a partir da fração de 150 ml continha aproximadamente 90% de mono-PEG-EPO e aproximadamente 10% de di-PEG-EPO. EXEMPLO 8: Termo-estabilidade de EPO e EPO pegilada em várias formulações: Análise por DSC (calorimetria de exploração diferencial) É aceito, de uma maneira geral, que a temperatura de transição da desnaturação térmica medida por meio de calorimetria de exploração diferencial constitui um indicador válido para a estabilidade térmica das proteínas. As soluções de eritropoetina ou de eritropoetina pegilada com concentrações situadas entre 0,6 e 1,2 mg/ml foram analisadas em vários amortecedores com ou sem estabilizadores por meio de um Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, USA) sob um regime de aquecimento de 2 K/minuto. Um aumento na temperatura de transição indica um aumento na estabilidade térmica da proteína. Os valores de temperatura medidos não deverão ser compreendidos como valores absolutos, mas, em vez disso, que representam diferenças na estabilidade das formulações individuais em relação umas às outras.

Com a finalidade de se definir o pH ótimo para a formulação, estudou-se o quanto a desnaturação térmica da eritropoetina pegilada é dependente do pH, numa faixa situada entre 4 e 9. As amostras de proteína foram analisadas em 30 mM Na2HP04, 30 mM citrato de sódio, 30 mM borato. A Figura 1 mostra um platô de temperatura de transição máxima situada entre cerca de pH 6 até cerca de pH 9, e uma diminuição repentina a-baixo de pH 5,5. Isto indica que o pH ótimo para a estabilidade térmica máxima fica situada acima de pH 5,5 (Figura 3) . A fim de se investigar o efeito da intensidade iônica, determinou-se a dependência da desnaturação térmica na concentração de fosfato. A Figura 4 mostra que a estabilidade térmica aumenta com um aumento na intensidade iônica da formulação. A influência da substância amortecedora também foi investigada por DSC. A partir da Figura 5 pode-se observar que os amortecedores ou aditivos mais adequados para uma alta estabilidade térmica são sulfato, citrato ou fosfato. A glicina, que é utilizada como um amortecedor nas formulações atualmente disponi- veis (vide acima), não é muito adequada. A Figura 6 mostra que o sulfato também constitui um amortecedor/aditivo que é adequado sob um baixo pH (por exemplo, pH 6,2), enquanto que o fosfato é menos adequado sob um pH de 6,2 em comparação com o pH de 7,5. Isto mostra que o sulfato mantém uma estabilidade térmica elevada, mesmo sob baixo pH. Esta descoberta permite uma formulação sob um pH situado entre 6,0 e 6,5, sem sérias perdas na estabilidade térmica da eritropoetina. EXEMPLO 9: Agregação da EPO e da peg-EPO sob tensão térmica: Análise por SDS-PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sódio) A fim de se investigar o efeito da tensão térmica na proteina de eritropoetina, amostras em diferentes formulações foram expostas a tensão térmica (20 minutos a 80°C) e analisadas por eletroforese de gel de poliacrilamida dodecilo de sódio (SDS-PAGE) sob condições redutoras (com DTT no amortecedor de amostra) e não redutoras (p/o DTT no amortecedor de amostra). Este processo permite a detecção de formação de agregados covalentes. Tal como se salientou anteriormente, a formação de agregados é uma das principais vias de degradação de proteínas e, conseqüentemente, deverá ser evitada nas formulações de proteínas farmacêuticas. Os agregados que podem ser detectados na ausência de agente redutor (por exemplo, DTT) e não detectados na presença de agente redutor têm alta probabilidade de serem formados por ligação de bissulfureto incorreta, uma reação de oxidação, sob tensão térmica. A Figura 5 mostra como a agregação é dependente do pH sob tensão térmica. Esta experiência mostra claramente que a formação de agregados é suprimida quando sob um pH inferior a 6,5. Quanto mais elevado for o pH, mais elevada será a quantidade de agregação. A maior parte dos agregados que são formados pode ser reduzida pelo tratamento das amostras com um agente redutor durante a SDS-PAGE, sugerindo que uma grande parte dos agregados que são formados sob tensão térmica são dimeros ligados por bissulfureto, oligômeros e agregados de ordem mais elevada. Considerando-se o conjunto, isto indica que a formação de agregados poderá ser evitada numa grande extensão ao manter-se o pH da formulação na faixa de pH 6,5 ou abaixo da mesma. A Figura 7: Dependência da agregação peg-EPO no pH. As amostras peg-EPO depois de tensão térmica (tal como descritas anteriormente) foram analisadas por SDS-PAGE. As proteínas foram manchadas com prata. Faixa 1: padrão de peso molecular. Faixa 2: pH 5. Faixa 3: pH 5, reduzido. Faixa 4: pH 6. Faixa 5: pH 6, reduzido. Faixa 6: pH 6,5. Faixa 7: pH 6,5, reduzido. Faixa 7: pH 7. Faixa 9: pH 7, reduzido. Faixa 10: peg-EPO, não sob tensão. A formação de agregados também poderá ser impedida pelo uso de antioxidantes. A Figura 8 mostra que o uso de 1 mg/ml de acetilcisteína como um antioxi- dante impede a formação de agregados sob tensão térmica. Conseqüentemente, é de utilidade utilizar-se um antioxidante, tal como, por exemplo, acetilcisteina sob um baixo pH, por exemplo, pH 6,2, para evitar a formação de agregados sob tensão térmica. A Figura 6: Ilustra que a agregação de peg-EPO poderá ser evitada por pH 6,2 e/ou acetilcisteina. As amostras de peg-EPO depois de tensão térmica (tal como se descreveu anteriormente) foram analisadas por meio de SDS-PAGE. As proteínas foram tingidas com prata. Faixa 1: peg-EPO, não sujeita a tensão. Faixa 2: pH 7,5, sujeita a tensão. Faixa 3: pH 6,2, sujeita a tensão. Faixa 4: pH 6,2, sujeita a tensão reduzida. Faixa 5: pH 7,5, 1 mg/ml de acetilcisteina, sujeita a tensão. Faixa 6 pH 7,5, 1 mg/ml de acetilcisteina, sujeita a tensão, reduzida.

EXEMPLO 10: Estabilidade da peg-EPO em várias formulações sob 4, 25, 30 e 40°C EPO pegilada em várias formulações é submetida a incubação sob diversas temperaturas. Nos pontos de tempo indicados, as amostras são recolhidas e a estabilidade é avaliada por meio de cromatografia de alto desempenho de fase inversa (rpHPLC), por cromato-grafia de exclusão de dimensão de alto desempenho (SEC) e por eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sódio (SDS-PAGE). A Tabela 3 proporciona uma comparação da estabilidade da peg-EPO em várias formulações sob diversas temperaturas. Estes dados mostram claramente a superioridade das formulações incluídas neste contexto com relação a recuperação e a-gregação de proteínas. TABELA. 3: Estabilidade da peg-EPO em várias formulações sob várias temperaturas: • as formulações são: Formulação A: 10 mM fosfato de sódio, 100 mM cloreto de sódio, pH 7,5.

Formulação B: 10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2.

Formulação C: 10 mM fosfato de sódio, 100 mM NaCl, pH 7,0.

Formulação D: 10 mM fosfato de sódio, 120 mM sulfato de sódio, pH 6,2.

Formulação E: 40 mM arginina, 30 mM sulfato de só- dio, 3% manitol, 1 itiM CaCl2, pH 6,2. EXEMPLO 11: Formulações otimizadas suprimem oxidação de metionina54 em proteína de EPO, metionina como um antioxidante EPO pegilada em várias formulações é incubada sob várias temperaturas. Depois de 6 meses, tomam-se as amostras e determina-se o grau de oxidação de metionina54, da maneira exposta em seguida. Sucintamente, as amostras de EPO são tratadas com endo-proteinase LysC. Os peptideos resultantes são separados por meio de cromatografia de fase inversa. Calcula-se então a relação de peptideo T8 oxidado (contendo a metionina54 oxidada) para peptideo T8 (que contém metionina54 não oxidada) . Os dados encontram-se resumidos na Tabela 4. TABELA. 4: Grau de oxidação de metionina54 de proteína EPO em várias formulações depois de seis meses sob as temperaturas indicadas • as formulações encontram-se listadas em seguida: Formulação A: 10 mM fosfato de sódio, 100 mM cloreto de sódio, pH 7,0.

Formulação C: 10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2.

Estes dados mostram claramente que a formulação preferida da presente invenção (10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2) é superior às outras formulações, tais como 10 mM fosfato de sódio, 100 mM NaCl, pH 7,0, com relação ao grau de oxidação de metionina54. A adição de 1 ou 10 mM metionina na formulação suprime claramente a oxidação da metionina54. Conseqüentemente, a metionina funciona como um antioxidante e estabiliza a EPO. EXEMPLO 12: Teor de ácido siálico das amostras de peg-EPO nas várias formulações Com a finalidade de analisar-se a integridade da estrutura dos carboidratos da glicoproteina de peg-EPO, o teor de ácido siálico das amostras de peg-EPO nas formulações otimizadas depois de um armazenamento durante 6 meses sob várias temperaturas, foi analisado por meio de técnicas padrão. Estes dados mostraram que a integridade das estruturas de carboidratos não foi influenciada negativamente pelo armazenamento da proteína nas novas formulações descritas neste contexto (Figura 9) . EXEMPLO 13: Bioatividade da EPO pegilada depois de armazenamento sob temperatura elevada durante períodos de tempo prolongados Com a finalidade de demonstrar que o armazenamento da peg-EPO em 10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2, não influencia negativamente a bioatividade in vivo, realizou-se um ensaio de EPO em rato padrão (vide Exemplo 6) . A-mostras de peg-EPO armazenadas durante 6 meses em 10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2, sob as temperaturas indicadas, mostraram não haver perda de atividade in vivo depois de armazenamento a 4, 25 e 30°C em comparação com o padrão de referência recentemente produzido (Figura 10). EXEMPLO 14: Teor de agregado da peg-EPO depois de armazenamento a temperatura elevada durante 6 meses Com a finalidade de analisar-se o teor de agregado nas amostras de peg-EPO depois de armazenamento sob temperatura elevada em 10 mM fosfato de sódio, 40 mM sulfato de sódio, 3% (p/v) manitol, pH 6,2, de- pois de 6 meses as amostras foram retiradas e analisadas por meio de cromatografia de exclusão de dimensão. Não foram detectados quaisquer agregados sob temperaturas de 4, 25 e 30°C, proporcionando a estabilidade da EPO pegilada nas formulações mencionadas anteriormente. A Figura 11 mostra uma sobreposição dos cromatogramas de exclusão de dimensão.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS (1) Informação Geral: (i) Requerente: (A) Nome: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Endereço: 124 Grenzacherstrasse (C) Cidade: Basiléia (E) Pais: Suiça (F) Código Postal (ZIP): CH-4070 (G) Telefone: (61) 688 11 11 (H) Telefax: (61) 688 13 95 (I) Telex: 962 292 hlr ch (ii) Titulo da Invenção: Nova Composição Farmacêutica (iii) Número de Seqüências: 2 (iv) Formulário de Exeqüibilidade em Computador: (A) Tipo de Meio: Disco flexível (B) Computador: Compatível com PC IBM

Claims

1. Composição farmacêutica liquida, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de eritropoietina humana peguilada, um ânion inorgânico com carga múltipla, em um tampão farmaceuticamente aceitável, adequado para manter o pH da solução na faixa de 5,5 a 7,0, e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis; a dita composição líquida sendo estável na temperatura ambiente, em que o dito ânion é um ânion sulfato, e tendo de 10 a 200 mmol/1 de sulfato.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma solução aquosa.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é uma solução isotônica.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pH varia de 5,8 a 6,7.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o pH varia de 6,0 a 6,5.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o pH é de cerca de 6,2.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o tampão é selecionado do grupo que consiste em um tampão de fosfato ou um tampão de arginina/H2S04/Na2S04.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dito tampão é um tampão tendo de 10 a 50 mmol/1 de fosfato.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados do grupo que consiste em sais, diluentes, solventes e conservantes farmaceuticamente aceitáveis.

11. Composição de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados do grupo que consiste em agentes de tonicidade, polióis, antioxidantes, e detergentes não-iônicos.

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é um poliol.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o poliol é selecionado do grupo que consiste em manitol, sorbitol, glicerol, trealose e sacarose.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o poliol é manitol.

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende um antioxidante.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o antioxidance é metionina.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende até 1 mmol/1 de CaCl2.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizada pelo fato de que o detergente não-iônico é polissorbato 80, polissorbato 20 ou pluronic F68.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o detergente não-iônico é o pluronic F68.

20. Composição de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que compreende até 1% (peso/volume) do detergente não-iônico .

21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que compreende até 0,1% (peso/volume) do detergente não-iônico.

22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoietina é um conjugado, o dito conjugado compreendendo uma glicoproteína de eritropoietina humana, sendo que a dita glicoproteína está ligada covalentemente a "n" grupos de poli-(etileno glicol) da fórmula -CO-(CH2)x-(OCH2)m-OR com o -CO de cada grupo de poli(etileno glicol) formando uma ligação de amida com um dos ditos grupos amino; em que R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m varia de cerca de 450 a cerca de 900; n varia de 1 a 3; e n e m são escolhidos de tal maneira que o peso molecular do conjugado menos o da glicoproteína de eritropoietina varia de 20 quilodáltons a 100 quilodáltons.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de eritropoietina tem a fórmula: (I) em que m, n, x e R são conforme definidos na reivindicação 22, e P é o resíduo da glicoproteína sem o(s) grupo (s) amino que forma(m) ligação (ões) de amida com o(s) grupo (s) de poli(etileno glicol).

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (I), x é 2, m é de 650 a 750, n é 1 e R é metila.

25. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a proteína de erítropoietina é um conjugado, o dito conjugado compreendendo uma glicoproteína de eritropoietina humana, sendo que a dita glicoproteína está ligada covalentemente a um a três grupos de alcóxi-inferior-poli(etileno glicol), sendo que cada grupo de poli(etileno glicol) está ligado covalentemente à glicoproteína através de um ligante de fórmula -C(0)-X-S-Y-, com o C(0) do ligante formando uma ligação amida com um dos ditos grupos amino, X é -(CH2)k_ ou -CH2(0-CH2-CH2)k-, em que k varia de 1 a cerca de 10, Y é e o peso molecular médio de cada porção de poli(etileno glicol) varia de cerca de 20 quilodáltons a cerca de 40 quilodáltons, e o peso molecular do conjugado varia de cerca de 51 quilodáltons a cerca de 175 quilodáltons.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoietina é um conjugado de fórmula: em que n é um número inteiro de 1 a 3; m é um número inteiro de 450 a 900; R é uma alquila inferior; X é -(CH2)k- ou “CH2 (O-CH2-CH2) k~, e P é o resíduo da glicoproteína de eritropoietina sem o grupo ou grupos amino que formam uma ligação de amida com X.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoietina é um conjugado de fórmula: em que n é um número inteiro que varia de 1 a 3; m é um número inteiro que varia de 450 a 900; R é uma alquila inferior; X é -(CH2)k_ ou -CH2 (0-CH2-CH2) k~, e P é o resíduo da glicoproteína de eritropoietina sem o grupo ou grupos amino que formam uma ligação de amida com X.

28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de proteína de eritropoietina por ml.

29. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de proteína de eritropoietina por ml, de 10 a 200 mmol/1 de sulfato, e de 10 a 50 mmol/1 de fosfato, a um pH de 6,0 a 6,5.

30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que consiste em 50 ou 400 pg/ml de eritropoietina peguilada, e compreende 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% (p/v) de manitol e 1 mM de metionina, e pH de 6,2.

31. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende até 20 mM de metionina, de 1 a 5% de um poliol (p/v), até 0,1% de pluronic F68 (p/v), e opcionalmente até 1 mM de CaCl2.

32. Composição de acordo com a reivindicação 29 ou 31, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 40 mmol/1 de sulfato, 10 mmol/1 de fosfato, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), e pH de 6,2.

33. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de eritropoietina por ml, de 10 a 100 mmol/1 de NaCl, de 10 a 50 mmol/1 de fosfato, pH de 6,0 a 7,0, e, opcionalmente, de 1 a 5% de um poliol.

34. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que compreende 20 mM metionina, até 0,1% de pluronic F68 e, opcionalmente, 7,5 μηαοΐ/ΐ de CaCl2.

35. Composição de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de proteina de eritropoietina por ml, 100 mmol/1 de NaCl, 10 mM metionina, 0,01% pluronic F68, e 10 mmol/1 de fosfato, e pH 7,0.

36. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 10.000 pg de proteina de eritropoietina por ml, de 10 a 50 mmol/1 de arginina, pH de 6 a 6,5, de 10 a 100 mmol/1 de sulfato de sódio.

37. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que compreende até 20 mM metionina, até 0,1% de pluronic F68, e, opcionalmente, até 1 mmol/1 de CaCl2 e, opcionalmente, de 1 a 5% de um poliol.

38. Composição de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg até 10.000 pg de proteina de eritropoietina por ml, 40 mmol/1 de arginina, pH de 6,2, 30 mmol/1 de sulfato de sódio, 3% de manitol, 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 e, opcionalmente, 1 mmol/1 de CaCl2.

39. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende de 25 a 2.500 pg/ml de eritropoietina e a) 10 mM de fosfato de sódio/potássio, 100 mM de NaCl, e pH de 7,0, ou b) 10 mM de fosfato de sódio, 120 mM de sulfato de sódio, e pH de 6,2, ou c) 10 mM fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), pH 6,2, ou d) 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), e pH de 6,2, ou e) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), e pH de 6,2, ou f) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% pluronic F68 (p/v), e pH de 6,2.

40. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteína de eritropoietina é de 50, 100, 400, 800 ou 2.500 pg/ml.

41. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol, 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68, e pH de 6,2.

42. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol, 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68, e pH de 6,2.

43. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoietina tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2.

44. Processo para a preparação de uma composição, conforme definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que compreende: misturar uma proteína de eritropoietina humana peguilada com uma solução que compreende um ânion de carga múltipla, e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e ajustar o pH para valores de 5,5 a 7,0, usando um tampão farmaceuticamente aceitável.

45. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que se destina à preparação de medicamentos para o tratamento e a ■ prevenção de enfermidades correlacionadas com a anemia em pacientes com insuficiência renal crônica (CRF), AIDS e/ou para o tratamento de pacientes de câncer submetidos à quimioterapia.