JP5728016B2 - 組換えヒトエリスロポエチン(epo)を精製するためのプロセス、このようにして精製されたepoおよびこれを含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
EP205564は、カチオン交換クロマトグラフィーステップを用い、続いてその後にRP−HPLCを行うEPOの精製を記載している。
EP228452およびUS4,667,016は、アニオン交換体、続いてRPクロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィーを行うEPO精製を記載した。
EP428267は、RPクロマトグラフィー後にさらにアニオン交換体による(特に酸性)アイソフォームの単離を取り扱うEP228452による方法の改善を記載している。
EP1394179は、色素アフィニティークロマトグラフィー、HIC、ハイドロキシアパタイト、RP−HPLCおよびアニオン交換体を含む精製プロセスを記載している。
EP1428878は、捕捉ステップとしての第1アニオン交換クロマトグラフィーステップおよび任意の酸性洗浄ステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および第2のアニオン交換クロマトグラフィーステップと酸性洗浄ステップを用いることによる、高シアリル化EPOアイソフォームの精製法を記載している。
WO99/28346は、炭水化物構造中のN−アセチル−ラクトサミン単位および/または四分岐型(tetra−antennary)分枝に関する高度のEPO精製を記載している。精製プロセスは、細胞培養上清で始め、アフィニティークロマトグラフィーによる捕捉、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトおよび逆相クロマトグラフィーによる精製を行う。
WO03/045996、細胞培地からrhEPOを回収し、精製する方法であって、とりわけ、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーのステップを含む方法を記載している。
WO03/080852は、EPOを産生するためのプロセスであって、少なくとも色素アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーを含み、場合によってゲルろ過クロマトグラフィーをさらに含むプロセスを記載した。
Miyakeら、J.Biol.Chem 252(1977),5558−5564は、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲルろ過および吸着クロマトグラフィーを含む7ステップ手順による尿EPOの精製を記載している。
Broudyら、Arch.Biochem.Biophys.265(1988),329−336は、Affi−Gel Blueクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによりEPOを精製するために、トランスフェクトされたBHK細胞系を使用した。
Gokanaら、J.Chromatography 791(1997),109−118は、免疫親和性によるEPOの以前の精製の後のDEAEクロマトグラフィーによる組換えヒトEPOアイソフォームの分離を記載している。EPOアイソフォームの分離は、それらの異なるpIに基づく。
Gotoら、Bio/Technology 6(1988),67−71 は、免疫親和性、ゲルクロマトグラフィーおよびハイドロキシアパタイトによるEPOの精製を記載している。
Hokkeら、Eur.J.Biochem.228(1995),981−1008は、N−グリカンおよびO−グリカンの個別分析のためのPNGase処理を含むEPOのグリカン分析を記載している。
Kishino and Miyazaki,J.Chromatography 699(1997),371−381は、末端RPクロマトグラフィーを用いて尿からEPOを精製することを含む糖タンパク質分析の方法を概説している。
Nimtzら、Eur.J.Biochem.213(1993),39−56は、PNGase F消化を含むEPOグリコシル化の分析を記載し、これは、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞で発現され、BHK細胞から得られる組換えヒトEPOが60%しかO−グリコシル化されていないことを示している。
Quelleら、Blood 74(1989),652−657は、昆虫細胞からのEPOの精製を記載し、この場合、精製プロセスは、アニオン交換クロマトグラフィーおよびRP−HPLCおよびその後のレクチンアフィニティークロマトグラフィーを含む。
Sasakiら、J.Biol.Chem.262(1987),12059−12076およびSasakiら、Biochemistry 27(1988)8618−8626は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現され、CHO細胞から得られる組換えヒトEPOの炭水化物構造の分析を記載している。EPOは、他の方法のなかでもRP−HPLCにより精製された。
Skibellら、Blood 98(2001),3626−3634は、組換えEPOと比較して、ヒト血清由来のEPOのグリカン構造の調査を記載し、O−グリコシル化が血液中を循環するEPOでも起こることを示す。
Sytkowski and Donahue J.Biol.Chem.262(1987),1161−1166は、モノクローナル抗体(mAb)の助けを借りて(中和により間接的に)決定されるEPO受容体結合部位を決定した。表IIから、EPOアミノ酸配列111〜129に対するmAbは、最強の中和効果を示すことがわかり、このことは、Ser126に位置するO−グリカンが受容体結合に関与し得ることを意味する。
(a)EPO含有溶液を捕捉し、濃縮し、そして潜在的な夾雑物の大幅な減少をもたらすための色素アフィニティークロマトグラフィー;
(b)EPOの酸性アイソフォームの濃縮、夾雑物(例えば、DNA、HCP)のさらなる除去、および第1カラムから浸出した可能性のある任意の色素リガンドの除去のためのアニオン交換クロマトグラフィー;
(c)Ser126残基でグリコシル化されないEPO分子を除去するため、および夾雑物を除去するための条件下でのRP−HPLC;
(d)RP−HPLC溶媒および凝集種を除去するため、緩衝液を交換するため、およびEPOフラクションを濃縮するためのカチオン交換クロマトグラフィー;ならびに
(e)残存する可能性のある凝集物および他の夾雑物を除去するために用いられる最終クロマトグラフィーステップとしてのサイズ排除クロマトグラフィー
を含む。
最も好ましくは、その表面がC4−アルキル鎖を有するシリカゲル粒子から構成されるVydac C4(Vydac)を使用する。EPOのタンパク質性不純物からの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、希トリフルオロ酢酸の存在下で水中アセトニトリル勾配で実施する。通常、「EPOピーク」の一部は、分別によりカットオフされなければならない。例えば、多くの約9または10のEPOを含む溶出液フラクションにおいて、典型的には全EPOピークの40%を構成し得る最後の1〜4試料を捨てなければならず、一方、残りの溶出液プールを次のステップでさらに精製する;図2も参照。
(a)捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ;
(b)アニオン交換クロマトグラフィーステップ;
(c)逆相(RP)クロマトグラフィーステップ;および
(d)カチオン交換クロマトグラフィーステップ;図1および実施例も参照。
第1ステップにおいて、色素クロマトグラフィーは主にプロテアーゼによる汚染を除去する。青色トリアジン色素、例えばCibachron(登録商標)ブルーが色素として好ましく用いられる。他のトリアジン色素も好適である。色素クロマトグラフィーの支持材料は重要ではないが、多糖ベースの支持材料、例えば、Sepharose、好ましくはSepharose 6 Fast Flowを好ましく使用する。本発明による高シアリル化およびO−グリコシル化EPOアイソフォームの濃縮は、その後のクロマトグラフィーステップで実施される;図1も参照。
(a)捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ;
(b)アニオン交換クロマトグラフィーステップ;
(c)逆相(RP)クロマトグラフィーステップ;
(d)カチオン交換クロマトグラフィーステップ;
(e)サイズ排除クロマトグラフィーステップ;
(f)ナノろ過ステップ;および
(g)ステップ(a)、(b)および/または(e)の前の限外ろ過ステップ
を含む。
EPOタンパク質を含む培地を、当該技術分野で記載されるように、増幅されたヒトEPO遺伝子を含む形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系(CHO dhfr−)の大規模な灌流培養により産生する;例えば、前述の文献を参照。培地中のEPOタンパク質濃度は、細胞の成長に関連する。実際には、生成物発現レベル(mg/体積)は達成される最大細胞数により制限される。したがって、長期の培養期間にわたって高密度細胞培養を可能にする連続灌流培養系を用いて産生を最大にする。灌流を所定の細胞密度で開始し、灌流速度は、細胞数に対して速度を手動で調節して、所定の範囲内に維持される。細胞保持は、音響沈殿槽、ろ過または遠心分離などの標準的手順により達成される。灌流液収穫物を冷却された温度で数回にわけて集める。全体的な方法は、典型的には数週間の灌流培養からなり、5〜10の収穫物を得る。灌流液中の残存細胞および細片を灌流液収穫物から深層ろ過により除去し、そしてタンパク質を好ましくは30kDaの分子量カットオフの接線流限外ろ過により濃縮する。濃縮物をアリコートに分け、そして全収穫物が集められるまで−70℃以下の温度で貯蔵する。濃縮された収穫物をフリーザーから取り出し、そして凍結−解凍ユニット中に入れる。プールされ、解凍された収穫物を、0.45μmの深層フィルターに通してろ過することにより清澄化する。解凍後の全ての下流精製ステップは、周囲温度(17〜25℃)で実施する。
緩衝液および溶液の組成
各精製ステップ用の緩衝液溶液を下記表1に記載する。
Blue Sepharose 6FFは、色素Cibacron Blueと共有結合したアガロース樹脂であり、培養収穫物に含まれる夾雑物の存在下でEPOと優先的を結合するために用いられる。生成物ストリームを、表2で規定するように、アフィニティークロマトグラフィーによりまず精製する。
溶出液を限外ろ過により濃縮し、接線流ろ過ユニットで10kDaカットオフ膜を使用してダイアフィルトレーションする;表3を参照。
Q−Sepharose HP樹脂でのアニオン交換クロマトグラフィーを、EPOの酸性アイソフォームの濃縮、夾雑物(例えば、DNA、HCP)のさらなる除去および第1カラムから浸出し得る任意の色素リガンドの除去のために使用する。加えて、アニオン交換クロマトグラフィーは、外来性ウイルス除去のための有効なステップである。したがって、ダイアフィルトレーション液を表4に明記するようにしてアニオン交換クロマトグラフィーにより処理し、続いてQ溶出液フラクションおよびフラクションプールの0.2μmろ過を行う。
C4樹脂を用いるRP−HPLCは、疎水性に基づいてEPOを潜在的な夾雑物から分離し、そして所望により、Ser126残基でグリコシル化されないEPO分子の量を減少させることもできる。加えて、このステップは第1カラムから浸出した可能性のある残存色素リガンドを除去する。ろ過されたアニオン交換クロマトグラフィーフラクションプールを、表5に明記するようにして、逆相クロマトグラフィーにより精製する。
検定する。最初に、70%(v/v)のアセトニトリルから100%(v/v)のアセトニトリル勾配を使用してカラムを洗浄する。カラムを次いで100%(v/v)のアセトニトリルで洗浄する。100%(v/v)のアセトニトリルから60%(v/v)のアセトニトリルの勾配で洗浄することにより、アセトニトリル濃度を減少させ、カラムを次いで60%(v/v)のアセトニトリル中で貯蔵する。
RP−HPLCステップ後に、溶出液を60〜180分間、22±3℃で保持する。溶出液中のアセトニトリル濃度は約41%(v/v)であり、TFA濃度は約0.1%(v/v)である。プロセスのこの段階中、保持温度および保持時間を制御する。
MacroPrep High S樹脂を使用したカチオン交換クロマトグラフィーを用いて、RP−HPLC溶媒および凝集した種を除去し、緩衝液をかなり短時間で交換する。表7で明記するように、RP−HPLC溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーによって処理し、続いてMacroPrep溶出液の0.2μmろ過を行う。
場合によって、ろ過されたカチオン交換クロマトグラフィー溶出液を、10kDaカットオフの接線流ろ過ユニットを用いる限外ろ過によりさらに濃縮して、所望の体積減少を達成する。ろ過ステップに関する情報を表8に記載する。
Superdex S200 prep gradeサイズ排除クロマトグラフィーは最終(ポリッシング)クロマトグラフィーステップであり、これを用い、残っている可能性のあるいかなる凝集物も除去し、原薬バルク溶液を処方する。限外ろ過(実施例7)後の濃縮物またはCEXクロマトグラフィー(実施例6)後の溶出液を、表9に明記するようにしてサイズ排除クロマトグラフィーにより処理し、続いて実施例9に記載するようにSE−HPLC溶出液の0.2μmろ過を行う。
最後に、15nmナノろ過ステップを精製プロセスに含めて、原薬のウイルス安全性を増大させる。溶出液からウイルス外来性因子を除去する働きをするPlanova 15Nフィルターを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー溶出濾液をナノろ過する。150mlの10mM NaPO4、0.15M NaCl、pH7.2でフラッシュすることにより、ナノフィルターユニットを調製する。0.2μmろ過されたサイズ排除クロマトグラフィー溶出液をナノフィルターにポンプで通し、そして濾液を滅菌使い捨てバッグ中にプールする。
充填プロセスは、EPO原薬製造プロセスの最終ステップである。最終容器を滅菌し、そして発熱物質を除去した後に充填する。ナノろ過されたフラクションを、蠕動ポンプを用いて30ml容積のサイズのバルク原薬貯蔵容器中に分注する。この操作を周囲温度の充填室中のラミナーフローフード(局所的保護)中で実施する。最終生成物の貯蔵は、70℃にて、例えばテフロンコーティングされたPPチューブ中で行うことができる。原薬を薬剤製品製造場所に移すことができ、バルク原薬の温度を輸送の間、ドライアイスを用いて−70℃未満に維持する。
Claims (22)
- Ser126残基でO−グリコシル化された生物活性なエリスロポエチン(EPO)アイソフォームを複雑なタンパク質混合物から、原薬として好適な純粋な形態で精製する方法であって、以下のステップ:
(a)EPO含有溶液を捕捉し、濃縮し、そして潜在的な夾雑物の大幅な減少をもたらすための色素アフィニティークロマトグラフィー;
(b)EPOの酸性アイソフォームの濃縮、夾雑物のさらなる除去、および第1カラムから浸出した可能性のある色素リガンドの除去のためのアニオン交換クロマトグラフィー;
(c)Ser126残基でグリコシル化されないEPO分子を除去するため、および夾雑物を除去するための条件下での逆相高圧液体クロマトグラフィー(RP−HPLC);
(d)RP−HPLC溶媒および凝集種を除去するため、緩衝液を交換するため、およびEPOフラクションを濃縮するためのカチオン交換クロマトグラフィー;ならびに
(e)残存する可能性のある凝集物および他の夾雑物を除去するために用いられる最終クロマトグラフィーステップとしてのサイズ排除クロマトグラフィー;
がこの順序で行われる、方法。 - 1以上のクロマトグラフィーステップにおけるEPOの溶出を段階または勾配溶出により実施する、請求項1に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーステップを、ジエチルアミノエチル基(DEAE)、第4級アミノエチル基(QAE)、第4級アンモニウム基(Q)、ジメチルアミノエチル基(DMAE)および/またはトリメチルアミノエチル基(TMAE)を官能基として含むアニオン交換樹脂または膜を用いて実施する、請求項1又は2に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーステップを、市販のQ−Sepharoseを用いて実施する、請求項3記載の方法。
- RP−HPLCを、メチル基、ブチル基、フェニル基、プロピル基および/またはオクチル基を官能基として含む樹脂を用いて実施する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- RP−HPLCを、市販のC4逆相クロマトグラフィー材料を用いて実施する、請求項5記載の方法。
- カチオン交換クロマトグラフィーステップを、スルホプロピルカチオン交換材料を含む樹脂を用いて実施する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- カチオン交換クロマトグラフィーステップを、市販のMacro−Prep High Sを用いて実施する、請求項7記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーステップを、色素クロマトグラフィー樹脂を用いて実施する請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーステップを、市販のBlue−Sepharoseを用いて実施する、請求項9記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィーステップを、Superdex、Sephacryl、Sephadex、Sepharose、Fractogel、Toyopearl、およびBio−Gelの群から選択されるゲルろ過媒体を用いて実施する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィーステップを、市販のSuperdex−S200を用いて実施する、請求項11記載の方法。
- 7.0のpHの20mMのトリス−HClを含む緩衝液中、0〜200mMのNaClの線形塩勾配を使用する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RP−HPLCステップにおいてEPOを有機溶媒の直線勾配で溶出する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 0〜70%の水中アセトニトリルの直線勾配を使用し、溶媒が0.1%のTFAを含む、請求項14記載の方法。
- アセトニトリルおよび0.1%の水中TFAを含む溶媒でのEPOのアイソクラティック溶出を使用する、請求項15記載の方法。
- 1以上のクロマトグラフィーステップの前に、限外ろ過ステップ、および場合によって最終ステップとしてナノろ過ステップを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のステップ
(f)ナノろ過ステップ;ならびに
(g)ステップ(a)、(b)および/または(e)の前の限外ろ過ステップ
を更に含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。 - EPOがヒト組換えEPOである、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- EPOが、CHO細胞で産生されるヒト組換えEPOである、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から20のいずれかの方法により精製されるSer126残基でO−グリコシル化された生物活性なEPOアイソフォームの調製物を含む医薬組成物であって、前記調製物が1%未満の非O−グリコシル化EPOアイソフォームを含む、医薬組成物。
- EPOがヒト組換えEPOである、請求項21記載の医薬組成物。
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