CN1280309C - 具有高比活的促红细胞生成素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高比活的新EPO组合物，其特征在于高比例的N-乙酰乳糖胺单元和/或糖结构中的四触角分支。另外，本发明也涉及制备这些EPO产物的方法。

Description

具有高比活的促红细胞生成素
本发明涉及具有高比活的新EPO组合物，其特征在于高含量的N-乙酰乳糖胺单元或/和糖结构中的四触角分支。本发明也涉及一种分离这些EPO产物的方法。
促红细胞生成素(EPO)是刺激红细胞产生的人糖蛋白。EPO只是以极低的浓度存在于健康人的血浆中，因此不可能以此方式大量提供。EP-B1-0 148 605和EP-B1-0 205 564描述了重组人EPO在CHO细胞中的产生。EP-B1-0 148 605所述的EPO具有比尿EPO更高的分子量，并且没有O糖基化。EP-B1-0 205 564所述的从CHO细胞中产生的EPO现在能大量地并以纯形式获得。
此外，人EPO从再生障碍性贫血患者尿中的分离是公知的(Miyake等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)252(1977)，5558-5564)。
以已知在其唾液酸化(sialylation)程度方面不同的多种同种型的混合物形式分离了重组和尿EPO。这些EPO同种型具有不同的等电点，能通过等电聚焦或毛细管电泳分离(见Tsao等人，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)40(1992)，1190-1196；Nieto等人，分析通讯(Anal.Commun.)33(1996)，425-427；Tran等人，色谱学杂志(J.Chromatogr.)542(1991)，459-471；Bietot等人，色谱学杂志759(1997)，177-184；Watson等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)210(1993)，389-393)。含有最大量唾液酸的同种型具有最高的比活，而含有最少量唾液酸的同种型具有最低的比活(见例如Imai等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)194(1990)457-462；EP-A-0 428 267)。
Takeuchi等人(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)，7819-7822)描述了生物活性与唾液酸含量之间的关系，以及二触角与三触角糖结构的比值。Takeuchi等人另外作出结论，EPO糖结构中存在的N-乙酰乳糖胺单元与生物活性不相关。
Fukuda等人(血液(Blood)73(1989)，84-89)涉及对生物活性十分重要的EPO从血液循环中清除的速率，并且得出结论，含有相对大量N-乙酰乳糖胺单元的EPO比不含乳糖胺单元的EPO更快地从循环中清除。Morimoto等人(糖缀合物杂志(Glycoconjugate J.)13(1996)，1093-1120)描述了利用mono-Q层析对EPO同种型的分离，使得单独级分只由少数同种型组成。对这些级分进行的研究显示，所有结构在所有级分中同等分布。在二触角或四触角结构或N-乙酰乳糖胺单元含量与比活之间未发现相关性。
因此现有技术显示，生物活性与糖结构，尤其与唾液酸含量间有普遍的相关性。然而，根本没有迹象表明，四触角结构含量或/和N-乙酰乳糖胺含量与生物活性直接相关。
当纯化EPO制品时，意外地发现，四触角糖结构或/和糖结构中N-乙酰乳糖胺单元含量的增加导致特异生物活性的显著提高。当按照欧洲申请97112640.4在人细胞系中生产EPO时这是特别适用的。
对糖结构只是在N-乙酰乳糖胺单元(LE单元)含量方面不同的单个EPO制品或EPO同种型的比较活性研究显示，具有相同唾液酸含量和大致相同程度的触角、但有较高含量的N-乙酰乳糖胺单元的制品或同种型，有显著高的活性。就此而论，基于N联糖链总数，触角被认为是EPO制品或分离的EPO同种型的二触角、三触角和四触角N联糖链的相对、平均含量(％)。此外发现，特别是在具有含量增高的四触角结构的制品或同种型中，乳糖胺单元的总含量对于体内活性极其重要。例如，以带有LE单元的核心结构进一步延伸(所谓的重复)形式的N-乙酰乳糖胺单元总含量的增加能大大提高生物活性。另外发现，四触角结构含量的增加能提高生物活性。
因此，如果试图高产量地产生具有可能的最高比活的EPO制品，然后进行纯化步骤，那么必须选择并优化生产细胞或/和其培养，以达到四触角糖结构的最高可能含量或/和N-乙酰乳糖胺单元的最高可能含量。
本发明的第一方面涉及一种基本上由糖基化EPO分子组成的EPO组合物，基于糖链总数即二触角、三触角和四触角结构的总和，该糖基化EPO分子含有比例至少为75％、优选地至少80％、特别优选地至少85％、最优选地至少90％的四触角结构。
本发明的另一方面涉及一种基本上由糖基化EPO分子组成的EPO组合物，基于EPO分子每一N联糖链的平均组成，该糖基化EPO分子含有平均数至少3.7个、优选地至少4.0个、特别优选地至少4.3个、最优选地至少4.5个的N-乙酰乳糖胺单元，或者，基于EPO分子的全部三种N联糖结构(总N-糖基化)，其含有数量至少11.1个、优选地至少12.0个、特别优选地至少13.0个、最优选地至少13.5个的N-乙酰乳糖胺单元。
本发明的另一方面涉及一种基本上由糖基化EPO分子组成的EPO组合物，该糖基化EPO分子中每个EPO分子的N-乙酰半乳糖胺单元平均总数乘以每分子EPO的平均唾液酸含量所得的乘积值，其至少为130，优选地至少135，特别优选地至少140，最优选地至少160。
此而论，术语“基本上”意思是，相对于EPO分子总数，希望的EPO分子以优选地至少80％、特别优选地至少90％、最优选地至少95％的比例存在于组合物中。
本发明的再另一方面涉及一种由糖基化EPO分子组成的EPO组合物，相对于糖链总数，该糖基化EPO分子具有平均比例至少75％、优选地至少80％、特别优选地至少85％的四触角结构。
另外，本发明涉及一种由糖基化EPO分子组成的EPO组合物，基于EPO分子每一N联糖链的平均组成，该糖基化EPO分子具有平均数至少为3.7个、优选地至少4.0个、特别优选地至少4.3个、最优选地至少4.5个的N-乙酰乳糖胺单元，或者，基于EPO分子的全部3种N联糖结构，其含有数量至少为11.1个、优选地至少12.0个、特别优选地至少13.0个、最优选地至少13.5个的N-乙酰乳糖胺单元。
四触角结构的最大比例能达到总糖链的100％，其中每一四触角结构在N联糖的核心结构中含有4个N-乙酰乳糖胺单元。以作为所谓的重复的核心结构延伸存在的附加N-乙酰乳糖胺单元，能提高每一糖结构及总糖基化中N-乙酰乳糖胺单元的数量。每一糖基化位点中(即每一N联糖结构中)N-乙酰乳糖胺单元的数量因而能达到6个(四触角结构和2个为重复形式的附加N-乙酰乳糖胺单元)(参见图1)，或者，在含有2个以上的附加N-乙酰乳糖胺单元结构的情况中，甚至能更高。对于总糖基化(三种N联糖结构)，N-乙酰乳糖胺单元的数量能高达18个或更高。
本发明的再一方面涉及一种由糖基化分子组成的EPO组合物，该糖基化EPO分子中EPO分子N-乙酰乳糖胺单元平均总数乘以每分子EPO的平均唾液酸含量所得的乘积平均值，其至少为130，优选地至少135，特别优选地至少140，最优选地至少160。
本发明的另一主题是具有至少两个或几个前述方面的特征的EPO组合物。
根据本发明的组合物可以由一种或几种同种型—即在等电聚焦中具有不同等电点的EPO分子—所组成。根据本发明的组合物优选地包含至少2种、例如2-5种同种型的混合物，尤其3或4种同种型的混合物。
根据本发明的组合物的比活优选地至少为体内175,000IU/mg，特别是200,000IU/mg(正常红细胞性贫血小鼠)。比活特别优选地在约200,000-400,000IU/mg或450,000IU/mg蛋白质的范围内，最优选地在250,000-400,000IU/mg或450,000IU/mg蛋白质的范围内.
在根据本发明的组合物中，每分子EPO的平均唾液酸含量或唾液酸残基平均数优选地是11-14，特别优选地至少11.5，最优选地至少12.5。
另一方面，如EP-B-0 205 564所述，根据本发明的EPO组合物能从作为外源DNA在哺乳动物细胞(如啮齿动物细胞，如CHO或BHK细胞)中表达产物的EPO分子中获得。此外，该组合物也能由如下EPO分子组成，它们是内源DNA在人细胞如无限增殖化细胞系如Namalwa(Nadkarni等人，癌症(Cancer)23(1969)，64-79)、HT1080(Rasheed等人，癌症33(1973)，1027-1033)或HeLa S3(Puck等人，实验方法杂志(J.Exp.Meth.)103(1956)，273-284)中基因激活后的表达产物。这些方法在欧洲专利申请97 112 640.4中有描述，其公开内容作为本申请的一部分。
EPO生物活性的其它重要参数是，含有重复(即附加N-乙酰乳糖胺单元)的糖链相对于N联糖链总数的比例，以及该重复比例与四触角糖链相对于糖链总数的比例之乘积值。对于来源于CHO细胞的EPO，重复的比例优选地为至少30％，特别优选地至少35％，最优选地至少40％。对于来源于人细胞如HeLa细胞的EPO，重复的比例优选地至少为10％，特别优选地至少12％，最优选地至少14％。因此，对于来源于CHO细胞的EPO，含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于糖链总数的比例与四触角结构相对于糖链总数的比例之乘积值优选地为至少2400，特别优选地至少2800，最优选地至少3400。对于来源于人细胞的EPO，该值优选地为至少800，特别优选地至少960，最优选地至少1100。
优选地使用一种EPO组合物，它是通过在含有低含量(如最大1％(v/v))血清的培养基中或者尤其在无血清培养基(参见WO 96/35718)中培养EPO生产细胞而产生的。合适的培养基的实例是RPMI1640或DMEM。
根据本发明的EPO组合物能任选地与常用的药学稀释剂、辅助物质和载体一起配制为药物制剂。如通过反相HPLC(例如在Vydac C4柱上)或/和大小排阻层析(例如在TSK2000SW Ultrapac柱上)所测定的，能用来产生药物制剂的根据本发明的EPO组合物优选地具有至少99％、特别优选地至少99.9％的纯度。
另外，根据本发明的组合物中每10,000IU蛋白质具有优选地小于＜10pg、特别优选地＜5pg、最优选地＜1pg DNA的DNA含量。此外，根据本发明的组合物优选地基本上不含细胞杂质(＜1CFU/ml)和内毒素(＜1EU/10,000IU蛋白质)。
通过应用放射性或荧光标记DNA的杂交试验能测定DNA含量。例如用市售的纯化的人DNA作为探针DNA。另外能用人DNA作为试验标准。这种杂交试验的检测下限大约为0.3pg/10,000IU EPO。EPO制品的微生物与内毒素含量能用如欧洲药典(Pharm.Eu.)或USP所述的标准化方法测定。
优选地具有本发明所希望的特征的EPO组合物可通过至少下列方法之一获得：
(a)选择能产生含有高比例四触角结构或/和N-乙酰乳糖胺单元的糖链的适当生产细胞系，
(b)为了产生含有高比例四触角结构或/和N-乙酰乳糖胺单元的糖链，选择细胞培养的适当培养条件，和
(c)富集含有含高比例四触角结构或/和N-乙酰乳糖胺单元的糖链的EPO分子时，从已知EPO分子组合物中分离不希望的成分。
方法(a)包括合适的细胞系的选择。在此情况中，一方面，能使用公知具有高产量地产生目标糖链结构倾向的细胞。这些细胞系的实例有来源于仓鼠的细胞如CHO或BHK，和人细胞系如HeLa、Namalwa、HT1080或由此衍生的细胞系。Hela S3细胞或改良的CHO细胞是特别优选的。
另一方面，也能通过在细胞中过量表达某种糖基化酶，特异地产生合适的生产细胞，例如通过重组表达或/和内源基因激活。这些糖基化酶的实例有唾液酸转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶和半乳糖基转移酶。
方法(b)包括对细胞培养中适当培养条件的选择。在本发明的第一个实施方案中，方法(b)包括向培养基中加入至少两种、优选地至少三种糖的混合物。糖优选地选自单糖和二糖，如葡萄糖、葡糖胺、核糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、甘露糖-1-磷酸、甘露糖-1-硫酸和甘露糖-6-硫酸。例如含有葡萄糖或/和甘露糖或/和半乳糖的营养培养基是合适的。用含有例如1∶(0.5-3)∶(1-5)、尤其是1∶(0.7-2.4)∶(1.8-4.0)质量比的葡萄糖、半乳糖和甘露糖混合物之营养培养基能获得特别好的结果，其中每种糖特别优选地使用D(+)形式。发酵过程中所有糖的总浓度优选地为O.1-10g/l培养基、特别优选地2-6g/l。优选地根据下面更详细阐述的细胞之各自需要加入糖混合物。
根据另一个优选的实施方案，方法(b)包括养分的控制添加，根据需要优选地包括至少一种对于培养的细胞系而言的必需氨基酸或/和至少一种根据各自细胞需要的糖。这样，在甚至具有高细胞密度发酵(收获时＞10×105细胞/ml、优选地＞20×105细胞/ml的细胞密度)的大发酵罐(体积＞1升，例如50-10,000升)中可获得大大改善的糖基化。为此，连续地或者以适当的时间间隔(如至少每天一次)测定与细胞的营养需求相关的参量浓度，并计算其消耗率。这使得能定量或/和定性地测定细胞的营养需求。这些参量可以是养分或细胞的代谢产物，如谷氨酰胺、铵、葡萄糖或/和乳酸浓度，尤其是谷氨酰胺浓度。
根据本发明此方面加入的养分包括必需氨基酸，例如谷氨酰胺或/和色氨酸或/和糖，和优选地其它非必需氨基酸、维生素、痕量元素、盐或/和生物因子，例如胰岛素。养分特别优选地包括至少一种必需氨基酸和至少一种糖。这些养分优选地以溶解的状态计量加入培养基中。营养液优选地含有谷氨酰胺和糖，尤其是如上所述的至少两种糖的混合物。特别优选地使用葡萄糖、半乳糖和甘露糖的混合物。另外，优选地，在细胞整个生长期中，根据需要，即根据培养基中测定的所选参量的浓度，加入养分。
优选地选择营养液中谷氨酰胺与糖的数量比，使其基本上符合发酵罐中的消耗率。这使得在发酵罐中能保持单个物质的基本恒定的浓度。谷氨酰胺的浓度优选地保持于＜150mg/l培养基的值，并且防止培基中形成≥2.3mmol/l的铵浓度。发酵过程中，如已经说明的，糖的总浓度优选地为0.1-10g/l，特别优选地为2-6g/l培养基。
所用的营养液具有对于总糖优选地为1∶3-20、特别优选地为1∶5-15的谷氨酰胺与糖的质量比。当使用含有谷氨酰胺以及三种糖—葡萄糖、半乳糖和甘露糖—的营养液时，谷氨酰胺与糖的质量比优选地为1∶(1-3)∶(1-5)∶(2-8)，特别优选地1∶(1.5-2.2)∶(1.5-3.6)∶(4-6)。
优选地以重复分批法进行培养，其中在生长期之后收获一部分培养液，剩余的培养液留在发酵罐中，随后再加入新鲜培养基至工作体积。根据本发明的方法使得能以极高产量收获糖基化的EPO。因此，收获时的浓度例如至少为每升培养基30mg，尤其至少40mg EPO。
本发明的再另一方面是从真核细胞中分离EPO的方法，其中真核细胞在适当培养基中培养，并从培养上清液中分离EPO，该方法的特征在于，在≤36℃、优选地30-35.5℃、特别优选地33-35.0℃的温度下进行培养。意外地发现，通过降低培养温度能大大提高含有希望的糖基化的EPO的比例。
方法(c)包括其糖结构不能满足本申请要求的不希望成分从已知EPO组合物中的分离。例如，这能通过对EPO制品的层析纯化来进行，例如通过在三嗪染料凝胶，优选地Cibacron Blue染料凝胶上的亲和层析。另外也能用疏水相互作用层析和反相HPLC分离不希望的成分。合适的配体是丁基、戊基、辛基、十八烷基和苯基残基。反相层析步骤优选地在6.0-8.5、特别优选地7.0-8.0的pH值下进行。合适的洗脱液是，例如乙腈、乙醇或异丙醇，优选地是乙腈。
能测定、合并适当的级分，最后进一步用毛细管区带电泳分析(CZE)处理。另外，也能用来源于蕃茄或马铃薯的凝集素直接富集含有高含量N-乙酰乳糖胺单元的EPO分子(Merkle，Cummings，生物化学杂志262(1987)，8179-8189)。优选地例如以固定化形式使用这些凝集素。
本发明的另一主题是提高EPO组合物比活的方法，其中组合物中富含EPO分子，该EPO分子具有
(a)高比例的四触角糖结构，
(b)大量的N-乙酰乳糖胺单元
(c)N-乙酰乳糖胺单元数与唾液酸含量之高乘积值，
(d)高比例的N-乙酰乳糖胺重复，或/和
(e)N-乙酰乳糖胺重复的比例与四触角糖结构比例之高乘积值。
通过上述方法(a)、(b)和(c)中的一种或多种能实现此富集。
进一步通过下列图和实施例阐述本发明。
图1：显示含有附加N-乙酰乳糖胺单元(重复)和唾液酸的四触角糖结构的图，
图2：显示单个EPO同种型的相对比例对加入培养基中的糖的依赖性，
图3：显示EPO制品的生物活性对加入培养基中的糖的依赖性，
图4：显示EPO同种型的生物活性对N-乙酰乳糖胺重复单元数量的依赖性。
实施例1EPO从细胞系培养上清液中的纯化
基本上用两种方法从人细胞或CHO细胞的培养上清液中纯化EPO，它们在层析步骤的数量和原理方面不同，并且根据培养基的组成和EPO浓度使用：
方法1：第1步：blue-Sepharose柱
第2步：丁基-Sepharose柱
第3步：羟基磷灰石柱
第4步：浓缩
方法2：第1步：blue-Sepharose柱
第2步：羟基磷灰石柱
第3步：浓缩
(备择的第3步：RP-HPLC)
 用方法1对含有2％(v/v)胎牛血清(FCS)的HeLa S3细胞培养上清液纯化的实例：
1.Blue-Sepharose柱：
5ml Hi-Trap Blue柱(购自Pharmacia的预制blue-Sepharose柱)用至少5个柱体积(CV)的缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH7.0；5mMCaCl2；100mM NaCl)平衡。随后在循环过程中以0.5ml/分钟的流速吸附70mlHela细胞上清液(含有大约245μgEPO和70-100mg总蛋白质)过夜。
用至少5CV的缓冲液B(20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl)和至少5CV的缓冲液C(20mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mMCaCl2；250mM NaCl)以0.5ml/分钟洗柱。通过测定OD280的蛋白质含量监测洗涤的成功。
用缓冲液D(100mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml的级分收集洗脱液。
通过将一个等份加于POROS R2/H柱上(Boehringer Mannheim)，用反相(RP)-HPLC测定级分、洗液和洗脱物中的EPO含量。此外，对于含EPO的级分之定性鉴定，也可进行免疫斑点印迹。
合并含有EPO的洗脱级分(8-12ml)，并加于丁基-Sepharose柱上。
blue-Sepharose柱后的产量为大约175μg EPO(相当于约70％)。blue-Sepharose后的产率一般为50-75％。
2.丁基-Sepharose柱(疏水相互作用层析)
自制的2-3ml丁基-Sepharose柱(材料：Toyopearl丁基S650)用至少5CV的缓冲液D(100mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mM CaCl2；2MNaCl)平衡，随后以0.5ml/分钟的流速吸附由步骤1获得的含有EPO(大约150μg EPO)的blue-Sepharose合并液。
用至少5CV的缓冲液E(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl和10％异丙醇)以0.5ml/分钟洗柱。通过测定OD280的蛋白质含量监测洗涤的成功。
用缓冲液F(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl和20％异丙醇)在室温下以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml的级分收集洗脱液。
通过一个等份加于POROS R2/H柱上，用RP-HPLC测定级分、洗液和洗脱物中的EPO含量。此外，对于含EPO的级分的定性鉴定，也可进行免疫斑点印迹。
合并含有EPO的洗脱级分(10-15ml)，并加于羟基磷灰石柱上。
丁基-Sepharose柱的产量是大约13μg EPO(相当于约85％)。丁基-Sepharose的产率是所加blue-Sepharose合并液的60-85％。
3.羟基磷灰石柱
5ml羟基磷灰石柱(购自BioRAD的预制Econo-Pac CHTII)用至少5CV的缓冲液F(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl；20％异丙醇)平衡，随后以0.5ml/分钟的流速吸附由步骤2获得的含有EPO(大约125μg EPO)的丁基-Sepharose合并液。
用至少5CV的缓冲液G(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl)以0.5ml/分钟洗柱。通过测定OD280的蛋白质含量监测洗涤的成功。
用缓冲液H(10mM磷酸钠，pH7.0；80mM NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml的级分收集洗脱液。
通过将一个等份加于POROS R2/H柱上，用RP-HPLC测定级分、洗液和洗脱物中的EPO含量。
合并含有EPO的洗脱级分(3-6ml)。羟基磷灰石柱的产量是大约80μg EPO(相当于约60％)。羟基磷灰石柱的产率一般为所加丁基-Sepharose合并液50-65％。
4.浓缩
用10kD排阻大小的离心单元(例如Filtron的Microsep)将从羟基磷灰石步骤获得的合并的EPO级分浓缩为0.1-0.5mg/ml的浓度，加入0.01％吐温20，以等份贮存于-20℃。
产率示意：
  EPO(μg)   产率(％)
初始   245   100
blue-Sepharose   175   70
丁基-Sepharose柱   130   53
羟基磷灰石柱   80   33
浓缩   60   25
分离的EPO的纯度约＞90％，通常甚至＞95％。
也用其中省略了丁基-Sepharose步骤的方法2来提高EPO产量。该方法尤其能适用于未加或添加有1％(v/v)FCS添加物的细胞培养上清液，产生大致相同纯度(90-95％)的分离的EPO。该方法中，羟基磷灰石柱平衡缓冲液(缓冲液F)中存在的5mM CaCl2导致结合的增强，于是也导致羟基磷灰石步骤中改善的可重复的EPO洗脱行为。因此，原则上应用与方法1相同的步骤用下列缓冲液施行方法2：
1.Blue-Sepharose柱
平衡缓冲液(缓冲液A)：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl
洗涤缓冲液1(缓冲液B)：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗涤缓冲液2(缓冲液C)：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗脱缓冲液(缓冲液D)：100mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；2MNaCl
2.羟基磷灰石柱
平衡缓冲液(缓冲液F)：50mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；1MNaCl
洗涤缓冲液(缓冲液G)：10mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；80mM NaCl
洗脱缓冲液(缓冲液H)：10mM磷酸钠，pH7.0；0.5mM CaCl2；80mMNaCl
产率示意
  EPO(μg)   产率(％)
  初始   600   100
  blue-Sepharose   450   75
  羟基磷灰石柱   335   55
  浓缩   310   52
方法1中向缓冲液C-G中加入5mM CaCl2也导致结合的增强和更确定的羟基磷灰石柱的洗脱。
此外或另外，也能用下列步骤纯化EPO：
-RP-HPLC，例如用Vydac C4材料
-DEAE-Sepharose ff层析
-渗滤
实施例2：EPO从培养上清液中的纯化，而保留同种型1-8(比较)
1.原材料
通过重复分批法发酵来源于哺乳动物细胞(如CHO或人细胞)的EPO。用预培养物接种1000升发酵罐，大约3-5天后收获发酵罐内容物。收获后，通过离心从发酵培养液中除去细胞。用1mol/l乙酸将无细胞的培养上清液调节为pH5.0-5.2，在1-9℃下过滤。
2.Blue-Sepharose层析
层析柱(Amicon P440×500，Amicon，GB)中填充60-80升blue-Sepharose，并用0.5N NaOH再生。随后用大约3个柱体积(CV)的乙酸缓冲液平衡该柱。
在10±5℃的温度和800-1400ml/分钟的流速下将调节为pH5的无细胞培养上清液吸附于柱上。在相同的流速和5±4℃下，用约1CV的洗涤缓冲液1再次洗柱。之后用大约2CV的洗涤缓冲液2洗柱。随后用大约3CV的洗脱缓冲液洗脱该柱.收集总蛋白质峰(约30-60升)，用HCl调节为pH6.9，贮存于5±4℃直到进一步处理。在该层析步骤中浓缩产物溶液，达到约40-50％的纯度。
平衡缓冲液：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.1mM NaCl，pH5.0±0.2
洗涤缓冲液1：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.25mM NaCl，pH5.0±0.2
洗涤缓冲液2：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pH6.5±0.3
洗脱缓冲液：100mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1M NaCl，pH9.0±0.2
3.丁基-Toyopearl层析(疏水性层析)
层析柱(Pharmacia BPG 300/500)中填充30-40升丁基-Toyopearl，用4M盐酸胍和0.5N NaOH再生。随后用至少3CV的平衡缓冲液平衡该柱。
调节blue-Sepharose柱的洗脱物到10％异丙醇，并在27±2℃的温度和800-1200ml/分钟的流速下吸附到柱上。在相同的温度和流速下用约1CV的平衡缓冲液然后用约2CV的洗涤缓冲液再次洗柱。随后用约3CV的洗脱缓冲液洗脱。收集总蛋白质峰(约10-18升)，立即用稀释缓冲液稀释三倍，贮存于15℃直到进一步处理。用该层析法可达到大约90％的纯度。
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，10％异丙醇，pH6.9±0.2
洗涤缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，19％异丙醇，pH6.9±0.2
洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，27％异丙醇，pH6.9±0.2
稀释缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pH6.9±0.2
4.羟基磷灰石Ultrogel层析
层析柱(Amicon P440×500或相当物)中装入30-40升羟基磷灰石Ultrogel，用0.5N NaOH再生。随后用至少4CV的平衡缓冲液平衡该柱。
在大约15℃的温度和500-1200ml/分钟的流速下，将丁基-Toyopearl柱的洗脱物吸附于柱上。在相同的温度和流速下用约1CV的平衡缓冲液然后用约2CV的洗涤缓冲液再次洗柱。随后用大约3CV的洗脱缓冲液洗脱。收集总蛋白质峰(约10-18升)，贮存于15℃直到进一步处理。用该层析法可达到大于95％的纯度。
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，9％异丙醇，pH6.9±0.2
洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pH6.8±0.2
洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，10mM磷酸钾，0.5M CaCl2，pH6.8±0.2
5.反相HPLC(RP-HPLC)
在22±4℃的温度下用Merck Prepbar 100分离装置(或相当物)进行制备型HPLC。分离柱(100mm×400mm，3.2l)中装入Vydac C4材料。使用前，通过重复应用缓冲液A到100％溶剂的梯度再生该柱，随后用缓冲液A平衡。
用三氟乙酸酸化羟基磷灰石柱的洗脱物至约pH2.5，无菌过滤。随后在22±4℃的温度和250-310ml/分钟的流速下加于柱上。在相同温度和流速下用缓冲液A到缓冲液B的线性梯度洗脱该柱。分级收集洗脱峰。通过首先加入4倍体积的HPLC稀释缓冲液立即中和洗脱物。
合并在分析型HPLC中纯度至少为99％的级分(合并体积约为4-6升)。用该层析法分离痕量杂质，达到超过99％的纯度。
缓冲液A：0.1％三氟乙酸水溶液
缓冲液B：80％乙腈、0.1％三氟乙酸水溶液
HPLC稀释缓冲液：10mM磷酸Na/K，pH7.5±0.2
6.DEAE-Sepharose ff层析
层析柱(Amicon P90×250或相当物)中填充100-200ml凝胶(对应于每克所加EPO)，用0.5N NaOH再生。随后首先用100mM磷酸Na/K缓冲液，pH7.5平衡，然后用至少12CV的平衡缓冲液平衡该柱。
在5±4℃的温度和大约150ml/分钟的流速下，将HPLC柱的洗脱物吸附于柱上。在相同的温度和流速下用至少5CV的平衡缓冲液洗涤，然后用约10CV的洗涤缓冲液再次洗柱。随后再用约10CV的平衡缓冲液洗涤，然后用大约7CV的洗脱缓冲液洗脱。收集总蛋白质峰(约2-5升)，无菌过滤并分配。
在该层析中，分离HPLC步骤的溶剂，并去除痕量杂质。纯度大于99％。
平衡缓冲液：10mM磷酸Na/K，pH7.5±0.2
洗涤缓冲液：30mM乙酸钠，pH4.5±0.1
洗脱缓冲液：10mM磷酸Na/K，80mM NaCl，pH7.5±0.2
实施例3：EPO从培养上清液中的纯化而保留同种型1-4(发明)
1.原材料
用重复分批法发酵来源于哺乳动物细胞如CHO或人细胞的EPO。用预培养物接种10升发酵罐，大约5天后收获发酵罐内容物。收获后，通过离心从发酵培养液中除去细胞。用1mol/l乙酸将无细胞培养上清液调节为pH5.0-5.2，在1-9℃下过滤。
2.Blue-Sepharose层析
适当的层析柱中填充150-250ml blue-Sepharose，并用0.5N NaOH再生。随后用大约3个柱体积(CV)的乙酸缓冲液平衡该柱。
在10±5℃的温度和1-2CV/小时的流速下使调节为pH5的无细胞培养上清液吸附于柱上。在相同的流速和5±4℃下，用约1CV的洗涤缓冲液1再次洗柱。之后用大约2CV的洗涤缓冲液2洗涤。随后用大约3-6CV的洗脱缓冲液洗脱该柱。分级收集蛋白质峰。CE分析后，合并适当级分，用HCl调节为pH6.9，贮存于5±4℃直到进一步处理。在该层析步骤中产物溶液得到浓缩，杂质和碱性同种型得到分离。
平衡缓冲液：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.1mM NaCl，pH5.0±0.2
洗涤缓冲液1：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.25mM NaCl，pH5.0±0.2
洗涤缓冲液2：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pH6.5±0.3
洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，pH8.0±0.2
3.丁基-Toyopearl层析(疏水性层析)
在适当层析柱中填充200-300ml丁基-Toyopearl，用4M盐酸胍和0.5N NaOH再生。随后用至少3CV的平衡缓冲液平衡该柱。
调节blue-Sepharose柱的洗脱物至10％异丙醇，并在27±2℃的温度和1-2CV/小时的流速下吸附到柱上。在相同的温度和流速下用约1CV的平衡缓冲液洗涤，然后用约2CV的洗涤缓冲液再次洗柱。随后用约5-10CV的洗脱缓冲液洗脱。收集蛋白质峰的级分，立即用稀释缓冲液稀释三倍。CE分析后，合并适当的级分，贮存于15℃直到进一步处理。在该层析中进一步去除了碱性同种型，可达到大约＞80％的纯度。
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.2M NaCl，10％异丙醇，pH6.9±0.2
洗涤缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.2M NaCl，17％异丙醇，pH6.9±0.2
洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.2M NaCl，23％异丙醇，pH6.9±0.2
稀释缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pR6.9±0.2
4.羟基磷灰石Ultrogel层析
适当的层析柱中填充150-200ml羟基磷灰石Ultrogel，用0.5NNaOH再生。随后用至少4CV的平衡缓冲液平衡该柱。
在约15℃的温度和1-2CV/小时的流速下，将丁基-Toyopearl柱的洗脱物吸附于柱上。在相同的温度和流速下用大约1CV的平衡缓冲液洗涤，然后用大约2CV的洗涤缓冲液再次洗柱。随后用大约3CV的洗脱缓冲液洗脱。收集总蛋白质峰，贮存于15℃直到进一步处理。在用该层析法可达到大于95％的纯度。
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl2，0.06M NaCl，7.5％异丙醇，pH6.9±0.2
洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl，5mM CaCl2，pH6.8±0.2
洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，10mM磷酸钾，0.5mM CaCl2，pH6.8±0.2
5.反相HPLC(RP-HPLC)
应用Vydac C4分离柱(20mm×250mm，大约80ml)在22±4℃的温度下进行半制备型HPLC。使用前，通过重复应用缓冲液A到100％溶剂的梯度再生该柱，随后用缓冲液A平衡。
在22±4℃的温度和8-15ml/分钟的流速下将羟基磷灰石柱的洗脱物加于柱上。根据下列HPLC方案，在相同温度和流速下用缓冲液A到缓冲液B的线性梯度洗脱该柱。分级收集洗脱峰。通过首先加入4倍体积的HPLC稀释缓冲液立即稀释洗脱物。
HPLC方案
  时间(分钟)   步骤   ％缓冲液A(v/v)   ％缓冲液B(v/v)
  开始
  0.0   100   0
  洗涤1
  10.0   100   0
  洗涤2
  20.0   50   50
  洗涤3和洗脱(*)
  160.0   0   100
  再洗涤
  170.0   0   100
  恢复初始条件
  171.0   100   0
(*)洗涤3和洗脱条件：50％缓冲液B到100％缓冲液B的梯度，50-200分钟，优选地140分钟。
合并在分析型HPLC中纯度至少为99％并且根据CE分析为适当的级分。用该层析去除痕量杂质和碱性同种型残余，达到大于99％的纯度。
缓冲液A：10mM磷酸Na/K，pH7.0±0.2
缓冲液B：10mM磷酸Na/K，80％乙腈，pH7.0
HPLC稀释缓冲液：10mM磷酸Na/K，100mM NaCl，pH7.5±0.2
6.渗滤
适当大小的渗滤装置备有10kD盒(cassette)，并用1N NaOH再生。随后用本体缓冲液漂洗该装置使之不含碱液。
在5±4℃的温度下浓缩HPLC柱的洗脱物，并对10倍体积的大量本体缓冲液渗滤。终浓度应为1-3mg/ml。
该步骤用来除去HPLC步骤的残余溶剂，调节所需的本体缓冲液条件和本体活性物质的产物浓度。
本体缓冲液：10mM磷酸Na/K，100mM NaCl，pH7.5±0.2
实施例4EPO体内比活的测定(对正常红细胞性贫血小鼠的生物测定)
利用EPO施用后血液中网织红细胞的增多的方法，在小鼠中体内测定EPO对红细胞前体细胞的增殖与分化的剂量依赖活性。
将待分析的EPO样品的不同剂量和EPO标准(用EPO WHO标准标准化)对8只小鼠的每一只肠胃外施用。随后将小鼠置于恒定的规定条件下。EPO施用4天后从小鼠中收集血液，并用吖啶橙染色网织红细胞。用流式细胞仪经显微荧光测定法通过分析红-荧光直方图，测定每30,000个红细胞的网织红细胞计数。
按照Linder所述的应用平行直线的浓度配对测定方法(Linder，“Planen und Auswerten von Versuchen”，第三版，1969，BirkenhauserVerlag，Basel)，由样品和不同剂量标准的网织红细胞计数值计算生物活性。
通过从在无血清培养基中培养的CHO细胞之培养上清液中纯化EPO，获得EPO制品CHO1、CHO2和CHO3，分别具有248,000(CHO1)、225,000(CHO2)和186,000IU/mg(CHO3)的生物活性。在从人细胞之培养上清液中纯化EPO的四种制品中，获得比活为220,000(HeLa1)、198,000(HeLa2)、204,000(HeLa3)、176,000(HeLa4)和100,000IU/mg(HeLa5)的产物。实施列11中给出了生物活性值与糖结构参数的相关性。
实施例5唾液酸残基含量的测定
在用产脲节杆茵(Arthrobacter ureafaciens)(A.ureaf，BoehringerMannheim)的神经氨酸酶对唾液酸酶切后，利用Dionex系统的HPAEC-PAD(具有脉冲安培计检测的高pH离子交换层析)用层析法测定唾液酸含量。
将来源于CHO和人细胞系(例如HeLaS3)的不同制品中，每种含有22μg EPO的制品用5mM磷酸钠缓冲液，pH7.2调节为0.2mg/ml的EPO浓度。通过RP-HPLC用每种制品的一半精确测定EPO的量。向另一半制品中加入5mM U的产脲节杆菌神经氨酸酶，37℃温育过夜(约18小时)。随后等分消化混合物，用H2O稀释20倍至500μl，将50μl(相当于大约27pmol EPO)加于Dionex系统中。为此使用下列层析参数：
柱：CarboPac PA 100
流速：1.0ml/分钟
检测器灵敏度：300nA
梯度：t(分钟)    ％缓冲液B
0                17
7                17
9                100
12               100
13               0
20               0
缓冲液A：0.1M NaOH
缓冲液B：0.1M NaOH；0.5M乙酸钠
利用从也经分析的唾液酸标准(Boehringer Mannheim)的值获得的校准线，测定所加样品中唾液酸的量。由唾液酸测定(Dionex系统)结果和利用RP-HPLC对EPO含量测定的结果计算唾液酸含量(摩尔唾液酸/摩尔EPO)。
CHO细胞的EPO具有每摩尔EPO12.9摩尔(CHO1)、11.8摩尔(CHO2)和11.7摩尔(CHO3)唾液酸的平均含量。来源于人细胞的EPO制品具有每摩尔EPO13.1摩尔(HeLa1)、13.2摩尔(HeLa2)、13.3摩尔(HeLa3)、11.6摩尔(HeLa4)和10.8摩尔(HeLa5)唾液酸的含量(参见实施例11)。
实施例6二触角、三触角和四触角糖结构比例的测定
通过Dionex系统的HPAEC-PAD层析分析N联糖结构。通过用N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim)和产脲节杆菌神经氨酸酶(Boehringer Mannheim)酶切，分离来源于CHO和人细胞系(例如HeLaS3)的EPO制品的脱唾液酸寡糖。
利用MicroCon超离心单元(Amicon，排阻大小10kD)使10μg或30μg EPO(每个混合物)脱盐，并用10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2调节为0.2或0.3mg/ml的浓度。随后向每一混合物中加入1U N-糖苷酶F和10mU神经氨酸酶，37℃温育过夜(约18小时)。为了从切割的寡糖中分离EPO多肽部分，温育后用Ultrafree离心单元(Millipore，排阻大小10kD)离心该混合物，用20μl H2O再洗Ultrafree装置两次。用H2O将滤液中所含的寡糖补充到150μl，其中100μl用Dionex系统分析。
对其使用下列层析参数：
柱：CarboPac PA 100
流速：1.0ml/分钟
检测器灵敏度：300nA
梯度：t(分钟)    ％缓冲液B
0                0
2                0
60               10
62               100
67               100
t(分钟)          ％缓冲液B
69                  0
          80              0
缓冲液A：0.1M NaOH
缓冲液B：0.1M NaOH；0.5M乙酸钠
在复合类型N-糖层析谱中通过标准寡糖(Oxford Glyco Systems)鉴定峰，并通过用酶内切-β-半乳糖苷酶或岩藻糖苷酶对EPO寡糖酶促消化，随后用Dionex系统分析来证实。利用相对于总峰面积(二触角、三触角和四触角结构的峰面积的总和)之代表相应N-糖结构的峰面积，计算二触角、三触角和四触角结构的百分数。
来源于CHO细胞的EPO具有4.2％二触角糖结构、22.3％三触角糖结构和73.5％四触角糖结构的含量(CHO3)，在CHO1制品中有86.7％四触角糖结构的含量，在CHO2中为78.6％。人细胞系EPO制品中二触角/三触角/四触角结构的含量对于HeLa1分别为5.8/8.8/85.4％，对于HeLa2分别为5.1/12.7/82.2％，对于HeLa3分别为4.1/17.7/78.2％，对于HeLa4分别为10.1/19.2/70.6％，对于HeLa5分别为12.6/25.4/62％(参见实施例11)。
实施例7  N-乙酰乳糖胺单元平均含量和附加N-乙酰乳糖胺单元(重复)平均含量的测定
由实施例6的实验之层析谱峰面积，计算EPO的N联糖结构中N-乙酰乳糖胺单元的总数(即核心糖结构加重复)。
如下计算每一糖链的N-乙酰乳糖胺单元平均含量数(n)：
n＝∑％(bi)×2+％(tri)×3+％(tetra)×4+％(tri+1r)×4+％(tetra+1r)×5+％(tri+2r)×5+％(tetra+2r)×6
其中
％(bi)＝相对于N联糖结构总量(100％)二触角结构的百分数
％(tri)＝不含附加N-乙酰乳糖胺单元的三触角结构的百分数
％(tetra)＝不合附加N-乙酰乳糖胺单元的四触角结构的百分数
％(tri+1r)＝含有1个附加N-乙酰乳糖胺单元的三触角结构的百分数
％(tetra+1r)＝含有1个附加N-乙酰乳糖胺单元的四触角结构的百分数
％(tri+2r)＝含有2个附加N-乙酰乳糖胺单元的三触角结构的百分数
％(tetra+2r)＝含有2个附加N-乙酰乳糖胺单元的四触角结构的百分数
对于来源于CHO细胞的EPO，发现每个糖链N-乙酰乳糖胺单元的平均数为4.3(CHO1)、4.4(CHO2)和4.2(CHO3)个。在来源于人细胞的EPO制品中，发现N-乙酰乳糖胺单元数为4.0(CHO1)、4.0(CHO2)、3.9(CHO3)、3.75(CHO4)和3.6(CHO5)(参见实施例11)。
由于EPO含有3种N联糖结构的事实，N-乙酰乳糖胺单元的总数为三倍高。基于EPO的总糖基化，来源于CHO细胞的EPO中N-乙酰乳糖胺单元数为12.9(CHO1)、13.2(CHO2)和12.6(CHO3)。在来源于人细胞的EPO制品中，相应的值是12.0(CHO1)、11.9(CHO2)、11.7(CHO3)、11.25(CHO4)和10.8(CHO5)。
对于来源于CHO细胞的EPO，每一糖结构的N-乙酰乳糖胺单元数乘以各自唾液酸含量的乘积得到55.5(CHO1)、52(CHO2)和49.3(CHO3)的值。对于来源于人细胞的EPO制品，相应值为52.4(CHO1)、52.5(CHO2)、51.3(CHO3)、43.5(CHO4)和38.9(CHO5)。
基于EPO的总糖基化(3种N联糖结构)，对于来源于CHO细胞的EPO，N-乙酰乳糖胺单元数乘以各自唾液酸含量的乘积分别为166.5(CHO1)、156(CHO2)和147.9(CHO3)。在来源于人细胞的EPO制品中，相应的值为157.2(CHO1)、157.5(CHO2)、153.9(CHO3)、130.5(CHO4)和116.7(CHO5)，参见实施例11。
另一重要参数是能与核心糖结构结合的N-乙酰乳糖胺单元的量，如所谓的重复(参见如图1)。重复的含量规定为含有重复的糖结构相对于所有N联糖结构总数(bi+tri+tetra＝100％)的百分数。
在来源于CHO细胞和人细胞的EPO制品中该重复的比例可能不同。对于来源于CHO细胞的制品测定到39.6％(CHO1)、51％(CHO2)和36.8％(CHO3)的重复百分数。对于来源于人细胞的制品测定到18％(CHO1)、16.5％(CHO2)、14.0％(CHO3)、12.2％(CHO4)和9.8％(CHO5)的重复百分数(参见实施例11)。
实施例8：根据需要控制及补料影响EPO的生物活性
在36.5℃的温度下，用按需要补料的重复分批法(重复补料分批法)进行培养。为此将不含血清、蛋白质缺乏的培养基置于搅拌式发酵罐(总工作体积：10L)中，并用接种培养物接种一次。接种后的细胞密度为3±1×105个活细胞/ml。
在144±24小时的生长期后，收获一部分培养液。其余的培养液残留于发酵罐中，作为下一个生长期的接种物；为此，发酵罐中再次填充新鲜培养基到工作体积。
通过离心发酵培养液获得含有EPO的培养上清液。
在生长期中向培养液中连续加入营养液。为此，将含有营养液的贮存罐与发酵罐连接在一起。营养液含有氨基酸、维生素、胰岛素、痕量元素、盐、谷氨酰胺和糖。如下进行两种发酵：
在发酵A中，营养液含有D-(+)-葡萄糖作为糖，在发酵B中，糖是D-(+)-葡萄糖、D-(+)-半乳糖和D-(+)-甘露糖。发酵B中谷氨酰胺与糖的质量比为1∶2.2∶3.6∶6。营养液中单个糖的浓度为7.2-18g/l。
定期分析发酵B之培养物中的谷氨酰胺浓度，并计算消耗。营养液的瞬时容积流量应满足细胞对养分的需求。在发酵A中，不用谷氨酰胺浓度作为控制变量。发酵B中的营养液含有质量比为2∶3∶5的D-(+)-葡萄糖、D-(+)-半乳糖和D-(+)-甘露糖的混合物。通过相应的补料使培养期间发酵罐中所有糖的浓度保持为2-6g/l。
生长期间细胞密度改变为大于20×105个细胞/ml，到收获时一般为30±10×105细胞/ml。收获时EPO浓度一般为40±10mg/l。
例如，通过ELISA测定收获的培养液中人促红细胞生成素的浓度。例如，通过用毛细管区带电泳(CZE)分离测定存在的该蛋白质同种型的百分比分布。
表1显示补加含有葡萄糖的营养液的发酵A与以受控的、需求导向的方式补加含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖的营养液的发酵B之间，EPO同种型分布的比较。发酵B中EPO同种型的含量计算为发酵A的相应同种型的百分数。后者每一个都标准化为100％。数据显示，与发酵A相比，在发酵中以非常高的比例存在所希望的较高糖基化的EPO同种型2-4。
表1
  CZE中的同种型名称   1   2   3   4   5   6   7   8
  [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]
 发酵A：补加葡萄糖   n.d.   100   100   100   100   100   100   100
 发酵B：按需要补加葡萄糖、甘露糖和半乳糖   n.d.   136   140   115   102   91   76   55
n.d.＝不可测定，因为该值低于检测下限
用补料获得的同种型模式在四种后续发酵收获中可复现，该发酵由受控的、和需求导向的补加营养液。
实施例9：通过改变培养温度影响EPO的生物活性
方法如实施例8(发酵B)所述，除了发酵罐温度是35.0℃而不是36.5℃及以1000升的规模进行发酵之外，采用受控及需求导向补料的分批补料法。
表2显示每一个均为营养液受控补加的36.5℃的发酵C与35.0℃的发酵D之间，EPO同种型分布的比较。发酵D中的EPO同种型的含量计算为发酵C的相应同种型的百分数。后者每一个均标准化为100％。数据显示降低温度能大大增加酸性EPO同种型2-4。
表2
  CZE中的同种型名称   1   2   3   4   5   6   7   8
  相对同种型分布   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]   [％]
  发酵C：温度36.5℃   n.d.   100   100   100   100   100   100   100
  发酵D：温度35.0℃   n.d.   131   116   110   94   100   88   86
n.d.＝不可测定，因为该值低于检测下限
实施例10：改变培养基中的糖组成影响EPO的生物活性
下面所示方法显示，通过改变补料培养基中的糖供应能改变人促红细胞生成素的质量。
显示了上述方法的两种变体(称为下面的发酵E和发酵F)，它们在所用培养基的组成方面不同。
在两种制品中，培养基的配制是根据改良的eRDF培养基。不使用血清，而使用重组胰岛素(只是蛋白质添加剂)和其它添加物(例如亚硒酸盐、腐胺、氢化可的松、硫酸铁)，它们通常在无血清或无蛋白质培养基中使用。
补加营养液也是基于改良的eRDF培养基，但不含有KCl、Na2HPO4和NaCl这些盐。
发酵E与F之间的主要区别是向补料培养基中添加多种不同单糖。
发酵E：
对于发酵E使用普通糖D-(+)-葡萄糖。初始浓度为3g/l。通过适当地补加含葡萄糖营养液，培养液中的葡萄糖浓度在整个培养过程中保持为3±0.5g/l。
培养期一般为100±20小时。收获时EPO浓度一般为40±10mg/l。
发酵F：
对于发酵F，除了D-(+)-葡萄糖之外，向补料培养基中以大约1∶2∶3的质量比加入D-(+)-半乳糖和D-(+)-甘露糖。培养期间，通过适当补料使所有糖的浓度保持为0.25g/l-3.5g/l。
该生长的培养期一般为100±20小时。收获时EPO浓度一般为40±10mg/l。
从培养上清液中纯化促红细胞生成素。设计纯化方法(参见实施例2)，使得糖蛋白相关同种型的分布不受影响。
如上所述测定纯化的促红细胞生成素的同种型分布。
人促红细胞生成素同种型的糖结构及其在收获的培养上清液中的分布在发酵E与发酵F中各不相同。与发酵F相比，发酵E具有相当高的同种型2、3和4比例。这些差异是由补加单糖甘露糖和半乳糖引起的(参见图2)。
由正常小鼠试验(实施例4)测定的生物活性与EPO同种型的分布和糖结构相关(图3)。用CZE和HPAEC分析检查从培养上清液E和F中获得的EPO制品的糖结构。
两种EPO制品的触角(二结构、三结构和四结构的含量)、N-乙酰乳糖胺单元(LE)的含量、唾液酸含量(SA)和LE与SA的乘积显示于表3中。
表3
  二结构[％]   三结构[％]   四结构[％]   SA含量   LE含量   LE×SA
  发酵E   12.6   25.4   62.0   10.8   10.8   116.7
  发酵F   10.1   19.2   70.6   11.6   11.25   130.5
实施例11：比活与糖结构的相关性
该实施例中总结了单个EPO同种型的生物活性对糖结构依赖性的研究。为此，分离并比较了不同EPO来源(来源于CHO细胞和人细胞的EPO的不同批次)的同种型(IF)。
11.1利用等电聚焦(IEF)和Western印迹对EPO单个同种型的分离A)IEF凝胶电泳和硝酸纤维素上电印迹的方法
为了以纯形式分离单个同种型，在ultrafree离心单元中使由几种同种型混合物组成的EPO溶液脱盐，并浓缩(5-10mg/ml)。350-1000μg该溶液加于Serva的IEF聚丙烯酰胺预制凝胶中(Servalyt Precotes，pH3-5，300μm，125×125mm)(每泳道含有70-100μg EPO的5-10条泳道)。在5℃和2500V下进行IEF 3.5小时；随后在硝酸纤维素膜上印迹凝胶(200mA下，在含有甲醇但不含SDS的Tris/甘氨酸缓冲液中温印迹3小时)。印迹过程后，取出凝胶并用丽春红S染色硝酸纤维素膜。切下染色的同种型，再用H2O或TBS缓冲液(100mM Tris，pH7.4；150mM NaCl)完全脱色。
B)同种型从膜上的提取
将含有各自同种型的脱色硝酸纤维素膜条带置于2ml Eppendorf管中(对应于IEF凝胶的3-4泳道)，加入1.5ml丙酮，涡旋溶解硝酸纤维素膜。在-20℃下温育过夜，以最佳地沉淀EPO。随后在Bench离心机中以14,000转/分离心10分钟分离含有EPO的沉淀。用1ml丙酮洗沉淀2-3次，然后在氮流下于室温或37℃干燥。随后将EPO沉淀溶解于含有0.01％吐温20的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中，并贮存于-20℃直到进一步分析。
C)同种型从初步分级分离的EPO溶液中的分离
如步骤A)和B)所述分离单个同种型，条件是初始EPO溶液中含有7-8种而不只是3-4种同种型。原材料是经过DE层析(阴离子交换剂)分离的EPO级分。这些级分只含有3-4种同种型(例如同种型6-8或同种型1-4)。为了分离同种型包装，对于每10mg所加的EPO用1-2mlDEAE-Sepharose ff填充适当层析柱，并用0.5M NaOH再生。随后首先用2CV的中和缓冲液平衡，然后用至少5CV的平衡缓冲液平衡该柱。
在5±4℃的温度和可达15CV/小时的流速下，吸附含有8种同种型的纯化EPO制品。然后用2-3CV的平衡缓冲液洗柱，随后用洗涤缓冲液漂洗直到pH值为5.0(约5CV)。
从20mM NaCl开始，以10mM的梯级提高洗脱缓冲液中NaCl的浓度，可洗脱出不同的同种型包装。碱性同种型与离子交换剂微弱结合，在低离子强度时被相应地洗脱，酸性同种型在可达70mM NaCl的较高NaCl浓度时洗脱。在一定的NaCl浓度时洗脱的同种型的量主要取决于原材料和洗脱体积。通常，在个别步骤时继续洗脱，直到OD 280降低至该NaCl浓度时最大值的大约50％。这对应于15-40CV。一种NaCl浓度内洗脱的同种型包装的其它级分需要该同种型的进一步分离。柱的流速可达15CV/小时。
中和缓冲液：10mM磷酸Na/K，pH7.5±0.2
平衡缓冲液：10mM磷酸Na/K，pH7.5±0.2
洗涤缓冲液：30mM NaAc/HAc，pH5.0±0.2
洗脱缓冲液：10mM NaAc/HAc，pH5.0±0.2，20mM NaCl，或以10mM梯级增至70mM NaCl的浓度
通过如步骤A)和B)中所述的纯化，从这样获得的同种型包装中分离单个纯同种型。
由步骤A-C获得的纯同种型(IF)按照其由酸性到碱性的等电点(pI)编号。同种型2(IF2)是具有最低pI的酸性最强的分离同种型。同种型8碱性最强，具有最高的pI。同种型2是具有最低pI的同种型，它能从起始混合物中足量地分离。只有1-2％的同种型1存在于起始混合物中，使得不能获得足够的量用于完全分析。
进行下列分析来表征纯同种型：
—利用RP-HPLC的方法测定量和产率
—通过毛细管电泳和等电聚焦测定纯度和同一性
单个同种型的产率一般为起始混合物中所用同种型的20-30％。
同种型的纯度通常＞90％，大多数甚至＞94％。
11.2结果
对纯化的同种型(IF)获得下列数据：
—N联糖结构的相对分布(相对于总糖基化，二触角、三触角和四触角结构的比例)和重复含量。
—正常小鼠试验中的生物活性
—唾液酸的含量
基本上通过前述方法进行这些测定。
不是分开对每一单个同种型制品测定分离同种型的唾液酸含量，而是以1-3个制品为例，对来源于CHO细胞的EPO同种型2-8或来源于人细胞EPO同种型2-6中的每一个进行测定。
用每种同种型的整数化的唾液酸值计算N-乙酰乳糖胺单元含量(LE值)与唾液酸含量(SA)的乘积。
对于来源于CHO细胞和人细胞的EPO，这些整数化SA值如下：
14(IF2)、13(IF3)、12(IF4)、11(IF5)、10(IF6)、9(IF7)和8(IF8)。
表4包含来源于CHO细胞(CHO1、CHO2和CHO3)以及来源于人细胞(HeLa1-5)的不同EPO制品的比活与糖结构之间相关性的数据。该表显示了比活与EPO分子中N-乙酰乳糖胺单元(LE)平均总数、平均唾液酸含量(SA)及LE×SA乘积之间的相关性。
表5包含，对于CHO细胞的非初步分级分离的EPO批次之分离同种型，生物活性与EPO分子中N-乙酰乳糖胺单元(LE)平均总数、平均唾液酸含量(SA)及LE×SA乘积之间相关性的数据。
表6包含从初步分级分离的CHO细胞EPO批次不同级分中分离的同种型(IF2或IF5)不同制品(A和B)的比较，即在每种情况下分析同种型2和5的两种制品(A和B)。如实施例11.1C所述利用DE阴离子交换剂进行初步分级分离。从DE柱的不同级分中分离同种型IF2和IF5的两种制品A和B(IF2来源于级分5和6，IF5来源于级分2和3)。分别分离出IF2/A或IF5/A的级分5或2，其从DE-Sepharose柱上比分别分离出IF2/B或IF5/B的级分6或3更早地洗脱下来(在较低盐浓度下)。然而，同种型2或5的制品A和B分别在随后的等电聚焦或毛细管电泳中的性质方面，它们是相同的，即IF2或IF5两种制品具有相同的唾液酸含量。然而，意外地发现，制品A的同种型具有显著高于制品B相应同种型的生物活性，这是由于其较高的LE值和较高的重复结构含量。不仅对同种型2和5，而且对其它同种型均观察到表6所述的情况：同种型生物活性对相同唾液酸含量时EPO分子中所含N-乙酰乳糖胺单元总数的依赖性。
表7比较了不同EPO来源(CHO细胞或人HeLa S3细胞)的相应同种型。在这种情况下，也发现了生物活性与LE×SA乘积之间的相关性。
因此，在所有表中，能发现N-乙酰乳糖胺单元数(LE)与唾液酸含量(SA)之乘积和生物活性的相关性。高LE×SA乘积值总是与高生物活性相关。
表4
  名称   四触角结构(％)   重复1(％)   LE   SA摩尔/摩尔   LE×SA   比活KU/mg
  CHO1   86.7   39.6   12.9   12.9   166.4   248
  CHO2   78.6   51   13.2   11.8   155.8   225
  CHO3   73.5   42.6   12.6   11.7   147.4   186
  HeLa1   85.4   18.0   12.0   13.1   157.2   220
  HeLa2   82.2   16.5   11.9   13.2   157.1   198
  HeLa3   78.2   14.0   11.7   13.3   155.6   204
  HeLa4   70.6   12.2   11.25   11.6   130.5   176
  HeLa5   62   9.8   10.8   10.8   116.7   100
LE：N-乙酰乳糖胺单元
SA：EPO制品的唾液酸含量
1：含有附加LE延伸的所有糖结构相对于糖结构总数(bi+tri+tetra＝100％)的百分数
表5
  四触角结构(％)   重复1(％)   LE  SA摩尔/摩尔   LE×SA   比活KU/mg
  IF2   98   48   13.7  14   191.1   400
  IF3   86   43   13.1  13   170.3   280
  IF4   75   40   12.6  12   151.2   200
  IF5   64   39   12.0  11   132   150
  IF6   56   41   11.4  10   114   75
  IF7   42   39   11.1  9.0   100   40
  IF8   34   33   10.5  8.0   84   19
LE：N-乙酰乳糖胺单元(如实施例7计算)
SA：各自同种型的唾液酸含量
1：含有附加LE延伸的所有糖结构相对于糖结构总数(bi+tri+tetra＝100％)的百分数
表6
  四触角结构(％)   重复1(％)   LE   SA摩尔/摩尔   LE×SA   比活KU/mg
  IF2/A   99   54   14.1   14   197.4   396
  IF2/B   97   31   12.9   14   180.6   330
  IF5/A   64   58   13.2   11   145.2   206
  IF5/B   55   32   11.4   11   125.4   112
LE：N-乙酰乳糖胺单元(如实施例7计算)
SA：各自同种型的唾液酸含量
1：含有附加LE延伸的所有糖结构相对于糖结构总数(bi+tri+tetra＝100％)的百分数
表7
  四触角结构(％)   重复1(％)   LE   SA摩尔/摩尔   LE×SA   比活KU/mg
  IF2(CHO2)   99   58   14.4   14   201.6   440
  IF2(CHO3)   98   48   13.7   14   191.8   400
  IF2(HeLa S3)   99   24   12.9   14   118.8   240
  IF5(CHO2)   68   48   12.9   11   141.9   175
  IF5(CHO3)   64   39   12.0   11   132.0   150
  IF5(HeLa S3)   70   15   10.8   11   119.0   60
LE：N-乙酰乳糖胺单元(如实施例7计算)
SA：各自同种型的唾液酸含量
1：含有附加LE延伸的所有糖结构相对于糖结构总数(bi+tri+tetra＝100％)的百分数
图4用单个同种型作为例子，显示了EPO的生物活性对含有附加N-乙酰乳糖胺单元(重复)的N联糖结构比例的依赖性。该同种型分离自含有不同比例的含有重复糖结构的EPO制品(EPO1含约50％、EPO2含约40％、EPO3含约15％的含重复的结构)。同种型中含重复的糖结构比例降低时，相应同种型(相同的唾液酸含量和大致相同的触角)的生物活性降低。对于同种型2直到至少同种型7均能观察到这一特征。

Claims (35)

1.EPO组合物，其中它由糖基化EPO分子组成，基于EPO分子的N联糖链，该分子含有数量平均为至少4.3个的N-乙酰乳糖胺单元，或者基于EPO分子的总N-糖基化，其含有平均至少13.0个N-乙酰乳糖胺单元，其中
i)EPO分子是外源DNA在哺乳动物细胞中表达的产物，由来源于CHO细胞的糖基化EPO分子组成，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于N联糖链总数的比例至少是30％；或者
ii)EPO分子是内源DNA在人细胞中表达的产物，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于糖链总数的比例至少是10％。
2.EPO组合物，其中它由糖基化EPO分子组成，基于N联糖链，该分子含有数量平均为至少4.3个的N-乙酰乳糖胺单元，或者基于EPO分子的总N-糖基化，其含有平均至少13.0个N-乙酰乳糖胺单元，其中
i)EPO分子是外源DNA在哺乳动物细胞中表达的产物，由来源于CHO细胞的糖基化EPO分子组成，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于N联糖链总数的比例至少是30％；或者
ii)EPO分子是内源DNA在人细胞中表达的产物，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于糖链总数的比例至少是10％。
3.权利要求1或2的EPO组合物，其中基于N联糖链，N-乙酰乳糖胺单元数至少为4.5个，或者基于总N-糖基化，其为13.5个。
4.权利要求1的EPO组合物，其中它由糖基化EPO分子组成，基于EPO分子N联糖链该分子的N-乙酰乳糖胺单元平均数乘以每分子EPO的平均唾液酸含量所得的乘积值，至少为43.3，或者基于EPO分子的总N-糖基化，该乘积至少为130。
5.权利要求2的EPO组合物，其中它由糖基化EPO分子组成，基于EPO分子N联糖链，该分子中的N-乙酰乳糖胺单元平均数乘以每分子EPO的平均唾液酸含量所得的乘积平均值，至少为43.3，或者基于EPO分子的总N-糖基化，该乘积至少为130。
6.权利要求4或5的EPO组合物，其中基于N联糖链该乘积值至少为46.7，或者基于总N-糖基化其至少为140。
7.EPO组合物，其中它具有权利要求1、2、4和5中至少两项的特征。
8.权利要求1或2的EPO组合物，其中它含有2-5种同种型的混合物。
9.权利要求1或2的EPO组合物，其中它含有3-4种同种型的混合物。
10.权利要求1或2的EPO组合物，其中它具有至少175,000IU/mg蛋白质的体内比活。
11.权利要求1或2的EPO组合物，其中它具有至少200,000IU/mg蛋白质的体内比活。
12.权利要求1或2的EPO组合物，其中每个分子的平均唾液酸含量至少为11。
13.权利要求1或2的EPO组合物，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于糖链总数的比例与四触角结构相对于糖链总数的比例之乘积值至少是2400。
14.权利要求1或2的EPO组合物，其中含有N-乙酰乳糖胺重复的糖链相对于糖链总数的比例与四触角结构相对于糖链总数的比例之乘积值至少是800。
15.权利要求1或2的EPO组合物，其中细胞在无血清培养基中培养。
16.药物制剂，其中它含有权利要求1或2的EPO组合物作为活性物质，以及任选地含有常用药物稀释剂、辅助物质和载体。
17.产生EPO组合物尤其如权利要求1或2所述的EPO组合物的方法，其中具有所希望的特征的EPO组合物至少通过下列方法之一获得：
(a)选择能产生含有高比例N-乙酰乳糖胺单元的糖链的适当的生产细胞，
(b)为了产生含有高比例N-乙酰乳糖胺单元的糖链，选择细胞培养的适当培养条件，和
(c)富集含有含高比例N-乙酰乳糖胺单元的糖链的EPO分子时，从已知EPO分子组合物中分离不希望的成分。
18.权利要求17的方法，其中方法(b)包括向培养基中加入至少2种糖、优选地至少3种糖的混合物。
19.权利要求18的方法，其中使用含有葡萄糖或/和甘露糖或/和半乳糖的糖混合物。
20.权利要求17的方法，其中方法(b)包括根据养分需要的控制添加，根据细胞的需要养分包括至少一种必需氨基酸或/和至少一种糖。
21.权利要求20的方法，其中根据培养基中测定的谷氨酰胺浓度确定细胞的营养需求。
22.权利要求20或21的方法，其中在细胞的整个生长期中根据需要加入养分。
23.权利要求20的方法，其中养分包括至少2种糖的混合物。
24.权利要求23的方法，其中养分包括至少3种糖的混合物。
25.权利要求17的方法，其中方法(b)包括在30-35.5℃的温度下培养。
26.权利要求25的方法，其中方法b)包括在33-35℃的温度下培养。
27.权利要求17的方法，其中方法(c)包括pH值为6-8的反相层析步骤。
28.权利要求27的方法，其中用乙腈、乙醇或异丙醇作为洗脱液。
29.权利要求17的方法，其中方法(c)包括使用三嗪染料的亲和层析步骤。
30.权利要求17的方法，其中方法(c)包括使用凝集素的亲和层析步骤。
31.提高EPO组合物之比活的方法，其中该组合物中富含EPO分子，该EPO分子具有
(a)大量的N-乙酰乳糖胺单元
(b)N-乙酰乳糖胺单元数与唾液酸含量之高乘积值，
(c)高比例的N-乙酰乳糖胺重复，或/和
(d)N-乙酰乳糖胺重复的比例与四触角糖结构比例之高乘积值，
其中经富集
(i)对于来源于CHO细胞的EPO，达到相对于糖链总数至少30％的N-乙酰乳糖胺重复的平均比例，或者
(ii)对于来源于人细胞的EPO，达到相对于糖链总数至少10％的N-乙酰乳糖胺重复的平均比例。
32.权利要求31的方法，其中经富集达到，基于EPO分子的N联糖链N-乙酰乳糖胺单元的平均数至少为4.3个，或者基于EPO分子的总N-糖基化，平均至少11.1个N-乙酰乳糖胺单元。
33.权利要求31的方法，其中经富集达到，基于EPO分子的N联糖链N-乙酰乳糖胺单元的平均数乘以平均唾液酸含量所得的乘积值至少为43.3，或者基于EPO分子的总N-糖基化其至少为130。
34.权利要求31的方法，其中经富集
(a)对于来源于CHO细胞的EPO，达到相对于糖链总数的N-乙酰乳糖胺重复的平均比例乘以四触角糖结构平均比例所得的乘积值，至少为2400，或者
(b)对于来源于人细胞的EPO，达到相对于糖链总数的N-乙酰乳糖胺重复的平均比例乘以四触角糖结构平均比例所得的乘积值，至少为800。
35.权利要求31-34中任一项的方法，其中通过权利要求17的方法(a)、(b)和(c)中的一个或几个来完成富集。
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