KR100390325B1 - 높은 특이활성을 가진 에리트로포이에틴 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄수화물 구조에서 고비율의 N-아세틸-락토사민 단위 또는/및 테트라안테너리 가지를 특징으로하는 높은 특이적 활성을 갖는 새로운 EPO 조성물에 관한 것이다. 이외에 본 발명은 이러한 EPO 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

높은 특이활성을 가진 에리트로포이에틴{ERYTHROPOIETIN WITH HIGH SPECIFIC ACTIVITY}
본 발명은 탄수화물 구조에서 고함량의 N-아세틸-락토사민 단위 및/또는 테트라안테너리 (tetraantennary) 분지를 특징으로 하는 높은 특이활성을 갖는 신규의 EPO 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 EPO 산물의 분리방법에 관한 것이다.
에리트로포이에틴 (EPO) 는 적혈 세포의 생산을 자극하는 인간 당단백질이다. EPO 는 단지 매우 낮은 농도로 건강한 사람의 혈장에서 생성되어 이러한 방식으로는 다량을 공급하는 것은 불가능하다. EP-B1-0 148 605 및 EP-B1-0 205 564 에는 CHO 세포에서 재조합 인간 EPO 의 생산이 기재되어 있다. EP-B1-0 148 605 에 기재된 EPO 는 요 EPO 보다 높은 분자량을 갖고 O-글리코실화가 없다. EP-B1-0 205 564 에 기재된 CHO 유래의 EPO 는 현재 다량 및 순수한 형태로 이용되고 있다.
더욱이, 재생불량성 빈혈 환자의 요에서 인간 EPO 를 분리하는 것이 공지되어 있다 (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564).
재조합 및 요 EPO 는 이들의 시알릴화의 정도에서 상이한 것으로 알려진 다양한 이소형(isoform)의 혼합물로서 분리된다. 이러한 EPO 이소형은 상이한 등전점을 가지며 등전 포커싱 또는 모세관 전기영동으로 분리할 수 있다 (참조, Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196; Nieto et al., Anal. Commun. 33 (1996), 425-427; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471; Bietot et al., J. Chromatogr.759 (1997), 177-184; Watson et al., Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393). 가장 많은 수의 시알산을 갖는 이소형은 가장 높은 특이 활성을 갖는 반면, 가장 적은 수의 시알산을 갖는 이소형은 가장 낮은 활성을 갖는다 (참조, Imai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990), 457-462; EP-A- 0 428 267).
다케우치(Takeuchi) 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822) 은 생물학적 활성과 시알산 함량과 바이안테너리(biantennary) 및 테트라안테너리 탄수화물 구조의 비율 사이의 관계를 기술하였다. 다케우치등은 추가로 EPO 탄수화물 구조내 존재하는 N-아세틸-락토사민은 생물학적 활성과는 상관관계가 없다는 결정을 지었다.
후꾸다(Fukude)등 (Blood 73 (1989), 84-89) 는 생물학적 활성에 중요한 기여를 하는 혈액순환으로부터 EPO 의 제거속도에 대해 논구하여 상대적으로 많은 수의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 EPO 가 좀더 신속하게 락토사민 단위없이 EPO 보다 순환으로부터 제거됨을 결론지었다. 모리모또(Morimoto)등 (Glycoconjugate J. 13 (1996), 1093-1120) 은 모노-Q 크로마토그래피를 이용하여 EPO 이소형을 분리하여 각각의 분획은 단지 몇몇의 이소형으로 구성되어 있음을 기술하였다. 이러한 분획에 대한 조사는 모든 분획에서 모든 구조의 편재를 보여준다. 바이안테너리 또는 테트라안테너리 구조의 함량 또는 N-아세틸-락토사민 단위의 함량과 특정 활성의 상관관계는 밝혀지지 않았다.
따라서, 상기 종래기술은 특히 시알산의 함량과 관련하여 생물학적 활성과 당구조와의 일반적 상관관계가 존재함을 보여준다. 그러나, 테트라안테너리 구조의 함량 또는/및 N-아세틸-락토사민의 함량은 생물학적 활성과 직접적인 상관관계가 있음을 보여주는 것은 전혀 없다.
EPO 제제를 정제하는 경우, 탄수화물 구조내 테트라안테너리 탄수화물 구조 또는/및 N-아세틸-락토사민 단위의 함량의 증가는 특정 생물학적 활성의 현저한 향상을 가져옴을 놀랍게도 발견하였다. 이것은 특히 EPO 가 유럽출원 97 112 640.4 에 따라 인간세포주에서 생산되는 경우 적용가능하다.
각각의 EPO 제제 또는 탄수화물 구조가 주로 단지 N-아세틸-락토사민 단위 (LE 단위) 의 함량에서만 상이한 EPO 이소형의 비교활성 조사는 동일한 시알산 함량 및 동일한 정도의 안테나러티(antennarity)과 비교하여 더 높은 함량의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 제제 또는 이소형에 대해 현저히 더 높은 활성을 보인다. 이와 관련하여, 안테나러티는 N-연결된 탄수화물 사슬의 총수에 대한, EPO 제제 또는 분리된 EPO 이소형의 바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 N-연결된 탄수화물 사슬의 상대적 평균 함량 (%)을 의미한다. 더욱이 특히 테트라안테너리 구조의 증가된 함량을 갖는 제제 또는 이소형에서, 락토사민 단위의 총함량은 인 비보 활성을 위해서는 매우 중요함이 발견되었다. N-아세틸-락토사민 단위, 예컨대, LE 단위를 갖는 코어 구조의 부가의 연장부 형태의 (소위 반복단위), 총함량의 증가는 상당히 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 테트라안테너리 구조의 함량의 증가는 생물학적 활성을 향상시킬 수 있음을 추가로 발견하였다.
따라서, 최고로 가능한 특이적 활성을 갖는 EPO 제제를 고수율로 생산하고자 한다면, 정제단계, 생산 세포 또는/및 이의 배양은 최고로 가능한 함량의 테트라안테너리 탄수화물 구조 또는/및 최고로 가능한 함량의 N-아세틸-락토사민 단위가 달성되도록 선택 및 최적화시켜야 한다.
본 발명의 첫번째 양태는 탄수화물 사슬의 총수, 즉, 바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 구조의 총합에 대하여 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 테트라안테너리 구조를 함유하는 글리코실화 EPO 분자로 주로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬당 평균 조성물에 대해 3.7 이상, 바람직하게는 4.0 이상, 특히 바람직하게는 4.3 이상, 가장 바람직하게는 4.5 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수 또는 EPO 분자의 모든 세개의 N-연결된 탄수화물 구조(총 N-글리코실화)에 대해 11.1 이상, 바람직하게는 12.0 이상, 특히 바람직하게는 13.0 이상, 가장 바람직하게는 13.5 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 수를 갖는 글리코실화 EPO 분자로 주로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 130 이상, 바람직하게는 135 이상, 특히 바람직하게는 140이상, 가장 바람직하게는 160 이상의, EPO 분자당 평균 시알산 함량과 EPO 분자당 N-아세틸-락토사민 단위의 평균총수의 곱한 값을 갖는 글리코실화 EPO 분자로 주로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 용어 "주로" 는 목적하는 EPO 분자가 조성물내 EPO 분자의 총수에 대해 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 비율로 존재하는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 추가의 양태는 탄수화물 사슬의 총수에 대해 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 85% 이상의 테트라안테너리 구조의 평균비율을 갖는 글리코실화 EPO 분자로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
이외에 본 발명은 EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬당 평균 조성물에 대해 3.7 이상, 바람직하게는 4.0 이상, 특히 바람직하게는 4.3 이상, 가장 바람직하게는 4.5 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수를 갖거나 또는 EPO 분자의 모든 3 개의 N-연결된 탄수화물 구조에 대해 11.1 이상, 바람직하게는 12.0 이상, 특히 바람직하게는 13.0 이상, 가장 바람직하게는 13.5 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 수를 포함하는 글리코실화 EPO 분자로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
테트라안테너리 구조의 최대비율은 각각의 테트라안테너리 구조가 N-연결된 당의 코어 구조내 4 N-아세틸-락토사민 단위를 포함하는 총 탄수화물 사슬의 100% 까지 다다를 수 있다. 소위 반복단위인 코어 구조의 연장부로 발생하는 부가의 N-아세틸-락토사민 단위는 총 글리코실화뿐만아니라 탄수화물 구조당 N-아세틸-락토사민 단위의 수를 증가시킬 수 있다. 따라서 글리코실화 부위당 (즉, N-연결된 탄수화물 구조당) N-아세틸-락토사민 단위의 수는 6 이하 (테트라안테너리 구조 및 반복단위 형태의 2 개의 부가 N-아세틸-락토사민 단위)(참조, 도 1) 일 수 있거나-2 개이상의 부가 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 구조의 경우에서는- 더 높을 수 있다. N-아세틸-락토사민 단위의 수는 총 글리코실화 (3 개의 N-연결된 탄수화물 구조) 에 대해 18 이하 또는 그 이상일 수 있다.
또한 본 발명의 추가의 양태는 130 이상, 바람직하게는 135 이상, 특히 바람직하게는 140 이상, 가장 바람직하게는 160 이상의 EPO 분자당 평균 시알산 함량과 EPO 분자의 N-아세틸-락토사민의 평균총수의 곱한 값을 갖는 글리코실화 분자로 구성된 EPO 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 요지는 전술한 양태의 둘이상의 특징을 갖는 EPO 조성물이다.
본 발명에 따른 조성물은 하나이상의 이소형, 즉 등전포커싱에서 상이한 등전점을 갖는 EPO 분자로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 2 이상, 예컨대 2 내지 5 의 이소형의 혼합물, 특히 3 또는 4 의 이소형의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물의 특이 활성은 인 비보에서 바람직하게는 175,000 IU/mg 이상, 특히 200,000 IU/mg (노르모시태믹 마우스) 이다. 특히 활성은 특히 바람직하게는 약 200,000 내지 400,000 IU/mg 또는 450,000 IU/mg 단백질 , 가장 바람직하게는 250,000 내지 400,000 IU/mg 또는 450,000 IU/mg 단백질의 범위이다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 분자 EPO 당 시알산 함량 또는 시알산 잔류기의 평균수는 바람직하게는 11 내지 14, 특히 바람직하게는 11.5 이상, 가장 바람직하게는 12.5 이상이다.
본 발명에 따른 EPO 조성물은, 한편, 포유류 세포, 예컨대, EP-B-0 202 564 에 기재되어 있는 CHO 또는 BHK 세포와 같은 설치류 세포에서 외인성 DNA 의 발현산물인 EPO 분자로부터 수득할 수 있다. 이와는 달리, 조성물은 또한 인간 세포, 예컨대, Namalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033) 또는 HeLa S3 (Puck et al., J.Exp. Meth. 103 (1956), 273-284) 와 같은 영생(immortalized) 세포주내에서 유전자 활성후 내인성 DNA 의 발현산물인 EPO 분자로 구성될 수 있다. 이러한 방법은 유럽 특허 출원 97 112 640.4 에 기재되어 있고, 이의 개시는 본 발명의 일부로 포함되어 있다.
EPO 의 생물학적 활성에 대한 추가의 중요한 변수는 N-연결된 탄수화물 사슬의 총수에 대한 반복단위, 즉, 부가의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율 및 반복단위의 이와 같은 비율과 탄수화물 사슬의 총수에 대한 테트라안테너리 탄수화물 사슬의 비율의 곱한 값이다. CHO 세포유래의 EPO 의 경우에 있어서, 반복단위의 비율은 바람직하게는 30% 이상, 특히 바람직하게는 35% 이상, 가장 바람직하게는 40% 이상이다. HeLa 세포와 같은 인간 세포유래의 EPO 의 경우에 있어서, 반복단위의 비율은 바람직하게는 10% 이상, 특히 바람직하게는 12% 이상, 가장 바람직하게는 14% 이상이다. 따라서, CHO 세포유래의 EPO 의 경우에는, 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율과 탄수화물 사슬의 총수에 대한 테트라안테너리 구조의 비율의 곱한값은 바람직하게는 2400 이상, 특히 바람직하게는 2800 이상, 가장 바람직하게는 3400 이상이다. 인간 세포유래의 EPO 의 경우에는 값은 바람직하게는 800 이상, 특히 바람직하게는 960 이상, 가장 바람직하게는 1100 이상이다.
EPO 조성물은 바람직하게는 저함량의 혈청, 예컨대, 최대 1%(v/v) 를 함유하는 배양배지 또는 특히 무혈청 배양 배지 (참조, WO 96/35718) 에 EPO 생산 세포를 배양하여 생산된 EPO 조성물을 사용한다. 적합한 배양 배지의 예는 RPMI 1640 또는 DMEN 이다.
본 발명에 따른 EPO 조성물은 임의적으로 통상의 약제학적 희석제, 보조 물질 및 캐리어와 함께 약제학적 제제로 제형화시킬 수 있다. 약제학적 제제를 생산하는데 사용할 수 있는 본 발명에 따른 EPO 조성물은 역상 HPLC (예, Vydac C4 컬럼상에서) 또는/및 크기절단 크로마토그래피 (예, TSK 2000SW Ultrapac 컬럼상에서) 으로 측정시 바람직하게는 99% 이상, 특히 바람직하게는 99.9% 이상의 순도를 갖는다.
이외에 본 발명에 따른 조성물은 10,000 IU 단백질당 바람직하게는 <10pg, 특히 바람직하게는 <5pg, 가장 바람직하게는 <1pg DNA의 DNA 함량을 갖는다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 실질적으로 세균 불순물 (<1 CFU/ml) 및 엔도톡신 (<1 EU/10,000 IU 단백질) 이 없다.
DNA 함량은 방사능 또는 형광-표식 DNA 를 이용하여 혼성화 시험으로 측정할 수 있다. 시판용의 정제된 인간 DNA 는 예컨대 프로브 DNA 로 사용할 수 있다. 인간 DNA 는 추가적으로 시험용 표준으로 사용할 수 있다. 이러한 혼성화 시험의 검출의 하한선은 약 0.3 pg/10,000 IU EPO 이다. EPO 제제의 병원균 및 엔도톡신 함량은 Pharm. Eu. 또는 USP 에 기재되어 있는 표준방법으로 측정할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 의해 요구되는 특징을 갖는 EPO 조성물은 하나이상의 하기 수단에 의해 수득가능하다 :
(a)고비율의 테트라안테너리 구조 또는/및 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬을 생산할 수 있는 적합한 생산세포주의 선택,
(b)고비율의 테트라안테너리 구조 또는/및 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬을 생산하기 위한 세포 배양에 적합한 배양 조건의 선택 및
(c) 고비율의 테트라안테너리 구조 또는/및 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬을 포함하는 EPO 분자를 풍부하는 반면 EPO 분자의 공지된 조성물로부터 비목적 성분의 제거.
수단 (a) 에는 적합한 생산 세포의 선택이 포함된다. 이러한 경우에서는, 한편, 고수율로 목적하는 탄수화물 사슬 구조를 생산하는 경향이 있는 것으로 알려진 세포를 사용할 수 있다. 이러한 세포주의 예는 CHO 또는 BHK 와 같은 햄스터 및 HeLa, Namalwa, HT1080 과 같은 인간세포주로부터 유래한 세포 또는 이들로부터 유래한 세포주이다. HeLa S3 세포 또는 변형된 CHO 세포가 특히 바람직하다.
한편, 세포에서 특정 글리코실화 효소를 과발현시켜, 예컨대, 재조합 발현 또는/및 내인성 유전자 활성으로 적합한 생산 세포를 특별히 생산하는 것이 가능하다. 이러한 글리코실화 효소의 예는 시알릴 트랜스퍼라아제, N-아세틸-글루코사미닐 트랜스퍼라아제 및 갈락토실 트랜스퍼라아제이다.
수단 (b) 에는 세포 배양에서의 적합한 배양 조건의 선택이 포함된다. 본 발명의 첫번째 구현예에 있어서, 수단 (b) 에는 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상의 탄수화물의 혼합물을 배양 배지에 첨가하는 것이 포함된다. 탄수화물은 바람직하게는 단당류 및 이당류, 예컨대, 글루코스, 글루코사민, 리보오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 수크로오스, 락토오스, 만노오스-1-포스페이트, 만노오스-1-술페이트 및 만노오스-6-술페이트로부터 선택한다. 글루코오스 또는/및 만노오스 또는/및 갈락토오스를 함유하는 영양 배지가 예컨대 적합할 수 있다. 특히 양호한 결과는 글루코오스, 갈락토오스 및 만노오스를 예컨대 1:(0.5-3):(1-5), 특히 1:(0.7-2.4):(1.8-4.0)의 질량비의 혼합물을 포함하는 영양 배지로 얻어지며, 여기에서 각각의 탄수화물은 특히 D(+) 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 발효동안의 모든 당의 총농도는 바람직하게는 배양 배지내 0.1 내지 10 g/l, 특히 바람직하게는 2 내지 6 g/l 이다. 탄수화물 혼합물은 바람직하게는 하기에 좀더 상술되는 바와 같이 세포의 각각의 요건에 따라 첨가한다.
추가의 바람직한 구현예 따라, 수단 (b) 는 바람직하게는 배양된 세포주를 위한 하나이상의 필수 아미노산 또는/및 각각의 세포 요건에 의해 결정되는 하나이상의 탄수화물을 포함하는 요건에 따른 영양물의 조절된 첨가를 포함한다. 이 방식에 있어서, 상당히 향상된 글리코실화가 고 세포농도 발효로 (수확시 세포농도 >10 ×105세포/ml, 바람직하게는 >20 ×105세포/ml) 대형 발효기 (용적 > 1 l, 예, 50-10,000 l) 에서 얻어진다. 이를 위해서는 세포의 영양 요건과 상관관계가 있는 변수의 농도를 연속적으로 또는 적당한 시간간격으로, 예컨대 적어도 하루에 한번 측정하고 이들의 소비율을 계산한다. 이것은 세포의 영양 요건을 정량적으로 또는/및 정성적으로 측정하는 것을 가능케한다. 이러한 변수는 글루타민, 암모늄, 글루코오스 또는/및 락테이트 농도, 특히 글루타민 농도와 같은 세포의 신진대사 산물 또는 영양물일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에 따라 첨가되는 영양물에는 필수 아미노산, 예컨대, 굴루타민 또는/및 트립토판 또는/및 탄수화물, 바람직하게는 이외에 비필수 아미노산, 비타민, 희귀원소, 염 또는/및 성장인자, 예컨대, 인슐린이 포함된다. 영양물은 특히 바람직하게는 하나이상의 필수 아미노산 및 하나이상의 탄수화물을 포함한다. 이러한 영양물은 바람직하게는, 용해된 상태로 배양 배지로 넣는다. 영양 용액은 바람직하게는 글루타민 및 탄수화물, 특히 전술한 바와 같은 둘 이상의 탄수화물의 혼합물을 함유한다. 글루코오스, 갈락토오스 및 만노오스의 혼합물이 특히 바람직하게 사용된다. 이외에 영양물은 세포의 전 성장단계에 걸쳐 필요에 따라, 즉, 배양 배지내에서 측정된 선택된 변수의 농도에 따라 첨가하는 것이 바람직하다.
영양 용액내 글루타민 대 탄수화물의 양의 비는 바람직하게는 발효기에서의 소비비율에 주로 상응하도록 선택한다. 이것은 각각의 기질의 실질적으로 일정한 농도가 발효기내에서 유지되도록하여 준다. 글루타민의 농도는 바람직하게는 배양 배지내에서 <150 mg/l 인 값에서 유지되며 배양 배지에서 암모늄 농도가 ≥2.3 mmol/l 로 진전하는 것을 방지한다. 발효동안 당의 총농도는 바람직하게는 앞서 설명한 바와 같이 배양 배지의 1 l 당 0.1 내지 10g, 특히 바람직하게는 2 내지 6 g 이다.
사용하는 영양 용액은 총 당에 대하여 바람직하게는 1:3 내지 20, 특히 바람직하게는 1:5 내지 15 범위인 글루타민 대 당의 질량비를 포함한다. 글루타민 및 3 개의 당, 글루코오스, 갈락토오스 및 만노오스를 포함하는 영양 용액을 사용하는 경우, 글루타민 대 당의 질량비는 바람직하게는 1:(1 내지 3):(1 내지 5):(2 내지 8), 특히 바람직하게는 1:(1.5 내지 2.2):(1.5 내지 3.6):(4 내지 6) 이다.
배양은 바람직하게는 배양 브로쓰의 일부를 성장단계후 수확하고, 배양 브로쓰의 나머지는 발효기에 남겨 후에 다시 작업용량으로 신선한 배지로 채우는 반복되는 배취공정으로 실행한다. 본 발명에 따른 방법으로 글리코실화 EPO 가 매우 높은 수율로 수확될 수 있다. 따라서 수확시의 농도는 예컨대 1 배양 배지당 30 mg 이상, 특히 40 mg EPO 이상이다.
또한, 본 발명의 추가의 양태는 진핵세포가 적당한 배지에서 배양되고 EPO 가 배양 상층액으로부터 분리되는 진핵세포로부터 EPO 를 분리하는 방법이며, 이 방법은 배양이 ≤36℃, 바람직하게는 30 내지 35.5℃, 특히 바람직하게는 33 내지 35.0℃ 의 온도에서 실행되는 것을 특징으로 한다. 목적하는 글리코실화를 갖는 EPO 의 비율은 배양동안 온도를 낮춤으로서 상당히 증가시킬 수 있음을 놀랍게도 발견하였다.
수단 (c) 는 탄수화물 구조가 본 발명의 명세사항을 만족시키지 못하는 공지된 EPO 조성물로부터 비목적 성분을 분리하는 것이 포함된다. 이것은 예컨대 EPO 제제의 크로마토그래피 정제, 예컨대 트리아진 염료 겔, 바람직하게는 시바크론 블루 염료겔상에서의 친화성 크로마토그래피로 실행할 수 있다. 또한 비목적 성분은 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 역상 HPLC 를 이용하여 추가적으로 분리할 수 있다. 이것에 적합할 수 있는 리간드는 부틸, 펜틸, 옥틸, 옥타데실 및 페닐 잔기이다. 역상 크로마토그래피 단계는 바람직하게는 6.0 내지 8.5 , 특히 바람직하게는 7.0 내지 8.0 범위의 pH 값에서 실행한다. 적합한 용출액은 예컨대 아세토니트릴, 에탄올 또는 이소프로판올, 바람직하게는 아세토니트릴이다.
적합한 분획은 측정한후, 합쳐서 최종적으로 추가로 모세관 영역 전기영동 분석 (CZE) 를 이용하여 가공처리할 수 있다. 이외에 고함량의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 EPO 분자는 토마토 또는 감자로부터 렉틴을 이용하여 직접적으로 풍부하게 할 수 있다 (Merkle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987), 8179- 8189). 이러한 렉틴은 바람직하게는 예컨대 부동형으로 사용한다.
본 발명의 추가의 요지는 하기를 갖는 조성물에서 EPO 분자가 풍부해지는 EPO 조성물의 특이적 활성을 증가시키기 위한 방법이다 :
(a) 고 비율의 테트라안테너리 탄수화물 구조,
(b) 다수의 N-아세틸-락토사민 단위,
(c) N-아세틸-락토사민 단위의 수와 시알산의 함량의 곱의 높은 값,
(d) 고 비율의 N-아세틸-락토사민 반복단위 또는/및
(e) N-아세틸-락토사민 반복단위의 비율과 테트라안테너리 탄수화물 구조의비율의 곱의 높은 값.
이러한 풍부화는 전술한 수단 (a), (b) 및 (c) 중 하나이상으로 달성될 수 있다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예 추가로 설명된다.
도 1 은 추가의 N-아세틸-락토사민 단위 (반복단위) 및 시알산을 갖는 테트라안테너리 탄수화물 구조의 도면을 보여준다.
도 2 는 배양 배지에 첨가된 탄수화물에 대한 각 EPO 이소형의 상대비율의 의존성을 보여준다.
도 3 은 배양 배지에 첨가된 탄수화물에 대한 EPO 제제의 생물학적 활성의 의존성을 보여준다.
도 4 는 N-아세틸-락토사민 반복단위의 수에 대한 EPO 이소형의 생물학적 활성의 의존성을 보여준다.
실시예 1 세포주의 배양 상층액으로부터 EPO의 정제
크로마토그래피 단계의 수 및 원리에서 상이한 필수적으로 2 가지의 방법을 이용하여 인간 세포 또는 CHO 세포의 세포배양 상층액으로 부터 EPO 를 정제하고, 배지의 조성 및 EPO 농도에 따라 사용된다 :
방법 1 : 1 단계 : 블루-세파로오스 컬럼
2 단계 : 부틸-세파로오스 컬럼
3 단계 : 히드록시아파타이트 컬럼
4 단계 : 농축
방법 2 : 1 단계 : 블루-세파로오스 컬럼
2 단계 : 히드록시아파타이트 컬럼
3 단계 : 농축
(3 단계 대안 : RP-HPLC)
방법 1 에 의한 2%(v/v) 소태아 혈청(FCS) 를 함유하는 HeLa S3 세포 배양 상층액의 정제의 예
1. 블루-세파로오스 컬럼:
5 ml Hi-Trap 블루 컬럼 (블루-세파로오스 컬럼, Pharmacia 사제)을 적어도 5 컬럼 부피 (CV) 버퍼 A (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl2; 100mM NaCl) 으로 평형시킨다. 이어서, 70 ml HeLa 세포 상층액 (약 245 ㎍ EPO 및 70-100mg 총 단백질 함유) 을 재순환절차로 0.5 ml/분의 유동속도로 밤새워 흡수시킨다.
컬럼은 적어도 5 CV 버퍼 B (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl2; 250mM NaCl) 및 적어도 5CV 버퍼 C (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl2; 250mM NaCl)으로 컬럼을 0.5ml/min 으로 세정한다. 세정의 성공은 OD 280 에서 단백질 함량을 측정하여 모니터한다.
EPO 는 버퍼 D (100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl2; 2 M NaCl)로 0.5ml/min 의 유동속도로 용출시킨다. 용출 용액은 1 - 2 ml 분획으로 수집한다.
분획, 세정용액 및 용출액의 EPO 함량은 분량(aliquot) 를 POROS R2/H 컬럼 (Boehringer Mannheim) 에 적용시켜 역상 (RP)-HPLC 로 측정한다. 이와는 달리면역학적 도트-블롯트를 EPO 를 함유하는 분획의 정성확인을 위하여 실시한다.
EPO 를 함유하는 용출액의 분획 (8-12ml) 는 합쳐 부틸-세파로오스 컬럼에 가한다.
블루-세파로오스 컬럼후 수율은 약 175 ㎍ EPO (약 70% 에 해당) 이다. 통상적으로 블루-세파로오스후의 수율은 50 내지 75% 이다.
2. 부틸-세파로오스 컬럼 (소수성 상호작용 크로마토그래피)
자가의 2-3 ml 부틸-세파로오스 컬럼 (재료: Toyopearl butyl S650) 을 적어도 5CV 버퍼 D (100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl2; 2M NaCl)으로 평형화시킨후, EPO (약, 150 ㎍ EPO)를 함유하는 1 유래의 블루-세파로오스 풀(pool) 을 0.5ml/min 의 유동속도로 흡수시킨다.
컬럼은 적어도 5CV 버퍼 E (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2M NaCl 및 10% 이소프로판올)로 0.5ml/min 에서 세정시킨다. 세정의 성공은 OD 280 에서 단백질 함량을 측정하여 모니터한다.
EPO 는 버퍼 F (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2M NaCl 및 20% 이소프로판올)로 실온에서 및 0.5ml/min 의 유동속도로 용출시킨다. 용출 용액은 1 - 2 ml 분획으로 수집한다.
분획, 세정용액 및 용출액의 EPO 함량은 분량을 POROS R2/H 컬럼에 적용시켜 역상 (RP)-HPLC 로 측정한다. 이와는 달리 면역학적 도트-블롯트를 EPO 를 함유하는 분획의 정성확인을 위하여 실시한다.
EPO 를 함유하는 용출액의 분획 (10-15ml) 는 합쳐 히드록시-아파타이트 컬럼에 가한다.
블루-세파로오스 컬럼의 수율은 약 130 ㎍ EPO (약 85% 에 해당) 이다. 통상적으로 블루-세파로오스의 수율은 적용된 블루-세파로오스 풀의 60 내지 85% 이다.
3. 히드록시아파타이트 컬럼
5 ml 히드록시아파타이트 컬럼 (Econo-Pac CHT II, BioRAD 사제) 을 적어도 5CV 버퍼 F (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2M NaCl; 20% 이소프로판올)로 평형화시킨후, EPO (약, 125 ㎍ EPO)를 함유하는 2 유래의 블루-세파로오스 풀(pool) 을 0.5ml/min 의 유동속도로 흡수시킨다.
컬럼은 적어도 5CV 버퍼 G (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2M NaCl)로 0.5ml/min 에서 세정시킨다. 세정의 성공은 OD 280 에서 단백질 함량을 측정하여 모니터한다.
EPO 는 버퍼 H (10 mM Na 포스페이트, pH 7.0; 80 mM NaCl)로 실온에서 및 0.5ml/min 의 유동속도로 용출시킨다. 용출 용액은 1 - 2 ml 분획으로 수집한다.
분획, 세정용액 및 용출액의 EPO 함량은 분량를 POROS R2/H 컬럼에 적용시켜 역상 (RP)-HPLC 로 측정한다.
히드록시-아파타이트 컬럼의 EPO 를 함유하는 용출액의 분획 (3-6ml)는 합친다.
수율은 약 80 ㎍ EPO (약 60% 에 해당) 이다. 통상적으로 히드록시아파타이트 컬럼의 수율은 적용된 블루-세파로오스 풀의 50 내지 65% 이다.
4. 농축
히드록시아파타이트 단계에서 유래한 합쳐진 EPO 분획은 10 kD (예컨대, Microsep, Filtron 사제)의 배제 크기를 갖는 원심분리 유니트에서 0.1-0.5 mg/ml 의 농도로 농축하고, 0.01% Tween 20 을 첨가한후 -20℃ 에서 분량으로 저장한다.
수율 계획안 :
EPO(㎍) 수율(%)
초기 245 100
블루-세파로오스 175 70
부틸-세파로오스 컬럼 130 53
히드록시아파타이트 컬럼 80 33
농축 60 25
단리된 EPO 의 순도는 약 > 90%, 통상적으로는 > 95% 이다.
부틸-세파로오스 단계가 생략된 방법 2 를 또한 사용하여 EPO 수율을 증가시킨다. 이 방법은 특히 1% (v/v) FCS 보충물의 첨가여부에 관계없이 세포 배양물 상층액에 적용할 수 있으며, 대략 동일한 순도 (90-95%) 의 분리된 EPO 를 산출한다. 히드록시아파타이트 컬럼을 위한 평형화 버퍼 (버퍼 F) 에서의 5 mM CaCl2의 존재는 이 방법에서 향상된 결합을 가져와, 또한 히드록시아파타이트 단계에서 EPO 의 향상된 재생성 용출 거동을 가져온다. 그러므로 방법 2 는 원칙적으로 방법 1 과 동일한 절차를 이용하여 다음의 버퍼로 실행한다.
1. 블루-세파로오스 컬럼 :
평형화 버퍼 (버퍼 A) : 20 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 100 mM NaCl
세정 버퍼 1 (버퍼 B) : 20 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 250 mM NaCl
세정 버퍼 2 (버퍼 C) : 20 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 250 mM NaCl
용출 버퍼 (버퍼 D) : 100 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 2M NaCl
2. 히드록시아파타이트 컬럼
평형화 버퍼 (버퍼 F) : 50 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 1M NaCl
세정 버퍼 (버퍼 G) : 10 mM Tris-HCl, pH 7.0;
5 mM CaCl2; 80 mM NaCl
용출 버퍼 (버퍼 H) : 10 mM Na-포스페이트, pH 7.0;
0.5 mM CaCl2; 80 mM NaCl
수율 계획안 :
EPO(㎍) 수율(%)
초기 600 100
블루-세파로오스 450 75
히드록시아파타이트 컬럼 335 55
농축 310 52
방법 1 에서 버퍼 C 내지 G 에 5 mM CaCl2 의 첨가는 또한 향상된 결합 및 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 좀더 한정된 용출을 가져온다.
이와는 달리 또는 추가적으로 하기 단계들이 또한 EPO 를 정제하기 위하여사용될 수 있다 :
- RP-HPLC,(예컨대, Vydac C4 재료를 갖는)
- DEAE-세파로오스 ff 크로마토그래피
- 투석여과(diafiltration)
실시예 2 : 이소형 1 - 8 를 보유하면서 배양 상층액으로부터 EPO 의 정제 (비교)
1. 출발물질
포유류 세포, 예컨대 CHO 또는 인간 세포유래의 EPO 는 반복된 배취 공정으로 발효시킨다. 1000 l 발효기에 예비배양물을 접종한후 약 3 내지 5 일후 발효기 내용물을 수확한다. 수확후 세포는 원심분리로 발효 브로쓰로부터 제거한다. 무세포 배양 상층액은 1 mol/l 아세트산으로 pH 5.0-5.2 로 조정한후 1-9℃ 에서 여과한다.
2. 블루-세파로오스 크로마토그래피
크로마토그래피 컬럼 (Amicon P440 ×500, Amicon, GB) 은 60 - 80 l 블루 세파로오스를 충진시켜 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서 컬럼은 약 3 컬럼 부피 (CV) 아세테이트 버퍼로 평형화시킨다.
pH 5 로 조정된 무세포 배양 상층액은 10±5℃ 의 온도 및 800-1400 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 유동속도 및 5±4℃ 에서 약 1CV 세정 버퍼 1 로 재세정한다. 뒤이어 약 2CV 세정 버퍼 2로 세정한다. 이어서 컬럼을 약 3 CV 용출버퍼로 용출시킨다. 총 단백질 피크(peak)는 수집하여(약 30-60 l), 염산으로 pH 6.9 로 조정한후 추가의 가공처리때까지 5 ±4℃ 에서 저장한다. 산물 용액은 이러한 크로마토그래피적 단계로 농축시키며 약 40-50 % 의 순도가 얻어진다.
평형화 버퍼 : 20 mM Na 아세테이트, 5mM CaCl2,
0.1M NaCl, pH 5.0±0.2
세정 버퍼 1 : 20 mM Na 아세테이트, 5mM CaCl2,
0.25M NaCl, pH 5.0±0.2
세정 버퍼 2 : 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,pH 6.5 ±0.3
용출 버퍼 : 100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,1M NaCl, pH 9.0 ±0.2
3. 부틸-토요펄 크로마토그래피 (소수성 크로마토그래피)
크로마토그래피 컬럼 (Pharmacia BPG 300/500) 에 30-40 l 부틸-토요펄을 충진하고 4 M 구아니딘-HCl 및 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서, 컬럼은 적어도 3 CV 평형화 버퍼로 평형화시킨다.
블루-세파로오스 컬럼에서 얻은 용출물을 10% 이소프로판올로 조정하고, 27±2℃ 및 800-1200 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 온도 및 유동속도에서 약 1 CV 평형화 버퍼로 재세정후 약 2CV 세정 버퍼로 재세정시킨다. 이어서 이것을 약 3CV 용출 버퍼로 용출시킨다. 총 단백질 피크는 수집후 (약 10-18 l), 즉시 희석버퍼로 3 배 희석시켜 추가의 가공처리전까지 15℃ 에서 저장한다. 약 90% 의 순도가 이 크로마토그래피로 달성된다.
평형화 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.75M NaCl, 10% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
세정 버퍼 1 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.75M NaCl, 19% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
용출 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.75M NaCl, 27% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
희석 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,pH 6.9 ±0.2
4. 히드록시아파타이트 울트로겔 크로마토그래피
크로마토그래피 컬럼 (Amicon P440 ×500 또는 등가물) 에 30-40 l 히드록시아파타이트 울트로겔을 충진하고 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서, 컬럼을 4 CV 이상의 평형화 버퍼로 평형화시킨다.
부틸-토요펄 컬럼에서 얻은 용출물을 약 15℃ 및 500-1200 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 온도 및 유동속도에서 약 1 CV 평형화 버퍼로 세정후 약 2CV 세정 버퍼로 재세정시킨다. 이어서 이것을 약 3CV 용출 버퍼로 용출시킨다. 총 단백질 피크는 수집후 (약 10-18 l), 추가의 가공처리전까지 15℃ 에서 저장한다. 약 95% 이상의 순도가 이 크로마토그래피로 달성된다.
평형화 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.25M NaCl, 9% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
세정 버퍼 : 10 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 6.8 ±0.2
용출 버퍼 : 10 mM Tris-HCl, 10mM K 포스페이트, 0.5M CaCl2,
pH 6.9 ±0.2
5. 역상 HPLC (RP-HPLC)
분취 HPLC 를 Merck Prepbar 100 분리장치 (또는 등가물) 을 이용하여 22 ±4℃ 의 온도에서 실시한다. 분리컬럼 (100mm ×400 mm, 3.2 l) 에 Vydac C4 물질을 충진시킨다. 사용전, 컬럼은 100% 용매로의 버퍼 A 의 농도구배를 반복적으로 적용하여 재생시킨후 버퍼 A 로 평형화시킨다.
히드록시아파타이트 컬럼에서 얻은 용출물을 트리플루오로아세트산으로 약 pH 2.5 로 산성화시키고 살균여과한다. 이어서 이것을 22 ±4℃ 의 온도 및 250 - 310 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 적용한다. 컬럼은 버퍼 A 의 버퍼B 로의 선형 농도구배로 동일한 온도 및 유동속도에서 용출시킨다. 용출액 피크는 분획으로 수집한다. 용출물은 처음에 4 부피의 HPLC 희석 버퍼를 즉시 첨가하여 중화시킨다.
분석 HPLC 에서 적어도 99% 이상의 순도를 갖는 분획을 합친다 (풀 부피 약 4-6l). 미량의 불순물은 상기 크로마토그래피로 분리시키며, 99% 이상의 순도가 달성된다.
버퍼 A : 수중 0.1 % 트리플루오로아세트산
버퍼 B : 80% 아세토니트릴, 수중 0.1% 트리플루오로아세트산
HPLC 희석 버퍼 : 10mM Na/K 포스페이트, pH 7.5 ±0.2
6. DEAE-세파로오스 ff 크로마토그래피
크로마토그래피 컬럼 (Amicon P90 ×250 또는 등가물) 에 사용되는 EPO g 당 100-200 ml 겔을 충진시키고 0.5N NaOH 로 재생시킨다. 이어서, 컬럼을 처음에는 100mM Na/K 포스페이트 버퍼로 평형화시킨후, pH 7.5, 이어서 12 CV 이상의 평형 버퍼로 평형화시킨다.
HPLC 컬럼에서 얻은 용출물을 5 ±4℃ 의 온도 및 약 150 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼을 동일한 온도 및 유동속도에서 5 CV 이상의 평형화 버퍼로 세정후 약 10 CV 세정버퍼로 재세정시킨다. 이어서, 이것을 다시 약 10CV 평형화 버퍼로 세정후 약 7CV 용출버퍼로 용출시킨다. 총 단백질 피크는 수집하여(약 2-5l), 살균여과하여 분산시킨다.
이 크로마토그래피에서, HPLC 단계에서 용매는 분리하고 미량의 불순물은 제거한다. 순도는 99% 이상이다.
평형화 버퍼 : 10 mM Na/K 포스페이트, pH 7.5 ±0.2
세정 버퍼 : 30 mM Na-아세테이트, pH 4.5 ±0.1
용출 버퍼 : 10mM Na/K 포스페이트, 80 mM NaCl pH 7.5 ±0.2
실시예 3 : 이소형 1 - 4 를 보유하면서 배양 상층액으로부터 EPO 의 정제 (본 발명)
1. 출발물질
포유류 세포, 예컨대 CHO 또는 인간 세포유래의 EPO 는 반복된 배취 공정으로 발효시킨다. 10 l 발효기에 예비배양물을 접종한후 약 5 일후 발효기 내용물을 수확한다. 수확후 세포는 원심분리로 발효 브로쓰로부터 제거한다. 무세포 배양 상층액은 1 mol/l 아세트산으로 pH 5.0-5.2 로 조정한후 1-9℃ 에서 여과한다.
2. 블루-세파로오스 크로마토그래피
적당한 크로마토그래피 컬럼에 150 - 250ml 블루 세파로오스를 충진시켜 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서 컬럼은 약 3 컬럼 부피 (CV) 아세테이트 버퍼로 평형화시킨다.
pH 5 로 조정된 무세포 배양 상층액은 10±5℃ 의 온도 및 1-2 CV/h 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 유동속도 및 5 ±4℃ 에서 약 1CV 세정 버퍼 1 로 재세정한다. 뒤이어 약 2CV 세정 버퍼 2로 세정한다. 이어서 컬럼을 약 3 - 6 CV 용출버퍼로 용출시킨다. 단백질 피크는 분획으로 수집한다. CE 분석후, 적합한 분획을 합쳐, 염산으로 pH 6.9 로 조정한후 추가의 가공처리때까지 5 ±4℃ 에서 저장한다. 산물 용액은 이러한 크로마토그래피 단계에서 농축시키고, 불순물 및 염기성 이소형은 분리시킨다.
평형화 버퍼 : 20 mM Na 아세테이트, 5mM CaCl2,
0.1M NaCl, pH 5.0 ±0.2
세정 버퍼 1 : 20 mM Na 아세테이트, 5mM CaCl2,
0.25M NaCl, pH 5.0 ±0.2
세정 버퍼 2 : 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,pH 6.5 ±0.3
용출 버퍼 : 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,0.25 M NaCl, pH 8.0 ±0.2
3. 부틸-토요펄 크로마토그래피 (소수성 크로마토그래피)
적당한 크로마토그래피 컬럼에 200-300 ml 부틸-토요펄을 충진하고 4 M 구아니딘-HCl 및 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서, 컬럼은 적어도 3 CV 평형화 버퍼로 평형화시킨다.
블루-세파로오스 컬럼에서 얻은 용출물을 10% 이소프로판올로 조정하고, 27±2℃ 및 1 - 2 CV/h의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 온도 및 유동속도에서 약 1 CV 평형화 버퍼로 세정후, 약 2CV 세정 버퍼로 재세정시킨다. 이어서 이것을 약 5 - 10 CV 용출 버퍼로 용출시킨다. 단백질 피크로부터 분획을 수집하여, 즉시 희석버퍼로 3 배 희석시킨다. CE 분석후, 적합한 분획을 합쳐 추가의 가공처리전까지 15℃ 에서 저장한다. 이 크로마토그래피에서 추가로 염기성 이소형을 제거하며, 약 > 80% 의 순도가 달성된다.
평형화 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.2M NaCl, 10% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
세정 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.2M NaCl, 17% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
용출 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.2M NaCl, 23% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
희석 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2,pH 6.9 ±0.2
4. 히드록시아파타이트 울트로겔 크로마토그래피
적당한 크로마토그래피 컬럼에 150-200 ml 히드록시아파타이트 울트로겔을 충진하고 0.5 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서, 컬럼을 4 CV 이상의 평형화 버퍼로 평형화시킨다.
부틸-토요펄 컬럼에서 얻은 용출물을 약 15℃ 및 1 - 2 CV/h 의 유동속도에서 컬럼에 흡수시킨다. 컬럼은 동일한 온도 및 유동속도에서 약 1 CV 평형화 버퍼로 재세정후 약 2CV 세정 버퍼로 세정시킨다. 이어서 이것을 약 3CV 용출 버퍼로 용출시킨다. 총 단백질 피크는 수집하여 추가의 가공처리전까지 15℃ 에서 저장한다. 약 95% 이상의 순도가 이 크로마토그래피로 달성된다.
평형화 버퍼 : 20 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2,
0.06M NaCl, 7.5% 이소프로판올, pH 6.9 ±0.2
세정 버퍼 : 10 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 6.8 ±0.2
용출 버퍼 : 10 mM Tris-HCl, 10mM K 포스페이트, 0.5mM CaCl2,
pH 6.8 ±0.2
5. 역상 HPLC (RP-HPLC)
반-분취 HPLC 를 Vydac C4 분리 컬럼 (20mm ×250mm, 약 80ml)을 이용하여 22 ±4℃ 의 온도에서 실시한다. 사용전, 컬럼은 버퍼 A 의 100% 용매로의 농도구배를 반복적으로 적용하여 재생시킨후 버퍼 A 로 평형화시킨다.
히드록시아파타이트 컬럼에서 얻은 용출물을 22 ±4℃ 의 온도 및 8 - 15 ml/min 의 유동속도에서 컬럼에 적용한다. 컬럼은 다음의 HPLC 프로토콜에 따라 버퍼 A 의 버퍼B 로의 선형 농도구배로 동일한 온도 및 유동속도에서 용출시킨다. 용출액 피크를 분획으로 수집한다. 용출물은 처음에 4 부피의 HPLC 희석 버퍼를 첨가하여 즉시 중화시킨다.
HPLC 프로토콜 :
시간(분) 단계 %버퍼A(v/v) %버퍼B(v/v)
개시
0.0 100 0
세정 1
10.0 100 0
세정 2
20.0 50 50
세정 3 및 용출(*)
160.0 0 100
재세정
170.0 0 100
초기조건으로 재설정
171.0 100 0
(*)세정 3 및 용출조건 : 50% 버퍼 B 의 100% 버퍼 B 로의 농도구배, 50 내지 200 분, 바바람직하게는 140 분
분석 HPLC 에서 적어도 99% 의 순도를 갖으며 CE 분석에 따라 적합한 분획을 합친다. 미량의 불순물 및 염기성 이소형의 잔류물은 상기 크로마토그래피로 분리시키며 99% 이상의 순도가 달성된다.
버퍼 A : 10 mM Na/K 포스페이트, pH 7.0 ±0.2
버퍼 B : 10 mM Na/K 포스페이트, 80% 아세토니트릴, pH 7.0
HPLC 희석 버퍼 : 10mM Na/K 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.5 ±0.2
6. 투석여과
적당한 크기의 투석여과 장치에 10kD 카세트를 장착하여 1 N NaOH 로 재생시킨다. 이어서 장치를 벌크 버퍼를 이용하여 잿물없이 헹궈낸다.
HPLC 컬럼의 용출물을 5 ±4℃ 의 온도에서 농축시키고 10 부피 벌크 버퍼에 대하여 투석여과한다. 최종 농도는 1 내지 3 mg/ml 이어야 한다.
이 단계는 HPLC 단계로부터 용매 잔류물을 제거하고, 필요한 벌크 버퍼 조건및 벌크 활성 물질의 산물농도를 조정시키는 역활을 한다.
벌크 버퍼 : 10 mM Na/K 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.5 ±0.2
실시예 4 인 비보에서 EPO 의 특이적 활성의 측정 (노르모시태믹 마우스에 대한 생검정)
에리트로사이트 전구체 세포의 복제 및 분화에 대한 EPO 의 용량 의존성 활성은 EPO 투여후 혈액내 망상적혈구에서의 증가를 이용하여 마우스에서 인 비보로 측정한다.
이를 위해 다양한 용량의 분석하고자하는 EPO 시료 및 EPO 표준 (EPO WHO 표준으로 표준화된) 각각을 8 마리의 마우스에 비경구 투여한다. 이어서 마우스는 일정한 한정된 조건하에 둔다. EPO 투여 4일후 마우스로부터 혈액을 채취하고, 망상적혈구를 아크리딘-오렌지로 염색시킨다. 30,000 에리트로사이트당 망상적혈구계수는 적색-형광 히스토그램을 분석하여 유동 세포계산기에서 미소형광법으로 측정한다.
생물학적 활성은 평행 직선으로 농도를 쌍 측정하는 린더에 의해 기술된 방법에 따라 상이한 용량에서 시료 및 표준의 망상적혈구 계수에 대한 값으로부터 계산한다 (Linder, "Planen und Auswerten von Versuchen", 3rd. edition, 1969,Birkenhauser Verlag, Basel).
EPO 제제 CHO1, CHO2 및 CHO 3 은 각각 248,000 (CHO 1), 225,000 (CHO 2) 및 186,000 IU/mg (CHO 3) 의 생물학적 활성을 갖는 무혈청 배지에서 배양한 CHO 세포의 배양 상층액으로부터 EPO 를 정제하여 수득한다. 인간 세포의 배양 상층액으로부터 EPO 가 정제된 4 개의 제제에 있어서, 220,000 (HeLa 1), 198,000 (HeLa 2), 204,000 (HeLa 3), 176,000 (HeLa 4) 및 100,000 IU/mg (HeLa 5) 의 특이적 활성을 갖는 산물이 수득된다. 생물학적 활성에 대한 값과 당구조에 대한 변수의 상관관계를 실시예 11 에 나타내었다.
실시예 5 시알산 잔기의 함량의 측정
시알산 함량은 시알산을 아쓰로박터 우레아페이션 (Arthrobacter ureafaciens)유래의 뉴라미니다아제 (A. ureaf., Boehringer Mannheim) 로 효소적으로 절단한후 Dionex 시스템에서 HPAEC-PAD (high pH anion exachange chromatography with pulsed amperometric detection) 으로 크로마토그래피적으로 측정한다.
CHO 및 인간 세포주 (예컨대, HeLa S3) 의 다양한 제제로부터 22㎍ EPO 를 함유하는 각 제제를 5mM Na 포스페이트 버퍼중 0.2 mg/ml 의 EPO 농도, pH 7.2 로 조정한다. 각 제제의 반을 사용하여 RP-HPLC 로 EPO 양을 정확하게 측정한다. A. ureaf 유래의 5 mM U 뉴라미니다제를 제제의 두번째 반에 첨가하여 37℃ 에서 밤새워 인큐베이션시킨다. (약 18 시간). 이어서, 소화 혼합물을 반으로 나누어 물을 이용하여 500㎕ 로 20 배 희석시키고, 이의 50㎕ (약 27 pmol EPO 에 해당) 을 Dionex 시스템에 적용시킨다. 이를 위해서 하기의 크로마토그래피 변수를 사용한다 :
컬럼 : CarboPac PA 100
유속 : 1.0 ml/min
검출기 감도 : 300nA
농도구배 t(min) % 버퍼 B
0 17
7 17
9 100
12 100
13 0
20 0
버퍼 A : 0.1 M NaOH
버퍼 B : 0.1 M NaOH; 0.5 M Na 아세테이트
사용된 시료중 시알산의 양은 또한 분석된 시알산 표준의 값으로부터 얻은 검도선 (calibration line) (Boehringer Mannheim) 을 이용하여 측정한다. 시알산 함량 (mole 시알산/mole EPO) 는 시알산 측정 (Dionex 시스템) 의 결과 및 RP-HPLC 를 이용하여 사용된 EPO 양의 측정으로부터 계산한다.
CHO 세포유래의 EPO 는 EPO 1 mole 당 12.9 mole (CHO 1), 11.8 mole (CHO 2), 11.7 mole (CHO 3) 시알산의 평균함량을 갖는다. 인간세포유래의 EPO 제제는 EPO 1 mole 당 13.1 mole (HeLa 1), 13.2 mole (HeLa 2), 13.3 mole (HeLa 3), 11.6 mole (HeLa 4) 및 10.8 mole (Hela 5) 시알산의 평균함량을 갖는다 (참조 실시예 11).
실시예 6 바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 탄수화물 구조의 비율의 측정
N-연결된 탄수화물 구조는 Dionex 시스템에서 HPAEC-PAD 로 크로마토그래피적으로 분석한다. CHO 및 인간 세포주 (예, HeLa S3) 유래의 EPO 제제의 아시알로 올리고당을 N-글리코시다아제 F (Boehringer Mannheim) 및 A.ureaf 유래의 뉴라미니다아제 (Boehringer Mannheim) 으로 효소적으로 절단하여 분리시킨다.
혼합물당 10 또는 30 ㎍ EPO 를 MicroCon ultracentrifugation units (Amicon, 배제크기 10kD) 을 이용하여 탈염시키고, 10 mM Na 포스페이트 버퍼 (pH 7.2) 로 0.2 또는 0.3 mg/ml 의 농도로 조정시킨다. 이어서, 1 U N-글리코시다아제 F 및 10 mU 뉴라미니다아제를 각각의 혼합물에 첨가하여 37℃ 에서 밤새워 (약 18 시간) 인큐베이션시킨다. 절단된 올리고당으로부터 EPO 폴리펩티드 부분을 분리시키기 위해서는, 혼합물을 Ultrafree centrifugation units (Millipore, 배제 크기 10kD) 를 통해 원심분리시킨후 인큐베이션시키고, Ultrafree 장치를 다시 20㎕ 물로 2 회 다시 세정시킨다. 여과물내 함유된 올리고당은 물로 150㎕ 까지 만들고 이의 100㎕ 를 Dionex 시스템에서 분석한다. 이를 위해서 다음의 크로마토그래피 변수를 사용한다 :
컬럼 : CarboPac PA 100
유속 : 1.0 ml/min
검출기 감도 : 300nA
농도구배 t(min) % 버퍼 B
0 0
2 0
60 10
62 100
67 100
t(min) % 버퍼 B
69 0
80 0
버퍼 A : 0.1 M NaOH
버퍼 B : 0.1 M NaOH; 0.5 M Na 아세테이트
피크는 표준 올리고당으로 컴플렉스 형의 N-당의 크로마토그램으로 동정하고 (Oxford Glyco System), 효소 엔도-β-갈락토시다아제 또는 푸코시다아제로 EPO 의 올리고당을 효소적으로 소화시키고 Dionex 시스템에서 후속적으로 분석하여 검증한다. 바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 구조의 비율은 총 피크 영역 (바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 구조의 피크 영역의 합)에 대한 대응하는 N-당 구조를 나타내는 피크의 영역을 이용하여 계산한다.
CHO 세포유래의 EPO 는 4.2% 바이안테너리 탄수화물 구조, 22.3% 트리안테너리 탄수화물 구조 및 73.5% 테트라안테너리 탄수화물 구조 (CHO3) 의 함량을 갖고, CHO 1 제제에서는 86.7% 테트라안테너리 탄수화물 구조의 함량 및 CHO 2 에서 78.6% 의 함량을 갖는다. 인간 세포주 유래의 EPO 의 제제에서의 바이안테너리/트리안테너리/테트라안테너리의 함량은 HeLa 1 에 대해서는 5.8/8.8/85.4%, HeLa 2 에 대해서는 5.1/12.7/82.2%, HeLa 3 에 대해서는 4.1/17.7/78.2%, HeLa 4 에 대해서는 10.1/19.2/70.6% 및 HeLa 5 에 대해서는 12.6/25.4/62% 이다 (참조, 실시예 11).
실시예 7 N-아세틸-락토사민 단위의 평균함량 및 추가의 N-아세틸-락토사민 단위(반복단위)의 평균함량의 측정
EPO 의 N-연결된 탄수화물 구조내 N-아세틸-락토사민 단위의 총수 (즉, 코어 탄수화물 구조 + 반복단위에서) 는 실시예 6 의 실험의 크로마토그램의 피크 영역으로부터 계산한다.
탄수화물 사슬당 N-아세틸-락토사민 단위의 평균 함량 (n) 의 수는 하기와 같이 계산한다 :
n = ∑%(bi)×2+%(tri)×3+%(tetra)×4+%(tri+1r)×4+%(tetra+1r)×5+%(tri+2r)×5+%(tetra+2r)×6
여기에서,
%(bi) = N-연결된 탄수화물 구조의 총량(100%) 에 대한 바이안테너리 구조의 %
%(tri) = 부가의 N-아세틸-락토사민 단위없는 트리안테너리 구조의 %
%(tetra) = 부가의 N-아세틸-락토사민 단위없는 테트라안테너리 구조의 %
%(tri+1r) = 1 부가의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 트리안테너리 구조의 %
%(tetra+1r) = 1 부가의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 테트라안테너리 구조의 %
%(tri+2r) = 2 부가의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 트리안테너리 구조의 %
%(tetra+2r) = 2 부가의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 테트라안테너리 구조의 %
CHO 세포유래의 EPO 의 경우, 탄수화물 사슬당 4.3 (CHO 1), 4.4(CHO 2) 및 4.2 (CHO 3) N-아세틸-락토사민 단위의 평균수가 발견된다. 인간 세포유래의 EPO 제제의 경우에서는, 4.0 (HeLa 1), 4.0 (HeLa 2), 3.9(HeLa 3), 3.75(HeLa 4) 및 3.6(HeLa 5) 의 수가 발견된다 (참조 실시예 11).
EPO 는 3N-연결된 당 구조를 포함하고 있다는 사실때문에, N-아세틸-락토사민 단위의 총수는 3 배 더 높다. EPO 의 총 글리코실화에 있어서, CHO 세포유래의 EPO 에 있어서 N-아세틸-락토사민 단위의 수는 12.9(CHO 1), 13.2(CHO 2) 및 12.6(CHO 3)이다. 인간 세포의 EPO 제제에 있어서, 상응하는 값은 12.0 (HeLa 1), 11.9(HeLa 2), 11.7(HeLa 3), 11.25(HeLa 4) 및 10.8(HeLa 5) 이다. 인간세포유래의 EPO 제제의 경우에 있어서, 대응하는 값은 52.4 (HeLa 1), 52.5(HeLa 2),51.3(HeLa 3), 43.5(HeLa 4) 및 38.9(HeLa 5) 이다.
EPO 의 총 글리코실화 (3N-연결된 탄수화물 구조) 에 있어서, 각각의 시알산 함량과 N-아세틸-락토사민 단위의 수의 곱은 CHO 세포유래의 EPO 에 대해 각각 166.5 (CHO 1), 156 (CHO 2) 및 147.9 (CHO 3) 이다. 인간 세포유래의 EPO 제제에 있어서는 그 대응하는 값은 157.2(HeLa 1), 157.5(HeLa 2), 153.9(HeLa 3), 130.5(HeLa 4) 및 116.7(HeLa 5) 이다 (참조 실시예 11).
추가의 중요한 변수는 소위 반복단위인 코어 탄수화물 구조에 결합할 수 있는 N-아세틸-락토사민 단위의 양이다(참조, 예, 도 1). 반복단위 함량은 모든 N-연결된 탄수화물 구조의 총합 (bi+tri+tetra=100%) 에 대한 단복단위-함유 탄수화물 구조의 퍼센티지로 특정한다.
이러한 반복단위의 비율은 CHO 세포 유래의 EPO 제제와 인간 세포 유래의 EPO 제제에서 상이할 수 있다. 따라서, CHO 세포유래의 제제의 경우는 39.6 % (CHO 1), 51% (CHO 2) 및 36.8% (CHO 3) 의 반복단위 퍼센티지가 측정된다. 인간세포유래의 제제의 경우에는 18%(HeLa 1), 16.5%(HeLa 2), 14.0%(HeLa 3), 12.2%(HeLa 4) 및 9.8%(HeLa 5) 의 반복단위 퍼센티지가 측정된다.
실시예 8 : 요건에 따른 조절된 공급에 의한 EPO 의 생물학적 활성의 영향
배양은 36.5℃ 의 온도에서 필요에 따라 공급하면서 (반복된 공급 배취) 반복된 배취 공정으로서 실행한다. 이를 위해서, 무혈청의 단백질이 빈약한 배양 배지를 교반된 발효기 (총 작업용량 10 L) 에 넣고, 접종물 배양물로 1 회 접종한다. 접종후 세포밀도의 범위는 3 ±1 ×105생세포/ml 이다.
144 ±24 시간의 성장단계후, 배양 브로쓰의 일부를 수확한다. 배양 브로쓰의 나머지는 발효기에 남겨두고, 다음 성장 단계를 위한 접종물로 사용한다; 이러한 목적을 위해서는 발효기는 다시 작업용량까지 신선한 배지로 채운다.
EPO 를 함유하는 배양 상층액은 발효 배양물을 원심분리하여 수득한다.
영양 용액은 성장단계동안 배양물에 연속적으로 공급한다. 이를 위해서, 영양 용액을 함유하는 저장용기는 발효기에 결합시킨다. 영양 용액은 아미노산, 비타민, 인슐린, 미량의 원소, 염, 글루타민 및 탄수화물을 함유한다. 하기와 같이 두번의 발효를 실시한다 :
발효 A 에서 영양 용액은 D-(+)-글루코오스를 당으로서 함유하고 발효 B 에서는 당은 D-(+)-글루코오스, D-(+)-갈락토오스 및 D-(+)-만노오스이다. 글루타민 대 당의 질량비는 발효 B 에서 1:2.2:3.6:6 이다. 영양 용액에서의 각각의 당의 농도는 7.2 내지 18g/l 이다.
배양물에서의 글루타민 농도는 발효 B 에서 주기적으로 분석하고 소비량을 계산한다. 영양 용액의 순간부피유동은 영양물에 대한 세포의 요건에 합치된다. 발효 A 에서 글루타민 농도는 조절된 변수로서 사용할 수 없다. 발효 B 내 영양 용액은 2:3:5 의 질량비로 당 D-(+)-글루코오스, D-(+)-갈락토오스 및 D-(+)-만노오스의 혼합물을 함유한다. 발효기내 모든 당의 농도는 대응하는 공급으로 배양동안 2 내지 6g/l 범위에서 유지된다.
세포 밀도는 성장동안 수확시까지 20 ×105세포/ml 이상, 전형적으로는 30 ±10×105세포/ml 으로 변화된다. 수확시 EPO 의 농도는 전형적으로 40 ±10 mg/l 이다.
인간 에리트로포이에틴의 농도는 예컨대 수확된 배양 브로쓰에서 ELISA 로 측정한다. 발생하는 이러한 단백질의 이소형의 퍼센티지 분포는 예컨대 모세관 영역 전기영동(CZE) 로 분리하여 측정한다.
표 1 은 조절되고 여건지향적인 방식으로 글루코오스를 함유하는 영양용액이 공급되는 발효 A 와 글루코오스, 만노오스 및 갈락토오스를 함유하는 영양용액이 공급되는 발효 B 사이의 EPO 이소형의 분포의 비교를 보여준다. 발효 B 에서 EPO 이소형의 함량은 발효 A 의 대응하는 이소형의 퍼센티지로서 계산한다. 후자는 각각 100% 로 표준화시킨다. 데이타는 목적하는 더 높은 글리코실화 EPO 이소형 2-4 가 발효 A 와 비교하여 발효동안 실질적으로 더 높은 비율로 존재함을 보여준다.
CZE에서의이소형명 1 2 3 4 5 6 7 8
[%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%]
발효A:글루코오스공급 n.d 100 100 100 100 100 100 100
발효 B:필요시 글루코오스, 만노오스 및갈락토오스공급 n.d 136 140 115 102 91 76 55
n.d.= 비측정, 값이 검출제한치미만
공급으로 수득한 이소형 패턴은 영양 용액의 조절된 요구-지향 공급으로 발효로부터 4 번의 연속 수확에서 재생될 수 있다.
실시예 9: 배양 온도의 변화에 의한 EPO 의 생물학적 활성의 영향
절차는 발효기의 온도를 36.5℃ 대신 35.0℃ 를 사용하고 발효를 1000l 용량에서 실시하는 것만 제외하고, 조절된 요구-지향 공급으로 공급-분할배취 공정으로 실시예 8 (발효 B) 에 기술된 바와 같이 실시한다.
표 2 는 각각 영양용액의 조절된 공급에 의한 36.5℃ 에서의 발효 C 및 35.0℃ 에서 발효 D 사이의 EPO 이소형 분포의 비교를 보여준다. 발효 D 에서 EPO 이소형의 함량은 발효 C 의 대응하는 이소형의 퍼센티지로서 계산한다. 후자는 각각 100% 로 표준화시킨다. 데이타는 산성 EPO 이소형 2 내지 4 는 온도를 감소시킴으로써 상당히 증가될 수 있음을 보여준다.
CZE에서의이소형명 1 2 3 4 5 6 7 8
상대이소형분포 [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%]
발효C:온도36.5℃ n.d 100 100 100 100 100 100 100
발효D:온도36.5℃ n.d 131 116 110 94 100 88 86
n.d.= 비측정, 값이 검출제한치미만
실시예 10 : 배지내에서 탄수화물 조성의 변화에 의한 EPO 의 생물학적 활성의 영향
다음에 나타낸 방법은 공급 배지에서 탄수화물 공급을 변화시킴으로서 인간 에리트로포이에틴의 질을 변화시킬 수 있음을 보여준다.
사용하는 배지의 조성이 상이한 상기 기술된 방법의 2 개의 변법 (이후 발횬 E 및 발효F 로 부른다) 을 나타내었다.
양 제제에 있어서 배양 배지의 배합은 개질된 eRDF 배지에 기초한다. 혈청은 사용되지 않고 오히려 재조합 인슐린 (유일한 단백질 첨가제) 및 통상 무혈청 또는 무단백질 배지에서 사용하는 추가의 보충물 (예, 셀레나이트, 푸트레신, 히드로코르티손, 아이론 술페이트) 를 사용한다.
또한 공급 영양 용액은 개질된 eRDF 배지에 기초하나 염 KCl, Na2HPO4및 NaCl 를 함유하지 않는다.
발효 E 와 F 사이의 주 차이점은 공급 배지에 다양한 단당류의 첨가이다.
발효 E:
통상의 당 D-(+)-글루코오스를 발효 E 를 위하여 사용한다. 초기 농도는 3 g/l 이다. 글루코오스-함유 영양 용액을 적절히 공급하여, 배양 브로쓰내 글루코오스 농도를 전 배양동안 3 ±0.5 g/l 에서 유지시킨다.
배양기간은 통상적으로 100 ±20 시간이다. EPO 의 농도는 전형적으로 수확시 40 ± 10mg/l 이다.
발효 F:
D-(+)-글루코오스외에, 당 D-(+)-갈락토오스 및 D-(+)-만노오스를 약 1:2:3의 질량비로 발효 F 용 공급 배지에 첨가한다. 배양동안 모든 당의 농도는 적적절히 공급하여 0.25 g/l 내지 3.5g/l 의 범위에서 유지시킨다.
이러한 성장을 위한 배양기간은 전형적으로 100 ±20 시간이다. 수확시의 EPO 농도는 전형적으로 40 ±10mg/l 이다.
에리트로포이에틴은 배양 상층액으로부터 정제한다. 정제 절차는 당단백질의 관련 이소형의 분포가 영향받지 않도록 디자인한다 (예, 실시예 2)
정제된 에리트로포이에틴의 이소형 분포는 전술한 바와같이 측정한다.
인간 에리트로포이에틴의 이소형의 탄수화물 구조와 이들의 수확된 배양 상층액내 분포는 발표 E 및 발표 F 에서 상이하다. 발효 E 는 발효 F와 비교하여 이소형 2,3 및 4 의 상당히 더 높은 비율을 갖는다. 이러한 차이는 단당류 만노오스 및 갈락토오스의 공급으로 야기된다 (예, 도 2).
노르모 마우스 시험 (실시예 4) 로 측정한 생물학적 활성은 EPO 이소형의 탄수화물 구조 및 분포와 상관관계가 있다 (도 3). 배양 상층액 E 및 F 로부터 수득한 EPO 제제의 탄수화물 구조는 CZE 및 HPAEC 분석으로 시험한다.
안테나러티 (bi구조, tri구조 및 tetra구조의 함량), N-아세틸-락토사민 단위 (LE) 의 함량, 시알산 함량 (SA) 및 두 EPO 제제의 LE 와 SA 의 곱을 표 3 에 나타내었다.
bi[%] tri[%] tetra[%] SA함량 LE함량 LExSA
발효E 12.6 25.4 62.0 10.8 10.8 116.7
발표F 10.1 19.2 70.6 11.6 11.25 130.5
실시예 11 : 특정 활성 및 탄수화물 구조의 상관관계
이 실시예에서 탄수화물 구조에대한 각각의 EPO 이소형의 생물학적 활성의 의존성에 대한 조사를 요약하였다. 이를 위해 다양한 EPO 원 유래의 이소형(IF) (CHO 세포 및 인간세포유래의 EPO 의 상이한 배취) 를 분리 및 비교하였다.
11.1 등전 포커싱 (IEF) 및 웨스턴 블롯을 이용한 EPO 의 각각의 이소형의 분리
A) 니트로셀룰로오스에 대한 IEF 겔 전기영동 및 전기블롯팅의 절차
순수형태로 각각의 이소형을 분리시키기 위하여, 여러 이소형의 혼합물로 구성된 EPO 용액을 ultrafree 원심분리 장치에서 탈염시키고 농축한다 (5-10mg/ml) 이러한 용액의 350-1000㎍ 는 Serva 사제의 시판용 IEF 폴리아크릴아미드 겔에 적용한다(Servalyt Precotes, pH 3-5, 300 ㎛, 125 ×125mm) (레인당 70-100㎍ EPO 을 함유하는 5 - 10 레인). IEF 는 5℃ 에서 3.5 시간동안 2500V 에서 실시하고; 이어서 겔을 니트로셀룰로오스상에 블롯트시킨다(SDS 없이 메탄올을 함유하는 Tris/글리신 버퍼에서 습식 블롯트, 200mA 에서 3 시간). 블롯팅 공정후, 겔을 제거하고 니트로셀룰로오스 막은 Ponceau S 로 염색시킨다. 염색된 이소형은 절단하고 다시 완전히 물 또는 TBS 버퍼 (100mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl) 로 탈염시킨다.
B) 막으로부터 이소형의 추출
각각의 이소형을 함유하는 탈염된 니트로셀룰로오스 스트립을 에펜도르프 용기 (IEF 겔의 3-4 레인에 해당) 에 넣고, 1.5ml 아세톤을 첨가한후 와류시켜 니트로셀를로오스를 용해시킨다. 20℃ 에서 밤새워 인큐베이터시켜 EPO 를 최적으로 침전시킨다. 이어서 EPO 를 함유하는 침전물은 14,000 rpm 에서 벤치 원심분리로 10 분간 분리시킨다. 침전물은 1 ml 아세톤으로 2-3 회 세정한후 질소기류하 실온 또는 37℃ 에서 건조시킨다. 이어서 EPO 침전물을 20mM Na-포스페이트 버퍼 (pH7.2, 0.01% Tween 20 함유) 에 용해시킨후 추가의 분석전까지 -20℃ 에서 저장시킨다.
c) 예비분획된 EPO 용액으로부터 이소형의 분리
각각의 이소형을 초기의 EPO 용액이 단지 3-4 이소형 대신에 7-8 를 함유하는 제한조건으로 A) 및 B) 에 기술된 바와 같이 분리시킨다. 출발물질은 DE 크로마토그래피 (음이온 교환기) 로 분리시킨 EPO 분획이다. 이러한 분획은 단지 3-4 이소형 (예컨대, 이소형 6-8 또는 이소형 1-4) 를 함유한다. 이소형 팩키지를 분리시키기 위해서는, 적합한 크로마토그래피 컬럼을 10mg 적용된 EPO 당 1-2ml DEAE-세파로오스 ff 로 충진시키고 0.5M NaOH 으로 재생시킨다. 이어서 컬럼을 처음에 2CV 중화버퍼로 평형화시킨후 적어도 5CV 평형화 버퍼로 평형화시킨다.
8 이소형을 포함하는 정제된 EPO 제제는 5 ±4℃ 의 온도 및 15 CV/h 이하의 유동속도에서 흡수시킨다. 이어서 컬럼을 2 내지 3 CV 평형화버퍼로 세정한후 pH 값이 5.0 (약 5 CV) 될 때까지 세정버퍼로 휑군다.
다양한 이소형 팩키지를 처음에 20 mM NaCl 로 시작하여 10mM 단계식 용출버퍼의 NaCl 농도를 증가시켜 용출시킨다. 염기성 이소형은 이온 교환기에 약하게 결합하여, 낮은 이온 강도에서 용출되며, 산성 이소형은 더 높은 NaCl 농도에서 70mM NaCl까지 용출된다. 특정 NaCl 농도에서 용출되는 이소형의 양은 출발물질 및 용출부피에 강력하게 좌우된다. 대체적으로 용출은 상기 NaCl 농도에서 OD 280 이 최대값의 약 50% 에까지 감소할 때까지 각 단계에서 계속한다. 이것은 15 내지 40CV 사이에 해당한다. NaCl 농도내에서 용출된 이소형 팩키지의 추가의 분획화는 추가의 이소형의 분리를 가져온다. 컬럼의 트래블 속도는 15CV/h 이하이다.
중화 버퍼 : 100 mM Na/K 포스페이트, pH 7.5 ±0.2
평형화 버퍼 : 10 mM Na/K 포스페이트, pH 7.5 ±0.2
세정 버퍼 : 30 mM NaAc/HAc, pH 5.0 ±0.2
용출 버퍼 : 10 mM NaAc/HAc, pH 5.0 ±0.2, 20 mM NaCl, 또는 70mM NaCl 까지 10mM 단계식 증가된 농도
각각의 순수한 이소형은 A) 및 B) 에 기술된바 같이 정제하여 상기의 방식에서 수득한 이소형 팩키지로부터 분리시킨다.
A-C 로부터 수득한 순수한 이소형 (IF)는 산성에서 염기성으로 이들의 등전점(PI) 에 따라 번호를 붙인다. 이소형 2 (IF2) 는 가장 낮은 pI 를 갖는 가장 강한 산성의 분리된 이소형이다. 이소형 8 은 가장높은 pI 를 가진 가장 강한 염기성이다. 이소형 2 는 출발 혼합물로부터 적절한 양으로 분리될 수 있는 가장낮은 pI 를 갖는 이소형이다. 단지 이소형 1의 1-2% 만이 출발 혼합물에 존재하여 완전한 분석을 위한 적절한 양을 수득하는 것은 불가능하다.
다음의 분석은 순수한 이소형을 특징화하기 위하여 실행한다 :
- RP-HPLC 를 이용한 양 및 수율의 측정
- 모세관 전기영동 및 등전점 포커싱에 의한 순도 및 동일성의 측정
각각의 이소형의 수율은 통상적으로 출발 혼합물에서 사용하는 이소형의 20 내지 30% 이다.
이소형의 순도는 통상적으로 >90%, 대부분은 >94% 이다.
11.2 결과
다음의 데이타는 순수한 이소형 (IF) 에 대하여 얻어진다 :
- N-연결된 탄수화물 구조의 상대적 분포 (총 글리코실화에 대한 바이안테너리, 트리안테너리 및 테트라안테너리 구조의 비율) 및 반복단위 함량
- 노르모 마우스 테스트에서 생물학적 활성
- 시알산 함량
이러한 측정은 주로 앞서 기술한 방법으로 실행한다.
분리된 이소형의 시알산 함량은 각각의 개별적인 이소형 제제에 대해 별도로 측정되지 않고 CHO 세포유래의 EPO 의 이소형 2-8 또는 인간세포유래의 EPO 의 이소형 2-6 의 각각에 대한 예로서 1-3 제제에 대하여 실행한다.
각각의 이소형의 반올림한 전수(whole number)의 시알산값을 사용하여 N-아세틸-락토사민 단위 (LE 값)의 함량과 시알산 함량 (SA) 의 곱을 계산한다.
이러한 반올린된 SA 값은 CHO 세포 및 인간 세포유래의 EPO 에 대해 다음과 같다 : 14 (IF2), 13(IF3),12(IF4), 11(IF5),10(IF6),9(IF7) 및 8(IF8).
표 4 에는 CHO 세포 (CHO 1, CHO2 및 CHO3) 및 인간 세포 (HeLa 1 내지 5)유래의 다양한 EPO 제제의 탄수화물 구조와 특이적 활성사이의 상관관계에 대한 데이타를 포함한다. 표는 EPO 분자내 N-아세틸-락토사민단위 (LE) 의 평균총수, 평균시알산 함량 (SA) 및 LE ×SA 곱과의 생물학적활성 사이의 상관관계를 보여준다.
표 5 는 EPO 분자내 N-아세틸-락토사민단위 (LE) 의 평균총수, 평균시알산 함량 (SA) 및 CHO 세포유래의 비 예비분획화된 EPO 배취의 분리된 이소형의 LE ×SA 곱과의 생물학적 활성사이의 상관관계를 보여준다.
표 6 은 CHO 세포유래의 예비분획된 EPO 배취의 다양한 분획으로부터 분리된 이소형 (IF2 또는 IF5) 의 다양한 제제 (A 및 B)의 비교를 포함한다. 즉, 이소형 2 및 5 의 2 제제 (A 및 B)는 각각의 경우에서 분석되었다. 예비분획화는 실시예 11.1C 에서 기술된 바와 같이 DE 음이온 교환기를 이용하여 실행한다. 이소형 IF2 및 IF5 의 두 제제 A 및 B 는 DE 컬럼의 상이한 분획 (분획 5 및 6 유래의 IF2 및 분획 2 및 3 유래의 IF5) 으로부터 분리시킨다. IF2/A 또는 IF5/A 가 각각 분리된 분획 5 또는 2 는 IF2/B 또는 IF5/B 각각이 분리된 분획 6 또는 3 보다 DE-세파로오스 컬럼으로부터 먼저 분리, 용출(낮은 염 농도에서)된다. 그러나, 이소형 2 또는 5 의 제제 A 및 B 는 각각 후속의 등전점 포커싱 또는 모세관 전기영동에서 이들의 특성에 있어 상이하지 않다. 즉, IF2 또는 IF5 의 양 제제는 동일한 시알산 함량을 갖는다. 그러나, 제제 A 유래의 이소형은 이들의 더 높은 LE 값 및 더 높은 반복단위 구조의 함량으로 인해 제제 B 유래의 대응하는 이소형보다 현저히 더 높은 생물학적 활성을 가짐을 놀랍게도 발견하였다. 동일한 시알산 함량에서 EPO 분자에 함유된 N-아세틸-락토사민 단위의 총수에 대한 이소형의 생물학적 활성의 표 6 은 이소형 2 에 대해서 뿐만아니라 다른 이소형에 대해서도 관찰된다.
표 7 은 다양한 EPO 원(CHO 세포 또는 인간 HeLa S3 세포)유래의 대응하는
이소형을 비교하였다. 또한 이러한 경우에서 생물학적 활성과 LE×SA 값 사이에서 상관관계가 발견된다.
따라서 모든 표에서 상관관계는 N-아세틸-락토사민 단위 (LE)의 수와 시알산 함량 (SA)의 곱과 생물학적 활성사이에서 볼 수 있다. 곱 LE ×SA 의 높은 값은 항상 높은 생물학적 활성과 관련이 있다.
명칭 테트라안테너리(%) 반복단위1(%) LE SA mole/mole LE ×SA 특이활성 KU/mg
CHO 1 86.7 39.6 12.9 12.9 166.4 248
CHO 2 78.6 51 13.2 11.8 155.8 225
CHO 3 73.5 42.6 12.6 11.7 147.4 186
HeLa 1 85.4 18.0 12.0 13.1 157.2 220
HeLa 2 82.2 16.5 11.9 13.2 157.1 198
HeLa 3 78.2 14.0 11.7 13.3 155.6 204
HeLa 4 70.6 12.2 11.25 11.6 130.5 176
HeLa 5 62 9.8 10.8 10.8 116.7 100
LE :N-아세틸-락토사민 단위SA : EPO 제제의 시알산함량1: 당구조(bi+tri+tetra = 100%)의 총량에 대한 부가의 LE 연장부를 갖는 모든 당구조의 퍼센티지
테트라안테너리(%) 반복단위1(%) LE SA mole/mole LE ×SA 특이활성 KU/mg
IF 2 98 48 13.7 14 191.1 400
IF 3 86 43 13.1 13 170.3 280
IF 4 75 40 12.6 12 151.2 200
IF 5 64 39 12.0 11 132 150
IF 6 56 41 11.4 10 114 75
IF 7 42 39 11.1 9.0 100 40
IF 8 34 33 10.5 8.0 84 19
LE :N-아세틸-락토사민 단위(실시예 7 에서와 같이 계산된)SA : 각각의 이소형의 시알산함량1: 당구조(bi+tri+tetra = 100%)의 총량에 대한 부가의 LE 연장부를 갖는 모든 당구조의 퍼센티지
테트라안테너리(%) 반복단위1(%) LE SA mole/mole LE ×SA 특이활성 KU/mg
IF 2/A 99 54 14.1 14 197.4 396
IF 2/B 97 31 12.9 14 180.6 330
IF 5/A 64 58 13.2 11 145.2 206
IF 5/B 55 32 11.4 11 125.4 112
LE :N-아세틸-락토사민 단위(실시예 7 에서와 같이 계산된)SA : 각각의 이소형의 시알산 함량1: 당구조(bi+tri+tetra = 100%)의 총량에 대한 부가의 LE 연장부를 갖는 모든 당구조의 퍼센티지
테트라안테너리(%) 반복단위1(%) LE SA mole/mole LE ×SA 특이활성 KU/mg
IF2(CHO2) 99 58 14.4 14 201.6 440
IF2(CHO3) 98 48 13.7 14 191.8 400
IF2(HeLaS3) 99 24 12.9 14 118.8 240
IF5(CHO2) 68 48 12.9 11 141.9 175
IF5(CHO3) 64 39 12.0 11 132.0 150
IF5(HeLaS3) 70 15 10.8 11 119.0 60
LE :N-아세틸-락토사민 단위(실시예 7 에서와 같이 계산된)SA : 각각의 이소형의 시알산함량1: 당구조(bi+tri+tetra = 100%)의 총량에 대한 부가의 LE 연장부를 갖는 모든 당구조의 퍼센티지
부가의 N-아세틸-락토사민 단위 (반복단위)를 갖는 N-연결된 탄수화물 구조의 비율에 대한 EPO 의 생물학적 활성의 의존성은 예로서 각각의 이소형을 사용하여 도 4 에 나타내었다. 이소형은 반복단위를 함유하는 탄수화물 구조의 상이한 비율 (약 50% 의 반복단위-함유 구조를 갖는 EPO, 약 40% 의 반복단위-함유 구조를 갖는 EPO2, 약 15% 의 반복단위-함유 구조를 갖는 EPO 3) 을 갖는 EPO 제제로부터 분리시킨다. 대응하는 이소형의 생물학적 활성 (시알산의 동일량 및 약간 동일한 안테나러티) 는 이소형에서 반복단위-함유 탄수화물 구조가 감소함에 따라 감소한다. 이러한 특징은 이소형 2 에서 적어도 이소형 7 까지에서 관찰할 수 있다.

Claims (42)

  1. EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬에 대해 평균 4.3 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 수 또는 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대해 평균 13.0 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 수를 포함하는 글리코실화 EPO 분자로 주로 구성된, 2 내지 5 이소형의 혼합물을 함유하는 EPO 조성물로서,
    (i) EPO 분자는 CHO 세포내 외인성 DNA 의 발현산물이고, N-연결된 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율이 30% 이상인 CHO 세포로부터 유래한 글리코실화 EPO 분자로 구성되거나,
    (ii) 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율이 10% 이상인, EPO 분자가 인간 세포내 내인성 DNA 의 발현산물인 것을 특징으로 하는 EPO 조성물.
  2. N-연결된 탄수화물 사슬에 대해 평균 4.3 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수 또는 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대해 평균 13.0 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수를 포함하는 글리코실화 EPO 분자로 구성된, 2 내지 5 이소형의 혼합물을 함유하는 EPO 조성물로서,
    (i) EPO 분자는 CHO 세포내 외인성 DNA 의 발현산물이고, N-연결된 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율이 30% 이상인 CHO 세포로부터 유래한 글리코실화 EPO 분자로 구성되거나,
    (ii) 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율이 10% 이상인, EPO 분자가 인간 세포내 내인성 DNA 의 발현산물인 것을 특징으로 하는 EPO 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, N-아세틸-락토사민 단위의 수는 N-연결된 탄수화물 사슬에 대해 4.5 이상 또는 총 N-글리코실화에 대해 13.5 인 EPO 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬에 대한 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수와 EPO 분자당 평균 시알산함량의 곱에 대한 값이 43.3 이상인 또는 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대하여는 130 이상인 글리코실화 EPO 분자로 주로 구성된 EPO 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서, EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬에 대한 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수와 EPO 의 분자당 평균 시알산함량의 곱에 대한 평균값이 43.3 이상인 또는 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대하여는 130 이상인 글리코실화 EPO 분자로 구성된 EPO 조성물.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 곱의 값이 N-연결된 탄수화물 사슬에 대해 46.7 이상 또는 총 N-글리코실화에 대하여는 140 이상인 EPO 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 3 내지 4 이소형의 혼합물을 함유하는 EPO 조성물.
  10. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 175,000 IU/mg 단백질 이상의 인 비보(in vivo) 특이적 활성을 갖는 EPO 조성물.
  11. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 200,000 IU/mg 단백질 이상의 인 비보 특이적 활성을 갖는 EPO 조성물.
  12. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자당 평균 시알산 함량은 11 이상인 EPO 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율과 탄수화물 사슬의 총수에 대한 테트라안테너리 구조의 비율의 곱에 대한 값이 2400 이상인 EPO 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위를 갖는 탄수화물 사슬의 비율과 탄수화물의 총수에 대한 테트라안테너리 구조의 비율의 곱에 대한 값이 800 이상인 EPO 조성물.
  19. 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 무혈청 배지에서 배양하는 EPO 조성물.
  20. 임의적으로 통상의 약제학적 희석제, 보조물질 및 캐리어와 함께 활성물질로서 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 청구된 EPO 조성물을 함유하며, 적혈구 생성을 촉진시키는 약제학적 제제.
  21. 목적하는 특징을 갖는 EPO 조성물은 다음의 수단 중 하나 이상으로 수득되는, 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 청구된 EPO 조성물의 제조 방법:
    (a) 고 비율의 테트라안테너리 구조를 갖는 탄수화물 사슬을 생산할 수 있는 적합한 생산 세포의 선택,
    (b) 고 비율의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬을 생산하기 위한 세포배양에 적합한 배양 조건의 선택, 및
    (c) 고 비율의 N-아세틸-락토사민 단위를 갖는 탄수화물 사슬을 포함하는 EPO 분자를 풍부하게하는 반면 EPO 분자의 공지된 조성물로부터 비목적 성분의 분리.
  22. 제 21 항에 있어서, 수단 (b) 는 2 이상의 탄수화물, 바람직하게는 3 이상의 탄수화물의 혼합물을 배양배지에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 글루코오스 또는/및 만노오스 또는/및 갈락토오스를 포함하는 탄수화물 혼합물을 사용하는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 수단 (b) 는 하나이상의 필수 아미노산 또는/및 세포의 요건에 의해 결정되는 하나이상의 탄수화물을 함유하는 영양물의 필요에 따른 조절된 첨가가 포함되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 세포의 영양 요건은 배양 배지에서 측정된 글루타민의 농도에 따라 결정되는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 영양물은 세포의 전 성장단계에 걸쳐 필요에 따라 첨가하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 영양물은 2 이상의 탄수화물의 혼합물을 함유하는 방법.
  28. 제 21 항에 있어서, 수단 (b) 는 30 내지 35.5℃의 온도에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 수단 (c) 에는 pH 6-8 범위의 값에서의 역상 크로마토그래피 단계가 포함되는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 아세토니트릴, 에탄올 또는 이소프로판올이 용출액으로 사용되는 방법.
  31. 제 21 항에 있어서, 수단 (c) 는 트리아진 염료를 사용하는 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
  32. 제 21 항에 있어서, 수단 (c) 는 렉틴 염료를 사용한 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
  33. EPO 분자는 하기를 갖는 조성물에서 풍부해지는, EPO 조성물의 특이적 활성을 증가시키는 방법 :
    (a) 고 비율의 N-아세틸-락토사민 반복단위 및 선택적으로,
    (b) 다수의 N-아세틸-락토사민 단위,
    (c) N-아세틸-락토사민 단위의 수와 시알산의 함량의 곱의 높은 값, 또는/및
    (d) N-아세틸-락토사민 반복단위의 비율과 테트라안테너리 탄수화물 구조의 비율의 곱의 높은 값.
  34. 제 33 항에 있어서, EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬에 대해 4.3 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수 또는 평균적으로 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대해 13.0 이상의 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수로 풍부해지는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 평균 시알산 함량과 EPO 분자의 N-연결된 탄수화물 사슬에 대한 N-아세틸-락토사민 단위의 평균수의 곱에 대한 값인 43.3 이상으로 또는 EPO 분자의 총 N-글리코실화에 대하여는 130 이상으로 풍부해지는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서,
    (a) CHO 세포 유래의 EPO 의 경우에는, 탄수화물 사슬의 총수에 대해 30% 이상의 N-아세틸-락토사민 반복단위의 평균 비율로 풍부해지거나, 또는
    (b) 인간 세포 유래의 EPO 의 경우에는, 탄수화물 사슬의 총수에 대해 10% 이상의 N-아세틸-락토사민 반복단위의 평균 비율로 풍부해지는 방법.
  37. 제 33 항에 있어서,
    (a) CHO 세포 유래의 EPO 의 경우에는, 2400 이상의 테트라안테러리 탄수화물 구조의 평균비율과 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위의 평균비율의 곱에 대한 값까지 풍부해지거나, 또는
    (b) 인간 세포 유래의 EPO 의 경우에는, 800 이상의 테트라안테러리 탄수화물 구조의 평균비율과 탄수화물 사슬의 총수에 대한 N-아세틸-락토사민 반복단위의 평균비율의 곱에 대한 값까지 풍부해지는 방법.
  38. 제 33 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 풍부화는 제 21 항에서 청구된 바와 같은 수단 (a), (b) 및 (c) 중 하나이상에 의해 달성되는 방법.
  39. 삭제
  40. 제 24 항에 있어서, 영양물은 3 이상의 탄수화물의 혼합물을 함유하는 방법.
  41. 삭제
  42. 삭제
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