JP2001525338A

JP2001525338A - 高い比活性を有するエリスロポエチン

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Publication number: JP2001525338A
Application number: JP2000523237A
Authority: JP
Inventors: ブルク，ヨーゼフ; ゼリンガー，カール−ハインツ; ハーゼルベック，アントン; コル，ハンス
Original assignee: ロシュダイアグノスティクスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2001-12-11
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: TR200001580T2; BR9813391C1; CN1280309C; US20050288220A1; EP1037921B1; WO1999028346A1; CA2309810C; AU2158199A; AR022358A1; KR20010024681A; AU744086B2; KR100390325B1; US7659373B2; CA2309810A1; JP2004339234A; JP4234647B2; CN1280586A; BR9813391A; JP3673261B2; JP2003238593A

Abstract

(57)【要約】本発明はＮ−アセチルラクトサミン単位及び／又は炭水化物構造内の４アンテナ分枝の高比率を特徴とする、高い比活性を有する新規ＥＰＯ組成物に関する。更に、本発明はその様なＥＰＯ製品の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】説明本発明は、その炭水化物構造においてＮ−アセチルラクトサミン単位及び／又
は４アンテナ分枝の高含量によって特徴づけられる高い比活性を有する新規ＥＰ
Ｏ組成物に関する。本発明はまた、その様なＥＰＯ製品の単離法に関する。

【０００２】エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球細胞の産生を刺激するヒト糖タンパク質
である。ＥＰＯは健康な人の血液血漿において、非常に低濃度だけ発生するので
、この様により多くの量を提供する事は可能ではない。ＥＰ−Ｂ１−０１４８
６０５及びＥＰ−Ｂ１−０２０５５６４はＣＨＯ細胞における組換えヒト
ＥＰＯの製造を記載する。ＥＰ−Ｂ１−０１４８６０５において記載された
ＥＰＯは尿ＥＰＯ及び非Ｏグリコシル化のものより高い分子量を有する。ＣＨＯ
細胞由来のＢＰ−Ｂ１−０２０５５６４において記載されたＥＰＯは大量に
おいて及び純粋形態において現在入手可能である。

【０００３】更に無形成貧血を有する患者の尿からのヒトＥＰＯの単離が知られている（Mi
yake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558〜5564）。組換え及び尿のＥＰＯはそれらのシアル化の値において異なることが知られて
いる様々なイソ型の混合物として単離される。これらのＥＰＯのイソ型は異なる
等電点を有し、そして等電点電気泳動又はキャピラリー電気泳動（Tsao et al.,
Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196 ; Nieto et al., Anal. Commun. 33
(1996), 425-427 ; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471 ; Biet
ot et al., J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184 ; Watson et al., Anal. Bio
chem. 210 (1993), 389-393 参照）によって分離されうる。最も大きな数のシア
ル酸を有するイソ型は最も高い比活性を有し、一方最も少ない数を有するそれら
は最も低い活性を有する（例えばImai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990),
457-462 ; EP-A-0 428 267参照）。

【０００４】 Takeuchiらは（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822)、前記生
物学的活性とシアル酸含量と２アンテナ及び４アンテナの炭水化物構造の比率と
の関係を記述している。Takeuchiらは、更にＥＰＯの炭水化物構造におけるＮ−
アセチルラクトサミン単位の存在が前記生物学的活性と相互に関係していない事
を結論づけている。

【０００５】 Fukudaらは（Blood 73 (1989),84〜89）、前記生物学的活性に重要な貢献をす
る血液循環由来のＥＰＯの排出速度を扱い、そして比較的多量のＮ−アセチルラ
クトサミン単位を有するＥＰＯが、ラクトサミン単位を有していないＥＰＯより
も前記循環からより素速く除去される事を結論づけている。Morimotoらは（Glyc
oconjugate J. 13 (1996),1093〜1120）、ｍｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィーによ
るＥＰＯのイソ型の分離、そしてその個々の画分が２、３のイソ型のみから成っ
ている事を記述している。これらの画分で行われた前記研究は、全ての画分にお
ける全ての構造の平衡を示している。相互関係が２アンテナ若しくは４アンテナ
の構造の含量又はＮ−アセチルラクトサミン単位の含量と前記比活性の間に見出
されなかった。

【０００６】この様に前記従来技術はシアル酸の含量に関して、特に前記糖構造と前記生物
学的活性の一般的な相互関係がある事を示している。しかしながら、４アンテナ
構造の含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの含量が直接前記生物学的活性
と相互関係している事は全く記載が無い。ＥＰＯ調製品を精製するとき、驚くことに炭水化物構造における４アンテナ炭
水化物構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の増大が前記特異的な生物
学的活性の有意な改良を引き起こす事が明らかにされた。これは、ＥＰＯが欧州
適用９７１１２６４０．４に従うヒト細胞系において製造される場合に特に
適用可能である。

【０００７】個々のＥＰＯ調製品又はＮ−アセチルラクトサミン単位（ＬＥ単位）の含量に
おいて本質的にわずかに異なる炭水化物構造のＥＰＯイソ型の比較活性の研究は
、前記調製品又は同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ度の値のＮ−アセ
チルラクトサミン単位の高含量を有するイソ型の更に有意に高い活性を示してい
る。この関連において、アンテナ度は、前記ＥＰＯ調製品の２アンテナ、３アン
テナ及び４アンテナのＮ結合炭水化物鎖の、又はＮ結合炭水化物鎖の総数に関す
る前記単離ＥＰＯのイソ型の、相対的平均含量（ｉｎ％）として理解される。更
に、４−アンテナ構造の含量が高められたものを有する調製品又はイソ型におい
て特に、ラクトサミン単位の全含量がｉｎｖｉｖｏ活性において非常に重要で
ある事を明らかにした。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の全含量における増加、
例えばＬＥ単位を有するその核構造の付加的な伸長の形態（いわゆる繰り返し）
における増加は前記生物学的活性を相当増大することができる。更に４アンテナ
構造の含量における増大が前記生物学的活性を改善しうる事が明らかにされた。

【０００８】故に、最大限可能な高い比活性を有し及び高収率のＥＰの製造を試みるならば
、それに続く精製段階、製造細胞及び／又はその培養は４アンテナ炭水化物構造
の最大限可能な高い含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の最大限可能
な高い含量を達成するために選択及び最適化されなければならない。本発明の第一の観点は炭水化物鎖の総数、すなわち２アンテナ、３アンテナ及
び４アンテナ構造の合計に関して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０
％、特に好ましくは少なくとも８５％及び最も好ましくは少なくとも９０％の４
アンテナ構造の比率を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成るＥＰ
Ｏ組成物に関する。

【０００９】本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの前記平均組成
物に関して少なくとも３．７、好ましくは少なくとも４．０、特に好ましくは少
なくとも４．３及び最も好ましくは少なくとも４．５のＮ−アセチルラクトサミ
ン単位の平均数又はＥＰＯ分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造（全Ｎグリコシル
化）に関して少なくとも１１．１、好ましくは少なくとも１２．０、特に好まし
くは少なくとも１３．０及び最も好ましくは少なくとも１３．５のＮ−アセチル
ラクトサミン単位数を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成るＥＰ
Ｏ組成物に関する。

【００１０】本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の
平均総数にＥＰＯの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも１３
０、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは少なくとも１４０及び最も好
ましくは少なくとも１６０の値を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質
的に成る、ＥＰＯ組成物に関する。

【００１１】この文脈において“本質的に”の語は前記所望のＥＰＯ分子がその組成物にお
けるＥＰＯ分子の総数に関して好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少
なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％の比率において存在する事
を意味する。本発明のより更なる観点は炭水化物鎖の総数に関して少なくとも７５％、好ま
しくは少なくとも８０％及び特に好ましくは少なくとも８５％の平均比率の４ア
ンテナ構造を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関す
る。

【００１２】更に本発明はＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの組成物の平均に関して少
なくとも３．７、好ましくは少なくとも４．０並びに特に好ましくは少なくとも
４．３及び最も好ましくは少なくとも４．５の平均数のＮ−アセチルラクトサミ
ン単位を有し、又はＥＰＯ分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造に関して少なくと
も１１．０、好ましくは少なくとも１２．０、特に好ましくは少なくとも１３．
０及び最も好ましくは少なくとも１３．５の数のＮ−アセチルラクトサミン単位
を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関する。

【００１３】４アンテナ構造の最大比率は、各々の４アンテナ構造がＮ結合糖の核構造にお
いて４個のＮ−アセチルラクトサミン単位を含む場合、全炭水化物鎖の１００％
に達することができる。いわゆる繰り返しの様に核構造の伸長を生じる付加的な
Ｎ−アセチルラクトサミン単位は炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミ
ン数並びにグリコシル化の総数を増大することができる。グリコシル化部位当た
りの（すなわちＮ結合炭水化物構造当たりの）Ｎ−アセチルラクトサミン単位の
数は６（繰り返しの形態における４アンテナ構造及び２つの付加的なＮ−アセチ
ルラクトサミン単位）まで達することができ、又は（２つの付加的なＮ−アセチ
ルラクトサミン単位以上有する場合において）それより多くなりうる。Ｎ−アセ
チルラクトサミン単位の数はグリコシル化の総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関
して１８又はそれ以上になりうる。

【００１４】本発明のより更なる観点は、ＥＰＯ分子のＮ−アセチルラクトサミン単位の平
均総数にＥＰＯの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも１３０
、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは少なくとも１４０及び最も好ま
しくは少なくとも１６０の平均値を有するグリコシル化された分子から成るＥＰ
Ｏ組成物に関する。

【００１５】本発明の更なる主題は前記の観点の少なくとも２又はそれ以上の形態を有する
ＥＰＯ組成物である。本発明に従う組成物は１又は複数のイソ型すなわち等電点電気泳動において異
なる等電点を有するＥＰＯ分子から成りうる。本発明に従う組成物は少なくとも
２つの、例えば２〜５つのイソ型の混合物、特に３又は４つのイソ型の混合物を
好ましくは含んで成る。

【００１６】本発明に従う組成物の比活性はｉｎｖｉｖｏ（正血球状態のマウス）で好ま
しくは少なくとも１７５，０００IU／mg、特に２００，０００IU／mgである。前
期比活性は特に好ましくは約２００，０００〜４００，０００IU／mg又は４５０
，０００IU／mgタンパク質の範囲内、最も好ましくは２５０，０００〜４００，
０００IU／mg又は４５０，０００IU／mgタンパク質の範囲内である。

【００１７】本発明に従う前記組成物において、平均シアル酸含量又はＥＰＯの分子当たり
のシアル酸残基の平均数は好ましくは１１〜１４、特に好ましくは少なくとも１
１．５及び最も好ましくは少なくとも１２．５である。本発明に従う前記ＥＰＯ組成物は、一方で、哺乳類の細胞、例えば齧歯類の細
胞、例えば、ＥＰ−Ｂ−０２０５５６４に記載のＣＨＯ又はＢＨＫにおける
外来ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子から得ることができる。あるいは、前
記組成物は、ヒト細胞、例えばNamalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969),
64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033)又はHeLa S3
(Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-284)の様な不死化された細胞に
おける遺伝子活性の後の、内因性ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子からも成
りうる。この様な方法は欧州特許適用９７１１２６４０．４に記述され、そ
の開示は本発明の適用の部分を成す。

【００１８】ＥＰＯの生物学的活性のための更に重要なパラメーターは、Ｎ結合炭水化物鎖
の総数に関する繰り返し、すなわち付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有
する炭水化物鎖の比率、及びこの繰り返しの比率と炭水化物鎖の総数に関する４
アンテナ炭水化物鎖の比率との積の値である。ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合に
おいて、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも３０％、特に好ましくは少なく
とも３５％及び最も好ましくは少なくとも４０％である。ヒト細胞、例えばＨｅ
Ｌａ細胞由来のＥＰＯの場合には、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも１０
％、特に好ましくは少なくとも１２％及び最も好ましくは少なくとも１４％であ
る。故に、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合には、炭水化物鎖の総数に関するＮ−
アセチルラクトサミン繰り返しを持つ炭水化物鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関
する４アンテナ構造の比率との積の値は好ましくは少なくとも２４００、特に好
ましくは少なくとも２８００及び最も好ましくは少なくとも３４００である。ヒ
ト細胞由来のＥＰＯの場合には、前記値は好ましくは少なくとも８００、特に好
ましくは少なくとも９６０及び最も好ましくは少なくとも１１００である。

【００１９】ＥＰＯ組成物は、低含量の血清、例えば最大１％（Ｖ／Ｖ）を含む培養培地に
おいて又は特別に無血清培地において（このＷＯ９６／３５７１８を参照）ＥＰ
Ｏ製造細胞を培養することにより製造されてきたものが好ましくは使用される。
適当な培養培地の例はＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥＭである。本発明に従うＥＰＯ組成物は一般の医薬希釈剤、補助物質及び担体と任意に一
緒の医薬調製品として調製されうる。医薬調製品を製造するために使用されうる
本発明に従うＥＰＯ組成物は、逆層ＨＰＬＣ（例えばＶｙｄａｃＣ４カラム使
用）及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えばＴＳＫ２０００ＳＷＵ
ｌｔｒａｐａｃカラム使用）によって決定された好ましくは少なくとも９９％及
び特に好ましくは少なくとも９９．９％の純度を有する。

【００２０】更に、本発明に従う組成物は、１０，０００IUタンパク質当たりのＤＮＡが好
ましくは１０pg以下、特に好ましくは５pg以下及び最も好ましくは１pg以下のＤ
ＮＡ含量を有する。更に本発明に従う組成物は、好ましくは微生物の夾雑物（１
CFU ／ml以下）及びエンドトキシン（１EU／１０，０００IUタンパク質）を本質
的に含まない。

【００２１】前記ＤＮＡ含量は放射活性又は蛍光で標識されたＤＮＡを用いてハイブリダイ
ゼーション試験によって決定されうる。商業的に入手可能な精製されたヒトＤＮ
ＡがそのプローブＤＮＡの例として使用される。前記ヒトＤＮＡは更に前記試験
のスタンダードとして使用されうる。その様なハイブリダイゼーション試験の検
出の下限は約０．３pg／１０，０００IU ＥＰＯである。前記ＥＰＯ調製品の微
生物及びエンドトキシンの含量は医薬の欧州又はＵＳ特許に記載の標準化された
方法によって決定されうる。

【００２２】本発明によって所望される前記形態を好ましくは有するＥＰＯ組成物は以下の
方法：（ａ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖の製造が可能である適当な製造細胞の選択、（ｂ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適当な培養条件の選択及
び（ｃ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖を含むＥＰＯ分子の強化の間、ＥＰＯ分子の知られた組成物から
の不所望成分の分離；の少なくとも１つによって得られる。

【００２３】方法（ａ）は適当な産生細胞の選択を含んで成る。この場合、ある者は、一方
で、前記所望の炭水化物鎖構造を高収率で産生する傾向を有する事が知られてい
る細胞を使用しうる。その様な細胞系の例はハムスター由来の細胞、例えばＣＨ
Ｏ若しくはＢＨＫ及びヒト細胞系由来の、例えばＨｅＬａ，Ｎａｍａｌｗａ，Ｈ
Ｔ１０８０又はそれら由来の細胞系である。ＨｅＬａＳ３細胞又は改良ＣＨＯ
細胞が特に好まれる。

【００２４】一方、細胞内であるグリコシル化酵素を過剰発現させることによって、例えば
組換え体発現によって及び／又は内因性遺伝子の活性によって適当な製造細胞を
特に製造することも可能である。その様なグリコシル化酵素の例はシアリルトラ
ンスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びガラクト
シルトランスフェラーゼである。

【００２５】方法（ｂ）は前記細胞培養における適当な培養条件を含んで成る。本発明の第
一の態様において、方法（ｂ）は少なくとも２つ及び好ましくは少なくとも３つ
の炭水化物の混合物を培養培地に加える事も含んで成る。前記炭水化物は単糖類
及び二糖類、例えばグルコース、グルコサミン、リボース、フルクトース、ガラ
クトース、マンノース、スクロース、ラクトース、マンノース−１−リン酸、マ
ンノース−１−硫酸及びマンノース−６−硫酸から好ましくは選択される。栄養
培地は例えばグルコース及び／又はマンノース及び／又はガラクトースを含むも
のが適当である。各々の炭水化物がＤ（＋）型で特に好ましく使用される場合、
例えば１：（０．５−３）：（１−５）及び特に１：（０．７−２．４）：（１
．８−４．０）の質量比の、グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物
を含む栄養培地を用いて特に良い結果が得られる。発酵の間の全ての糖類の合計
濃度は、前記培養培地において好ましくは０．１〜１０ｇ／ｌ、特に好ましくは
２〜６ｇ／ｌである。炭水化物混合物は以下で更に詳細に解明される前記細胞の
それぞれの要求性に依存して好ましくは加えられる。

【００２６】更に好ましい態様に従い、方法（ｂ）は前記の培養された細胞系のための少な
くとも１つの必須アミノ酸及び／又は各々の細胞要求性に依存の少なくとも１つ
の炭水化物を含んで成る、栄養素の調節された、好ましくは要求性に従う添加を
含んで成る。この方法において、多くの改良されたグリコシル化が、高細胞密度
発酵（採収時の細胞密度が１０×１０⁵細胞／ml以上及び好ましくは２０×１０ ⁵ 細胞／ml以上）にもかかわらず大発酵槽（容積１ｌ以上、例えば５０〜１０，
０００ｌ）において得られる。この目的のために、前記細胞の栄養要求性に関連
するパラメーターの濃度は、連続的に又は適当な時間間隔で、例えば少なくとも
日に１回決定され、そしてそれらの消費速度が算出される。この事は前記細胞の
栄養要求性が定量的に及び／又は定性的に決定される事を可能にする。この様な
パラメーターは前記細胞の栄養素又は代謝産物、例えばグルタミン、アンモニウ
ム、グルコース及び／又は乳酸の濃度そして特にグルタミン濃度でありうる。

【００２７】本発明のこの観点に従って添加された前記栄養素は、必須アミノ酸、例えばグ
ルタミン及び／又はトリプトファン及び／又は炭水化物類並びに好ましくは更に
非必須アミノ酸、ビタミン類、微量元素、塩類及び／又は増殖因子、例えばイン
スリンから成る。前記栄養素は特に好ましくは少なくとも１つの必須アミノ酸及
び少なくとも１つの炭水化物を含む。これらの栄養素は溶解状態において培養培
地に好ましくは計量しながら加えられる。前記栄養素溶液はグルタミン及び炭水
化物類、特に上述した様な少なくとも２つの炭水化物類の混合物を好ましくは含
む。グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物が特に好ましく使用され
る。更に栄養素が前記細胞の全体の増殖期の後の必要性に従い、すなわち培養培
地において測定された前記の選択されたパラメーターの濃度に依存して加えられ
る事が好まれる。

【００２８】前記栄養素溶液における炭水化物類に対するグルタミンの量比は、発酵槽にお
ける消費率に本質的に一致する様、好ましくは選択される。この事は発酵槽にお
いて個々の基質の一定の濃度が維持される事を実質上可能にする。グルタミンの
濃度は前記培養培地において１５０mg／ｌ以下の値で好ましくは維持され、そし
て前記培養培地において２−３mmol／ｌ以上のアンモニウム濃度の発生を防ぐ。
発酵の間、糖類の全濃度は既に説明した様に培養培地で好ましくは０．１〜１０
ｇ／ｌの範囲内、特に好ましくは２〜６ｇ／ｌの範囲内である。

【００２９】使用される栄養素溶液は全ての糖に関して好ましくは１：３〜２０の範囲内及
び特に好ましくは１：５〜１５の範囲内である糖に対するグルタミンの質量比を
含む。使用される栄養素溶液がグルタミン、並びに三つの糖、グルコース、ガラ
クトース及びマンノースを含む場合、前記糖類に対するグルタミンの質量比は、
好ましくは１：（１〜３）：（１〜５）：（２〜８）及び特に好ましくは１：（
１．５〜２．２）：（１．５〜３．６）：（４〜６）である。

【００３０】前記培養は好ましくは繰り返しのバッチ工程として行われ、増殖期の後に培養
液の一部が採収され、そして前記培養液の残査が、続いて作業体積に新鮮培地で
再び満たされる発酵槽において維持される。本発明に従う前記工程はグルコシル
化されたＥＰＯが高収率で採収される事を可能にする。故に採収時の前記濃度は
例えば培養培地のＬ当たりのＥＰＯが少なくとも３０mg及び特に少なくとも４０
mgである。

【００３１】本発明のより更なる観点は真核細胞からのＥＰＯの単離方法であり、ここで前
記真核細胞は適当な培地において培養され、そして前記ＥＰＯは培養上清から単
離され、その培養において特徴づけられる前記方法は３６℃以下、好ましくは３
０と３５．５℃の間及び特に好ましくは３３と３５．０℃の間の温度で行われる
。培養の間の温度を低める事によって所望のグリコシル化を有するＥＰＯの比率
が大いに増大されうる事は驚きを持って見出された。

【００３２】方法（ｃ）は本適用の特徴を満たさない、炭水化物構造の知られたＥＰＯ組成
物からの不所望の成分の分離を含んで成る。例えば、この事は前記ＥＰＯ調製品
のクロマトグラフィー精製によって、例えばトリアジン色素ゲル、好ましくはシ
バルコンブルー色素ゲルでの親和性クロマトグラフィーによって行われうる。不
所望の成分もまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆層ＨＰＬＣを用い
る事によって更に分離されうる。このために適当なリガンドはブチル、ペンチル
、オクチル、オクタデシル及びフェニル残基である。前記逆層ＨＰＬＣ段階は、
６．０〜８．５の範囲内及び特に好ましくは７．０〜８．０の範囲内のpHの値で
好ましくは行われる。適当な溶出液は、例えばアセトニトリル、エタノール又は
イソプロパノール、好ましくはアセトニトリルである。

【００３３】適当な画分が決定され、プールされそして最終的にキャピラリーゾーン電気
泳動解析（ＣＺＥ）を用いて、更に処理されうる。更に高含量のＮ−アセチルラ
クトサミン単位を有するＥＰＯ分子はトマト又はジャガイモ由来のレクチン類を
用いて直接強化されうる（MerKle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987),8179
〜8189）。その様なレクチン類は例えば固定化型において好ましくは使用される
。

【００３４】本発明の更なる主題はＥＰＯ組成物の比活性を増大させるための方法であり、
ここでＥＰＯ分子は；（ａ）４アンテナ構造を高い比率、（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を多数、（ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位数とシアル酸含量との積を高い値、（ｄ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しを高い比率及び／又は（ｅ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しと４アンテナ炭水化物構造との積を高
い値：有する組成物に強化される。

【００３５】この強化は、上述した方法（ａ），（ｂ）及び（ｃ）の１又は複数によって達
成されうる。例１細胞系の培養上清からのＥＰＯの精製前記クロマトグラフィー段階の数及び原理において異なる本質的に２つの方法
が、ヒト細胞又はＣＨＯ細胞由来の細胞培養上清からＥＰＯを精製するために使
用され、培地の組成及びＥＰＯ濃度に依存して使用された：方法１：第１段階：ブルーセファロースカラム第２段階：ブチルセファロースカラム第３段階：ハイドロキシアパタイトカラム第４段階：濃縮方法２：第１段階：ブルーセファロースカラム第２段階：ハイドロキシアパタイトカラム第３段階：濃縮（択一的第３段階：ＲＰ−ＨＰＬＣ）方法１による２％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＨｅＬａ細胞培養
上清の精製例：１．ブルーセファロースカラム：５ml Ｈｉ−Ｔｒａｐブルーカラム(Pharmaciaの既製のブルーセファロースカ
ラム）を少なくとも５カラム体積（CV）の緩衝液Ａ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂；１００mM ＮａＣｌ）で平衡化した。続いて７
０mlのＨｅＬａ細胞上清（約２４５μｇのＥＰＯ及び７０〜１００mgの全タンパ
ク質を含む）を循環方法において０．５ml／分の流速で一晩吸収させた。

【００３６】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｂ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
０；５mM ＣａＣｌ₂；２５０mM ＮａＣｌ）及び少なくとも５CVの緩衝液Ｃ（
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM ＣａＣｌ₂；２５０mM Ｎａ
Ｃｌ）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質
含量を測定することによって監視した。

【００３７】ＥＰＯを緩衝液Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM Ｃａ
Ｃｌ₂；２ＭＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を
１〜２mlの画分に集めた。前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳ
Ｒ２／Ｈカラム（Boehringer Manheim）にかけることにより逆層（ＲＰ）−Ｈ
ＰＬＣによって決定した。択一的に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分
の定性的な同定のために使用した。

【００３８】ＥＰＯを含む溶出画分（８〜１２ml）をプールし、ブチルセファロースカラム
にかけた。ブルーセファロースカラム後の収量は約１７５μｇＥＰＯであった（約７０
％に相当）。たいていブルーセファロース後の収率は５０と７５％の間であった
。

【００３９】２．ブチルセファロースカラム（疎水性相互作用クロマトグラフィー）自分で作った２〜３mlのブチルセファロースカラム（材料：Toyopearl butyl
S650）を少なくとも５CVの緩衝液Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；
０．２mM ＣａＣｌ₂；２ＭＮａＣｌ）を用いて平衡化し、そしてそれに続き
ＥＰＯを含む方法１からのブチルセファロースプール（約１５０μｇＥＰＯ）を
０．５ml／分の流速で吸収させた。

【００４０】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｅ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
０；２ＭＮａＣｌ及び１０％イソプロパノール）を用いて０．５ml／分で洗浄
した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質含量を測定することによって監視し
た。ＥＰＯを緩衝液Ｆ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２ＭＮａＣｌ及
び２０％イソプロパノール）を用いて室温で及び０．５ml／分の流速で溶出した
。溶出溶液を１〜２mlの画分において回収した。

【００４１】前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳ
Ｒ２／ＨカラムにかけることによりＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。択一的
に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分の定性的な同定のために使用した
。ＥＰＯを含む溶出画分（１０〜１５ml）をプールし、ハイドロキシアパタイト
カラムにかけた。

【００４２】ブチルセファロースカラムの収量は約１３０μｇＥＰＯであった（約８５％
に相当）。たいていブチルセファロースの収率はブルーセファロースにかけたプ
ールの６０と８５％の間であった。３．ハイドロキシアパタイトカラム５mlのハイドロキシアパタイトカラム(Bio RADの既製のＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ
ＣＨＴII）を少なくとも５CVの緩衝液Ｆ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０
；２ＭＮａＣｌ；２０％イソプロパノール）を用いて平衡化し、そしてそれに
続きＥＰＯを含む方法２からのブチルセファロースプール（約１２５μｇＥＰ
Ｏ）を０．５ml／分の流速で吸収させた。

【００４３】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｇ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
０；２ＭＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８
０でタンパク質含量を測定することによって監視した。ＥＰＯを緩衝液Ｈ（１０mM リン酸ナトリウム、pH７．０；８０mM ＮａＣｌ
）を用いて０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において
回収した。

【００４４】前記画分、洗浄溶液、及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯ
ＳＲ２／ＨカラムにかけることによってＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。ＥＰＯを含む溶出画分（３〜６ml）をプールした。ハイドロキシアパタイトカ
ラムの収量は約８０μｇＥＰＯであった（約６０％に相当）。たいてい、ハイ
ドロキシアパタイトカラムの収率はブチルセファロースにかけたプールの５０と
６５％の間であった。

【００４５】４．濃縮ハイドロキシアパタイト段階からの、プールされたＥＰＯ画分を１０KDの排除
サイズを有する遠心装置（例えばFiltron のＭｉｃｒｏｓｅｐ）において０．１
〜０．５mg／mlの濃度まで濃縮した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を加え、そして
これを−２０℃でアリコートにおいて保存した。

【００４６】

【表１】

【００４７】単離されたＥＰＯの純度は約９０％以上、通常９５％以上でさえあった。ブチルセファロース段階が削除された方法２は、ＥＰＯ収率を増大させるため
にも使用される。この方法は、１％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ補足の添加が無し又は有り
の細胞培養培地に特に適用することができ、そして単離されたＥＰＯの収率はほ
ぼ同一の純度（９０〜９５％）である。ハイドロキシアパタイトカラムのための
平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）における５mM ＣａＣｌ₂の存在は、この方法におい
て結合の改良、そしてこのようにハイドロキシアパタイト段階におけるＥＰＯの
再現可能な溶出性質の改良を導いた。その結果、方法２は原理において同一な、
方法１の様な方法を使用する以下の緩衝液を用いて行われた：１．ブルーセファロースカラム：平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂；１００mM ＮａＣｌ洗浄緩衝液１（緩衝液Ｂ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂；２５０mM ＮａＣｌ洗浄緩衝液２（緩衝液Ｃ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０５mM ＣａＣｌ₂，２５０mM ＮａＣｌ溶出緩衝液（緩衝液Ｄ）：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０５mM ＣａＣｌ₂；２ＭＮａＣｌ２．ハイドロキシアパタイトカラム平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）：５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂；１ＭＮａＣｌ洗浄緩衝液（緩衝液Ｇ）：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂；８０mM ＮａＣｌ溶出緩衝液（緩衝液Ｈ）：１０mM リン酸ナトリウム、pH７．０；０．５mM ＣａＣｌ₂；８０mM ＮａＣｌ

【００４８】

【表２】

【００４９】方法１における緩衝液Ｃ〜Ｇへの５mM ＣａＣｌ₂の添加はまた、結合の改良
及びハイドロキシアパタイトカラムからの溶出のさらなる定義づけへと導く。択一的又は付加的に以下の段階もＥＰＯを精製するために使用される： − ＲＰ−ＨＰＬＣ、例えばＶｙｄａｃＣ４材料を使用 − ＤＥＡＥセファロースｆｆクロマトグラフィー − ダイアフィルトレーション例２：イソ型１〜８（対比）の保持と同時の、培養上清からのＥＰＯの精製１．出発材料哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを繰り返しのバッチ工程
によって発酵した。１０００Ｌの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記
発酵槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発
酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０
〜５．２に調節し、そして１〜９℃で濾過する。

【００５０】２．ブルーセファロースクロマトグラフィークロマトグラフィーカラム（ＡｍｉｃｏｎＰ４４０×５００、Ａｍｉｃｏｎ
，ＧＢ）を６０〜８０Ｌのブルーセファロースで満たし、そして０．５ＮＮａ
ＯＨを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（CV）の酢酸緩衝液
を用いて平衡化した。

【００５１】 pH５に調節された無細胞培養上清を１０±５℃の温度及び８００〜１４００ml
／分の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて
前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続
けた。次に前記カラムを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク
質のピークを回収し（約３０〜６０Ｌ）、ＨＣｌを用いてpH６．９に調節し、そ
して次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィ
ー段階において濃縮し、そして約４０〜５０％の純度を達成した。

【００５２】平衡化緩衝液：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ，pH５．０±０．２洗浄緩衝液１：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂、０．２５ＭＮａＣｌ，pH５．０±０．２洗浄緩衝液２：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂、 pH６．５±０．３溶出緩衝液：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂、１ＭＮａＣｌ，pH９．０±０．２３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）クロマトグラフィーカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢＰＧ３００／５００）
を３０〜４０Ｌのブチルトーヨーパールで満たし、そして４ＭグアニジンＨＣｌ
及び０．５ＮＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを少なくとも３CVの平衡
化緩衝液を用いて平衡化した。

【００５３】前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を１０％イソプロパノールに調節
し、そして２７±２℃の温度及び８００〜１２００ml／分の流速で吸収させた。
カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記
と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶
出した。全てのタンパク質のピークを回収し（約１０〜１８Ｌ）、すぐに希釈緩
衝液を用いて３倍に希釈し、そして次の工程まで１５℃で保存した。約９０％の
純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

【００５４】平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．７５ＭＮａＣｌ，１０％イソプロパノール、pH６．９±０．２洗浄緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．７５ＭＮａＣｌ，１９％イソプロパノール、pH６．９±０．２溶出緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．７５ＭＮａＣｌ，２７％イソプロパノール、pH６．９±０．２希釈緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，pH６．９±０．２４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィークロマトグラフィーカラム（ＡｍｉｃｏｎＰ４４０×５００又は等価のもの
）を３０〜４０Ｌのハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、０．５ＮＮ
ａＯＨで再生した。次にカラムを少なくとも４CVの平衡化緩衝液で平衡化した。

【００５５】前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約１５℃の温度及び５０
０〜１２００ml／分の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝
液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗
浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピ
ークを回収し（約１０〜１８Ｌ）、そして次の工程まで１５℃で保存した。９５
％以上の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

【００５６】平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．２５ＭＮａＣｌ，９％イソプロパノール、pH６．９±０．２洗浄緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，pH６．８±０．２溶出緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM リン酸カリウム、０．５ＭＣａＣｌ₂，pH６．８±０．２５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）予備的なＨＰＬＣをＭｅｒｃｋＰｒｅｐｂａｒ１００分離装置（又は同等
のもの）を用いて２２±４℃の温度で行った。分離カラム（１００mm×４００mm
、３．２１）をＶｙｄａｃＣ４材料で詰めた。使用の前に、カラムを緩衝液Ａ
から１００％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用い
て平衡化した。

【００５７】前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液をトリフルオロ酢酸を用い
て約pH２．５に酸性化し、そして無菌濾過した。次にそれをカラムに２２±４℃
の温度及び２５０〜３１０ml／分の流速でかけた。カラムを緩衝液Ａから緩衝液
Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画
分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬＣ希釈緩衝液によって
すぐに中和した。

【００５８】分析的なＨＰＬＣにおいて少なくとも９９％の純度を有する画分をプールした
（プール体積約４〜６Ｌ）。微量不純物をこのクロマトグラフィーにおいて分離
し、そして９９％以上の純度を達成した。緩衝液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／水緩衝液Ｂ：８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸／水ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．５±０．
２６．ＤＥＡＥ−セファロースｆｆクロマトグラフィークロマトグラフィーカラム（ＡｍｉｃｏｎＰ９０×２５０又は等価のもの）
を、かけるＥＰＯのｇ当たり１００〜２００mlのゲルで満たし、そして０．５Ｎ
ＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを最初に１００mM リン酸ナトリウム
／カリウム緩衝液、pH７．５、そして少なくとも１２CVの平衡化緩衝液を用いて
平衡化した。

【００５９】前記ＨＰＬＣカラムからの溶出溶液を５±４℃の温度及び約１５０ml／分の流
速でカラムに吸収させた。カラムを少なくとも５CVの平衡化緩衝液及びそれに続
いて約１０CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次
にそれを約１０CVの平衡化緩衝液を用いて再び洗浄し、そしてそれに続いて約７
CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し（約２〜５
Ｌ）、無菌濾過し、そして分配した。

【００６０】このクロマトグラフィーにおいて前記ＨＰＬＣ段階からの溶媒を分離し、そし
て微量不純物を除去した。純度は９９％以上である。平衡化緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．５±０．２洗浄緩衝液：３０mM 酢酸ナトリウム、pH４．５±０．１溶出緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０mM ＮａＣｌ，pH７
．５±０．２例３：イソ型１〜４（発明）の保持と同時の培養上清からのＥＰＯの精製１．出発材料哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを繰り返しのバッチ工程
によって発酵した。１０Ｌの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵
槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発酵液
から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０〜５
．２に調節し、そして１〜９℃で濾過する。

【００６１】２．ブルーセファロースクロマトグラフィー適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２５０mlのブルーセファロースで
満たし、そして０．５ＮＮａＯＨを用いて再生させた。次に前記カラムを約３
カラム体積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。 pH５に調節された無細胞培養上清を１０±５℃の温度及び１〜２CV／時の流速
でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて前記と同一
の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に
前記カラムを約３〜６CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。タンパク質のピークを
画分に回収した。ＣＥ解析の後、適当な画分をプールし、ＨＣｌを用いてpH６．
９に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのク
ロマトグラフィー段階において濃縮し、不純物及び塩基性のイソ型を分離した。

【００６２】平衡化緩衝液：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ，pH５．０±０．２洗浄緩衝液１：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂、０．２５ＭＮａＣｌ，pH５．０±０．２洗浄緩衝液２：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂、 pH６．５±０．３溶出緩衝液：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂、０．２５ＭＮａＣｌ，pH８．０±０．２３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）適当なクロマトグラフィーカラムを２００〜３００mlのブチルトーヨーパール
で満たし、そして４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．５ＮＮａＯＨを用いて再生し
た。次にカラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。

【００６３】前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を１０％イソプロパノールに調節
し、そして２７±２℃の温度及び１〜２CV／時の流速で吸収させた。カラムを約
１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温
度及び流速で再洗浄した。次にそれを約５〜１０CVの溶出緩衝液を用いて溶出し
た。画分をタンパク質ピークから回収し、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈
した。ＣＥ解析の後、適当な画分をプールし、次の工程まで１５℃で保存した。
このクロマトグラフィーにおいて、更に基本的なイソ型を除去し、そして約８０
％以上の純度を達成した。

【００６４】平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．２ＭＮａＣｌ，１０％イソプロパノール、pH６．９±０．２洗浄緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．２ＭＮａＣｌ，１７％イソプロパノール、pH６．９±０．２溶出緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．２ＭＮａＣｌ，２３％イソプロパノール、pH６．９±０．２希釈緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，pH６．９±０．２４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２００mlのハイドロキシアパタイ
トウルトロゲルで詰め、０．５ＮＮａＯＨで再生した。次にカラムを少なくと
も４CVの平衡化緩衝液で平衡化した。

【００６５】前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約１５℃の温度及び１〜
２CV／時の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれ
に続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次
にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収
し、そして次の工程まで１５℃で保存した。９５％以上の純度をこのクロマトグ
ラフィーにおいて達成した。

【００６６】平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，０．０６ＭＮａＣｌ，７．５％イソプロパノール、pH６．９±０．２洗浄緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂，pH６．８±０．２溶出緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM リン酸カリウム、０．５mM ＣａＣｌ₂，pH６．８±０．２５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）半調製用ＨＰＬＣをＶｙｄａｃＣ４カラム（２０mm×２５０mm、約８０ml）
を用いて２２±４℃の温度で行った。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから１００
％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化し
た。

【００６７】前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液を２２±４℃の温度及び８
〜１５ml／分の流速でカラムにかけた。カラムを次のＨＰＬＣ実験計画に従って
緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出し
た。溶出ピークを画分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬＣ
希釈緩衝液においてすぐに中和した。

【００６８】

【表３】

【００６９】分析用ＨＰＬＣにおいて少なくとも９９％の純度を有し、そしてＣＥ解析に従
う適当な画分をプールした。微量不純物及び塩基性イソ型の残査をこのクロマト
グラフィーにおいて除去し、そして９９％以上の純度を達成した。緩衝液Ａ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．０±０．２緩衝液Ｂ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０％アセトニトリル、
pH７．０ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、１００mM Ｎａ
Ｃｌ，pH７．５±０．２６．ダイアフィルトレーション適当な大きさのダイアフィルトレーション装置を１０KDのカセットで合わせ、
１ＮＮａＯＨで再生した。次にこの装置をバルク緩衝液を用いてアルカリが無
くなるまですすいだ。

【００７０】前記ＨＰＬＣカラムの溶出溶液を５±４℃の温度で濃縮し、そして１０体積の
バルク緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。最終的な濃度は１〜３mg
／mlの間であるべきである。この段階は前記ＨＰＬＣ段階から溶媒残査を除去すること、要求されたバルク
緩衝液条件及びバルク活性物質の製品濃度を調節することを提供する。

【００７１】バルク緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、１００mM ＮａＣｌ，
pH７．５±０．２例４：ｉｎｖｉｖｏでのＥＰＯの比活性の決定（正血球状態マウスでのバイオ
アッセイ）赤血球前駆体細胞の増殖及び分化におけるＥＰＯの投与量依存的活性は、ＥＰ
Ｏ投与の後、マウスにおける血液中の網状赤血球の増大によってｉｎｖｉｖｏ
で決定された。

【００７２】このため、解析されうるＥＰＯ試料及びＥＰＯ標準（ＥＰＯＷＨＯ標準で標
準化された）の様々な投与量を８匹のマウスに非経口に各々投与した。前記マウ
スを一定の定めた条件下で引き続き保った。血液を、ＥＰＯ投与の後、４日目の
マウスから回収し、そして網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。３０，
０００赤血球当たりの網状赤血球数を赤色蛍光ヒストグラムの解析によるフロー
サイトメーターにおける微蛍光定量法によって決定した。

【００７３】生物学的活性を前記試料及びLinderによって記述された、平行直線を用いる濃
度のペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）決定法（Linder“Planen und Auswerten
von Versuchen”, 3rd. edition, 1969, Birkenhaeuser Verlag, Basel)に従う
、異なる投与量における標準の網状赤血球数の値から算出された。ＥＰＯ調製品ＣＨＯ１，ＣＨＯ２及びＣＨＯ３を、それぞれ２４８，０００（
ＣＨＯ１）、２２５，０００（ＣＨＯ２）及び１８６，０００IU／mg（ＣＨＯ３
）の生物学的活性を有する、無血清培地において培養されたＣＨＯ細胞の培養上
清からＥＰＯを精製することによって得た。ヒト細胞の培養上清から精製された
ＥＰＯの４つの調製品において、２２０，０００（ＨｅＬａ１）、１９８，００
０（ＨｅＬａ２）、２０４，０００（ＨｅＬａ３）、１７６，０００（ＨｅＬａ
４）及び１００，０００IU／mg（ＨｅＬａ５）の比活性を有する製品が得られた
。糖構造のためのパラメーターを有する生物学的活性の値の関係を例１１におい
て与える。例５：シアル酸残基含量の決定アルスロバクター・ウレアファシエンス（A. ureaf., Boehringer Mannheim）
由来のノイラミニダーゼを用いたシアル酸の酵素的開裂の後、Dionex system の
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルス電流計検出を用いる高pH陰イオン交換クロマトグラ
フィー）によってシアル酸含量を決定した。

【００７４】ＣＨＯ及びヒト細胞系（例えばＨｅＬａＳ３）の様々な調製品由来のＥＰＯ
を２２μｇそれぞれ含む調製品を、５mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２中
で０．２mg／mlのＥＰＯ濃度に調節した。それぞれの調製品の半分を、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣによって前記ＥＰＯの量を正確に決定するために使用した。A. ureaf. 由
来の５mMノイラミニダーゼを前記調製品の残りの半分のものに加え、３７℃で一
晩（約１８時間）インキュベートした。次に消化混合物を２等分し、Ｈ₂Ｏを用
いて５００μｌに２０倍希釈し、その５０μｌ（約２７pmol ＥＰＯに相当）を
前記Dionex system にかけた。次のクロマトグラフィーパラメーターを、このた
めに使用した。

【００７５】カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００流速：１．０ml／分検出感度：３００nA 勾配：ｔ（分）％緩衝液Ｂ０１７７１７９１００１２１００１３０２００緩衝液Ａ：０．１ＭＮａＯＨ緩衝液Ｂ：０．１ＭＮａＯＨ；０．５Ｍ酢酸ナトリウム適用した試料におけるシアル酸の量を、同様に解析されたシアル酸標準の値（
Boehringer Mannheim)から得られた検量線の補助を用いて決定した。シアル酸含
量（モルシアル酸／モルＥＰＯ）をシアル酸決定の結果（Dionex system)及び
ＲＰ−ＨＰＬＣによって使用されたＥＰＯの量の決定から算出した。

【００７６】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯはモルＥＰＯ当たり１２．９モル（ＣＨＯ１）、１１
．８（ＣＨＯ２）及び１１．７モル（ＣＨＯ３）シアル酸の平均含量を有してい
た。ヒト細胞に由来するＥＰＯ調製品はモルＥＰＯ当たり１３．１モル（ＨｅＬ
ａ１）、１３．２モル（ＨｅＬａ２）、１３．３モル（ＨｅＬａ３）、１１．６
モル（ＨｅＬａ４）及び１０．８モル（ＨｅＬａ５）のシアル酸量を有していた
（例１１も参照）。例６：２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ炭水化物構造の比率の決定Ｎ結合炭水化物構造をDionex system のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィ
ー的に解析した。ＣＨＯ及びヒト細胞系（ＨｅＬａＳ３）由来のＥＰＯ調製品
のアシアロオリゴ糖類をＮ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Mannheim)及びA. u
reaf由来のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannheim)を用いた酵素的開裂によっ
て単離した。

【００７７】混合物当たり１０又は３０μｇのＥＰＯを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ超遠心装置（Ａ
ｍｉｃｏｎ、排所サイズ１０KD）によって脱塩し、１０mM リン酸ナトリウム緩
衝液、pH７．２を用い０．２又は０．３mg／mlの濃度に調節した。次に１ＵのＮ
−グリコシダーゼＦ及び１０mU ノイラミニダーゼを各混合物に加え、３７℃で
一晩（約１８時間）インキュベートした。開裂したオリゴ糖類からＥＰＯポリペ
プチド部分を単離するために、混合物をインキュベーションの後、Ｕｌｔｒａｆ
ｒｅｅ遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、排所サイズ１０KD）を通して遠心し、前
記Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ装置を２０mlのＨ₂Ｏで再び２回洗浄した。濾液中に含ま
れたオリゴ糖類をＨ₂Ｏで１５０mlに合わせ、その１００μｌをDionex system
で解析した。このために、以下のクロマトグラフィーのパラメーターを使用した
。

【００７８】カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００流速：１．０ml／分検出感度：３００nA 勾配：ｔ（分）％緩衝液Ｂ００２０６０１０６２１００６７１００ｔ（分）％緩衝液Ｂ６９０８００緩衝液Ａ：０．１ＭＮａＯＨ緩衝液Ｂ：０．１ＭＮａＯＨ；０．５Ｍ酢酸ナトリウムピークを標準的なオリゴ糖類による複合型のＮ糖のクロマトグラムにおいて同
定し、エンド−β−ガラクトシダーゼ又はフコシダーゼの酵素を用いてＥＰＯの
オリゴ糖類の酵素的消化によって変化させ、そしてDionex system での次の解析
にかけた。２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のパーセンテージを全ピ
ーク領域（２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のピーク領域の総計）に
関するＮ糖構造に一致して表されるピークの領域によって算出した。

【００７９】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯは４．２％２アンテナ炭水化物構造、２２．３％
３アンテナ炭水化物構造及び７３．５％の４アンテナ炭水化物構造（ＣＨＯ３）
の含量、ＣＨＯ１調製品において８６．７％の４アンテナ炭水化物構造並びにＣ
ＨＯ２において７８．６％の含量を有していた。ヒト細胞系由来のＥＰＯの調製
品における２アンテナ／３アンテナ／４アンテナ構造の含量は、ＨｅＬａ１で５
．８／８．８／８５．４％、ＨｅＬａ２で５．１／１２．７／８２．２％、Ｈｅ
Ｌａ３で４．１／１７．７／７８．２％、ＨｅＬａ４で１０．１／１９．２／７
０．６％、ＨｅＬａ５で１２．６／２５．４／６２％であった（例１１も参照）
。例７：Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均含量及び付加的なＮ−アセチルラク
トサミン単位（繰り返し）の平均含量の決定ＥＰＯのＮ結合炭水化物構造中のＮ−アセチルラクトサミン単位（すなわち核
中の炭水化物構造＋繰り返し）の総数を、例６の実験のクロマトグラムのピーク
領域から算出した。

【００８０】炭水化物鎖当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の平均含量の数（ｎ）を以
下の様に算出した：ｎ＝Σ％（２アンテナ）×２＋％（３アンテナ）×３＋％（４アンテナ）×４＋％（３アンテナ＋１ｒ）×４＋％（４アンテナ＋１ｒ）×５＋％（３アンテナ＋２ｒ）×５＋％（４アンテナ＋２ｒ）×６（ここで％（２アンテナ）＝Ｎ結合炭水化物の総計（１００％）に関する２アン
テナ構造のパーセンテージ；％（３アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの３アンテナ
構造のパーセンテージ％（４アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの４アンテナ
構造のパーセンテージ；％（３アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有
する３アンテナ構造のパーセンテージ；％（４アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有
する４アンテナ構造のパーセンテージ；％（３アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有
する３アンテナ構造のパーセンテージ；％（４アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有
する４アンテナ構造のパーセンテージ；である）。

【００８１】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合、炭水化物鎖当たり４．３（ＣＨＯ１）、４．
４（ＣＨＯ２）及び４．２（ＣＨＯ３）のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均
数が明らかになった。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、４．０（ＨｅＬａ
１）、４．０（ＨｅＬａ２）、３．９（ＨｅＬａ３）、３．７５（ＨｅＬａ４）
及び３．６（ＨｅＬａ５）のＮ−アセチルラクトサミン単位数が明らかになった
（例１１も参照）。

【００８２】ＥＰＯが３Ｎ結合糖構造を含む事実のため、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の
総数は更に３倍高い。ＥＰＯのグルコシル化総数に関して、ＣＨＯ細胞由来のＥ
ＰＯにおけるＮ−アセチルラクトサミン単位数は、故に１２．９（ＣＨＯ１）、
１３．２（ＣＨＯ２）及び１２．６（ＣＨＯ３）である。ヒト細胞のＥＰＯ調製
品において、一致する値は１２．０（ＨｅＬａ１）、１１．９（ＨｅＬａ２）、
１１．７（ＨｅＬａ３）、１１．２５（ＨｅＬａ４）及び１０．８（ＨｅＬａ５
）であった。

【００８３】それぞれのシアル酸含量を掛けた炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサ
ミン単位数の積は、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯにおいて５５．５（ＣＨＯ１）、５
２（ＣＨＯ２）及び４９．３（ＣＨＯ３）の値を生じた。ヒト細胞由来のＥＰＯ
調製品の場合において、一致する値は５２．４（ＨｅＬａ１）、５２．５（Ｈｅ
Ｌａ２）、５１．３（ＨｅＬａ３）、４３．５（ＨｅＬａ４）及び３８．９（Ｈ
ｅＬａ５）であった。

【００８４】ＥＰＯのグリコシル化総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して、それぞれのシ
アル酸含量を掛けたＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、ＣＨＯ細胞由来の
ＥＰＯにおいてそれぞれ１６６．５（ＣＨＯ１）、１５６（ＣＨＯ２）及び１４
７．９（ＣＨＯ３）である。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、一致する値
は１５７．２（ＨｅＬａ１）、１５７．５（ＨｅＬａ２）、１５３．９（ＨｅＬ
ａ３）、１３０．５（ＨｅＬａ４）及び１１６．７（ＨｅＬａ５）であった（例
１１も参照）。

【００８５】更に重要なパラメーターは、繰り返しと称される、炭水化物構造の核に結合し
うるＮ−アセチルラクトサミン単位の量である（Ｆｉｇ．７参照）。繰り返しの
含量は、全てのＮ結合炭水化物構造の総計（２アンテナ＋３アンテナ＋４アンテ
ナ＝１００％）に関する炭水化物構造を含む繰り返しのパーセンテージとして記
載されている。

【００８６】この繰り返しの比率は、ＣＨＯ細胞由来及びヒト細胞由来のＥＰＯ調製品にお
いて異なりうる。この様に、３９．６％（ＣＨＯ１）、５１％（ＣＨＯ２）及び
３６．８％（ＣＨＯ３）の繰り返し比率がＣＨＯ細胞由来の調製品のものとして
決定された。１８％（ＨｅＬａ１）、１６．５％（ＨｅＬａ２）、１４．０％（
ＨｅＬａ３）、１２．２％（ＨｅＬａ４）及び９．８％（ＨｅＬａ５）がヒト細
胞由来の調製品のものとして決定された（例１１参照）。例８：要求に従う調節及び供給によるＥＰＯの生物学的活性への影響培養を３６．５℃の温度で要求に従う供給を用いる繰り返しのバッチ工程（繰
り返しのフェドバッチ）として行った。このために、無血清の、タンパク質に乏
しい培養培地を滅菌発酵槽（総作業容量：１０ｌ）に居え、そして接種培養物を
用いて１回接種した。接種後の細胞密度は３±１×１０⁵生細胞／mlであった。

【００８７】１４４±２４時間の増殖期の後、培養液の一部を採収した。培養液の残りは発
酵槽内に残され、そして次の増殖期のための接種の代わりとなった；この目的の
ため発酵槽は再び作業容積まで新鮮培地で満たされた。ＥＰＯを含む培養上清を発酵培養物を遠心する事によって得た。栄養素溶液を、増殖期の間、連続的に培養物に加えた。この目的のために、栄
養素溶液を含む保存容器は発酵槽と組合わされた。栄養素溶液はアミノ酸類、ビ
タミン類、インスリン、微量元素、塩類、グルタミン及び炭水化物類を含んだ。
２つの発酵を以下の様に行った：発酵Ａにおいて栄養素溶液は糖としてＤ−（＋）−グルコースを含み、そして
発酵Ｂにおいて糖類はＤ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−ガラクトース及び
Ｄ−（＋）−マンノースであった。糖類に対するグルタミンの質量比は発酵Ｂに
おいて１：２、２：３、６：６であった。栄養素溶液における個々の糖類の濃度
は７．２〜１８ｇ／ｌの間であった。

【００８８】培養物におけるグルタミンの濃度は発酵Ｂにおいて周期的に解析され、そして
その消費が算出された。栄養素溶液の瞬間体積流は細胞の栄養素要求に釣り合っ
ていた。発酵Ａにおいてグルタミン濃度は調節変化が可能なものとして使用され
なかった。発酵Ｂにおける栄養素溶液は、２：３：５の質量比のＤ−（＋）−グ
ルコース、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）−マンノースの糖類の混合
物を含んだ。発酵槽における全糖類の濃度は、一致した供給によって培養の間、
２〜６ｇ／ｌの範囲内に保たれた。

【００８９】細胞密度は、増殖の間、採収時までに２０×１０⁵細胞／ml以上、典型的に３
０±１０×１０⁵細胞／mlに変化した。採収時、ＥＰＯの濃度は典型的に４０±
１０mg／ｌであった。ヒトエリスロポエチンの濃度は、採収した培養液において、例えばＥＬＩＳＡ
によって決定された。生じたこのタンパク質のイソ型のパーセンテージ分布は、
例えばキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いた分離によって決定された
。

【００９０】表４は、グルコースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ａとグルコース、マン
ノース及びガラクトースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ｂとの間のＥＰＯイ
ソ型の分布の比較を示す。発酵ＢにおけるＥＰＯイソ型の含量は、発酵Ａのイソ
型に対応するパーセンテージとして算出された。後者は各々１００％に標準化さ
れた。本データは、所望の高度にグリコシル化されたＥＰＯイソ型２〜４が、発
酵Ａと比較して、発酵の間、より高い比率で本質的に存在している事を示す。

【００９１】

【表４】

【００９２】供給を用いて得られたイソ型のパターンは、栄養素溶液の調節され及び要求に
従う供給を用いた発酵から４つの連続的な採収において再現可能であった。例９：培養温度の変化によるＥＰＯの生物学的活性への影響本工程は、発酵槽温度が３６．５℃の代わりに３５．０℃である事を除く、調
節され及び要求に応じる供給を用いるフェド−スプリットバッチ（ｆｅｄ−ｓｐ
ｌｉｔｂａｔｃｈ）工程における例８において記述したものと同じであり（発酵
Ｂ）、本発酵は１０００Ｌ規模で行われた。

【００９３】表５は、各々が栄養素溶液の調節された供給を用いる、３６．５℃での発酵Ｃ
と３５．０℃での発酵ＤのＥＰＯのイソ型分布の比較を示す。発酵ＤにおけるＥ
ＰＯのイソ型の含量は、発酵Ｃの対応しているイソ型のパーセンテージとして算
出された。後者は、それぞれが１００％に標準化された。本データは酸性ＥＰＯ
イソ型の２〜４が、温度の低下によってかなり増大しうる事を示す。

【００９４】

【表５】

【００９５】例１０：培地中の炭水化物組成の変化によるＥＰＯの生物学的活性への影響以下に表す方法は、供給培地における炭水化物供給の変化によりヒトエリスロ
ポエチンの質を変える事が可能である事を示す。上述した本方法の２つの変異体は（以下発酵Ｅ及び発酵Ｆと称する）、使用し
た培地の組成が異なる事を示している。

【００９６】両調製品において、培養培地の処方は改変ｅＲＤＦ培地を基にしている。無血
清を使用し、しかし幾分の組換えインスリン（唯一のタンパク質添加物）及び更
なる追加物（例えばセレナイト、プトレッシン、ヒドロコルチゾン、硫化鉄）が
無血清又は無タンパク質培地において通常使用される。供給栄養素溶液はまた、改変ｅＲＤＦ培地が基となっているが、塩類ＫＣｌ，
Ｎａ₂ＨＰＯ₄及びＮａＣｌは含まない。

【００９７】発酵ＥとＦとの間の主な違いは、供給培地への様々な単糖類の添加である。発酵Ｅ：通常の糖、Ｄ−（＋）−グルコースが発酵Ｅのために使用される。最初の濃度
は３ｇ／ｌであった。グルコース含有栄養素溶液を適当に供給する事によって、
培養液におけるグルコース濃度を、全体の培養の間、３±０．５ｇ／ｌに保った
。

【００９８】培養周期は典型的に１００±２０時間であった。ＥＰＯの濃度は採収時におい
て典型的に４０±１０mg／ｌであった。発酵Ｆ：Ｄ−（＋）−グルコースに加えて、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）
−マンノースの糖類が、発酵Ｆのために、供給培地に約１：２：３の質量比で加
えられた。培養の間、全糖類の濃度を、適当な供給によって０．２５ｇ／ｌと３
．５ｇ／ｌの間の範囲内に保った。

【００９９】この増殖のための培養周期は典型的に１００±２０時間であった。採収時のＥ
ＰＯの濃度は典型的に４０±１０mg／ｌであった。エリスロポエチンを前記培養上清から精製した。精製方法は、本糖タンパク質
の関連したイソ型の分布が影響されないよう設計された（例２を参照）。精製されたエリスロポエチンのイソ型分布を上述した様に決定した。

【０１００】ヒトエリスロポエチンのイソ型の炭水化物構造及び採収した培養上清中のそれ
らの分布は発酵Ｅ及びＦにおいて異なった。発酵Ｅは、発酵Ｆと比較して、イソ
型２，３及び４をかなりの高い比率で有していた。これらの違いは単糖類マンノ
ース及びガラクトースの供給によって生じた（例２参照）。正常マウス試験（例４）によって決定された生物学的活性（例４）は前記ＥＰ
Ｏのイソ型の分布及び炭水化物構造に関連する（Ｆｉｇ．３）。前記培養上清Ｅ
及びＦから得たＥＰＯ調製品の炭水化物構造を、ＣＺＥ及びＨＰＡＥＣ解析で試
験した。

【０１０１】アンテナ度（２つの構造、３つの構造及び４つの構造を含む）、Ｎ−アセチル
ラクトサミン単位の含量（ＬＥ）、シアル酸含量（ＳＡ）及び２つのＥＰＯ調製
品のＬＥとＳＡの積を表６に示す。

【０１０２】

【表６】

【０１０３】例１１：特異的活性と炭水化物構造との関係この例において、炭水化物構造への個々のＥＰＯのイソ型の生物学的活性の依
存に対する研究を要約する。このために、様々なＥＰＯ供給源由来のイソ型（Ｃ
ＨＯ細胞及びヒト細胞由来のＥＰＯの異なる一群）を単離及び比較した。１１．１等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びウェスタンブロットによる個々のイ
ソ型の単離Ａ）ＩＥＦゲル電気泳動及びニトロセルロースへのエレクトロブロッティングのための方法純粋な状態において個々のイソ型を単離するために、複数のイソ型の混合物か
ら成るＥＰＯ溶液をｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心装置において脱塩し、そして濃縮（
５〜１０mg／ml）した。この溶液の３５０〜１０００μｇをＳｅｒｖａのＩＥＦ
ポリアクリルアミド既製ゲル（ＳｅｒｖａｌｙｔＰｒｅｃｏｔｅｓ、pH３〜５
、３００μｍ、１２５×１２５mm）にかけた（レーン当たり７０〜１００μｇの
ＥＰＯを含む５〜１０レーン内）。本ＩＥＦを５℃で３．５時間２５００Ｖで行
い；次にそのゲルをニトロセルロースにブロットした（２００mAでの３時間のメ
タノールを含むがＳＤＳは含まないＴｒｉｓ／グリシン緩衝液中でのウェットブ
ロット）。ブロッティング工程の後、ゲルを除き、ニトロセルロース膜をポンソ
ー染色液で染色した。染色されたイソ型を切り取り、そして再びＨ₂Ｏ又はＴＢ
Ｓ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ、pH７．４；１５０mM ＮａＣｌ）で完全に脱色
した。

【０１０４】Ｂ）膜からのイソ型の抽出各々のイソ型を含む脱色されたニトロセルロースの小片を２mlのＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ容器に据え（前記ＩＥＦゲルの３〜４レーンに一致）、１．５mlのアセト
ンを加え、そしてそのニトロセルロースをボルテックスによって溶解した。それ
はＥＰＯを最適に沈澱させるために２０℃で一晩インキュベートされた。次にＥ
ＰＯを含むその沈澱を１０分間のベンチ遠心、１４，０００rpm で単離した。沈
澱物を１mlのアセトンを用いて２〜３回洗浄し、そして次に窒素気流下、室温又
は３７℃で乾燥させた。ＥＰＯ沈澱物を次に、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
２０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２に溶解し、そして次の解析まで−２
０℃で保存した。

【０１０５】Ｃ）沈澱ＥＰＯ溶液からのイソ型の単離個々のイソ型を、たった３〜４個のイソ型の代わりとして７〜８個を含む初期
のＥＰＯ溶液の性質を用いてＡ）及びＢ）に記述した様に単離した。出発物質は
ＤＥクロマトグラフィー（陰イオン交換体）によって単離されたＥＰＯ画分であ
った。これらの画分は３〜４個のイソ型のみ（例えばイソ型６〜８又はイソ型１
〜４）を含んだ。

【０１０６】イソ型群を単離するために、適当なクロマトグラフィーカラムを使用するＥＰ
Ｏ１０mg当たり１〜２mlのＤＥＡＥ−セファロースｆｆで満たし、０．５Ｎ
ＮａＯＨで再生した。次にカラムを最初に２CVの中和緩衝液及び次に少なくとも
５CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。８個のイソ型を含んで成る精製されたＥＰＯ調製品を５±４℃の温度及び最大
１５CV／時の流速で吸収させた。そのカラムを次に２〜３CVの平衡化緩衝液を用
いて洗浄し、そしてそれに続きpH値が５．０まで洗浄緩衝液（約５CV）ですすい
だ。

【０１０７】様々なイソ型群を、溶出緩衝液において１０mMの段階から開始して２０mM Ｎ
ａＣｌまで、ＮａＣｌ濃度を増加することによって溶出した。塩基性イソ型はイ
オン交換体に弱く結合し、そして低イオン強度に相当して溶出され、酸性イソ型
は最大７０mMのＮａＣｌのより高いＮａＣｌ濃度で溶出される。あるＮａＣｌ濃
度において溶出されるイソ型の量は出発物質及び溶出体積に強く依存する。規定
通り、溶出をＯＤ２８０がこのＮａＣｌ濃度において最大値の約５０％まで減少
するまで個々の段階において続けた。この事は１５〜４０CVの間に相当する。Ｎ
ａＣｌ濃度範囲内での溶出されたイソ型群の更なる分画は、前記イソ型の更なる
分離を生じる。カラムの進行速度は最大１５CV／時であった。

【０１０８】中和緩衝液：１００mM リン酸ナトリウム／カリウム、 pH７．５±０．２平衡化緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、 pH７．５±０．２洗浄緩衝液：３０mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH５．０±０．２溶出緩衝液：１０mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH５．０±０．２、２０mM ＮａＣｌ、又は１０mM〜７０mM ＮａＣｌまでの濃度増加個々の純粋イソ型を、Ａ）及びＢ）に記述した精製に従って得られたイソ型群
から単離した。

【０１０９】Ａ〜Ｃから得られた純粋なイソ型（ＩＦ）を酸性から塩基性までのそれらの等
電点（ｐＩ）に従い番号をつけた。イソ型２（ＩＦ２）は、最も低いｐＩを有す
る、最も強く酸性の単離されたイソ型である。イソ型８は最も高いｐＩを有する
、最も強く塩基性である。イソ型２は、出発混合物から十分な量において単離さ
れうる、最も低いｐＩを有するイソ型であった。出発混合物において、イソ型１
の１〜２％のみが存在するため、完全な解析のために十分な量を得ることが出来
ない。

【０１１０】純粋なイソ型を特徴づけるために以下の解析： − ＰＰ−ＨＰＬＣによる量及び収率の決定 − キャピラリー電気泳動及び等電点電気泳動による純度及び同一性の決定；
を行った。個々のイソ型の収率は、一般に出発混合物において使用されるイソ型の２０％
〜３０％の間であった。

【０１１１】イソ型の純度は通常９０％以上、多くは９４％以上でさえあった。１１．２結果精製されたイソ型（ＩＦ）のために以下のデータ： − Ｎ結合炭水化物構造の相対分布（グリコシル化総数に関する２アンテナ、
３アンテナ及び４アンテナ構造の比率）及び繰り返しの含量 − 正常マウス試験における生物学的活性 − シアル酸含量；を得た。

【０１１２】これらの決定を前述した方法によって本質的に行った。それぞれ個々のイソ型調製品のための単離されたイソ型のシアル酸含量は、単
独に決定されなかったが、ＣＨＯ細胞由来ＥＰＯのイソ型２〜８又はヒト細胞由
来ＥＰＯのイソ型２〜６のそれぞれの例として１〜３個の調製品において行われ
た。

【０１１３】各イソ型の、おおよその、全ての番号のシアル酸の値をＮ−アセチルラクトサ
ミン単位の含量（ＬＥ値）とシアル酸含量（ＳＡ）の積を算出するために使用し
た。これらおおよそのＳＡ値は、ＣＨＯ細胞及びヒト細胞由来のＥＰＯにおいて以
下の様に：１４（ＩＦ２）、１３（ＩＦ３）、１２（ＩＦ４）、１１（ＩＦ５）
、１０（ＩＦ６）、９（ＩＦ７）及び８（ＩＦ８）；であった。

【０１１４】表７はＣＨＯ細胞（ＣＨＯ１，ＣＨＯ２及びＣＨＯ３）並びにヒト細胞（Ｈｅ
Ｌａ１〜５）由来の様々なＥＰＯの特異的活性と炭水化物構造の間の関係のデー
タを含む。この表は生物学的活性とＥＰＯ分子におけるＮ−アセチルラクトサミ
ン単位の平均総数（ＬＥ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×ＳＡの積と
の間の関係を示す。

【０１１５】表８はＣＨＯ細胞由来の予備分画されていないＥＰＯ群の単離されたイソ型の
、生物学的活性とＥＰＯ分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数
（ＬＥ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×ＳＡの積との間の関係のデー
タを含む。表９はＣＨＯ細胞由来の予備分画されたＥＰＯ群の様々な画分から単離された
イソ型（ＩＦ２又はＩＦ５）の様々な調製品（Ａ又はＢ）の比較を含み、すなわ
ちイソ型２及び５の２つの調製品（Ａ及びＢ）がそれぞれの場合において解析さ
れた。予備分画を例１１．１Ｃに記述されたＤＥ陰イオン交換体によって行った
。イソ型ＩＦ２及びＩＦ５の２つの調製品Ａ及びＢを、ＤＥカラムの異なる画分
から単離した（画分５及び６からＩＦ２、画分２及び３からＩＦ５）。ＩＦ２／
Ａ又はＩＦ５／Ａがそれぞれ単離された画分５又は２は、ＩＦ２／Ｂ又はＩＦ５
／Ｂがそれぞれ単離された画分６又は３より、ＤＥセファロースカラムから容易
に溶出された（より低い塩濃度において）。しかしながら、イソ型２又は５の調
製品Ａ及びＢはそれぞれ、次の等電点電気泳動において又はキャピラリー電気泳
動においてそれらの特性に違いはなく、すなわちＩＦ２又はＩＦ５の両調製品は
同一のシアル酸含量を有している。しかしながら、調製品Ａからのイソ型が、そ
れらのより高いＬＥ値及びより高い繰り返し構造の含量のため、調製品Ｂの相当
するイソ型よりも有意に高い生物学的活性を有する事が驚くことに明らかとなっ
た。同一のシアル酸含量においてＥＰＯ分子内に含まれるＮ−アセチルラクトサ
ミン単位の総数に対するイソ型の生物学的活性の表９に記載の依存性はイソ型２
及び５だけでなく他のイソ型においても観察されなかった。

【０１１６】表１０は様々なＥＰＯ供給源（ＣＨＯ細胞又はヒトＨｅＬａＳ３細胞）由来
の相当するイソ型を比較する。また、この場合において相関関係が生物学的活性
とＬＥ×ＳＡの値との間で明らかになった。故に、全ての表において、相関関係がＮ−アセチルラクトサミン単位数（ＬＥ
）とシアル酸含量（ＳＡ）の積と生物学的活性との間で見られうる。ＬＥ×ＳＡ
の積の高い値は高い生物学的活性と常に関連する。

【０１１７】

【表７】

【０１１８】

【表８】

【０１１９】

【表９】

【０１２０】

【表１０】

【０１２１】付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）を有するＮ結合炭水化物
構造の比率に対する生物学的活性の依存を、例として個々のイソ型を用いてＦｉ
ｇ．４に示す。イソ型を、繰り返し含有炭水化物構造の異なる比率を含むＥＰＯ
調製品から単離した（繰り返し含有構造を約５０％有するＥＰＯ１、約４０％有
するＥＰＯ２及び約１５％を有するＥＰＯ３）。対応するイソ型（同一のシアル
酸含量及びほぼ同一のアンテナ度）の生物学的活性は、繰り返し含有炭水化物構
造がそのイソ型において減少する様に減少する。この特性は、イソ型２から少な
くともイソ型７においてまで見られうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）及びシアル酸を有
する４アンテナ構造の図を示す。

【図２】図２は培養培地に加えられた炭水化物類に対する個々のＥＰＯイソ型の相対的
な比率の依存性を示す。

【図３】図３は培養培地に加えられた炭水化物類に対するＥＰＯ調製品の生物学的活性
の依存性を示す。

【図４】図４はＮ−アセチルラクトサミン繰り返し単位に対するＥＰＯのイソ型の生物
学的活性の依存性を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１０日（２０００．２．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 // Ｃ０７Ｋ 1/20 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1/22 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハーゼルベック，アントンドイツ連邦共和国，デー−82362 バイルハイム，ベレンミュールベク 50 (72)発明者コル，ハンスドイツ連邦共和国，デー−82362 バイルハイム，アドレルベク２Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 DA02 DA03 EA04 GA11 HA20 4B064 AG18 CA10 CA19 CC03 CC24 DA01 4B065 AA91X AA93X BB18 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 DB56 MA01 NA05 NA06 NA14 ZA512 ZA552 ZC022 4H045 BA53 CA42 CA44 DA13 EA24 GA22 GA24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関して少なくとも７５％の比率の
４アンテナ構造を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的になる、ＥＰＯ
組成物。
【請求項２】Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関して少なくとも７５％の平均比
率の４アンテナ構造を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から成る、ＥＰＯ組成
物。
【請求項３】４アンテナ構造の比率が少なくとも８０％である、請求項１
又は２に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項４】ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関して少なくとも平均３．
７のＮ−アセチルラクトサミン単位数、又はＥＰＯ分子のＮ−グリコシル化総数
に関して少なくとも平均１１．１のＮ−アセチルラクトサミン単位数を含むグリ
コシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成る、ＥＰＯ組成物。
【請求項５】Ｎ結合炭水化物鎖に関して少なくとも平均３．７のＮ−アセ
チルラクトサミン単位又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも
平均１１．１のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数を含むグリコシル化され
たＥＰＯ分子から成る、ＥＰＯ組成物。
【請求項６】Ｎ−アセチルラクトサミン単位数が少なくともＮ結合炭水化
物鎖に関して４．０又はＮグリコシル化総数に関して１２．０である、請求項４
又は５に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項７】ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関するＮ−アセチルラクト
サミン単位の平均数にＥＰＯの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少な
くとも４３．３、又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも１３
０の値を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成る、ＥＰＯ組成物
。
【請求項８】ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関するＮ−アセチルラクト
サミン単位の平均数にＥＰＯの分子当たりのシアル酸含量を掛けた積が少なくと
も４３．３、又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも１３０の
平均値を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から成る、ＥＰＯ組成物。
【請求項９】前記の積の値が、Ｎ結合炭水化物鎖に関して少なくとも４６
．７、又はＮグリコシル化総数に関して少なくとも１４０である、請求項７又は
８に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１０】請求項１，２，４，５，７及び８の少なくとも２つの構成
を有する、ＥＰＯ組成物。
【請求項１１】２〜５個のイソ型の混合物を含んで成る、請求項１〜１０
のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１２】３〜４個のイソ型の混合物を含んで成る、請求項１１に記
載のＥＰＯ組成物。
【請求項１３】少なくとも１７５，０００IU／mgタンパク質のｉｎｖｉ
ｖｏ比活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１４】少なくとも２００，０００IU／mgタンパク質のｉｎｖｉ
ｖｏ比活性を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１５】１分子当たりの平均シアル酸含量が少なくとも１１である
、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１６】前記ＥＰＯ分子が哺乳類細胞における外来ＤＮＡの発現の
産物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１７】Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミ
ン単位の伸長（繰り返し）を持つ炭水化物鎖の比率が少なくとも３０％である、
ＣＨＯ細胞由来のグリコシル化されたＥＰＯ分子から成る、請求項１６に記載の
ＥＰＯ組成物。
【請求項１８】炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り
返しを持つ炭水化物鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の比率
との積の値が少なくとも２４００である、請求項１７に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項１９】前記ＥＰＯ分子がヒト細胞における内因性ＤＮＡの発現の
産物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項２０】炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り
返しを持つ炭水化物鎖の比率が少なくとも１０％である、請求項１９に記載のＥ
ＰＯ組成物。
【請求項２１】炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り
返しを持つ炭水化物鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の比率
との積の値が少なくとも８００である、請求項２０に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項２２】前記細胞が無血清培地で培養される、請求項１６又は１９
に記載のＥＰＯ組成物。
【請求項２３】一般的な医薬希釈剤、補助物質及び担体と一緒の前記活性
物質の様な請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＥＰＯ組成物を任意に含む、
医薬調製品。
【請求項２４】前記の所望の形態を有するＥＰＯ組成物が以下の方法：（ａ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖の製造が可能である適当な製造細胞の選択、（ｂ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適当な培養条件の選択及
び（ｃ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有
する炭水化物鎖を含むＥＰＯ分子の強化の間、ＥＰＯ分子の知られた組成物から
の不所望成分の分離：の少なくとも１つによって得られる、特に請求項１〜２３のいずれか１項に記載
の、ＥＰＯ組成物の製造方法。
【請求項２５】方法（ｂ）が少なくとも２つの炭水化物及び、好ましくは
少なくとも３つの炭水化物の前記培養培地への添加を含んで成る、請求項２４に
記載の方法。
【請求項２６】グルコース及び／又はマンノース及び／又はガラクトース
を含む炭水化物混合物が使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】方法（ｂ）が前記細胞の要求に依存して少なくとも１つの
必須アミノ酸及び／又は少なくとも１つの炭水化物を含んで成る栄養素の必要性
に従う調節添加を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】前記細胞の栄養素要求が前記培養培地において測定された
グルタミンの濃度に依存して決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記栄養素が前記細胞の全体の増殖期を越えて必要性に従
い加えられる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】前記栄養素が少なくとも２つの炭水化物及び好ましくは少
なくとも３つの炭水化物の混合物を含んで成る、請求項２７〜２９のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項３１】方法（ｂ）が３０と３５．５℃の間、好ましくは３３と３
５．０℃の間の温度での培養を含んで成る、請求項２４〜３０のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項３２】方法（ｃ）がpH値６〜８の範囲内における逆層クロマトグ
ラフィー段階を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】アセトニトリル、エタノール又はイソプロパノールが溶出
剤として使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】方法（ｃ）がトリアジン色素を使用する親和性クロマトグ
ラフィー段階を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】方法（ｃ）がレクチンを使用する親和性クロマトグラフィ
ー段階を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】ＥＰＯ分子が（ａ）４アンテナ構造を高い比率、（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を多数、（ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位数とシアル酸含量との積を高い値、（ｄ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しを高い比率及び／又は（ｅ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しと４アンテナ炭水化物構造との積を高
い値：有する組成物に強化される、ＥＰＯ組成物の前記比活性を増大させるための方法
。
【請求項３７】炭水化物鎖の総数に関して少なくとも平均比率７５％の４
アンテナ構造に強化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関して少なくとも３．７
のＮ−アセチルラクトサミン単位又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して
少なくとも平均１１．１のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数に強化される
、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関するＮ−アセチルラク
トサミン単位の平均数に平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも４３．３、又
はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも１３０の値に強化される
、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】（ａ）ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合における炭水化物鎖
の総数に関して少なくとも３０％Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しの平均比率
又は（ｂ）ヒト細胞由来のＥＰＯの場合における炭化水素鎖の総数に関して少なくと
も１０％のＮ−アセチルラクトサミン繰り返しの平均比率：に強化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】（ａ）ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合において、炭水化物
鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しの平均比率に４アンテナ炭
水化物構造の平均比率を掛けた積が少なくとも２４００の値、又は（ｂ）ヒト細胞由来のＥＰＯにおいて、炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチル
ラクトサミン繰り返しの平均比率に４アンテナ炭水化物構造の平均比率を掛けた
積が、少なくとも８００の値；に強化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】前記強化が請求項２４に記載の方法（ａ），（ｂ）及び（
ｃ）の１又は複数によって達成される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載
の方法。