DE102012105416A1 - Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids - Google Patents

Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids Download PDF

Info

Publication number
DE102012105416A1
DE102012105416A1 DE201210105416 DE102012105416A DE102012105416A1 DE 102012105416 A1 DE102012105416 A1 DE 102012105416A1 DE 201210105416 DE201210105416 DE 201210105416 DE 102012105416 A DE102012105416 A DE 102012105416A DE 102012105416 A1 DE102012105416 A1 DE 102012105416A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
a1at
peptide
glycosylation
target peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE201210105416
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Berger
Matthias Kaup
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority to DE201210105416 priority Critical patent/DE102012105416A1/de
Publication of DE102012105416A1 publication Critical patent/DE102012105416A1/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung des Glykosylierungsprofils einer vorgegebenen, in einem Zielpeptid enthaltenen Glykosylierungsstelle. Zum Verfahren zählt es, ein Fusionsprotein aus einem Prägeprotein und dem Zielpeptid, das die vorgegebene Glykosylierungsstelle enthält, rekombinant herzustellen. Das Prägeprotein ist ein Glykoprotein mit mindestens einer im Glykoprotein enthaltenen Glykosylierungsstelle. Bei der rekombinanten Herstellung erhält die vorgegebene Glykosylierungsstelle des Zielpeptids im Wesentlichen das Glykosylierungsprofil des Prägeproteins.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifizierung des Glykosylierungsprofils der Glykosylierungsstelle eines Peptids. Ein entsprechendes Verfahren erlaubt es, an einer Glykosylierungsstelle eines Peptids ein gewünschtes Glykosylierungsprofil vorzusehen.
  • Biopharmazeutika gehören zu den wichtigsten Wachstumsmotoren der Pharma- und Biotechnologieindustrie. Über 50% der zugelassenen Biopharmazeutika in Deutschland sind glykosyliert, wie zum Beispiel therapeutische Antikörper, Wachstums- und Gerinnungsfaktoren und Hormone. Neben der Zunahme der Bedeutung von proteinbasierten Medikamenten wird ebenso der Einsatz von peptidbasierten Medikamenten immer wichtiger. So kennt man eine Reihe von natürlich vorkommenden Peptiden, die wichtige physiologische Funktionen übernehmen. Hierzu gehören Blutdruck-regulierende Peptide (Angiotensin, Bradykinin, Substanz P/Tachykinine, AN F, Endothelin), Verdauungsregulierende Peptide (Cholecystokinin, Gastrin, Sekretin, Glucagon, Insulin) Neuropeptide (Neuropeptid Y, Neurotensin, Orexin, MSH) und Hormone der Opioid-Familie (Endorphine, Enkephaline).
  • Pharmakokinetik und Pharmakodynamik entsprechender Biopharmazeutika sind in hohem Maße von der Glykosylierung abhängig. Hierzu zählen die Bioverfügbarkeit, die Gewebedurchdringung, Serumstabilität und Serumhalbwertszeit, die Stabilität gegenüber Proteasen, die Bioverteilung sowie die Immunogenität. Der Findung der optimalen Glykosylierung von Biopharmazeutika kommt daher eine zentrale Bedeutung zu. Neue oder verbesserte Biopharmaka zu entwickeln, ist jedoch aufgrund der Herstellung in lebenden ZelLkulturen wesentlich aufwendiger und komplexer als die Herstellung von organischen Molekülen niedrigen Molgewichts als pharmazeutischen Wirkstoffen.
  • Einige Peptide werden bereits therapeutisch eingesetzt. Hierzu gehören: Oxytocin (zur Uteruskontraktion bei Geburtskomplikationen), Insulin zur Blutzuckersenkung bei Diabetes mellitus, Vasopressin und sein synthetisches Derivat Desmopressin als Antidiurethika, Gonadoliberin (FSH) zur Stimulation der Folikelreifung, humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Schwangerschaftsunterstützung, Glucagon bei Hypoglykämien, zur Ruhigstellung des Darms und als Antidot bei Vergiftungen mit Betablockern und Calciumkanalblockern.
  • Eine weitere wichtige Rolle spielen Glykopeptide in der Antitumorimmuntherapie. Die Glykoproteine von Tumorzellen sind im Vergleich zu Glykoproteinen auf der Oberfläche von gesunden Zellen vielfach abweichend glykosyliert. Diese Glykopeptidfragmente von Membranglykoproteinen von Tumorzellen sind folglich als tumorassoziierte Antigene interessant für die Unterscheidung zwischen normalen und Tumorzellen. Deshalb eignen sich diese tumorassoziierten Antigene insbesondere für die selektive Vaccinierung zur Behandlung verschiedenster Tumorerkrankungen.
  • Die Herstellung der Peptide erfolgt entweder synthetisch oder gentechnologisch mittels geeigneter Produktionszellen. Kurzkettige Peptide mit weniger als 70 Aminosäuren können im Routinebetrieb mit Hilfe von Syntheseautomaten gewonnen werden. Beispiele hierfür sind Oxytocin, Gonadoliberin und Desmopressin. Für die Synthese größerer Peptide wurde die Methode der native chemical ligation (NCL) entwickelt. Hierbei werden synthetische Peptidfragmente kondensiert, von denen eines einen carboxyterminalen Thioester und das andere einen aminoterminalen Cysteinrest trägt. Diese Reaktion verläuft unter milden und selektiven Bedingungen und ist kompatibel mit der Anwesenheit eines Glykans auf einem oder beiden Peptidfragmenten. Hierdurch ist es folglich möglich, Glykopeptide zu größeren Glykoproteinen zu verknüpfen. Diese Methode ist jedoch, aufgrund der begrenzten Größe der zur Reaktion eingesetzten Glykopeptide, auf Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als 20 kDa begrenzt.
  • Für größere Proteine wurde das Verfahren der so genannten expressed protein ligation (EPL) entwickelt, mit dessen Hilfe rekombinante Proteine mit Peptiden über einen carboxyterminalen Thioester an aminoterminale Cysteinreste verknüpft werden. Die Voraussetzung für das spezifische Einfügen von Glykanen in die zur Synthese eingesetzten Glykopeptide bedingt die Verfügbarkeit von entsprechend modifizierten Aminosäure- oder Peptidbausteinen als so genanntes Kassettenmodul. Dies stellt insbesondere für das Anfügen von N-Glykanen aufgrund deren Komplexität und begrenzten Verfügbarkeit eine Herausforderung dar. Für die Synthese von Oligosacchariden sind im Bereich der Glyko-Synthesechemie bereits einige Fortschritte durch die Einführung neuartiger Verfahren erzielt worden. Die Oligosaccharidsynthese steht hierbei vor zwei wesentlichen Herausforderungen. Funktionelle Gruppen mit ähnlicher Reaktivität erfordern unterschiedliche Vorgehensweisen für die spezifische Ausbildung verknüpfter Strukturen. Weiterhin ist die Stereochemie des anomeren Zentrums zu beachten, welche bei Verknüpfung zweier Monosaccharide zu einem einzigen Produkt mit einer einzigen Konfiguration führen sollte. Für die Erfüllung dieser Anforderungen werden in der Oligosaccharidsynthese selektiv blockierte Kohlenhydrat-Aufbaueinheiten verwendet, die über eine Reihe von Glykosylierungsreaktionen zu den Oligosacchariden verknüpft werden. Dabei ist der limitierende Faktor für die synthetische Großproduktion von Oligosacchariden die Bereitstellung ausreichender Mengen der Aufbaueinheiten. Ähnlich verhält es sich mit der enzymatischen Synthese von Oligosacchariden, wobei sich mit Hilfe von Glykosyltransferasen hochselektiv Oligosaccharide produzieren lassen. Der entscheidende Kostenfaktor ist hier die Bereitstellung der Enzyme, daneben auch einiger für die Reaktionen benötigter aktivierter Monosaccharide wie z. B. CMP-N-Acetylneuraminsäure.
  • Schaut man sich aber das N-Glykosylierungsprofil eines Proteins näher an, so erkennt man, dass sich an den verschiedenen N-Glykosylierungsstellen innerhalb eines Proteins nur bestimmte Glykane finden. Folglich sind innerhalb eines Proteins bereits spezifisch glykosylierte Peptidbereiche vorhanden.
  • Es ergibt sich somit der Bedarf an einer Möglichkeit, die es erlaubt, das Glykosylierungsprofil von Glykosylierungsstellen in einem Peptid zu beeinflussen oder zu verändern. Eine solche Möglichkeit wird mit dem Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 der vorliegenden Offenbarung bereitgestellt.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren, das es erlaubt, ein Peptid („Carbopeptide”), im Folgenden auch als Zielpeptid bezeichnet, an einer entsprechenden Glykosylierungsstelle mit einem gewünschten Glykosylierungsprofil zu versehen. Dazu wird ein Prägeprotein mit dem gewünschten Glykosylierungsprofil ausgewählt und ein Fusionsprotein aus dem Zielpeptid und dem Prägeprotein hergestellt. Als Zielpeptid und Prägeprotein kommt jedes gewünschte Peptid bzw. Protein in Frage. Das Zielpeptid kann künstlich entworfen sein, ein Teilabschnitt des Prägeproteins oder ein Teilabschnitt eines anderen Proteins darstellen. Um ein glykosyliertes Fusionsprotein zu erhalten, kann dieses gemäß üblicher und dem Fachmann geläufiger Techniken in einem geeigneten Expressionssystem wie z. B. einer eukaryontischen Zelle, exprimiert werden. Das Zielpeptid erhält im Fusionsprotein im Wesentlichen das Glykosylierungsprofil des Prägeproteins. Durch Abspalten des Zielpeptids aus dem Fusionsprotein lässt sich das gewünschte glykosylierte Zielpeptid gewinnen.
  • Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann als Verfahren zur Modifizierung des Glykosylierungsprofils einer in einem Zielpeptid enthaltenen Glykosylierungsstelle definiert werden. Das Verfahren umfasst, ein Fusionsprotein aus einem Prägeprotein und dem Zielpeptid rekombinant herzustellen. Das Zielpeptid enthält die vorgegebene Glykosylierungsstelle. Das Prägeprotein ist ein Glykoprotein mit mindestens einer Glykosylierungsstelle, die im entsprechenden Glykoprotein enthalten ist. Bei der rekombinanten Herstellung des Fusionsproteins erhält die Glykosylierungsstelle des Zielpeptids im Wesentlichen das Glykosylierungsprofil des Prägeproteins.
  • Mit Hilfe eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung lässt sich somit über ein Prägeprotein das Glykosylierungsmuster eines bestimmten Peptids steuern. Am Beispiel von N-Glykanen bedeutet dies, dass eine Peptidsequenz z. B. aus L-Selektin, die in der Regel mit biantennären Glykanen und zum Tell N-Acetylgalactosaminbausteinen versehen ist, als Glykosylierung nun beispielsweise die höher-antennären Glykane des Prägeproteins Alpha1-Antitrypsin (A1AT) erhält. Als weiteres Beispiel ist es möglich, Peptide der RNaseB, die in der Regel nur Mannosereiche Glykane tragen, mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung mit höher-antennären und komplexen Glykanstrukturen auszustatten. Im Umkehrschluss ist es also möglich Glykopeptide herzustellen, die in der Peptidsequenz identisch, aber durch das erfindungsgemäße Verfahren mit unterschiedlichen und definierten Glykanen ausgestattet werden. Hierbei sei erwähnt, dass „im wesentlichen” in Bezug auf das Glykosylierungsprofil des Prägeproteins bedeutet, dass das Glykosylierungsmuster des Zielpeptids nicht absolut identisch mit dem Glykosylierungsmuster des Prägeproteins sein muss, sondern, dass gewisse – z. B. durch die rekombinante Herstellung bedingte Abweichungen oder der der Glykosylierung innewohnende Mikroheterogenität – Unterschiede im Glykosylierungsmuster des Zielpeptids im Vergleich zum Prägeprotein auftreten können. So können z. B. bei einer N-Glykosylierung im Rahmen der Erfindung Unterschiede in der Antennerität den N-Glykanstrukturen zwischen Prägeprotein und Zielpeptid auftreten, die sich z. B. durch Unterschiede im Vorkommen von bi, tri- und tetraantennären Strukturen mit unterschiedlichen Sialylierungs- und Fucosylierungsgraden äußern können (siehe hierzu die Beispiele und 14 bis 16 und 18 bis 20).
  • Zum besseren Verständnis und zur Veranschaulichung enthält die Offenbarung die im Folgenden kurz erläuterten Figuren.
  • 1A skizziert schematisch den Aufbau eines Fusionsproteins, das gemäß der vorliegenden Erfindung zur Modifizierung des Glykosylierungsprofils einer Glykosylierungsstelle in einem Zielpeptid. Das Zielpeptid erhält das Glykosylierungsmuster des Prägeproteins.
  • 1B zeigt schematisch als Beispiel ein Fusionsprotein aus Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) und einem Zielpeptid, verbunden über eine Spaltstellensequenz der TEV-Protease, die die Abspaltung des Zielpeptids erlaubt.
  • 1C skizziert schematisch die Spaltung eines in 1A illustrierten Fusionsproteins (SP = Signalpeptid). Nach Expression lässt sich das Fusionsprotein beispielsweise chromatographisch isolieren, z. B. mittels eines spezifischen Antikörpers, der z. B. gegen die Spaltstelle gerichtet sein kann.
  • 1D skizziert exemplarisch die nach erfolgter Spaltung des Fusionsproteins erhaltenen Bruchstücke.
  • 1E, 1F und 1G illustrieren schematisch die Spaltprodukte aus Fusionsproteinen mit beispielhaften Prägeproteinen (vgl. 1D).
  • 2 zeigt die gelelektrophoretische Analyse mittels Coomassie-Färbung von Fraktionen einer Anionenaustauschchromatograpie mit SepharoseQ eines Fusionsproteins gemäß der Erfindung, das A1AT und das synthetische Glykopeptid GT1.4t (s. 5) enthält, verbunden über eine TEV-Schnittstelle, abgekürzt A1AT-TEV-GT1.4t. Auftrag von je 15 μl Durchfluss (DF), Waschfraktion (WF) und den SepharoseQ-Fraktionen 6–18 auf ein 10% SOS-Gel.
  • 3 zeigt die gelelektrophoretische Analyse mittels Coomassie-Färbung von Fraktionen einer Gelfiltration von vereinigten nach SepharoseQ erhaltenen Fraktionen, die A1AT-TEV-Zielpeptid enthielten (2). Das jeweilige Zielpeptid ist unter dem Abbild des jeweiligen Gels gezeigt. Auftrag von je 15 μl der S200-Fraktionen 10–15 auf ein 10% SDS-Gel.
  • 4 zeigt die gelelektrophoretische Analyse mittels Coomassie-Färbung von Fraktionen einer Gelfiltration Fraktionen der Gelfiltration von Fusionsproteinen A1AT-TEV-Zielpeptid im Coomassie-gefärbten SDS-Gel. Das jeweilige Zielpeptid ist angegeben. Auftrag von je 15 μl der gereinigten Fusionsproteine (Fraktionen der Gelfiltration: K2; 13; N271, L-Sel, CD52, GT1.4t, tPA: 12) auf ein 10% SDSGel.
  • 5 zeigt schematische die C-terminale TEV-Schnittstellensequenz an A1AT und der Zielpeptide. Gezeigt ist der Aufbau der Schnittstellensequenz der TEV-Protease, die C-terminal an A1AT gebunden ist (die Schnittstelle ist durch ^ gekennzeichnet). An die TEV-Schnittstellensequenz sind die Sequenzen der verschiedenen Zielpeptide gebunden. Vier der GlykoTags stammen aus den Proteinen A1AT (N271), L-Selektin (L-Sel), Campath-1 Antigen (CD52) und Tissue Plasmin Activator (tPA). Das Glykosylierungsmotiv von GT1.4t ist N-terminal von 11 Aminosäuren und C-terminal von 9 Aminosäuren, deren Sequenzmotiv aus humanem Transferrin stammt, flankiert. K2 besteht aus 10 Aminosäuren und enthält kein Glykosylierungsmotiv.
  • 6 zeigt die Analyse von A1AT-Fusionsproteinen vor und nach Inkubation mit PNGaseF im Coomassie-gefärbten SDSGel. Auftrag von je 15 μl der A1AT-Fusionsproteine je vor (–) und nach (+) der Inkubation mit PNGaseF auf ein 10% SOS-Polyacrylamidgel.
  • 7 zeigt MALDI-TOF-MS-Spektren der Glykane der A1AT-Fusionsproteine. Messung der abgespaltenen und desialylierten Glykane der A1AT-Konstrukte im Positiv-Ionen-Modus.
  • 8 zeigt die A1AT-Fusionsproteine vor und nach Inkubation mit TEV-Protease mit Zusatz von 1% (v/v) NP-40 und 1% (v/v) β-Mercaptoethanol (ME) im Coomassie-gefärbten SDS-Gel. Auftrag von je 15 μl der A1AT-Konstrukte je vor (–) und nach (+) der Inkubation mit TEV-Protease auf ein 10% SDS-Polyacrylamidgel.
  • 9 zeigt ein MALDI-TOF-MS-Spektrum des Zielpeptids von A1AT-TEV-CD52 gemessen im Negativ-Ionen-Modus.
  • 10 zeigt ein MALDI-TOF-MS-Spektrum des Zielpeptids von A1AT-TEV-GT1.4t gemessen im Negativ-Ionen-Modus.
  • 11 zeigt ein MALDI-TOF-MS-Spektrum des Zielpeptids von A1AT-TEV-tPA gemessen im Negativ-Ionen-Modus.
  • 12 zeigt eine Übersicht weiterer beispielhafter A1AT-TEV-Fusionsproteine. Angegeben sind die C-terminalen TEV-Schnittstellensequenz an A1AT und die Sequenz der Zielpeptide, als Glykopeptid bezeichnet. Zusätzlich wurden zwei Konstrukte generiert, bei denen das natürliche C-Mannosylierungsmotiv des A1ATs substituiert wurde (A1ATW238A-TEV-C-Man; A1AT-W238A-TEV-TSR). Der Pfeil kennzeichnet die Aminosäuren zwischen denen die TEV-Protease das Protein spaltet.
  • 13 zeigt eine gelelektrophoretische (SDS-PAGE) Analyse mittels Coomassie-Färbung Coomassie-Färbung. Je 15 μl Proteinlösung wurden in einem 10%igen SDS-Gel (reduzierend) aufgetrennt. Die Gele wurden anschließend für die Extraktion und massenspektrometrische Analytik verwendet. Die markierten Rechtecke kennzeichnen den Bereich der Bande, der hierzu ausgestanzt wurde.
  • 14 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-K2 nach In-Gel-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 15 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-RNaseB nach In-Gel-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 16 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-GT1.4tail nach In-Gel-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 17 zeigt eine Analyse der indizierten A1AT-TEV-Fusionsproteine vor (–) und nach (+) PNGaseF-Verdau nach Separation im reduzierenden 10% SDS-Gel (Coomassie-Färbung).
  • 18 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-K2 nach In-Lösung-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 19 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-RNaseB nach In-Lösung-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 20 zeigt ein Massenspektrum der desialylierten N-Glykane von A1AT-TEV-GT1.4tail nach In-Lösung-Verdau. MALDITOF-MS, Positiv-Modus [M + Na+], Matrix sDHB.
  • 21 zeigt CE-LIF-Elektropherogramme von mit dem Fluorophor 8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonat (APTS) markierten N-Glykanen der A1AT-TEV-Proteine nach In-Gel-Analytik. Die oberhalb der Kurven zugeordneten Strukturen beziehen sich auf alle Proben.
  • 22 zeigt schematisch die Struktur der Grundtypen von N-Glykanen. Die angegebenen Symbole für Monosaccharid-Einheiten wurden auch in den übrigen Figuren, wie 14–16 oder 18–21 verwendet.
  • Die Erfindung beruht auf der überraschenden Beobachtung, dass sich das Glykosylierungsprofil eines Zielpeptides weitestgehend steuern lässt, wenn dieses in Form eines Fusionsproteins mit einem Prägeprotein in einem für Glykoproteinexpression geeigneten Expressionssystem exprimiert wird. In einigen Ausführungsformen ist das Zielpeptid an den C-Terminus des Prägeproteins gekoppelt, beispielsweise über ein Verbindungspeptid. Das Zielpeptid kann sowohl an den N-Terminus als auch an den C-Terminus des Prägeproteins gekoppelt sein. In beiden Fällen kann ein Verbindungspeptid zwischen dem Prägeprotein und dem Zielpeptid angeordnet sein. Ein entsprechendes Verbindungspeptid kann eine Länge von 1 bis etwa 10 oder 15 Aminosäuren aufweisen, ist jedoch in einigen Ausführungsformen 1 bis etwa 4, z. B. 2 oder 3 Aminosäuren beschränkt. Ein solches Verbindungspeptid kann jede beliebige Aminosäuresequenz aufweisen. Ferner kann ein solches Verbindungspeptid eine Spaltstelle für eine beliebige Protease enthalten. Eine Protease kann beispielsweise eine Serinprotease, eine Cystein-(Thiol)Protease, eine Aspartatprotease oder eine Metallprotease sein. Wird eine Proteaseschnittstelle in einem entsprechenden Fusionsprotein vorgesehen, so handelt es sich typischerweise um eine Protease, die eine so hohe Spezifität für eine bestimmte Aminosäureabfolge aufweist, dass nur in unwesentlichem Umfang eine Spaltung an anderen Stellen im Fusionsprotein auftritt, oder das durch die Protease keine Spaltung an anderen Stellen im Fusionsprotein erfolgt. Eine geeignete Protease kann beispielsweise die Humaner Rhinovirus 3C Protease (HRV 3C Protease) sein, eine Cysteinprotease, die die Spaltstelle Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro erkennt. Die HRV 3C Protease spaltet diese Sequenz zwischen Gln und Gly. Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Protease ist die TEV NIa protease, eine Cysteinprotease des Tabakätzvirus (TEV), die die Spaltstelle Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser erkennt. Für X kommen in dieser Sequenz zahlreiche Aminosäuren in Frage, ggf. kann vor dem Einsatz einer geplanten Schnittstelle getestet werden, ob die als X vorgesehene(n) Aminosäure(n) eine geeignete Spaltstelle ergeben. Weiterhin kann die Kex2 Protease aus Hefe geeignet sein, um für ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Verbindung eine Spaltstelle zu definieren. Die Kex2 Protease ist eine Serinprotease, die die Sequenzen N-Arg-Arg/-C und N-Lys-Arg/-C am Carboxylende spaltet. Als weiteres Beispiel sei die Subtilisin-ähnliche Protease C1 aus Sojabohne genannt, die an den Stellen Glu-Glu und Glu-Gln in Sequenzen spaltet, die eine Mehrzahl an Glutamat- und/oder Aspartat-Resten enthält, z. B. in der Sequenzen Ac-KVEKE-ESEE-NH2 ode Ac-KVEKE-ESSSG-NH2. Beispiele für Proteasen, die keine Spezifität für eine bestimmte Aminosäuresequenz aufweisen, sind die Thiolprotease Bromelain, die Thiolprotease Ficin oder die Metallprotease Dispase. Diese Proteasen sind somit für den Einsatz zur Freisetzung des Zielpeptids aus dem Fusionsprotein im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht geeignet. In einigen Ausführungsformen besteht das Verbindungspeptid zwischen Prägeprotein und Zielpeptid ausschließlich aus der Sequenz einer Proteaseschnittstelle.
  • Als Prägeprotein kommt grundsätzlich jedes beliebige Protein in Frage, das eine oder mehrere Glykosylierungsstelle(n) aufweist und das bei einer rekombinanten Expression in einer definierten Weise glykosyliert wird, d. h. ein gewünschtes Glykosylierungsprofil aufweist. Das Prägeprotein kann ein natürlich vorkommendes Glykoprotein sein, aber auch ein mutiertes Protein, das von Natur aus keine Glykosylierungsstelle aufweist, in das eine Glykosyilierungsstelle jedoch künstlich eingeführt worden ist. In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein Alpha-1-Antitrypsin (A1AT). A1AT ist ein Serumprotein, das hauptsächlich in Hepatozyten und zu einem geringeren Anteil auch in Alveolarmakrophagen und Monozyten synthetisiert wird. Das Protein gehört zu den Serinproteinase-Inhibitoren (Serpine) und trägt maßgeblich zum Schutz des Lungengewebes bei, indem es proteolytische Enzyme, wie z. B. die Neutrophile Elastase irreversibel inhibiert. A1AT ist ein „Akute-Phase-Protein” und wird bei Entzündungsreaktionen als Antwort auf die erhöhte Freisetzung von Proteasen vermehrt synthetisiert und sezerniert.
  • A1AT kann jede Variante des bekannten Alpha-1-Antitrypsins sein. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P01009 (wie am 18. April 2012, Version 183), wobei es sich um die dort als Isoform 1 bezeichnete Variante handelt (Identifizierungsnr. P01009-1). In einigen Ausführungsformen ist A1AT die im UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag P01009 ebenfalls angegebene Isoform 2 (Identifizierungsnr. P01009-2). Diese unterscheidet sich von Isoform 1 im Bereich der Aminosäurepositionen 356–418, deren Sequenz Ala-Val-His-Lys-Ala-Val-Leu-Thr-Ile-Asp-Glu-Lys-Gly-Thr-Glu-Ala-Ala-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Met-Ile-Glu-Gln-Asn-Thr-Lys-Ser-Pro-Leu-Phe-Met-Gly-Lys-Val-Val-Asn-Pro-Thr-Gln-Lys in Isoform 1 durch die Sequenz Val-Arg-Ser-Pro ersetzt ist. In einigen Ausführungsformen ist A1AT die auch im UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag P01009 angegebene Isoform 3 (Identifizierungsnr. P01009-3). Isoform 3 unterscheidet sich von Isoform 1 dadurch, dass der Bereich der Aminosäurepositionen 307–418 nicht enthalten ist. In einigen Ausführungsformen kann A1AT das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-1 mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P07758 (wie am 16. Mai 2012, Version 111), das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-2 mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag der Nummer P22599 (wie am 16. Mai 2012, Version 103), das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-3 mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag Nr. Q00896 (wie am 16. Mai 2012, Version 94), das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-4 mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag der Nummer Q00897 (wie am 16. Mai 2012, Version 91), das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-5 mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag Nr. Q00898 (wie am 16. Mai 2012, Version 96) oder das Maus-Protein Alpha-1-antitrypsin 1-6 mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag der Nummer Q9DCQ7 (wie am 16. Mai 2012, Version 70) sein. In einigen Ausführungsformen ist A1AT das Ratten-Protein mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag Nr. P17475 (wie am 16. Mai 2012, Version 101), das Schweine-Protein mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag Nr. P50447 (wie am 16. Mai 2012, Version 69), das Rinder-Protein mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag Nr. P34955 (wie am 16. Mai 2012, Version 87) oder das Pferde-Protein mit dem UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Eintrag Nr. P38029 (wie am 16. Mai 2012, Version 72).
  • Die Polypeptidkette von reifem humanen A1AT der Isoform 1 mit UniProt-/Swiss-Prot-Nr. P01009 besteht aus 418 Aminosäuren (Signalsequenz von 24 Aminosäuren mit einbezogen) und besitzt eine molekulare Masse von 52 kDa, wovon ca. 15% dem Kohlenhydratanteil zukommen. Das Protein enthält drei N-Glykosylierungsmotive an den Positionen Asn70, Asn107 und Asn27, die hauptsächlich komplexe di- und tri-, aber in geringem Maße auch tetraantennäre Glykane tragen. Die Glykosylierungen tragen zur Stabilität von A1AT bei, wirken Aggregation entgegen und verlängern somit die Halbwertszeit des Proteins im Serum. Die physiologische Serumkonzentration von A1AT, das eine Halblebenszeit von 4–5 Tagen hat, liegt zwischen 1–2,8 g/L. Bei einem genetisch bedingten A1AT-Mangel mit einer A1AT-Serumkonzentration von unter 0,5 g/L können Elastasen nicht mehr genügend abgebaut werden, was zur Schädigung des Lungengewebes und letztendlich zu Lungenemphysemen führen kann. Gegenwärtig wird ein A1AT-Mangel durch die intravenöse Infusion von aus humanem Plasma gewonnenem A1AT therapiert (60 mg A1AT/kg Körpergewicht). Jedoch haben Studien ergeben, dass nur 2–3% des infundierten A1AT tatsächlich das Lungengewebe erreichen. Zudem ist der therapeutische Aufwand für den Patienten und den Behandelnden relativ groß, da die Applikation von A1AT einmal wöchentlich nötig ist. Hinzu kommt das Risiko von Kontaminationen durch neue oder unbekannte Pathogene im zugeführten Plasma.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein L-Selektin. L-Selektin kann jede Variante des Proteins sein. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P14151 (wie am 16. Mai 2012, Version 148), das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer Q8WW79 (wie am 16. Mai 2012, Version 87) oder das humane Protein mit UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag Nr. Q6ULR8 (wie am 16. Mai 2012, Version 55). In einigen Ausführungsformen kann L-Selektin das Maus-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P18337 (wie am 16. Mai 2012, Version 119) sein, das Schimpansen-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer Q95237 (wie am 16. Mai 2012, Version 83), das Rinder-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P98131 (wie am 16. Mai 2012, Version 85) oder das Ratten-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P30836 (wie am 16. Mai 2012, Version 97).
  • L-Selektin ist ein Glykoprotein, das auf der Membran von Leukozyten exprimiert wird. Das 50 kDa große Protein gehört zur Familie der Zelladhäsionsmoleküle und vermittelt die Adhäsion von Leukozyten an endotheliale Gewebe bei Entzündungsreaktionen. Zur N-Glykosylierung von L-Selektin gibt es nur wenige Untersuchungen. Nach Klonierung der cDNA des humanen Proteins wurden sieben Glykosylierungsstellen identifiziert. Aminoterminal der Glykosylierungsstelle Asn60 enthält die Aminosäurensequenz von L-Selektin drei basische Argininreste (... NWQRARRCRDN60YTDL...), welche möglicherweise ein Erkennungsmotiv der GalNAc-Transferase darstellen. Untersuchungen zufolge ist dieses basische Muster für die Ausbildung von (sulfatierten) terminalen GalNAc-Resten auf den Antennen des Glykans in dieser Position verantwortlich.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein Campath-1 Antigen (CD52). CD52 kann jede Variante des Proteins sein. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P31358 (wie am 16. Mai 2012, Version 105), das Maus-Protein mit dem Eintrag Nr. Q64389 in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank (wie am 16. Mai 2012, Version 83) oder das Ratten-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer Q63064 (wie am 16. Mai 2012, Version 70).
  • CD52 ist ein Glycosylphosphatidylinositol-verankertes Glykoprotein, das auf nahezu allen humanen Lymphocyten exprimiert wird. Monoklonale Antikörper gegen dieses Antigen bewirken Komplement-vermittelte Zelllyse. CD52 ist ein sehr kleines Protein (6 kDa). Das humane Protein verfügt über eine Glykosylierungsstelle an Position Asn3, welche N-Glykane mit großer Mikroheterogenität in den Strukturen ausbildet.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein der humane Tissue-type Plasminogen Activator (gewebespezifischer Plasminogenaktivator, tPA). tPA kann jede Variante des Proteins sein. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P00750 (wie am 16. Mai 2012, Version 175), das Maus-Protein mit dem Eintrag Nr. P11214 in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank (wie am 16. Mai 2012, Version 134) das Ratten-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P19637 (wie am 16. Mai 2012, Version 116) oder das Rinder-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer Q28198 (wie am 16. Mai 2012, Version 103).
  • TPA ist ein Schlüsselenzym beim Abbau von Blutgerinnseln. Es wandelt das Zymogen Plasminogen in Plasmin um, welches wiederum Fibrinvernetzungen in Tromben im vaskularen System abbaut. Das Enzym wird in vaskularen endothelialen Zellen synthetisiert und sekretiert. tPA besitzt eine molekulare Masse von 68 kDa und verfügt über drei N-Glykosylierungsdomänen. Die Glykosylierungsstelle an Position Asn117 weist ausschließlich High-Mannose-Strukturen auf, während die Positionen Asn184 und Asn448 heterogene N-Glykanstrukturen tragen.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein Ribonuklease B (RNaseB). RNase B kann jede Variante des betreffenden Proteins sein. In einer Ausführungsform ist das Prägeprotein bovine RNase B (Das Gen für die bovine RNase (AccNo.: BC149636, EH204084) codiert für eine nicht glykosylierte Form (RNaseA) und eine glykosylierte Form (RNaseB), die an nur eine Stelle glykosyliert wird und daher vorteilhafterweise als Prägeprotein verwendet kann), RNaseB wird im Pankreas gebildet und katalysiert die Spaltung von einzel- und doppelsträngiger RNA auf der 3'-Seite der Pyrimidin-Nukleotide. Das reife Protein besteht aus 124 Aminosäuren und besitzt an Position 34 eine N-Glykosylierungsstelle (Asn34) der Aminosäuresequenz Asn-Leu-Thr. Für diese Position konnten mehrere Arbeitsgruppen N-Glykane des High-Mannose-Typs nachweisen.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Prägeprotein ein Immunglobulin oder eine Kette oder ein Fragment davon, wie z. B. ein Fc-Fragment eines IgG, inklusive eines humanen IgG.
  • In anderen Ausführungsformen ist das Prägeprotein ein lösliches Fragment eines Membranglykoproteins von Tumorzellen, wobei das Fragment das Tumorzell-typische Glykosylierungsmuster dieses tumorassoziierten Antigens (Membranglykoproteins) besitzt.
  • Zu einer Variante eines der zuvor genannten Proteine zählt ein Protein mit einer hohen Sequenzidentität zu einer entsprechenden bekannten Form des Proteins. Eine entsprechende Sequenz einer Variante hat in einigen Ausführungsformen wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wenigstens 80%, wenigstens 82%, wenigstens 85%, wenigstens 87% oder wenigstens 90% Identität, inklusive wenigstens 92%, wenigstens 93%, wenigstens 94%, wenigstens 95%, wenigstens 96%, wenigstens 97%, wenigstens 98%, wenigstens 99% oder wenigstens 99,5% Identität zu einer entsprechenden bekannten Form des Proteins. Der Begriff „Identität” betrifft eine Eigenschaft von Sequenzen, die die deren Ähnlichkeit oder das Verhältnis von Sequenzen zueinander angibt. Die Identität wird ermittelt, indem die Zahl identischer Reste durch die Gesamtzahl von Resten geteilt wird und das Produkt mit 100 multipliziert wird. Dem Fachmann ist dabei bewusst, dass EDV-Programme verfügbar sind, mit denen sich mit Hilfe von Standardparametern Sequenzidentitäten bestimmen lassen, z. B. BLAST, BLAST2 oder Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195–197). Eine Variante eines bekannten Proteins kann eine oder mehrere Mutationen enthalten – relativ zur Sequenz der bekannten Proteinform. Eine entsprechende Variante kann in einigen Ausführungsformen anhand der Sequenz einer bekannten Proteinform mittels molekularbiologischer Techniken, inklusive rekombinanter Techniken, erhalten werden.
  • In einigen Ausführungsformen hat eine Variante eine Sequenz, die eine Substitution, d. h. einen Austausch, enthält, die eine sog. konservative Substitution ist, eine Substitution, die nicht mit einer Änderung der biologischen Aktivität verbunden ist. Dennoch ist grundsätzlich jede Substitution möglich, solange das entsprechende Peptid oder Protein eine messbare biologische Aktivität aufweist, wobei die Aktivität qualitativ mit der Aktivität der bekannten Variante des Proteins übereinstimmt.
  • Als konservative Substitutionen werden im Allgemeinen die folgenden Substitutionen angesehen, aufgelistet gemäß der zu mutierenden Aminosäure, gefolgt von ein oder mehreren Substitutionen, die als konservativ angesehen werden können: Ala → Gly, Ser, Val; Arg → Lys; Asn → Gln, His; Asp → Glu; Cys → Ser; Gln → Asn; Glu → Asp; Gly → Ala; His → Arg, Asn, Gln; Ile → Leu, Val; Leu → Ile, Val; Lys → Arg, Gln, Glu; Met → Leu, Tyr, Ile; Phe → Met, Leu, Tyr; Ser → Thr; Thr → Ser; Trp → Tyr; Tyr → Trp, Phe; Val → Ile, Leu. Weitere Substitutionen sind ebenfalls zulässig und können empirisch oder gemäß anderen bekannten konservativen oder nicht-konservativen Substitutionen ermittelt werden. Als eine weitere Orientierung können die folgenden acht Gruppen dienen, von denen jede Aminosäuren enthält, die typischerweise als gegenseitige konservative Substitutionen gelten können:
    • 1) Alanine (Ala), Glycin (Gly);
    • 2) Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu);
    • 3) Asparagin (Asn), Glutamin (Gln);
    • 4) Arginin (Arg), Lysin (Lys);
    • 5) Isoleucin (Ile), Leucin (Leu), Methionin (Met), Valin (Val);
    • 6) Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp);
    • 7) Serin (Ser), Threonin (Thr) und
    • 8) Cystein (Cys), Methionin (Met).
  • Im Gegensatz dazu lässt sich erwarten, dass die folgenden Substitutionen die Wahrscheinlichkeit einer Änderung der biologischen Aktivität erhöhen und erheblichere Veränderungen darstellen: Ala → Leu, Ile; Arg → Gln; Asn → Asp, Lys, Arg, His; Asp → Asn; Cys → Ala; Gln → Glu; Glu → Gln; His → Lys; Ile → Met, Ala, Phe; Leu → Ala, Met, Norleucine; Lys → Asn; Met → Phe; Phe → Val, Ile, Ala; Trp → Phe; Tyr → Thr, Ser; Val → Met, Phe, Ala.
  • Die Erfinder haben gefunden, dass das Zielpeptid keinen Einfluss auf die Glykosylierung des Prägeproteins hat. Dagegen wurde in allen Fällen beobachtet, dass die Glykosylierung des Zielpeptids vom Prägeprotein bestimmt wird. Beispielhaft seien Untersuchungen genannt, bei denen die Zielpeptide N-Glykosylierungsdomänen enthielten, welche aus Proteinen mit eindeutiger oder besonders vielfältiger Glykosylierungsausprägung stammten. Um zu untersuchen, ob die Glykane der Zielpeptide am beispielhaften Prägeprotein A1AT ihre natürlichen Strukturen bewahren oder ob sie durch das neue Proteinumfeld in ihrer Struktur beeinflusst werden, wurden Zielpeptide aus Domänen mit besonders verschiedenartigen Glykanstrukturen ausgewählt und massenspektrometrische Untersuchungen der erhaltenen Produkte durchgeführt (siehe die Erläuterungen in den Beispielen).
  • Das Zielpeptid kann jedes beliebige Zielpeptid sein. Das Zielpeptid kann ein natürlich vorkommendes Peptid oder Polypeptid, eine Mutante, einschließlich eines Fragments eines natürlichen Peptids oder Polypeptid oder ein Peptid mit einer völlig künstlichen Aminosäuresequenz sein. Das Zielpeptid besteht in der Regel aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, die bei rekombinanter Herstellung aus einer Nukleinsäuresequenz mittels eines geeigneten Expressionssystems translatiert und ggf. transkribiert werden können. In einigen Ausführungsformen hat das Zielpeptid eine Sequenz mit einer Länge bis zu etwa 40 Aminosäuren, wie z. B. bis zu etwa 35 Aminosäuren, bis zu etwa 30 Aminosäuren, bis zu etwa 28 Aminosäuren, bis zu etwa 26, bis zu etwa 25, bis zu etwa 24, bis zu etwa 23, bis zu etwa 22, bis zu etwa 21, bis zu etwa 20, bis zu etwa 19, bis zu etwa 18, bis zu etwa 17, bis zu etwa 16, bis zu etwa 15 oder weniger Aminosäuren. Das Zielpeptid kann z. B. eine Länge von etwa 10 bis etwa 32 Aminosäuren, z. B. von etwa 12 bis etwa 32 Aminosäuren, von etwa 14 bis etwa 30 Aminosäuren oder von etwa 16 bis etwa 25 Aminosäuren haben. Allerdings ist es ebenfalls möglich, dass das Zielpeptid eine längere Aminosäuresequenz mit bis zu etwa 100, 150, 175 oder 200 Aminosäuren aufweist. Der hier verwendete Begriff Zielpeptide schließt somit auch längere Peptide ein, die üblicherweise als Polypeptide bezeichnet werden.
  • Als illustratives Beispiel für ein solches Polypeptid kann das Zielpeptid z. B. Erythropoetin (EPO), ein Glykoprotein-Hormon oder ein Peptidfragment von EPO sein. Reifes EPO ist ein Polypeptid mit 165 Aminosäuren, das als Wachstumsfaktor für die Bildung von Erythrozyten während der Hämatopoese von Bedeutung ist. Biotechnologisch hergestelltes Erythropoetin wird vorwiegend bei der Behandlung der Blutarmut von Dialysepatienten, bei denen die Blutbildung infolge eines Nierenversagens gestört ist, eingesetzt sowie nach aggressiven Chemotherapiezyklen. Dabei kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Variante von EPO als Zielpeptid eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen ist das Zielpeptid dabei das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P01588 (wie am 13. Juni 2012, Version 134), das Ratten-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P29676 (wie am 16. Mai 2012, Version 81), das Maus-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P07321 (wie am 16. Mai 2012, Version 99), das Protein aus Schwein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P49157 (wie am 16. Mai 2012, Version 70) oder das Protein aus Rind mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P48617 (wie am 16. Mai 2012, Version 71). Ein illustratives Beispiel einer künstlich modifizierten Zielpeptids ist die auch als Darbepoetin alfa bekannte von der Firma Amgen entwickelte EPO-Variante, die durch das Einfügen zusätzlicher Glykosylierungsstellen in der Sequenz von EPO fünf anstelle von drei Asparagin-gebundenen N-Glykanen aufweist.
  • Weitere illustrative Zielpeptide sind Angiotensin und Angiotensinogen, oder ein Peptidfragment davon. Angiotensin kann jede Variante des entsprechenden Proteins sein, wie z. B. humanes Angiotensin-1, Angiotensin-2 oder Angiotensin-3. Humanes Angiotensin mit der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank Nr. P01019 (wie am 13. Juni 2012, Version 154), stellt die unreife Form dar, die auch Angiotensinogen enthält und in eine reife Form prozessiert wird. Dabei werden die drei Formen Angiotensin-1, Angiotensin-2 und Angiotensin-3 freigesetzt. Ein weiteres Beispiel für ein Zielpeptid ist Vasopressin oder ein Fragment davon. Vasopressin kann jede Variante des Proteins sein. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das humane Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P01185 (wie am 13. Juni 2012, Version 138), das in vivo in die drei Peptide Arg-Vasopressin, Neurophysin 2 und Copeptin gespalten wird. Der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbankeintrag P01185 listet 42 bekannte Varianten des humanen Vasopressin auf. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um das Rinder-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P01180 (wie am 16. Mai 2012, Version 109) oder um das Ratten-Protein mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer P01186 (wie am 16. Mai 2012, Version 108). Ein weiteres Beispiel für ein Zielpeptid sind Choriogonadotropin, eine Untereinheit oder ein Fragment davon. In einigen Ausführungsformen handelt es sich um die Variante 1 der beta-Untereinheit des humanen Choriogonadotropin mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer A6NKQ9 (wie am 13. Juni 2012, Version 48) oder um die Variante 2 der beta-Untereinheit des humanen Choriogonadotropin mit dem Eintrag in der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank der Nummer Q6NT52 (wie am 13. Juni 2012, Version 68).
  • Ein anderes illustratives Beispiel eines Zielpeptides ist ein Interferon wie Interferon alpha-2a, Interferon alpha-2b, Interferon alpha-4, Interferon alpha-5, Interferon alpha-6, Interferon alpha-7, Interferon alpha-8, Interferon alpha-10, Interferon alpha-1/13, Interferon alpha-14, Interferon alpha-16, Interferon alpha-17, Interferon alpha-21, Interferon beta, Interferon beta-1a, Interferon beta-1b, Interferon beta, Interferon delta, Interferon gamma, Interferon epsilon, Interferon kappa, Interferon ni, Interferon omega, Interferon tau oder Interferon zeta, oder ein Fragment eines solchen Interferons. Als illustratives Beispiel seien humanes Interferon gamma mit der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Nummer P01579 (wie am 13. Juni 2012, Version 146) und Rinder-Interferon gamma mit der UniProt-/Swiss-Prot-Datenbank-Nummer P07353 (wie am 16. Mai 2012, Version 105) genannt.
  • Eine weitere wichtige Rolle spielen Glykopeptide in der Antitumorimmuntherapie. Die Glykoproteine von Tumorzellen sind im Vergleich mit Glykoproteinen auf der Oberfläche von gesunden Zellen vielfach abweichend glykosyliert. Diese Glykopeptidfragmente von Membranglykoproteinen von Tumorzellen sind folglich als tumorassoziierte Antigene interessant für die Unterscheidung zwischen gesunden Zellen und Tumorzellen. Deshalb eignen sich diese tumorassoziierten Antigene insbesondere für die selektive Vakzinierung zur Behandlung verschiedenster Tumorerkrankungen. Daher können im Rahmen der vorliegenden Erfindung Glykopeptidfragmente aus Membranglykoproteinen als Zielproteine eingesetzt werden. Andererseits ist es, wie bereits oben erwähnt, im Rahmen der Erfindung auch möglich, z. B. lösliche Fragmente von Membranglykoproteinen, die das Tumorzell-typische Glykosylierungsmuster besitzen, als Prägeproteine für die Herstellung von tumorassoziierten Antigenen (Zielpeptide) zu verwenden.
  • Andere illustrative Beispiele für Zielpeptide sind Blutdruck-regulierende Peptide wie Angiotensin, Bradykinin, Substanz P/Tachykinine, AN F, Endothelin, Verdauungsregulierende Peptide wie Cholecystokinin, Gastrin, Sekretin, Glucagon, Insulin, Neuropeptide wie Neuropeptid Y, Neurotensin, Orexin, MSH oder Peptidhormone der Opioid-Familie wie Endorphine und Enkephaline sowie biologisch aktive Mutanten und Fragmente dieser Peptide.
  • Der Begriff „Nukleinsäure” betrifft, wenn hier verwendet, jedwede Nukleinsäure in jeder möglichen Konfiguration, wie z. B. einzelsträngig, doppelsträngig oder eine Kombination daraus. Zu Nukleinsäuern zählen DNA-Moleküle, z. B. genomische DNA oder cDNA, RNA-Moleküle wie z. B. mRNA, Analoga von DNA oder RNA, die mittels Nukleotidanaloga oder durch chemische Nukleinsäuresynthese hergestellt sind, sowie z. B. PNA (engl. Protein nucleic acid). Eine Nukleinsäure kann natürlich nicht vorkommende Nukleotidanaloga enthalten oder an eine Affinitätsanhängsel („Tag”) oder Label gekoppelt sein. Zahlreiche Nukleotidanaloga, die enthalten sein können, sind dem Fachmann bekannt. Ein Nukleotidanalogon ist ein Nukleotid, das eine Modifikation an beispielsweise der Basen-, der Zucker- und/oder der Phosphatgruppe aufweist. Zur Veranschaulichung sei als Beispiel genannt, dass bekanntermaßen eine Substitution von 2'-OH-Resten von siRNA mit 2'F-, 2'O-Me- oder 2'H-Resten die in vivo-Stabilitt der betreffenden RNA erhöht. Zu Modifikationen an der Basengruppe zählen natürliche und synthetische Modifikationen von A, C, G und T/U, verschieden Purin- oder Pyrimidinbasen wie Uracil-5-yl, Hypoxanthin-9-yl, und 2-Aminoadenin-9-yl, sowie Nicht-Purin- oder Nicht-Purin-Basen. Andere Nukleotidanaloga dienen als universelle Basen. Zu universellen Basen zählen beispielsweise 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol. Universelle Basen sind in der Lage, mit jeder Base ein Basenpaar zu bilden. Oft können Basenmodifikationen mit beispielsweise einer Zuckermodifikation, z. B. 2'-O-methoxyethyl, kombiniert werden, beispielsweise um einzigartige Eigenschaften wie eine verbesserte Duplexstabilität zu erreichen.
  • In der Regel enthält das Zielpeptid eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, inklusive zwei, drei, vier oder mehr Glykosylierungsstellen. Eine Glykosylierungsstelle kann eine im Zielpeptid natürlich enthaltene Glykosylierungsstelle oder eine künstlich generierte Glykosylierungsstelle sein. Eine Glykosylierungsstelle läßt sich künstlich generieren, wenn eine Aminosäureabfolge bekannt ist, die eine Aminosäureseitenkette, die bewirkt, dass eine Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe in der Seitenkette einer Aminosäure des Zielpeptids glykosyliert wird. Solche Sequenzen sind insbesondere für N-Glykosylierungen bekannt (s. u.). Das Glykosylierungsprofil der Glykosylierungsstelle(n) des Zielpeptids wird durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gesteuert. Dabei kann es sich um jeden Bereich des Zielpeptids handeln, der sich in vitro und/oder in vivo glykosylieren läßt. Die Begriffe „Glykosylierung”, „Glykosylieren”, „Glykosylierungsstelle” und „Glykosylierungsprofil” beziehen sich dabei allgemein auf die kovalente Verknüpfung einer Peptidsequenz mit einer Kohlenhydratgruppe, bei der es sich üblicherweise um ein Monosaccharid oder um eine Mehrzahl von kovalent miteinander verknüpften Monosaccharid-Einheiten handelt. Die kovalent miteinander verknüpften Monosaccharid-Einheiten bilden dabei eine Kette, die ein- oder mehrfach verzweigt sein kann. Eine solche Kette definiert ein Oligo- oder ein Polysaccharid und wird auch als Glykan bezeichnet. Die kovalente Verknüpfung eines Mono- oder Oligosaccharids mit einem Protein gehört neben Phosphorylierungen zu den wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eines Proteins und wird vom Fachmann als Glykosylierung bezeichnet. Mehr als die Hälfte der biologisch wichtigen Proteine und der Hauptteil aller Serumproteine beim Menschen sind glykosyliert. Die Glykane haben dabei einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften und Funktionalität der Proteine.
  • Glykosylierungen lassen sich nach Art der Verknüpfung des Glykans mit dem Protein klassifizieren. Am häufigsten erfolgt die Proteinglykosylierung über eine N- oder O-glykosidische Bindung zwischen einer Aminosäure und dem Glykan. So werden bei der N-Glykosylierung die Glykane typischerweise über ein N-Acetylglucosamin (GlcNAc) mit der Amidgruppe der Seitenkette eines Asparagins verknüpft, wenn das Asparagin Bestandteil der Aminosäuresequenz Asn-X-Ser/Thr ist. Innerhalb dieser Konsensussequenz kann die Position X von jeder Aminosäure mit Ausnahme von Prolin eingenommen werden. Dies bedeutet, dass für die Prägung durch ein Prägeprotein, das eine N-Glykosylierung aufweist, im Rahmen der vorliegenden Erfindung diese für N-Glykane spezifische Konsensussequenz N-X-Ser/Thr entsprechend in ein Zielpeptid eingefügt werden kann oder aber auch in diesem Zielpeptid verschoben werden kann. Eine O-Glykosylierung kann über die Bindung von N-Acetylgalactosamin (GalNAc) an die Hydroxylgruppe der Seitenketten von Serin (Ser) oder Threonin (Thr) stattfinden. Für diese Art der Glykosylierung ist bislang keine Konsensussequenz bekannt. Es ist jedoch beobachtet worden, dass das Vorhandensein eines Prolinrests entweder –1 oder +3 relativ zu einem Serin oder Threonin die O-Glykosylierung begünstigt. Auch lässt sich vom Fachmann leicht durch Expression eines entsprechenden Zielpeptids überprüfen, ob eine zuvor identifizierte Glykosylierungsstelle nach wie vor glykosyliert wird. Eine O-Glykosylierung kann des Weiteren über die Bindung einer Mannose-Einheit an ein Serin oder ein Threonin eingeleitet werden, an die ein N-Acetylglucosamin, ein N-Acetylgalactosamin und eine Galaktose angefügt werden können. Neben der N-Acetylgalactosamin-Verknüpfung und der Mannose-Verknüpfung sind weitere Beispiele für eine O-Glykosylierung eine Fucose-Verknüpfung und eine Glucose-Verknüpfung. Auch für diese Glykosylierungen sind bislang keine Konsensussequenzen bekannt, allerdings liegt es auch im Wissen des Fachmanns eine für diese Glykosylierungsmuster verantwortliche Sequenz nach ihrer Identifizierung in eine Zielpeptide einzuführen. So, sind z. B. neben Serin- und Theronin-Resten auch Tyrosinreste geeignete Positionen, an denen eine z. B. O-Glykosylierung erfolgen kann.
  • N-Glykane können trotz einer Vielzahl an potenziell möglichen Strukturvarianten, bedingt durch die Vielfalt der Monosaccharidbausteine sowie deren Verknüpfungsmöglichkeiten, in drei Grundtypen eingeteilt werden, die in 22 schematisch widergegeben sind: dem High-Mannose-Typ, dem komplexen Typ sowie dem Hybrid-Typ. Ihnen allen liegt ein gemeinsames Pentasaccharidgerüst (Core-Struktur) zu Grunde. Hierbei handelt es sich um eine einfach verzweigte Kette, die aus der Abfolge von zwei N-Acetylglucosamin-(GlcNAc) und einem sich anschließenden Mannosemolekül besteht, an das zwei Mannosemoleküle gebunden sind.
  • Der High-Mannose-Typ zeichnet sich dadurch aus, dass den endständigen Mannoseresten der Core-Struktur weitere Mannosen hinzugefügt werden. Der vorwiegend in Säugetierzellen gebildete komplexe Typ hingegen weist andere Monosaccharid-Einheiten auf, die mit beiden endständigen Mannoseresten der Core-Struktur verknüpft sind. Der komplexe Typ weist also nur in der Core-Struktur Mannosen auf, wobei die α-Mannose-Reste mit je einem GlcNAc verknüpft sind. Der Hybrid-Typ vereint strukturelle Merkmale des High-Mannose- und Komplex-Typs. Darüber hinaus kann die Core-Struktur am endständigen N-Acetylglucosamin (GlcNAc) über eine 1,6-glykosidische Bindung um eine Fucose (Fuc) erweitert sein. Trägt der α-Mannose-Rest am C4-Atom ein zusätzliches GlcNAc, so liegt eine so genannte Bisecting-(halbierende)Struktur vor. Häufiger Bestandteil von komplexen Glykanen sind Sialinsäuren, negativ geladene Monosaccharide, die an die terminalen Zuckerreste gebunden sind.
  • Des Weiteren werden die N-Glykane entsprechend ihrer Antennarität unterteilt, wobei in der Natur bi-, tri-, und tetraantennäre Strukturen dominieren, vereinzelt aber auch mono- und pentaantennäre Strukturen auftreten können. 22 illustriert schematisch biantennäre und triantennäre Strukturen.
  • Die N-Glykosylierung von Proteinen ist ein kotranslationaler Prozess, der über mehrere Schritte sowohl im rauen Endoplasmatischen Retikulum (ER) als auch im Golgi-Apparat der Zelle erfolgt. Die hierfür notwendigen Monosaccharide liegen in ihrer aktivierten Form als Nukleotidzucker vor (UDP-GlcNAc, UDP-Glc, GDP-Man) und werden durch jeweils spezifische Glykosyltransferasen miteinander verknüpft.
  • Die Synthese eines Oligosaccharidvorläufers beginnt auf der zytosolischen Seite des ER und wird auf der luminalen Seite der ER-Membran fortgesetzt. Dort wird die Vorläuferstruktur Glc3Man9GlcNAc2 gebildet. Anschließend wird diese Struktur kotranslational auf die naszierende Polypeptidkette übertragen. Der Transfer des Oligosaccharidvorläufers auf den Asparagin-Rest der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr wird von einem membranständigen Oligosaccharyltransferase-Komplex (OST) vermittelt. Daraufhin findet eine umfangreiche Modifikation der Oligosaccharidstruktur statt, bei der sowohl einzelne Monosaccharide abgespalten als auch Monosaccharide angefügt werden. Damit einher geht die Faltung des Glykoproteins. Nur bei korrekt gefalteten Proteinen werden alle Glucosemoleküle und als letztes eine Mannose Einheit entfernt. Die Proteine können daraufhin das ER verlassen und werden im Golgi-Apparat der abschließenden Prozessierung unterzogen.
  • Unter den Begriff der N-Glykosylierung wird vorliegend auch eine Glykosylierung am Aminoterminus eines Proteins bzw. Peptids gefasst.
  • Die O-Glykosylierung erfolgt in Eukaryoten durch schrittweises Anfügen von Monosaccharid-Einheiten an Serin- oder Threoninreste der Peptidkette im Golgi-Apparat. Eine erste an eine Peptidkette angefügte Monosaccharid-Einheit eines O-Glykans ist ein N-Acetyl-galaktosamin. Es sind verschiedene Core-Strukturen bekannt. Die vier am häufigsten auftretenden Core-Strukturen sind gebildet durch a) Anfügen von Galaktose an die N-Acetylgalactosamin-Einheit, b) Anfügen von N-Acetylglucosamin, c) Anfügen sowie einer einzigen N-Acetyl-glucosamin-Einheit und d) Anfügen einer einzigen N-Acetylglucosamin-Einheit sowie einer zusätzlichen N-Acetylgalactosamin-Einheit.
  • Die rekombinante Herstellung eines Fusionsproteins aus dem Prägeprotein und dem Zielpeptid, ggf. inklusive einer dazwischen befindlichen Proteaseschnittstelle, kann mittels jedes geeigneten molekularbiologischen Verfahrens erfolgen. Üblicherweise kann eine Nukleinsäure, z. B. ein DNA-Molekül, mittels der Kombination von Restriktionsenzymen und Ligasen erzeugt werden, das für das gewünschte Fusionsprotein kodiert. Aus der das Fusionsprotein kodierenden Nukleinsäure lässt sich mit Hilfe eines geeigneten Expressionssystems das entsprechende Fusionsprotein gewinnen. In einigen Ausführungsformen kann die Sequenz, die das Fusionsprotein kodiert, in einem Vektor vorliegen. Ein entsprechender Vektor kann vorteilhafterweise einen Promotor enthalten, der darin wirksam ist, die Transkription im gewählten Expressionssystem zu initiieren.
  • Der Begriff „Vektor”, gelegentlich auch als Gentransfervehikel bezeichnet, betrifft ein Makromolekül oder einen Komplex von Makromolekülen, der ein Polynukleotid aufweist, das in eine Wirtszelle transferiert werden soll. Typischerweise ist ein Vektor ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges zirkuläres Nukleinsäuremolekül, das den Transfer einer Nukleinsäuresequenz in eine Zelle ermöglicht oder erleichtert. Im Allgemeinen kann ein Vektor in Zellen transfiziert werden und mit dem Zellgenom oder unabhängig davon repliziert werden. Ein zirkuläres doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül lässt sich durch Behandeln mit einem geeignetem Restriktionsenzym schneiden und dadurch linearisieren.
  • Ein entsprechendes Fusionsprotein kann beispielsweise auf rekombinantem Weg in einer Wirtszelle exprimiert werden, beispielsweise in einer eukaryontischen Wirtszelle oder in einer prokaryontischen Wirtszelle, die die erforderlichen Glykosylierungsenzyme enthält, z. B. in heterologer Form. Geeignete eukaryontischen Zellen können z. B. Zellen sein, die einem Säugetier entstammen wie bzw. einer Maus, einem Kaninchen, einer Ratte, einem Meerschweinchen, einem Hamster, einem Hund, einer Kuh, einem Schwein, einer Ziege, einem Schaf, einem Pferd, einem Rhesusaffem, einem Schimpanzen, einem Gorilla oder einem Menschen. Eine eukaryontischen oder prokaryontische Wirtszelle kann beispielsweise eine Zelle einer Zellinie sein. Ein illustratives Beispiel für eine eukaryontischen Zelllinie sind CHO-Zellen (engl. für Chinese Hamster Ovary) aus den Ovarien chinesischer Hamster.
  • Zur Expression in einer Wirtszelle kann eine das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure auf jedem geeigneten Weg in eine entsprechende Wirtszelle eingebracht werden. Zu geeigneten Techniken zählen beispielsweise das direkte Einbringen von z. B. DNA, beispielsweise über Transfektion, Liposomen-vemittelte Transfektion, Rezeptor-vermittelte Transfektion, Injektion, inklusive Mikroinjektion, Elektroporation, Kalziumphosphatpräzipitation, durch DEAE-Dextran gefolgt von Polyethylenglykol, direktes Beladen durch Schall, Mikroprojektilbeschuss, Bewegen mit Siliziumkarbidfasern, Agrobakterium-vermittelte Transformation, DNA-Aufnahme über Trocknen/Inhibition oder eine Kombination von vorangehenden Techniken.
  • Zur Expression in einer Wirtszelle kann eine das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure neben der Sequenz des Fusionsproteins geeignete Sequenzabschnitte aufweisen, die eine Expression des Fusionsproteins in der betreffenden Wirtszelle bewirken. Hierzu zählt insbesondere ein Promoter, d. h. eine Nukleinsäuresequenz, die zur Expression einer Gensequenz erforderlich ist. Promoterregionen sind von Organismus zu Organismus verschieden, geeignete Sequenzen für alle üblichen Expressionssysteme sind dem Fachmann jedoch bekannt. In Eukaryoten enthält eine Promoterregion beispielsweise neben dem Promoter, der die Initiation der RNA-Transkription lenkt, DNA-Sequenzen, die, wenn sie in RNA transkribiert sind, die Initiation de Protein-/Peptidsynthese signalisieren. Zu derartigen Bereichen zählen normalerweise die 5'-nicht-kodierenden Sequenzen, die an der Initiation der Transkription und Translation beteiligt sind, wie die TATA-Box, die Capping-Sequenz und die CAAT-Sequenz.
  • Bei der Expression des Fusionsproteins wird dieses glykosyliert, beispielsweise durch eine Glykosylierungsmaschinerie, heterolog oder homolog, z. B. in Golgi und Endoplasmatischem Retikulum. Das exprimierte Fusionsprotein kann in einigen Ausführungsformen, in denen es in einer Wirtszelle exprimiert wird, von selbiger sezerniert werden. Das Fusionsprotein wird dabei typischerweise in das Medium abgegeben, in der die Zelle kultiviert wird.
  • Wie bereits vorangehend erläutert, enthält das Fusionsprotein in einigen Ausführungsformen eine Spaltstelle für eine Protease. In einem Verfahren gemäß der Erfindung kann das glykosylierte Fusionsprotein durch die entsprechende Protease gespalten werden (vergl. oben). Dadurch werden Prägeprotein und Zielpeptid voneinander getrennt. Typischerweise kann das Fusionsprotein, bevor es mit der Protease in Kontakt gebracht wird, angereichert, isoliert oder gereinigt werden. Dazu können beispielsweise dem Fachmann bekannte Chromatographietechniken eingesetzt werden.
  • Zur Erfindung gehören auch neben Fusionsproteinen aus Prägeprotein und Zielpeptid, die gegebenenfalls über ein Verbindungspeptid miteinander verknüpft sind, auch Vektoren, die für diese Fusionsproteine kodieren sowie Vektoren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine geeignet sind. Ein Vektor, der zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Fusionsproteins geeignet ist, umfasst z. B. die Nukleinsäuresequenz eines gewünschten Prägeproteins sowie die kodierenden Sequenz einer gewünschten Peptidbindungsspaltstelle wie z. B. eine TEV-Spaltstelle. In einen derartigen Vektor kann ein gewünschtes Zielpeptid über vorgegebene Restriktionsschnittstellen hinter die kodierende Sequenz der Peptidbindungsspaltstelle kloniert werden. Nach der Klonierung des Zielpeptids hinter die Nukleinsäuresequenz der Peptidbindungsspaltstelle kann durch Expression des Fusionsproteins aus Prägeprotein und Zielpeptid in einer vorgegebenen Zelllinie, gefolgt von der Abspaltung und Reinigung/Isolierung des glykosylierten Zielpeptids auf sehr einfache Weise verschiedene Glykopeptid-Varianten eines Zielpeptids hergestellt werden. Ein in der vorliegenden Erfindung eingesetzter Kit kann somit neben einem Vektor, der zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Fusionsproteins geeignet ist auch eine entsprechende Zelllinie zur Expression des gewünschten Zielpeptids enthalten.
  • Näheres zu einzelnen Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. Die folgenden Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
  • AUSFÜHRUNGSBEISPIELE Klonierungen und Transfektionen
  • Klonierungen und Transfektionen wurden gemäß bekannter und etablierter Verfahren durchgeführt.
  • Ein typischer Reaktionsansatz für die Mutagenese-PCR ist in Tabelle 1 aufgeführt. Vor Zugabe der Plasmid-DNA wurde der Ansatz zunächst für 2 min auf 99°C erhitzt und auf Eis abgekühlt.
  • Die PCR wurde mit dem Mutagenese-PCR-Programm im Thermocycler durchgeführt. Tabelle 1: Reaktionsansatz Mutagenese-PCR
    Reagenz Volumen
    10 × Pfu-Puffer 2,5 μl
    10 mM dNTP-Mix 1,0 μl
    Oligonukleotid-Primer fw (5 μM) 1,0 μl
    Oligonukleotid-Primer rev (5 μM) 1,0 μl
    Plasmid-DNA (aus Minipräparation) 1,0 μl
    Pfu-Polymerase (5 U/μl) 1,5 μl
    MilliQ-Wasser (ad 25,0 μl) 17,0 μl
    RCR_Programm Mutagenese PCR
    Initiale Denaturierung 95°C 1 min
    Denaturierung 95°C 30 s 13 ×
    Primer_Anlagerung 50°C 30 s 13 ×
    Strangverlängerung 72°C 8 min 13 ×
    Finale Strangverlängerung 72°C 10 min
    Kurzzeitlagerung 4°C
  • Im Anschluss an die PCR wurde der gesamte Ansatz über eine NucleoSEQ-Säule (Machery & Nagel) gemäß Herstellerangaben durch Gelfiltration gereinigt. Die entsalzte DNA wurde daraufhin mit dem Enzym Dpnl verdaut.
  • Der Reaktionsansatz des Dpnl-Verdaus wurde entsprechend Tabelle 2 pipettiert und für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Verdau-Ansatz in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Tabelle 2: Reaktionsansatz Dpnl-Verdau
    Reagenz Volumen
    PCR-Ansatz 200 μl
    FastDigest Buffer 30 μl
    DpnI 1,5 μl
    MilliQ ad 30 μl 5,5 μl
  • Transformation und Retransformation von Plasmid-DNA in E. coli Um die Plasmid-DNA in E. coli-Zellen zu transformieren, wurde in diesem Beispiel die so genannte Hitzeschock-Transformation angewandt. Bei dieser Methode werden die zuvor mit der Plasmid-DNA versetzten und auf Eis inkubierten kompetenten Bakterienzellen kurzzeitig einer Temperatur von 42°C ausgesetzt, wodurch die Zellmembran der Bakterien vorübergehend durchlässig für die Plasmid-DNA wird.
  • 30 μl des Dpnl-Verdaus (Transformation) bzw. 0,5 μl der durch Mini-Präparation gewonnenen DNA (Retransformation) wurden zu 50 μl DH5α-Zellen gegeben und der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss an den Hitzschock (30 s bei 42°C) wurde die Zellsuspension wiederum für 2 min in Eis gekühlt, dann in 250 μl vorgewärmten LB-Medium aufgenommen und für 1 h bei 37°C leicht geschüttelt. 100 μl der Zellsuspension wurden nachfolgend auf einer ampicillinhaltigen LB-Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Präparation der Plasmid-DNA aus den gewachsenen Kolonien.
  • Die Isolation der Plasmid-DNA aus den Bakterienzellen erfolgte durch alkalische Lyse und anschließender Fällung der DNA mittels Isopropanol.
  • Zellbiologische Verfahren
  • Sämtliche zellbiologischen Arbeiten wurden unter einer sterilen Werkbank durchgeführt, wobei entweder steril verpackte Einmalartikel oder zuvor im Autoklaven bei 120°C im Wasserdampf sterilisierte Materialien verwendet wurden.
  • Die Kultivierung von HEK-293-Zellen wurden im Begasungsbrutschrank bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in Kulturmedium (DMEM mit 4,5 g/l Glucose; 2 mM L-Glutamin; 10% (v/v) FCS; 1 mM Natriumpyruvat; 100 U/ml Penicillin; 100 μg/ml Streptomycin; 100 μg/ml Zeocin) kultiviert. Die adhärent wachsenden Zellen wurden alle 3–4 Tage umgesetzt.
  • In HEK293-Zellen transfizierte Konstrukte (s. o.) wurden in zeocinhaltigem Medium selektiert, bis sie eine stabile Zellproliferation erlangten. Klonierte Plasmide wurden durch Lipofektion in HEK293-Zellen eingebracht und anschließend selektiert.
  • Gewinnung von rekombinantem A1AT-Fusionsprotein
  • Zur Gewinnung der A1AT-Konstrukte wurden die Zellen in serumfreiem Medium kultiviert, da Bovines Serumalbumin (BSA) des FCS mit einer dem A1AT ähnlichen Molekülmasse (66 kDa) die Analytik und Aufreinigung der A1AT-Konstrukte erschweren würde. Die Kultivierung der Zellen in AEM wurde im Batch-Verfahren durchgeführt. Vor Beginn der serumfreien Kultivierung wurden die Zellen 1:3 in Kulturmedium in Zellkulturschalen (⌀ 10 cm) umgesetzt und zwei Tage lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen nach Entfernung des Mediums dreimal mit 1 × PBS gewaschen und in AEM überführt. Unter den serumfreien Bedingungen wurden die Zellen zu Suspensionszellen. Die Zellen wurden vier Tage lang in Zellkulturflaschen im Begasungsbrutschrank kultiviert. Darauf folgte die Überführung in 250-ml-Erlenmeyerkolben und eine einwöchige Kultivierung im Inkubationsschüttler. Um die ins Medium sekretierten A1AT-Konstrukte zu isolieren, wurde die Zellsuspension zentrifugiert (20 min, 756 × g, 4°C) und der Zellkulturüberstand abgenommen. Dieser wurde bis zur Reinigung der Proteine bei –20°C gelagert.
  • Vor der Reinigung der Proteine wurde der Zellüberstand filtriert (Porengröße des Filters: 0,22 μm) und 1:1 mit MilliQ-Wasser verdünnt. Die Reinigung der Proteine erfolgte in einem ersten Schritt durch FPLC-Anionenaustauschchromatographie an SepharoseQ mit einem Gradienten von 0,5 × PBS (filtriert) zu 0,5 × PBS + 1 M NaCl (filtriert). Die Elution der Proteine wurde bei einer Absorption von 280 nm verfolgt und in 1-ml-Fraktionen aufgefangen. Diese wurden mittels SDS-Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung analysiert.
  • Es schloss sich eine FPLC-Gelfiltration an Superdex 200 (S200) 10/300 GL an, bei der als mobile Phase 0,5 × PBS (filtriert) eingesetzt wurde. Dazu wurden die Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie, in denen die A1AT-Konstrukte nachgewiesen werden konnten, vereinigt. Der Durchlauf wurde bei einer Absorption von 280 nm verfolgt und in 3-ml-Fraktionen aufgefangen. Diese wurden mittels SDS-Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung analysiert.
  • Enzymatische Freisetzung der Glykane durch PNGaseF
  • Für die Glykananalyse der A1AT-Konstrukte wurden die Glykane enzymatisch mit N-GlykosidaseF (PNGaseF) vom Protein abgespalten. PNGaseF ist eine Endoglycosidase, welche zwischen dem innersten GlcNAc des Glykans und dem Asparagin des Proteins spaltet. Das Glykan wird dabei in intaktem Zustand freigesetzt.
  • Vor dem Verdau wurden 300 μl der mittels Gelfiltration gereinigten Proteinlösung bis zur Trockne eingeengt und in 25 μl Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau wurde in den Detergenzien SDS und NP-40 und dem Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol durchgeführt (Inkubationsprotokoll, Tabelle 3). Tabelle 3: Inkuationsprotokoll für PNGaseF-Verdau
    Reagenz Volumen (μl)
    H2O 25 μl
    SDS (10%) 2 μl
    β-Mercaptoethanol 1 μl
    ⇒ 5°C, 5 min
    NP-40 20 μl
    H2O 52 μl
    PNGaseF (1 U/μl) 0,5 μl
  • Die Proteine wurden vor Zugabe des Enzyms bei 95°C für 5 min denaturiert. Die Inkubation erfolgte im Horizontalschüttler (37°C, 150 rpm, 16 h). Nach der Inkubation wurde die PNGaseF bei 95°C für 5 min deaktiviert.
  • Um die Detergentien nach Inkubation mit PNGaseF aus der Probe zu entfernen, wurde die Probe mit Calbiosorp-Kügelchen aus hydrophoben Harz, das organische Verbindungen in wässrigen Medien bindet, gereinigt. Dazu wurden die Kügelchen in ein Glasgefäß überführt und dreimal mit MilliQ-Wasser gewaschen. Zu 100 μl Probe wurden etwa 50 μl der Kügelchen gegeben und über Nacht bei 4°C im Überkopfschüttler invertiert. Nach der Entfernung von Calbiosorb wurde die Probe im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne eingeengt.
  • Zur Isolierung der Glykane wurde die Probe über eine C-18 Reversed-Phase-Säule gereinigt. Proteine binden aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen reversibel an die C18-Matrix, während freie Glykane keine Affinität besitzen und die Säule passieren.
  • Nach Äquilibrierung der Säule (mit 3 × 400 μl 80% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA und 3 × 400 μl 0,1% (v/v) TFA) wurde die Probe in 40 μl Wasser aufgenommen und mit 1% (v/v) TFA auf pH < 4 eingestellt. Die Probe wurde auf die Säule aufgetragen, woraufhin die Glykane mit 3 × 400 μl 0,1% (v/v) TFA heruntergespült wurden. Zur vollständigen Entsalzung wurde der gesammelte Durchlauf der C18-Säule direkt auf eine zuvor äquilibrierte (mit 3 × 400 μl 80% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA und 3 × 400 μl 0,1% (v/v) TFA) Graphit-Säule (Carbograph) aufgetragen. Die Glykane wurden mit 3 × 400 μl 25% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA eluiert.
  • Das gesammelte Eluat wurde im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mehrmals in MilliQWasser aufgenommen und wieder bis zur Trockne eingeengt, um die Probe zu neutralisieren.
  • Enzymatische Abspaltung des Zielpeptids vom Prägeprotein durch TEV-Protease
  • Die enzymatische Abspaltung der Zielproteine von A1AT erfolgte durch TEV-Protease, einer Cysteinprotease des Tobacco Etch Viruses (TEV). Die TEV-Protease erkennt die Aminosäure-Sequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly und hydrolysiert die Peptidbindung zwischen Glutamin und Glycin hochspezifisch. Der Verdau wurde in dem Detergenz NP-40 und dem Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol über Nacht bei 30°C mit einem Probenvolumen von 300 μl durchgeführt (Inkubationsprotokoll, Tabelle 4). Vor Zugabe des Enzyms wurden die Proteine durch Hitze denaturiert (95°C, 5 min). Tabelle 4: Inkubationsprotokoll des Verdaus mit TEV-Protease, Volumen (μl).
    Reagenz MALDI-TOF-MS In-Gel-Analytik ESI-Analyse
    Protein 300 30 100
    β-Mercaptoethanol (10%, v/v) 50 5 -
    NP-40 (10%, v/v) 50 5 -
    20 × TEV-Protease-Verdaupuffer 20 2 5
    DTT 3 0,3 1
    ⇒ Denaturierung: 5 min, 95°C; Abkühlen auf Eis
    TEV-Protease (10 U/μl) 4 2 3,5
  • Isolierung und Reinigung der Zielproteine mittels Gelfiltration
  • Nach ihrer Abspaltung von A1AT wurden die Zielproteine über eine Gelfiltration an Superdex 75 (S75) 10/300 GL isoliert. Hierzu wurden die TEV-Protease-Verdauansätze auf eine mit 1 × PBS (filtriert) äquilibrierte Säule aufgetragen und 1 × PBS (filtriert) gespült (Flussrate: 0,5 ml/min, Vol.: 65 ml). Das Eluat wurde bei einer Absorption von 280 nm überwacht und in 1-ml-Fraktionen aufgefangen. Diese wurden mittels SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung analysiert.
  • Diejenigen Fraktionen der Gelfiltration, in denen das Zielprotein aufgrund seiner Molekülmasse angenommen wurde, wurden mittels ZipTip entsalzt, wobei es sich um gefüllte Pipettenspitzen handelt, die analog zu Chromatographiesäulen behandelt werden und eine miniaturisierte Form von C-18 Reversed-Phase-Säulen darstellen.
  • Das ZipTip wurde 5 × mit 10 μl 80% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA und 5 × mit 10 μl 0,1% (v/v) TFA äquilibriert. Die Probe wurde mit 1% (v/v) TFA auf pH < 4 eingestellt und auf das ZipTip aufgetragen. Daraufhin wurde 5 × mit 10 μl 0,1% (v/v) TFA gewaschen. Die Elution der Peptide erfolgte mit 5 × 5 μl 50% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA. Die Eluate wurden im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne eingeengt.
  • Für die Analyse kleinerer Mengen an Expressionskultur wurde ein alternatives Verfahren zur Reinigung des Fusionsproteins und Zielpeptid-Abspaltung erprobt. Dabei wurde zunächst das A1AT-TEV-Protein über eine Immunpräzipitation (IP) vom Zellkulturüberstand abgetrennt. Das immobilisierte A1AT-TEV-Protein wurde direkt im Anschluss an die IP TEV-Protease verdaut, was eine einfache Trennung der GlykoTags vom A1AT ermöglichte. Nach kurzer Zentrifugation der Proben konnte der GlykoTag-haltige Überstand von den Sepharose-Kügelchen abgenommen werden.
  • Um den Erfolg des TEV-Verdaus zu bestätigen, wurden pro A1AT-TEV-Protein jeweils zwei IPs parallel durchgeführt. Ein Ansatz wurde dann mit der TEV-Protease versetzt, der zweite diente als unverdaute Kontrolle für die SDS-PAGE bzw. für die Western-Blot-Analyse.
  • Soweit nicht anders angegeben fanden alle Zentrifugationsschritte der IP unter folgenden Bedingungen statt: 1 min, 5000 rpm und RT.
  • Für die Immunpräzipitation wurden zunächst 30 μl ProteinA-Sepharose-Kügelchen mit 1 ml PBS vermischt und zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und der Waschschritt wiederholt. Anschließend wurde PBS in etwa dem gleichen Volumen wie ProteinA-Sepharose vorhanden war hinzugesetzt und gut vermengt. Von diesem Gemisch wurden 60 μl in ein neues Reaktionsgefäß überführt, 150 μl PBS sowie 3 μl des polyklonalen anti-A1AT-Antikörpers (Dako, Glostrup, Dänemark) hinzugefügt und der Ansatz im Überkopfschüttler inkubiert (1 h, RT). Daraufhin wurde zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen. Dem schlossen sich zwei weitere Waschschritte an, wobei nach dem ersten Waschen die ProteinA-Sepharose-Kügelchen mit PBS in 15-ml-Reaktionsgefäße überführt und danach wiederum zentrifugiert wurden. Im Anschluss erfolgte die Inkubation der ProteinA-Sepharose mit 10 ml Zellkulturüberstand im Überkopfschüttler (1 h, RT). Der Überstand wurde abzentrifugiert, die ProteinA-Sepharose in 1 ml einer Lösung aus 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl und 0,2% NP-40 aufgenommen und in 1-ml-Reaktionsgefäße überführt. Um niederaffine Proteine von der Sepharose zu entfernen, folgten weitere Waschschritte mit einer Lösung von 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl und 0,2% NP-40, einer Lösung von 10 mM Tris/HCl pH 7,5 sowie PBS-Puffer. Vor jedem Pufferwechsel wurde zentrifugiert. Im letzten Schritt wurde die Sepharose mit einer Hamilton-Pipette vollständig trocken gezogen und 30 μl PBS hinzugegeben.
  • Je nach IP-Ansatz gab es prinzipiell zwei weitere Vorgehensweisen: a) Zur Abspaltung der Zielpeptide wurde über Nacht ein TEV-Verdau bei 30°C durchgeführt (siehe Tabelle 5; IP-Ansatz 1). b) Zum Nachweis der Aufreinigung des A1AT-Konstruktes (Kontrolle) mittels SDS-PAGE und Western-Blot wurden 30 μl PBS zur ProteinA-Sepharose sowie 15 μl 4x-SDS-Probenpuffer hinzugegeben (IP-Ansatz 2). Tabelle 5: Ansatz TEV-Protease-Verdau nach IP
    Reagenz Volumen [μl]
    A1AT-ProteinA-Sepharose-Lösung in PBS 30,0
    β Mercaptoethanol (10% v/v) 5,0
    NP-40 (10% v/v) 5,0
    20x-TEV-Puffer 2,0
    DTT 0,3
    TEV-Protease 0,4
  • Der Verdauüberstand wurde am Folgetag nach kurzer Zentrifugation abgenommen und ZipTipC18 gereinigt (s. o.). 15 μl des Verdaus wurden abgenommen und nach Denaturierung (5 min, 95°C) zusammen mit den Kontrollen per SDS-PAGE und Western-Blot analysiert.
  • Analyse der sialylierten Zielproteine mittels MALDI-TOF-MS
  • Die isolierten und aufgereinigten Zielpeptide wurden – zunächst in ihrer sialylierten Form – mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Hierzu wurden 1 μl Probe und 0,5 μl Matrix (10 mg/ml Dehydroxybenzoesäure in 50% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA) auf eine Position des Metallträgers aufgetragen, bei RT trocknen gelassen und im Massenspektrometer Ultraflex III gemessen. Die Messung wurde im Negativ-Ionen-Modus durchgeführt. Als Standard wurde Pepmix eingesetzt.
  • Da bei der massenspektroskopische Messung im Positiv-Ionen-Modus meist stärkere Signale detektiert werden als im Negativ-Ionen-Modus, wurden die Glykane der Zielpeptide desialyliert und mittels ZipTip (vergleiche Isolierung und Reinigung der Zielproteine mittels Gelfiltration) aufgereinigt, bevor im Positiv-Ionen-Modus gemessen wurde.
  • Hierzu wurden die Glykane in 8 μl MilliQ-Wasser aufgenommen und nach Zugabe von 1 μl 5 M Natriumacetat, pH 5 mit 1 μl Sialidase (1 mU/μl) unter Schütteln inkubiert (37°C, 16 h). Am folgenden Tag wurde das Enzym durch kurzes Erhitzen (95°C, 5 min) deaktiviert.
  • Nach Inkubation mit Sialidase wurde die Probe mittels TopTip (Typ P2 Carbon) gereinigt und entsalzt. TopTip ist eine mit Graphit gefüllte Pipettenspitze, die als Chromatographiesäule fungiert. Nach jedem Auftrag auf die stationäre Phase wird die Pipettenspitze zentrifugiert, um den Durchlauf zu beschleunigen. Das TopTip wurde 2 × mit 10 μl 80% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA und 3 × 10 μl 0,1% (v/v) TFA äquilibriert. Die Probe wurde mit 1% (v/v) TFA auf pH < 4 eingestellt und auf die Säule aufgetragen. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1% (v/v) TFA wurden die Glykane mit 25% (v/v) Acetonitril + 0,1% (v/v) TFA eluiert. Das Eluat wurde im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne eingeengt.
  • Zur Analyse der desialylierten Glykane wurden die Proben (0,5 μl Probe und 0,5 μl Matrix (5 mg/ml Arabinosazon in 80% (v/v) Ethanol)) auf eine Position des Metallträgers aufgetragen, bei RT trocknen gelassen und im Massenspektrometer Ultraflex III im Positiv-Ionen-Modus gemessen. Als Standard wurde ein Dextran Hydrolysat eingesetzt.
  • Präparation von N-Glykanen aus Polyacrylamidgelen (In-Gel-Analyse)
  • Zur Analyse des Glykosylierungsstatus der A1AT-TEV-Proteine wurde zunächst eine SDS-PAGE durchgeführt, sowohl mit den gereinigten und konzentrierten Proteinen als auch mit den TEVProtease verdauten Proteinen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Blau gefärbt. Pro Bande wurden dreimal sieben Gelstücke ausgestanzt und in drei separaten Reaktionsgefäßen mit MilliQ-Wasser gesammelt. Die Proben wurden zunächst getrennt voneinander behandelt und die N-Glykane einer Proteinbande zur Erhöhung der Probenkonzentration für die massenspektrometrische Analyse später vereinigt.
  • Zunächst wurde das MilliQ-Wasser möglichst vollständig von den Gelstücken abgenommen und diese für 10 min mit 40 μl 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,1)/50% (v/v) Acetonitril überschichtet. Anschließend wurde die Phosphatpuffer/Acetonitril-Mischung entfernt, die Gelstücke mit 50 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,1) versetzt und für 30 min bei 37°C im Horizontalschüttler (150 rpm) inkubiert. Nach Abnahme des Überstands und 10-minütiger Inkubation mit 10 μl Acetonitril wurden die Proben erneut mit 50 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,1) unter den oben genannten Bedingungen inkubiert. Letztlich wurde die gesamte Waschphase von den entfärbten Gelstücken abgenommen und verworfen.
  • Die entfärbten Gelstücke wurden für 30 min im Umlufttrockenschrank mit einer Temperatur von 50°C getrocknet. Zur enzymatischen Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen dem Asparagin des Glykoproteins und des endständigen N-Acetylglucosamins des Glykans wurden 1 μl PNGaseF und 4 μl einer Lösung von 8 g/l Oktyl-D-β-glucopyranosid in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,1) zu jeder Probe gegeben und vorerst für 1 h bei 37°C im Horizontalschüttler (150 rpm) inkubiert. Anschließend wurden 10 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,1) hinzugegeben und der Reaktionsansatz über Nacht unter den oben genannten Bedingungen fortgesetzt.
  • Zur Extraktion der N-Glykane wurden zu einem PNGaseF-Ansatz 10 μl MilliQ-Wasser hinzugefügt und die Proben 30 min bei 50°C im Umlufttrockenschrank inkubiert. Im Anschluss wurde die N-glykanhaltige Extraktionsphase von den Gelstücken abgenommen. Alle Überstände, die aus Gelstücken ein und derselben Proteinbande stammen, wurden von nun an in einem Glasgefäß vereint.
  • Die Extraktion noch verbliebener N-Glykane erfolgte für 10 min mit 10 μl Acetonitril. Der Überstand wurde entfernt, die Probe mit 10 μl einer Lösung von 1 g/l Oktyl-D-β-glucopyranosid in 50 MilliQ-Wasser versetzt und für 30 min bei 50°C im Umlufttrockenschrank inkubiert. Nach Abnahme und Vereinigung der Extraktionsphase im Glasgefäß wurden wiederum 10 μl Acetonitril für 10 min hinzugeben, der Überstand abgenommen und 30 μl MilliQ-Wasser zu den Gelstücken pipettiert und für 30 min bei 37°C auf dem Horizontalschüttler für 30 min inkubiert. Dieser Extraktionsschritt wurde nochmals wiederholt, bevor schließlich die jeweils gesammelten Extraktionsphasen in der Vakuumzentrifuge vollständig eingeengt wurden.
  • Kapillarelektrophorese mit laserinduzierter Fluoreszenz-Detektion (CE-LIF)
  • In einem elektrischen Feld lassen sich N-Glykane entsprechend ihrer Größe und Struktur auftrennen. Diese Eigenschaft wird bei der Kapillarelektrophorese (Capillar Electrophoresis, CE) ausgenutzt. Es wurde ein Messgerät der Firma Beckmann Coulter mit einem Fluoreszenzdetektor verwendet. Für diese Art der Analyse mussten die N-Glykane am reduzierenden Ende mit dem Fluorophor 8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonat (APTS) versehen werden. Das Fluorophor APTS erfüllt hierbei zwei Aufgaben, zum einen erhöht es die Sensitivität der Detektion, die hier mittels laserinduzierter Fluoreszenz (LIF) durchgeführt wurde, und zum anderen erhält das N-Glykan drei negative Ladungen, die die elektrophoretische Trennung in der Kapillarelekrotophorese ermöglichen.
  • Die Fluoreszenz wurde bei 488 nm angeregt und die Emission bei 588 nm detektiert.
  • Die desialylierten und mittels Graphitspitzen gereinigten Proben (s. o.) wurden mit 100 pmol Maltose-Standard-Lösung versetzt und in der Vakuumzentrifuge eingeengt. Daraufhin erfolgte die Markierung des reduzierenden Endes mit APTS (Reaktionsansatz Tabelle 6) über Nacht bei 37°C auf dem Horizontalschüttler. Am nächsten Tag wurden pro Ansatz 21 μl MilliQ-Wasser hinzugefügt. Die Proben wurden bis zur CE-Messung bei –20°C gelagert. Tabelle 6: Reaktionsansatz APTS-Markierung
    Reagenz Volumen [μl]
    Markierungspuffer 3,0
    NaCNBH3 0,5
    APTS-Lösung 0,5
    Markierungspuffer: 15% Essigsäure in H2O/THF 1:1; NaCNBH3: 1 M NaCNBH3 in THF; APTS-Lösung: 10 mg APTS in 100 μl 15% Essigsäure
  • ERGEBNISSE
  • Es wurden A1AT-Konstrukte mit verschiedenen C-terminal an das Protein gebundenen Zielpeptiden exprimiert und auf ihre Glykosylierung hin untersucht. Vier der Zielpeptide enthielten N-Glykosylierungsdomänen, welche aus Proteinen mit eindeutiger oder besonders vielfältiger Glykosylierungsausprägung stammten. Es sollte ermittelt werden, ob die Glykane der Zielpeptide am beispielhaften Prägeprotein A1AT ihre natürlichen Strukturen bewahren oder ob sie durch das neue Proteinumfeld in ihrer Struktur beeinflusst werden. Dazu wurden für die Zielpeptide Domänen mit besonders verschiedenartigen Glykanstrukturen ausgewählt. Die Glykosylierungsdomänen stammten aus den Proteinen CD52 (Glykosylierungsstelle: Asn3), tPA (Asn117) und L-Selektin (Asn60) sowie aus A1AT (Asn271) selbst. Während CD52 an der Position Asn3 Strukturen mit großer Mikroheterogenität und tPA an Asn117 ausschließlich High-Mannose-Strukturen ausbilden, wurden an Asn60 in L-Selektin vor allem N-Glykane mit sulfatierten terminalen GalNAc-Resten gefunden. A1AT trägt an der Glykosylierungsstelle Asn271 komplexe diantennäre Glykane. Weiterhin wurde das synthetische Zielpeptid GlykoTag1.4tail (GT1.4t) untersucht, dessen Glykosylierungscharakter unbekannt war. Auch hier sollte ermittelt werden, ob das Zielpeptid mit einer für GT1.4t spezifischen Glykanstruktur ausgestattet wird oder ob das generierte Glykan mit denen der anderen Zielpeptide vergleichbare Strukturmerkmale aufweisen würde.
  • Zu Vergleichszwecken wurde das A1AT-Konstrukt K2 exprimiert, welches über eine TEV-Schnittstellensequenz verfügte, jedoch kein Zielpeptid besaß.
  • Die Klonierung der A1AT-TEV-GlykoTag-Konstrukte erfolgte in dem eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.1zeo, der ein Gen für Zeocinresistenz enthielt. Dies ermöglichte die Selektion der stabil transfizierten Zellen unter Zugabe des Antibiotikums Zeocin. 5 zeigt einen schematischen Aufbau der Expressionsplasmide und eine Übersicht über die C-terminalen Zielpeptide. 12 zeigt schematisch den Aufbau weiterer Konstrukte.
  • Kultivierung der HEK-293-Zellen
  • Die Kultivierung der A1AT-TEV-Zielpeptid-Konstrukte exprimierenden HEK-293-Zellen erfolgte in DMEM- und im serumfreien AEM-Kulturmedium (zur Expression). Die Zellen wiesen eine normale Proliferationsrate auf und lichtmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Zellen eine für HEK-Zellen natürliche Morphologie besaßen. Unter den Zellen mit unterschiedlichen Plasmiden waren dennoch Wachstums- und Konstitutionsunterschiede zu verzeichnen. Die Zellen, die die Konstrukte A1AT-TEV-N273 und A1AT-TEV-tPA exprimierten, teilten sich deutlich langsamer als die Zellen der anderen vier A1AT-Konstrukte.
  • Chromatographische Reinigung der A1AT-Konstrukte
  • Die Reinigung der A1AT-Konstrukte erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurden die A1AT-Konstrukte mittels Anionenaustauschchromatographie über eine SepharoseQ-Säule aus dem Zellüberstand aufkonzentriert. Alle A1AT-TEV-GlykoTag-Konstrukte eluierten in vergleichbaren Fraktionsbereichen und konnten erfolgreich isoliert werden. 2 zeigt beispielhaft ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel des Elutionsprofils von A1AT-TEV-GT1.4t. Im Durchfluss sowie in den Waschfraktionen läßt sich kein Konstrukt detektieren, was darauf hindeutet, dass die Proteine effektiv an die stationäre Phase gebunden haben.
  • Drei Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie, die den quantitativ größten Anteil an Protein aufwiesen, wurden vereinigt und mittels Gelfiltration (S200) gereinigt. 3 zeigt die Elutionsprofile der sechs A1AT-Konstrukte im Coomassie-gefärbten SDS-Gel.
  • Bei den Konstrukten A1AT-TEV-L-Sel, -GT1.4t und -tPA ist die Doppelbande bei 60 bzw. 67 kDa gut zu erkennen. A1AT-TEV-CD52 und -GT1.4t weisen relativ große Mengen des A1AT-Spaltprodukts auf.
  • In 4, die die aufgereinigten A1AT-Konstrukte in einem Coomassie-gefärbten SDS-Gel vergleichend nebeneinander darstellt, sind zwischen den Konstrukten deutliche Konzentrationsunterschiede zu sehen. Während A1AT-TEV-GT1.4t, gefolgt von -CD52, -tPA und K2 relativ starke Banden aufweist, konnten A1AT-TEV-N271 und -L-Sel offensichtlich nur in geringerer Menge gewonnen werden. Die Quantifizierung der aufgereinigten A1ATKonstukte mittels BCA-Assay bestätigte dies. Für A1AT-TEV-GT1.4t wurde eine mittlere Konzentration von ca. 400 μg/ml ermittelt. A1AT-TEV-CD52, -tPA und K2 wiesen eine mittlere Konzentration von ca. 100 μg/ml auf, während die Konzentrationen von A1AT-TEVL-Sel und -N271 sich auf unter 50 μg/ml beliefen.
  • Glykananalyse der A1AT-Konstrukte K2, N271, L-Sel, CD52, Gt1.4t und tPA
  • Zur Analyse aller Glykane der A1AT-Konstrukte wurden diese mittels PNGaseF enzymatisch abgespalten. Als Vergleich für die spätere Glykancharakterisierung wurden die Glykane von K2 ebenfalls abgespalten. 6 zeigt die A1AT-Konstrukte vor und nach der Inkubation im Coomasie-gefärbten SDS-Gel. Anhand der deutlichen Unterschiede in der Laufweite bei der elektrophoretischen Trennung („Bandenshifts”) und aufgrund der Schärfe der Banden der mit PNGaseF inkubierten Konstrukte ist anzunehmen, dass die Glykane nahezu vollständig abgespalten wurden. Die Konstrukte weisen nach Abspaltung der Glykane eine apparente Bande von ca. 50 kDa auf. Bei ca. 40 kDa ist eine weitere schwache Bande zu sehen, wobei es sich vermutlich um PNGaseF handelt (theoretische Masse: 36 kDa).
  • Zur Entfernung der Detergenzien, die zum Verdau mit PNGaseF eingesetzt wurden, wurden die Proben mit Calbiosorb behandelt. Mittels Analyse durch ein Coomassie-gefärbtes SDSGel stellte sich heraus, dass hierbei ebenfalls A1AT entfernt wurde (nicht gezeigt).
  • Die isolierten Glykane wurden desialyliert und mittels MALDI-TOF-MS analysiert.
  • 7 zeigt das im Positiv-Ionen-Modus aufgenommene Spektrum der Glykane der sechs A1AT-Konstrukte. Es zeigte sich, dass alle sechs Konstrukte ein nahezu identisches Glykanmuster aufweisen. Es konnte kein Unterschied zwischen der Glykosylierung der A1AT-Konstrukte mit den GlykoTags und K2 ausgemacht werden. Es wurden ausschließlich Massenpeaks für komplexe di-, tri- und tetraantennäre und in geringer Menge pentaantennäre Glykane mit Fucose und terminalen Sialinsäuren detektiert, wobei der Anteil der triantenären Glykane geringfügig überwog. Dies deutet darauf hin, dass die im Zusammenhang mit A1AT exprimierten GlykoTags dieselben Glykosylierungsstrukturen aufweisen wie A1AT und nicht die Strukturen der Glykosylierungsdomänen der Proteine, aus denen sie ursprünglich stammen.
  • Glykananalyse der Zielpeptide
  • Die Einfügung einer TEV-Protease-Schnittstelle zwischen A1AT und den Zielpeptid-Sequenzen sollte die spezifische Abspaltung der Zielpeptide ermöglichen, mit dem Ziel, die Glykane der Zielpeptide unabhängig von den natürlichen N-Glykanen von A1AT zu analysieren. Die Durchführung der Spaltung nach dem Protokoll des Herstellers (20 × TEV-Puffer, DTT) führte jedoch zu keiner (K2, N271, LSel) oder unvollständiger (CD52, GT1.4t, tPA) Abspaltung der Zielpeptide. Wurde als Detergenz statt SDS jedoch NP-40 (0,1% (v/v)) und als Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol (0,1% (v/v)) verwendet, so wurde das Fusionsprotein nahezu vollständig gespalten.
  • Die Isolierung der Zielpeptide erfolgte mittels Gelfiltration (S75). Die massenspektrometrische Untersuchung der mittels ZipTip aufgereinigten Fraktionen zeigte, dass die Zielpeptide von A1AT-TEV-CD52, -GT1.4t und -tPA erfolgreich isoliert werden konnten. Die Zielpeptide wurden mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Die 9 bis 11 zeigen beispielhaft die im Negativ-Ionen-Modus aufgenommenen Spektren. Nach Abzug der Masse der Peptide ergab die Auswertung der Spektren, dass die GlykoTags von A1AT-TEV-CD52, -GT1.4t und -tPA komplexe di-, tri- und tetraantennäre Glykane mit Core-Fucose und terminalen Sialinsäuren tragen, was mit dem Ergebnis der Gesamtglykananalyse der A1AT-Konstrukte übereinstimmt. A1AT-TEV-GT1.4t und tPA wiesen zudem pentaantennäre N-Glykane auf.
  • In-Gel-Analytik der A1AT-Konstrukte C-Man, TSR, RNaseB, Gt1.4t und K2
  • Für die In-Gel-Analytik wurde jedes Zielprotein sowohl TEV-Protease-verdaut als auch unverdaut eingesetzt. Vom TEV-Protease-Verdau und der konzentrierten Probe wurden jeweils 15 μl auf ein 10%-Gel aufgetragen und die Proteine per SDS-PAGE voneinander getrennt (13). Nach der Coomassie-Färbung konnten unter Verwendung des ExQuest-Spotcutters ausgewählte Proteinbanden aus dem Gel ausgestanzt werden. Diese wurden entfärbt und die N-Glykane durch Inkubation mit PNGaseF abgespalten.
  • Der Extraktion der N-Glykane aus dem SDS-Gel folgte die Desialylierung durch Essigsäure. Anschließend wurden die Massen im MALDI-TOF-MS bestimmt. Aus den 14 bis 16 ist zu entnehmen, dass alle A1AT-TEV-Proteine grundsätzlich gleiche Glykanstrukturen aufweisen wie A1AT-TEV-K2, jedoch mit Unterschieden in den Verhältnissen der detektierten N-Glykane. Es handelt sich um N-Glykane des komplexen Typs mit hauptsächlich bi-, tri- und tetraantennären Strukturen und einem sehr geringen Anteil an pentaantennären Strukturen. Weiterhin tragen fast alle N-Glykane Core-Fucose.
  • Die Hauptstruktur des A1AT-TEV-K2 (14) wurde aus dem triantennären, einfach fucosylierten Glykan (m/z 2174,7) gebildet. Weitere Hauptstrukturen sind bi- und tetraantennäre komplexe Glykane (m/z 1809,6 und 2539,9) mit einfacher Fucosylierung. Einen hohen Anteil an der Gesamtglykosylierung nimmt auch die Struktur mit dem m/z-Verhältnis 1850,6 ein. Diese konnte mittels Exoglykosidaseverdau und MS/MS-Analyse als biantennäre Struktur mit terminalen GalNAc zugeordnet werden. Bei m/z 2012,7 konnte eine biantennäre, einfach fucosylierte Glykanstruktur detektiert werden, die ein zusätzliches GlcNAc enthält. Dabei könnte es sich um eine Bisecting-Struktur handeln. Darüber hinaus treten in geringem Maße auch sowohl zweifach fucosylierte als unvollständig glykosylierte Strukturen auf.
  • Für A1AT-TEV-RNaseB (15) konnte ein dem A1AT-TEV-K2-Protein ähnliches N-Glykosylierungsmuster nachgewiesen werden, welches jedoch keine High-Mannose-Strukturen enthält. Hier überwiegen die biantennären Strukturen (m/z 1809,6). Tri- und tetraantennäre Strukturen sind etwa in gleichen Verhältnissen detektiert worden, während der Massenpeak bei 2012,7 hier im Vergleich zu A1AT-TEV-K2 wesentlich geringer ausgeprägt war.
  • Die Verteilung der Strukturen des A1AT-TEV-TSR (nicht gezeigt) weicht von der Verteilung bei A1AT-TEV-K2 ab. Hier konnten ebenfalls wiederum vor allem bi-, tri- und tetraantennäre Strukturen identifiziert werden, jedoch mit einer starken Tendenz zur Ausbildung von Strukturen mit einem zusätzlichen GlcNAc.
  • Im Massenspektrum von A1AT-TEV-GT1.4tail (16) wurden hauptsächlich tri- und tetraantennäre Strukturen nachgewiesen. Gegenüber dem Kontrollprotein A1AT-TEV-K2 konnten mit wesentlich geringerem Anteil biantennäre Strukturen detektiert werden.
  • Für eine indirekte Analyse der Glykosylierung der GlykoTags wurde die In-Gel-Analyse auch für die mit TEV-Protease verdauten rekombinanten Proteine durchgeführt. Die MALDI-TOF-MS-Spektren unterschieden sich nicht wesentlich von den bereits hier aufgeführten für die unverdauten Proteine, was darauf hindeutet, dass die N-Glykane der RNaseB- und GT1.4tail-GlykoTags die gleichen Strukturen aufweisen, wie die natürlichen N-Glykane des A1ATs (Daten nicht gezeigt).
  • In-Lösung-Analyse der A1AT-Konstrukte C-Man, TSR, RNaseB, Gt1.4t und K2
  • Der Erfolg der Deglykosylierung konnte anhand einer SDS-PAGE nachvollzogen werden (17), da die Proteine nach Abspaltung der N-Glykane keine Verzögerung mehr im Gel erfahren.
  • Für alle Proteine ist nach Inkubation mit PNGaseF eine deutliche Abnahme der apparenten molekularen Masse zu erkennen. A1AT-TEV-RNaseB sowie A1AT-TEV-TSR separieren nach Verdau in zwei Banden bei etwa 60 kDa sowie 50 kDa, A1AT-TEV-K2 und A1AT-TEV-GT1.4tail sogar in drei oder mehrere Banden um 50 kDa. Dies könnte auf eine unvollständige Deglykosylierung oder beginnende Proteindegradation zurückzuführen sein. Nach PNGaseF-Verdau besitzen alle Proteine mit Ausnahme von A1AT-TEV-K2 apparente Molekularmassen von etwa 60 kDa. Die Masse von A1AT-TEV-K2 liegt auf Grund des geringeren Gehalts an Aminosäuren in der Primärsequenz erwartungsgemäß unter den Massen der anderen Proteine. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Differenz in der Molekularmasse von A1AT-TEV-K2 und den anderen Proteinen viel größer als die theoretische von etwa 2 kDa ausfällt.
  • In allen vier Ansätzen ist bei 37 kDa eine Bande zu erkennen. Bei dieser handelt es sich wahrscheinlich um PNGaseF, die eine theoretische Molekularmasse von 36 kDa besitzt.
  • Nach Desialylierung und Entfernung der im Verdauansatz befindlichen Detergenzien wurde eine MALDI-TOF-MS-Analyse der N-Glykane durchgeführt (18 bis 20).
  • Für alle Zielproteine wurden bi-, tri- und tetraantennäre N-Glykane des komplexen Typs detektiert, was die In-Gel-Analytik (s. o.) bestätigt. Hinsichtlich des Anteils der Strukturen ergaben sich Unterschiede zwischen den A1AT-TEV-Proteinen, die sich jedoch im Wesentlichen mit den Daten der In-Gel-Analytik decken. So wurden für A1AT-TEV-K2 ( ), A1AT-TEVRNaseB (19) und A1AT-TEV-Gt1.4tail (20) hauptsächlich bi-, tri- und tetraantennäre Strukturen nachgewiesen, wobei die tetraantennären Strukturen stärkere Intensitäten aufwiesen, als die Biantennären. Der Anteil der biantennären Struktur mit Bisecting-GlcNAc (m/z 2012,6) war für A1AT-TEV-K2 (18) nicht mehr so stark ausgeprägt wie in der In-Gel-Analytik (vgl. 14). Für A1AT-TEV-RNaseB konnten wiederum keine High-Mannose-Strukturen nachgewiesen werden ( ). Alle Zielproteine wiesen wie in der In-Gel-Analytik einen gewissen Anteil an bi-, tri- und tetra-Bisecting-Strukturen mit Core-Fucose auf. Mit Abstand das auffälligste Glykanmuster ergab die Analyse von A1AT-TEV-TSR ( ). Die bi- und triantennären Strukturen mit m/z 1809,6, 1850,6 sowie 2174,7 waren im Vergleich zu A1AT-TEV-K2 deutlich weniger gebildet worden. Dafür konnte eine Zunahme der bi-, tri- und tetraantennären Strukturen mit Bisecting-GlcNAc (m/z 2012,7, 2377,8 und 2743,0) nachgewiesen werden.
  • Analyse der A1AT-Konstrukte C-Man, TSR, RNaseB, Gt1.4t und K2 mittels Kapillarelektrophorese (CE-LIF)
  • Die massenspektrometrische Analyse der nach dem In-Gel-Protokoll extrahierten N-Glykane wurde durch Kapillarelektrophorese (CE) ergänzt. Diese hat den Vorteil, dass sich mit ihr Strukturisomere voneinander separieren lassen. Nach Desialylierung wurden die N-Glykane an ihrem reduzierenden Ende mit APTS markiert. APTS erhöht die Sensitivität der Detektion, die hier mittels laserinduzierter Fluoreszenz (LIF) durchgeführt wurde, und verleiht dem zu analysierenden N-Glykan drei negative Ladungen, die die elektrophoretische Trennung in der Kapillarelektrophorese ermöglichen.
  • Die in den Elektropherogrammen der CE-LIF-Analyse (21) detektierten N-Glykanstrukturen stimmen erwartungsgemäß mit denen der MALDI-TOF-MS-Analyse überein. So wurden wiederum ausschließlich bi-, tri- und tetraantennäre Glykane des komplexen Typs mit Core-Fucose identifiziert.
  • Des Weiteren konnten eindeutig Bisecting-Strukturen nachgewiesen werden: eine biantennäre nach 14,6–14,8 min, eine triantennäre bei 16 min sowie eine tetraantennäre bei 17,6 min. Die Bisecting-GlcNAc tragenden N-Glykane zeichnen sich gegenüber den antennären GlcNAc-Strukturen durch eine kompaktere Form aus.
  • Diskussion der N-Glykananalyse der A1AT-Proteine
  • Zur Analyse der N-Glykosylierungsmuster der Fusionsproteine wurden die N-Glykane mit der Endoglykosidase PNGaseF enzymatisch abgespalten. Die Deglykosylierung erfolgte entweder direkt aus der konzentrierten Proteinlösung (In-Lösung-Analyse) oder nach SDS-PAGE aus dem Gel (In-Gel-Analytik). Letztere hat den Vorteil, dass gezielt nur Banden mit dem entsprechenden Protein untersucht werden und somit der Anteil an N-Glykanen von verunreinigenden Proteinen in der Analytik reduziert wird. Nach Desialylierung wurden die Glykane massenspektrometisch und kapillarelektrophoretisch untersucht.
  • Für alle Fusionsproteine konnten N-Glykanstrukturen in der MALDI-TOF-MS (14 bis 16; 18 bis 20) und in der CE-LIF nachgewiesen werden. Kolarich et al. beschreiben für humanes A1AT an Asn46 und Asn247 vorrangig biantennäre Strukturen, während Asn283 eine hohe Mikroheterogenität mit bi-, tri- und tetraantennären Strukturen mit unterschiedlichen Sialylierungs- und Fucosylierungsgraden aufweist (Kolarich, D., et al. Proteomics (2006) 6, 3369–80). Dies stimmt mit denen in dieser Arbeit nachgewiesenen Strukturen für die Zielproteine überein. Sowohl in der In-Gel- als auch in der In-Lösung-Analytik wurden vorwiegend N-Glykane des komplexen Typs mit hohem Anteil an bi-, tri- und tetraantennären Strukturen mit einfacher Fucosylierung detektiert. In geringen Anteilen konnten auch pentaantennäre und mehrfach fucosylierte Strukturen identifiziert werden. Im Vergleich zum Kontrollprotein A1AT-TEV-K2 weichen die Glykosylierungsmuster der A1AT-Proteine nicht wesentlich voneinander ab. Lediglich in Bezug auf die relativen Intensitäten der Strukturen ergaben sich Unterschiede.
  • Prien et al. konnten für die bovine Ribonuklease B N-Glykane des High-Mannose-Typs idenffizieren, sodass diese Strukturen für den RNaseB-GlykoTag erwartet wurden (Prien, J. M., et al., J Am Soc Mass Spectrom (2009) 20, 539–56). In diesen Beispielen wurde jedoch für A1AT-TEV-RNaseB eine dem des Kontrollproteins A1AT-TEV-K2 ähnliche N-Glykanausstattung nachgewiesen. Mittels MALDI-TOF-MS konnten keine High-Mannose-Strukturen detektiert werden. Es konnte für verschiedene A1AT-Fusionsproteine gezeigt werden, dass die Glykanstruktur des Zielpeptids weitestgehend durch das Prägeprotein A1AT bestimmt wird. Mit A1AT-TEV-RNaseB konnte bestätigt werden, dass die Glykanausstattung vom Fusionsprotein und nicht von der einzelnen Glykosylierungssequenz im Zielpeptid abhängt. Eine Erklärung könnte in der Struktur des A1AT-TEV-Zielpeptid-Proteins zu finden sein. So bestimmt die Struktur eines Proteins die Zugänglichkeit des Oligosaccharids für Glykosyltransferasen und Glykosidasen während der abschließenden Prozessierung im Golgi-Apparat. Es kann sein, dass das A1AT-TEV-Zielpeptid-Protein während der Proteinfaltung eine Konformation einnimmt, die die Entstehung von komplexen N-Glykanen gegenüber High-Mannose-Strukturen begünstigt. SEQUENCE LISTING
    Figure 00370001
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195–197 [0053]
    • Kolarich, D., et al. Proteomics (2006) 6, 3369–80 [0157]
    • Prien, J. M., et al., J Am Soc Mass Spectrom (2009) 20, 539–56 [0158]

Claims (11)

  1. Verfahren zur Modifizierung des Glykosylierungsprofils einer in einem Zielpeptid enthaltenen Glykosylierungsstelle, wobei das Verfahren umfasst, ein Fusionsprotein aus einem Prägeprotein und dem Zielpeptid, das die vorgegebene Glykosylierungsstelle enthält, rekombinant herzustellen, wobei das Prägeprotein ein Glykoprotein mit mindestens einer im Glykoprotein enthaltenen Glykosylierungsstelle ist, und wobei bei der rekombinanten Herstellung die vorgegebene Glykosylierungsstelle des Zielpeptids im Wesentlichen das Glykosylierungsprofil des Prägeproteins erhält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in dem Zielpeptid enthaltene Glykosylierungsstelle eine natürliche Glykosylierungsstelle ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fusionsprotein eine Peptidbindungs-Spaltstelle aufweist, die zwischen dem Prägeprotein und dem Zielpeptid angeordnet ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fusionsprotein an der Peptidbindungsspaltstelle gespalten und das Zielpeptid vom Prägeprotein abgetrennt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, des Weiteren aufweisend: Anreichern des rekombinanten Fusionsproteins vor dessen Spaltung an der Peptidbindungsspaltstelle.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei im Fusionsprotein das Zielpeptid C-terminal zum Prägeprotein angeordnet ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die im Zielpeptid enthaltene mindestens eine Glykosylierungsstelle eine N-Glykosylierungsstelle und/oder eine O-Glykosylierungsstelle ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die rekombinante Herstellung aufweist: Exprimieren des Fusionsproteins in einer eukaryotischen Zelle.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Prägeprotein A1AT, L-Selektin, CD52 oder gewebespezifischer Plasminogenaktivator ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Zielpeptid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einen hämatopoetisch aktiven Peptid, einem Blutdruckregulierenden Peptid, einem Verdauungsregulierenden Peptid, einem Peptidhormon der Opioid-Familie, einem tumorzellassoziierten Glykopeptid sowie biologisch aktiven Mutanten und Fragmente dieser Peptide ausgewählt wird.
  11. Fusionsprotein und/oder lykosyliertes Zielpeptid, erhalten mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
DE201210105416 2012-06-21 2012-06-21 Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids Ceased DE102012105416A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201210105416 DE102012105416A1 (de) 2012-06-21 2012-06-21 Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201210105416 DE102012105416A1 (de) 2012-06-21 2012-06-21 Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102012105416A1 true DE102012105416A1 (de) 2013-12-24

Family

ID=49713655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE201210105416 Ceased DE102012105416A1 (de) 2012-06-21 2012-06-21 Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102012105416A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019043946A (ja) * 2017-08-31 2019-03-22 国立大学法人埼玉大学 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kolarich, D., et al. Proteomics (2006) 6, 3369-80
Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture *
Prediction, conservation analysis, and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites *
Prien, J. M., et al., J Am Soc Mass Spectrom (2009) 20, 539-56
Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019043946A (ja) * 2017-08-31 2019-03-22 国立大学法人埼玉大学 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TSUDA et al. The role of carbohydrate in recombinant human erythropoietin
JP6416738B2 (ja) エリスロポエチンの精製
JP4234647B2 (ja) 高い比活性を有するエリスロポエチン
US9689016B2 (en) Method for in vivo production of deglycosylated recombinant proteins used as substrate for downstream protein glycoremodeling
TWI604850B (zh) 藥學製劑
EP2513313A1 (de) Stoffe und verfahren zur behandlung von lysosomalen speicherkrankheiten
VOSS et al. Expression of human interferon ω1 in Sf9 cells: No evidence for complex‐type N‐linked glycosylation or sialylation
JP2018535964A (ja) 線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ）１アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置
Beintema et al. Differences in glycosylation pattern of human secretory ribonucleases.
KR102649603B1 (ko) 재조합 히알루로니다제의 생산 방법
US20190352365A1 (en) Expression construct and method for producing proteins of interest
KR20080026113A (ko) 적혈구생성 자극 단백질의 생산을 위한 재조합 방법
DE102012105416A1 (de) Modifizierung des glykosylierungsprofils der glykosylierungsstelle eines peptids
DE60033141T2 (de) Verfahren zum entfernen von den n-terminalen alaninresten mit aeromonas aminopeptidase
WO2000061727A2 (de) Herstellung von pankreatischer procarboxypeptidase b, isoformen und muteinen davon und ihre verwendung
CN108699530A (zh) 用于产生具有二触角n-聚糖的重组糖蛋白的细胞系、使用其的方法及重组糖蛋白
EP3932943A1 (de) Biologisch aktives rekombinantes pferde-choriongonadotropin (recg) und verfahren zur herstellung davon, tierärztliche zusammensetzung und verwendung
EP2847334B1 (de) Verwendung artifizieller forisomenkörper zur enzymimmobilisierung oder zur aufreinigung rekombinanter proteine
US20110135630A1 (en) Chemical modification of antibody fragments
WO2024068753A1 (en) Glycan-mediated protein degradation
DE102005011579B4 (de) Affinitätsmarker zur Proteinreinigung, seine Herstellung und Verwendung sowie Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins
CN113785071A (zh) 唾液酸化蛋白质的方法
KR20160117851A (ko) O-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R002 Refusal decision in examination/registration proceedings
R003 Refusal decision now final

Effective date: 20131220