JP2019043946A - 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、下記一般式(1)で表されるpH感受性色素化合物と担体結合部位を備えるリンカーを含む、分子精製用リガンドである。
WXXWXXWXXWXXWXX (3)
(上記式(3)中、Wはトリプトファンであり、Xは固定的に特定されないアミノ酸である。)
本発明は、上述したように、上記一般式(1)で表されるpH感受性色素化合物と担体結合部位を備えるリンカーを含む、分子精製用リガンドに関する。構成要素である(a)pH感受性色素化合物、(b)リンカー、及び(c)担体固定部位について、以下にそれぞれ説明する。
本明細書中、「pH感受性」とは溶媒等の外部環境のpHの変化により化学構造が変化する性質を有することを表し、「pH感受性色素化合物」とは、当該化学構造の変化に伴って呈色変化が生じる化合物を表す。
リンカーは、上記pH感受性色素化合物と、後述する担体結合部位との間に位置する直鎖状又は分岐鎖状化合物であり、リンカー結合部位で前記上記pH感受性色素化合物に結合されている。目的タンパク質の精製効率を上げるため、疎水性のpH感受性色素化合物に対しては親水性化合物をリンカーとして使用することが、担体表面の親水性を向上させ、また表面電荷を抑制する性質を有することから好ましい。
担体固定部位は、分子精製用リガンドを精製用の任意のビーズ又はレジン等の担体に結合させて固定化する部位である。アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、アジド基、アルキニル基、マレイミド基及びカルボキシル基などの反応性官能基を有する。これにより、所望の担体が有する官能基と特異的に結合できる。
本明細書中、「タグペプチド」とは、組み換えタンパク質に含まれ、特定のリガンドと結合及び解離するペプチドを表す。特に、本発明の分子精製用タグペプチドは、上記分子精製用リガンドのpH感受性色素化合物と結合及び解離する6〜8アミノ酸残基からなるペプチド(以下、「TP1」ということがある。)または配列番号25で示されるトリプトファンを5個含む15残基のペプチド(以下、「TP2」ということがある。)を表す。
DNAライブラリを構築する際、例えば、本発明のpH感受性色素化合物中に3つの芳香環を有することに着目し、π−π相互作用を考慮して芳香族アミノ酸を豊富に有するランダムペプチド配列を設計する。
cDNAディスプレイを作製する際に使用するリンカーは、特許第4318721号に開示されているリンカー、特開2013-39060で開示されているリンカー、WO2014/142020で開示されているリンカー等を使用することができるが、WO2016/159211に開示されているcnvKを利用した光架橋型リンカーであるcnvKリンカーを使用することが、セレクションサイクルを高速で行うことができる点で好ましい。
以下の3つのステップで、分子精製用タグペプチドのセレクションを行う。
(3−1)ステップ1:PhPリガンドと結合するcDNAディスプレイのセレクション
上記にようにして調製したcDNAディスプレイを、所望の担体に固定化させたPhPリガンドを詰めたカラムに通し、所望のセレクションバッファーで洗浄後、所望の温度で所望の時間インキュベートし、PhPリガンドとcDNAディスプレイを結合させる。
次いで、上記のセレクションで得られたPhPリガンドと結合するcDNAディスプレイを、所望のプライマーを用いて、所望のアニーリング温度で所望の時間PCRを行うことでフルコンストラクトのDNAを再生する。得られたPCR産物を用いて、上述したセレクションサイクルを所望の回数を行ったあと、得られたcDNAディスプレイを、所望の担体で固定化したPhPリガンドのカラムを通して、cDNAディスプレイとPhPリガンドを結合させる。
続いて、上記セレクションで得られたpH応答性タグペプチドに結合性を有するcDNAディスプレイを、再度所望のプライマーを用いて、所望のアニーリング温度で所望の時間PCRを行う。得られたPCR産物を用いて、上述したセレクションサイクルを所望の回数を行ったあと、得られたcDNAディスプレイを、所望の担体で固定化したPhPリガンドのカラムを通して、cDNAとPhPリガンドを結合させる。
上記セレクションによって得られた複数のcDNAディスプレイの中から、次世代シーケンサーを用いて各ペプチド配列を解析し、多くのペプチドに共通にみられる配列を抽出する。
3.76 gの40 mmol フェノールと、3.86 gの20 mmol 4−ニトロフタル酸無水物を10 mlのメタンスルホン酸に溶解させ、90℃で一晩撹拌した。反応後、反応溶液を室温まで冷却した後、氷水を加えて撹拌した。生じた沈殿物を、濾取して乾燥させた。残留物を、ヘキサン/酢酸エチルを展開溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。精製物を減圧濃縮して淡黄色固体を4.83 g得た。
実施例1で調製したPhPリガンドに、以下のレジン(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)と磁気ビーズ(NHS-Activated Magnetic Beads、Dynabeads MyOne Carboxylic Acid、及びNHS Mag Sepharose)を担体として用いて固相へ結合させた。反応には下記表1のバッファーを使用した。
MicroSpin Columnsに、300μlのNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(いずれも、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を入れて保存液を除いた。氷冷の1 mlの1 mM HClで洗浄し、300 nmolのPhPを混合した195μlのカップリングバッファーを加えて3時間撹拌した。
Protein LoBind Tube 1.5 ml(エッペンドルフ社製)に、50μlのNHS Mag Sepharose(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を入れ、氷冷の100μlの1mM HClで洗浄した。40 nmolのPhPを混合した30μlのカップリングバッファーを加え、4℃で一晩撹拌した。
Protein LoBind Tube 1.5 ml(エッペンドルフ社製)に、100μlのDynabeads MyOne Carboxylic Acid(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を入れ、100μlの25 mM MES buffer, pH 6で10分撹拌して洗浄を2回行う。洗浄後、50μlの200 mM N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及び50μlの200 mM 1‐エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を加え、室温で30分撹拌した。200μlの25 mM MESバッファー(pH 6)で2回洗浄し、40 nmolのPhPを混合した40μlの25 mM MESバッファー(pH 6)を加え、4℃で一晩撹拌した。
Protein LoBind Tube 1.5 ml(エッペンドルフ社製)に、100μlのNHS-Activated Magnetic Beadsを入れ、氷冷の100μlの1mM HClで洗浄し、40 nmolのPhPを混合した30μlのカップリングバッファーを加え、4℃で一晩撹拌した。
(1)PhPリガンドのpKa値
pH 7〜pH 12まで0.5刻みの0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液を用いて、実施例1で調製したPhPリガンドを1,000倍に希釈し、それぞれUV測定を行った。極大吸収波長554 nmにおける吸光度は、塩基性が強いほど増加することが示された(図2)。
実施例2で調製したレジン固定化PhPの吸光変化を観察した。その結果、当該レジンへ固定化後も、吸光変化が保持されることが確認された(図4)。
実施例2で調製した、分子精製用リガンドのレジン固定化PhPに結合する分子精製用タグ配列をcDNAディスプレイ法により取得するために、当該方法で必要となるDNAライブラリを以下のようにして3Aライブラリ、WIライブラリ及びSKVライブラリという、3つのDNAライブライブラリを考案した。
3Aライブラリは、ランダムアミノ酸8残基からなる芳香族アミノ酸を豊富に含むようデザインし、図5に示すアミノ酸の出現比率で設計した。具体的には、上記配列中のR, Y, Mをぞれぞれ(A, T, G, C)=(15, 40, 15, 30),(30, 30, 30, 10),(0, 33.3, 33.3, 33.3)となるようにした。
WIライブラリは、ランダムアミノ酸10残基にトリプトファンを規則的に5個導入できるようデザインし、図8に示すアミノ酸の出現比率で設計した。最初のPCRの際にプライマーにΩ-W-Random-BDAとcnvK NewYtag for poly Aを使用した以外、上記3Aライブラリと同じ条件でPCRを行い、WIライブラリのフルコンストラクトを調製した(図9)。当該フルコンストラクトの塩基配列を下記に示した(配列番号22)。
SKVライブラリは、ランダムアミノ酸10残基の両端に、セリン-リシン-バリン-イソロイシン-ロイシン-フェニルアラニン-グルタミン酸の配列を導入し、環状ペプチドを形成するようデザインした。この配列を両端に導入すると環状ペプチドを形成する事が報告されている(Marks et al., Chem. Biol., 11, 347-356 (2004))。
次に、2種類のextension産物を上記酵素を用いてアニーリング温度66℃、伸長時間10秒、15サイクルの条件でextensionした。
実施例4で調製した、3AライブラリとWIライブラリを用いて、cDNAディスプレイ法のセレクションサイクル(図11)により、それぞれのcDNAディスプレイを以下のように調製した。使用するバッファーは下記表3に記載した。
cnvK rG Linkerの構造を図12に示す。主鎖となるビオチンフラグメントの配列は下記配列番号9に記載された配列を有する。ここで、上記主鎖の5'末端にはBioTEGが結合しており、また、塩基配列中のgはグアノシン、VはAmino C6-dTを、Kは3-シアノビニルカルバゾールをそれぞれ表す。また、側鎖となるピューロマイシンセグメントは、5' (5S)TCTFZZCCの配列を有する。
B液:80%アセトニトリル
プログラム:A液とB液との組成比は、開始時のA液85%を45分かけて65%とするグラディエント
流速:1mL/分
分画:1mL
上記3Aライブラリ及びWIライブラリのコンストラクトDNAを、T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System(Promega社製)を使用し、添付されたマニュアルに従って転写した。使用したDNAは1stラウンドで5.3μg、2ndラウンド以降は1.32μgとした。得られた転写産物は、RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen社製)を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。
精製した20 pmol mRNA及び20 pmol cnvK rGリンカーに、NaCl(終濃度 0.2 M)及びTris-HCl(pH 7.5、終濃度 0.05 M)を加え、90 ℃で1分間インキュベートした。その後、0.1 ℃/秒の速度で70℃まで降温させ、70 ℃で1分間インキュベートした。次いで、0.02 ℃/秒の速度で25℃まで降温させ、2 ℃/秒の速度で10 ℃まで降温させ、cnvK rGリンカーをmRNAの3' 末端側にハイブリダイズさせた。
6 pmolのmRNA-リンカーを、50μLスケールの無細胞翻訳系(Rabbit reticulocyte Lysate (nuclease-treated)、Promega社製)を用いて、30 ℃で20分間インキュベートした。次いで、MgCl2及びKClをそれぞれ最終濃度75 mM、900 mMとなるように加えて37℃で1時間インキュベートし、mRNA-リンカー上のピューロマイシンにmRNAに対応するペプチドをディスプレイした。次いで、EDTA(pH 8.0)を最終濃度70 mM になるように加えて、37 ℃で5分間インキュベートし、mRNA-リンカーに結合しているリボソームを除去し、mRNAディスプレイを形成させた。
1×結合バッファーで洗浄済みのDynabeads MyOne C1 ストレプトアビジン(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製) 60μlに上記mRNAディスプレイをすべて加えて、冷却サーモブロックローテーター((株)日伸理化製、SNP-24B)を用いて、25℃で60分間撹拌した。100μlの1×結合バッファーで3回洗浄した後、100μlの1×ReverTraAce(登録商標)バッファー(東洋紡(株)製)で洗浄した。
20μlのHis Mag Sepharose Ni(GEヘルスケアサイエンス社製)を、100μlのHisタグ結合バッファーで洗浄し,上記のcDNAディスプレイサンプルをすべて加えて,25℃で2時間撹拌した。その後、100μlのHisタグ洗浄バッファーで洗浄し、Hisタグ溶出バッファー(20-40μl)を加えて室温で20分間撹拌し、cDNAディスプレイ(His tag溶出液)を回収した。
回収したcDNAディスプレイ(crude)、Hisタグ上清、His tag溶出液を10×NEバッファー2とRNase Hを用いて20μLスケールに調製し、37℃で30分間インキュベートした。またmRNAディスプレイ(IVV)、streptavidinビーズとIVVの反応後の上清(SA)、及びmRNAリンカーについてもサンプルを用意した。これらの泳動サンプルを2×SDS サンプルバッファーで40 μLスケールに調製し、8 M尿素を含む条件下(以下同じ)でSDS-PAGE電気泳動を行った。
興味のペプチド配列についてPhPリガンドとの結合を確認したい場合には、前述のcDNAディスプレイの簡易版としてペプチド・リンカー複合体を形成させて評価を実施する場合がある。この手順としては、Protein Lobind Tubeに、Dynabeads Myone streptavidin C1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を60μl入れ、100μlのセレクションバッファーで洗浄した後、上記(1)−(4)の方法で調製したmRNAディスプレイを加え、25℃で30分間撹拌した。200μlの結合バッファーで3回洗浄し、100μlのセレクションバッファーで洗浄した。洗浄後、39.8μlのセレクションバッファーと、0.2μlの1,000 U/μlのRNase T1とを加え37℃15分撹拌することによってリンカー複合体を得た。
(1)PhPリガンドと結合する分子精製用タグペプチドのセレクション
PhPリガンドと結合する分子精製用タグを取得するため、実施例5で取得した3Aライブラリから調製したcDNAディスプレイを用いて、セレクションの1stラウンドを以下の方法で行った。
上記、セレクションの1stラウンド後のcDNAディスプレイを用いて、pHに応答して結合及び解離するcDNAディスプレイのセレクションを行った。
上記6thラウンド後に取得したNaOH溶出画分を用いて、7thラウンドのセレクションを行った。7thラウンドでは、cDNAディスプレイ上の核酸によるPhPリガンドとの非特異結合を除くため、プロテイナーゼ Kを用いて、cDNAディスプレイ上のペプチドを分解した。その後、cDNAディスプレイを80 mM NaOHを使用して室温で10分間反応させた後に溶出を行った。得られたプロテイナーゼ溶出画分およびNaOH溶出画分を定量PCRで回収量を評価した(図17)。
上記7thラウンドのプロテアーゼ溶出画分に含まれるペプチド配列の解析は、次世代シーケンサー(MiSeq:イルミナ社製)を用いて、(株)ファスマックに依頼して行った。解析結果から共通する配列を有するペプチドを選び、実施例4及び5に記載の方法でcDNAディスプレイを調製し、実施例1で調製したPhPリガンドと反応させ、NaOH溶出画分のSDS-PAGE電気泳動を行った。
LV59タグペプチドを有するcDNAディスプレイを実施例5の方法で調製し、溶出時のpHを下記のように変化させたときの、当該タグペプチドとPhPリガンドとの親和性の検討を行った。
実施例8の実験では、実施例5の方法により作製した、BDAとLV59の融合ペプチドがディスプレイされたcDNAディスプレイによるPhPリガンドとの結合実験を行った。そこで、cDNAディスプレイとPhPリガンドとの親和性がBDAではなく、LV59に起因することを確認するため、別のペプチドとの融合ペプチドを用いて検討した。当該ペプチドには、PDO(POU specific DNA-binding domain of Oct-1)を用いた。
精製時の素通り画分の再使用と、PhPリガンドの再利用について検討を行った。
Protein Lobind Tubeに、実施例2で調製したビーズ固定化PhPリガンドを25μl加え、100μlの70%エタノール、100μl洗浄バッファー及び100μlセレクションバッファーで洗浄後、実施例4および5(8)に従った方法によって作製した38μlのLV59ペプチドのリンカー複合体を加え、室温で30分間撹拌した。素通り画分(1回目)を回収し、新しいビーズ固定化リガンド25μlをそこに加え、室温で30分間撹拌した。素通り画分(2回目)を回収した後、ビーズを100μlのセレクションバッファーで洗浄し、50 mM NaOHを加えて結合分子を溶出させた。1回目で用いたビーズからも同様に溶出を行った。その後、溶出画分のSDS-PAGEを行った。その結果、2回目の溶出画分においてもLV59のバンドが確認され、素通り画分(フロースルー:FT)からの再精製により目的タンパク質の回収量を上げられることが示された(図23)。
Protein Lobind Tubeに、実施例2で調製したビーズ固定化PhPリガンドを25μl加え、100μlの70%エタノール、100μl洗浄バッファー及び100μlセレクションバッファーで洗浄後、実施例4および5(8)に従った方法によって作製した38μlのリンカー複合体(LV59ペプチド)を加え、室温で30分間撹拌した。
溶出時におけるセレクションバッファーの塩濃度の変化によるLV59とPhPリガンドとの親和性を検討した。
実施例10と同様に調製したリンカー複合体をビーズ固定化PhPリガンドを用いて精製する際に、0 M、0.5 M及び4 MのNaClを含むセレクションバッファーを使用した。溶出方法及びSDS−PAGEは実施例10と同じ条件で行った。
(1)ライブラリ作製
実施例7〜11に示したように、PhPと結合-解離が可能なLV59ペプチドには、トリプトファン(W)が比較的多く含まれており、疎水相互作用及びπスタッキング(図26)による相互作用が親和性に寄与していると考えられた。このため、実施例4に記したWIライブラリを作製した。ライブラリの塩基配列は配列番号22の通りである。またアミノ酸配列は配列番号25の通りである。下記の配列中、Wはトリプトファンを、また、Xはランダムなアミノ酸を示す。このライブラリについてのIVV、cDNAディスプレイ及びHisタグ溶出物の形成効率については既に実施例5で述べたとおりである。
実施例6(1)と同じ条件で、WIライブラリについて1stラウンドのセレクションを行なった。SDSで溶出した1stラウンドでのセレクションの結果を図27Aに示す。図27Aより、フロースルーと洗浄とを比べると、洗浄の回数を重ねるについて標的のバンドは薄くなり、洗浄5以降は検出されなることが明らかになった。
これは、図27Aに示すように、PhPリガンドと結合していたcDNAディスプレイ分子は、SDSによって溶出されること、及び溶出の際にはcDNAディスプレイ分子が変性していることによるものと考えられた(図27B)。続いて、定量PCRを行なわなかった点を除き、上記実施例6(2)と同様の条件で2ndラウンドのセレクションを行った。
図28に示すように、ラウンドが進むについて、PhP(+)ビーズを使用したときのcDNAディスプレイの回収率は増加する傾向が見られ、7thラウンドでは、回収率が約8%と3rdラウンドのPhP(+)ビーズを使用したときと比べて、30倍以上高くなっていた。また、PhP(−)ビーズ(PhPリガンドを固定していない担体そのものをいう。以下同じ。)を使用したときには、回収量は低く1%未満であった。
以上のようにして得られたcDNAディスプレイ分子を、次世代シーケンサー(NGS)で分析したところ、PhPに特異的に結合する候補ペプチドとして、以下の配列を有するものが得られた。これらを上からPhP1-PhP10と命名した。
上記PhP1〜10をWIライブラリのランダム部分に導入したDNAを常法により作製し実施例5に従ってcDNA display化させたものをPhP(+)ビーズと室温で2時間インキュベートして結合させ、NaOH(50 mM)で溶出した。ビーズに添加した溶液と溶出液のSDSゲル電気泳動を行うことで、結合能を確認した。SDSゲル電気泳動は、4%スタッキングゲル−6%分離用ゲル、20mAで2時間の条件で行った。結果を図30A〜Cに示す。溶出物のバンドの濃さから、PhP3が最も高い結合効率を有することが明らかになった。またPhP6〜Ph9については有意な結合が確認できず、非特異的な増幅配列と考えられた。
実施例7で得られたLV59と、上記PhP3を用いて、上記(3)と同様の条件でcDNAディスプレイ分子を作製後、ビーズに結合・溶出させ、上記(3)と同じ条件でSDSゲル電気泳動に供した。結果を図31A〜Cに示す。PhP3とLV59との溶出物の量を比較したところ、結合に供したディスプレイ分子の量を100%としたときに、PhP3は32.3%、LV59は4.3%となり、PhP3の結合・溶出効率がLV59のそれよりも大幅に高いことが明らかになった(図31A)。
またPhP3をPhP(+)ビーズと、PhP(-)ビーズとを用いて溶出物中のPhP3の量を確認したところ、PhP(+)ビーズを使用した場合にのみ溶出されることが確認された(図31B)。
配列番号2:分子精製用タグペプチド配列
配列番号3:分子精製用タグペプチド配列
配列番号4:分子精製用タグペプチド配列
配列番号5:分子精製用タグペプチド配列
配列番号6:分子精製用タグペプチド配列
配列番号7:分子精製用タグペプチド配列
配列番号8:分子精製用タグペプチド配列
配列番号9:cnvKリンカーのビオチンフラグメント
配列番号10:PCR用プライマー
配列番号11:PCR用プライマー
配列番号12:PCR用プライマー
配列番号13:PCR用プライマー
配列番号14:PCR用プライマー
配列番号15:PCR用プライマー
配列番号16:PCR用プライマー
配列番号17:PCR用プライマー
配列番号18:PCR用プライマー
配列番号19:PCR用プライマー
配列番号20:PCR用プライマー
配列番号21:3Aライブラリのフルコンストラクト
配列番号22:WIライブラリのフルコンストラクト
配列番号23:SKVライブラリのフルコンストラクト
配列番号24:PCR用プライマー
配列番号25:WIライブラリのペプチド配列
配列番号26:WIライブラリから得られたペプチド配列(1)
配列番号27:WIライブラリから得られたペプチド配列(2)
配列番号28:WIライブラリから得られたペプチド配列(3)
配列番号29:WIライブラリから得られたペプチド配列(4)
配列番号30:WIライブラリから得られたペプチド配列(5)
配列番号31:WIライブラリから得られたペプチド配列(6)
配列番号32:WIライブラリから得られたペプチド配列(7)
配列番号33:WIライブラリから得られたペプチド配列(8)
配列番号34:WIライブラリから得られたペプチド配列(9)
配列番号35:WIライブラリから得られたペプチド配列(10)
Claims (16)
- 前記pH感受性色素化合物は、フェノールフタレイン、チモールブルー、チモールフタレイン、ナフトールフタレイン、フェノールレッド、クレゾールフタレイン、クレゾールレッド、ブロモフェノールブルー、ブロモチモールブルー、クロロフェノールレッド、ブロモクレゾールグリーン及びブロモクレゾールパープルからなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項1に記載の分子精製用リガンド。
- 前記pH感受性色素化合物は、フェノールフタレイン、チモールブルー、チモールフタレイン、ナフトールフタレイン、フェノールレッド、クレゾールフタレイン、クレゾールレッドからなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項2に記載の分子精製用リガンド。
- 前記リンカーは、ポリエチレングリコールリンカー、アルキルリンカー、核酸リンカー及びペプチドリンカーからなる群から選ばれる少なくとも一つのリンカーであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の分子精製用リガンド。
- 前記担体結合部位は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、アジド基、アルキニル基、マレイミド基及びカルボニル基からなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の分子精製用リガンド。
- 前記pH感受性色素化合物は、溶液が呈する色の変化によって検出可能な構造変化によって、分子精製用タグペプチドと結合又は解離することを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の分子精製用リガンド。
- 前記構造変化はpHの変化に対応することを特徴とする、請求項6に記載の分子精製用リガンド。
- 前記分子精製用タグペプチドと解離及び結合を繰り返すことができることを特徴とする、請求項6又は7に記載の分子精製用リガンド。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の分子精製用リガンドと結合することができる、下記一般式(2)のアミノ酸配列を含むアミノ酸残基が6〜8の分子精製用タグペプチド。
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (2)
(一般式(2)中、X1、X2、X5及びX6はそれぞれ独立して、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、バリン(V)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸であり、X3及びX4は任意の一のアミノ酸である。) - 前記アミノ酸配列が、LVFLIWWM(配列番号1)、YLYVWLWF(配列番号2)、WVIWILFF(配列番号3)、MWFFMFWM(配列番号4)、FWLWVYLY(配列番号5)、FFLIWIVW(配列番号6)、LLLLLLLL(配列番号7)及びWWWWWWWW(配列番号8)からなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項9に記載の分子精製用タグペプチド。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の分子精製用リガンドと結合することができる、下記の(3)式で表されるアミノ酸配列(配列番号25)を含む分子精製用タグペプチド。
WXXWXXWXXWXXWXX (3)
(式(3)中、Wはトリプトファンであり、Xは固定的に特定されないアミノ酸である。) - 前記アミノ酸配列が、WKIWYRWRKWKKWKR(配列番号26)、WKRWKVWRSWKKWRK(配列番号27)、WVLWAHWPWWRVWYR(配列番号28)、WHRWPDWAYWGIWRL(配列番号29)、WRSWGRWRLWQWWWD(配列番号30)、及びWKKWRRWFRWSLWRK(配列番号35)からなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項11に記載の分子精製用タグペプチド。
- 前記分子精製用リガンドと解離及び結合を繰り返すことができることを特徴とする、請求項9〜12のいずれかに記載の分子精製用タグペプチド。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の分子精製用リガンドと、前記分子精製用リガンドと結合可能な分子精製用タグペプチドを用いた、分子精製方法。
- 前記分子精製用タグペプチドは、請求項9〜12のいずれかに記載の分子精製用タグペプチドであることを特徴とする、請求項14に記載の分子精製方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の分子精製用リガンドと固定化用担体が結合した固定化リガンド、pH調整剤、洗浄バッファー及びセレクションバッファーを備える、分子精製用キット。
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