JP2016098198A - Ｄｎａライブラリの製造方法、ｄｎａライブラリ、スクリーニング方法及びスクリーニングキット - Google Patents

Abstract

【課題】ライブラリの多様性を確保できるＤＮＡライブラリの製造方法を提供する。また、ＤＮＡライブラリ、スクリーニング方法、及びスクリーニングキットを提供する。【解決手段】抗体をコードするＤＮＡを複数に分割した塩基配列からなる複数のＤＮＡ断片のうち、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を選別して回収する工程（ａ）と、少なくとも２つの前記ＤＮＡ断片を連結して前記抗体をコードするＤＮＡを形成する工程（ｂ）と、を備える、ＤＮＡライブラリの製造方法、プロモーター配列と、抗体をコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない核酸からなるＤＮＡライブラリ、ＤＮＡライブラリのスクリーニング方法及びスクリーニングキット。【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡライブラリの製造方法、ＤＮＡライブラリ、スクリーニング方法及びスクリーニングキットに関する。

新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサー等様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。

新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であった。しかし、より有用なタンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。

進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。

例えば、ピューロマイシンを有することを特徴とする、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質複合体作製用核酸リンカーが知られている。ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下では、リボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。上記の核酸リンカーはこの現象を利用するものである。

ところで、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ等）の血清中には、重鎖抗体と呼ばれる、軽鎖を持たない特殊な抗体が存在することが知られている。重鎖抗体の可変領域ドメインからなる抗体は、ＶＨＨ抗体と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量のものである。

例えば、ＶＨＨ抗体は大腸菌等を用いて簡便に合成でき、リフォールディング能が高く、熱変性にも強いため、産業応用の観点から次世代抗体として注目されている。したがって、リフォールディング能が高い、或いは熱変性に強い抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）のＤＮＡライブラリは産業上有用性が高い。また、非特許文献１のように、ＤＮＡライブラリを化学合成により製造する方法が知られている。

Cho. et al., Constructing High Complexity Synthetic Libraries of Long ORFs Using In Vitro Selection, J. Mol. Biol., 297, 309-319, 2000.

例えば抗体ライブラリ等のランダム化領域を含むＤＮＡライブラリを、化学合成等により製造する場合、アミノ酸のコドンを終止コドンに変えるナンセンス変異や、挿入や欠失等によりオープンリーディングフレームがずれてしまうフレームシフト変異が蓄積する。そうした結果、目的の長さのタンパク質をコードするライブラリメンバーの数や種類が少なくなり、ライブラリの多様性を十分に確保することができない場合がある。

そこで、本発明は、ライブラリの多様性を確保できるＤＮＡライブラリの製造方法、ＤＮＡライブラリ、スクリーニング方法、及びスクリーニングキットを提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、下記（１）〜（６）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様におけるＤＮＡライブラリの製造方法は、抗体をコードするＤＮＡを複数に分割した塩基配列からなる複数のＤＮＡ断片のうち、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を選別して回収する工程（ａ）と、回収した少なくとも２つの前記ＤＮＡ断片を連結して前記抗体をコードするＤＮＡを形成する工程（ｂ）と、を備える。
（２）本発明の一実施態様におけるＤＮＡライブラリは、プロモーター配列と、抗体をコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない核酸からなる。
（３）本発明の一実施態様におけるＤＮＡライブラリは、プロモーター配列と、アプタマーをコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、前記アプタマーをコードする塩基配列のうち前記アプタマーの相補性決定領域を除く領域は、システイン残基をコードするコドンを有しない。
（４）本発明の一実施態様におけるＤＮＡライブラリは、プロモーター配列と、第１のタグをコードする塩基配列と、抗体をコードする塩基配列と、第２のタグをコードする塩基配列と、核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列と、を備える。
（５）本発明の一実施態様におけるスクリーニング方法は、前記ＤＮＡライブラリを転写してｍＲＮＡを合成する工程（Ｓ１）と、前記ｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程（Ｓ２）と、前記タンパク質から、所望の活性を有するタンパク質を選択する工程（Ｓ３）と、を備える。
（６）本発明の一実施態様におけるスクリーニングキットは、前記ＤＮＡライブラリと、転写酵素と、無細胞翻訳系と、を備える。

本発明によれば、ライブラリの多様性を確保できるＤＮＡライブラリの製造方法、ＤＮＡライブラリ、スクリーニング方法、及びスクリーニングキットを提供することができる。

核酸リンカーの一実施態様を説明する図である。 ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の形成方法の一実施態様を説明する図である。 コドンの塩基配列が「ＮＮＮ」である場合と、「ＮＮＳ」又は「ＮＮＫ」（ＫはＧ又はＴを表す。）である場合において、終止コドンが出現しない確率を計算した結果を示すグラフである。 実施例に係るＶＨＨ抗体ライブラリの構造及び製造方法を説明する図である。 実施例に係るＶＨＨ抗体ライブラリの製造方法を説明する図である。 実施例に係るＤＮＡ断片５００ａの合成過程を説明する図である。 実施例に係る、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａの選別及び回収工程を説明する図である。

［ＤＮＡライブラリの製造方法］
一実施態様において、本発明は、ＤＮＡライブラリの製造方法を提供する。本実施態様に係るＤＮＡライブラリの製造方法は、抗体をコードするＤＮＡを複数に分割した塩基配列からなる複数のＤＮＡ断片のうち、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を選別して回収する工程（ａ）と、回収した少なくとも２つの前記ＤＮＡ断片を連結して前記抗体をコードするＤＮＡを形成する工程（ｂ）と、を備える。

後述するように、複数に分割して合成したＤＮＡ断片から、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないものを選別して回収し、回収した複数のＤＮＡ断片を互いに連結することにより、ライブラリメンバーが少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡライブラリを効率よく製造することができる。

本製造方法によって製造するＤＮＡライブラリは、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法に用いられるものであってもよい。例えば、ターゲット（例えば抗原）に結合可能な抗体のＤＮＡライブラリであってもよい。また、本実施態様のＤＮＡライブラリは、抗体をコードするＤＮＡだけでなく、例えば、アプタマー、タンパク質、ペプチド、酵素等をコードするＤＮＡライブラリであってもよい。この場合、例えば、上記のターゲットは、抗原だけでなく、アプタマー、タンパク質、ペプチドなどであっても良い。

また、本実施態様のＤＮＡライブラリが抗体のＤＮＡライブラリである場合、上記抗体は、ＶＨＨ抗体であってもよい。

上述したように、ＶＨＨ抗体は次世代抗体として注目されているため、ＶＨＨ抗体のＤＮＡライブラリは産業上有用性が高い。

ところで、天然のＶＨＨ抗体にはシステイン残基が２つ含まれており、分子内でジスルフィド結合を形成している。しかしながら、このようなＶＨＨ抗体を大腸菌等で製造する場合には、ジスルフィド結合形成のための工程を設ける必要が生じる。また、システイン残基の存在は、ＶＨＨ抗体の分子間会合を引き起こす原因ともなる。また、ＳＨ基を用いてＶＨＨ抗体を化学修飾する場合に、修飾対象のシステイン残基の選択や指向性を制御することは困難である。

したがって、ＶＨＨ抗体のような抗体を創薬や診断薬用ツールとして使用する観点から、上記の抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）は、相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しないものであってもよい。例えば、システインを有さない（Ｃｙｓｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ）ＶＨＨライブラリは、大腸菌での発現とｉｎ ｖｉｔｒｏリフォールディングとを容易にする。更に、ＶＨＨ抗体は、相補性決定領域にもシステイン残基を有しないものであってもよい。なお、本明細書において、相補性決定領域とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域ともいう。また、本明細書において、相補性決定領域を除く領域とは、フレームワーク領域、すなわち、抗体の可変領域のうち、保存性の高い領域を含む。

（ＤＮＡ断片の準備）
ＤＮＡ断片の準備方法は特に限定されず、例えば、ホスホロアミダイトで誘導体化されたヌクレオシドを固相上で順に結合させて、ＤＮＡ断片を化学的に合成するホスホロアミダイト法により化学合成してもよく、変異率の高い条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）を行うこと等により、鋳型ＤＮＡにランダムに変異を導入してもよい。

［ＤＮＡライブラリの製造方法の変形例］
一実施態様において、上記のＤＮＡライブラリの製造方法は、工程（ａ）が、分割したＤＮＡ断片をｍＲＮＡに転写する工程（ａ１）と、ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程（ａ２）と、ｍＲＮＡを翻訳して得られる生成物（タンパク質）とｍＲＮＡとが核酸リンカーを介して連結した複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）を形成する工程（ａ３）と、当該複合体のｍＲＮＡを逆転写し、ＤＮＡ断片を回収する工程（ａ４）と、を含むものであってもよい。

本実施態様によれば、上記のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のタンパク質が正しく翻訳されることを指標として、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないものを選別することができる。また、タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡが連結して複合体を形成しているため、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないタンパク質を選別して回収すれば、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡを回収することができる。また、当該ｍＲＮＡを逆転写することにより、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片を回収することができる。

後述するように、ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程（ａ２）は、ｍＲＮＡの３’末端と核酸リンカーの５’末端とをライゲーションする工程であってもよい。

［ＤＮＡライブラリの製造方法の変形例］
一実施態様において、工程（ａ１）は、抗体をコードするＤＮＡを複数に分割したＤＮＡ断片の塩基配列の３’末端に、ペプチドタグをコードする塩基配列及び核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列（リンカーハイブリダイゼーション配列）を付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を準備する工程（ａ１１）を含んでいてもよい。

ＤＮＡ断片にリンカーハイブリダイゼーション配列を付加することにより、ＤＮＡ断片を転写して得られたｍＲＮＡと上述した核酸リンカーとのライゲーション効率を向上させることができる。

後述するように、核酸リンカーの５’末端は、ＤＮＡ断片を転写して得られたｍＲＮＡの３’末端とライゲーションするものであるため、リンカーハイブリダイゼーション配列は、ＤＮＡ断片の塩基配列の３’末端に位置することが好ましい。したがって、ペプチドタグをコードする塩基配列及びリンカーハイブリダイゼーション配列は、ＤＮＡ断片の５’末端側から３’末端側に向かって、この順で並んでいることが好ましい。

後述するように、ＤＮＡ断片の塩基配列の３’末端に、ペプチドタグをコードする塩基配列を付加することにより、当該ペプチドタグが正しく翻訳されることを指標としてナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片を選別して回収することが可能になる。なお、本明細書において、「ペプチドタグ」を含む生体分子タグを「タグ」という場合がある。

（ペプチドタグ）
ペプチドタグとしては、特に制限されず、ヒスチジンタグ；ＦＬＡＧタグ；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質タグ等が挙げられる。

これらのペプチドタグ又はタグは、特異的に反応する抗体、特異的な酵素活性、特異的な担体への結合能、特定波長の蛍光を発する等の機能を有しており、目的に応じて使い分けることができる。

（核酸リンカー）
核酸リンカーとは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するためのリンカーを含む。核酸リンカーの一実施態様について、図１を用いて説明する。

図１において、核酸リンカー１００は、５’側にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２００の領域２１０の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分１１０と、前記タンパク質３００との連結部分１２０を３’末端に有するアーム部分１３０と、ｍＲＮＡ２００の３’末端との結合部位１４０と、を有し、これらが一本鎖を形成している。ｍＲＮＡ２００の領域２１０の配列は、核酸リンカー１００がハイブリダイズする塩基配列（リンカーハイブリダイゼーション配列）である。

図１中、Ｐｕはピューロマイシンを示し、ＡＴＣＧはＤＮＡ配列を示している。また、ＳＰＣはアーム部を構成するスペーサーを示し、ｒＧはＲＮＡ配列を示している。

ポリヌクレオチド部分１１０は、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）等の核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡであってもよい。

修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡ等、本技術分野において知られている修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。

アーム部分１３０は、ｍＲＮＡ２００とタンパク質３００との連結部分１２０とを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部１３０の５’末端は、ポリヌクレオチド部分１１０の３’末端と結合し、アーム部分１３０の３’末端はタンパク質連結部分１２０を有する。

アーム部分１３０の５’末端は、ポリヌクレオチド部分１１０の３’末端から数塩基５’側の位置でポリヌクレオチド部分１１０と結合し、Ｔ字型の構造を形成していてもよい。このような構造であれば、タンパク質３００をコードするｍＲＮＡ２００を逆転写させる必要がある場合には、ポリヌクレオチド部分１１０の３’末端を逆転写反応のプライマーとして機能させることができる。

３’末端を除くアーム部分１３０は、標識物質１５０により標識されていてもよい。標識物質１５０としては、例えば、ビオチン、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。

蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。

本実施形態の核酸リンカー１００は、アーム部分１５０が、標識物質１５０を、後述する切断部位１６０よりも、タンパク質３００との連結部分１２０側に有する。標識物質１５０で核酸リンカー１００を標識することにより、タンパク質３００を標識物質１５０で標識することができる。

アーム部１３０の３’末端にはタンパク質３００の連結部分１２０が存在する。連結部分１２０は、所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質３００のＣ末端に特異的に結合する性質を有するものであり、例えばピューロマイシンであってよい。

ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。連結部分１２０としては、伸張中のタンパク質３００のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、例えば、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）等のピューロマイシン誘導体を用いることができる。

ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。

ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。

ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）等が挙げられる。

アーム部１３０を構成するスペーサーＳＰＣは、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。アーム部１３０には更に、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾が付加されていてもよい。

本実施形態の核酸リンカー１００は、切断部位１６０として、１本鎖核酸切断酵素部位を、標識物質１５０の結合位置よりも５’側に含んでいる。切断部位１６０で核酸リンカー１００を切断することにより、標識物質１５０が結合したタンパク質３００を切り出すことができる。

１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ等の１本鎖核酸切断酵素により切断できる核酸基をいい、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。本実施形態においては、ＲＮａｓｅＴ１によって切断されるｒＧが用いられている。

切断部位１６０は、光切断性部位であってもよい。光切断性部位とは、紫外線等の光を照射すると切断される性質を有する基をいい、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（例えば、特開２００５−２４５２２３を参照。）等が挙げられる。光切断性部位としては、本技術分野において知られているいずれの基を用いてもよい。

本実施形態の核酸リンカー１００は、ｍＲＮＡ２００の３’末端との結合部位１４０を、ポリヌクレオチド部分１１０の５’末端に有する。結合部位１４０は、核酸リンカー１００の５’末端とｍＲＮＡ２００の３’末端とをライゲーション又はハイブリダイズ可能な部位であれば特に限定されず、例えば、図１に示すように、ｍＲＮＡ２００の塩基と相補的な塩基からなる部位（例えば、ｍＲＮＡ２００の３’末端がｐｏｌｙＡである場合には、ｐｏｌｙＡと相補的な塩基であるｐｏｌｙＴ）であってもよい。

結合部位１４０を有することにより、核酸リンカー１００とｍＲＮＡ２００との結合の安定度を増すことができる。

（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）
続いて、図２を用いてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の形成方法の一実施態様を説明する。

まず、ｍＲＮＡ２００と核酸リンカー１００とをアニールさせる。ｍＲＮＡ２００は、例えば、スクリーニングすべきタンパク質３００をコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得ることができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。上記のＤＮＡとしては、例えば、ＤＮＡライブラリを利用することができる。

続いて、ｍＲＮＡ２００の３’末端領域と核酸リンカー１００の５’末端領域とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡ２００を変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することにより、ｍＲＮＡ２００と核酸リンカー１００とをアニールさせることができる。

続いて、ｍＲＮＡ２００の３’末端と核酸リンカー１００の５’末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成する。ライゲーションに際し、ｍＲＮＡ２００の３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ等が挙げられる。

続いて、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ２００からタンパク質３００を合成する。すると、図２に示すように、タンパク質３００のＣ末端と核酸リンカー１００の連結部分１２０とが結合し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が形成される。

無細胞タンパク質翻訳系とは、適宜の細胞から抽出された、タンパク質合成能を有する成分を含むタンパク質翻訳系である。無細胞タンパク質翻訳系には、リボソーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な成分が含まれている。このような無細胞タンパク質翻訳系としては、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。

また、無細胞タンパク質翻訳系として、精製された、翻訳に必要な因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系も使用することができる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりも、ヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。

［ＤＮＡライブラリの製造方法の変形例］
一実施態様において、上記の工程（ａ４）、すなわち、回収したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のｍＲＮＡを逆転写し、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片を回収する工程は、回収したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のｍＲＮＡを逆転写し、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）を生成する工程（ａ４１）と、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片を有する複合体（ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）を、核酸リンカーに結合する担体と結合させて回収する工程（ａ４２）と、を含んでいてもよい。

工程（ａ４２）は、例えば、予め核酸リンカーにビオチン修飾を施しておき、ストレプトアビジンコートされた磁性粒子を上記ビオチンと結合させて、磁石で回収する方法等により実施することができる。この工程を行うことにより、例えば、核酸リンカーがライゲーションしていないｍＲＮＡ等の夾雑物を除去することができ、ＤＮＡライブラリの作成効率を向上させることができる。

［ＤＮＡライブラリの製造方法の変形例］
一実施態様において、上記の工程（ａ１１）は、抗体をコードするＤＮＡを複数に分割した前記ＤＮＡ断片の塩基配列の５’末端に前記ペプチドタグとは異なるペプチドタグをコードする塩基配列を更に付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を準備する工程を含んでいてもよい。

ここで、５’末端とは、５’末端近傍を含む。例えば、ＤＮＡライブラリにコードされる抗体遺伝子よりも５’末端側の領域であれば、５’末端でなくてもよい。

本実施態様に係るＤＮＡライブラリの製造方法において、例えば、３’末端のペプチドタグ又はタグは、正しく翻訳されることが、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片であることを示すものである。

５’末端に３’末端と同じペプチドタグを付加した場合、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有するＤＮＡ断片であっても、５’末端のペプチドタグが正しく翻訳されれば、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片に混入して回収されてしまう可能性がある。このため、５’末端と３’末端のペプチドタグは異なるものであることが好ましい。

５’末端に、３’末端のペプチドタグとは異なるペプチドタグを付加することにより、ペプチドタグを利用した抗体の精製や検出の選択肢を増やすことができる。なお、本明細書において、３’末端のペプチドタグを「第１のペプチドタグ」又は「第１のタグ」という場合がある。また、５’末端のペプチドタグを「第２のペプチドタグ」又は「第２のタグ」という場合がある。

５’末端のペプチドタグとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。例えば、ＤＮＡ断片の３’末端にヒスチジンタグをコードする塩基配列を付加し、５’末端にＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を付加してもよい。

例えば、Ｍ１モノクローナル抗体、Ｍ２モノクローナル抗体、Ｍ５モノクローナル抗体（いずれもシグマアルドリッチ社製）等の、ＦＬＡＧタグに特異的なモノクローナル抗体が知られている。これらのモノクローナル抗体は、タンパク質におけるＦＬＡＧタグの位置により反応性が異なる。例えば、Ｎ末端のメチオニン残基の直後に配置されたＦＬＡＧタグは、Ｍ５モノクローナル抗体と非常に高い結合強度で反応することが知られている。

したがって、上記のＤＮＡ断片は、翻訳された場合に、Ｎ末端がメチオニン残基であり、その直後にＦＬＡＧタグが配置されたタンパク質となるＤＮＡ断片であってもよい。本実施態様のＤＮＡ断片にコードされたタンパク質は、上記のＭ５モノクローナル抗体を用いて効率よく精製又は検出することができる。

［ＤＮＡライブラリの製造方法の変形例］
一実施態様において、上記の工程（ａ）は、分割されたＤＮＡ断片を更に２以上に分割した塩基配列からなる２以上のＤＮＡ断片を準備する工程（ａ１１１）と、２以上のＤＮＡ断片及び当該ＤＮＡ断片の分割部位を含む領域に相補的なＤＮＡ断片（添え木（スプリント）ＤＮＡ断片）をハイブリダイズさせる工程（ａ１１２）と、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片をライゲーション（スプリントライゲーション）し、分割前の塩基配列からなるＤＮＡ断片を生成する工程（ａ１１３）と、を備えるものであってもよい。

現在のオリゴＤＮＡの化学合成技術では、１００残基を超える長さのＤＮＡは、合成の質が著しく低下し、またコストも増大する傾向にある。

これに対し、本実施態様によれば、高品質で低コストに合成できる短いＤＮＡ断片を連結させることにより、全長の長いＤＮＡ断片であっても高品質で低コストに合成することができる。また、本実施形態によれば、ＤＮＡライブラリ製造工程における翻訳後の精製効率が高いため、ＤＮＡライブラリの高い多様性を維持できる。

本実施態様の方法によれば、単に１本鎖ＤＮＡ断片同士をライゲーションするのではなく、１本鎖ＤＮＡ断片同士を、これらの連結部分に相補的なＤＮＡ断片（スプリントＤＮＡ断片）とハイブリダイズさせ、部分的に２本鎖ＤＮＡを形成したうえでライゲーションするため、ライゲーション効率を格段に向上させることができる。

スプリントＤＮＡは、例えば、１本鎖ＤＮＡ断片の連結部分の前後２０ｍｅｒ程度ずつ、合計４０ｍｅｒ程度の長さであってもよく、融解温度（Ｔｍ）は、例えば６０℃程度であってもよい。後述する実験例において、スプリントライゲーションの具体的を示す。

［ＤＮＡライブラリ］
一実施態様において、本発明は、プロモーター配列と、抗体をコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない核酸（ライブラリメンバー）からなるＤＮＡライブラリを提供する。

本実施態様に係るＤＮＡライブラリは、ライブラリメンバーの多様性が高いため、有用である。

（プロモーター配列）
本実施態様に係るＤＮＡライブラリにおいて、プロモーター配列は、ＤＮＡライブラリをｍＲＮＡに転写するために用いるものである。プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが認識する塩基配列等を利用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列等が挙げられる。

上記のＤＮＡライブラリはＶＨＨ抗体のライブラリであってもよい。

本実施態様に係るＶＨＨ抗体のライブラリは、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないライブラリメンバーを含み、ライブラリメンバーの多様性も高いため、産業上有用性が高い。

上記のＶＨＨ抗体は、相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しないものであってもよい。例えば、上記のＤＮＡライブラリは、ＶＨＨ抗体をコードする塩基配列のうち相補性決定領域をコードする領域を除く領域に、システイン残基をコードするコドンを有しないものであってもよい。

更に、上記のＶＨＨ抗体は、相補性決定領域にもシステイン残基を有しないものであってもよい。また、例えば、本実施形態のＤＮＡライブラリは、抗体又はアプタマーをコードする塩基配列において相補性決定領域をコードする配列とフレームシフト領域をコードする配列とのうちフレームシフト領域をコードする配列にシステイン残基をコードするコドンを有しないものであってもよい。

上述したように、システイン残基を有しないＶＨＨ抗体は、大腸菌等で生産する場合においてもジスルフィド結合形成のための工程を設ける必要がない。ＶＨＨ抗体の分子間会合を引き起こさないため、取り扱いが容易である。また、ＳＨ基を用いてＶＨＨ抗体を化学修飾することも容易である。

本実施態様に係るＤＮＡライブラリにおいて、上記の核酸は、ペプチドタグをコードする塩基配列の３’側に、核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列（リンカーハイブリダイゼーション配列）を更に有していてもよい。

ライブラリメンバーのＤＮＡ断片がリンカーハイブリダイゼーション配列を有していることにより、ＤＮＡ断片を転写して得られたｍＲＮＡと核酸リンカーとのライゲーション効率を向上させることができる。

本実施態様に係るＤＮＡライブラリにおいて、上記の核酸は、プロモーター配列と、抗体をコードする前記塩基配列との間に、上記の３’末端側のペプチドタグとは異なるペプチドタグをコードする塩基配列を更に有していてもよい。

ペプチドタグとしては、上述したものが挙げられる。例えば、ＤＮＡ断片の３’末端側にヒスチジンタグをコードする塩基配列を付加し、５’末端側（抗体をコードする前記塩基配列との間）にＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を付加してもよい。

また、ＦＬＡＧタグは、翻訳された場合に、Ｎ末端のメチオニン残基の直後にＦＬＡＧタグが配置されたタンパク質となるように配置されていてもよい。このようなＦＬＡＧタグであれば、非常に高い結合強度で反応するＭ５モノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社製）を利用することができる。

［ＤＮＡライブラリの変形例］
一実施態様において、本発明は、プロモーター配列と、アプタマーをコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、前記アプタマーをコードする塩基配列のうち前記アプタマーの相補性決定領域を除く領域にシステイン残基をコードするコドンを有しない、ＤＮＡライブラリを提供する。

更に、上記のアプタマーは、相補性決定領域にもシステイン残基を有しないものであってもよい。

（アプタマー）
アプタマーとしては、例えば、アミノ酸が連結してなるアプタマーが挙げられ、ペプチドアプタマー、タンパク質アプタマー、抗体アプタマー、抗体断片アプタマー等が挙げられる。

本実施態様のＤＮＡライブラリは、目的の反応性を有するアプタマーをスクリーニングする対象として有用である。また、上記のアプタマーは、相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しないため、大腸菌等で生産する場合においてもジスルフィド結合形成のための工程を設ける必要がない。また、アプタマーの分子間会合を引き起こさないため、取り扱いが容易である。また、ＳＨ基を用いてアプタマーを化学修飾することも容易である。

［ＤＮＡライブラリの変形例］
一実施態様において、本発明は、プロモーター配列と、第１のタグをコードする塩基配列と、抗体をコードする塩基配列と、第２のタグをコードする塩基配列と、核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列と、を備える、ＤＮＡライブラリを提供する。

本実施態様のＤＮＡライブラリにおいて、第１のタグ及び第２のタグの機能は上述したものと同様である。すなわち、本実施態様に係るＤＮＡライブラリにおいて、第２のタグ（３’末端側のタグ）は、正しく翻訳されることが、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片であることを示すものである。

第１のタグ（５’末端側のタグ）と、第２のタグとは異なるものであってもよい。第１のタグと、第２のタグとが異なるものであれば、タグを利用した抗体の精製や検出の選択肢を増やすことができる。

第１のタグ及び第２のタグとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。例えば、第１のタグとしてＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を用い、第２のタグとしてヒスチジンタグをコードする塩基配列を用いてもよい。

［ＤＮＡライブラリを用いたスクリーニング方法］
本実施形態では、ＤＮＡライブラリを用いたスクリーニング方法であり、上記のＤＮＡライブラリを転写してｍＲＮＡを合成する工程（Ｓ１）と、ｍＲＮＡを翻訳してプレイ（ｐｒｅｙ）（例、タンパク質など）を合成する工程（Ｓ２）と、該プレイから、所望の活性を有するプレイを選択する工程（Ｓ３）と、を備える、ＤＮＡライブラリを用いたスクリーニング方法を提供する。
一実施態様において、本発明は、上記のＤＮＡライブラリを転写してｍＲＮＡを合成する工程（Ｓ１）と、ｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程（Ｓ２）と、タンパク質から、所望の活性を有するタンパク質を選択する工程（Ｓ３）と、を備える、ＤＮＡライブラリを用いたスクリーニング方法を提供する。

（ＤＮＡライブラリを転写してｍＲＮＡを合成する工程）
本工程において、ＤＮＡライブラリに適切な転写因子を反応させてｍＲＮＡを合成する。例えば、ＤＮＡライブラリに導入されていたプロモーター配列がＴ７プロモーターの塩基配列であった場合には、Ｔ７ファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを反応させるとよい。

（ｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程）
本工程において、上記のｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する。本工程は、例えば、上述した無細胞タンパク質翻訳系を用いて実施することができる。

（所望の活性を有するタンパク質を選択する工程）
本工程において、上記のプレイ（ｐｒｅｙ）（例、タンパク質など）の中から、所望の活性を有するものを選択する。所望の活性は、スクリーニングの目的に応じて適宜選択されるものであり、例えば、特定の標的分子（例、抗原、タンパク質、ベイトなど）に対する結合能であってもよく、特定の基質との反応性であってもよい。また、例えば、標的分子としては、特定の疾患マーカ、病気の予後マーカ、創薬マーカ、食品マーカなどであっても良い。

［ＤＮＡライブラリを用いたスクリーニング方法の変形例］
一実施態様において、本発明は、上記の工程（Ｓ１）の後に、ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程（Ｓ１１）を更に備え、上記の工程（Ｓ２）が、ｍＲＮＡを翻訳して得られるタンパク質とｍＲＮＡとが前記核酸リンカーを介して連結した複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）を形成する工程（Ｓ２１）と、ｍＲＮＡを逆転写して、ｍＲＮＡが逆転写されたｃＤＮＡと、ｍＲＮＡと、タンパク質とが、核酸リンカーを介して連結した複合体（ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）を形成する工程（Ｓ２２）と、を備え、上記の工程（Ｓ３）の後に、選択したタンパク質に連結したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して回収する工程（Ｓ４）を更に備える、ＤＮＡライブラリのスクリーニング方法を提供する。

（ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程）
本工程において、ｍＲＮＡの３’末端と核酸リンカーの５’末端とをライゲーションする。核酸リンカーとしては上述したものを使用することができる。ライゲーションに際し、ｍＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションには、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ等を利用することができる。

（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成する工程）
上記のｍＲＮＡを無細胞タンパク質翻訳系で翻訳すると、上述したように、タンパク質のＣ末端と核酸リンカーの連結部分とが共有結合し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が形成される。

（ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成する工程）
続いて、上記のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に逆転写酵素を作用させ、ｃＤＮＡを合成する。これにより、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成することができる。

（選択したタンパク質に連結したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して回収する工程）
上記のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を適宜のアッセイに供し、目的のタンパク質を回収すると、当該タンパク質と共にそのタンパク質のｃＤＮＡを回収することができる。したがって、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより、目的のタンパク質のｃＤＮＡを容易に得ることができる。

以下、ＤＮＡライブラリがＶＨＨ抗体ライブラリである場合を例に、本実施態様に係るスクリーニング方法について説明する。まず、後述する実験例における「ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａの選別及び回収」と同様の操作により、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作成する。本実施態様においては、上記のＤＮＡ断片５００ａに代えて、完成したＤＮＡライブラリを使用する。

本実施態様においては、作製されたｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体におけるタンパク質はＶＨＨ抗体である。次に、この複合体を目的の抗原に反応させ、目的の抗原に結合した複合体を回収するアフィニティー選択を行う。

アフィニティー選択の結果回収された複合体は、目的の抗原に結合するＶＨＨ抗体と、当該ＶＨＨ抗体をコードするｃＤＮＡを含んでいる。したがって、回収された複合体に含まれるｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより、目的の抗原に結合するＶＨＨ抗体をコードするｃＤＮＡを容易に得ることができる。

［スクリーニングキット］
一実施態様において、本発明は、上記のＤＮＡライブラリと、転写酵素と、無細胞翻訳系と、を備える、スクリーニングキットを提供する。

（転写酵素）
転写酵素は、ＤＮＡライブラリをｍＲＮＡに転写するものである。転写酵素は、ＤＮＡライブラリに導入されたプロモーター配列に対応するものを使用する。例えば、プロモーター配列がＴ７プロモーター配列である場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、プロモーター配列がＳＰ６プロモーター配列である場合には、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、プロモーター配列がＴ３プロモーター配列である場合には、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。

（無細胞翻訳系）
無細胞翻訳系としては、特に制限はなく、上述したものを適宜選択することができる。

［スクリーニングキットの変形例］
一実施態様において、上記のスクリーニングキットは、核酸リンカーと、逆転写酵素と、を更に備えていてもよい。

本実施態様のスクリーニングキットによれば、上述した、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を利用したＤＮＡライブラリのスクリーニング方法を行うことができる。本実施態様のスクリーニングキットによれば、目的のタンパク質を回収すれば、同時に当該タンパク質のｃＤＮＡを回収することができるため、スクリーニングが容易である。

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［ＶＨＨ抗体ライブラリの製造］
（ＶＨＨ抗体の塩基配列の設計）
図４は、ＶＨＨ抗体ライブラリの構造及び製造方法を説明する図である。まず、ＶＨＨ抗体をコードする塩基配列５００（配列番号１）を設計した。以下の説明において、用語「塩基配列」は「ＤＮＡ断片」を意味する場合がある。

塩基配列５００の領域５１０は、Ｔ７プロモーター及びＦＬＡＧタグを含んでいる。また、塩基配列５００の領域５２０は、ヒスチジンタグ及びリンカーハイブリダイゼーション配列を含んでいる。配列番号１のＶＨＨ抗体が備える主な構造を下記表１に示す。

配列番号１のＶＨＨ抗体は、ＣＤＲを除く領域にシステイン残基を有しないように設計した。具体的には、ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の第２２番目に存在するシステイン残基をトリプトファンに変異させ、第９６番目に存在するシステイン残基をアラニンに変異させた。

また、ＣＤＲ１は９アミノ酸のランダムアミノ酸とし、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は７アミノ酸のランダムアミノ酸とした。そして、ＣＤＲ１〜３の各コドンの塩基配列は「ＮＮＳ」とした。ここで、ＮはＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）又はＧ（グアニン）を表し、ＳはＣ又はＧを表す。

下記表２に、コドンの塩基配列が「ＮＮＮ」である場合と、「ＮＮＳ」又は「ＮＮＫ」（ＫはＧ又はＴを表す。）である場合において、終止コドンが出現しない確率を計算した結果を示す。また、図３に、表２の結果をグラフにしたものを示す。

表２に示すように、各コドンの塩基配列を「ＮＮＮ」ではなく、「ＮＮＳ」又は「ＮＮＫ」とすることにより、終止コドンが出現しない確率を上昇させることができる。

表２に示すように、例えば、９アミノ酸のランダムアミノ酸を塩基配列「ＮＮＮ」でコードすると、終止コドンが出現しない確率が６４．９％であるのに対し、塩基配列「ＮＮＳ」でコードすると、終止コドンが出現しない確率を７５．１％に上昇させることができる。

同様に、７アミノ酸のランダムアミノ酸を塩基配列「ＮＮＮ」でコードすると、終止コドンが出現しない確率が７１．５％であるのに対し、塩基配列「ＮＮＳ」でコードすると、終止コドンが出現しない確率を８０．１％に上昇させることができる。

また、ＣＤＲ１〜３の合計のアミノ酸残基数２３を塩基配列「ＮＮＮ」でコードすると、終止コドンが出現しない確率が３３．１％であるのに対し、塩基配列「ＮＮＳ」でコードすることにより、終止コドンが出現しない確率を４８．２％に上昇させることができる。

また、この結果から、ＤＮＡライブラリを２以上に分割した塩基配列からなるＤＮＡ断片から製造することの有効性を説明することができる。

ＤＮＡライブラリを断片化せずに合成したと仮定すると、ＣＤＲ１〜３の合計のアミノ酸残基数２３の間に、理論上終止コドンが出現しない確率は、「ＮＮＳ」コドンの場合４８．２％（「ＮＮＮ」コドンの場合は３３．１％）である。

これに対し、ＤＮＡライブラリを断片化し、ＣＤＲ１〜３を別々に作製することにより、理論上終止コドンが出現しない確率は、ＣＤＲ１については、「ＮＮＳ」コドンの場合７５．１％（「ＮＮＮ」コドンの場合６４．９％）、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３については、「ＮＮＳ」コドンの場合８０．１％（「ＮＮＮ」コドンの場合７５．１％）となる。

したがって、断片化することにより、終止コドンの出現によるＤＮＡライブラリの多様性の減少を最小限に抑えることができ、全長再構築後のＤＮＡライブラリの多様性を確保することができる。

また、断片ごとに、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないものを選別して回収し、ＤＮＡライブラリを構築するため、最終的なＤＮＡライブラリにおいて終止コドンが出現する確率を著しく低下させることができる。

また、発明者らの検討の結果、計算で得られる終止コドンの出現頻度以上に、ＤＮＡライブラリ構築の過程において、塩基の挿入や欠失が頻繁に発生することが確認された。ＤＮＡライブラリを構成するＤＮＡ断片の長さが長くなればなるほど、塩基の挿入や欠失の発生確率が高くなり、ナンセンス変異又はフレームシフト変異が発生してＤＮＡライブラリの質が低下する傾向にある。

したがって、ＤＮＡライブラリを断片化して製造することにより、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の発生によるＤＮＡライブラリの質の低下を抑制することができる。

次に、ランダムアミノ酸を塩基配列「ＮＮＮ」でコードした場合と、塩基配列「ＮＮＳ」又は「ＮＮＫ」でコードした場合の各アミノ酸（終止コドンを含む）の出現頻度及び出現割合を表３に示す。「ＮＮＮ」でコードした場合と「ＮＮＳ／ＮＮＫ」でコードした場合で各アミノ酸の出現割合には大きな変化は認められない。

したがって、ランダムアミノ酸を「ＮＮＳ」でコードすることにより、終止コドンの出現によるライブラリメンバーの多様性の減少を最小限に抑えることができる。

（ＶＨＨ抗体をコードするＤＮＡ断片の製造）
まず、ＶＨＨ抗体をコードする核酸の製造工程の概要を説明する。図４に示すように、設計したＶＨＨ抗体の塩基配列５００を３つの領域に分割し、分割された各領域の５’末端と３’末端に所定の機能を有する領域を付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃを製造した。

続いて、後述する方法により、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない５００ａ、５００ｂ及び５００ｃのＤＮＡ断片を選別して回収した。続いて、図５に示すように、５００ａ、５００ｂ及び５００ｃのＤＮＡ断片を鋳型として、図５にＰｒｉｍｅｒ １〜６（それぞれ配列番号２〜７）として示すプライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応により、ＰＣＲ増幅断片に制限酵素認識部位が導入された。

続いて、図５に示すように、上記のＰＣＲ増幅断片を制限酵素で切断してＤＮＡ断片５００ａ’、５００ｂ’及び５００ｃ’を得た後、これらをライゲーションして連結することにより、ＶＨＨ抗体をコードするＤＮＡ断片を得た。制限酵素としては、制限酵素認識部位と切断面とは決まった塩基数離れているＩＩＳ型の制限酵素を使用してもよい。制限酵素は例えば、ＢｂｖＩ、ＢｂｓＩである。制限酵素には図５のように複数種類の制限酵素を用いてもよく、また、一種類のみの制限酵素を用いてもよい。例えば、制限酵素としてＢｂｓＩの一種類のみを用いてもよい。この場合、制限酵素の認識配列が同一であっても切断される配列が異なるため、制限酵素切断後、断片を全て混ぜて一気にライゲーションを行っても、設計上、ライゲーションされる断片の組合せは１通りとなる。

以下、上記過程をより詳細に説明する。まず、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃの製造について説明する。

ＤＮＡ断片５００ａの領域５１０ａは、ＤＮＡ断片５００の領域５１０と同一の塩基配列を有しており、Ｔ７プロモーター及びＦＬＡＧタグを含んでいる。また、ＤＮＡ断片５００ｂの領域５１０ｂ、及びＤＮＡ断片５００ｃの領域５１０ｃもＤＮＡ断片５００ａの領域５１０ａと同様であり、Ｔ７プロモーター及びＦＬＡＧタグを含んでいる。

また、ＤＮＡ断片５００ａの領域５２０ａは、ＤＮＡ断片５００の領域５２０と同一の塩基配列を有しており、ヒスチジンタグ及びリンカーハイブリダイゼーション配列を含んでいる。また、ＤＮＡ断片５００ｂの領域５２０ｂ、及びＤＮＡ断片５００ｃの領域５２０ｃもＤＮＡ断片５００ａの領域５２０ａと同様であり、ヒスチジンタグ及びリンカーハイブリダイゼーション配列を含んでいる。

ところで、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ、５００ｃはそれぞれ約３００残基の長さがある。現在のオリゴＤＮＡの化学合成技術では、１００残基を超える長さのＤＮＡは、合成の質が著しく低下し、またコストも増大する傾向にある。

そこで、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ、５００ｃを、それぞれ図４の矢印で示す位置で分割して合成した。図６は、一例として、ＤＮＡ断片５００ａの合成過程をより詳細に説明した図である。

まず、ＤＮＡ断片５００ａを、図６にＣＤＲｘ−１、ＣＤＲｘ−２、ＣＤＲｘ−３及びＣＤＲｘ−４として示す各ＤＮＡ断片に分割して化学合成した。各ＤＮＡ断片の５’末端にはリン酸基を付加した。

続いて、上記の各ＤＮＡ断片を、図６にＳｐｌｉｎｔｘ−１、Ｓｐｌｉｎｔｘ−２、Ｓｐｌｉｎｔｘ−３として示す添え木（スプリント）ＤＮＡ断片の存在下でライゲーション（以下、「スプリントライゲーション」という場合がある。）することにより連結し、ＤＮＡ断片５００ａを得た。添え木ＤＮＡ断片は、各ＤＮＡ断片の末端部分に相補的な塩基配列を有しており、スプリントライゲーションにより、ライゲーション効率を向上させることができる。

図６中、ＣＤＲｘ−１〜ＣＤＲｘ−４及びＳｐｌｉｎｔｘ−１〜Ｓｐｌｉｎｔｘ−３は、ＤＮＡ断片を表し、ｘは１〜３である。ＤＮＡ断片５００ａの場合ｘは１であり、ＤＮＡ断片５００ｂの場合ｘは２であり、ＤＮＡ断片５００ｃの場合ｘは３である。下記表４に、各ＤＮＡ断片と配列番号との対応を示す。

図６に示すように、スプリントライゲーションにより得られたＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃの５’末端にはビオチンが付加されていた。そこで、スプリントライゲーション後の反応液に、ストレプトアビジンコートされた磁性粒子を添加して、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃをストレプトアビジンコートされた磁性粒子に結合させた。続いて、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃをアルカリ変性させ、スプリントＤＮＡ断片を変性させた。続いて、磁石を用いてＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃを回収した。以上の操作により、スプリントＤＮＡ断片が除去された。

続いて、５〜１０サイクルのＰＣＲ反応により、ＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃを増幅して精製した。以上の操作により、５’末端にビオチンを有し、かつＰＣＲプライマーに対応する配列を有するＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃを得た。

（ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａ、５００ｂ及び５００ｃの選別及び回収）
図７は、一例として、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａを選別及び回収する手順を説明した図である。

まず、図７（ａ）に示す、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片５００ａを鋳型として、Ｔ７ポリメラーゼを反応させて、図７（ｂ）に示すｍＲＮＡ５００ｔを合成した。

続いて、図７（ｃ）に示すように、合成したｍＲＮＡ５００ｔに核酸リンカー（ピューロマイシンリンカー）１００を結合させた。

ピューロマイシンリンカーとしては、図１におけるアーム部分１３０が、５’−Ｔ（チオール化）ＣＴ（フルオレセイン標識）−（スペーサーホスホロアミダイト１８×４）−ＣＣ−（ピューロマイシン）−３’であり、ポリヌクレオチド部分１１０及び結合部位１４０が、５’−ＣＣ（ｒＧ）ＣＴ（ビオチン化）Ｃ（ｒＧ）ＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴ（アミノ化）ＣＣＴ−３’（配列番号２５）であるものを使用した。アーム部分１３０と、ポリヌクレオチド部分１１０及び結合部位１４０とは、アミノ化されたチミン残基の部分でクロスリンキング試薬であるＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド、同仁化学社製）を用いて連結した。

したがって、このピューロマイシンリンカーは、アーム部分１３０の５’末端が、ポリヌクレオチド部分１１０の３’末端から４塩基５’側の位置でポリヌクレオチド部分１１０と結合したＴ字型の構造を有しており、ポリヌクレオチド部分１１０の３’末端を逆転写反応のプライマーとして機能させることができるものであった。

続いて、図７（ｄ）に示すように、ウサギ網状赤血球抽出液中のリボソームを用いてｍＲＮＡ５００ｔを翻訳してタンパク質３００を合成させ、核酸リンカー１００と合成されたタンパク質３００とを共有結合させ、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体（以下、「ｍＲＮＡディスプレイ」又は「ＩＶＶ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）」という場合がある。）を得た。

ここで、ｍＲＮＡ５００ｔがナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する場合には、タンパク質３００のＣ末端に設計したヒスチジンタグが正しく翻訳されないため、後の工程において、ヒスチジンタグを用いた精製ができない。ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａの回収には、この原理を利用する。

続いて、図７（ｅ）に示すように、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に逆転写酵素を反応させてｍＲＮＡ５００ｔを逆転写し、ｃＤＮＡ５００ｄを合成した。

続いて、ｃＤＮＡ５００ｄを合成した後の反応液に、ストレプトアビジンコートされた磁性粒子６００を添加して、核酸リンカー１００に付加されていたビオチンに結合させた。

続いて、磁石を用いて核酸リンカー１００がライゲーションした、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体（ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体、以下本複合体を「ｃＤＮＡディスプレイ」又は「ＩＶＶ」という場合がある。）を回収した。この操作により、核酸リンカー１００がライゲーションしていない、ｍＲＮＡ５００ｔが除去された。

続いて、図７（ｆ）に示すように、核酸リンカー中の特異的な塩基配列を選択的に加水分解し、ストレプトアビジンコートされた磁性粒子６００からｃＤＮＡディスプレイを切り出した。

続いて、図７（ｇ）に示すように、切り出したｃＤＮＡディスプレイをＮｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）磁性粒子、又はＮｉ−ＮＴＡカラムである担体７００を用いて、ヒスチジンタグに基づいた精製を行った。

Ｎｉ−ＮＴＡを用いて回収されたｃＤＮＡディスプレイは、ヒスチジンタグをＣ末端に有するタンパク質３００と、これをコードするｍＲＮＡ５００ｔと、ｍＲＮＡ５００ｔの逆転写産物であるｃＤＮＡ５００ｄを有する。

続いて、回収されたｃＤＮＡディスプレイのｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ａを回収した。

ＤＮＡ断片５００ａと同様の手順により、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないＤＮＡ断片５００ｂ及び５００ｃも回収した。

その後、上述したように、図５に示す手順により、ＤＮＡ断片５００ａ’、５００ｂ’及び５００ｃ’を得た後、これらをライゲーションして連結し、ＶＨＨ抗体をコードするＤＮＡ断片からなるＤＮＡライブラリ（ＶＨＨ抗体ライブラリ）を得た。

（ＶＨＨ抗体ライブラリの確認）
得られたライブラリメンバーの塩基配列をシークエンスにより確認した。具体的には、ＤＮＡライブラリを、上述したＰｒｉｍｅｒ １（配列番号２）及びＰｒｉｍｅｒ ６（配列番号７）を用いたＰＣＲ反応により増幅し、増幅産物をベクター（商品名「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」、インビトロジェン社製）に挿入し、大腸菌（商品名「５−ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ」、ＮＥＢ社製）に導入してクローニングした。続いて、大腸菌からプラスミドを精製し、定法により塩基配列を解析した。その結果、ＤＮＡライブラリのライブラリメンバーが、設計通りの塩基配列を有していることが確認された。

本実施形態によれば、熱安定が高く、有機溶媒中の標的分子と相互作用し、低分子薬や毒性物質と相互作用する、という特徴を有するＶＨＨ抗体のライブラリを作成することが可能となった。ＶＨＨは、例えば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ。一本鎖抗体）、ｖｅｎｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ（毒ペプチド）と比べて高い熱安定性を持つ。また、ＶＨＨは従来の抗体やｓｃＦｖよりもサイズが小さく、Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ（オクラトキシン）、カフェインのような小さい分子について、高い結合能と特異性をもつ。

ｃＤＮＡディスプレイは、ライブラリの多様性を大きくできる傾向にある（例えば１０^１４／ｍＬ）。また、ｃＤＮＡディスプレイでは、毒性のあるタンパク質であっても発現することができる。

また、ｃＤＮＡディスプレイは、タンパク質をコードする核酸がＤＮＡであるため、核酸の安定性が高い傾向にある。また、ｃＤＮＡディスプレイは、翻訳後に固相に固定させることができる。

したがって、ｃＤＮＡディスプレイとＶＨＨライブラリ、更には相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しないＶＨＨライブラリとの組み合わせは、例えば、動物で免疫することが困難な分子や、毒性のある物質に結合する構造体を取得する手段として非常に強力なものである。

本発明によれば、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないライブラリメンバーからなるＤＮＡライブラリの製造方法を提供することができる。また、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しないライブラリメンバーからなるＤＮＡライブラリ、ＤＮＡライブラリのスクリーニング方法、及びスクリーニングキットを提供することができる。

１００…核酸リンカー、１１０…ポリヌクレオチド部分、１２０…連結部分、１３０…アーム部分、１４０…結合部位、１５０…標識物質、１６０…切断部位、２００，５００ｔ…ｍＲＮＡ、２１０…リンカーハイブリダイゼーション配列、３００…タンパク質、５００…塩基配列、５００ａ，５００ｂ，５００ｃ，５００ａ’，５００ｂ’，５００ｃ’，ＣＤＲｘ−１，ＣＤＲｘ−２，ＣＤＲｘ−３，ＣＤＲｘ−４，Ｓｐｌｉｎｔｘ−１，Ｓｐｌｉｎｔｘ−２，Ｓｐｌｉｎｔｘ−３…ＤＮＡ断片、５１０，５１０ａ，５１０ｂ，５１０ｃ，５２０，５２０ａ，５２０ｂ，５２０ｃ…領域、６００…ストレプトアビジンコートされた磁性粒子、７００…担体、Ｂ…ビオチン、Ｐｕ…ピューロマイシン、ｒＧ…ＲＮＡ配列、ＳＰＣ…スペーサー。

Claims (19)

1. 抗体をコードするＤＮＡを複数に分割した塩基配列からなる複数のＤＮＡ断片のうち、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を選別して回収する工程（ａ）と、
   回収した少なくとも２つの前記ＤＮＡ断片を連結して前記抗体をコードするＤＮＡを形成する工程（ｂ）と、
   を備える、ＤＮＡライブラリの製造方法。
2. 前記工程（ａ）は、
   分割した前記ＤＮＡ断片をｍＲＮＡに転写する工程（ａ１）と、
   前記ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程（ａ２）と、
   前記ｍＲＮＡを翻訳して得られる生成物と前記ｍＲＮＡとが前記核酸リンカーを介して連結した複合体を形成する工程（ａ３）と、
   前記複合体の前記ｍＲＮＡを逆転写し、前記ＤＮＡ断片を回収する工程（ａ４）と、
   を含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記工程（ａ４）は、
   回収した前記複合体の前記ｍＲＮＡを逆転写し、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を生成する工程（ａ４１）と、
   少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない前記ＤＮＡ断片を有する前記複合体を、前記核酸リンカーに結合する担体と結合させて回収する工程（ａ４２）と、
   を含む、請求項２に記載の製造方法。
4. 前記工程（ａ１）は、
   前記ＤＮＡを複数に分割した前記ＤＮＡ断片の塩基配列の３’末端に、ペプチドタグをコードする塩基配列及び前記核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を準備する工程（ａ１１）を含む、
   請求項２又は３に記載の製造方法。
5. 前記工程（ａ１１）は、
   前記ＤＮＡを複数に分割した前記ＤＮＡ断片の塩基配列の５’末端に前記ペプチドタグとは異なるペプチドタグをコードする塩基配列を更に付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を準備する工程を含む、
   請求項４に記載の製造方法。
6. 前記工程（ａ）は、
   分割された前記ＤＮＡ断片を更に２以上に分割した塩基配列からなる２以上のＤＮＡ断片を準備する工程（ａ１１１）と、
   前記２以上のＤＮＡ断片及び当該ＤＮＡ断片の分割部位を含む領域に相補的なＤＮＡ断片をハイブリダイズさせる工程（ａ１１２）と、
   ハイブリダイズした前記ＤＮＡ断片をライゲーションし、分割前の塩基配列からなる前記ＤＮＡ断片を生成する工程（ａ１１３）と、
   を備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. プロモーター配列と、抗体をコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、少なくともナンセンス変異又はフレームシフト変異を有しない核酸からなるＤＮＡライブラリ。
8. 前記抗体がＶＨＨ抗体である、請求項７に記載のＤＮＡライブラリ。
9. 前記抗体が、相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しない、請求項８に記載のＤＮＡライブラリ。
10. 前記核酸が、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の３’側に、核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列を更に有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡライブラリ。
11. 前記抗体をコードする塩基配列のうち相補性決定領域をコードする領域を除く領域に、システイン残基をコードするコドンを有しない、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡライブラリ。
12. 前記核酸が、前記プロモーター配列と、抗体をコードする前記塩基配列との間に、前記ペプチドタグとは異なるペプチドタグをコードする塩基配列を更に有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡライブラリ。
13. プロモーター配列と、アプタマーをコードする塩基配列と、ペプチドタグをコードする塩基配列とをこの順に有し、前記アプタマーをコードする塩基配列のうち前記アプタマーの相補性決定領域を除く領域にシステイン残基をコードするコドンを有しない、ＤＮＡライブラリ。
14. プロモーター配列と、第１のタグをコードする塩基配列と、抗体をコードする塩基配列と、第２のタグをコードする塩基配列と、核酸リンカーがハイブリダイズする塩基配列と、を備える、ＤＮＡライブラリ。
15. 請求項７〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡライブラリを転写してｍＲＮＡを合成する工程（Ｓ１）と、
    前記ｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程（Ｓ２）と、
    前記タンパク質から、所望の活性を有するタンパク質を選択する工程（Ｓ３）と、
    を備える、スクリーニング方法。
16. 前記工程（Ｓ１）の後に、前記ｍＲＮＡの末端と核酸リンカーの末端とをライゲーションする工程を更に備え、
    前記工程（Ｓ２）が、前記ｍＲＮＡを翻訳して得られるタンパク質と前記ｍＲＮＡとが前記核酸リンカーを介して連結した複合体を形成する工程を備える、
    請求項１５に記載のスクリーニング方法。
17. 前記ｍＲＮＡを逆転写して、前記ｍＲＮＡが逆転写されたｃＤＮＡと、前記ｍＲＮＡと、前記タンパク質とが、前記核酸リンカーを介して連結した複合体を形成する工程と、
    前記工程（Ｓ３）の後に、選択したタンパク質に連結した前記ｃＤＮＡを回収する工程（Ｓ４）と、
    を備える請求項１５又は１６に記載のスクリーニング方法。
18. 請求項７〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡライブラリと、
    転写酵素と、
    無細胞翻訳系と、
    を備える、スクリーニングキット。
19. 核酸リンカーと、
    逆転写酵素と、
    を更に備える、請求項１８に記載のスクリーニングキット。

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