WO2013073706A1 - スリーフィンガー構造を有するリガンド、及びそれを用いた分子の検出方法 - Google Patents

スリーフィンガー構造を有するリガンド、及びそれを用いた分子の検出方法 Download PDF

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WO2013073706A1
WO2013073706A1 PCT/JP2012/080000 JP2012080000W WO2013073706A1 WO 2013073706 A1 WO2013073706 A1 WO 2013073706A1 JP 2012080000 W JP2012080000 W JP 2012080000W WO 2013073706 A1 WO2013073706 A1 WO 2013073706A1
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seq
ligand
protein
amino acid
sequence
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PCT/JP2012/080000
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根本　直人
勇也 四本
Original Assignee
国立大学法人埼玉大学
株式会社ニコン
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a ligand having a three-finger structure and a method for detecting a specific molecule using the same.
  • antigen-antibody reactions utilizing the specificity of reactions have been frequently used in protein screening and detection.
  • an antigen-antibody reaction it is necessary to obtain an antibody using a molecule such as a protein serving as an antigen.
  • the antibody cannot be obtained successfully due to the molecular weight or the like.
  • it takes time and effort to purify an antibody that binds to a specific epitope.
  • the binding between an antigen and an antibody is highly specific and often forms a strong bond.
  • ⁇ -neurotoxin which has a molecular weight that is not as high as that of antibodies.
  • ⁇ -type neurotoxins are a group of proteins often found in snake venoms such as the elapidae family, and are small proteins composed of 60 to 70 amino acids (MW: 7 to 8 KDa). And some of them usually contain three-finger-like scaffolds containing four to five disulfide bonds, three to five anti-parallel ⁇ -sheets, and three protruding loops forming a three-finger structure (Endo T, Tamiya N. (1987), Pharmacol Ther., 34, 403-451 (Non-patent Document 1)).
  • the above-mentioned scaffold is formed by a disulfide bond, it is also called a disulfide framework, but its form is highly conserved even if the type of amino acid residue forming the ⁇ sheet changes, and Amino acids involved in binding to the natural receptor are similarly conserved (Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999). J. Biol. Chem., 274, 34851-34858 ( Non-patent document 2); Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. (2002) J. Biol. Chem.
  • Non-patent Document 4 Such protein scaffolds are small, have high thermal stability and can withstand temperatures of 60-70 ° C (Sivaraman T, Kumar TK, Hung KW, Yu C. Biochemistry. 2000 Aug 1; 39 (30 ): 8705-10 (Non-patent Document 4)) and having a very high specificity for each receptor (protein) (Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999), J. Biol. Chem., 274, 34851-34858 (Non-Patent Document 5)). Furthermore, Nygren, PA and Skerra, A. (2004), J. Immunol. Methods., 290, 3-28 (Non-Patent Document 6), created a combinatorial library of proteins, and developed a new protein to replace antibodies. An attempt to discover is disclosed (hereinafter referred to as “Prior Art 1”).
  • Patent Document 1 discloses that a part of the loop region of CTx3 having a three-finger-like scaffold is modified to interleukin-6 receptor (hereinafter referred to as “IL-6R”). And a technique for producing a protein that specifically binds to the protein (hereinafter referred to as “Prior Art 2”).
  • IL-6R interleukin-6 receptor
  • Prior Art 2 a technique for producing a protein that specifically binds to the protein
  • Prior art 1 introduces site-specific mutations into either loop I or loop II, or both of loop I, loop II and tail regions involved in interaction with natural receptors. This is an excellent technique in terms of analyzing amino acid residues involved in binding properties.
  • the contents described in the prior art 1 have a problem that the affinity of these sites to the target protein and the recognition specificity cannot be changed.
  • the prior art 2 is intended to provide a protein library for identifying a novel protein that can bind to a desired target using a three-finger-like scaffold. This is an excellent technique in that it provides a protein that binds automatically.
  • AchBP acetylcholine binding protein
  • IL-6R target binding protein receptor
  • the intermolecular interaction occurs not only between a general receptor and a target protein having a high molecular weight but also between various globular proteins and low molecular compounds having a low molecular weight.
  • a scaffold capable of interacting with such a low molecular weight protein or compound can be used in various applications, there is a social demand for creating such a scaffold.
  • a scaffold target is a protein that serves as a marker for various diseases, it leads to early detection and early treatment of diseases, and there is a particularly strong demand from the viewpoint of preventive medicine.
  • the inventors of the present invention are peptides that bind to a target by randomly recreating a predetermined portion of a protein having three loop-like structures isolated from snake venom or the like.
  • the present invention has been completed through extensive research for the purpose of obtaining the above. That is, the first aspect of the present invention includes three fingers composed of an anti-parallel ⁇ sheet and a loop region sandwiched between them, and at least the fingertip portion formed by the loop region of each finger binds to the target molecule.
  • a ligand having the following amino acid sequence:
  • X represents an arbitrary amino acid constituting the fingertip portion of the finger, and each number represents the number of amino acids.
  • X7 and X4 are not composed of the same amino acid.
  • X7 is any sequence selected from the following (A)
  • X4 is any sequence selected from the following (B)
  • X2 is from the following (C): It is any combination selected.
  • A PTQPKRT (SEQ ID NO: 2), PNPADRN (SEQ ID NO: 4), NPPTSDT (SEQ ID NO: 6), PEVDIRQ (SEQ ID NO: 8), ETNNGQP (SEQ ID NO: 10), RRSMHTV (SEQ ID NO: 12) and PRTIRA (SEQ ID NO: 14)
  • B GTRQ (SEQ ID NO: 3), NPSH (SEQ ID NO: 5), PGNT (SEQ ID NO: 7), KLPR (SEQ ID NO: 9), TIPA (SEQ ID NO: 11), IAKN (SEQ ID NO: 13) and DLAE (SEQ ID NO: 15) )
  • C PP, NR, TQ, KP, ER, TP and NQ
  • X7, X4 and X2 of the amino acid sequence of the fingertip part are any combination selected from the group consisting of the following (a) to (c) and (d).
  • A PTQPKRT (SEQ ID NO: 2), GTRQ (SEQ ID NO: 3), PP
  • B PNPADRN (SEQ ID NO: 4), NPSH (SEQ ID NO: 5), NR (C) NPPTSDT (SEQ ID NO: 6), PGNT (SEQ ID NO: 7), TQ (D) PEVDIRQ (SEQ ID NO: 8), KLPR (SEQ ID NO: 9), KP
  • E ETNNGQP (SEQ ID NO: 10), TIPA (SEQ ID NO: 11), ER (F) RRSMHTV (SEQ ID NO: 12), IAKN (SEQ ID NO: 13), TP (G) PRTIRA (SEQ ID NO: 14), DLAE (SEQ ID NO: 15), NQ
  • the “target molecule” is preferably selected from the group consisting of survivin monomer, survivin dimer, and low molecular weight compound, and particularly preferably survivin monomer or survivin dimer.
  • the “low molecular weight compound” means a compound having a molecular weight in the range of 30 to 1,500, regardless of the presence or absence of sugar chains.
  • aflatoxin B1, ciguatoxin, fluorescein, N-acetyl-D-glucosamine and the like can be mentioned.
  • the ligand is preferably present in a form associated with the polynucleotide encoded by the ligand, and the ligand is bound to the polynucleotide encoding the ligand via puromycin. Is preferred.
  • the second aspect of the present invention comprises three fingers composed of an anti-parallel ⁇ sheet and a loop region sandwiched between them, and at least the fingertip part and the target molecule formed by the loop region of each finger are the target molecule.
  • X represents an arbitrary amino acid constituting the fingertip portion of the finger, and each number represents the number of amino acids.
  • X6 and X4 are not composed of the same amino acid.
  • X6 is any sequence selected from the following (A ′)
  • X4 is any sequence selected from the following (B)
  • X2 is the following (C ), Any combination selected from the above.
  • a ′ PTQPKRT (SEQ ID NO: 2), PNPADRN (SEQ ID NO: 4), NPPTSDT (SEQ ID NO: 6), PEVDIRQ (SEQ ID NO: 8), ETNNGQP (SEQ ID NO: 10), RRSMHTV (SEQ ID NO: 12) and PRTIRA (SEQ ID NO: 14) an amino acid sequence consisting of 6 amino acids wherein any one amino acid is deleted from each sequence in the sequence consisting of 7 amino acids represented by 14);
  • B GTRQ (SEQ ID NO: 3), NPSH (SEQ ID NO: 5), PGNT (SEQ ID NO: 7), KLPR (SEQ ID NO: 9), TIPA (SEQ ID NO: 11), IAKN (SEQ ID NO: 13) and DL
  • any one amino acid is deleted from each sequence means, for example, in the case of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 above, from the amino acid sequence PTQPKRT, any one amino acid Means a deleted sequence and represents TQPKRT, PQPKRT, PTPKRT, PTQKRT, PTQPRT, PTQPKT, and PTQPKR.
  • the “target molecule”, “low molecular compound”, and ligand are as described above.
  • the third aspect of the present invention includes: (a) a conjugate forming step in which a ligand and a specimen are contacted to form a ligand-target molecule conjugate; and (b) the ligand-target molecule conjugate is A disease marker detection method comprising: a selection step of selecting; and (c) a concentration calculation step of obtaining a level in the sample of the selected target molecule.
  • the target protein is preferably selected from the group consisting of survivin monomer, survivin dimer, and low molecular weight compound. The low molecular weight compound is as described above.
  • the disease is selected from the group consisting of tumors, infectious diseases, and food poisoning.
  • the above tumor is generally a benign tumor that grows slowly, does not have invasiveness to surrounding tissues, and does not adversely affect the host, and the primary lesion has invasiveness to surrounding tissues, and metastasis.
  • malignant tumors that adversely affect the host. Histologically, papilloma, adenoma, cyst, squamous cell carcinoma, transitional cell carcinoma, hepatocellular carcinoma and other benign tumors, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, transitional cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, undifferentiated cancer and other It is divided into malignant tumors.
  • Infectious diseases are classified into bacterial infections, infections caused by rickettsia, fungal infections, infections caused by parasitic protozoa, and viral infections. Specifically, tuberculosis, cholera, diphtheria, dysentery, scarlet fever, Legionella, Lyme disease, Q fever and other bacterial infections, rash typhus, tsutsugamushi disease and other rickettsial infections, aspergillosis, candidiasis, cryptococcosis , Pneumocystis pneumonia and other fungal infections, amoeba dysentery, malaria and other parasitic protozoa, influenza, viral hepatitis, measles, chickenpox, rubella, polio, dengue fever, rabies, West Nile fever and other viral infections, etc. Can be mentioned.
  • Food poisoning is often toxic food poisoning caused by ingestion of harmful and toxic causative substances contained in food.
  • infectious types that cause infectious diseases due to microbial infection, intermediate types, and the like.
  • examples of the toxin type include enterotoxin, botulinum toxin, tetrodotoxin, aflatoxin, verotoxin, various toxins contained in mushrooms, and the like.
  • Infectious types include Vibrio parahaemolyticus, Salmonella and other bacterial infections.
  • an mRNA-linker conjugate is produced by binding a ligand evolution linker and an mRNA having a sequence complementary to the linker by an RNA ligase at the mRNA binding site of the linker.
  • the linker is composed of a main chain and a side chain, the main chain is located in the vicinity of its 3 ′ end, a side chain binding site for binding the side chain; and located on its 5 ′ end side, A solid phase binding site that binds a predetermined molecule that forms a bond with a solid phase, wherein the side chain has a label binding site for binding a label, and a protein binding site that binds to the bait protein; And the label is bound to the label binding site of the side chain.
  • the side chain is preferably formed of an arbitrary base sequence or a polyethylene glycol spacer, and the predetermined molecule is preferably biotin.
  • the ligase is preferably T4 RNA ligase.
  • the solid phase is preferably magnetic particles, and in the collecting step, the solid phase is preferably collected magnetically.
  • the protein side that serves as a bait is called a “bait” and the protein side that is caught is “played” (Prey, prey) ".
  • the bait protein for example, a desired protein can be used in addition to the above-described ligand of the present invention.
  • the prey protein is preferably selected from the group consisting of, for example, survivin monomer, survivin dimer, and low molecular weight compound, and particularly preferably survivin monomer or survivin dimer.
  • the “low molecular weight compound” means a compound having a molecular weight in the range of 30 to 1,500, regardless of the presence or absence of sugar chains.
  • aflatoxin B1, ciguatoxin, fluorescein, N-acetyl-D-glucosamine and the like can be mentioned.
  • a ligand that functions as a target molecule, antagonist, or agonist can be obtained in the same manner as an antibody. In addition, it can be produced at a lower cost than an antibody. In addition, according to the present invention, it is possible to quickly and accurately detect a disease marker. Furthermore, according to the present invention, a prey protein having a desired interaction with a bait protein can be obtained by a quick and simple screening method.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the ligand of the present invention.
  • Figure 2 contrasts the structures of Bucandin (A), which was used to produce the ligands of the present invention, with other three finger scaffolds (Erabutokin-a (B), Toxin- ⁇ (C), Candoxin (D)).
  • FIG. 3 is a view showing the structure of the ligand of the present invention as an amino acid sequence.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure of survivin.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a case where a linker to which a ligand of the present invention is bound is fixed to a magnetic bead.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of the ligand of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing selection, amplification, and selection of the ligand of the present invention by the IVV method.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the screening method of the present invention.
  • FIG. 9 is an electrophoretic image showing the state of binding between the ligand and the target molecule obtained in Round 5 and Round 7.
  • FIG. 10 is an electrophoretic image showing the state of binding between the ligand and the target molecule obtained in Round 7.
  • FIG. 11 is a gel electrophoresis photograph showing the binding between the ligand obtained in Round 6 (R6), Round 7 (R7) and Round 12 (R12A to D) and the target molecule, and a graph showing the relative binding activity. .
  • conserved cysteines that are contained in the amino acid sequence of a three-finger-like scaffold and form a disulfide bond are indicated as C1 to C8 in order from the N-terminal side.
  • “exists in a correlated form” means that the protein and the polynucleotide encoding it exist in a manner that allows them to be associated one-to-one.
  • Such an association technique is also called a display technique, but various techniques are known.
  • a ribosome display method As an association technique using a cell-free translation system, a ribosome display method, a STABLE method (non-covalent DNA display method), a microbead droplet method, and a covalent DNA display method can be raised and used in the present invention.
  • In vitro viral methods are also included.
  • the ligand In the in vitro virus method, the ligand is bound to a polynucleotide encoding the ligand via, for example, puromycin.
  • yeast display method, bacterial display method and other display methods a pair of polynucleotides encoding the ligand may be contained in each phage or cell.
  • FIG. 1 schematically shows a ligand of the present invention having a three-finger scaffold structure.
  • the portion represented by the wide arrow indicates a portion having a ⁇ sheet structure, and each finger is indicated by the numbers L1 to L3 in order from the 5 ′ end side of the ligand.
  • the portions of the ⁇ sheet structure of L1 and L2 are opposite to each other.
  • the ligand according to the first aspect of the present invention comprises three fingers consisting of (a) ⁇ sheets opposite to each other (anti-parallel ⁇ sheet) and (b) a loop region sandwiched between them, (C) The finger region that binds to the target molecule is included in the loop region of each finger.
  • the ligand of the present invention has one of the following amino acid sequences.
  • X represents an arbitrary amino acid, and each number represents the number of amino acids. Therefore, in the amino acid sequence, X7 represents a sequence of 7 amino acids, X6 represents a sequence of 6 amino acids, X4 represents a sequence of 4 amino acids, and X2 represents a sequence of 2 amino acids.
  • examples of the protein having a three-finger scaffold include those shown in Table 1 below.
  • Bucandin should be used as a protein with 3F. Can do.
  • Bucandin is a peptide isolated from the poison of the Malayan snake genus Bungarus candidus and consists of 63 amino acids. This protein is a neurotoxin and cytotoxin, has a platelet aggregation inhibitory effect, and also functions as an ion channel blocker.
  • randomization of the fingertip portions of the loop regions L1 to L3 is preferably performed by a cDNA display method as described below.
  • the 3F-cDNA display method is suitable for generating and selecting a large number of ligands, and can speed up the evolution when such a series of steps is taken as one round, and also reliably reverse transcription. This is because an oxidation process is performed when the step is performed, so that a disulfide bond is formed and modified Bucandin can be efficiently obtained.
  • “randomization” refers to the replacement of the original Bucandin amino acid sequence with a different amino acid sequence at a predetermined position of the above protein, and X7 and X4 contain only the same amino acid. Does not include substituted sequences. Moreover, based on the sequence information obtained in a certain round, it is possible to randomize only a specific position of the amino acid sequence and not to change the sequence of the remaining positions.
  • the target molecule refers to any molecule to which the ligand of the present invention can bind, and examples thereof include proteins, glycoproteins, saccharides, nucleic acids, and various low molecular compounds. Specific examples include various receptors, virus and cell surface antigens, antibodies, hormones, DNA, RNA, and the like.
  • the bond between the protein and the target molecule may be any of a hydrophobic bond, an electrostatic bond, a hydrogen bond, and a van der Waals bond.
  • the target molecule of the ligand of the present invention is preferably a low molecular peptide selected from the group consisting of survivin monomer, survivin dimer, and low molecular compound.
  • survivin is an apoptotic protein inhibitor (IAP, a group of proteins that inhibit caspases, which are proteolytic components of the apoptotic pathway). And it is known that it is frequently expressed in cancer cells, and is also said to be involved in resistance to anticancer agents.
  • IAP apoptotic protein inhibitor
  • survivin functions as either a monomer or a dimer, but has a complex structure as shown in FIG. Survivin binds to the ligand of the present invention regardless of whether it is a monomer or a dimer, and thus is important as a disease marker.
  • a low molecular weight compound means a compound having a molecular weight in the range of 30 to 1,500, regardless of the presence or absence of sugar chains.
  • aflatoxin B1, ciguatoxin, fluorescein, N-acetyl-D-glucosamine and the like can be mentioned, and in particular, aflatoxin B1, ciguatoxin and the like can be preferably used for reasons of food poisoning prevention.
  • X7 is any sequence selected from (A) below
  • X4 is any sequence selected from (B) below
  • X2 is any sequence selected from (C) below
  • Such a combination is preferable because it has high binding properties to survivin as a target molecule and the above-described low molecular weight compounds.
  • PTQPKRT SEQ ID NO: 2
  • PNPADRN SEQ ID NO: 4
  • NPPTSDT SEQ ID NO: 6
  • PEVDIRQ SEQ ID NO: 8
  • ETNNGQP SEQ ID NO: 10
  • RRSMHTV SEQ ID NO: 12
  • PRTIRA SEQ ID NO: 14
  • B GTRQ (SEQ ID NO: 3), NPSH (SEQ ID NO: 5), PGNT (SEQ ID NO: 7), KLPR (SEQ ID NO: 9), TIPA (SEQ ID NO: 11), IAKN (SEQ ID NO: 13) and DLAE (SEQ ID NO: 15)
  • C PP, NR, TQ, KP, ER, TP and NQ
  • X7, X4 and X2 is (a) PTQPKRT (SEQ ID NO: 2), GTRQ (SEQ ID NO: 3), PP; (b) PNPADRN (SEQ ID NO: 4), NPSH (SEQ ID NO: 5), NR; c) NPPTSDT (SEQ ID NO: 6), PGNT (SEQ ID NO: 7), TQ; (d) PEVDIRQ (SEQ ID NO: 8), KLPR (SEQ ID NO: 9), KP; (e) ETNNGQP (SEQ ID NO: 10), TIPA (sequence) No.
  • Loop 1 (7aa) indicates that the randomized sequence portion in Loop 1 is composed of the 7 amino acids described above.
  • loop 2 (4aa) and loop 3 (2aa) each randomized sequence portion is composed of 4 amino acids and 2 amino acids.
  • X6 is any sequence selected from the following (A ′), X4 is any sequence selected from the following (B), and X2 is any combination selected from the following (C): Is preferable because of its high binding property to survivin, which is a target molecule, and the above-described low molecular weight compounds.
  • a ′ SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, RRSMHTV (SEQ ID NO: 12), and a sequence consisting of 7 amino acids represented by SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence consisting of 6 amino acids from which any one amino acid has been deleted
  • B GTRQ (SEQ ID NO: 3), NPSH (SEQ ID NO: 5), PGNT (SEQ ID NO: 7), KLPR (SEQ ID NO: 9), TIPA (SEQ ID NO: 11), IAKN (SEQ ID NO: 13) and DLAE (SEQ ID NO: 15);
  • C PP, NR, TQ, KP, ER, TP and NQ
  • the ligand of the present invention is preferably present in a form associated with the polynucleotide encoding it, and particularly preferably bound to the polynucleotide encoding each protein via puromycin. preferable. This is because the presence of the associated forms as described above enables efficient selection of ligands having various functions.
  • Various kinds of disease markers can be detected using the ligand of the present invention produced by the method described later. Specifically, (a) preparing the ligand described above, (b) contacting the ligand with serum to form a ligand-target molecule conjugate, and (c) selecting the ligand-target molecule conjugate. (D) The disease marker can be detected by determining the serum level of the selected target molecule. Detection of a disease marker can be performed using a commonly used UV detection device, transmitted light measurement device, fluorescence detection device, or the like, using a desired wavelength. Among these, it is preferable to perform fluorescence detection in terms of high accuracy.
  • IVV in vitro virus
  • puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 'end of aminoacyl-tRNA, and has a property of specifically binding to the 3' end of a growing protein on a ribosome under predetermined conditions.
  • a protein having a desired function is selected from the complex library.
  • the complex of mRNA and protein can be reverse transcribed before selection and selected as an mRNA / cDNA-protein complex, or DNA can be synthesized by reverse transcription after selection. That is, DNA may be synthesized from mRNA using reverse transcriptase to form a complex of mRNA / cDNA hybrid and protein, and this complex may be selected (Non-patent literature, Yamaguchi, et al., CDNA).
  • the linker for ligand evolution used in the screening method of the present invention can be prepared as follows.
  • the linker is (a) a solid phase binding site (BB) having a predetermined molecule that forms a bond with a solid phase; (b) located on the 5 ′ end side of the linker and recognized by RNA ligase Possible mRNA ligation site (mRNA binding site) (MB); (c) side chain binding site (side chain linking site) (SB) located near the 3 ′ end of the linker; (d) A main chain comprising a primer region (PR) located on the 3 ′ end side and functioning as a primer for reverse transcription when reverse transcription is performed on the linker; (e) the side chain ligation site (SB And a side chain linked to.
  • BB solid phase binding site having a predetermined molecule that forms a bond with a solid phase
  • MB RNA binding site
  • SB side chain linking site
  • a main chain comprising a primer region (PR) located on the 3 ′ end side
  • solid phase refers to beads, the side wall, bottom surface, etc. of the reaction vessel, and the linker used in the present invention is fixed directly or indirectly.
  • the use of magnetic particles is preferred because it enables high throughput screening.
  • the “predetermined mRNA” includes an mRNA having a gene-coding sequence or a sequence necessary for ligation formation, translation reaction promotion, or other sequences.
  • Examples of the predetermined molecule used in (a) include biotin when avidin and streptavidin are bound to the solid phase, and maltose and G protein when maltose binding protein is bound. Guanine nucleotides when bound, metals such as Ni or Co when bound with polyhistidine peptides, glutathione when bound with glutathione-S-transferase, sequence-specific DNA or RNA DNA or RNA having specific sequences when binding proteins are bound, antigen or epitope peptide when antibodies or aptamers are bound, calmodulin binding peptide when calmodulin is bound ATP, estradio when ATP binding protein is bound Examples include estradiol and the like when a cholesterol receptor protein is bound.
  • Such a solid phase binding site (BB) is a site for binding a conjugate such as the above-mentioned mRNA-linker-protein conjugate to the solid phase via a linker, and is composed of at least 1 to 10 bases. Is preferred.
  • biotin-modified deoxythymidine (dT) represented by the following formula (III) is preferable.
  • the above-mentioned specific polypeptide or the like is introduced into the solid phase binding site by a method using tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyruvic aldehyde, bis-diazotized benzidone, toluene-2,4-diisocyanate, etc.
  • tannic acid formalin
  • glutaraldehyde pyruvic aldehyde
  • bis-diazotized benzidone toluene-2,4-diisocyanate
  • the mRNA linking site is preferably composed of at least 1 to 10 bases.
  • the mRNA ligation region (MB) does not need to be phosphorylated in advance, but in order to be ligated to a predetermined mRNA, prior to or during the ligation reaction with the 3 ′ end of the mRNA, It needs to be phosphorylated by a kinase or the like.
  • the side chain binding site (SB) located in the vicinity of the 3 ′ end of the linker is a site to which side chains described later are linked.
  • the side chain linking site (SB) of the linker is composed of Amino-Modifier C6 dT represented by the following formula (IV)
  • the 5 ′ end of the side chain is represented by the following formula (V)
  • the main chain and the side chain can be linked by crosslinking using EMCS represented by the following formula (VI).
  • the following formula shows a state with a protecting group.
  • the primer region (PR) is a region that is located on the 3 ′ end side of the linker and functions as a primer for reverse transcription when reverse transcription is performed on the linker. Adjacent to the side.
  • the primer region (PR) is a region that functions as a primer for reverse transcription when reverse transcription is performed on the linker. This region preferably consists of about 1 to 15 bases, particularly 3 to 5 bases. When the number of bases exceeds 15, the binding efficiency as a linker is deteriorated. Therefore, from the viewpoint of the binding efficiency with a linker and the reaction efficiency as a primer, the above base number is preferable.
  • the side chain linked to the side chain linking site (SB) of (f) is a protein linking site (protein binding site) (P) for linking a protein synthesized from mRNA complementary to the main chain, A spacer and a fluorescent group (F) are present between the side chain linking sites.
  • P protein binding site
  • F fluorescent group
  • any puromycin derivative can be used as long as it has a function of specifically binding to the 3 ′ end of the extending protein.
  • puromycin such as puromycin, ribocytidylpuromycin (rCpPur), deoxydylpuromycin (dCpPur), and deoxyuridylpuromycin (dUpPur) in which the 3 ′ end of the nucleotide sequence and an amino acid form an amide bond
  • 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside PANS-amino acid
  • 3′-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside AANS-amino acid
  • PANS-amino acids examples include PANS-Gly, PANS-Val, and PANS-Ala.
  • AANS-amino acids include AANS-Gly, AANS-Val, and AANS-Ala.
  • those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can be used, but it is particularly preferable to use puromycin because of the high stability of protein ligation at the protein ligation site.
  • a linker having the following structure By using a linker having the following structure, a disulfide bond forming step can be introduced after formation of a complex between an mRNA / cDNA hybrid and a protein, and as a result, a three-finger scaffold structure can be formed.
  • a molecule such as Spacer 18 Phosphoramidite represented by the following formula (VII) can be suitably used because it has flexibility and low steric hindrance.
  • the side chain When the side chain is short, steric hindrance occurs when the puromycin analog is incorporated into the ribosome. Therefore, the side chain has a structure in which about 1 to 8 Phosphoramidite molecules are connected. Preferably there is. In view of the balance between the synthesis efficiency of the linker and the formation efficiency of each of the above-mentioned linkages, it is more preferable that the structure has about 4 such Phosphoramidite molecules.
  • the side chain has a fluorescent group between the protein linking site and the side chain linking site, the presence or absence of a linker can be easily detected in each step of the cDNA display method described later.
  • the fluorescent group include a free functional group such as a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group that can be converted into a phosphoramidide, or an amino group, and can be linked to a linker as a labeled base. It is preferable to use fluorescent compounds that can be used.
  • fluorescent compounds examples include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride, tetramethylrhodamine isothiocyanate, and fluorescein-dT.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • phycobiliprotein examples include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride, tetramethylrhodamine isothiocyanate, and fluorescein-dT.
  • Fluorescein-dT used as a compound for molecular labeling because synthesis is easy.
  • VIII The structural formula (VIII) of Fluorescein-dT is shown below.
  • various mRNA coding sequences can be referred to.
  • mRNA encoding various receptor proteins with known sequences mRNA encoding various antibodies or fragments thereof, mRNA encoding various enzymes, mRNA of unknown sequence transcribed from DNA in various gene libraries, organic MRNA with random sequence transcribed from DNA with a sequence synthesized at random by synthesis, mRNA transcribed from DNA that encodes a protein with unknown sequence by insertion of random mutation using PCR method, etc.
  • any mRNA that does not contain a termination codon can be selected.
  • the sequence does not include a stop codon
  • the 3 ′ terminal analog of aminoacyl-tRNA such as puromycin or its analog is incorporated into the C-terminal of the polypeptide chain generated by translation from the coding sequence of mRNA.
  • the strand and the mRNA-linker conjugate will be linked.
  • Such mRNA can be obtained using in vitro transcription reaction, chemical synthesis, extraction from living organisms, cells and microorganisms and other various methods. From the viewpoint of the reaction efficiency of linker linking and cell-free translation, it is preferable to prepare by using in vitro transcription reaction.
  • RNA Ribonucleic acid
  • it has at least one of a 5'-terminal 7-methylated guanosine cap structure and a 3'-terminal poly A tail structure. It is more preferable to have a Kozak sequence or Shine-Dalgarno sequence because it promotes the initiation of translation.
  • the length of mRNA used here depends in principle on the length of the coding region defined by the length of the protein or polypeptide to be molecularly evolved using the present invention. A length of 50 to 1,000 bases is preferable from the viewpoint of reaction efficiency, and a length of 200 to 500 bases is more preferable because the highest reaction efficiency can be obtained.
  • a single-stranded oligomer for use as a main chain is prepared.
  • the single-stranded oligomer thus synthesized includes a solid phase binding site, two or more cleavage sites, an mRNA linking site, a side chain linking site, and a primer region.
  • the length of the single-stranded oligomer serving as the main chain is appropriately determined depending on the size of the two or more cleavage sites and the position in the main chain.
  • a side chain having a desired length is synthesized and linked to a side chain linking site on the main chain.
  • puromycin can be introduced into the free end of the side chain as a protein binding site, and the above-described Fluorescein-dT can be introduced into the fluorescent labeling site to obtain a linker for ligand evolution.
  • the protein can be identified by analyzing a DNA sequence after selecting a protein having a desired function using the ligand evolution linker prepared as described above.
  • Three-finger scaffold containing Bucandin gene (hereinafter sometimes referred to as “3F”) — a full-length construct for cDNA display is a fragment containing a promoter, a cap site, an untranslated sequence and a translation initiation site on the 5 ′ side. It can be constructed by adding a spacer, a tag and a tag sequence to the side. For example, it can be prepared as follows. The amino acid sequence of each loop region is randomized, for example, at the portion shown in FIG.
  • T7-UTR fragment containing a T7 promoter, cap site, ⁇ sequence untranslated sequence (UTR) and translation initiation site is added to the 5 ′ side of the base sequence of the ligand thus modified, and a spacer is placed on the 3 ′ side. It is designed to add (GGGS) 2, C-terminal His6-tag, spacer (GGGS) and Y-tag sequences (FIG. 6).
  • T7-UTR is used for in vitro transcription and translation of the base sequence of the ligand of the present invention, His6-tag sequence is used for library purification, and Y-tag sequence is used for ligation to mRNA and puromycin linker.
  • the spacer is introduced in order to smoothly fold the synthesized protein.
  • a 3F scaffold in which the above-described X7, X4, and X2 portions are substituted with various sequences can be obtained. That is, translation is performed under desired conditions using a desired amount of mRNA and a ligand evolution linker. In a cell-free translation system such as rabbit reticulocyte or the like with a low DTT or nuclease content, the ribosome reads the mRNA linked to the linker and synthesizes the protein. The synthesized protein is presented on puromycin.
  • mRNA can be digested with RNase, and then a disulfide bond can be formed between cysteines in the protein to obtain the desired 3F scaffold.
  • sequence shown in FIG. 3 can be obtained by using survivin as a target molecule, for example.
  • Pull-down assays are the most common method for interacting protein analysis using tagged proteins. In the pull-down assay, first, a target molecule and a tag peptide are bound under predetermined conditions to produce a tagged protein. This tagged protein is then mixed with the desired protein extract to form a protein complex in vitro. This protein complex is reacted with an antibody, and the protein complex is separated by centrifugation or the like. The obtained protein complex is separated by SDS-PAGE and analyzed using fluorescence or the like (see FIG. 8).
  • a small protein such as survivin (see FIG. 4) is used as the target protein.
  • Survivin is coupled to a tag peptide such as a His-6 tag.
  • a buffer 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM CaCl2, pH 7.4
  • a desired primer and a tag sequence such as Y-tag sequence
  • 15 to 30 seconds at 90 to 98 ° C, 10 to 30 seconds at 60 to 75 ° C, and 15 to 45 at 67 to 80 ° C.
  • a sequence used for in vitro transcription and translation of the obtained base sequence of the ligand for example, a T7-UTR sequence can be added simultaneously.
  • Y-tag sequences can be used for ligation to mRNA and puromycin linker.
  • the synthesized protein can be folded smoothly.
  • a ligand used for detection of the above-mentioned disease marker is obtained, and a ligand solution used for the reaction can be prepared by adding a buffer to a desired concentration. .
  • a sufficient amount of scaffold is formed, it can be used without any particular purification.
  • the collected specimen is whole blood
  • it is added in a predetermined amount to form a ligand-target molecule conjugate.
  • the ligand is bound to a molecule for binding to the solid phase
  • the ligand can be bound to the solid phase in advance (see FIG. 5). Thereafter, the serum level of the target molecule can be determined accurately and easily by removing the serum.
  • serum extraction processing such as centrifugation is unnecessary.
  • the collected specimen is a tissue piece, it is homogenized according to a conventional method, centrifuged to separate the supernatant, and the supernatant is treated in the same manner as described above, so that the target molecule can be accurately and easily treated.
  • An organizational level can be sought.
  • the target molecule is preferably selected from the group consisting of survivin monomer, survivin dimer, and low molecular weight compound, and is preferably survivin monomer or survivin dimer.
  • a peptide aptamer can also be used as a target molecule.
  • the disease is preferably selected from the group consisting of tumors, infections and food poisoning. Tumors, infections and food poisoning are as described above. In the case of these diseases, the therapeutic effect can be improved by the early examination and the start of early treatment.
  • the prey protein screening method of the present invention comprises: (A) an mRNA-linker conjugate generating step of binding a ligand evolution linker and mRNA having a sequence complementary to the linker by RNA ligase at the mRNA binding site of the linker; (B) A linker-protein- in which a protein having enzyme-like activity is synthesized from a cDNA chain synthesized by reverse transcription using the mRNA as a template, and the protein is bound to a protein binding site on the side chain of the linker a conjugate generating step to obtain an mRNA conjugate; (C) a bait protein formation step of digesting mRNA to obtain a ligand according to any one of claims 1 to 11, which is a bait protein capable of solid phase binding; (D) an immobilization step of linking a predetermined molecule bound to the solid phase binding site of the bait protein and a desired molecule bound on the solid phase to immobilize the bait protein on the solid phase; (E) a reaction
  • a DNA template having a desired sequence is prepared according to a conventional method. For example, a sequence containing the T7 promoter, omega sequence, Kozak sequence, bait protein coding region, and puromycin-linker hybridization region (HR) is generated.
  • T7 RiboMAX TM Express Large Scale RNA Production System Promega (Promega) Co., Ltd.
  • RNA purification kit Qiagen (Qiagen) Co., Ltd.) Purify with.
  • Purified mRNA is ligated with puromycin-linker by T4 RNA ligase (Catala Bio) and polynucleotide kinase (hereinafter referred to as “PNK”, Toyobo Co., Ltd.), and the ligation product is used as a template for in vitro translation reaction.
  • T4 RNA ligase Catala Bio
  • PNK polynucleotide kinase
  • the reaction is carried out under desired conditions to prepare an mRNA-linker-protein fusion.
  • EDTA solution 0.5 M, pH 8.0
  • RNase I Promega
  • the biotinylated bait protein thus obtained is captured from the solution using Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • IgG and anti-FLAG tagged mAb are prepared from Sigma-Aldrich
  • anti-FasLmAb hamster: Medical & Biological Laboratories
  • Each prey protein is labeled using, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) -fluorescein (Pierce), and the resulting prey protein solution is prepared to the desired concentration, Incubate with magnetic particles at desired temperature for desired time.
  • the protein solution prepared to a concentration of 100 to 500 nM is incubated at 20 to 30 ° C. for 15 to 60 minutes. Subsequently, it is washed a desired number of times with a phosphate buffered saline containing a surfactant having a desired concentration, and the remaining prey protein is eluted with an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample solution.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • phosphate buffered saline PBS-T
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • Proteins eluted with SDS-PAGE sample solution are incubated for the desired time at the desired temperature. For example, incubate at 85-95 ° C. for 3-7 minutes, then subject to gel electrophoresis for visualization.
  • a desired prey protein can be screened.
  • Example 1 Production of Ligand Using Bucandin Bucandin having a random region used in the present invention was purchased from Operon Biotechnology Co., Ltd. T7 promoter, cap site, T7-UTR fragment containing Xenopus globulin untranslated sequence (UTR) and translation start site, spacer (GGGS) 2, His6-tag, spacer (GGGS) and Y-tag sequence for construct construction Were purchased from Gene World Co., Ltd. Bucandin randomized each of the three loop region portions shown in FIG. 3 by the following method to obtain a set of amino acid sequences including the amino acid sequences of Nos. 1 to 10 shown in Table 2 below.
  • 3F (bucandin) loop1, 3F (bucandin) loop2, 3F (bucandin) loop3 incorporating amino acid sequences including the sequences of Nos. 1 to 15 shown in Table 2 above were ligated using T4 DNA ligase, and this ligated product was linked.
  • the T7-UTR fragment, His6-tag and spacer were further ligated using T4 DNA ligase.
  • overlap PCR was performed on this ligated body to obtain the construct shown in FIG. ' 5'-CTCAAAATAA CGTGCTCGGC CGAGGAGACC TTCTGCTACA AGTGGCTGAA CAAG-3 ' ...
  • sequence of 3F (bucandin) loop1 (88mer) is as follows. 5'-TCCTCGGCCG AGCACGTTAT TTTGAGNNBN NBNNBNNBNN BNNBNNBGCG GTAGCACTCC ATCAAAGCTT TGAAGAGCTT GTCTTCTT-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • sequence of 3F (bucandin) loop2 (60mer) is as follows. 5'-TTCGCGCAGC CCAGCCAACG NNBNNBNNBN NBCTTGTTCA GCCACTTGTA GCAGAAGGTC-3 '... (SEQ ID NO: 22)
  • sequence of 3F (bucandin) loop3 (113mer) is as follows. 5'-TTTCCCCGCC GCCCCCCGTC CTTCCTGAGC CTCCACTCCC TCCGCCCGTA TTACATAGAT TGGTAGTACA ACATTTATTA TATACNNBNN BGGTGTCGAT CTCCGTGCAA GTC-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • sequence of T7-His-tag DNA is as follows. 5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAACAACAACAACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGAGGGAAATCAAACGG-3 '... (SEQ ID NO: 24)
  • the resulting DNA was transcribed into mRNA using T7 RiboMAX TM Express Large Scale RNA Production System ( Promega (Promega) Co., Ltd.), the synthesized mRNA, purified RNA purification kit (Qiagen (Qiagen) Co., Ltd.) did.
  • Example 2 IVV assay (1) Synthesis of puromycin biotin linker
  • Puromycin biotin linker was purchased from Puro-FS (manufactured by Geneworld) and biotin loop (manufactured by BEX). The two modified oligonucleotides were synthesized by crosslinking using a bifunctional reagent (EMCS) according to a conventional method.
  • EMCS bifunctional reagent
  • Puro-FS used here was previously labeled with fluorescein by puromycin binding to one end of the spacer according to a conventional method. This Pyro-FS had a thiol group at the other end.
  • the thiol group of 10 nmol Puro-FS was reduced for 6 hours at room temperature using 100 ⁇ L of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0,) containing 1 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Thereafter, desalting was performed using a NAP-5 column (manufactured by GE Healthcare) immediately before use. A total amount of 10 nmol of biotin loop and 2 ⁇ mol of EMCS was added to 100 ⁇ L of sodium phosphate buffer (pH 7.0) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, ethanol precipitation was performed at 4 ° C. to remove excess EMCS.
  • the resulting precipitate was washed twice with 500 ⁇ L of 70% ethanol that had been cooled in advance, and dissolved in 10 ⁇ L of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) that had been cooled in advance. Reduced Puro-FS was quickly added and stirred at 4 ° C. overnight.
  • the fraction of the last peak detected at 254 nm was collected. After drying, the resulting puromycin-linker was resuspended in diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water and stored.
  • the biotin loop was composed of a base sequence capable of taking a stem-loop structure and biotin bound to the loop portion. In the stem portion, a recognition site for the restriction enzyme PvuII was incorporated, and IVV was recovered by cutting it.
  • the sequence 3 ′ from the stem of the biotin loop corresponds to the Y-tag sequence in the full-length construct described above, and anneals to the sequence 3 ′ of mRNA generated from this construct. At the 5 'end, ligation with mRNA occurs.
  • the dT near the 3 ′ end of the biotin loop was modified to have a primary amino group, and was bound to Puro-FS by EMCS via this amino group.
  • the 3 ′ end of the biotin loop functioned as a primer in reverse transcription from the ligated mRNA.
  • the beads displaying the mRNA-protein complex were washed twice with 200 ⁇ L of a binding buffer containing an RNase inhibitor (SUPERaseIn, manufactured by Ambion), and 100 ⁇ L of TR buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM) Rinse with MgCl 2 )).
  • Reverse transcription was performed at 42 ° C. for 10 minutes by adding 80 ⁇ L of RT buffer and 80 units of reverse transcriptase M-MLV (Takara) to the beads.
  • cDNA-protein conjugate-fixed magnetic particles having the cDNA-protein conjugate immobilized on the surface were obtained.
  • This complex was used in the next round as a second 3F-cDNA display ligand. This procedure was repeated, and selection was performed in multiple rounds to produce a ligand. In each round after the second round, the reaction was carried out with the concentration of survivin as the target molecule being 200 pmol in the first to fourth rounds, 100 pmol in the fifth round, 50 pmol in the sixth round, and incubation time of 30 minutes each.
  • the survivin concentration was 10 pmol and the incubation time was 15 minutes.
  • the survivin concentration was 10 pmol and the incubation time was 5 minutes. From the 9th to the 12th round, select the survivin concentration, the 9th round is 10 pmol, the 10th round is 4 pmol, the 11th round is 1 pmol, the 12th round is 0.5 pmol, the incubation time is 4 minutes, and the number of washings is increased and selected The pressure was gradually increased. Table 3 shows the survivin concentration and incubation time for each round.
  • FIG. 9 shows a comparison between the result of washing the beads with a buffer (0.1 M NaCl, 50 mM Tris, 1 mM CaCl 2 , pH 7.4) and the result of dissociating and surviving survivin from the beads with EDTA.
  • the fixed amount of survivin was 100 pmol for R5 and 10 pmol for R7.
  • R5 those with low binding strength were eluted by washing, but such elution was not observed in R7.
  • the two lanes where survivin was released from the beads and eluted similar results were obtained in both rounds. From the above, it was shown that the binding strength of the ligand increases with repeated rounds.
  • the ligands obtained in rounds 6, 7, and 12 were immobilized on streptavidin-derivatized Sepharose beads (magnetic beads) with puromycin-biotin linker and bound with fluorescently modified survivin.
  • the beads were washed with a buffer (Tris-HCl (pH 8.0) 100 mM, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% tween20, 10 ⁇ M biotin), and 25 ⁇ L SDS-PAGE sample buffer (0.5 M Tris-HCl, 10% SDS, 10% Survivin was eluted using% ⁇ mercaptoethanol, 175 mM sucrose, 8M urea).
  • Tris-HCl pH 8.0
  • the present invention contributes to a technique for detecting a novel protein or polypeptide, and is useful for research and development of drugs or diagnostic agents.
  • SEQ ID NO: 1 Three finger protein with protruding disulfide bond, ⁇ sheet and three protruding loops;
  • Xaa is any amino acid SEQ ID NO: 2: Partial within loop 1 of three finger protein SEQ ID NO: 3: Within loop 2 of three finger protein Partial SEQ ID NO: 4 Partial SEQ ID NO: 5 in Loop 1 of Three Finger Protein Partial SEQ ID NO: 6 in Loop 2 of Three Finger Protein SEQ ID NO: 7: Loop of Three Finger Protein in Loop 1 of Three Finger Protein Partial sequence number 8 in 3: partial sequence number 9 in loop 1 of three finger protein 9: Partial sequence number in loop 2 of three finger protein 10: Partial sequence number 11 in loop 1 of three finger protein 11: Three finger protein The le Partial SEQ ID NO: 12 in loop 2: Partial SEQ ID NO: 13 in loop 1 of three finger protein: Partial SEQ ID NO: 14 in loop 2 of three finger protein: SEQ ID NO: 15: Partial finger in loop 1 of three finger protein Partial SEQ ID NO: 16 in loop 2
  • n is any nucleotide SEQ ID NO: 23: 3F (bucandin) loop3; n is any nucleotide SEQ ID NO: 24: T7-eXact-tag DNA SEQ ID NO: 25: Primer for concentrating three finger protein-cDNA complex

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Abstract

　cDNAディスプレイ法における、IVV（インヴィトロウィルス）合成効率と、スクリーニングされたcDNAに由来するmRNAの安定性を向上させることで、分子進化工学的手法によるペプチド創出の効率性と確実性を高めることを目的とする。　アンチパラレルβシートとそれらに挟まれたループ領域とからなる３つのフィンガーを備え、少なくとも、各フィンガーのループ領域が構成する指先部分と標的分子とが結合するリガンドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するリガンドを提供する。配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘ７は、前記フィンガーの指先部分を構成する任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。Ｘ７及びＸ４は、同一のアミノ酸で構成されることはない。

Description

スリーフィンガー構造を有するリガンド、及びそれを用いた分子の検出方法
　本発明は、スリーフィンガー構造を有するリガンド及びこれを用いて特定の分子を検出する方法に関する。
　近年、タンパク質のスクリーニングや検出等において、反応の特異性を利用した抗原抗体反応が多用されている。
　抗原抗体反応を利用する場合には、抗原となるタンパク質等の分子を用いて抗体を得なければならないが、分子量等の関係からうまく抗体が得られない場合がある。また、得られたとしても特定のエピトープと結合する抗体を精製するには、時間と労力を要する。また、抗原と抗体との結合は特異性が高く、強い結合を形成することが多い。
　抗体とは異なる構造のタンパク質のうち、抗体ほどは分子量が大きくないα型神経毒（α-neurotoxin）がある。α型神経毒は、elapidae科をはじめとするヘビのヘビ毒にしばしば見いだされるタンパク質群であり、60～70アミノ酸（MW：7～8KDa）で構成されている小型のタンパク質である。そして、それらのうちのいくつかは、通常は、4～5個のジスルフィド結合、3～5個のアンチパラレルβシート、およびスリーフィンガー構造を形成する3つの突起ループを含む、スリーフィンガー様スキャフォールドを共通して含んでいる（Endo T, Tamiya N. (1987), Pharmacol Ther., 34, 403-451（非特許文献１））。
　また、上記スキャフォールドはジスルフィド結合によって形成されるため、ジスルフィド・フレームワークとも呼ばれるが、その形は、βシートを形成するアミノ酸残基の種類が変化しても高度に保存されており、及び、天然のレセプターへの結合に関与するアミノ酸も、同様に保存されている（Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999). J. Biol. Chem., 274, 34851-34858（非特許文献２）；Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. (2002) J. Biol. Chem., 277, 25741-25747（非特許文献３））。
　このようなタンパク質スキャフォールドは、小型で、熱安定性が高く、60～70℃の温度にも耐えられること（Sivaraman T, Kumar TK, Hung KW, Yu C. Biochemistry. 2000 Aug 1;39(30):8705-10.（非特許文献４））、及びそれぞれのレセプター（タンパク質）に対して非常に高い特異性を有していること（Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999), J. Biol. Chem., 274, 34851-34858（非特許文献５））が知られている。
　さらに、Nygren, P-A and Skerra, A. (2004), J. Immunol. Methods., 290, 3-28（非特許文献６）には、タンパク質のコンビナトリアルライブラリを作製し、抗体に代わる新規なタンパク質を発見する試みが開示されている（以下、「従来技術１」という）。
　また、特開2007-306866号公報（特許文献１）には、スリーフィンガー様スキャフォールドを有するCTx3のループ領域の一部を改変し、インターロイキン６レセプター（以下、「IL-6R」ということがある。）と特異的に結合するタンパク質を作製する技術が開示されている（以下、「従来技術２」という。）。
特開2007-306866号公報
Endo T, Tamiya N. (1987), Pharmacol Ther., 34, 403-451 Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999). J. Biol. Chem., 274, 34851-34858 Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. (2002) J. Biol. Chem., 277, 25741-25747 Sivaraman T, Kumar TK, Hung KW, Yu C. Biochemistry. 2000 Aug 1;39(30):8705-10. Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999), J. Biol. Chem., 274, 34851-34858 Nygren, P-A and Skerra, A. (2004), J. Immunol. Methods., 290, 3-28
　従来技術１は、天然のレセプターとの相互作用に関与する、ループＩ、ループIIおよびテール領域のうち、ループＩ又はループIIのいずれか、あるいはこれらの両方に部位特異的な突然変異を導入することにより結合特性に関わるアミノ酸残基を解析するという点では優れた技術である。しかし、従来技術１に記載された内容では、これらの部位の標的タンパク質への親和性や、認識特異性を変化させることができないという問題点がある。
　また、従来技術２は、スリーフィンガー様スキャフォールドを利用して所望の標的に結合しうる新規なタンパク質を同定するためのタンパク質ライブラリを提供することを目的とするものであり、IL-6Rと特異的に結合するタンパク質を提供するという点では優れた技術である。しかし、もともと、アセチルコリン結合タンパク質（AchBP）（アセチルコリン・レセプターの細胞外ドメイン）に結合する上記スリーフィンガー様スキャフォールドを、標的結合タンパク質であるレセプター（IL-6R）と特異的に結合するように改変したものである。このため、通常の球状タンパク質と結合するか否かに関しては、明らかではなかった。
　ところで、分子間相互作用は、一般的なレセプターと標的タンパク質のような分子量の高いもの同士の間のみならず、分子量の低い種々の球状タンパク質、低分子化合物との間でも起こる。そして、こうした低分子量のタンパク質や化合物と相互作用をすることができるスキャホールドは様々な用途で使用できるため、こうしたスキャホールドを作成すること対する社会的な要請がある。
　特に、こうしたスキャフォールドの標的が、種々の疾病のマーカーとなるタンパク質である場合には、疾病の早期発見、早期治療にもつながり、予防医学観点からは、特に強い要請がある。
　以上のような知見に基づいて、本発明の発明者らは、ヘビ毒等から単離された3つのループ状の構造を持つタンパクの所定の部分を、ランダムに作り替えることで標的に結合するペプチドを得ることを目的として、鋭意研究を重ね、本発明を完成したものである。
　すなわち、本発明の第１の態様は、アンチパラレルβシートとそれらに挟まれたループ領域とからなる３つのフィンガーを備え、少なくとも、各フィンガーのループ領域が構成する指先部分と標的分子とが結合するリガンドであって、以下のアミノ酸配列を有するリガンドである。
MECYR(X7)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１）
　ここで、Ｘは、前記フィンガーの指先部分を構成する任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。Ｘ７及びＸ４は、同一のアミノ酸で構成されることはない。
　また、前記指先部分のアミノ酸配列のうち、Ｘ７は下記（Ａ）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ４は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ２は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする。
（Ａ）PTQPKRT（配列番号２）、PNPADRN（配列番号４）、NPPTSDT（配列番号６）、PEVDIRQ（配列番号８）、ETNNGQP（配列番号１０）、RRSMHTV（配列番号１２）及びPRTIRA（配列番号１４）
（Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号１１）、IAKN（配列番号１３）及びDLAE（配列番号１５）
（Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
　また、前記指先部分のアミノ酸配列のＸ７、Ｘ４及びＸ２が、下記（ａ）～（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする。
（ａ）PTQPKRT（配列番号２）、GTRQ（配列番号３）、PP
（ｂ）PNPADRN（配列番号４）、NPSH（配列番号５）、NR
（ｃ）NPPTSDT（配列番号６）、PGNT（配列番号７）、TQ
（ｄ）PEVDIRQ（配列番号８）、KLPR（配列番号９）、KP
（ｅ）ETNNGQP（配列番号１０）、TIPA（配列番号１１）、ER
（ｆ）RRSMHTV（配列番号１２）、IAKN（配列番号１３）、TP
（ｇ）PRTIRA（配列番号１４）、DLAE（配列番号１５）、NQ
　ここで、「標的分子」とは、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることが好ましく、サバイビンモノマー又はサバイビンダイマーであることが、特に好ましい。ここで、上記「低分子化合物」とは、分子量30～1,500の範囲にある化合物をいい、糖鎖の有無を問わない。例えば、アフラトキシンＢ１、シガトキシン、フルオロセイン、N-アセチル-D-グルコサミン等を挙げることができる。
　また、前記リガンドは、前記リガンドのコードするポリヌクレオチドと対応付けられた形で存在していることが好ましく、前記リガンドが、ピューロマイシンを介して前記リガンドをコードするポリヌクレオチドと結合していることが好ましい。
　本発明の第２の態様は、アンチパラレルβシートとそれらに挟まれたループ領域とからなる３つのフィンガーを備え、少なくとも、各フィンガーのループ領域が構成する指先部分と標的分子とが標的分子と結合するリガンドであって、以下のアミノ酸配列を有するリガンドである。
MECYR(X6)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１６）
　ここで、Ｘは、前記フィンガーの指先部分を構成する任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。Ｘ６及びＸ４は、同一のアミノ酸で構成されることはない。
　また、前前記指先部分のアミノ酸配列のうち、X6は下記（Ａ’）から選ばれるいずれかの配列であり、X4は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、X2は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする。
（Ａ’）PTQPKRT（配列番号２）、PNPADRN（配列番号４）、NPPTSDT（配列番号６）、PEVDIRQ（配列番号８）、ETNNGQP（配列番号10）、RRSMHTV（配列番号12）及びPRTIRA（配列番号14）で表わされる７個のアミノ酸からなる配列において、各配列からいずれか１個のアミノ酸が欠失した６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列；
（Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号11）、IAKN（配列番号13）及びDLAE（配列番号15）；
（Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
　ここで、「各配列からいずれか１個のアミノ酸が欠失した」とは、例えば、上記配列番号２のアミノ酸配列の場合を例に挙げると、PTQPKRTというアミノ酸配列から、任意の１個のアミノ酸が欠失した配列を意味し、TQPKRT、PQPKRT、PTPKRT、PTQKRT、PTQPRT、PTQPKT、及びPTQPKRを表わす。
　また、「標的分子」、「低分子化合物」及びリガンドは、上述した通りである。
　また、本発明の第３の態様は、（ａ）上述したリガンドと検体とを接触させてリガンド－標的分子結合体を形成させる結合体形成工程と；（ｂ）前記リガンド－標的分子結合体を選択する選択工程と；（ｃ）前記選択された標的分子の検体中レベルを求める濃度算出工程と；を備える、疾病マーカーの検出方法である。
　ここで、前記標的タンパク質は、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれるものであることが好ましい。前記低分子化合物は、上述した通りである。
　さらに、前記疾病が、腫瘍、感染症、及び食中毒からなる群から選ばれるものであることが好ましい。ここで、上記腫瘍は、一般に、増殖がゆっくりで、周辺組織への浸潤性を有さず、宿主に悪影響を起こさない良性腫瘍と、原発巣は周辺組織への浸潤性を有し、転移巣を形成するとともに、宿主に悪影響を及ぼす悪性腫瘍とに分けられる。組織学的には、乳頭腫、腺腫、嚢腫、扁平上皮腫、移行上皮腫、肝細胞腫その他の良性腫瘍と、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肝細胞癌、未分化癌その他の悪性腫瘍とに分けられる。
　また、解剖学的には、上顎癌、咽頭癌、喉頭癌その他の頭頸部の癌、甲状腺癌、乳癌、肺癌その他の胸部の癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝癌その他の消化器の癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌その他の泌尿器の癌、子宮癌、卵巣その他の生殖器の癌、基底細胞癌、有蕀細胞癌その他の皮膚の癌、脈絡膜乳頭腫、神経鞘腫、星状細胞腫、神経線維腫、メラニン細胞性黒斑、髄膜腫その他の良性の神経性腫瘍、神経芽細胞腫、悪性褐色細胞腫、メラノーマ、悪性神経鞘腫その他の悪性の神経性腫瘍等を挙げることができる。
　また、感染症は、細菌性感染症、リケッチアによる感染症、真菌性感染症、寄生性原虫による感染症、ウイルス性感染症等に分類される。具体的には、結核、コレラ、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、レジオネラ、ライム病、Ｑ熱その他の細菌性の感染症、発疹チフス、ツツガムシ病その他のリケッチアによる感染症、アスベルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、ニューモシスチス肺炎その他の真菌感染症、アメーバ赤痢、マラリアその他の寄生性原虫による感染症、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、麻疹、水痘、風疹、ポリオ、デング熱、狂犬病、ウエストナイル熱その他のウイルス性感染症等を挙げることができる。
　食中毒は、食物などに含まれていた有害・有毒な原因物質を摂取することによって惹起される毒素性の食中毒が多い。と、微生物感染に起因して感染症を起こす感染型、中間型等に分けられる。毒素型としては、エンテロトキシン、ボツリヌス毒素、テトロドトキシン、アフラトキシン、ベロ毒素、きのこに含まれる各種の毒素等によるものを挙げることができる。また、感染型としては、腸炎ビブリオ、サルモネラその他の細菌感染によるものを挙げることができる。
　本発明の第４の態様は、（ａ）リガンド進化用リンカーと、前記リンカーと相補的な配列を有するｍＲＮＡとを、前記リンカーのｍＲＮＡ結合部位でＲＮＡリガーゼによって結合させる、ｍＲＮＡ－リンカー連結体生成工程と；（ｂ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡ鎖から酵素様活性を有するタンパクを合成し、前記タンパクが前記リンカーの側鎖上のタンパク結合部位に結合されたリンカー－タンパク－ｍＲＮＡ結合体を得る結合体生成工程と；（ｃ）ｍＲＮＡを消化して、固相結合可能なベイトタンパク質である、上述したリガンドを得る、ベイトタンパク質形成工程と；（ｄ）前記ベイトタンパク質の固相結合部位に結合した所定の分子と、前記固相上に結合された所望の分子とを連結し、前記ベイトタンパク質を固相に固定する固定化工程と；
（ｅ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と；（ｆ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と；（ｇ）前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と；を備えるプレイタンパク質のスクリーニング方法である。
　ここで、前記リンカーは主鎖と側鎖とからなり、前記主鎖はその３’末端近傍に位置し、前記側鎖を結合する側鎖結合部位と；その５’末端側に位置し、前記固相との結合を形成する所定の分子を結合する固相結合部位と；を有し、前記側鎖は標識を結合するための標識結合部位と、前記ベイトタンパク質と結合するタンパク質結合部位と、を有し、前記側鎖の前記標識結合部位には前記標識が結合されている、ことを特徴とする。
　また、前記側鎖は、任意の塩基配列又はポリエチレングリコールスペーサーで形成されていることが好ましく、前記所定の分子はビオチンであることが好ましい。また、前記連結酵素はT4 RNAリガーゼであることが好ましい。
　さらに、前記固相は磁性粒子であることが好ましく、前記収集工程では、前記固相が磁気によって収集されることが好ましい。
　特定のタンパク質又はタンパク質断片を餌とし、それと相互作用するタンパク質又はタンパク質断片をライブラリー中からスクリーニングする際に、餌となるタンパク質側を「ベイト（bait）」といい、釣られるタンパク質側を「プレイ（prey、餌食）」という。
　ここで、ベイトタンパク質（bait protein）としては、例えば、上述した本発明のリガンドのほか、所望のタンパク質を使用することができる。また、プレイタンパク質（prey protein）としては、例えば、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることが好ましく、サバイビンモノマー又はサバイビンダイマーであることが、特に好ましい。ここで、上記「低分子化合物」とは、分子量30～1,500の範囲にある化合物をいい、糖鎖の有無を問わない。例えば、アフラトキシンＢ１、シガトキシン、フルオロセイン、N-アセチル-D-グルコサミン等を挙げることができる。
　本発明によれば、抗体と同様に、標的分子、アンタゴニスト、又はアゴニストとして機能するリガンドを得ることができる。また、抗体と比較すると、低コストで生産することが可能である。
　また、本発明によれば、迅速かつ正確な疾病マーカーの検出が可能となる。
　さらに、本発明によれば、ベイトタンパク質と所望の相互反応をするプレイタンパク質を、迅速かつ簡便なスクリーニング方法によって得ることができる。
図１は、本発明のリガンドを表す模式図である。 図２は、本発明のリガンドの作製に使用したBucandin（A）と、他のスリーフィンガースキャフォールド（Erabutokin-a（B）、Toxin-α（C）、Candoxin（D））との構造を対比して示した、模式図である。 図３は、本発明のリガンドの構造をアミノ酸配列として示す図である。 図４は、サバイビンの構造を示す模式図である。 図５は、本発明のリガンドが結合されたリンカーが磁性体ビーズに固定された場合を示す模式図である。 図６は、本発明のリガンドの構造を示す模式図である。
図７は、IVV法による本発明のリガンドの選択、増幅、淘汰を示す模式図である。 図８は、本発明のスクリーニング方法を示す模式図である。 図９は、ラウンド５及びラウンド７で得られたリガンドと標的分子との結合の状況を示す電気泳動像である。 図１０は、ラウンド７で得られたリガンドと標的分子との結合の状況を示す電気泳動像である。 図１１は、ラウンド６（Ｒ６）、ラウンド７（Ｒ７）及びラウンド１２（Ｒ１２Ａ～Ｄ）で得られたリガンドと標的分子との結合を示すゲル電気泳動写真及び相対的結合活性を示すグラフである。
　以下に、本発明を、図１～９を参照しつつ、さらに詳細に説明する。
　本明細書中では、スリーフィンガー様スキャフォールドのアミノ酸配列に含まれ、ジスルフィド結合を形成する保存システインを、Ｎ末端側から順番にそれぞれＣ１～Ｃ８と示す。
　また、「対応づけられた形で存在する」とは、タンパク質とそれをコードするポリヌクレオチドとが、これらを１対１で対応づけることが可能な様式で存在することを意味する。このような対応付け技術はディスプレイ技術とも呼ばれるが、種々の技術が知られている。無細胞翻訳系を利用した対応付け技術としては、リボソームディスプレイ法、STABLE法（非共有結合DNAディスプレイ法）、マイクロビーズドロップレット法、共有結合DNAディスプレイ法を上げることができ、本発明で使用するインビトロウイルス法も含まれる。上記インビトロウイルス法では、上記リガンドは、例えば、ピューロマイシンを介してそのリガンドをコードするポリヌクレオチドと結合している。また、ファージディスプレイ法、イーストディスプレイ法、バクテリアディスプレイ法その他のディスプレイ法のように、個々のファージや細胞中に、上記リガンドをコードするポリヌクレオチドの対が含まれるようになっていてもよい。
　図１に、スリーフィンガースキャフォールド構造を有する本発明のリガンドを、模式的に示す。図１中、幅の広い矢印で表わされた部分は、βシート構造を有する部分を示し、各フィンガーは、本リガンドの５’末端側から順に、L1～L3の番号で示す。図１中、βシートの向きを表す矢印の向きから明らかなように、L1とL2のβシート構造の部分は、互いに逆向きとなっている。
　すなわち、本発明の第１の態様のリガンドは、（ａ）互いに逆向きのβシート（アンチパラレルβシート）と、（ｂ）それらに挟まれたループ領域と、からなる３つのフィンガーを備え、（ｃ）各フィンガーのループ領域には、標的分子と結合する指先部分が含まれている。そして、本発明のリガンドは、以下のいずれかのアミノ酸配列を有している。
　MECYR(X7)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１）
　MECYR(X6)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１６）
　ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。したがって、上記アミノ酸配列中、X7はアミノ酸7個の配列を、X6はアミノ酸6個の配列を、X4はアミノ酸4個の配列を、また、X2はアミノ酸2個の配列を、それぞれ示す。
　ここで、スリーフィンガースキャフォールド（以下、「3FS」という。）を有するタンパク質としては、例えば、下記表1に示すものを上げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記表1に示すニューロトキシンのうち、Erabutoxin-a（エラブトキシン－a）、Toxin-α（トキシン－α）、Candoxin（カンドキシン）及びBucandin（ブカンディン）の構造を模式的に図２(Ａ)～２(Ｄ)に示す。これらのうち、図２Ａに示すBucandin以外は、３つのフィンガーの長さの差が大きいこと、標的分子の認識性が高いこと、及び低分子に対する認識性は低いことが知られている。
　これに対し、Bucandinは３つのフィンガーの長さ、分子全体の大きさが上記の３つのニューロトキシンとは相違する。Bucandinは、他の３つに比べて３つのフィンガーの長さの差が比較的小さく、低分子に対する認識性を高める可能性があると考えられることから、3Fを有するタンパク質として好適に使用することができる。
　Bucandinは、マレーアマガサヘビ属Bungarus candidusの毒から単離されたペプチドであり、63アミノ酸で構成されている。このタンパクは、神経毒及び細胞毒であり、血小板凝集阻害作用を持ち、イオンチャネルブロッカーとしても機能する。
　また、L1～L3のループ領域の指先部分のランダム化は、以下に示すように、cDNAディスプレイ法によって行うことが好ましい。3F-cDNAディスプレイ法は、多数のリガンドを生成し選択を行うのに適しており、また、こうした一連の流れを1ラウンドとしたときの進化の速度を速めることができること、さらに、確実に逆転写を行う際に酸化過程を経ることになるため、ジスルフィド結合が形成され、改変されたBucandinを効率的に得ることができるからである。
　ここで、「ランダム化」とは、上記タンパク質の所定の位置に、もとのBucandinのアミノ酸配列を、それとは異なるアミノ酸配列と置換することをいい、X7及びX4には、同一のアミノ酸のみで置換された配列を含まない。
　また、あるラウンドで得られた配列情報に基づいて、アミノ酸配列の特定の位置のみをランダム化し、残りの位置の配列は変化させないようにすることもできる。
　標的分子とは、本発明のリガンドが結合しうる任意の分子をいい、例えば、タンパク質、糖タンパク質、糖類、核酸、各種の低分子化合物等を挙げることができる。具体的には、各種レセプター、ウイルスや細胞の表面抗原、抗体、ホルモン、DNA、RNA等が挙げられる。タンパク質と標的分子との結合は、疎水性結合、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス結合のいずれであってもよい。
　本発明のリガンドの標的分子は、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれる低分子のペプチドであることが好ましい。特に、サバイビンは、アポトーシスタンパク質阻害因子（IAP、アポトーシス経路のタンパク質分解成分であるカスパーゼを阻害する一群のタンパク質）である。そして、癌細胞で高頻度に発現していることが知られており、また、抗がん剤への耐性にも関与しているといわれている。
　サバイビンの構造を、図４に模式的に示す。サバイビンは、モノマー又はダイマーのいずれでも機能するが、図４に示す通りの複雑な構造を有する。また、サバイビンは、本発明のリガンドとは、モノマー又はダイマーのいずれであっても結合するため、疾病のマーカーとして重要である。
　また、低分子化合物は、分子量30～1,500の範囲にある化合物をいい、糖鎖の有無を問わない。具体的には、アフラトキシンＢ１、シガトキシン、フルオロセイン、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン等を挙げることができ、特にアフラトキシンB1、シガトキシン等を、食中毒予防の理由から好適に使用することができる。
　「ランダム化配列」としては、X7は下記（Ａ）から選ばれるいずれかの配列であり、X4は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、X2は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることが、標的分子であるサバイビンや上述した低分子化合物との結合性が高いために好ましい。
（Ａ）PTQPKRT（配列番号２）、PNPADRN（配列番号４）、NPPTSDT（配列番号６）、PEVDIRQ（配列番号８）、ETNNGQP（配列番号10）、RRSMHTV（配列番号12）及びPRTIRA（配列番号14）
（Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号11）、IAKN（配列番号13）及びDLAE（配列番号15）
（Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
　また、X7,X4及びX2の組み合わせが、（ａ）PTQPKRT（配列番号２）、GTRQ（配列番号３）、PP；（ｂ）PNPADRN（配列番号４）、NPSH（配列番号５）、NR；（ｃ）NPPTSDT（配列番号６）、PGNT（配列番号７）、TQ；（ｄ）PEVDIRQ（配列番号８）、KLPR（配列番号９）、KP；（ｅ）ETNNGQP（配列番号10）、TIPA（配列番号11）、ER；（ｆ）RRSMHTV（配列番号12）、IAKN（配列番号13）、TP；（ｇ）NPRTIRA（配列番号14）、DLAE（配列番号15）、NQ；のいずれかであることが、上述した標的分子との結合性が一層高いことから、さらに好ましい。
　上記のようなランダム化配列を含むDNAテンプレートを、図６に模式的に示す。図６中、「ループ１（7aa）」はループ１中のランダム化配列部分が、上述した７アミノ酸で構成されていることを示す。ループ２（4aa）及びループ３（2aa）についても同様に、それぞれのランダム化配列部分が４アミノ酸、２アミノ酸で構成されていることを示す。
　また、X6は下記（Ａ’）から選ばれるいずれかの配列であり、X4は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、X2は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることが、標的分子であるサバイビンや上述した低分子化合物との結合性が高いために好ましい。
（Ａ’）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、RRSMHTV（配列番号１２）、及び配列番号１４で表わされる７個のアミノ酸からなる配列において、各配列からいずれか１個のアミノ酸が欠失した６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号11）、IAKN（配列番号13）及びDLAE（配列番号15）；
（Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
　また、本発明のリガンドは、それをコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在していることが好ましく、ピューロマイシンを介してそれぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと結合していることが特に好ましい。上記のように対応付けられた形で存在することによって、種々の機能を有するリガンドの選択を、効率よく行うことができるからである。
　後述する方法で作製した本発明のリガンドを用いて、各種の疾病マーカーを検出することができる。具体的には、（ａ）上述したリガンドを調製し、（ｂ）前記リガンドと血清とを接触させてリガンド－標的分子結合体を形成させ、（ｃ）前記リガンド－標的分子結合体を選択し、（ｄ）前記選択された標的分子の血清中レベルを求めることによって、疾病マーカーの検出をすることができる。
　疾病マーカーの検出は、一般的に使用されるUV検出装置、透過光測定装置、蛍光検出装置等を使用して、所望の波長を用いて行うことができる。これらの中でも、蛍光検出を行うことが、精度の高さの面で好ましい。
　本明細書において、「インビトロウイルス（IVV）」とは、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドがピューロマイシンを介して結合している複合体をいい、ｍＲＮＡ－ピューロマイシン－タンパク質、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ－ピューロマイシン－タンパク質、およびＤＮＡ－ピューロマイシン－タンパク質が含まれる。ピューロマイシンは、アミノアシル－ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上の伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する性質を有する。適当なリンカーを介してｍＲＮＡとピューロマイシンとを結合させておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡからタンパク質を合成すると、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体を得ることができる（Nemoto et al., FEBS Lett., 414, 405-408, 1997）。
　次に、この複合体のライブラリから所望の機能をもつタンパク質を選択する。mRNAとタンパク質の複合体は、選択前に逆転写し、mRNA/cDNA－タンパク質複合体として選択することもでき、選択した後に逆転写によりDNAを合成してもよい。すなわち、mRNAから逆転写酵素を用いてDNAを合成して、mRNA/cDNAハイブリッドとタンパク質の複合体の形とし、この複合体を選択してもよい（非特許文献、Yamaguchi, et al., cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions, Nucleic Acids Res, 37, e108, 2009）（非特許文献、Mochizuki, et al., One-pot preparation of mRNA/cDNA display by a novel and versatile puromycin-linker DNA, ACS Comb. Sci., 13, 478-485, 2011）。
　本発明のスクリーニング方法で使用するリガンド進化用リンカーは、以下のようにして作成することができる。
　上記リンカーは、（ａ）固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位（BB）と；（ｂ）前記リンカーの５’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位（mRNA結合部位）（MB）と；（ｃ）前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖結合部位（側鎖連結部位）（SB）と；（ｄ）前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域（PR）と、を備える主鎖と；（ｅ）前記側鎖連結部位（SB）に連結される側鎖とを有する。
　ここで、「固相」とは、ビーズ、反応容器の側壁、底面等をいい、本願発明で使用するリンカーが直接的又は間接的に固定される。磁性粒子を使用することが、ハイスループットスクリーニングを可能にすることから好ましい。
　本明細書中において、「所定のmRNA」には、遺伝子をコードする配列、又は連結体形成、翻訳反応促進に必要な配列、あるいはその他の配列等を有するmRNAが含まれるものとする。
　前記（ａ）中で使用する所定の分子としては、例えば、固相にアビジン及びストレプトアビジン等が結合されている場合にはビオチン、マルトース結合タンパク質が結合されている場合にはマルトース、Ｇタンパク質が結合されている場合にはグアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチドが結合されている場合にはNi又はCo等の金属、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが結合されている場合にはグルタチオン、配列特異的なDNA又はRNA結合タンパク質が結合されている場合にはこれらに特異的な配列を有するDNA又はRNA、抗体又はアプタマーが結合されている場合には抗原又はエピトープペプチド、カルモジュリンが結合されている場合にはカルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質が結合されている場合にはATP、エストラジオール受容体タンパク質が結合されている場合にはエストラジオール等を挙げることができる。
　これらの中でも、ビオチン、マルトース、Ni又はCo等の金属、グルタチオン、抗原分子又はエピトープペプチド等を使用することが好ましく、リンカー合成の容易さの面から、ビオチンを使用することが、さらに好ましい。
　こうした固相結合部位（BB）は、上述したmRNA－リンカー－タンパク質連結体等の連結体を、リンカーを介して固相に結合させるための部位であり、少なくとも１～10塩基で構成されることが好ましい。具体的には、下記式（III）で示されるビオチン修飾デオキシチミジン（ｄＴ）であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、上記の特定のポリペプチド等の固相結合部位への導入は、タンニン酸、ホルマリン、グルタールアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス－ジアゾ化ベンジゾン、トルエン－２，４－ジイソシアネート等を利用する方法によっても行うことができるが、ＩＶＶの変性を避けるために分子間の親和性のみを利用して行うことが好ましい。
　前記mRNA連結部位は、少なくとも１～10塩基で構成されるものであることが好ましい。前記mRNA連結領域（MB）は、あらかじめリン酸化されている必要はないが、所定のmRNAと連結されるためには、前記mRNAの3'末端とのライゲーション反応に先だって、又はライゲーション反応中に、キナーゼ等によりリン酸化される必要がある。
　前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖結合部位（SB）は、後述する側鎖が連結する部位である。
　また、例えば、リンカーの側鎖連結部位（SB）が、下記式（IV）で表わされるAmino-Modifier C6 dTで構成されている場合には、前記側鎖の5'末端を下記式（V）の5'-Thiol-Modifier C6として、下記式（VI）で表わされるEMCSを用いて架橋させ、主鎖と側鎖とを連結させることができる。
なお、下記の式では保護基がついた状態を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　前記プライマー領域（PR）は、前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能する領域であり、前記側鎖連結部位の３’側に隣接している。
　ここで、プライマー領域（PR）は、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能する領域である。この領域は、約1～15塩基からなることが好ましく、特に３～５塩基からなることが好ましい。15塩基を越えると、リンカーとしての結合効率が悪くなるため、リンカーとの結合効率及びプライマーとしての反応効率という面から、上記の塩基数とすることが好ましい。
　また、前記（ｆ）の前記側鎖連結部位（SB）に連結する側鎖は、主鎖と相補的なmRNAから合成されたタンパク質を連結するタンパク質連結部位（タンパク質結合部位）（Ｐ）と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基（Ｆ）とを有するものである。
　ピューロマイシンの他に、伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意のピューロマイシン誘導体を用いることができる。例えば、ヌクレオチド配列の３'末端とアミノ酸がアミド結合を形成しているピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン（rCpPur）、デオキシジルピューロマイシン（dCpPur）、デオキシウリジルピューロマイシン（dUpPur）等のピューロマイシン類縁体の他、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（PANS-アミノ酸）、3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（AANS-アミノ酸）等を挙げることができる。
　PANS-アミノ酸としては、例えば、PANS-Gly、PANS-Val、PANS-Ala等を挙げることができ、AANS-アミノ酸としては、AANS-Gly、AANS-Val、AANS-Ala等を挙げることができる。また、ヌクレオシドとアミノ酸とがエステル結合したものなども使用することができるが、ピューロマイシンを使用することが、前記タンパク質連結部位におけるタンパク質の連結の安定性が高いことから特に好ましい。
　また、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾、複合体の検出のための標識、精製を容易にするためのアフィニティー部位、他の分子への結合を容易にするための結合部位などを含むよう設計された種々の誘導体が市販されているか、または容易に製造することができる。以降のような構造のリンカーとすることによって、mRNA/cDNAハイブリッドとタンパク質の複合体形成後にジスルフィド結合形成ステップを導入でき、結果、スリーフィンガースキャフォールド構造の形成が可能となる。
　また、スペーサーとしては、下記式（VII）で表わされるSpacer 18 Phosphoramidite等の分子を、柔軟性があり、立体障害性が低いことから好適に使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　前記側鎖が短い場合には、ピューロマイシン類縁体がリボソームに取り込まれるときに立体障害が発生するため、前記側鎖は上記のようなPhosphoramidite分子が１～８個程度連なった構造を有するものであることが好ましい。リンカーの合成効率及び上述した各連結体の形成効率とのバランスの点から、こうしたPhosphoramidite分子が４個程度連なった構造を有するものであることがさらに好ましい。
　前記側鎖が、前記タンパク質連結部位と、前記側鎖連結部位との間に蛍光基を有することで、後述するcDNAディスプレイ法の各工程において、リンカーの有無を容易に検出することが可能となる。
　蛍光基としては、例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホロアミダイドに変換可能な水酸基、又はアミノ基等のフリーの官能基を有し、標識された塩基としてリンカーに連結することができる蛍光化合物を使用することが好ましい。このような蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Fluorescein-dT等を挙げることができる。これらの中でも、分子標識用の化合物として使用されるFluorescein-dTを使用することが、合成が容易であることから好ましい。以下に、Fluorescein-dTの構造式（VIII）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　主鎖の設計に際しては、各種のmRNAのコード配列を参考にすることができる。例えば、配列が知られている各種のレセプタータンパク質をコードするmRNA、各種抗体又はその断片をコードするmRNA、各種酵素をコードするmRNA、各種遺伝子ライブラリ中のDNAから転写される配列未知のmRNA、有機合成によってランダムに合成された配列を有するDNAから転写されたランダムな配列を有するmRNA、PCR法を利用したランダム変異の挿入により配列未知のタンパク質をコードするようになったDNAから転写されるmRNAその他のmRNA等を挙げることができ、終始コドンを含まないものであれば、これらの中から選択することができる。
　終止コドンを含まない配列であれば、mRNAのコード配列から翻訳されて生成されたポリペプチド鎖のＣ末端に、ピューロマイシンやその類縁体といったアミノアシルtRNAの3'末端アナログが取り込まれ、前記ポリペプチド鎖とmRNA－リンカー連結体とが連結されることになる。こうしたmRNAは、in vitro転写反応、化学合成、生体・細胞・微生物からの抽出その他の各種の方法を用いて得ることができる。リンカーとの連結及び無細胞翻訳の反応効率の点から、in vitro転写反応を用いて作製することが好ましい。
　また、5'末端の７－メチル化グアノシンキャップ構造、又は3'末端のポリＡ尾部構造の少なくとも一方の構造を有するものであることが、タンパク質の合成効率の点から好ましい。Kozak配列や、Shine-Dalgarno配列を有することが、翻訳の開始を促進することから、さらに好ましい。
　ここで使用するmRNAの長さは、原則として本発明を利用して分子進化させるべきタンパク質又はポリペプチドの長さより規定されるコード領域の長さに依存する。50～1,000塩基長であることが、反応効率の面からであることが好ましく、200～500塩基であることが、最も高い反応効率を得られることから、さらに好ましい。
　上記リンカーの作成にあたっては、まず、所望の配列となるように、常法に従ってDNAを合成し、主鎖として使用するための一本鎖のオリゴマーを作製する。このように合成した一本鎖オリゴマーは、固相結合部位と、２以上の切断部位と、mRNA連結部位と、側鎖連結部位と、プライマー領域とを備えている。２以上の切断部位の大きさ及び主鎖中の位置によって、主鎖となる一本鎖オリゴマーの長さを適宜決定する。
　次いで、所望の長さの側鎖を合成し、主鎖上の側鎖連結部位に連結させる。側鎖の遊離末端に、例えば、タンパク質結合部位としてピューロマイシンを導入し、上述したFluorescein-dTを蛍光標識部位に導入して、リガンド進化用リンカーを得ることができる。
　以上のようにして作成したリガンド進化用リンカーを使用して、所望の機能をもつタンパク質を選択した後、DNAの配列を分析することにより、タンパク質を同定することができる。
　Bucandin遺伝子を含むスリーフィンガースキャフォールド（以下、「3F」ということがある）-cDNAディスプレイ用の全長コンストラクトは、５’側にプロモーター、キャップ部位、非翻訳配列及び翻訳開始部位を含むフラグメント、３’側にスペーサー、タグ及びタグ配列を付加して構築することができ、例えば、以下のようにして作成することができる。
　各ループ領域のアミノ酸配列を、例えば、図３に示す部分でランダム化する。ついで、このように改変したリガンドの塩基配列の５’側に、T7プロモーター、キャップ部位、ω配列非翻訳配列（UTR）及び翻訳開始部位を含むT7-UTRフラグメントを付加し、３’側にスペーサー（GGGS）２、C-末端His6-タグ、スペーサー（GGGS）およびY-タグ配列を付加するよう設計する（図６）。
　T7-UTRは本願発明のリガンドの塩基配列のインビトロ転写および翻訳に、His6-タグ配列はライブラリの精製に、Y-タグ配列はmRNAとピューロマイシンリンカーへのライゲーションに用いるための配列である。スペーサーは、合成したタンパク質のフォールディングをスムーズにするために導入するものである。
　以上の配列としたコンストラクトを作製し、これを上述したcDNAディスプレイ法中で使用することにより、上述したX7、X4及びX2の部分が各種の配列で置換された３Fスキャフォールドを得ることができる。
　すなわち、所望の量のmRNAとリガンド進化用リンカーとを使用して、所望の条件下で翻訳を行う。
　DTTやヌクレアーゼの含有量の少ないもの、例えば、ウサギ網状赤血球等の無細胞翻訳系中で、リンカーに連結されたmRNAをリボソームが読み取ってタンパク質を合成する。合成されたタンパク質はピューロマイシン上に提示される。次いで、mRNAをRNaseによって消化し、その後、タンパク質中のシステイン間でジスルフィド結合を形成させ、目的とする３Ｆスキャフォールドを得ることができる。　そして、標的分子として、例えば、サバイビンを使用することによって、図３に示す配列の3Fスキャフォールドを得ることができる。
　タグ付きタンパク質を使った相互作用タンパク質解析では、プルダウンアッセイが最も一般的な方法である。プルダウンアッセイでは、まず、標的分子とタグペプチドとを所定の条件の下に結合させ、タグ付きタンパク質を作製する。次に、このタグ付きタンパク質を、所望のタンパク質抽出液と混合し、in vitroでタンパク質複合体を形成させる。
　このタンパク質複合体を抗体と反応させ、遠心等によって、タンパク質複合体を分離する。得られたタンパク質複合体を、SDS-PAGEで分離し、蛍光等を用いて分析する（図８参照）。
　具体的には、標的タンパクとして小型のタンパク、例えば、サバイビン（図４参照）を使用する。サバイビンをHis-6タグ等のタグペプチドと結合させる。
　次に、cDNAディスプレイ法で得た3F-cDNAディスプレイリガンドとともに、例えば、25℃で30分、バッファー（100mM NaCl、50mM Tris、1mM CaCl2、pH7.4）中にてインキュベートする。
　次いで、所望のプライマーとY-タグ配列等のタグ配列とを5～20pmol加えて、90～98℃で15～30秒、60～75℃で10～30秒、67～80℃で15～45秒のサイクルを20～30回繰り返し、PCRによる増幅を行う。これと同時に、ここで得られたリガンドの塩基配列のインビトロ転写および翻訳に使用する配列、例えば、T7-UTR配列の付加を同時に行うことができる。
　mRNAとピューロマイシンリンカーへのライゲーションには、Y-タグ配列を使用することができる。また、スペーサーを組み込んでおくと、合成したタンパク質のフォールディングをスムーズに行うことができる。
　このスキャフォールドを常法に従って精製することによって、上記疾病のマーカーの検出に使用するリガンドを得て、バッファーを加えて所望の濃度とすることにより、反応に使用するリガンド溶液を調製することができる。また、十分な量のスキャフォールドが形成されている場合には、特に精製をすることなく、使用することもできる。
　例えば、採取された検体が全血である場合には、室温にて低速、例えば、1,000×gで遠心して得られた血清を、所望の量で反応用のチューブに移し、上記溶液を必要に応じて適宜希釈しつつ、所定の量で添加し、リガンド－標的分子結合体を形成させる。上記リガンドを、固相と結合するため分子と結合させておけば、予め、上記リガンドを固相に結合させることができる（図５参照）。その後、血清を除去することによって、精度よく、かつ簡便に上記標的分子の血清中レベルを求めることができる。検体が血清である場合には、遠心等の血清抽出処理は不要である。
　採取された検体が組織片である場合には、常法に従ってホモジナイズし、遠心して上清を分離し、この上清を上記と同様に処理することにより、精度よく、かつ簡便に上記標的分子の組織中レベルを求めることができる。
　以上の手順によって、疾病のマーカーを検出ことができ、正常値と対比することによって、疾病に罹患しているか否かを推定することが可能となる。
　ここで、前記標的分子が、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれるものであることが好ましく、サバイビンモノマー又はサバイビンダイマーであることが好ましい。また、ペプチドアプタマーを標的分子とすることもできる。
　また、前記疾病が、腫瘍、感染症及び食中毒からなる群から選ばれるものであることが好ましい。腫瘍、感染症及び食中毒は、上述した通りである。これらの疾病の場合には、早期検査及び早期治療の開始によって、治療効果を上げることができる。
　本発明のプレイタンパク質のスクリーニング方法は、図６に示すように、
（ａ）リガンド進化用リンカーと、前記リンカーと相補的な配列を有するｍＲＮＡとを、前記リンカーのｍＲＮＡ結合部位でＲＮＡリガーゼによって結合させる、ｍＲＮＡ－リンカー連結体生成工程と；
　（ｂ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡ鎖から酵素様活性を有するタンパクを合成し、前記タンパクが前記リンカーの側鎖上のタンパク結合部位に結合されたリンカー－タンパク－ｍＲＮＡ結合体を得る結合体生成工程と；
　（ｃ）ｍＲＮＡを消化して、固相結合可能なベイトタンパク質である、請求項１～１１のいずれかに記載のリガンドを得る、ベイトタンパク質形成工程と；
　（ｄ）前記ベイトタンパク質の固相結合部位に結合した所定の分子と、前記固相上に結合された所望の分子とを連結し、前記ベイトタンパク質を固相に固定する固定化工程と；
　（ｅ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と；
　（ｆ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と；
　前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と；
を備えている。
　まず、所望の配列を有するDNAテンプレートを常法に従って作成する。例えば、T7プロモーター、オメガ配列、コザック配列、ベイトタンパク質コード領域、及びピューロマイシン‐リンカーのハイブリダイゼーション領域（HR）を含む配列を作成する。このように作成したDNAを、T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System (プロメガ（Promega）社製)を用いてmRNAに転写し、合成されたmRNAを、RNA精製キット（キアジェン(Qiagen)社製）で精製する。
　精製したmRNAをT4 RNA ligase (カタラバイオ社)及びポリヌクレオチドキナーゼ（以下、「PNK」と略すことがある、東洋紡社)によって、ピューロマイシン‐リンカーと連結し、ライゲーション産物をin vitro翻訳反応の鋳型として、例えば、Retic Lysate IVT kit (アンビオン(Ambion)社製)を用いて、所望の条件で反応させて、mRNA‐リンカー‐タンパク質融合体を調製する。
　EDTA溶液(0.5 M, pH 8.0)を翻訳溶液に加えて結合したリボソームを除去し、その後、RNase I (プロメガ(Promega)社製)を試料に加えてmRNA‐リンカー‐ベイトタンパク質融合体のmRNA部分を分解させる。
　このようにして得られたビオチン化ベイトタンパク質を、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (インビトロジェン(Invitrogen)社製)を用いて、製造元の指示書に従って溶液中から捕捉する。IgG及び抗-FLAGタグmAb (マウス：シグマ－アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社より購入)、抗FasLmAb（ハムスター：医学生物学研究所(Medical & Biological Laboratories)を準備する。
　各々のプレイタンパク質を、例えば、N-ヒロドキシスクシンイミド(NHS)-フルオレセイン(ピアス（Pierce）社製)を使用して標識し、得られた標識プレイタンパク質溶液を所望の濃度に調製して、磁性粒子と所望の温度で所望の時間インキュベートする。例えば、100～500 nMの濃度に調製したタンパク質溶液と、20～30℃で15～60分間インキュベートする。
　次いで、所望の濃度の界面活性剤を含有するリン酸緩衝生理食塩水で所望の回数洗浄し、残存しているプレイタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)試料溶液で溶出させる。例えば、0.005～0.02%のTweenを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS-T)で2～4回洗浄する。
　SDS-PAGE試料溶液で溶出させたタンパク質を、所望の温度で所望の時間インキュベートする。例えば、85～95℃で3～7分間インキュベートしし、その後、ゲル電気泳動に供して可視化する。
　以上のようにして、所望のプレイタンパク質をスクリーニングすることができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）Bucandinを用いたリガンドの作製
　本発明で使用するランダム領域を有するBucandinは、オペロン・バイオテクノロジー （株）より購入した。コンストラクト作製のために、T7プロモーター、キャップ部位、Xenopusグロブリン非翻訳配列（UTR）および翻訳開始部位を含むT7-UTRフラグメント、スペーサー（GGGS）２、His6-タグ、スペーサー（GGGS）およびY-タグ配列は、いずれもジーンワールド（株）から購入した。
　Bucandinは、図３に示す３つのループ領域の部分をそれぞれ、以下の方法でランダム化し、下記表２に示すNo.1～10のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のセットを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記表２に示すNo.1～15の配列を含むアミノ酸配列を組み込んだ3F(bucandin) loop1、3F(bucandin) loop2、3F(bucandin) loop3を、T4DNAリガーゼを用いて連結し、この連結体にT7-UTRフラグメント、His6-タグ及びスペーサーを、T4DNAリガーゼを用いてさらに連結した。次いで、T7-eXact-tagDNAを用いて、この連結体についてオーバーラップPCRを行い、図６に示すコンストラクトを得た。'
5'-CTCAAAATAA CGTGCTCGGC CGAGGAGACC  TTCTGCTACA AGTGGCTGAA CAAG-3'
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１７）
5'-CGTTGGCTGGGCTGCGCGAAGACTTGCACGGAGATCGACACC-3' （配列番号１８）
　また、プライマーとしては、以下の２つの合成オリゴマーを使用した。
5'-GATCCCGCGA　AATTAATACG　ACTCACTATA　GGG-3' （配列番号１９）
5'-TTTCCCCGCC  GCCCCCCGTC  CT-3' （配列番号２０）
　さらに、3F(bucandin) loop1(88mer)の配列は、以下通りである。
5'-TCCTCGGCCG AGCACGTTAT TTTGAGNNBN NBNNBNNBNN BNNBNNBGCG
 GTAGCACTCC ATCAAAGCTT TGAAGAGCTT GTCTTCTT-3' （配列番号２１）
　また、3F(bucandin) loop2 (60mer)の配列は、以下通りである。
5'-TTCGCGCAGC　CCAGCCAACG  NNBNNBNNBN NBCTTGTTCA GCCACTTGTA
  GCAGAAGGTC-3' 　　・・・（配列番号２２）
　さらにまた、3F(bucandin) loop3 (113mer)の配列は、以下通りである。
5'-TTTCCCCGCC  GCCCCCCGTC  CTTCCTGAGC  CTCCACTCCC TCCGCCCGTA
 TTACATAGAT  TGGTAGTACA  ACATTTATTA  TATACNNBNN  BGGTGTCGAT
  CTCCGTGCAA  GTC-3' 　　・・・（配列番号２３）
　T7-His-tagDNAの配列は、以下の通りである。
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGAGGGAAATCAAACGGGG-3' 　　・・・（配列番号２４）
　得られたDNAを、T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System (プロメガ（Promega）社製)を用いてmRNAに転写し、合成されたmRNAを、RNA精製キット（キアジェン(Qiagen)社製）で精製した。
（実施例２）　IVVアッセイ
（１）ピューロマイシン・ビオチン・リンカーの合成
　ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは、Puro-F-S（ジーンワールド社製）及びビオチン・ループ（BEX社）より購入した。
　この２つの修飾オリゴヌクレオチドを、常法に従って、二官能性試薬（EMCS）を用いて架橋させることにより合成した。ここで使用するPuro-F-Sは、予め、常法に従ってスペーサーの一方の端にピューロマイシンを結合させておき、フルオレセインで標識しておいた。このPyro-F-Sは、他方の端にチオール基を有していた。
　10nmolのPuro-F-Sのチオール基を、1mMのTCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）含有する50mMリン酸バッファー（pH 7.0,）100μLを用いて、室温で６時間還元した。その後、NAP-5カラム（GE　ヘルスケア社製）で、使用直前に脱塩した。
　全量で10nmolのビオチンループ及び2μmolのEMCSとを、100μLのリン酸ナトリムバッファー（pH 7.0）に加え、37℃で30分間インキュベーションした。その後、４℃でエタノール沈殿を行って、過剰のEMCSを除去した。
　生じた沈殿を予め冷却しておいた500μLの70％エタノールで2回洗浄し、予め冷却しておいた10μLの0.2Mのリン酸バッファー（pH 7.0）に溶解させた。還元したPuro-F-Sを速やかに加えて４℃で終夜撹拌した。
　4mMのTCEPを加えて37℃で15分間インキュベートすることによって反応を停止させた。次いで、室温にてエタノール沈殿を行い、過剰のPuro-F-Sを除去した。
　ビオチンループ及び架橋していないビオチンループ-EMCS複合体を除去するために、0.1MのTEAA（グレンリサーチ社製）又は0.1Mのリン酸バッファーを加えて、以下の条件でC18 HPLCにて精製した。
　カラム：AR-300（I.D. 4.6mm×250mm、ナカライテスク（株））
　溶媒A：0.1M　TEAA
　溶媒B：アセトニトリル／水（80/20、v/v）
　グラジエント：B/A（15‐35％、33分間）
　流速：0.5ｍL/分
　検出：254nm及び490nm
　254nmで検出された最後のピークの画分を集めた。乾燥後、得られたピューロマイシン‐リンカーをジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水に再懸濁して保存した。
　ビオチン・ループは、ステムループ構造をとることができる塩基配列と、ループ部分に結合したビオチンとで構成した。ステム部分には、制限酵素PvuIIの認識部位が組み込まれており、ここを切断することによって、IVVを回収した。ビオチン・ループのステムから３’側の配列は、上述の全長コンストラクト中のY-タグ配列と対応しており、このコンストラクトから生成したmRNAの３’側の配列とアニーリングする。５’末端では、mRNAとのライゲーションが起こる。
　ビオチン・ループの３’末端近傍のdTは１級アミノ基を有するよう修飾しておき、このアミノ基を介してEMCSによってPuro-F-Sと結合させた。ビオチン・ループの３’末端は、ライゲーションしたmRNAからの逆転写を行う際にプライマーとして機能した。
　Puro-F-Sのチオール基を還元し、ビオチン・ループとEMCSとの複合体を加えて、Puro-F-Sの末端チオール基とビオチン・ループ上のアミノ基とを結合させ、ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを得た。
（実施例３）Pull downアッセイ
（１）磁性粒子との結合
　ストレプトアビジンコート磁性粒子（2.3μm、MAGNOTEX、（株）タカラ）を、指示書に従って結合バッファー（10mMトリス塩酸バッファー（pH 8.0, 1mM EDTA, 1M NaCl, 0.1% Triton X-100））で2回洗浄した。48pmolのmRNA-ピューロマイシン-リンカーの連結体と1.2mgのストレプトアビジンビーズを、120μLの結合バッファー中で室温にて10分間インキュベートした。ついで、無細胞翻訳系に入れる前に、結合バッファー及び翻訳ミックスバッファーで各々1どずつビーズを洗浄した。
（２）ベイトタンパク質結合用3F-cDNA ディスプレイリガンドの作製
　マグネティックスタンドや磁石などの磁気を用いて磁性粒子を分離した後に、300μLの無細胞系翻訳エキストラクト（Ambion社製）を加え、30℃で20分間インキュベートした。タンパク質-リガンド融合体の収量を上げるために、翻訳産物を、高塩濃度下（KCL及びMgCl2、各々の終濃度は750mM及び63mM）で90分間37℃にてさらにインキュベートした。
　その後、ｍRNA-タンパク質複合体をディスプレイしたビーズを、RNase阻害剤（SUPERaseIn、Ambion社製）を含む結合バッファー200μLで2回洗浄し、100μLのTRバッファー（50mMトリス塩酸(pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2)）でリンスした。
　逆転写を42℃で10分間、80μLのRTバッファー及び80ユニットの逆転写酵素M-MLV（（株）タカラ）をビーズに加えて行った。
　以上のようにして、cDNA-タンパク質結合体が表面に固定された、cDNA-タンパク質結合体固定磁性粒子を得た。
（３）リフォールディング
　得られたcDNA-タンパク質結合体固定磁性粒子を、100mMのジチオスレイトール（DTT）で1時間、25℃で還元し、結合バッファー（（株）タカラ）で洗浄した。リフォールディングは、1mMの酸化グルタチオン、10mMの還元グルタチオン、及び使用したcDNA-タンパク質結合体と等モルのプロテインジスルフィドイソメラーゼの存在下に、25℃で１時間行った。ビーズを洗浄して、ベイトタンパク質固定化磁性粒子を得た。
（４）プレイタンパク質との反応
　次いで、各々のプレイタンパク質を、N-ヒロドキシスクシンイミド(NHS)-フルオレセイン(ピアス（Pierce）社製)を使用して、<1.0 色素／タンパク質の割合で標識した。
　得られたフルオレセイン標識プレイタンパク質溶液(200又は400 nM)を、ベイトタンパク質を固定化した磁性粒子と25℃で30分間インキュベートした。この磁性粒子を、0.01% Tween20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS-T)で3回洗浄した。次いで、磁性粒子上に結合されているプレイタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)試料溶液で溶出させた。
　溶出させた生成物を、T7配列と一部のUTRを含む下記のプライマー
[GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA]
　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号２５）
とY-tag配列を、それぞれ10pmolで用いて、95℃25秒、69℃20秒、72℃30秒のサイクルを25回繰り返し、PCRによる増幅と、T7-UTRの配列を付加とを同時に行った。実施例２と同様にして転写させ、得られたmRNAをピューロマイシンリンカーにライゲーションさせ、翻訳、逆転写を行って、DNA/mRNA-ピューロマイシンリンカー－タンパク質複合体を得た。
　この複合体を、第２の3F-cDNA ディスプレイ用リガンドとして、次のラウンドで使用した。この手順を繰り返し、複数ラウンドで選択を行い、リガンドを作製した。第２ラウンド以降の各ラウンドにおいて、標的分子であるサバイビンの濃度を1ラウンド目から4ラウンド目は200pmol、5ラウンド目は100pmol、6ラウンド目は50pmol、インキュベーション時間を各々30分として反応させた。
　7ラウンド目は、サバイビンの濃度を10pmol、インキュベーション時間を15分、8ラウンド目はサバイビン濃度を10pmol、インキュベーション時間を5分とした。9ラウンド目から12ラウンド目までは、サバイビン濃度を、9ラウンド目は10pmol、10ラウンド目は4pmol、11ラウンド1pmol、12ラウンド0.5pmol、インキュベーション時間を4分として、洗浄の回数を増やして、選択圧を順次高めた。
　各ラウンドのサバイビン濃度と、インキュベーション時間とを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ラウンド６（R6）、ラウンド７（R7）、ラウンド12については、ラウンド12（A）～（D）の４つのクローンを得た。
　ラウンド５（R5）及びラウンド７（R7）を対比した結果を、図９に示す。図９には、バッファー（0.1M NaCl、50mM Tris、1mM CaCl2、pH7.4）でビーズを洗浄した結果と、EDTAによってサバイビンをビーズから解離させて溶出した結果とを対比して示した。サバイビンの固定量は、R5では100pmol、R7では10pmolとした。
　図９に示すように、R5では、結合力の低いものが洗浄によって溶出されたが、R7ではこのような溶出は認められなかった。一方で、サバイビンをビーズから解離させて溶出した2つのレーンでは、いずれのラウンドでも同様の結果が得られた。
　以上から、リガンドの結合力は、ラウンドを重ねることによって上昇することが示された。
　ついで、ラウンド６、７及び12で得た上記リガンドを、ストレプトアビジン誘導化セファロースビーズ（磁性体ビーズ）にピューロマイシン・ビオチン・リンカーで固定し、蛍光修飾されたサバイビンと結合させた。
　バッファー（Tris-HCl(pH8.0)100mM、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1%tween20、10μM biotin）でビーズを洗浄し、25μLのSDS-PAGEサンプルバッファー（0.5M Tris-HCl、10%SDS、10%βメルカプトエタノール、175mMスクロース、8M尿素）を用いて、サバイビンを溶出させた。得られた各溶出液を12μLずつとって、4％＋16％　SDS-PAGEに供し、10mAにて130分間泳動させ、泳動結果をFITCで検出した。結果を図９に示す。
　ラウンド６及び７の泳動結果によれば、No. 1, 4, 7及び10で溶出されたサバイビンの量が多いと判断された（図10参照）。
　ラウンド12で得られた４つのリガンド（R12A～R12D）の結合性を、ラウンド６（R6）及びラウンド７（R7）で得られたそれらと比較した。結果を図11に示す。図11の上段にはゲル電気泳動の結果を、下段には溶出されたサバイビンの量に基づく結合活性を示した。ラウンド12のB～Dは、ラウンド6及び7よりも結合活性が高く、特に、R12Bの活性が高くなっていた。
　以上の結果から、cDNA ディスプレイによって、サバイビンを認識できるリガンドを作製ですることができたこと、及び選択圧を高めることにより、結合活性の高いリガンドを選択することができたことが確認された。
　本発明は新規タンパク質又はポリペプチドを検出する技術に貢献し、医薬又は診断薬の研究開発に有用である。
　配列番号１：突出ジスルフィド結合、βシート及び３つの突出ループを有するスリーフィンガータンパク質；Xaaは任意のアミノ酸
配列番号２：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号３：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号４：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号５：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号６：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号７：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号８：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号９：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号１０：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号１１：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号１２：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号１３：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号１４：スリーフィンガータンパク質のループ１内の部分
配列番号１５：スリーフィンガータンパク質のループ２内の部分
配列番号１６：突出ジスルフィド結合、βシート及び３つの突出ループを有するスリーフィンガータンパク質；Xaaは任意のアミノ酸
配列番号１７：スプリントＤＮＡ
配列番号１８：スプリントＤＮＡ
配列番号１９：スリーフィンガータンパク質－cDNA複合体を作製するためのプライマー
配列番号２０：スリーフィンガータンパク質－cDNA複合体を作製するためのプライマー
配列番号２１：3F(bucandin) loop1；nは任意のヌクレオチド
配列番号２２：3F(bucandin) loop2；nは任意のヌクレオチド
配列番号２３：3F(bucandin) loop3；nは任意のヌクレオチド
配列番号２４：T7-eXact-tagDNA
配列番号２５：スリーフィンガータンパク質-cDNA複合体を濃縮するためのプライマー

Claims (21)

  1. 　アンチパラレルβシートとそれらに挟まれたループ領域とからなる３つのフィンガーを備え、少なくとも、各フィンガーのループ領域が構成する指先部分と標的分子とが結合するリガンドであって、以下のアミノ酸配列を有するリガンド。
    MECYR(X7)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１）
    　ここで、Ｘは、前記フィンガーの指先部分を構成する任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。Ｘ７及びＸ４は、同一のアミノ酸で構成されることはない。
  2. 　前記指先部分のアミノ酸配列のうち、Ｘ７は下記（Ａ）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ４は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ２は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載のリガンド。
    （Ａ）PTQPKRT（配列番号２）、PNPADRN（配列番号４）、NPPTSDT（配列番号６）、PEVDIRQ（配列番号８）、ETNNGQP（配列番号１０）、RRSMHTV（配列番号１２）及びPRTIRA（配列番号１４）；
    （Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号１１）、IAKN（配列番号１３）及びDLAE（配列番号１５）；
    （Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
  3. 　前記指先部分のアミノ酸配列のＸ７、Ｘ４及びＸ２の組み合わせが、下記（ａ）～（ｆ）及び（ｇ）からなる群から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリガンド。
    （ａ）PTQPKRT（配列番号２）、GTRQ（配列番号３）、PP；
    （ｂ）PNPADRN（配列番号４）、NPSH（配列番号５）、NR；
    （ｃ）NPPTSDT（配列番号６）、PGNT（配列番号７）、TQ；
    （ｄ）PEVDIRQ（配列番号８）、KLPR（配列番号９）、KP；
    （ｅ）ETNNGQP（配列番号１０）、TIPA（配列番号１１）、ER；
    （ｆ）RRSMHTV（配列番号１２）、IAKN（配列番号１３）、TP；
    （ｇ）NPRTIRA（配列番号１４）、DLAE（配列番号１５）、NQ
  4. 　前記標的分子が、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のリガンド。
  5. 　前記リガンドが、前記リガンドのコードするポリヌクレオチドと対応付けられた形で存在していることを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載のリガンド。
  6. 　前記リガンドが、ピューロマイシンを介して前記リガンドをコードするポリヌクレオチドと結合していることを特徴としている、請求項１～５のいずれかに記載のリガンド。
  7. 　アンチパラレルβシートとそれらに挟まれたループ領域とからなる３つのフィンガーを備え、少なくとも、各フィンガーのループ領域が構成する指先部分と標的分子とが標的分子と結合するリガンドであって、以下のアミノ酸配列を有するリガンド。
    MECYR(X6)LKITCSAEETFCYKWLNK(X4)RWLGCAKTCTEID(X2)NVYNKCCTTNLCNT
    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（配列番号１６）
    　ここで、Ｘは、前記フィンガーの指先部分を構成する任意のアミノ酸を表わし、各数字はアミノ酸の数を表わす。Ｘ６及びＸ４は、同一のアミノ酸で構成されることはない。
  8. 　前前記指先部分のアミノ酸配列のうち、Ｘ６は下記（Ａ’）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ４は下記（Ｂ）から選ばれるいずれかの配列であり、Ｘ２は下記（Ｃ）から選ばれるいずれかの組み合わせであることを特徴とする、請求項７に記載のリガンド。
    （Ａ’）PTQPKRT（配列番号２）、PNPADRN（配列番号４）、NPPTSDT（配列番号６）、PEVDIRQ（配列番号８）、ETNNGQP（配列番号１０）、RRSMHTV（配列番号１２）及びPRTIRA（配列番号１４）で表わされる７個のアミノ酸からなる配列において、各配列からいずれか１個のアミノ酸が欠失した６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列；
    （Ｂ）GTRQ（配列番号３）、NPSH（配列番号５）、PGNT（配列番号７）、KLPR（配列番号９）、TIPA（配列番号１１）、IAKN（配列番号１３）及びDLAE（配列番号１５）；
    （Ｃ）PP、NR、TQ、KP、ER、TP及びNQ
  9. 　前記標的分子が、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７又は８に記載のリガンド。
  10. 　前記リガンドが、前記リガンドのコードするポリヌクレオチドと対応付けられた形で存在していることを特徴とする、請求項７～９のいずれかに記載のリガンド。
  11. 　前記リガンドが、ピューロマイシンを介して前記リガンドをコードするポリヌクレオチドと結合していることを特徴としている、請求項７～１０のいずれかに記載のリガンド。
  12. 　（ａ）請求項１又は７に記載のリガンドを調製するリガンド調製工程と；
    　（ｂ）前記リガンドと検体とを接触させてリガンド－標的分子結合体を形成させる結合体形成工程と；
    　（ｃ）前記リガンド－標的分子結合体を選択する選択工程と；
    　（ｄ）前記選択された標的分子の検体中レベルを求める濃度算出工程と；
    を備える、疾病マーカーの検出方法。
  13. 　前記標的分子が、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の疾病マーカーの検出方法。
  14. 　前記疾病が、腫瘍、感染症及び食中毒からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の疾病マーカーの検出方法。
  15. 　（ａ）リガンド進化用リンカーと、前記リンカーと相補的な配列を有するｍＲＮＡとを、前記リンカーのｍＲＮＡ結合部位でＲＮＡリガーゼによって結合させる、ｍＲＮＡ－リンカー連結体生成工程と；
    　（ｂ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡ鎖から酵素様活性を有するタンパクを合成し、前記タンパクが前記リンカーの側鎖上のタンパク結合部位に結合されたリンカー－タンパク－ｍＲＮＡ結合体を得る結合体生成工程と；
    　（ｃ）ｍＲＮＡを消化して、固相結合可能なベイトタンパク質である、請求項１～１１のいずれかに記載のリガンドを得る、ベイトタンパク質形成工程と；
    　（ｄ）前記ベイトタンパク質の固相結合部位に結合した所定の分子と、前記固相上に結合された所望の分子とを連結し、前記ベイトタンパク質を固相に固定する固定化工程と；
    　（ｅ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と；
    　（ｆ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と；
    　前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と；
    を備える、プレイタンパク質のスクリーニング方法。
  16. 　前記リンカーは主鎖と側鎖とからなり、
    　前記主鎖は、その３’末端近傍に位置し、ピューロマイシン結合用のスペーサーとして機能する側鎖を結合する側鎖結合部位と；その５’末端側に位置し、固相との結合を形成する所定の分子を結合する固相結合部位と；を有し、
    　前記側鎖は標識を結合するための標識結合部位を有し、
    　　前記側鎖の前記標識結合部位には標識が結合され、前記側鎖の主鎖を結合されていない末端にはピューロマイシンが結合されている、請求項１５に記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
  17. 　前記側鎖は、任意の塩基配列又はポリエチレングリコールスペーサーで形成されていることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
  18. 　前記所定の分子はビオチンであることを特徴とする、請求項１５～１７のいずれかに記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
  19. 　前記連結酵素はT4 RNAリガーゼであることを特徴とする、請求項１５～１８のいずれかに記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
  20. 　前記固相は磁性粒子であることを特徴とする、請求項１５～１９のいずれかに記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
  21. 　前記収集工程では、前記固相が磁力によって収集される特徴とする、請求項２０に記載のプレイタンパク質のスクリーニング方法。
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