JP6048975B2 - タンパク質固定化固相、及びポリヌクレオチド固定化固相、並びに、核酸回収方法 - Google Patents

タンパク質固定化固相、及びポリヌクレオチド固定化固相、並びに、核酸回収方法 Download PDF

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Description

本発明は、タンパク質固定化固相、及びポリヌクレオチド固定化固相、並びに、核酸回収方法に関する。
本願は、２０１１年１１月４日に、日本に出願された特願２０１１−２４２７８９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。
新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であったが、より有用なタンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。
進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを結合させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成し、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次に、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、作製したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、所望の機能をもつタンパク質を選択する。選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択する前でもよい。（非特許文献２参照）。
上記ｍＲＮＡ（又は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ）−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質アレイは、網羅的解析により、短期間で機能性タンパク質を取得するためのツールとして重要である（特許文献２参照）。
特許第４３１８７２１号公報 特開２００８−１１６２１８号公報
Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年 Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３７巻、ｅ１０８頁、２００９年
進化分子工学的手法においては、上記タンパク質アレイを含むタンパク質が固定化された固相担体又は固相基板を用いて、有用タンパク質をスクリーニングした後、タンパク質（表現型）と対応づけられるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ（遺伝子型）を、固相担体又は固相基板から回収する必要がある。
しかし、固相担体又は固相基板から有用タンパク質と対応づけられるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを選択的に効率よく回収することは容易ではない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、固相上から核酸回収を効率よく行うことができるタンパク質固定化固相、及びポリヌクレオチド固定化固相、並びに、効率のよい核酸回収方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーに光切断部位もしくは切断部位を導入することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１８）を提供するものである。なお本発明において、「光切断部位」という用語は光により切断される部位を意味しているが、この用語を他の物理学的、化学的なエネルギーによる作用により切断される、「切断部位」に置換した場合も考慮されるものとする。また、「光照射」という用語についても、「切断部位」を切断するための「物理学的、化学的なエネルギーによる作用」に置換した場合も考慮されるものとする。
（１）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、前記タンパク質の連結部が、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなることが好ましい。
（６）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相において、前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー、及びペプチドのうちいずれか１つを構成することが好ましい。
（７）本発明の一実施態様におけるポリヌクレオチド固定化固相は、ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（８）本発明の一実施態様におけるポリヌクレオチド固定化固相は、ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、前記核酸リンカーは、
１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（９）本発明の一実施態様における核酸回収方法は、先に記載の固定化固相を用いて、該固定化固相を光照射し、前記核酸リンカーの有する光切断部位で前記核酸リンカーを切断することにより、ｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドを回収する工程を有することを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（１４）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相は、前記タンパク質の連結部が、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなることが好ましい。
（１５）本発明の一実施態様におけるタンパク質固定化固相において、前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー、及びペプチドのうちいずれか１つを構成することが好ましい。
（１６）本発明の一実施態様におけるポリヌクレオチド固定化固相は、ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（１７）本発明の一実施態様におけるポリヌクレオチド固定化固相は、ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、前記核酸リンカーは、１つの３’末端領域と、１つの５’末端領域と、からなり、前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とする。
（１８）本発明の一実施態様における核酸回収方法は、先に記載の固定化固相を用いて、前記核酸リンカーの有する切断部位で前記核酸リンカーを切断することにより、ｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドを回収する工程を有することを特徴とする。
本発明によれば、固相上から核酸回収を効率よく行うことができる。
本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例において、ＢＤＡ（Ｂ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＡ）のｍＲＮＡと、核酸リンカーをハイブリダイズさせたものの概略図である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例におけるニトロベンジル基挿入ＤＮＡの光切断における波長依存性の検討結果である。 実施例における光切断されたＤＮＡの共焦点レーザースキャン顕微鏡による測定結果である。 実施例における光照射後の金基板上、及びアミノ基修飾ガラスカバー上のＤＮＡ／ｍＲＮＡ複合体の蛍光画像である。
≪タンパク質固定化固相≫
［第１実施形態］
本実施形態のタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
前記核酸リンカーは、切断部位（例、光切断部位）及び固相結合部位を有する。
先ず、本実施形態に用いられるｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体の構造について、図１を用いて説明する。
（核酸リンカー）
本実施形態に用いられる核酸リンカー２は、ｍＲＮＡ２３と、これがコードするタンパク質３３とを連結するためのリンカーである。
図１中、Ｐはピューロマイシンを示している。
核酸リンカー２は、１つの３’末端領域５１と、枝分かれした２つの５’末端領域（一方の領域５２，他方の領域５３）と、からなる。
３’末端領域５１は、スクリーニングすべきタンパク質３３をコードしているｍＲＮＡ２３の３’末端側の配列とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aから枝分かれし、末端にタンパク質３３の連結部２ａを有するアーム部５１ｂと、を含む。
１本鎖ポリヌクレオチド部５１aは、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど、当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。
アーム部５１ｂは、ｍＲＮＡ２３とタンパク質連結部２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部５１ｂの５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端側の箇所で１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと結合し、アーム部５１ｂの３’末端はタンパク質連結部２ａを有する。
１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとアーム部５１ｂとの連結は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１a上の連結箇所に存在する修飾ヌクレオチド（例えばアミノ基がスペーサーを介して塩基部分に導入されたヌクレオチド）と、アーム部５１ｂの末端に存在する修飾ヌクレオチド（例えばチオールを５’末端にもつヌクレオチド）とを二官能性試薬を用いて架橋することにより行うことができる。
後述するようにスクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、アーム部５１ｂの５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端から数塩基５’側の位置で１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと結合し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。逆転写の際に１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端がプライマーとして機能するからである。
１本鎖ポリヌクレオチド部５１a、又は、末端を除くアーム部５１ｂは、標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質は、蛍光色素や放射性物質等から適宜選択される。
アーム部５１ｂの３’末端にはタンパク質３３の連結部２ａが存在する。タンパク質連結部２ａとは、所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部２ａとしては、伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシシチジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。
アーム部５１ｂは、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。
アーム部５１ｂにはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。
５’末端領域は、２つに枝分かれしており、一方の領域５２と、他方の領域５３と、からなる。一方の領域５２は、３’末端領域５１の一本鎖ポリヌクレオチド部５１ａと他方の領域５３の境界から分岐し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。このような分岐部分である一方の領域５２を合成するには、塩基部分からスペーサーを介して分岐鎖合成が可能な修飾ヌクレオチドアミダイトや、分岐用リン酸基アミダイトが使用される。
ｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとの結合を強固なものとするため、一方の領域５２の５’末端は、ｍＲＮＡ２３の３’末端とライゲーションされることが好ましい。
本実施形態の核酸リンカー２の他方の領域５３は、光切断部位２ｃを含む。光切断部位２ｃにより、タンパク質３３と対応づけられるｍＲＮＡ２３を固相上から回収することができる。
光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとして、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）などが挙げられる。
光切断部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよく、例えばニトロベンジル基が挙げられる。
また、本実施形態の核酸リンカー２の他方の領域５３は、例えば、１本鎖核酸切断酵素切断部位を含む。１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれ、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイノシンが挙げられる。
本実施形態の核酸リンカー２の他方の領域５３は、５’末端に固相結合部位２ｂを有する。
核酸リンカー２の固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合を利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
また、本実施形態においては、核酸リンカーとして図２に示す核酸リンカー２２を用いてもよい。図２において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
核酸リンカー２２は、１つの３’末端領域６１と、１つの５’末端領域６２と、からなる。
５’末端領域６２と３’末端領域６１は、ループ領域６４を形成している。
３’末端領域６１は、５’末端側に第１の光切断部位２ｃ１を含み、５’末端領域６２は、第２の光切断部位２ｃ２を含む。
５’末端領域６２は、５’末端側から順に、ｍＲＮＡ２３の３’末端との結合部位、第２の光切断部位２ｃ２、及び、前記第１の光切断部位２ｃ１と前記第２の切断部位２ｃ２の間から枝分かれした固相結合部位２ｂを有する。該固相結合部位２ｂを末端に有する分岐領域６３は、ループ領域６４から分岐し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。分岐領域６３を合成するには、塩基部分からスペーサーを介して分岐鎖合成が可能な修飾ヌクレオチドアミダイトや、分岐用リン酸基アミダイト、及び塩基部分にスペーサーを介して固相結合部位が修飾されているヌクレオチドアミダイトが使用される。
ｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとの結合を強固なものとするため、５’末端領域６２の５’末端は、ｍＲＮＡ２３の３’末端とライゲーションされていることが好ましい。
（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）
次いで、核酸リンカー２を用いて、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を製造する。
ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体の製造方法は、
（ａ）ｍＲＮＡ２３と核酸リンカー２とをアニールさせる工程と、
（ｂ）ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ２３からタンパク質３３を合成することにより、タンパク質３３のＣ末端が核酸リンカー２のタンパク質の連結部２ａと結合しているｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程と、
を有する。
以下、各工程について説明する。
工程（ａ）において、ｍＲＮＡ２３と核酸リンカー２とをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡ２３の調製について説明する。
ｍＲＮＡ２３は、スクリーニングすべきタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
転写前のＤＮＡの３’末端に共通のタグ配列を挿入し、転写後のｍＲＮＡの３’側が、核酸リンカー２の１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとハイブリダイズするように設計しておく。
次にｍＲＮＡ２３の３’末端領域と核酸リンカー２の１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡ２３を変性させた後、１５分かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡ２３が核酸リンカー２に確実にハイブリダイズされる。
次に工程（ｂ）において、ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端領域の一方の領域とをライゲーションさせる。ライゲーションに際し、核酸リンカー２の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。
次に工程（ｃ）において、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ２３からタンパク質３３を合成することにより、タンパク質３３のＣ末端が核酸リンカー２のタンパク質連結部２ａと結合しているｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する。
無細胞タンパク質翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボソーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体が製造される。
上述したｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を固相上に固定化することにより、タンパク質固定化固相が製造される。固定化方法としては、特に限定されず、上記のように翻訳後のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を固定化してもよいし、翻訳前のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体を固相上に固定化した後に翻訳し、固相上でｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を製造してもよい。
固相としては、基板又はビーズ担体が好ましく挙げられる。
（タンパク質アレイ）
上述したｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を基板上に固定化することによりタンパク質アレイが製造される。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体の核酸リンカー２には、５’末端に固相結合部位が設けられており、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、核酸リンカー２の固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
（タンパク質結合ビーズ）
上述したｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体をビーズ担体上に固定化することによりタンパク質結合ビーズが製造される。用いられるビーズ担体としては、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられ、磁性を利用したハンドリングが容易であることから磁気ビーズが好ましい。タンパク質結合ビーズを用いて、複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板中の反応槽に配列させることにより、タンパク質アレイを構成することもできる。
ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体の固定化には、タンパク質アレイにおける固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせと同様に、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、ビーズ担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合を利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
本実施形態のタンパク質固定化固相によれば、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を構成する核酸リンカー２が、他方の領域５３を有するため、他方の領域５３を構成する５’末端の塩基配列を適宜延長することにより、固相と光切断部位２ｃとの間の距離をとることができる。
例えば、光切断部位２ｃとしてニトロベンジル基を有する核酸リンカー２を用い、固相として金基板を用いる場合、金基板とニトロベンジル基との距離が短いと、ニトロベンジル基の切断に要する光エネルギーを金基板が吸収してしまうおそれがある。本実施形態においては、かかるおそれがなく、光照射により効率よく核酸リンカー２を切断し、タンパク質３３と対応づけられるｍＲＮＡ２３を効率よく回収することができる。
［第２実施形態］
本実施形態のタンパク質固定化固相は、ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
前記核酸リンカーは、切断部位（例、光切断部位）及び固相結合部位を有する。
本実施形態に用いられるｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ７−核酸リンカー２複合体の構造について、図３を用いて説明する。
図３において、第１実施形態において説明されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付してその説明を省略する。
（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｄ）を有する。
工程（ｄ）は、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質複合体３３を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ７−核酸リンカー２複合体を作製する工程である。
工程（ｄ）において、逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
逆転写されたｃＤＮＡ７は、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質複合体３３のｍＲＮＡ２３とハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質複合体３３中のｍＲＮＡ２３は、ｃＤＮＡと比べて昜分解性である他、アプタマーとして非特異的相互作用する可能性が高いため、タンパク質間相互作用解析を行う場合には、このようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製しておくことが好ましい。
また、スクリーニングにより有用性を見出されたタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。
本実施形態のタンパク質固定化固相によれば、光照射により効率よく核酸リンカー２を切断し、タンパク質３３と対応づけられるｃＤＮＡ７を効率よく回収することができる。
≪ポリヌクレオチド固定化固相≫
本実施形態のポリヌクレオチド固定化固相は、ＤＮＡ又はＲＮＡと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、
前記核酸リンカーは、切断部位（例、光切断部位）及び固相結合部位を有する。
先ず、本実施形態に用いられるポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体の構造について、図４を用いて説明する。図４において、タンパク質固定化固相の実施形態に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
（核酸リンカー）
本実施形態に用いられる核酸リンカー１２は、ポリヌクレオチド２３ａと連結するリンカーである。
核酸リンカー１２は、タンパク質固定化固相の実施形態に示されたものと同様に、１つの３’末端領域７１と、枝分かれした２つの５’末端領域（一方の領域５２，他方の領域５３）と、からなる。３’末端領域７１は、スクリーニングすべきポリヌクレオチド２３ａの３’末端側の配列とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aを含む。
スクリーニングすべきポリヌクレオチド２３ａとしては、リボザイムやデオキシリボザイム、ＲＮＡアプタマーやＤＮＡアプタマーなどの機能性ポリヌクレオチドが想定されるため、本実施形態においては、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aがハイブリダイズしうるポリヌクレオチド２３aはｍＲＮＡに限定されない。また、３’末端領域７１は、末端にタンパク質の連結部を有するアーム部を含まなくともよい。
また、本実施形態においては、核酸リンカーとして図５に示す核酸リンカー３２を用いてもよい。図５において、図４の核酸リンカー１２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
核酸リンカー３２は、１つの３’末端領域８１と、１つの５’末端領域６２と、からなる。
５’末端領域６２と３’末端領域８１は、ループ領域６４を形成している。
３’末端領域８１は、５’末端側に第１の光切断部位２ｃ１を含み、５’末端領域６２は、第２の光切断部位２ｃ２を含む。
５’末端領域６２は、５’末端側から順に、ポリヌクレオチド２３aの３’末端との結合部位、第２の光切断部位２ｃ２、及び、前記第１の光切断部位２ｃ１と前記第２の切断部位２ｃ２の間から枝分かれした固相結合部位２ｂを有する。該固相結合部位２ｂを末端に有する分岐領域６３は、ループ領域６４から分岐し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。分岐領域６３を合成するには、塩基部分からスペーサーを介して分岐鎖合成が可能な修飾ヌクレオチドアミダイトや、分岐用リン酸基アミダイト、及び塩基部分にスペーサーを介して固相結合部位が修飾されているヌクレオチドアミダイトが使用される。
ｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとの結合を強固なものとするため、５’末端領域６２の５’末端は、ポリヌクレオチド２３ａの３’末端とライゲーションされていることが好ましい。
（ポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体）
次いで、核酸リンカー１２を用いて、ポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体を製造する。
ポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体の製造方法は、
（ａ’） ポリヌクレオチド２３ａと核酸リンカー１２とをアニールさせる工程と、
（ｂ’） ポリヌクレオチド２３ａの３’末端と核酸リンカー１２の５’末端とをライゲーションさせる工程と、を有する。
工程（ａ’）及び工程（ｂ’）は、ｍＲＮＡ２３がポリヌクレオチド２３ａに変更され、核酸リンカー２が核酸リンカー１２に変更された以外は、上述したｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３の製造方法における工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様である。
上述したポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体を固相上に固定化することにより、ポリヌクレオチド固定化固相が製造される。
固相としては、基板又はビーズ担体が好ましく挙げられる。
（ポリヌクレオチドマイクロアレイ）
上述したポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体を基板上に固定化することによりポリヌクレオチドマイクロアレイが製造される。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。ポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体の核酸リンカー１２には、５’末端に固相結合部位が設けられており、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、ポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体を基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、タンパク質固定化固相の実施形態に示されたものと同様のものが挙げられ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
（ポリヌクレオチド結合ビーズ）
上述したポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体をビーズ担体上に固定化することによりポリヌクレオチド結合ビーズが製造される。用いられるビーズ担体としては、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられ、磁性を利用したハンドリングが容易であることから磁気ビーズであることが好ましい。ポリヌクレオチド結合ビーズを用いて、複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板中の反応槽に配列させることにより、ポリヌクレオチドマイクロアレイを構成することができる。ポリヌクレオチド２３ａ−核酸リンカー１２複合体の固定化には、タンパク質アレイにおける固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせと同様に、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー１２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、ビーズ担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や金-チオール結合などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
本実施形態のポリヌクレオチド固定化固相によれば、光照射により効率よく核酸リンカー１２を切断し、機能性ポリヌクレオチドとして見出されたポリヌクレオチド２３ａを効率よく回収することができる。
≪核酸回収方法≫
本実施形態の核酸回収方法は、上述した固定化固相を用いて、該固定化固相を光照射し、前記核酸リンカーの有する切断部位（例、光切断部位）で前記核酸リンカーを切断することにより、ｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドを回収する工程を有する。
上述したタンパク質固定化固相又はポリヌクレオチド固定化固相を用いて、スクリーニングを行うことにより見出されたスポットには、核酸リンカーを介してｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドが固定化されている。該核酸リンカーは光切断部位を有するため、特定のスポットに光照射することにより、切断され、該スポットからｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドが遊離する。これら核酸の塩基配列を解析することにより、有用タンパク質又は有用ポリヌクレオチドが同定される。
例えば、光照射による切断反応は、マイクロメートルスケールの微小領域に光照射が可能な点で優れている。照射される光の波長としては、核酸リンカーの光切断部位に用いられるニトロベンジル基が切断される波長を考慮して、３００ｎｍ以上が好ましく、解析対象の核酸の光照射による損傷を抑える点を考慮して、３５０ｎｍ〜４００ｎｍがより好ましい。
例えば、本実施形態の核酸回収方法は、光照射又は核酸切断酵素によって切断され遊離した核酸を、正電荷を有する固相を用いて捕捉する工程を有することが好ましい。
固相としては、固相担体又は固相基板が挙げられ、後述する実施例に示されるように、光照射による核酸切断反応を行う際の蓋として用いることができる点から、固相基板を用いることが好ましい。
固相担体としては、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられる。
固相基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
これら固相は、正電荷を有することにより、負電荷を有する核酸を捕捉することができる。かかる電荷の制御手段としては、固相を化学修飾することにより、正電荷を有する官能基を固相表面に導入する方法が挙げられる。
正電荷を有する官能基としては、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノエチル基等のジアルキルアミノ基；イミノ基、グアニジノ基等が挙げられ、アミノ基が好ましい。
例えば、固相としてガラス基板を用いる場合には、アミノ基を有するシランカップリング剤を用いることにより、容易に表面処理をすることができる。
また、電気的制御手段により、固相が正のゼータ電位を帯びるように制御し、固相と、核酸との静電的相互作用を増強させる方法も挙げられる。
このようにして核酸を捕捉した後、固相表面の電荷を正から負に切り替えることにより、捕捉した核酸を容易に離脱させることができる。
電荷を切り替える方法としては、リン酸緩衝液を用いて溶液のｐＨを変化させる方法、核酸様の構造を有する分子の溶解液を用いて捕捉された核酸を溶出する方法、電気的制御手段により、固相が負のゼータ電位を帯びるように制御する方法等が挙げられる。
本実施形態の核酸回収方法によれば、有用タンパク質又は有用ポリヌクレオチドが固定されている固相から、そのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または有用ポリヌクレオチドを選択的に効率よく回収することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（核酸リンカーの合成）
１−１ 材料
下記３種のＤＮＡオリゴマーの合成を日本バイオサービスに委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（１）ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’−（ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−(ＰＣ)−ＴＴＴ（Ｃ−ＣＣＣ−５’）−Ｘ１−(Ｔ−ＮＨ２)−ＣＣＴ−３’］
Ｘ１は以下の配列を表す。
ＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（配列番号１：１５ｍｅｒ）。

（２）ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’−（Ｂ）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−(ＰＣ)−ＴＴＴ(Ｃ−ＣＣＣ−５’)−Ｘ１−(Ｔ−ＮＨ２)−ＣＣＴ−３’］
Ｘ１は上記のとおりである。

（３）Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’− （ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）−ＴＣＴ−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）−３’］

ここで、（ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）は、（１−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−ｈｅｘｙｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，１’−[（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)を用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ）。
(ＰＣ)は、［４−（４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｂｕｔｙｒａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−１−(２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)−ｅｔｈｙｌ]−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：ＰＣ Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
（Ｃ−ＣＣＣ−５’）は、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｎ４−（Ｏ−ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ−６−ｏｘｙｈｅｘｙｌ）−５−Ｍｅｔｈｙｌ−２'−ｄｅｏｘｙＣｙｔｉｄｉｎｅ，３’−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて、塩基側分岐鎖にデオキシシトシンを３’→５’方向に３塩基縮合したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：５−Ｍｅ−ｄＣ Ｂｒａｎｃｈｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
（Ｔ−ＮＨ２）は、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−[Ｎ−(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ)−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ]−２'−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ,３'−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ）。
（Ｂ）は、［１−Ｎ−（４，４'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｂｉｏｔｉｎｙｌ−６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ]−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：５’−Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
（ｓｐｃ１８）は、１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８）。
（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、５'-Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｎ-ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２'-ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ−ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−ＣＰＧを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＣＰＧ）。
１−２ 合成、精製方法
（１）Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの還元
２．５ｍＭのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ １８μｌを１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ９．０）９０μｌと混合し、１Ｍ ＤＴＴを１０μｌ加え、室温で１時間反応させ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの５’側にあるジスルフィド基をチオール基に還元した。その後、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)で平衡化したＮＡＰ−５ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、過剰なＤＴＴを除去した。
（２）ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ修飾
１ｍＭのＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ１０μｌを０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)１００μｌと混合し、０．１Ｍの二価性架橋剤ＥＭＣＳ （６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（同仁化学研究所社製）を２０μｌ加えてよく撹拌し、３７℃で３０分間反応させた。その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させ、未反応のＥＭＣＳを除去した。沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した。
（３）Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔと、ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ又はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔとの架橋
前記ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ架橋物の沈澱物、又は前記ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ架橋物の沈澱物を、還元後の前記Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの溶解液（約２０ｎｍｏｌ)に溶解し、４℃で一晩放置した。
その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させた。沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した後、３０μｌの滅菌水に溶解した。得られた架橋物を８Ｍ尿素１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳｙｂｒＧｏｌｄ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色した。
結果を図６に示す。レーン１は１０ｂｐ ＤＮＡ ｓｔｅｐ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン３はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔとＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋物、レーン４はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン５はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋物である。レーン３，５より目的の架橋物(Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ)が得られていることが確認された。
（４）Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒのＨＰＬＣ精製
上記の様に合成したＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒをＨＰＬＣにより精製した。
（ｍＲＮＡの合成）
５’上流にＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、３’側下流にスペーサー領域及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ又はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒとの相補鎖領域を有する配列を付加したＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（以下、ＢＤＡという。配列番号２：３６７ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５〜３０ｐｍｏｌ／μｌのｍＲＮＡを合成した（３３７ｂ）。
前記ｍＲＮＡ ５ｐｍｏｌと、前記Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ １０ｐｍｏｌ又はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ １０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、０．５μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、０．５μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。
反応産物を８Ｍ尿素８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。結果を図７に示す。
レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）、レーン３はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン４はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物である。
Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒともにｍＲＮＡと連結し、高分子量側にバンドがシフトしていることが観察でき、合成した核酸リンカーがｍＲＮＡと連結する能力を有していることが確認できた。
図８に、ＢＤＡと、核酸リンカーをハイブリダイズさせたものの概略図を示す。図８中、Ｐはピューロマイシン、ＰＣは光切断部位（ニトロベンジル基）を示す。大文字で示した部分はＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡを示す。Ｘは、５’−（Ｂ）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’を示す。
（無細胞翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡのライゲーション産物を用いて翻訳反応を行った。１ｐｍｏｌのｍＲＮＡ−核酸リンカーライゲーション産物（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒライゲーション産物）と０．７２μｌの２０ｘ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ （Ａｍｂｉｏｎ社製）と、１０．２μｌのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製）と０．３ μｌのＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ (ｐｒｏｍｅｇａ社製)に、ＲＮａｓｅフリー水を加えて混合し、１５μｌの混合液とした。
この混合液を３０℃にて２０分間反応させた後、６μｌの３Ｍ 塩化カルシウム溶液と１．８ μlの１ Ｍ 塩化マグネシウム溶液を加え、混合した。この混合液を更に３７℃で３０分間反応させ、ＢＤＡ遺伝子のポリペプチド鎖を合成し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成させた。反応産物を８Ｍ尿素含有ＳＤＳ−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、タンパク質中に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光シグナルを検出した。
更に、反応産物をＳｙｂｒＧｏｌｄ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色し、ｍＲＮＡを検出した。結果を図９に示す。
レーン１はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン２はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物の翻訳産物、レーン３は、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン４は、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物の翻訳産物である。
この泳動結果より、ｍＲＮＡより高分子量側に蛍光シグナルを示すｍＲＮＡ−タンパク質複合体のバンドを確認でき、合成された核酸リンカーがタンパク質ディスプレイ能を有していることが確認できた。
（ニトロベンジル基挿入ＤＮＡの光切断における波長依存性）
下記ニトロベンジル基挿入ＤＮＡの合成を日本バイオサービスに委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
［配列：５’−（Ｂ）−(ＰＣ)−Ｘ２−(Ｆ)−３’］
Ｘ２は以下の配列を表す。
Ｎ４６（Ａ：Ｔ：Ｇ：Ｃ＝１：１：１：１の４６ｍｅｒのランダム配列）
（Ｆ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｄＴを示し、（Ｂ）及び(ＰＣ)は上記と同様である。
蛍光分光光度計を用いて、石英キュベット中、上記ニトロベンジル基挿入ＤＮＡの水溶液 (１０μＭ) ４００ μｌに対して３００−４２０ｎｍの光を照射し、照射後のサンプル１０ μｌ （１ ｐｍｏｌ) をＰＡＧＥ分析した。結果を図１０に示す。照射条件は以下のとおりである
照射条件
光源:１５Ｗ Ｘｅランプ
光強度: ０．１５〜０．３１ｍＷ／ｍｍ２
光照射面積:５０ｍｍ２(５ｍｍｘ１０ｍｍ)
照射時間：１８０秒
石英キュベット寸法: ２．５ｍｍ x １３ ｍｍ x １０ ｍｍ, (照射面 ２．５ｍｍ x １３ ｍｍ)
温度：室温
光強度詳細
３００ ｎｍ:０．１５ｍＷ／ｍｍ２
３２０ ｎｍ:０．２０ｍＷ／ｍｍ２
３４０ ｎｍ:０．２５ ｍＷ／ｍｍ２
３６０ ｎｍ:０．３０ ｍＷ／ｍｍ２
３７７ ｎｍ:０．３１ ｍＷ／ｍｍ２
４００ ｎｍ:０．２６ ｍＷ／ｍｍ２
４２０ ｎｍ:０．２４ ｍＷ／ｍｍ２
図１０上段（図１０Ａ）は、光照射後のニトロベンジル基挿入ＤＮＡを８Ｍ尿素含有１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、その蛍光シグナルを検出した結果である。図１０下段（図１０Ｂ）は、図１０上段（図１０Ａ）を定量化した結果である。切断率は、（切断後の蛍光シグナル強度）／［(切断前の蛍光シグナル強度)＋（切断後の蛍光シグナル強度）］により算出した値である。
図１０から、３００ｎｍ付近の波長を有する光によって切断されるが、ＤＮＡの損傷に影響の少ない３５０−４００ｎｍの波長を有する光によってもニトロベンジル基挿入ＤＮＡを切断できることが確認された。
（ビオチン修飾ニトロベンジル基挿入二本鎖ＤＮＡの調製）
以下に示すオリゴヌクレオチドのセット（ＤＲ(２Ｈｉｓ)ＰＣ−ＢＴＢ又はＤＲＢｉｏ(２Ｈｉｓ)、及びＡｎｔｉ−Ｄｒ(ＧＦＰｕｖ５)ＴｅｘａｓＲｅｄ）を用いてビオチン修飾ニトロベンジル基挿入二本鎖ＤＮＡを調整した。
用いたオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
（１）ＤＲ(２Ｈｉｓ)ＰＣ−ＢＴＢ
［配列：５’−（Ｂ）−Ｔ−（Ｂ）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−（ＰＣ）−Ｘ３−３’］
Ｘ３は以下の配列を表す。
ＴＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ（配列番号３：２７ｍｅｒ）。（Ｂ）、（ＰＣ）は前記と同様である。
（２）ＤＲＢｉｏ(２Ｈｉｓ)
［配列：５’−（Ｂ）−Ｘ３−３’］
Ｘ３は前記と同様である。
（３）Ａｎｔｉ−Ｄｒ(ＧＦＰｕｖ５)ＴｅｘａｓＲｅｄ
［配列：５’−ＴｅｘａｓＲｅｄ−Ｘ５−３’］
Ｘ４は以下の配列を表す。
ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡ（配列番号４：２７ｍｅｒ）。
表１に示す組成の反応液を調製し、室温で３０分間静置した。

（スプトアビジン修飾磁気ビーズの前処理）
ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（ＳＰＨＥＲＯ ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ＳＶＭ−８０−５，φ８．８μｍ，１．０％ ｗ／ｖ)３５μｌ分を１ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ３５ μｌで３回ｗａｓｈした後、１ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ３５ μｌに懸濁した。
（ビオチン修飾ニトロベンジル基挿入二本鎖ＤＮＡの固定）
前処理済みのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ懸濁液１０μlの上清を除去し、表１に示した組成の反応後の溶液に懸濁し、室温で３０分間攪拌した。次いで、１ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌで懸濁液中のビーズを３回Ｗａｓｈした後、１ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌに懸濁した。懸濁液をドロップしたカバーガラスに共焦点レーザースキャン顕微鏡 (Ｎｉｋｏｎ Ｃ１)を用いて、光照射し、観察を行った。結果を図１１に示す。尚、光照射及び観察の条件は以下のとおりである。
光照射条件
対物レンズ：２０ｘＳ Ｆｌｕｏｒ (ＮＡ ０．７５)
光源：３７７ｎｍ レーザー
光強度：１８μW
照射領域：１９．７ｘ１９．７μｍ２
スキャン密度：１０２４ｘ１０２４ｐｉｘｅｌｓ
図１１上段（図１１Ａ）に示されるように、ニトロベンジル基が挿入されたビオチン修飾二本鎖ＤＮＡ固定化磁気ビーズにおいては、光照射により蛍光強度が減少していることが確認された。一方、ニトロベンジル基が挿入されていないビオチン修飾二本鎖ＤＮＡ固定化磁気ビーズにおいては、光照射による蛍光強度の変化は無かった。図１１Ａの結果を定量化した結果を図１１Ｂに示す。
このように、ニトロベンジル基が挿入されたビオチン修飾二本鎖ＤＮＡ固定化磁気ビーズにおいては、光照射によりＤＮＡが切断され、溶媒中に遊離したことが確認された。
（アミノシラン修飾ガラス基板の作製）
１８ｍｍｘ１８ｍｍカバーガラス(松浪硝子製)を、濃硫酸と過酸化水素水を体積比１：１で混合させた溶液に浸漬し、２００℃で１５分間反応させた後、超純水にて洗浄し、窒素ガスブローにて乾燥させた（以下、ＳＰＭ洗浄という。）。
次いで、上記カバーガラスを０．１ＭのＮａＯＨ溶液に１分間浸した後、窒素ガスブローにてカバーガラス上の溶液を除去した。
次いで、１％ＡＰＴＥＳ（３-ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ, 東京化成製)含有０．１％酢酸水溶液に上記カバーガラスを浸漬し、９０℃、６０分間加熱し、エタノールで１分間洗浄した後、超純水で１分間洗浄し、窒素ガスブローにてガラスを乾燥させてアミノシラン修飾ガラス基板を得た。
（金薄膜ガラス基板の作製）
２０ｍｍｘ２０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのガラスをＳＰＭ洗浄し、上記ガラスにＣｒ，２５０Ｗ，３０秒、Ａｕ，１００Ｗ，３分の順でスパッタリングし、厚さ２００ｎｍの金薄膜ガラス基板を作製した。
（光切断性ＤＮＡオリゴマーの金基板上への固定化）
下記光切断性ＤＮＡオリゴマー（ＤＲ（２Ｈｉｓ）−ＰＣ−Ｔ３０−ＳＨ）を通常のホスホロアミダイト法に基づいて、自動核酸合成装置を用いて合成した。尚、合成は、株式会社日本バイオサービスに依頼し、５’末端のチオール基はＤＴＴで還元された状態で納品された。また、ネガティブコントロールとして、光切断部位を有しないＤＮＡオリゴマー（Ｓ−（Ｔ２０）Ｌｉｎ）を合成した。
（１）ＤＲ（２Ｈｉｓ）−ＰＣ−Ｔ３０−ＳＨ
［配列：５’−(Ｔｈｉｏｌ) −(Ｔ３０) −(ＰＣ) −Ｘ５−３’］
Ｘ５は以下の配列を表す。
ＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ（配列番号５：１８ｍｅｒ）。ここで（Ｔｈｉｏｌ）はチオール基を表し、試薬名：Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ (Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製)を用いて合成した。
（Ｔ３０）はデオキシチミジンが３０塩基並んだものを表す。（ＰＣ）は上記と同様である。
（２）Ｓ−（Ｔ２０）Ｌｉｎ
［配列：５'−(Ｔｈｉｏｌ)−Ｔ２０−Ｘ６−３'］
Ｘ６ は以下の配列を表す。
ＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣ（配列番号６：１７ｍｅｒ）。（Ｔ２０）はデオキシチミジンが２０塩基並んだものを表す。（Ｔｈｉｏｌ）は上記と同様である。
上記のように作製した金基板をＳＰＭ洗浄し、金基板表面に１ｘＰＢＳで１μＭに調製した光切断性ＤＮＡオリゴマー５００μＬに浸し、室温で４時間反応させ、金−チオール結合により、光切断性ＤＮＡオリゴマーを、金基板上に、薄膜状に固定化した。
次いで、金基板を１ｍＭ ６−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ水溶液中で１時間反応させた後、１ｘＰＢＳで５回洗浄し、スピンドライした。
（Ｃｙ５蛍光色素導入ＲＮＡの調製）
５'上流にＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、３'側下流にスペーサー領域及び上記光切断性ＤＮＡオリゴマーリンカーのＤＮＡ部分との相補な配列を有し、終始コドンを削ったＧＦＰ(配列番号７：８６９ｂｐ)をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）および、Ｃｙ５−ＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５〜３０ｐｍｏｌ／μｌのＣｙ５導入ｍＲＮＡを合成した（８３９ｂ）。
（チオール修飾ニトロベンジル基挿入ＤＮＡ／ＲＮＡの固定）
上記Ｃｙ５導入ｍＲＮＡを、０．１％ＳＤＳ含有３ｘＰＢＳに溶解し、０．６ｐｍｏｌ／μＬのｍＲＮＡ溶液を調製した。４℃の条件下、ｍＲＮＡ溶液１０μＬを金基板に滴下し、その上にカバーガラスを置いた。尚、金基板とカバーガラスの間は、シリコングリースを用いて密閉した。
その金基板を、サーマルサイクラーを用いて、７０℃に加熱した後、１５分かけて１０℃まで徐冷し、光切断性オリゴマーＤＲ（２Ｈｉｓ）−ＰＣ−Ｔ３０−ＳＨと、Ｃｙ５導入ｍＲＮＡをハイブリダイズさせた。この金基板を、０．２％ｔｗｅｅｎ２０含有３ｘＰＢＳで２回、３ｘＰＢＳで２回、０．１ｘＰＢＳで２回洗浄した。
（金基板上に固定されたＤＮＡ／ｍＲＮＡの光切断、及びアミノ基修飾ガラスカバーへの転写吸着）
金基板上に７μＬの０．１xＰＢＳを滴下し、上記アミノ基修飾カバーガラスを、アミノ基修飾面を金基板側に向けて置いた。尚、金基板とアミノ基修飾カバーガラスの間は、シリコングリースを用いて密閉した。
次いで、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、Ｃｙ５の蛍光像を観察し（Ｅｘ：６３３ｎｍ，Ｅｍ：６５５−７１０ｎｍＢＰ)、Ｃｙ５導入ｍＲＮＡがハイブリダイズされていることを確認した。
次いで、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、図１２Ａに示すように、金基板上の５０μｍｘ５０μｍの領域に３７７ｎｍのレーザー光(８．３μＷ)を１２０秒間照射し、固定化されているＤＮＡの光切断基を切断した。３７７ｎｍレーザー光照射後、室温で３０分間放置し、アミノ基修飾カバーガラスを外し、金基板上のＤＮＡ切断パターン、及びアミノ基修飾カバーガラス上のＤＮＡ吸着パターンを、ｍＲＮＡに修飾されたＣｙ５の蛍光を指標に共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。金基板上のＤＮＡ切断パターンを図１２Ｂに、アミノ基修飾カバーガラス上のＤＮＡ吸着パターンを図１２Ｃに示す。
図１２Ｂにおいて、図１２Ａで示されたレーザー照射エリア相当箇所の蛍光が検出されないことから、レーザー照射によりＤＮＡの光切断箇所が切断されていることが確認された。
一方、図１２Ｃにおいて、図１２Ａで示されたレーザー照射エリア相当箇所の蛍光が検出されていることから、光切断されたＤＮＡがアミノ基修飾カバーガラスに吸着していることが確認された。
このように、領域特異的に金薄膜上での光切断・回収が可能であることが確認された。
以上の結果から、本実施形態によれば、固相上の特定領域から核酸回収を効率よく行うことができることが明らかである。
本発明によれば、固相上から核酸回収を効率よく行うことができる。そのため、本発明は産業上極めて有用である。
２，１２，２２，３２…核酸リンカー、２ａ…連結部、２ｂ…固相結合部位、２ｃ…光切断部位、２ｃ１…第１の光切断部位、２ｃ２…第２の光切断部位、７…ｃＤＮＡ、２３…ｍＲＮＡ、２３ａ…ポリヌクレオチド、３３…タンパク質、５１，６１，７１，８１…３’末端領域、５１ａ…一本鎖ポリヌクレオチド部、５１ｂ…アーム部、５２…一方の領域、５３…他方の領域、６２…５’末端領域、６３…分岐領域、６４…ループ領域。

Claims (18)

  1. ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  2. ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  3. ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  4. ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  5. 前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質固定化固相。
  6. 前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー、及びペプチドのうちいずれか１つを構成することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質固定化固相。
  7. ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、光切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化固相。
  8. ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の光切断部位を有し、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の光切断部位、及び、前記第１の光切断部位と前記第２の光切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化固相。
  9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の固定化固相を用いて、該固定化固相を光照射し、前記核酸リンカーの有する光切断部位で前記核酸リンカーを切断することにより、ｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドを回収する工程を有することを特徴とする核酸回収方法。
  10. ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  11. ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  12. ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  13. ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が核酸リンカーを介して連結されてなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が、固相上に固定化されてなるタンパク質固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、
    前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするタンパク質固定化固相。
  14. 前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質固定化固相。
  15. 前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー、及びペプチドのうちいずれか１つを構成することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質固定化固相。
  16. ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、
    前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
    前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を有し、５’末端に固相結合部位を有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化固相。
  17. ポリヌクレオチドと核酸リンカーが連結されてなるポリヌクレオチド−核酸リンカー複合体が固相上に固定化されてなるポリヌクレオチド固定化固相であって、
    前記核酸リンカーは、
    １つの３’末端領域と、
    １つの５’末端領域と、からなり、
    前記３’末端領域は、前記ポリヌクレオチドの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、５’末端側に第１の切断部位を有し、
    前記５’末端領域は、５’末端側から順に、前記ポリヌクレオチドの３’末端との結合部位又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位、第２の切断部位、及び、前記第１の切断部位と前記第２の切断部位の間から枝分かれした固相結合部位を有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化固相。
  18. 請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の固定化固相を用いて、前記核酸リンカーの有する切断部位で前記核酸リンカーを切断することにより、ｍＲＮＡ−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体、又はポリヌクレオチドを回収する工程を有することを特徴とする核酸回収方法。
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