KR100713953B1 - Ｒｎａ-단백질 융합체를 이용한 단백질의 선별 - Google Patents
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Abstract
본원에는 고염 해독후 인큐베이션(high salt post-translational incubation) 단계를 포함하는 RNA-단백질 융합체 생산 방법이 개시되어 있다.
RNA, 단백질, 융합체, cDNA, 역전사, 해독, 고염, 펩티드 수용체, 퓨로마이신
Description
본 발명은 스조스택(Szostack) 등의 현재는 포기된 1997년 11월 6일자 미국특허 가출원 제 06/064,491호 및 현재는 포기된 1997년 1월 21일자 미국특허 가출원 제 06/035,963호의 이익을 향유하고 현재 출원 중인 스조스택 등의 1998년 1월 14일자 미국특허출원 제 09/007,005호의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 단백질 선별 방법(protein selection methods)에 관계한다.
본 발명은 후원 F32 GM17776-01 및 F32 GM17776-02하에 정부의 지원에 의해 성안되었으므로, 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
현재 RNA 및 DNA 분자들의 기능에 기초하여 RNA 및 DNA 분자들을 분리하는 방법들이 다수 존재하고 있다. 예를 들어, 엘링톤 및 스조스택(Nature 346: 818(1990); 및 Nature 355:850 (1992)) 및 투에르크 및 골드(Science 249:505 (1990); 및 J. Mol. Biol. 222:739 (1991))는 선별 및 증폭(selection and amplification)을 여러 라운드 반복실시함으로써 분자들의 복잡한 풀(complex pool)로부터 목적으로 하는 특성을 갖는 매우 드문(즉, 1/1013 미만) 핵산 분자들을 분리해낼 수 있다는 것을 입증하였다. 이들 방법들은 (ⅰ) 매우 큰(>1015) 후보 풀(candidate pool)들을 스크리닝할 수 있고, (ⅱ) 숙주 생존능력 및 생체내 조건(in vivo conditions)에 무관하고, (ⅲ) 선별이 생체내 유전자 스크리닝(in vivo genetic screen)이 존재하지 않는 경우에도 수행될 수 있다는 점에서 종래의 유전자 선별 방법을 능가하는 이점들을 제공한다. 시험관 내 선별(in vitro selection)의 위력은 신규한 RNA 및 DNA 서열들을 매우 특이적인 단백질 결합 기능(예컨대, Tuerk and Gold, Science 249: 505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Oliphant et al., Mol. Cell.. Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990); Pollock and Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen and Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Stormo and Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5699 (1991); 및 Bock et al., Nature 355:564 (1992) 참조), 소분자 결합 기능 [small molecule binding functions](Ellington and Szostak, Nature 346: 818 (1990); Ellington and Szostak, Nature 355: 850 (1992)), 및 촉매 기능[catalytic functions](Green et al., Nature 347:406 (1990); Robertson and Joyce, Nature 344: 467 (1990); Beaudry and Joyce, Science 257: 635 (1992); Bartel and Szostak, Science 261: 1411 (1993); Lorsch and Szostak, Nature 371: 31-36 (1994); Cuenound and Szostak, Nature 375: 611-614 (1995); Chapman and Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); 및 Lohse and Szostak, Nature 381:442-444 (1996))에 의해 규명함에 있어서 입증되어 왔다. 유사한 단백질 선별 및 증폭 방법도 알려져 왔다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은 시험관내 선별(in vitro selection) 및 시험관내 진화(in vitro evolution)의 원리를 단백질에 적용할 수 있도록 하는 것이다. 본 발명은 부분적으로 또는 전체적으로 랜덤한 아미노산 서열들로 이루어진 대형 풀(pool)로부터 목적으로 하는 특성을 갖는 단백질들을 용이하게 분리해낼 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 mRNA 코드화 서열(coding sequence)을 단백질 분자에 공유 결합시킴으로써 단백질 서열 정보(protein sequence information)를 회수 및 증폭시켜야 되는 문제점을 해결한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 자신의 mRNA의 3' 말단에 공유 결합되어 있는 단백질, 즉 RNA-단백질 융합체를 생성하는 시험관내 또는 원장소 전사/해독 프로토콜(in vitro or in situ transcription/translation protocol)로 구성된다. 이것은 3' 말단에 부착되어 있는 펩티드 수용체(peptide acceptor)를 갖는 mRNA 분자의 합성 및 시험관내 또는 원장소 해독(in vitro or in situ translation)에 의해 달성된다. 하나의 바람직한 펩티드 수용체는 신장하는 펩티드 사슬의 C-말단에 첨가되어 해독을 중지시키는 뉴클레오시드인 퓨로마이신(puromycin)이다. 하나의 바람직한 설계에서, DNA 서열은 메시지의 끝 부분과 리보솜을 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 말단에서 정지시키도록 설계된 펩티드 수용체 사이에 포함되어, 펩티드-tRNA 연결(linkage)의 가수분해 이전에 펩티드 수용체(예컨대, 퓨로마이신)가 생성되고 있는 펩티드 사슬(peptide chain)을 수용하기 위한 추가의 시간을 제공한다.
원하는 경우, 수득한 RNA-단백질 융합체들을 여러 라운드 반복적으로 선별 및 증폭시킬 수 있는데, 이것은 단백질 서열 정보가 역전사 및 증폭에 의해 회수될 수 있기 때문이다(예를 들어, PCR 증폭은 물론 3SR 또는 TSA와 같은 RNA-기초 증폭 기술과 같은 기타의 다른 증폭 기술에 의해). 이어서 증폭된 핵산은 전사, 변형, 및 시험관내 또는 원장소 해독되어 다음 단계의 선별을 위한 mRNA-단백질 융합체를 생성할 수 있다. 다수의 라운드의 선별 및 증폭을 행할 수 있는 능력은 예컨대, 1015 멤버로 구성된 풀로부터 하나의 목적 단백질을 분리해내는 경우와 같이 매우 드문 분자들의 증대(enrichment) 및 분리를 가능하게 한다. 이것은 더 나아가 궁극적으로 임의의 표적을 특이적으로 인식하거나 목적으로 하는 화학반응을 촉매하는 신규하고 개량된 단백질들의 분리를 가능하게 한다.
따라서, 첫 번째 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 목적 단백질의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고, 각각이 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결된 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내 또는 원장소 해독(in vitro or in situ translating)하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체를 선별하여 목적으로 하는 단백질을 선별해내는 단계.
관련 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 목적 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각각이 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결된 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내 또는 원장소 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체를 선별해내는 단계; 및 (d) 융합체의 RNA 부분으로부터 목적 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.
다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 기준 단백질(reference protein)에 비해서 변형된 기능을 갖는 단백질의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 후보 DNA 주형의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 제조하는 단계로서, 후보 DNA 주형들은 각각 기준 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, RNA 분자들은 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각각 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내 또는 원장소 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 변형된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합체를 선별하여 목적으로 하는 변형된 기능을 갖는 단백질을 선별해내는 단계.
또 다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 기준 단백질에 비해서 변형된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 후보 DNA 주형의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 제조하는 단계로서, 후보 DNA 주형들이 각각 기준 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, RNA 분자들은 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각각 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내 또는 원장소 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체를 생성하는 단계; (c) 변형된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합체를 선별해내는 단계; 및 (d) 융합체의 RNA 부분으로부터 변형된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 목적 RNA의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 후보 RNA 분자들의 집단을 제조하는 단계로서, RNA 분자들이 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각각 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내 또는 원장소 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체를 선별하여 목적 RNA를 선별해내는 단계.
상술한 방법들의 바람직한 구현예에 있어서, 펩티드 수용체는 퓨로마이신이다; 각각의 후보 RNA 분자들은 정지 서열(pause sequence)을 추가로 포함하거나 RNA의 3' 말단에 공유 결합된 DNA 또는 DNA 유사체 서열(DNA analog sequence)들을 추가로 포함한다; 후보 RNA 분자들의 집단은 적어도 109, 바람직하게 적어도 1010, 더욱 바람직하게 적어도 1011, 1012 또는 1013, 및 가장 바람직하게 적어도 1014 개의 상이한 RNA 분자들을 포함한다; 시험관내 해독 반응(in vitro translation reaction)은 진핵세포 또는 그의 일부분으로부터 만들어진 세포용해질(lysate) 내에서 수행된다(예를 들어, 망상적혈구 세포용해질 또는 밀 배아 세포용해질 내에서 이루어진다); 시험관내 해독 반응은 원핵세포(예컨대, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 그의 일부분으로부터 만들어진 추출물(extract) 내에서 수행된다; 선별 단계는 목적으로 하는 단백질을 고정된 결합 파트너(immobilized binding partner)에 결합시키는 과정을 포함한다; 선별 단계는 목적 단백질의 기능적 활성을 분석하는 과정을 포함한다; DNA 분자는 증폭된다; 상기 방법은 상기 선별 방법의 단계들을 반복실시하는 과정을 포함한다; 상기 방법은 DNA 분자로부터 RNA 분자를 전사시키고 단계 (a) 내지 (d)를 반복실시하는 과정을 포함한다; 시험관내 해독에 이어, 상기 방법은 50-100 mM Mg2+의 존재하에서 수행되는 인큐베이션 단계를 추가로 포함한다; 그리고 RNA-단백질 융합체는 유연성(flexibility)을 증가시키고 펩티드 수용체에 근접하여 위치하는 핵산 또는 핵산 유사체 서열(nucleic acid analog sequence)을 추 가로 포함한다.
다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 선별된 RNA-단백질 융합체를 특징으로 한다; 리보핵산은 아마이드 결합(amide bond)을 통해서 아미노산 서열에 결합되고 아미노산 서열은 리보핵산에 의해 코드화된다; 리보핵산은 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결된 해독 개시 서열 및 개시 코돈을 포함한다; 리보핵산은 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체(예컨대, 퓨로마이신)에 작동가능하게 연결된다.
두 번째 양상에 있어서, 본 발명은 서열 풀(sequence pool)의 증대에 의한 목적 단백질 또는 목적 RNA 분자의 선별 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계로서, RNA 분자들이 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고, 각각 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열들을 시험관내 또는 원장소 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; (c) 결합 파트너(binding partner)-RNA-단백질 융합체 복합체가 집단의 결합되지 않은 구성원들로부터 확실하게 분리되는 조건하에서 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 RNA-단백질 융합체의 RNA 부분 또는 단백질 부분 중 하나에 대해 특이적인 결합 파트너에 접촉시키는 단계; (d) 상기 복합체로부터 결합된 RNA-단백질 융합체를 분리하는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 얻은 RNA-단백질 융합체의 집단을 결합 파트너-RNA-단백질 융합체 복합체가 집단의 결합되지 않은 구성원들로부터 확실하게 분리되는 조건하에서 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체의 단백질 부분에 대해 특이적인 결합 파트너와 접촉시켜 목적 단백질 및 목적 RNA를 선별하는 단계.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (e)를 반복실시하는 과정을 추가로 포함한다. 또한, 이들 반복 단계에서, 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체의 선택적인 증대(selective enrichment)를 위해 동일 또는 상이한 결합 파트너를 이용할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 단계 (d)는 목적 융합체의 단백질 부분에 대해 특이적인 결합 파트너(예컨대, 단클론 항체)의 이용을 포함한다. 이 단계는 바람직하게 융합체의 RNA 부분의 역전사를 수행하여 목적 단백질을 코드화하는 DNA를 생성한다. 원하는 경우, 이러한 DNA는 분리 및/또는 PCR 증폭될 수 있다. 이러한 증대 기술은 목적 단백질을 선별하는데 이용되거나 기준 단백질에 비해서 변형된 기능을 갖는 단백질을 선별하는데 이용될 수 있다.
증대 방법(enrichment methods)의 다른 바람직한 구현예에서, 펩티드 수용체는 퓨로마이신이다; 각각의 후보 RNA 분자들은 정지 서열(pause sequence)을 추가로 포함하거나 RNA의 3' 말단에 공유 결합된 DNA 또는 DNA 유사체 서열(analog sequence)을 추가로 포함한다; 후보 RNA 분자들의 집단은 적어도 109, 바람직하게 적어도 1010, 더욱 바람직하게 적어도 1011, 1012 또는 1013, 및 가장 바람직하게 적어도 1014 개의 상이한 RNA 분자들을 포함한다; 시험관내 해독 반응(in vitro translation reaction)은 진핵세포 또는 그의 일부분으로부터 만들어진 세포용해질 내에서 수행된다(예를 들어, 망상적혈구 세포용해질 또는 밀 배아 세포용해질 내에 서 이루어진다); 시험관내 해독 반응은 원핵세포(예컨대, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 그의 일부분으로부터 만들어진 추출물 내에서 수행된다; DNA 분자는 증폭된다; 적어도 하나의 결합 파트너는 고형 지지체(solid support) 위에 고정된다; 시험관내 해독 단계에 이어, 상기 방법은 50-100 mM Mg2+의 존재하에서 수행되는 인큐베이션(incubation) 단계를 추가로 포함한다; 그리고 RNA-단백질 융합체는 유연성(flexibility)을 증가시키고 펩티드 수용체에 근접하여 위치하는 핵산 또는 핵산 유사체 서열(nucleic acid analog sequence)을 추가로 포함한다.
관련 양상에 있어서, 본 발명은 라이브러리(예컨대, 단백질, DNA 또는 RNA-융합체 라이브러리)의 제조방법, 또는 해독후 고염(high salt)(제한 없이, K+, NH4
+, 또는 Na+와 같은 1가 양이온, Mg2+와 같은 2가 양이온, 또는 이들의 조합을 포함)의 존재하에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는 목적 분자(예컨대, 단백질, DNA, 또는 RNA 분자들 또는 특수한 기능 또는 변형된 기능을 갖는 분자들)의 선별 방법을 특징으로 한다. 이러한 인큐베이션은 대략적으로 실온 또는 약 -20℃에서 수행되고, 1가 양이온의 경우 약 125 mM∼1.5M (더욱 바람직하게, 약 300 mM∼600 mM 사이) 사이, 그리고 2가 양이온의 경우 약 25 mM∼200 mM 사이의 바람직한 염 농도에서 수행될 수 있다.
다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 본원에 설명된 선별 방법들중 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 특징으로 한다.
세 번째의 최종 양상에 있어서, 본 발명은 RNA-단백질 융합체에 혼성화되는 고정된 단일-가닥 핵산의 배열(array)을 포함하는 마이크로칩(microchip)을 특징으로 한다. 바람직하게, RNA-단백질 융합체의 단백질 성분은 RNA에 의해 코드화된다.
본원에서 이용될 때, "집단(population)"이란 하나 이상의 분자(예컨대, 하나 이상의 RNA, DNA, 또는 RNA-단백질 융합체 분자)들을 의미한다. 본 발명의 방법은 바람직한 경우, 많은 수의 후보 분자들을 가지고 시작하는 선별을 용이하게 하기 때문에, 본원발명에 따른 "집단"은 바람직하게 109 개 분자들, 더욱 바람직하게 1011, 1012 또는 1013 개 이상의 분자들, 및 가장 바람직하게 적어도 1014 개 이상의 분자들을 의미한다.
"선별(selecting)"이라 함은 실질적으로 집단 내에서 하나의 분자를 다른 분자들로부터 구별해내는 것을 의미한다. 본원에서 이용될 때, "선별" 단계는 선별 단계 이후 집단내의 원치 않는 분자들에 비해서 목적 분자를 적어도 2배, 바람직하게 30배, 더욱 바람직하게 100배, 그리고 가장 바람직하게 1000배 증대시키는 것을 의미한다. 본원에서 언급한 바와 같이, 선별 단계는 임의의 횟수 만큼 반복실시할 수 있고, 다른 타입의 선별 단계들을 주어진 접근법에 결합시켜 사용할 수 있다.
"단백질"이란 하나 이상의 펩티드 결합에 의해 연결된 두 개 이상의 천연 또는 변형된 아미노산들을 의미한다. 본원에서 "단백질" 및 "펩티드"라는 용어는 서로 호환적으로 사용한다.
"RNA"라 함은 두 개 이상의 공유 결합된 천연 또는 변형된 리보핵산을 의미한다. 이 용어에 포함되는 변형된 RNA의 일례는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) RNA이다.
"해독 개시 서열(translation initiation sequence)"이란 기능적인 리보솜 진입부위(ribosome entry site)를 제공할 수 있는 임의의 서열을 의미한다. 박테리아 시스템에서, 이러한 영역은 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno Sequence)이라고 한다.
"개시 코돈(start codon)"이란 단백질 코드화 서열의 시작을 신호하는 3 염기를 의미한다. 일반적으로, 이들 염기들은 AUG(또는 ATG)이다; 그러나, 이러한 방식으로 이용될 수 있는 임의의 다른 3 염기들로 대체할 수도 있다.
펩티드 수용체에 "공유 결합된(covalently bonded)"이란 펩티드 수용체가 "단백질 코드화 서열"에 공유 결합에 의해 직접 결합되거나, 또는 다른 공유 결합된 서열(예컨대, 정지 부위(pause site)에 해당하는 DNA)을 통해서 간접적으로 결합되어 있는 것을 의미한다.
"펩티드 수용체(peptide acceptor)"란 리보솜 펩티드 트렌스페라제(peptidyl transferase) 기능의 촉매활성에 의해 신장하는 단백질쇄(growing protein chain)의 C-말단에 첨가될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 전형적으로, 이러한 분자들은 (ⅰ) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드-유사 단위체(nucleotide-like moiety)(예컨대, 아데노신 또는 아데노신 유사체(N-6 아미노 위치에서 디메틸화된 것은 허 용가능)), (ⅱ) 아미노산 또는 아미노산-유사 단위체(예컨대, 20 D- 또는 L-아미노산들중 어느 하나 또는 이들의 아미노산 유사체(예컨대, O-메틸티로신 또는 Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991에 기재된 임의의 유사체들)), 및 (iii) 둘 사이의 결합(예컨대, 3' 위치, 덜 바람직하게는 2' 위치에서의 에스테르, 아마이드, 또는 케톤 결합)을 포함한다; 바람직하게 이러한 결합은 천연 리보핵산 형태(conformation)로부터의 고리의 주름(pucker)을 심각하게 손상시키지 않는다. 펩티드 수용체들은 친핵체(nucleophile)를 가질 수 있는데, 이들은 제한 없이 아미노기, 수산기, 또는 설프하이드릴기(sulfhydryl group)일 수 있다. 또한, 펩티드 수용체들은 뉴클레오티드 의사체(nucleotide memetics), 아미노산 의사체(amino acids mimetics), 또는 결합된 뉴클레오티드-아미노산 구조의 의사체(mimetics of the combined nucleotide-amino acid structure)로 구성될 수 있다.
펩티드 수용체가 단백질 코드화 서열의 "3' 말단"에 위치한다는 것은 펩티드 수용체 분자가 단백질 코드화 서열의 최종 코돈(final codon) 다음에 위치한다는 것을 의미한다. 이러한 용어는, 제한 없이, 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 정확하게 위치하는 펩티드 수용체 분자는 물론, 최종 코돈으로부터 개재 코드화 또는 비코드화 서열(intervening coding or non-coding sequence)(예컨대, 정지 부위에 해당하는 서열) 만큼 떨어져 있는 펩티드 수용체 분자도 포함한다. 이러한 용어는 펩티드 수용체 분자 다음에 코드화 서열 또는 비코드화 서열이 이어지는(즉, 3' 쪽에) 구조물도 포함한다. 또한, 이 용어는, 제한 없이, 단백질 코드화 서열에 직접 또는 개재 핵산 서열(intervening nucleic acid sequence)을 통해서 간접적으 로 공유 결합되어 있는 펩티드 수용체 분자는 물론, 비공유 결합 수단, 예컨대, 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있거나 그 근방에 있고, 그 자체가 펩티드 수용체 분자에 결합되는 제 2의 핵산 서열을 이용한 혼성화를 통해서 단백질 코드화 서열에 결합되어 있는 펩티드 수용체 분자도 포함한다.
"변형된 기능(altered function)"이란 분자의 기능상의 임의의 정성적 또는 정량적 변화를 의미한다.
"정지 서열(pause sequence)"이란 리보솜이 해독을 중지하게 하거나 해독 속도를 늦추게 만드는 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 이용될 때, "결합 파트너(binding partner)"란 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체의 일부분에 대해서 특이적인, 공유 또는 비공유 친화성(specific, covalent or non-covalent affinity)을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 결합 파트너의 예들은, 제한 없이, 다수의 항원/항체 쌍들, 단백질/억제제(inhibitor) 쌍들, 수용체(receptor)/리간드 쌍들(예컨대, 호르몬 수용체/펩티드 호르몬 쌍들과 같은 세포 표면 수용체/리간드 쌍들), 효소/기질 쌍들(예컨대, 키나제/기질 쌍들), 레시틴/탄수화물 쌍들, 올리고머 또는 헤테로올리고머 단백질 응집체(aggregates), DNA 결합 단백질/DNA 결합 부위 쌍들, RNA/단백질 쌍들, 및 핵산 듀플렉스, 헤테로듀플렉스, 또는 연결된 가닥들(ligated strands)의 멤버는 물론, RNA-단백질 융합체의 임의의 부분과 하나 이상의 공유 또는 비공유 결합(예컨대, 이황화 결합)을 형성할 수 있는 모든 분자들을 포함한다. 결합 파트너들은, 제한 없이, 도 2에 제시된 "선별 모티프(selection motif)"들중 임의의 것을 포함한다.
"고형 지지체(solid support)"란, 제한 없이, 친화성 복합체(affinity complex)가 직접 또는 간접적으로(예컨대, 다른 항체 또는 프로테인 A와 같은 다른 결합 파트너 중간체를 통해서) 결합되거나, 또는 그 안에 친화성 복합체가 임베드(imbed)될 수 있는(예컨대, 수용체 또는 채널을 통해서) 임의의 컬럼(또는 컬럼 재료), 비드, 시험관, 마이크로타이터 디쉬(microtiter dish), 고체 입자(예컨대, 아가로오스 또는 세파로오스), 마이크로칩(예컨대, 실리콘, 실리콘-유리, 또는 금 칩), 또는 막(예컨대, 리포좀 또는 소포(vesicle)의 막)을 의미한다.
"고염(high salt)"이란 1가 양이온의 농도가 적어도 200mM, 바람직하게 적어도 500mM이거나 심지어 1M인 것을 의미하고/하거나 2가 또는 그 이상의 다가 양이온의 농도가 적어도 25 mM, 바람직하게 적어도 50 mM, 가장 바람직하게 적어도 100 mM인 것을 의미한다.
본 발명은 많은 현저한 이점들은 제공한다. 우선, 본 발명의 단백질의 선별 및 증폭을 위한 스킴 중 하나를 설명한다. 이러한 기술은 핵산만이 복제될 수 있기 때문에 분리된 목적 단백질에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 회수해야만 하는 필요에 의해 발생하는 곤란함을 해결한다. 특히, 부분적으로 또는 전체적으로 랜덤한 풀로부터 단백질을 분리할 수 있도록 하는 많은 종래의 방법들은 생체내(in vivo) 단계를 통해서 분리한다. 이러한 종류의 방법은 단클론 항체 기술(Milstein, Sci. Amer. 243:66 (1980); 및 Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68: 26 (1990)), 파아지 디스플레이(phage display)(Smith, Science 228:1315 (1985); Parmley and Smith, Gene 73:305 (1988); 및 Mccafferty et al., Nature 348:552 (1990)), 펩티드-lac 리프레서 융합체(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 (1992)), 및 전통적인 유전자 선별 기술(genetic selection technique)을 포함한다. 본 발명의 기술과 달리, 이러한 기술들은 단백질과 핵산 사이의 토폴로지 결합(topological link)에 의존하기 때문에, 단백질의 정보가 유지되고 독출가능한 핵산 형태(readable nucleic acid form)로 회수된다.
또한, 본 발명은 선별이 리보솜 및 그의 mRNA와 여전히 결합되어 있는 신생 단백질쇄(nascent protein chain)의 특성에 의해 이루어지는 해독 중지 방법(stalled translation method)을 능가하는 이점들을 제공한다(Tuerk and Gold, Science 249: 505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222: 739 (1991); Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1844-1848 (1982); Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994); Mattheakis et al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996); 및 Hanes and Pluckthuen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)). 해독 중지 방법과 달리, 본 발명의 방법은 매우 손상되기 쉬워서 기술적으로 사용가능한 선별 유형을 제한하는, mRNA:리보솜:신생 쇄의 3원 복합체의 완전성(integrity)을 반드시 유지하지 않아도 된다.
본 발명은 DNA-펩티드 융합체를 생성하고 제 1 라운드의 선별 이후에 유전 정보를 이론적으로 구하는 브레너 및 러너에 의해 제안된 브랜치 합성 방법(branched synthesis approach)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383) (1992))을 능가하는 이점을 제공한다. 브랜치 합성 방법과 달리, 본 발명은 융합체의 DNA 부분으로부터 펩티드를 재생(브랜치 합성 방법에서는 일반적으로 개별적 인 라운드의 화학적 합성에 의해서 이루어지는)하지 않아도 된다. 따라서, 본 방법에 의하면 후보 물질의 집단을 이용해서 선별 과정을 여러 라운드 반복할 수 있다. 또한, 일반적으로 매우 짧은 서열의 분리에만 이용할 수 있는 브랜치 합성 기술과 달리, 본 발명의 방법은 상당히 긴 단백질 분자의 선별에도 이용할 수 있다.
또 다른 이점으로, 본 발명의 선별 및 직접 진화 기술(direct evolution technique)은 매우 크고 복잡한 후보 서열 라이브러리를 이용할 수 있다. 이와 대조적으로, 생체내 단계에 의존하는 기존의 단백질 선별 방법들은 전형적으로 복잡성이 어느 정도 제한되는 비교적 적은 크기의 라이브러리에 대해서만 적용할 수 있었다. 이러한 이점은, 예를 들어 1013개의 가능성 있는 서열들 가운데서 고작 10 아미노산 길이의 하나의 아미노산을 선별해내야 함을 고려할 때, 기능적인 단백질 서열들(functional protein sequences)을 선별하는 경우에 특히 중요하다. 고전적인 유전자 기술인, lac 리프레서 융합체 접근방법 및 파아지 디스플레이 방법에서, 최대의 복잡성은 차수로 1013 구성원 미만이었다. 큰 라이브러리 크기는 서열 공간(sequence space)이 임의의 주어진 개시 서열(starting sequence) 주위에서 보다 심도있게 탐색될 수 있다는 점에서 직접 진화 기술(direct evolution technique)의 경우에도 이점을 제공한다.
본 발명은 선별 단계가 경우에 따라서 달라지지 않는다(context-independent)는 점에서 종래 기술의 접근방법과 상이하다. 많은 다른 선별 스킴 에서, 예를 들어, 발현된 단백질(expressed protein)이 존재하는 경우는 생성된 라이브러리의 특성에 크게 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 발현된 단백질은 특수한 시스템에서 적절하게 발현되지 않거나 적절하게 디스플레이되지 않을 수 있다(예컨대, 파아지 입자의 표면상에서). 그렇지 않으면, 단백질의 발현은 실제로 선별 사이클 중에서 하나 이상의 중요한 단계들(예를 들어, 파아지 생존력, 또는 감염력, 또는 lac 리프레서 결합)을 방해할 수 있다. 이러한 문제들은 기능적인 분자(functional molecules)의 손실을 초래하거나 적용가능한 선별 방법의 특성을 제한할 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 방법은 시험가능한 단백질의 레퍼토리를 조절할 수 있게 하기 때문에 유익하다. 특수한 기술(예컨대, 항체 선별(antibody selection))에서는 출발 풀(starting pool)의 속성을 조절할 수 없거나 약간밖에 조절할 수 없다. 또 다른 기술(예컨대, lac 융합체 및 파아지 디스플레이)에서는, 후보 풀은 융합 단백질의 경우에만 발현되어야 한다. 이와 대조적으로, RNA-단백질 융합 구조물들은 스크리닝 가능한 후보 풀의 속성을 조절할 수 있게 한다. 또한, 후보 풀 크기는 RNA 또는 DNA 풀(∼1015 구성원들) 만큼 커질 수 있고, 단지 수행된 시험관내 해독 반응의 규모에 의해서만 제한된다. 후보 풀의 구성은 전적으로 실험적 설계(experimental design)에 의존한다; 랜덤 영역(random region)들은 목적 융합 단백질의 분리와 별도로 또는 동시에 함께 분리될 수 있고, 모든 가능한 서열들(possible sequences)은 아니라고 하더라도 대부분이 RNA-단백질 융합 체의 후보 풀 내에서 발현될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
먼저 도면에 관하여 간단히 설명한다.
도 1a-1c는 RNA-단백질 융합체의 제조에 포함되는 단계들의 개략도이다. 도 1a는 융합체의 RNA 부분을 제조하기 위한 시료 DNA 컨스트럭트(construct)의 도면이다. 도 1b는 RNA/퓨로마이신 접합체(conjugate)의 생성을 도시한 것이다. 도 1c는 RNA-단백질 융합체의 생성을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일반적인 선별 프로토콜의 개략도이다.
도 3은 3' 퓨로마이신을 포함하는 최소 해독 주형(minimum translation templates)의 합성 프로토콜의 개략도이다. 단계 (A)는 퓨로마이신 상의 반응성 작용기(5'-OH 및 NH2)에 보호기를 부착하는 단계를 도시한 것이다; 변형되면, 이러한 작용기들은 포스포르아미다이트계 올리고뉴클레오티드 합성(phosphoramidite based oligonucleotide synthesis)에 사용되기 위해 적절하게 보호된다. 보호된 퓨로마이신은 DNA의 3'OH를 통해서 DNA를 부착하는 표준 프로토콜(Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series(IRL Press, Oxford, 1984))을 이용하여 2' OH기를 통해서 아미노헥실-조절 포어 글래스(aminohexyl controlled pore glass: CPG)에 부착된다. 단계 (B)에서는, 43개의 뉴클레오티드들을 포함하는 최소 해독 주형("43-P"라 함)이 표준 RNA 및 DNA 화학(Millipore, Bedford, MA)을 이용하여 합성되고, NH4OH 및 TBAF에 의해 탈보호된 다음 겔 정제된다. 주형은 5' 말단에 13 염기의 RNA를 포함하고 그 다음에는 3' 퓨로마이신의 5'OH에 부착된 29 염기의 DNA가 존재한다. RNA 서열은 (ⅰ) 16S rRNA의 5 염기와 상보적인 샤인-달가노 공통서열(Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine and Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974); 및 Steitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)), (ⅱ) 5 염기 스페이서, 및 (ⅲ) 단일 AUG 개시 코돈을 포함한다. DNA 서열은 dA27dCdCP로서, 여기서 "P"는 퓨로마이신이다.
도 4는 보호된 CPG-결합 퓨로마이신의 바람직한 제조방법의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 주형에 메티오닌을 통합(methionine incorporation)하는 데 이용가능한 방법을 설명한 개략도이다. 반응 (A)에 도시한 바와 같이, 주형은 리보솜에 결합하여, 70S 개시 복합체(initiation complex)를 생성하게 한다. Fmet tRNA는 P 부위에 결합하여 주형과 염기 쌍을 형성한다. 주형의 3' 말단에 있는 퓨로마이신은 분자내 방식(intramolecular fashion)으로 A 부위로 들어가 펩티드 트랜스페라제 센터를 통해서 N-포밀 메티오닌에 아마이드 결합하여, tRNA를 탈아실화한다. 반응 생성물을 페놀/클로로포름으로 추출하면 메티오닌이 공유 결 합되어 있는 주형이 수득된다. 반응 (B)에 도시된 것은 주형과 퓨로마이신 함유 올리고뉴클레오티드들의 원치 않는 분자간 반응이다. 전술한 바와 같이, 최소 주형은 P 부위에 결합된 fmet tRNA를 포함하는 70S 리보솜의 생성을 촉진한다. 이어서 두 번째 주형이 트랜스(in trans)로 들어가 공유 결합된 메티오닌을 제공한다.
도 6a-6h는 35S-메티오닌(35S met)이 해독 주형에 통합되는 과정을 보여주는 사진이다. 도 6a는 반응이 마그네슘(Mg2+) 의존성임을 보여준다. 도 6b는 생성물의 염기 안정성(base stability)을 입증한다; 이 도면에서 이동성 면에서의 변화는 43-P("Met 주형"이라고도 한다)의 5' RNA 서열의 손실에 해당하여 30-P라고 하는 DNA-퓨로마이신 부분을 생성한다. 염기 처리(base treatment)후 표지(label)의 보유는 35S-메티오닌과 주형의 3' 퓨로마이신 사이의 펩티드 결합의 형성과 일치한다. 도 6c는 펩티드 트랜스페라제 억제제의 존재 하에서의 생성물의 생성이 억제된다는 것을 입증한다. 도 6d는 35S-메티오닌 통합이 주형 코드화 서열에 의존한다는 것을 입증한다. 도 6e는 35S-메티오닌 통합의 DNA 주형 길이 의존성을 입증한다. 도 6f는 43-P 및 25-P 주형을 이용한 시스(cis) 대 트랜스(trans) 생성물을 도시한 것이다. 도 6g는 43-P 및 13-P 주형을 이용한 시스(cis) 대 트랜스(trans) 생성물을 도시한 것이다. 도 6h는 망상적혈구 세포용해질 시스템에서의 43-P 및 30-P 주형을 이용한 시스(cis) 대 트랜스(trans) 생성물을 도시한 것이다.
도 7a-7c는 펩티드 융합체 생성 및 선별을 시험하기 위한 구조물의 개략도이다. 도 7a는 LP77("연결-생성물(ligated-product)", "77" 뉴클레오티드 길이)("짧은 myc 주형"이라고도 한다)(서열 1)을 도시한 것이다. 이러한 서열은 5' 개시 코돈과 3' 링커가 측접하는 c-myc 단클론 항체 에피톱 태그 EQKLISEEDL(서열 2)(Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 (1985))를 포함한다. 5' 영역은 43-P의 샤인-달가노 서열과 동일한 박테리아 샤인-달가노 서열을 포함한다. 코드화 서열은 박테리아 시스템에서의 해독에 최적화되었다. 특히, 43-P와 LP77의 5' UTRs는 16S rRNA의 5 염기와 상보적인 샤인-달가노 서열을 포함하고(Steitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)), 리보솜 단백질 서열들과 유사하게 스페이스되어 있다(Stormo et al., Nucleic Acids Res. 10:2971-2996 (1982)). 도 7b는 LP154(연결 생성물, 154 뉴클레오티드 길이)("긴 myc 주형"이라고도 한다)(서열 3)을 도시한 것이다. 이 서열은 c-myc 항체를 분리하는데 이용된 펩티드를 생성하기 위한 코드를 포함한다. 5' 말단은 TMV 상류 서열의 절두된(truncated) 버전("TE"라고 함)을 포함한다. 이러한 5' UTR은 두 개의 ACAAAUUAC 직접 반복서열을 포함하는 TMV 5'UTR로부터 유래된 22 뉴클레오티드 서열을 포함한다(Gallie et al., Nucl. Acids. Res. 16:883 (1988)). 도 7c는 펩티드 선별에 이용될 서열의 예인 풀 #1(서열 4)을 도시한 것이다. 원래의 myc 펩티드의 마지막 7개의 아미노산들은 주형의 PCR을 위해 요구되는 3' 불변 영역(constant region)으로 기능하도록 주형에 포함되었다. 이 서열은 항체 결합 에피톱의 일부가 아닌 것으로 알려져 있다.
도 8은 43-P, LP77 및 LP154, 그리고 망상적혈구("Retic") 및 밀 배아("Wheat") 해독 시스템(translation systems)을 이용한 RNA-단백질 융합체의 합성을 도시한 개략도이다. 도면의 좌측 반은 세 개의 주형 각각에 대한 35S-메티오닌 통합을 설명하는 것이다. 도면의 우측 반은 세 개의 주형 각각에 대해서 RNase A 처리하여 RNA 코드화 영역을 제거한 결과로 수득한 생성물을 도시한 것이다; 도시된 것은 35S-메티오닌-표지된 DNA-단백질 융합체이다. 각각의 DNA 부분은 올리고 30-P와 동일하다. 따라서, 이동성의 차이는 코드화 영역의 길이에 비례하고, 각 케이스내의 상이한 길이의 단백질들의 존재와 일치한다.
도 9는 LP154로부터 합성되고 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석된 RNA-단백질 융합체의 프로테아제 감수성(protease sensitivity)을 입증하는 사진이다. 레인 1은 32P-표지된 30-P 를 포함한다. 레인 2-4, 5-7 및 8-10은 각각 무처리, RNase A 처리 또는 RNase A 및 프로테인아제 K를 처리한 망상적혈구 세포용해질 반응액으로부터 회수된 35S 표지된 해독 주형들을 포함한다. 도 10은 시험관내에서 해독된 33 아미노산 myc-에피톱 단백질을 이용한 면역침강 반응의 결과를 나타낸 사진이다. 레인 1과 레인 2는 각각 myc 에피톱 단백질과 β-글로빈 주형의 해독 생성물을 나타낸다. 레인 3-5는 각각 c-myc 단클론 항체와 PBS, DB 및 PBSTDS 세정 버퍼를 이용한 myc-에핍톱 펩티드의 면역침강 결과를 나타낸 것이 다. 레인 6-8은 β-글로빈 해독 생성물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 면역침강 반응을 나타낸 것이다.
도 11은 시험관내 해독 반응에 의해 수득한 RNA-단백질 융합체의 면역침강을 나타낸 사진이다. 반응에 사용된 주형을 피코몰로 나타내었다. 레인 1-4는 RNA124(LP154 융합체의 RNA 부분)를 나타낸 것이고, 레인 5-7은 RNA-단백질 융합체 LP154를 나타낸 것이다. c-myc 단클론 항체 및 단백질 G 세파로오스를 이용하여 면역침강시킨 후에, 시료에 RNase A와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 처리하고나서 변성 우레아 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하여 융합체를 육안으로 확인할 수 있게 하였다. 주형을 포함하지 않거나 긴 myc 주형(RNA124)의 RNA 부분만을 포함하는 시료들을 사용한 레인 1-4에서는, 융합체가 발견되지 않았다. 레인 5-7에서는 융합체에 해당하는 밴드가 선명하게 보였다. 32P-표지된 30-P의 위치를 표시하였고, 입력 주형의 양은 도면의 상단에 나타내었다.
도 12는 시험관내 해독 반응에 의해 수득된 융합체 물질의 정량(quantitation)을 도시한 그래프이다. 도 11의 레인 5-7에 나타난 융합체 밴드 및 30-P 밴드(도시하지는 않았으나 dT25 상에서의 병행 실험에서 분리된)의 강도를 포스포이메이저 플레이트(phosphorimager plate) 상에서 정량하여 입력 LP154 농도에 대한 함수로 플로팅하였다. 회수된 변형 30-P(좌측 y축)는 입력 주형(x축)에 비례하였으나, 링커-펩티드 융합체(우측 y축)는 변함이 없었다. 이러한 분석으로부터, 1 ㎖의 해독 반응 시료 마다 ∼1012 융합체가 생성됨을 산정하였다.
도 13은 티오프로필 세파로오스 및 dT25 아가로오스, 그리고 이러한 기질들의 본 발명의 RNA-단백질 융합체와의 반응능력을 나타낸 개략도이다.
도 14는 본 발명의 융합체를 순차적으로 분리한 결과를 보여주는 사진이다. 레인 1은 32P-표지된 30-P를 포함한다. 레인 2 및 3은 해독 반응물로부터 분리되고 RNase A에 의해 처리된 LP154를 나타낸 것이다. 레인 2에서, LP154는 티오프로필 세파로오스에 이어 dT25 아가로오스에 의해 순차적으로 분리되었다. 레인 3은 단지 dT25 아가로오스만을 이용해서 분리한 결과를 나타낸다. 결과들은 생성물이 myc 에피톱 코드화 서열내에 유리 티올(free thiol), 아마도 전종단 시스테인(penultimate cysteine)을 포함한다는 것을 가리킨다.
도 15a 및 도 15b는 SDS-트리신-PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의해 분석된 β-글로빈 주형을 이용한 융합 생성물의 형성을 보여주는 사진이다. 도 15a는 주형을 사용하지 않거나(레인 1), syn-β-글로빈 주형(레인 2-4), 또는 LP-β-글로빈 주형(레인 5-7)을 이용한 경우의 35S의 통합을 도시한 도면이다. 도 15b(각 레인은 도 15a와 동일하게 표지함)는 올리고뉴클레오티드 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된 35S-표지된 물질들을 나타낸다. 30-P 테일(tail)이 없는 경우(레인 2-4)에는 물질이 분리되지 않았다.
도 16a-16c는 시험관내 선별에 의해 풀 dsDNA로부터 myc dsDNA를 증대하는 과정을 보여주는 도면 및 사진이다. 도 16a는 선별 프로토콜의 개략도이다. myc 주형과 풀 주형들의 4 가지 혼합물을 시험관내에서 해독시키고 dT25 아가로오스 상에서 분리한 후, TP 세파로오스로 분리한 다음 고정된 주형으로부터 주형 융합체를 정제하였다. 이어서 mRNA-펩티드 융합체들을 역전사하여 주형에 존재하는 임의의 2차 구조 또는 3차 구조를 억제하였다. 각 혼합물의 분취량을 친화성 선별 이전 및 이후에 각각 취하여, 표지된 프라이머의 존재하에서 PCR에 의해 증폭시키고 myc DNA만을 절단하는 제한효소에 의해 절단하였다. 입력 주형 혼합물들은 순수한 myc(레인 1), 또는 1:20, 1:200 또는 1:2000 myc:풀(레인 2-4)이었다. 선별되지 못한 물질들은 myc 주형의 우선적인(preferential) 해독과 역전사로 인해 입력 비율(input ratio)로부터 제하였다. 선별 단계 중의 myc 주형의 증대는 선별 전후의 풀:myc 비율의 변화로부터 산출되었다.
도 17은 myc RNA 주형들의 해독을 나타낸 사진이다. 다음과 같은 링커들을 사용하였다: 레인 1-4, dA27dCdCP; 레인 5-8, dA27rCrCP; 및 레인 9-12, dA21C9C9C9dAdCdCP. 각 레인에서, RNA 주형의 농도는 600nM이었고,
35S-Met이 표지에 사용되었다. 반응 조건들은 다음과 같다: 레인 1, 5 및 9는 30℃에서 1시간; 레인 2, 6, 및 10은 30℃에서 2시간; 레인 3, 7 및 11은 30℃에서 1시간, -20℃에서 16시간; 그리고 레인 4, 8, 및 12는 30℃에서 1시간, 50mM Mg2+ 존재하에 -20℃에서 16시간. 본 도면에서 "A"는 유리 펩티드를 의미하고, "B"는 mRNA-펩티드 융합체를 나타낸다.
도 18은 32P-표지된 myc RNA 주형들의 해독을 나타낸 사진이다. 사용된 링커는 dA21C9C9C9dAdCdCP이었다. 해독은 30℃에서 90분간 진행하였고 Mg2+를 첨가하지 않은 상태로 -20℃에서 2일간 인큐베이션하였다. mRNA 주형들의 농도는 400nM(레인 3), 200nM(레인 4), 100nM(레인 5), 및 100nM(레인 6)이었다. 레인 1은 35S-Met으로 표지된 mRNA-펩티드 융합체이다. 레인 2는 32P-표지된 mRNA를 나타낸다. 레인 6에서, 반응은 0.5mM 캡 유사체(cap analog)의 존재하에서 수행되었다.
도 19는 암비온(Ambion)(레인 1), 노바젠(Novagen)(레인 2) 및 아머샴(Amersham)(레인 3)으로부터 입수한 세포용해질을 이용한 myc RNA 주형의 해독을 도시한 사진이다. 사용된 링커는 dA27dCdCP이었다. 주형의 농도는 600nM이었고, 표지하기 위해 35S-Met를 사용하였다. 해독은 30℃에서 1시간 동안 진행하였고 50mM Mg2+의 존재하에 -20℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
도 20은 6 라운드의 시험관내 선별 진행 중에 항-myc 단클론 항체 9E10에 의해 결합된 RNA-펩티드 융합체의 증대를 나타낸 그래프이다.
도 21은 합성 myc 펩티드들을 가지고 행한 경쟁분석(competition assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 랜덤 27-머 라이브러리로부터 선별된 12개 펩티드들의 아미노산 서 열의 개략도이다.
도 23은 융합체 생성에 대한 링커 길이의 영향을 나타낸 사진이다. 본 도면에서, 링커[N]=13, 19, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 뉴클레오티드 길이의 링커들(dA10-47dCdCP)을 포함하는 Myc 주형들을 SDS-PAGE에 의해 융합체 형성(fusion formation)에 대해 분석하였다. 유연성 링커(flexible linker) F(dA21[C9]3dAdCdCP)도 도시하였다. 해독은 600 nM의 주형을 가지고 30℃에서 90분간 진행하였고, 이어서 50 mM Mg2+를 첨가한 후 -20℃에서 2일간 인큐베이션하였다.
도 24는 myc와 λPPase mRNA의 동시-해독(co-translation)을 나타내는 사진이다. 본 도면에서, 유연성 링커 F(dA21[C9]3dAdCdCP)를 포함하는 200 nM의 λPPase RNA(RNA716) 및/또는 50 nM의 myc RNA(RNA152)를 [35S]-Met을 사용하여 해독시켰다. Mg2+(75 mM)를 첨가하고나서, -20℃에서 인큐베이션하였다. 교차-생성물(cross- product)(λPPase 단백질에 대한 myc 주형 융합체)에 해당하는 밴드는 발견되지 않았다.
본원에서는, 단백질이 그들 자신의 mRNA에 공유 결합되어 있는 융합체를 사용하여 목적으로 하는 기능을 갖는 단백질을 선별하는 일반적인 방법이 기술된다. 이러한 RNA-단백질 융합체는 그들의 3' 말단에 펩티드 수용체가 부착되어 있는 mRNA 풀(pool)의 시험관내(in vitro) 또는 원장소(in situ) 해독에 의해 합성된다. 바람직한 일구현예에서, 리보솜은 메시지의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 통독한 후, 설계된 정지 부위(pause site)에 도달시 멈춰서고, 수용체 단위체가 리보솜 A 부위를 차지한 후 P 부위 내의 펩티드-tRNA로부터의 신생 펩티드를 수용하여 RNA-단백질 융합체를 생성한다. RNA와 단백질간의 공유 결합(mRNA의 3' 말단과 그 mRNA가 코드화하는 단백질의 C-말단 사이의 아마이드 결합 형태인)은 상기 RNA의 역전사에 의한 선별후에 상기 단백질 내의 유전정보가 회수 및 증폭(예를 들면, PCR에 의해)될 수 있게 해준다. 일단 융합체가 생성되면, 선별 또는 증대(enrichment)가 mRNA-단백질 융합체의 특성에 근거하여 수행되거나, 또는 대안으로, 단일가닥 RNA가 선별에 미칠 임의의 영향을 배제하기 위하여 mRNA 주형이 단백질에 부착되어 있는 상태로 mRNA 주형을 사용하여 역전사가 수행될 수 있다. mRNA-단백질 컨스트럭트가 사용될 때, 선별된 융합체는 어떤 단위체(단백질, RNA, 또는 양자)가 원하는 기능을 제공하는지를 결정하기 위해 시험될 수 있다.
바람직한 일구현예에서, 퓨로마이신(티로실 아데노신과 유사한)은 신장중인 펩티드를 그의 mRNA에 부착시키는 수용체로 작용한다. 퓨로마이신은 펩티드 신장(elongation)을 종결시킴으로써 작용하는 항생물질이다. 아미노아실-tRNA의 의사체(mimetics)로서, 그것은 A 부위에 결합하여 신장중인 펩티드 사슬을 수용한 후 리보솜을 떼어내버림으로써(KD=10-4M로)(Traut and Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964); Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)) 보편적인 단백질 합성 저해제로 작용한다. 퓨로마이신의 가장 매력적인 특징중의 하나는 그것이 신장중인 펩 티드 사슬과 안정적인 아마이드 결합을 형성함으로써, 불안정한 에스테르 결합을 형성하는 잠재적인 수용체보다 더 안정적인 융합체를 형성한다는 사실이다. 특히, 펩티드-퓨로마이신 분자는 펩티드와 퓨로마이신의 O-메틸 티로신 부위 사이에 안정한 아마이드 결합을 가지고 있다. O-메틸 티로신은 안정한 아마이드 결합에 의해 퓨로마이신의 변형된 아데노신의 3'-아미노기에 연결된다.
수용체에 대한 다른 가능한 선택권은, mRNA의 3' 말단에 있는 tRNA-유사 구조물(tRNA-like structures) 뿐만 아니라, 퓨로마이신과 유사한 방식으로 작용하는 다른 화합물들을 포함한다. 그러한 화합물은, 제한 없이, 아미노산 뉴클레오티드, 페닐알라닐-아데노신(A-Phe), 티로실-아데노신(A-Tyr) 및 알라닐-아데노신(A-Ala)과 같이, 아데닌 또는 아데닌-유사 화합물에 연결된 아미노산을 가진 임의의 화합물은 물론, 페닐알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신 및 티로실 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신과 같은 아마이드-유사 구조물(amide-like structures)을 포함하며; 이들 화합물 중에서 자연발생적인(naturally occuring) L-아미노산 또는 그의 유사체가 사용될 수도 있다. 또한, 결합된 tRNA-유사 3' 구조물-퓨로마이신 접합체(combined tRNA-like 3' structure puromycin conjugate)도 본 발명에 사용될 수 있다.
도 2에는 본 발명에 따른 바람직한 선별 스킴이 도시되어 있다. 이러한 선별에 수반되는 단계들은 일반적으로 다음과 같이 수행된다.
단계 1. DNA 주형의 제조. 본 발명의 RNA-단백질 융합체를 생성하기 위한 단계로서, 융합체의 RNA 부분이 합성된다. 이것은 직접적인 화학적 RNA 합성에 의 해 달성되거나, 또는 보다 일반적으로는, 적절한 이중가닥 DNA 주형을 전사함으로써 달성된다.
그러한 DNA 주형은 임의의 표준기술에 의해 생산될 수 있다(재조합 DNA 기술, 화학적 합성, 또는 양자중 임의의 기술을 포함하여). 원칙적으로는, 공지된 랜덤(random), 랜덤화된(randomized) 또는 돌연변이된 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 주형 생산을 허용하는 임의의 방법이 이러한 목적에 사용될 수 있다. 특정 접근법에 있어서, 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 랜덤 염기)가 합성되고 전사 이전에 증폭(예를 들면, PCR에 의해)된다. 화학적 합성 또한 공지의 단백질 코드화 서열의 중심으로 삽입될 랜덤 카세트를 생산하는데 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, chapter 8.2, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons and Greene Publishing Company, 1994). 후자의 접근법은 단백질 내의 관심있는 특정 부위 주변에 높은 밀도의 돌연변이를 생성한다.
DNA 주형 서열의 전체 랜덤화(total randomization)에 대한 대안은 부분 랜덤화(partial randomization)이며, 이러한 방식으로 합성된 풀은 일반적으로 "도프(doped)" 풀이라 불리운다. RNA 서열상에서 수행되는 이러한 기술의 일례가, 예를 들면, Ekland et al.(Nucl. Acids Research 23:3231 (1995))에 기술되어 있다. 부분 랜덤화는, 각 염기 첨가 반응 혼합물이 한 가지 염기는 과량으로 함유하고 나머지 다른 염기들 각각은 소량으로 함유하도록 합성 반응을 편향시킴으로써, 또는 염기 농도를 세심하게 조절함으로써 화학적으로 수행될 수 있으며, 원하는 돌연변이 빈도가 이러한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 부분 랜덤화 풀은 또한, 예 를 들면, 뷰드리 및 조이스(Beaudry and Joyce, Science 257:635 (1992)), 및 바텔 및 스조스텍(Bartel and Szostack, Science 261:1411 (1993))에 의해 기술된 바와 같이 에러 프론(error prone) PCR 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
공지의 서열을 가지고 출발하여 돌연변이된 DNA 풀을 생성하는 다수의 방법 또한 DNA 컨스트럭트 생산에 유용하다. 그러한 기술의 예는 오즈벨 등의 문헌(Ausubel et al., supra, chapter 8); 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, chapter 15, Cold Spring Harbor Press, New York, 2nd ed. (1989)); 캐드웰 등의 문헌(Cadwell et al., PCR Methods and Applications 2:28 (1992)); 창 등의 문헌(Tsang et al., Meth. Enzymol. 267:410 (1996)); 라이드하르 올젠 등의 문헌(Reidhaar Olsen et al., Meth. Enzymol. 208;564 (1991)); 및 에클랜드 및 바텔의 문헌(Ekland and Bartel, Nucl. Acids. Res. 23:3231 (1995))에 기술되어 있다. 마지막으로, 둘 또는 그 이상의 상동 유전자(homologous genes)가 시험관내에서 재조합되어 출발 라이브러리를 생성할 수 있다(Crameri et al., Nature 391:288-291 (1998)).
ORFs는 선택된 코돈에 따라 다양한 방식으로 랜덤 서열로부터 구성될 수 있다. 오픈 리딩 프레임 내의 종결 코돈(stop codon)은 필시 회피된다. 전적으로 랜덤한 서열 라이브러리가 사용될 수 있으나(NNN 코드화), 가장 짧은 라이브러리를 제외하고는 모두 허용불가능하게 높은 종결 코돈 비율(3/64=4.7%/코돈)을 갖는다. 그러한 라이브러리는 또한 때때로 열세한 해독을 초래할 수 있는 드물게 사용되는 코돈을 포함한다. NNG/C 코돈은 다소 감소된 종결 빈도(1/32=3.1%/코돈)를 제공함과 동시에, 포유동물 해독 시스템에 적합한 20 아미노산에 대한 최적의 코돈에 대한 접근을 제공한다. NNG/C 코돈은, 최적의 코돈이 7가지 경우(AEGKRTV)에 A 또는 T로 끝나는 박테리아 해독 시스템에 적용시에는 덜 적합하다. 세 가지 상이한 뉴클레오티드의 혼합인 N1N2N3 코돈을(LeBean and Kauffman, Protein Science 2:1249-1254 (1993) 및 거기에 인용된 참조문헌들)을 사용하여 구형 단백질과 유사한 아미노산 함량 및 매우 낮은 종결 코돈 빈도를 제공하는 몇 가지 해결책이 있다. 마지막으로, 가장 무한히 다양한 세미-합리적(semi-rational) 설계 전략이 아미노산 타입에 따른 패턴 라이브러리(pattern library)에 적용될 수 있다. 예를 들면, 소수성(h) 또는 극성(p) 아미노산들이 각각 NTN 또는 NAN 코돈을 사용하여 선택될 수 있다(Beasley and Hecht, J. Biol. Chem. 272:2031-2034 (1997)). 이들은 α-나선(phpphhpp…) 또는 β-시트(phphph…) 형성에 대한 선호도를 제공하도록 패턴화될 수 있다.
합성 서열로부터 구성된 ORFs 또한 합성 DNA 내에서의 삽입 또는 결실에 의해 초래된 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 결함은 해독 리딩 프레임의 변화에 기인하는 부정적인 결과를 가져올 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드로부터 구성된 다수의 풀과 유전자의 검사 결과는 삽입 및 결실이 위치당 ~0.6%, 또는 코돈당 1.8%의 빈도로 발생함을 암시하였다. 정확한 발생빈도는 변하기 쉬우며, 합성 DNA의 소스(source)와 길이에 의존하는 것으로 생각된다. 특히, 서열이 길수록 삽 입 및 결실의 빈도가 더 높아진다(Haas et al., Current Biology 6:315-324 1996)). ORF 내의 프레임 이동(frame shift)을 감소시키기 위한 간단한 해결책은 순일하게 정제될 수 있는 상대적으로 짧은 합성 DNA 분절(80 뉴클레오티드 또는 그 이하)을 사용하는 것이다. 이어서, 몇 개의 짧은 서열의 제한효소 처리 및 리게이션(ligation)에 의해 더 긴 ORFs가 생성될 수 있다.
본 발명의 선별 스킴을 최적화하기 위해, 주형의 3' 및 5' 말단의 서열과 구조 또한 변형될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변형은 두 가지 개별적인 선별에서 수행되는데, 각각은 적절한 말단에 인접한 주형 내로의 랜덤 영역의 삽입 및 선별을 포함한다. 이러한 선별은 (i) 제조된 융합체의 양을 최대화하는(그리고 그럼으로써 라이브러리의 복잡성을 최대화하는) 역할을 하거나, 또는 (ii) 최적화된 해독 서열을 제공하는 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 방법은 일반적으로 돌연변이유발 PCR(mutagenic PCR)과 조합하여 코드화영역 및 비코드화영역 내의 해독 주형을 최적화시키는데 적용될 수 있다.
단계 2. RNA 생성. 상술한 바와 같이, RNA-단백질 융합체의 RNA 부분은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이와 달리, 그리고 특히 더 긴 RNA 서열이 사용되는 경우, RNA 부분은 DNA 주형의 시험관내 전사(in vitro transcription)에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 접근법에서는, T7 폴리메라제가 RNA 주형을 효소적으로 생산하는데 사용된다. 전사는 일반적으로 PCR 반응과 동일한 부피로 수행된다(100ul 반응으로부터 얻은 PCR DNA가 100ul 전사에 사용된다). 이러한 RNA는, 만일 원한다면, 전사반응시 GTP에 비하여 과량의 m7GpppG를 사용하여 5' 캡을 보유하도록 생성될 수 있다(Gray and Hentze, EMBO J. 13:3882-3891 (1994)). 이러한 용도에 적절한 다른 RNA 폴리메라제는 SP6, T3 및 이. 콜라이 RNA 폴리메라제(예를 들면, Ausubel et al. supra, chapter 3에 기술되어 있는)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 합성된 RNA는 전체적으로 또는 부분적으로 변형된(modified) RNA일 수 있다. 특정한 일실시예에서, 포스포로티오에이트 RNA가 변형된 리보뉴클레오티드 및 표준기술을 사용하여 (예를 들면, T7 전사에 의해) 생산될 수 있다. 그러한 변형된 RNA는 뉴클레아제(nuclease)에 대해 안정하다는 이점을 제공한다. 이어서, 전장(full length) RNA 시료가, 전술한 바와 같이, NAP-25(Pharmacia) 상에서의 탈염(desalting)이 뒤따르는 우레아 PAGE를 사용하여 전사 반응액으로부터 정제된다(Roberts and Szostack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302 (1997)).
단계 3. 퓨로마이신의 주형에의 리게이션. 다음으로, 퓨로마이신(또는 임의의 다른 적절한 펩티드 수용체)이 주형 서열에 공유 결합된다. 이 단계는 T4 RNA 리가아제를 사용하여 퓨로마이신을 RNA 서열에 직접 부착함으로써 달성되거나, 또는 두 뉴클레오티드 서열을 함께 연결할 수 있는 T4 DNA 리가아제 또는 임의의 다른 효소를 사용하여 DNA "스플린트(splint)" 방식으로 퓨로마이신을 부착함으로써 달성될 수 있다(참조: 도 1b)(참조: 예를 들면, Ausubel et aL., supra, chapter 3, sections 14 and 15). 또한, tRNA가 퓨로마이신-유사 화합물을 RNA에 부착하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면, 페닐알라닌-tRNA 합성효소는 3' 아미노기를 함 유한 페닐알라닐-tRNA 분자에 페닐알라닌을 연결하여, 퓨로마이신-유사 3' 말단을 가진 RNA 분자를 생성한다(Faser and Rich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70:2671 (1973)). 사용가능한 다른 펩티드 수용체의 예에는, 제한 없이, 아미노산 뉴클레오티드, 페닐알라닐-아데노신(A-Phe), 티로실-아데노신(A-Tyr) 및 알라닐-아데노신(A-Ala)과 같이 아데닌 또는 아데닌-유사 화합물에 연결된 아미노산을 소유한 임의의 화합물은 물론, 페닐알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신 및 티로실 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신과 같은 아마이드-결합 구조물(amide-linked structures)이 포함되며; 이들 화합물 중에서 자연발생적인 L-아미노산 또는 그의 유사체가 사용될 수도 있다. 다수의 펩티드 수용체가, 예를 들면, 크레이브스키 및 쿠크하노바의 문헌(Krayevsky and Kukhanova, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1 (1979))에 기술되어 있다.
단계 4. RNA-단백질 융합체의 생성 및 회수. RNA-단백질 융합체를 생성하기 위해, 임의의 시험관내 또는 원장소 해독 시스템이 사용될 수 있다. 후술하는 바와 같이, 진핵생물 시스템이 바람직하며, 특히 바람직한 두 가지 시스템은 밀 배아 및 망상적혈구 용해질 시스템을 포함한다. 그러나, 원칙적으로, RNA-단백질 융합체 형성을 허용하고 그 융합체의 RNA 부분을 심각하게 분해하지 않는 모든 해독 시스템이 본 발명에 유용하다. 또한, 이들 시스템중 임의의 시스템에서의 RNA 분해를 감소시키기 위해, 분해-차단 안티센스 올리고뉴클레오티드(degradation-blocking antisense oligonucleotie)가 해독 반응 혼합물에 포함될 수 있으며; 그 러한 올리고뉴클레오티드는 그 분자의 RNA 부분에 있는 분해를 촉발하는 서열에 특이적으로 혼성화하여 그 서열을 덮는다(예를 들면, Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:4937 (1997) 참조).
상술한 바와 같이, 다수의 진핵생물 해독 시스템이 본 발명에 유용하다. 이들은 효모, 복수(ascites), 종양세포(Leibowitz et al., Meth. Enzymol. 194:536 (1991)) 및 제노푸스(Xenopus) 난자의 용해질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 박테리아 시스템 유래의 유용한 시험관내 해독 시스템은 주베이의 문헌(Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)); 첸 및 주베이의 문헌(Chen and Zubay, Meth. Enzymol. 101:44 (1983)); 및 엘만의 문헌(Elman, Meth. Enzymol. 202:301 (1991))에 기술된 것들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 해독 반응은 원장소에서(in situ) 수행될 수도 있다. 특정한 일실시예에서, 해독은 표준기술을 사용하여 mRNA를 제노푸스 난자에 주입함으로써 수행될 수 있다.
RNA-단백질 융합체가 일단 생성되면, 임의의 표준 단백질 또는 RNA 정제기술을 사용하여 해독 반응 혼합물로부터 회수될 수 있다. 일반적으로, 단백질 정제기술이 사용된다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이, dT25 아가로오스 또는 티오프로필 세파로오스와 같은 적당한 크로마토그래피 시약을 사용함으로써 융합체 정제가 촉진될 수 있다. 그러나, 정제는, 또한 또는 한편, 융합체의 RNA 부분에 기초한 정제를 포함한다; 그러한 정제를 위한 기술은, 예를 들면, 오즈벨 등의 문헌(Ausubel et al., supra, chapter 4)에 기술되어 있다.
단계 5. 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체의 선별. 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체의 선별은 후보 융합체 집단으로부터 원하는 융합체를 선택적으로 구별 또는 분리하는데 유용한 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 분리 기술의 예에는, 예를 들면, 컬럼, 비드, 막 또는 다른 고형 지지체 상에 직접 또는 간접적으로 고정된 결합 파트너에의 선택적 결합, 및 융합체의 단백질 단위체에 특이적인 항체를 사용한 면역침강법이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 기술중 첫 번째는 그에의 결합이 가능한 임의의 타입의 분자로 구성된 고정된 선별 모티프(immobilized selection moiety)를 사용한다. 가능한 선별 모티프 분자의 목록이 도 2에 도시되어 있다. 선별은 또한 후보 분자와 반응하는 친화성 표지(affinity label)에 부착된 기질 분자(예를 들면, 기질-비오틴)의 사용에 기초하거나, 또는 융합체 분자와의 임의의 타입의 상호작용에 기초할 수 있다. 또한, 단백질은 바텔 및 스조스텍(Bartel and Szostack, supra)에 의해 RNA 효소 분리에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 그들의 촉매활성에 근거하여 선별될 수 있다; 그러한 특정 기술에 따르면, 원하는 분자들은 표적 분자를 자신에 연결시키는 그들의 능력에 근거하여 선별되며, 이어서 기능성 분자들이 그러한 표적의 존재에 기초하여 분리된다. 이와 동일한 접근법 또는 기타 다른 기능성 선별법(functional selection)을 사용하여 신규한 또는 향상된 촉매활성 단백질을 분리하기 위한 선별 스킴이 본 발명에 의해 가능해진다.
또한, 본원에 기술한 바와 같이, 원하는 RNA-단백질 융합체(또는 그의 DNA 카피)의 선별은 후보 분자 풀 내에서의 그 융합체의 증대(enrichment)에 의해 촉진될 수 있다. 그러한 최적의 증대를 달성하기 위해, 후보 RNA-단백질 융합체 집단은, 결합 파트너-융합체 복합체를 시료 내의 결합하지 않은 성분들로부터 실질상 분리시키는 조건하에서, 그 융합체의 RNA 부분 또는 단백질 부분에 특이적인 결합 파트너(예를 들면, 상술한 결합 파트너들 중의 하나)와 접촉된다. 이러한 단계는 반복될 수 있으며, 그 기술은 바람직하게는 적어도 2개의 연속적인 증대 단계를 포함하는데, 그들 중 한 단계에서는 RNA 부분에 특이적인 결합 파트너를 사용하여 융합체가 선별되며, 다른 한 단계에서는 단백질 부분에 특이적인 결합 파트너를 사용하여 융합체가 선별된다. 또한, 만일 융합체의 동일 부분(예를 들면, 단백질 부분)을 표적으로 하는 증대 단계가 반복되는 경우, 바람직하게는 상이한 결합 파트너가 사용된다. 본원에 기술된 특정한 일실시예에서는, 우선 융합체의 RNA 부분에 특이적인 결합 파트너를 사용한 다음, 2개의 연속적인 단계에서, 양자 모두 융합체의 단백질 부분에 특이적인 두 가지 상이한 결합 파트너를 사용함으로써, 한 분자집단 내에서 목적으로 하는 융합체를 증대시킬 수 있다. 또한, 이들 복합체는, 제한 없이 컬럼 친화성 크로마토그래피, 원심분리 또는 면역침강을 포함하는 임의의 표준 분리기술에 의해 시료 성분들로부터 분리될 수 있다.
아울러, 증대(또는 선별) 복합체(enrichment complex)로부터 RNA-단백질 융합체의 용출(또는 선별)이 다수의 접근법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이, 한 접근법은 원하는 RNA-단백질 융합체를 분리하기 위해 변성 또는 비특이적 화학적 용출단계를 포함한다. 그러한 단계는 성분들 사이의 및/또는 성분과 고형 지지체 사이의 비공유 결합을 파괴함으로써 비특이적인 방식으로 복합체 성분들이 서로로부터 또는 결합된 고형 지지체로부터 유리(release)되는 것을 촉진한다. 본원에 기술된 바와 같이, 한 예시적인 변성 또는 비특이적 화학적 용출 시약은 4% HOAc/H2O이다. 다른 예시적인 변성 또는 비특이적 화학적 용출 시약은 구아니딘, 우레아, 고염(high salt), 계면활성제, 또는 비공유성 부가물이 일반적으로 제거될 수 있는 임의의 다른 시약을 포함한다. 이와 달리, 한 접근법은 특이적 화학적 용출 단계를 포함할 수 있는데, 그러한 단계에서는 융합분자의 특이적인 방출을 초래하는 화학물질이 사용된다. 특정한 일실시예에서, 만일 원하는 융합 단백질의 링커 팔(linker arm)이 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함하는 경우, 결합된 융합 파트너는, 예를 들면, 이황화 결합의 환원 및 결합된 표적의 유리를 초래하는 DTT 첨가에 의해 용출될 수 있다.
이와 달리, 용출은 친화성 복합체를 특이적으로 파괴함으로써 달성될 수 있다; 그러한 기술은 복합체의 한 성분을 과량으로 첨가함으로써 복합체 성분들을 특이적으로 방출시킨다. 예를 들면, ATP-결합 선별(ATP-binding selection)에서, 용출은 과량의 ATP를 인큐베이션 혼합물에 첨가함으로써 수행된다. 마지막으로, 한 접근법은 효소적 용출 단계를 포함할 수 있다. 이러한 접근법에 의하면, 결합된 분자 자체 또는 외부에서 첨가된 프로테아제(또는 다른 적절한 가수분해 효소)가 표적 또는 효소 중 어느 하나를 절단하여 유리시킨다. 특정한 일실시예에서, 프로테아제 표적 부위가 복합체 성분들 중 어느 하나에 포함되어, 결합된 분자가 프로 테아제 첨가에 의해 방출될 수 있다. 이와 달리, 촉매성 선별(catalytic selection)에서, 용출은 그 자신을 고형 지지체로부터 유리(예를 들면, 절단)시킬 수 있는 분자의 분리를 위한 선별단계로서 사용될 수 있다.
단계 6. 역전사효소를 사용한 RNA 서열의 DNA 카피 생성. 원한다면, 임의의 표준기술을 사용하여(예를 들면, Superscript 역전사효소를 사용하여) RNA 서열을 역전사함으로써 선별된 RNA 융합 서열의 DNA 카피를 용이하게 수득할 수 있다. 이러한 단계는 선별 또는 증대 단계 이전에(예를 들면, 도 16에 도시된 바와 같이), 또는 그 단계 이후에 수행될 수 있다. 이와 달리, 역전사 과정은 융합체를 시험관내 또는 원장소 해독 혼합물로부터 분리하기 이전에 수행될 수도 있다.
다음으로, DNA 주형이 일부 또는 전장 이중가닥 서열로서 증폭된다. 바람직하게는, 이 단계에서, 적절한 올리고뉴클레오티드 및 PCR 증폭술을 사용하여 전장 DNA 주형이 생성된다.
이들 단계, 및 이들 단계를 수행하기 위한 시약 및 기술을 특정 실시예를 들어 상세히 기술하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며, 제한적인 것으로 해석되지 않는다.
RNA-단백질 융합체를 위한 주형 생산
도 1a 및 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 선별 스킴은 바람직하게는 다수의 설계 요소들(design elements)을 포함하는 이중가닥 DNA 주형을 사용한다. 이러한 요소들 중 제 1 요소는 mRNA 합성을 위해 원하는 RNA 폴리메라제와 함께 사 용되는 프로모터이다. 도 1a에 도시되고 본원에 기술된 바와 같이, T7 프로모터가 바람직하나, 선형 이중가닥 DNA로부터의 합성을 지시할 수 있는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다.
도 1a에 도시된 주형의 제 2 요소는 5' 비해독 영역(또는 5' UTR)이라 불리우며, 해독 개시 부위 상류의 RNA에 해당한다. 담배 모자이크 바이러스 5' 비해독 영역의 결실 돌연변이체이며 특히 TMV 해독 개시 부위에 바로 5'인 염기에 해당하는 바람직한 5' UTR("TE"라 불리움)이 도 1a에 도시되어 있으며; 이러한 UTR의 서열은 다음과 같다: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA(처음 3 뉴클레오티드는 전사를 증대시키기 위해 삽입되었음)(서열 5). 임의의 다른 적절한 5' UTR이 사용될 수도 있다(참조: 예를 들면, Kozak, Microbiol. Rev. 47:1 (1983); 및 Jobling et al., Nature 325:622 (1987)).
도 1a에 도시된 제 3 요소는 해독 개시 부위가다. 일반적으로, 이것은 AUG 코돈이다. 그러나, AUG 이외의 코돈이 자연발생적인 코드화 서열에 활용되는 예가 있으며, 이러한 코돈 또한 본 발명의 선별 스킴에 사용될 수 있다. 이러한 코돈 주위의 정확한 전후 서열환경은 해독 효율에 영향을 미친다(Kozak, Microbiological Reviews 47:1-45 (1983); and Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)). 5'RNNAUGR 서열은 대부분의 서열에 양호한 개시 서열환경(start context)을 제공하는데, 첫 번째 퓨린(-3)에는 A가, 그리고 두 번째 퓨린(+4)에는 G가 선호된다(Kozak, Microbiological Reviews 47:1-45 (1983); and Kozak, J. Biol. Chem. 196:947-950 (1987)).
도 1a에 도시된 제 4 요소는 단백질 서열을 코드화하는, 단백질의 오픈 리딩 프레임("ORF"라 불리움)이다. 이러한 오픈 리딩 프레임은 임의의 자연발생적인, 랜덤한, 랜덤화된, 돌연변이된, 또는 전적으로 합성된 단백질 서열을 코드화할 수 있다. ORF와 인접한 3' 불변 영역(constant region)의 가장 중요한 특징은 둘 중 어느 것도 종결 코돈을 포함하지 않는다는 것이다. 종결 코돈의 존재는 단백질 합성의 불완전한 종료(premature termination)를 허용하여 융합체 형성을 저해할 것이다.
도 1a에 도시된 제 5 요소는 3' 불변 영역이다. 이 서열은 풀(pool) 서열의 PCR 증폭 및 퓨로마이신-함유 올리고뉴클레오티드의 mRNA에의 리게이션을 촉진한다. 원한다면, 이 영역은 또한, 리보솜이 정지하게 함으로써 수용체 단위체(예를 들면, 퓨로마이신)가 펩티드-tRNA로부터 신생 펩티드 사슬을 수용하기 위한 추가적인 시간을 허용하는 서열인 정지 부위(pause site)를 포함할 수 있다; 이러한 정지 부위는 아래에서 보다 상세히 토의된다.
현재의 방법을 개발하기 위해, 초기에 RNA-단백질 융합체는 1~2 코돈을 포함하는 매우 단순화된 mRNA 주형을 사용하여 생산되었다. 이러한 접근법은 두 가지 이유 때문에 채택되었다. 첫째, 이러한 크기의 주형은 화학적 합성에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 그리고 둘째, 작은 오픈 리딩 프레임은 연결(linkage) 효율, 말단 불균일성(end heterogeneity), 주형 의존성 및 해독 정확성을 포함하는 반응의 결정적인 특징들의 분석을 용이하게 한다.
컨스트럭트 설계. 기본적인 컨스트럭트가 시험용 RNA-단백질 융합체를 생산 하는데 사용되었다. 상기 분자는, (i) 리보솜 단백질 L1으로부터의 샤인-달가노(Shine-Dalgano) 서열의 3 염기 결실을 가지고 있고 16S rRNA의 5 염기에 상보적인 해독개시용 샤인-달가노(SD) 서열(즉, rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA)(서열 6)(Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine and Dalgano, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974); 및 Steitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975))을 포함하는 mRNA, (ii) AUG 개시 코돈, (iii) 정지 부위로 작용하는 DNA 링커(즉, 5'-(dA)27), (iv) dCdC-3', 및 (v) 3' 퓨로마이신(P)으로 구성된다. 폴리 dA 서열은 그것이 A 부위에서 tRNA를 열세하게 본뜨는 것으로 알려져 있기 때문에(Morgan et al., J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967); Ricker and Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578 (1991)) 선택되었으며, 우수한 정지 부위로 작용하도록 설계되었다. 올리고 dA 링커의 길이는 리보솜의 디코드화(decoding) 부위와 펩티드 전달 센터(peptidyl transfer center) 사이의 ~60-70Å 거리에 이르도록 선택되었다. dCdCP는 tRNA의 CCA 말단을 모방하였으며, 퓨로마이신이 리보솜의 A 부위에 결합하는 것을 촉진하도록 설계되었다.
최소 주형 43-P의 화학적 합성. 43-P 컨스트럭트(도 3에 도시됨)를 합성하기 위해, 우선 퓨로마이신을 표준 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성 화학에 적합한 방식으로 고형 지지체에 부착하였다. 이러한 올리고에 대한 합성 프로토콜이 도 3에 개략적으로 도시되어 있으며, 아래에 보다 상세히 기술된다. 퓨 로마이신을 조절된 포어 글래스(controlled pore glass, "CPG") 고형 지지체에 부착하기 위해, 아미노기를 DNA 합성기 모델 380용의 Applied Biosystems User Bulletin #49 (1988)에 설명된 바와 같이 트리플루오로아세틸기로 보호하였다. 그런 다음, 표준 DMT-Cl 접근법(Gait, Oligonucleotide Synthesis The Practical Approach Series(IRL Press, Oxford, 1984))을 사용하여 5' OH 보호를 수행하였으며, 2' OH를 통한 아미노헥실 CPG에의 부착을 3' OH가 데옥시뉴클레오시드 부착에 이용될 때와 완전히 동일한 방식으로 수행하였다(참조: 도 3 및 Gait, supra, p. 47). 5'에 DMT-CPG가 연결된 보호된 퓨로마이신은 포스포르아미다이트 모노머를 사용한 사슬 신장(chain extension)에 적합하였다. 올리고 합성은 3'→5' 방향으로 다음과 같은 순서로 진행되었다: (i) 3' 퓨로마이신, (ii) pdCpdC, (iii) 링커로서 ~27 유닛의 dA, (iv) AUG, 및 (v) 샤인-달가노 서열. 43-P 컨스트럭트의 서열이 하기에 도시된다.
CPG 퓨로마이신의 합성. 보호된 CPG 퓨로마이신의 합성은 앞서 개설한 데옥시뉴클레오티드에 사용된 일반적인 경로(Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984))를 따랐다. 주요 차이점에는 적절한 N 차단기(N blocking group)의 선별, 퓨로마이신 2' OH에서의 고형 지지체에의 부착, 및 고형 지지체에 대한 결합 반응이 포함되었다. 후자의 경우에, 반응은 매우 낮은 농도의 활성화된 뉴클레오티드를 가지고 수행되었는데, 이는 이 물질이 고형 지지체보다 훨씬 더 비싸기 때문이다. 결과되는 수율(~20umol/g 지지체)은 묽은 반응조건을 고려할 때 상당히 만족스러웠 다.
N-트리플루오로아세틸 퓨로마이신의 합성. 우선, 267mg(0.490mmol) 퓨로마이신·HCl을 물에 용해시키고 pH 11 탄산 버퍼를 첨가한 후 클로로포름으로 추출(3X)함으로써, 유리 염기(free base) 형태로 전환시켰다. 유기상을 증발시켜 건조시키고, 중량을 측정하였다(242mg, 0.513mmol). 이어서, 유리 염기를 11ml 건조 피리딘 및 11ml 건조 아세토니트릴에 용해시킨 후, 139ul(2.0mmol) 트리에틸아민(TEA; Fluka) 및 139ul(1.0mmol) 트리플루오로아세틱 안하이드라이드(TFAA; Fluka)를 교반하면서 첨가하였다. 그런 다음, 혼탁한 용액에 박막크로마토그래피(TLC)(93:7, 클로로포름/메탄올) 분석시 출발물질이 전혀 남아있지 않을 때까지 TFAA를 20ul 분취량으로 첨가하였다. 반응은 한 시간 동안 진행되었다. 이 시점에서, 두 개의 밴드가 박막크로마토그래피에 의해 발견되었으며, 양자 모두 출발물질보다 더 높은 이동성을 시현하였다. NH4OH와 물에 의한 반응의 워크업(workup)은 생성물을 단일 밴드로 감소시켰다. 실리카 크로마토그래피(93:7 클로로포름/메탄올)는 293mg(0.515mmol)의 생성물 N-TFA-Pur을 생성하였다. 이 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 도시되어 있다.
N-트리플루오로아세틸 5'-DMT 퓨로마이신의 합성. 상기 반응으로부터의 생성물을 분취한 다음, 물을 제거하기 위해 건조 피리딘과 함께 2회 증발시켰다. 여러가지 반응 조건을 시험하기 위해 여러 개의 시험관을 준비하였다. 소규모 반응(small scale reaction)시에는, 27.4mg(48.2umole) N-TFA-Pur을 0.05 당량 DMAP와 1.4 당량 TEA를 함유하는 480ul 피리딘에 용해시켰다. 이 혼합물에, 20.6mg 디메톡시 트리틸 클로라이드(60umol)를 첨가하고, 교반하면서 반응이 완결되도록 하였다. 용액에 동일 부피의 물(약 500ul)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이 반응이 성공적인 것으로 보였기 때문에, 대규모 버전(large scale version)을 수행하였다. 상세하게는, 262mg(0.467mmole) N-TFA-Pur을 2.4ml 피리딘에 용해시킨 다음, 1.4 당량의 TEA, 0.05 당량의 DMAP 및 1.2 당량의 디메톡시 트리틸 클로라이드(Sigma)를 첨가하였다. 약 2시간 후에, 50mg(0.3 당량) 디메톡시트리틸·Cl(DMT·Cl)을 더 첨가한 다음, 반응이 20분간 더 진행되도록 하였다. 3ml의 물을 첨가하여 반응을 종료시키고, CH3CN과 함께 3회 증발시켰다. 반응액을 100ml 실리카(건조) 2mm 지름 컬럼 상에서 95:5 클로로포름/메탄올로 정제하였다. 불완전한 정제 때문에, 동일한 두 번째 컬럼 상에서의 정제가 97.5:2.5 클로로포름/메탄올을 사용하여 수행되었다. 총수율은 325mg, 즉 0.373mmol(또는 72% 수율)이었다. 이 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 도시되어 있다.
N-트리플루오로아세틸, 5'-DMT, 2'-숙시닐 퓨로마이신의 합성. 소규모 반응시에는, 상기와 같이 합성된 생성물 32mg(37umol)을 350ul 피리딘에 용해된 1.2 당량의 DMAP와 합하였다. 이 용액에, 44ul 건조 CH3CN 내의 숙시닉 안하이드라이드 1.2 당량을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 박막크로마토그래피 결과, 소량의 출발물질이 남아있음이 밝혀졌다. 대규모 반응시에는, 이전의 생성물 292mg(336umol)을 3ml 피리딘 내의 1.2 당량 DMAP와 합하였다. 여기에, 건조 CH3CN 내의 1M 숙시닉 안하이드라이드(Fluka) 403ul를 첨가하고, 그 혼합물을 밤새 교반하였다. 박막크로마토그래피 결과, 역시 소량의 출발물질이 남아있음이 확인되었다. 두 반응액을 취합한 다음, 추가적인 0.2 당량의 DMAP와 숙시네이트를 첨가하였다. 생성물을 톨루엔과 함께 1회 증발시키고, 고진공에서 노란색 거품이 될 때까지 건조시켰다. CH2Cl2(20ml)를 첨가하고, 이 용액을 차가운 10% 시트르산 15ml로 2회 추출한 후, 순수한 물로 2회 추출하였다. 생성물을 건조시키고, CH2Cl2 2ml에 재용해시킨 다음, 교반하면서 50ml 핵산을 첨가하여 침전시켰다. 이어서, 생성물을 볼텍싱(vortexing)한 다음, 임상 원심분리기(clinical centrifuge)에서 10분 동안 600rpm으로 원심분리하였다. 용출액의 대부분을 따라버리고, 나머지 생성물을 데시케이터(dessicator) 내에서 처음에는 저진공에서, 그리고 다음에는 고진공에서 건조시켰다. 이 반응의 수율은 약 260umol이었으며, 단계별 수율을 약 70%이었다.
N-트리플루오로아세틸, 5'-DMT, 2'-숙시닐, CPG 퓨로마이신의 합성. 전단계에서의 생성물을 1ml 디옥산(Fluka)으로 용해시킨 후, 0.2ml 디옥산/0.2ml 피리딘을 첨가하였다. 이 용액에, 40mg p-니트로페놀(Fluka) 및 140mg 디사이클로헥실카보디이미드(DCC; Sigma)를 첨가한 다음, 반응이 2시간 동안 진행되도록 하였다. 상기 반응에 의해 생성된 불용성 사이클로헥실 우레아를 원심분리로 제거한 다음, 생성물 용액을 22ml 건조 DMF 내에 현탁된 5g의 아미노헥실-조절 포어 글래스(aminohexyl controlled pore glass: CPG)에 첨가하고 밤새 교반시켰다. 그런 다음, 수지를 DMF, 메탄올, 및 에테르로 세정하고 건조시켰다. 결과되는 수지 는 g당 22.6umol 트리틸을 함유하고 있는 것으로 분석되었으며, 이는 이러한 타입의 지지체에 대해 허용가능한 범위내에 드는 것이다. 이어서, 지지체를 15ml 피리딘, 1ml 아세틱 안하이드라이드 및 60mg DMAP와 함께 30분 동안 인큐베이션하여 캡을 씌웠다. 결과되는 컬럼 물질은 닌히드린 테스트(ninhydrin test)에서 음성(무색) 결과를 시현하였으며, 이러한 결과는 상기 물질이 암청색 비색반응을 보였던 차단 이전의 결과와는 대조되는 것이다. 이 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 도시되어 있다. 대안으로, 퓨로마이신-CPG를 상업적으로(Trilink) 구입할 수도 있다.
mRNA-퓨로마이신 접합체의 합성. 상술한 바와 같이, 퓨로마이신이 부착된 올리고(puromycin tethered oligo)가 해독 주형으로 작용하는 mRNA-퓨로마이신 접합체를 생산하기 위한 두 가지 방법중 하나에 사용될 수 있다. 극히 짧은 오픈 리딩 프레임의 경우, 퓨로마이신 올리고는 전형적으로 RNA 또는 DNA 모노머와 함께 화학적으로 신장되어 전적으로 합성인(totally synthetic) 주형을 생산한다. 보다 긴 오픈 리딩 프레임을 원하는 경우에는, 일반적으로 RNA 또는 DNA 올리고가 무어 및 샤프의 문헌(Moore and Sharp, Science 256:992 (1992))에 기술된 바와 같이 DNA 스플린트와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 mRNA의 3' 말단에 리게이션된다.
시험관내 해독 및 RNA-단백질 융합체의 시험
상기에서 생산된 주형을 다음과 같이 박테리아 및 진핵생물 시험관내 해독 시스템을 사용하여 시험관내에서 해독하였다.
최소 주형의 시험관내 해독. 43-P 및 관련 RNA-퓨로마이신 접합체를 다음을 포함하는 몇몇 상이한 시험관내 해독 시스템에 첨가하였다: (i) 엘만 등(Methods Enzymol. 202:301 (1991))에 의해 기술된 바와 같이 제조된, 이. 콜라이 MTE600으로부터 유래된 S30 시스템(Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen and Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, In Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; 및 Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)); (ii) 쿠들리키 등(Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389 (1992))에 의해 기술된 바와 같이 제조된, 동일한 균주로부터 유래된 리보솜 분획; 및 (iii) 레슬리 등(Leseley et al., J. Biol. Chem. 266:2632 (1991))에 의해 기술된 바와 같이 제조된, 이. 콜라이 BL21로부터 유래된 S30 시스템. 각 경우에, 사용된 프리믹스(premix)는 레슬리 등(Leseley et al., J. Biol. Chem. 266:2632 (1991))의 것이었으며, 인큐베이션 시간은 30분 이었다.
융합체의 특성 시험. 우선, 이. 콜라이로부터의 S30 해독 추출물을 사용하여 43-P 주형을 시험하였다. 도 5(반응 "A")는 43-P가 리보솜에 결합하여 fMet에 대한 주형 및 fMet의 수용체로 동시에 작용하는 분자내(cis) 반응을 입증한다. 35S-메티오닌의 삽입 및 그의 주형내 위치를 우선 시험하였으며, 그 결과가 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있다. 시험관내 해독 반응혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 그 생성물을 SDS-PAGE로 분석하자, 35S-표지된 밴드가 43-P 주형과 동일한 이동성(mobility)으로 나타났다. 이 물질의 합성량은 Mg2+ 농도 의존적이었다(도 6a). 최적의 Mg2+ 농도는 9 내지 18mM인 것으로 나타났는데, 이것은 이러한 시스템에서의 해독을 위한 최적치와 유사하였다(Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen and Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 170-209; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991); Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389 (1992); 및 Leseley et al., J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). 또한, 삽입된 표지는 NH4OH 처리에 안정하였으며(도 6b), 따라서 그 표지가 분자의 3' 절반(염기-안정성(base-stable) DNA 부위)쪽에 위치하며, 퓨로마이신과 fMet 간의 아마이드 결합에 대해 예측되는 바와 같이 염기-안정성 결합에 의해 부착되어 있음을 암시하였다.
리보솜 및 주형 의존성. 상기에서 관찰된 반응이 리보솜 상에서 일어남을 입증하기 위해, 리보솜의 펩티드 트랜스페라제 기능의 특이적 저해제의 효과를 시험하였으며(도 6c), 메티오닌 코드화 서열 변화의 효과를 시험하였다(도 6d). 도 6c는 상기 반응이 펩티드 트랜스페라제 저해제인 버지니아마이신(virginiamycin), 고우게로틴(gougerotin) 및 클로람페니콜(Monro and Vazquez, J. Mol. Biol. 28:161-165 (1967); 및 Vazquez and Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173 (1967))에 의해 강력하게 저해됨을 명확하게 입증하였다. 도 6d는 주 형내의 단일 염기를 A에서 C로 변화시키는 것이 9mM Mg2+ 농도에서 35S-메티오닌 삽입을 파괴하며, 18mM에서는 35S-메티오닌 삽입을 크게 감소시킴을 보여준다(고농도의 Mg2+가 메시지의 미스리딩을 허용한다는 사실과 일치함). 이러한 실험들은 반응이 리보솜 상에서 주형 의존적 방식으로 일어남을 입증하였다.
링커 길이. 또한, 반응의 링커 길이에 대한 의존성이 시험되었다(도 6e). 원래 주형은 링커가 디코드화 부위(주형의 AUG 코돈에 의해 점유된)로부터 수용체 부위(퓨로마이신에 의해 점유된)까지의 거리에 걸치도록 고안되었는데, 상기 거리는 tRNA의 안티코돈 루프와 수용체 스템(stem) 사이의 거리와 대략 동일한 길이이거나 또는 약 60-70Å이다. 염기당 최소 3.4Å의 거리에 근거할 때, 시험된 첫 번째 링커는 길이가 30 뉴클레오티드(≥ 102Å)이었다. 30 내지 21 뉴클레오티드(n=27-18; 길이 ≥ 102 - 71Å) 사이의 범위에서, 반응효율의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 따라서, 링커 길이는 다변할 수 있다. 21 내지 30 뉴클레오티드 사이의 링커가 바람직한 길이를 대표하긴 하나, 80 뉴클레오티드 보다 짧은 링커, 바람직하게는 45 뉴클레오티드 보다 짧은 링커도 본 발명에 사용될 수 있다.
분자내 대 분자간 반응. 최종적으로, 본 발명자들은 반응이 원했던 바와 같이 분자내 방식으로 일어나는지 또는 분자간 방식으로 일어나는지(도 5, 반응 "B") 여부를 시험하였다. 이것은 3' 퓨로마이신만을 가지고 있고 리보솜 결합서열을 가지고 있지 않은 올리고뉴클레오티드(즉, 주형 25-P, 13-P 및 30-P)를 43-P 주형을 함유한 해독 반응액에 첨가함으로써 시험되었다(도 6f, 6g, 및 6h). 만일 반응이 분자간 방식으로 일어났다면, 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 표지될 것이다. 도 6f-6h에서 입증된 바와 같이, 세 개의 더 짧은 올리고들 내로는 35S-메티오닌이 거의 삽입되지 않았으며, 이는 반응이 주로 분자내 방식으로 일어났음을 암시한다. 25-P(서열 10), 13-P(서열 9) 및 30-P(서열 8)가 하기에 도시된다.
망상적혈구 용해질. 도 6h는 35S-메티오닌이, 상기에서 사용된 이. 콜라이 용해질 이외에, 시험관내 해독용 토끼 망상적혈구 용해질(하기 참조)을 사용하여 43-P 주형내에 삽입될 수 있음을 입증한다. 이러한 반응은 원했던 바와 같이 주로 세포내 메카니즘으로 일어났다.
c-myc 에피톱 태그를 함유한 융합체의 합성 및 시험
단백질 부분내에 c-myc 단클론 항체 9E10에 대한 에피톱 태그(Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610 (1985))를 포함하는 예시적인 융합체 또한 생산되었다.
주형 고안. 세개의 초기 에피톱 태그 주형(즉, LP77, LP154 및 Pool #1)을 설계하였으며, 도 7a-c에 도시하였다. 처음 두 개의 주형은 c-myc 에피톱 태그 서열 EQKLISEDL(서열 2)을 포함하였으며, 세 번째 주형은 랜덤 선별 풀의 합성에 사용된 디자인이다. LP77은 12 아미노산 서열을 코드화하였는데, 코돈은 박테리아 해독에 최적화되어 있었다. LP154 및 그의 유도체는 코돈이 진핵생물 해독에 최적화된, 33 아미노산 mRNA 서열을 포함한다. 코드화된 아미노산 서열 MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA(서열 7)은 9E10 항체 분리에 사용되었던 원래 의 펩티드에 해당한다. 풀 #1은 myc 펩티드의 마지막 7 아미노산(myc 에피톱 서열의 일부가 아닌)에 해당하는 서열이 뒤따르는 NNG/C의 27 코돈(랜덤 펩티드를 생산하기 위한)을 포함한다. 이들 서열은 하기에 도시된다.
망상적혈구 대 밀 배아 시험관내 해독 시스템. 43-P, LP77 및 LP154 주형이 토끼 망상적혈구 및 밀 배아 추출물(Promega, Boehringer Mannheim) 해독 시스템 내에서 시험되었다(도 8). 해독은 30℃에서 60분 동안 수행되었다. 주형을 dT25 아가로오스를 사용하여 4℃에서 분리하였다. 주형을 15mM NaOH, 1mM EDTA를 사용하여 아가로오스로부터 용출하고, NaOAc/HOAc 버퍼로 중화시킨 다음, 즉각 에탄올침전시키고(2.5-3 부피), 세정(100% 에탄올로)한 후, 스피드백(speedvac) 농축기에서 건조시켰다. 도 8은 35S-메티오닌이 밀 배아 및 망상적혈구 시스템 양자에서 세 개의 모든 주형내로 삽입되었음을 보여준다. 주형의 보다 적은 분해가 망상적혈구 시스템으로부터의 융합 반응에서 관찰되었으며, 따라서 이 시스템이 RNA-단백질 융합체 형성에 더 바람직하다. 또한, 일반적으로, 진핵생물 시스템이 박테리아 시스템 보다 더 바람직하다. 진핵생물 세포가 더 낮은 수준의 뉴클레아제를 함유하는 경향이 있기 때문에, mRNA의 수명이 박테리아 세포에서 보다 이러한 세포 내에서 일반적으로 10-100배 더 길다. 하나의 특정한 이. 콜라이 해독 시스템을 사용한 실험에서, c-myc 에피톱을 사용한 경우 융합체의 형성이 관찰되지 않았다; 다양한 위치에서의 주형의 표지는 이러한 관찰이 아마도 주형의 RNA 및 DNA 부분 양자의 분해에 기인함을 제시하였다.
이들 융합체의 펩티드 부분을 조사하기 위해, 시료들을 RNase로 처리하여 코드화 서열을 제거하였다. 이러한 처리 이후에, 43-P 생성물은 32P-표지된 30-P 올리고와 거의 동일한 이동성으로 주행하였으며, 이는 30-P에 부가된 매우 작은 펩티드(아마도 유일하게 메티오닌)와 일치하는 것이다. LP77의 경우, 코드화 서열의 제거는 30-P 올리고 보다 더 낮은 이동성을 가진 생성물을 생성하였는데, 이는 12 아미노산 펩티드가 퓨로마이신에 부가되었다는 생각과 일치하는 것이다. 마지막으로, LP154의 경우, 코드화 서열의 제거는 훨씬 더 낮은 이동성을 가진 생성물을 생성하였는데, 이는 30-P 올리고에 부가된 33 아미노산 서열과 일치하는 것이다. RNase로 처리된 P154 망상적혈구 레인에서는 로딩 실수 때문에 아무런 올리고도 관찰되지 않았다. 도 9에서, 이러한 생성물의 이동성은 밀 배아 추출물에서 생성된 생성물과 동일한 것으로 도시되어 있다. 요컨대, 이러한 결과들은 RNase-내성 생성물이 30-P 올리고의 말단에 부가되었으며, 생성물의 크기가 코드화 서열의 길이에 비례하고, 생성물이 크기 면에서 상당히 균일함을 암시하였다. 또한, 두 시스템이 유사한 융합 생성물을 생산하였을 지라도, 망상적혈구 시스템이 더 높은 주형 안정성 때문에 더 우수한 것으로 나타났다.
RNase 및 프로테인아제 K에 대한 감수성. 도 9에서, RNase A 및 프로테인아제 K에 대한 감수성을 LP154 융합체를 사용하여 시험하였다. 레인 2-4에 도시된 바와 같이, LP 154 주형에 대해 35S-메티오닌의 삽입이 입증되었다. 이 생성물이 RNase A로 처리되었을 때, 융합체의 이동성이 감소하였으나, 여전히 32P로 표지된 30-P 올리고뉴클레오티드 보다는 훨씬 더 높았으며, 이는 3' 말단에의 33 아미노산 부가와 일치하는 것이다. 이 물질이 또한 프로테인아제 K로 처리되었을 때, 35S 신호가 완전히 사라졌으며, 이는 상기 표지가 30-P 단편 3' 말단의 펩티드 내에 존재한다는 생각과 일치하는 것이다. 유사한 결과가 43-P 및 LP77을 사용한 동등한 실험에서 얻어졌다.
35S-Met에 의한 주형 표지가 해독의 결과이며, 보다 구체적으로는 리보솜의 펩티드 트랜스페라제 활성으로부터 초래되었음을 확인하기 위해, 표지 반응에 대한 다양한 저해제의 효과를 조사하였다. 진핵생물 펩티드 트랜스페라제의 특이적 저해제인 안이소마이신(anisomycin), 고우게로틴(gougerotin), 및 스파르소마이신(sparsomycin)(Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), p. 312 (1979))은 물론, 전좌(translocation) 저해제인 사이클로헥시마이드(cycloheximide) 및 에메타인(emetine)(Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), p. 312 (1979)) 모두 긴 myc 주형 및 망상 적혈구 해독 시스템을 사용한 RNA-펩티드 융합체 형성을 ~95% 감소시켰다.
면역침강 실험. mRNA-펩티드 융합체의 면역침강 효율을 예증하기 위해 고안된 실험에서, 시험관내 해독에 의해 생성된 유리 c-myc 펩티드를 면역침강시키기 위한 시도가 이루어졌다. 도 10은 SDS PAGE 펩티드 겔 상에서 분석된 이들 실험의 결과를 도시한 것이다.
레인 1 및 2는 RNA124(LP154의 RNA 부분) 또는 β-글로빈 mRNA를 함유하는 해독 반응으로부터 유래된 표지된 물질을 보여준다. 레인 3-8은 몇가지 상이한 버퍼 조건(하기에 기술됨)하에서 c-myc 단클론 항체를 사용한 이들 반응 시료의 면역침강을 보여준다. 레인 3-5는 RNA124로부터 유래된 펩티드가 효과적으로 면역침강되었으며, 전체 TCA 침강가능 카운트(TCA precipitable counts)의 ~83%가 분리된 레인 4가 가장 우수한 경우였다. 레인 6-8은 β-글로빈 단백질을 거의 보이지 않았는데, 이는 100배 이상의 정제를 암시하는 것이다. 이러한 결과들은 RNA124(및 LP154)에 의해 코드화되는 펩티드가 이러한 면역침강 프로토콜에 의해 정량적으로 분리될 수 있음을 암시하였다.
융합체 면역침강. 다음으로, 본 발명자들은 LP154 해독 반응 및 c-myc 단클론 항체 9E10을 사용하여 키메라 RNA-펩티드 생성물을 면역침강시키는 능력을 시험하였다(도 11). 망상적혈구 반응으로부터의 해독 생성물을 면역침강(본원에 기술된 바와 같은)으로 분리한 다음, RNase A 1ug으로 실온에서 30분 동안 처리하여 코드화 서열을 제거하였다. 이는 5'OH를 생성하였으며, 상기 5'OH를 T4 폴리뉴클레오티드키나아제로 32P-표지하여 변성 PAGE로 분석하였다. 도 11은 LP154의 RNase 처리에 의해 생성된 30-P와 c-myc 에피톱 간의 융합체(상기 참조)와 유사한 이동성을 가진 생성물이 분리되었으나, 주형의 RNA 부분(RNA124)만이 해독된 경우에는 아무런 해당 생성물이 생성되지 않았음을 입증하였다. 도 12에서, 분리된 융합단백질의 양을 결정하여 변형되지 않은 30-P의 양(본 도면에는 도시하지 않음)에 대하 여 도시하였다. 변형되지 않은 링커와 링커-myc 펩티드 융합체의 비율 정량은 입력 메시지의 0.2-0.7%가 융합 생성물로 전환되었음을 보여주었다. 리보솜/주형의 비율이 높을 수록 입력 RNA의 보다 높은 분율이 융합 생성물로 전환되었다: 시험된 입력 mRNA 농도 범위에 걸쳐, 해독 추출물 1ml당 약 0.8-1.0x1012 융합체 분자들이 생성되었다.
또한, 본 발명자들의 결과는 RNA종에 결합된 펩티드들이 그 mRNA에 의해 코드화되었음을, 즉 신생 펩티드가 다른 mRNA의 퓨로마이신으로 전달되지 않았음을 암시하였다. 해독 추출물 내에서 링커(30-P)와 긴 myc 주형을 20:1의 높은 비율로 함께 인큐베이션하였을 때 교차-전달(cross-transfer)이 일어났음을 보여주는 아무런 징후도 관찰되지 않았으며, 유리 링커의 존재가 긴 myc 융합체의 생산량을 심각하게 감소시키지도 않았다. 이와 마찬가지로, 짧은 주형과 긴 주형, 즉 43-P와 LP154의 동시해독(co-translation)은 주형이 단독으로 해독되었을 때 나타나는 융합 생성물만을 생산하였으며, 짧은 주형과 긴 myc 펩티드 간의 융합체에 대해 기대되는 중간 이동성을 가진 생성물은 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 결과 양자는 모두 융합체 형성이 주로 신생 펩티드와 동일한 리보솜에 결합된 mRNA 사이에 발생함을 제시하였다.
연속적인 분리. 시험관내 해독된 LP154 주형 생성물의 특성을 좀더 확인하고자, 본 발명자들은 이 생성물의 행동을 두 가지 상이한 유형의 크로마토그래피 미디어 상에서 조사하였다. 티오프로필(TP) 세파로오스는 유리 시스테인을 함유한 생성물(예를 들면, C 말단에 인접한 시스테인 잔기를 가진 LP154 생성물)의 분리를 허용한다(도 13). 유사하게, dT25 아가로오스는 폴리 dA 서열을 포함하는 주형(예를 들면, 30-P)의 분리를 허용한다(도 13). 도 14는 TP 세파로오스와 dT25 아가로오스 상에서의 연속적인 분리가 dT25 아가로오스 단독 상에서의 분리와 동일한 생성물을 생성함을 보여준다. 시험관내 해독 생성물이 폴리-A 관(tract)과 유리 티올 양자를 모두 함유하고 있다는 사실은 해독 생성물이 원하는 RNA-펩티드 융합체임을 강력하게 암시하였다.
상기 결과는 mRNA-펩티드 융합체를 합성하고 그들을 시험관내 해독 추출물로부터 완전한 형태로 회수하는 능력과 일치한다. 그렇게 합성된 융합체의 펩티드 부분은, 면역침강 및 적절한 크로마토그래피 기술을 사용한 분리에 의해 입증된 바와 같이, 의도된 서열을 가지고 있는 것으로 보인다. 상기 결과에 따르면, 반응은 분자내 반응이며 주형 의존적 방식으로 일어난다. 마지막으로, 1% 이하의 주형 변형만으로도 본 시스템은 약 103개의 후보 복합체들에 기초한 선별을 촉진한다.
c-myc 에피톱 회수 선별. 추가적인 c-myc 에피톱을 선별하기 위해, 랜덤화된 영역(randomized region)을 포함하는 거대한 해독 주형 라이브러리(예를 들면, 1015 주형)가 생산되었다(도 7c 및 하기 참조). 이러한 라이브러리가 ~1012-1013
융합체를 생산하는데 사용되었으며, 상기 융합체들은 반복적인 시험관내 선별에서 c-myc-코드화 주형을 증대시키기 위해 항-c-myc 항체로 처리되었다(예를 들면, 면역 침강에 의해, 또는 컬럼 또는 다른 고형 지지체에 고정된 항체를 사용하여).
융합체 형성 모델. 특별한 이론에 집착하지 않고, 본 발명자들은 해독이 정상적으로 개시되고 신장이 오픈 리딩 프레임의 끝까지 진행되는 융합체 형성 메카니즘의 모델을 제안한다. 리보솜이 주형의 DNA 부분에 도달할 때, 해독이 멎는다. 이 시점에서, 복합체는 두 가지 운명으로 갈릴 수 있다: 신생 펩티드의 유리, 또는 주형의 3' 말단에 있는 퓨로마이신으로의 신생 펩티드의 전달. 상기 전달반응의 효율은 멈춰선 해독 복합체의 안정성 및 3'-퓨로마이신 잔기의 펩티드 트랜스페라제 센터의 A 부위로의 진입(entry)에 영향을 미치는 다수의 요인에 의해 조절되는 것 같다. 전달반응 후에, mRNA-펩티드 융합체는 공지의 방출인자(release factor)가 RNA와 펩티드 영역 사이의 안정한 아마이드 결합을 가수분해할 수 없기 때문에 아마도 리보솜과 결합된 채로 남아 있는다.
표준 신장 모델(Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46:1399 (1964)) 및 중간상태 모델(Moazed and Noller, Nature 342:142 (1980)) 양자는 퓨로마이신이 펩티드 트랜스페라제 센터 내로 들어갈 수 있도록 A 부위가 비어있을 것을 요구한다. 퓨로마이신이 빈 A 부위로 들어가기 위해서는, 링커가 리보솜 외부 주위로 루프를 형성하거나 또는 A 부위를 통해 디코드화 부위로부터 펩티드 트랜스페라제 센터까지 직접 관통해야 한다. 본원에 기술된 데이터는, 시험된 가장 짧은 링커(21nts) 조차도 리보솜의 외부 둘레를 지나기에 충분히 길기 때문에, 이들 양자(alternatives)를 구분하지 못한다. 어떤 리보솜 구조 모델(Frank et al., Nature 376:441 (1995))에서, mRNA는 디코드화 부위의 어느 한면 위에 나있는 채널 을 통해 지나가는데, 이러한 경우 퓨로마이신이 A 부위를 통해 펩티드 트랜스페라제 센터에 도달하는 것을 허용하기 위해 링커가 채널로부터 빠져나오는 것(unthreading)이 요구된다.
신생 펩티드의 퓨로마이신에의 전달은, 링커에 결합된 펩티드의 균일성(homogeneity) 및 길이에 의해 입증된 바와 같이, 신장 과정에 비해 느린 것으로 보인다. 만일 퓨로마이신이 신장 동안에 아미노아실 tRNA와 효과적으로 경쟁한다면, 융합 생성물내에 존재하는 링커-펩티드 융합체는 크기 면에서 불균일할 것으로 예상된다. 또한, Met-주형 융합체와 변형되지 않은 링커 사이의 겔 이동성의 유사성에 의해 암시된 바와 같이, 리보솜은 링커 영역을 해석하는 것으로 보이지 않는다. dA3n은 분명히 링커의 이동성을 감소시킬 (라이신)n을 코드화해야 한다. mRNA의 빠져나옴(unthreading)의 느린 속도가 전좌(translocation) 속도에 비해 융합체 형성 속도가 느린 이유를 설명해줄 수 있을 것이다. 예비 결과는 아마도 신생 펩티드를 퓨로마이신에 전달할 수 있는 시간이 증가하기 때문에 저온에서의 해독후 인큐베이션(post-translational incubation)을 연장함으로써 형성되는 융합 생성물의 양이 현저히 증가함을 제시한다.
상세한 재료 및 방법
시험관내 해독 및 myc 에피톱 태그를 가진 융합체를 포함한 RNA-단백질 융합체의 시험과 관련된 상세한 재료 및 방법을 후술한다.
서열. 다수의 올리고뉴클레오티드가 상기 RNA-단백질 융합체 생성에 사용되었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 갖는다.
모든 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있다. 리보뉴클레오티드 염기는 뉴클레오티드 명칭 앞에 소문자 "r"로 표시되어 있다; P는 퓨로마이신이다; rN은 동량의 rA, rG, rC 및 rU를 표시한다; rS는 동량의 rG 및 rC를 표시한다; 나머지 다른 명칭들은 DNA 올리고뉴클레오티드를 표시한다.
화학물질. 퓨로마이신·HCl, 장쇄 알킬아민-조절 포어 글래스(long chain alkylamine controlled pore glass), 고우게로틴, 클로람페니콜, 버지니아마이신, DMAP, 디메틸트리틸 클로라이드, 및 아세틱 안하이드라이드는 Sigma Chemical(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 피리딘, 디메틸포름아마이드, 톨루엔, 숙시닉 안하이드라이드, 및 파라-니트로페놀은 Fluka Chemical(Ronkonkoma, NY)로부터 구입하였다. 베타-글로빈 mRNA는 노바젠(Madison, WI)으로부터 구입하였다. TMV RNA는 베링거 만하임(Indianapolis, IN)으로부터 구입하였다.
효소. 프로테인아제 K는 프로메가(Madison, WI)로부터 구입하였다. DNase-free RNase는 샘브룩 등(Sambrook et al., supra)의 프로토콜에 의해 제조되거나 또는 Boehringer Mannheim(Indianapolis, IN)으로부터 구입하였다. T7 폴리메라제는 자와즈키 및 그로스(Zawadzki and Gross, Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991))의 변형이 가미된 그로드버그 및 듄(Grodberg and Dunn, J. Bacteriol. 170:1245 (1988))의 간행된 프로토콜에 따라 제조되었다. T4 DNA 리가아제는 New England Biolabs(Beverly, MA)로부터 구입하였다.
방사성표지 삽입(incorporation)의 정량. 방사능 겔 밴드의 경우, 각 밴드 에 존재하는 방사성표지(35S 또는 32P)의 양은 Betagen 603 blot analyzer(Betagen, Waltham, MA) 상에서 또는 포스포이메이저(phosphorimager) 플레이트(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 정량되었다. 액체 및 고체 시료의 경우, 존재하는 방사성표지(35S 또는 32P)의 양은 액체섬광계수기(Beckman, Columbia, MD)를 사용하여 측정되었다.
겔 이미지. 겔 이미지는 방사성자동사진술(autoradiography, Kodak XAR 필름을 사용한) 또는 포스포이메이저 플레이트(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 얻었다.
CPG 퓨로마이신의 합성. 자세한 CPG-퓨로마이신 합성 프로토콜은 상술하였다.
효소 반응. 일반적으로, 키나아제, 전사, PCR, 및 이. 콜라이 추출물을 사용한 해독 반응에 사용되는 핵산의 조제는 동일하였다. 각 조제 프로토콜은 동일부피의 1:1 페놀/클로로포름을 사용한 추출로 시작되어, 원심분리 및 수성층의 분리가 뒤따랐다. 아세트산 나트륨(pH 5.2) 및 스퍼미딘(spermidine)을 각각 300mM 및 1mM의 최종 농도로 첨가한 다음, 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 -70℃에서 20분간 인큐베이션하여 시료를 침전시켰다. 시료를 >12,000g에서 원심분리한 다음, 상청액을 제거하고, 펠렛을 과량의 95% 에탄올로 세정하였다. 이어서, 결과되는 펠렛을 진공하에서 건조시키고 재현탁하였다.
올리고뉴클레오티드. 모든 합성 DNA 및 RNA는 각각에 대하여 제조자(Milligen, Bedford, MA)에 의해 제공된 표준화학을 사용하여 Millipore Expedite 합성기 상에서 합성되었다. 3' 퓨로마이신을 함유한 올리고뉴클레오티드는 30-50mg의 고형 지지체(~20umole 퓨로마이신/g)가 채워진 CPG 퓨로마이신 컬럼을 사용하여 합성되었다. 3' 비오틴을 함유한 올리고뉴클레오티드는 Glen Research(Sterling, VA)의 1umole Bioteg CPG 컬럼을 사용하여 합성되었다. 5' 비오틴을 함유한 올리고뉴클레오티드는 5' 염기로서 Bioteg 포스포르아미다이트를 첨가함으로써 합성되었다. RNA 분자의 3' 말단에 리게이션될 올리고뉴클레오티드는 탈보호(deprotection) 이전에 5' 말단에 화학적으로 인산화되거나(Glen Research의 화학적 인산화 시약을 사용하여), 또는 탈보호 이후에 ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(New England Biolabs)를 사용하여 효소적으로 인산화되었다. 오로지 DNA(및 3' 퓨로마이신 또는 3' 비오틴)만을 함유하는 시료는 25% NH4OH를 첨가한 다음 55℃에서 12시간 동안 인큐베이션함으로써 탈보호되었다. RNA 모노머(예를 들면, 43-P)를 함유하는 시료는 NH4OH 용액에 에탄올(25%(v/v))을 첨가한 다음 55℃에서 12시간 동안 인큐베이션함으로써 탈보호되었다. 2'OH는 THF 내의 1M TBAF를 사용하여 실온에서 48시간 동안 탈보호되었다. TBAF는 NAP-25 Sephadex 컬럼(Pharmacia, Piscataway, NJ)을 사용하여 제거되었다.
원하는 경우, 3' 수산기의 존재를 검사하기 위해, 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 방사성표지한 다음, 말단(terminal) 디옥시뉴클레오티드 트랜스페라제를 사용한 신장에 프라이머로 사 용할 수 있다. 퓨로마이신 내의 일차 아민의 존재는 NHS-LC-비오틴(Pierce)과 같은 아민 유도 시약(amie derivatizing reagent)과의 반응에 의해 분석될 수 있다. 30-P와 같은 올리고뉴클레오티드는 반응시 변성 PAGE에 의해 검출가능한 이동성 변화(mobility shift)를 시현함으로써, 상기 시약과의 정량적인 반응을 암시한다. 퓨로마이신이 결여된 올리고뉴클레오티드는 NHS-LC-비오틴과 반응하지 않으며, 이동성의 변화를 시현하지 않는다.
탈보호된 DNA 및 RNA 시료는 이어서 변성 PAGE를 수행한 다음, 침지(soaking)하거나 또는 Elutrap(Schleicher and schuell, Keene, NH)을 사용하여 겔로부터 전기용출(electro-eluting)하고, NAP-25 Sephadex 컬럼을 사용하여 탈염(desalting)하거나 또는 상술한 바와 같이 에탄올침전시켜 정제되었다.
Myc DNA 구성(construction). c-myc 에피톱 태그를 포함하는 두 개의 DNA 주형을 구성하였다. 첫 번째 주형은 올리고뉴클레오티드 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3')(서열 18) 및 18.109 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3')(서열 19)의 조합으로부터 생산되었다. 이 주형을 사용한 전사는 펩티드 MEQKLISEEDLN(서열 20)을 코드화하는 RNA 47.1을 생산하였다. RNA 47.1의 30-P에의 리게이션은 도 7a에 도시된 LP77을 생성하였다.
두 번째 주형은 우선 다음과 같은 서열의 길이가 99 염기인 RWR 99.6이라는 명칭의 단일 올리고뉴클레오티드로 제조되었다: 5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3' (서열 21). 이러한 서열을 포함하는 이중가닥 전사 주형은 간행된 프로토콜(Ausubel et al., supra, chapter 15)에 따라 올리고 RWR 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3')(서열 22) 및 RWR 63.26 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3')(서열 23)을 사용한 PCR에 의해 구성되었다. 이 주형을 사용한 전사는 펩티드 MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (서열 24)를 코드화하는 RNA124라는 명칭의 RNA를 생성하였다. 이 펩티드는 담체 단백질(Oncogene Science Technical Bulletin)에 접합(conjugation)시 단클론 항체 9E10을 유발하는데 사용된 서열을 포함하였다. RNA124는 124 뉴클레오티드 길이이며, RNA124의 30-P에의 리게이션이 도 7b에 도시되어 있다. RNA124의 서열은 다음과 같다(서열 32):
랜덤화된 풀 구성(construction). 랜덤화된 풀(randomized pool)을 RWR130.1이라 명명된 길이가 130 염기인 단일 올리고뉴클레오티드로서 구성하였다. 3' 말단에서부터 시작하여 그 서열은 다음과 같다: 3'-CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC (NNS)27 GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (서열 25). N은 임의의 위치를 나타내며, 이 서열은 표준 합성 프로토콜에 따라 제조되었다. S는 dG와 dC 염기의 동량 믹스를 나타낸다. PCR이 올리고뉴클레오티드 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA-3')(서열 26) 및 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (서열 27)을 사용하여 수행되었다. 이 주형의 전사는 풀 130.1이라 명명된 RNA를 생산하였다. 풀 130.1의 30-P에의 리게이션은 도 7c에 도시된 풀 #1(LP160이라고도 불리우는)을 생성하였다.
7회의 PCR 사이클이 다음과 같은 차이점을 제외하고는 간행된 프로토콜(Ausubel et al., supra)에 따라 수행되었다: (i) RWR 130.1의 출발농도는 30nmole이었고, (ii) 각 프라이머는 1.5uM의 농도로 사용되었으며, (iii) dNTP 농도는 각 염기마다 400uM이었고, (iv) Taq 폴리메라제(Boehringer Mannheim)가 100ul당 5 유닛으로 사용되었다. 이중가닥 생성물은 비변성 PAGE에 의해 정제후 전기용출에 의해 분리되었다. DNA 양은 공지의 가닥과 비교하여 260nm에서의 UV 흡광도와 에티디움 브로마이드 형광에 의해 측정되었다.
RNA의 효소적 합성. 이중가닥 PCR DNA 및 합성 올리고뉴클레오티드로부터의 전사반응이 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(Milligan and Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51 (1989)). 전장 RNA를 변성 PAGE에 의해 정제후 전기용출한 다음, 상술한 바와 같이 탈염시켰다. 풀(pool) RNA 농도는 1300 O.D/umole의 흡광도를; RNA 124 농도는 1250 O.D/umole의 흡광도를; 그리고 RNA 47.1 농도는 480 O.D/umole의 흡광도를 사용하여 각각 계산되었다. 이중가닥 풀 DNA로부터의 전사는 ~90nmole의 풀 RNA를 생성하였다.
RNA-퓨로마이신 접합체의 효소적 합성. myc 및 풀 mRNA 서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 퓨로마이신에의 리게이션이 19.35 (5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A-3')(서열 28)라 명명된 DNA 스플린트(splint)를 사용하여 무어 및 샤프(Moore and Sharp, Science 250:992 (1992))에 의해 기술된 것과 유사한 과정에 따라 수행되었다. 반응액은 mRNA, 스플린트, 및 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드(30-P, dA27dCdCP)를 0.8:0.9:1.0의 몰비로 함유하였으며, 풀 mRNA pmole 당 1-2.5 유닛의 DNA 리가아제를 포함하였다. 반응은 실온에서 1시간 동안 수행되었다. 풀 RNA 융합체 구성의 경우, mRNA 농도는 ~6.6umolar 이었다. 리게이션 후에, RNA-퓨로마이신 접합체가 상기에서 효소반응에 대해 기술한 바와 같이 제조되었다. 침강물을 재현탁하고, 전장 융합체를 변성 PAGE로 정제한 다음 상술한 바와 같이 전기용출로 분리하였다. 풀(pool) RNA 농도는 1650 O.D/umole의 흡광도를, 그리고 myc 주형 농도는 1600 O.D/umole의 흡광도를 사용하여 각각 계산되었다. 이러한 방식으로, 2.5nmole의 접합체가 생산되었다.
dT 25 스트렙트애비딘 아가로오스 제조. 3' 비오틴을 포함하는 dT25
(Bioteg 포스포이메이저 컬럼(Glen Research) 상에서 합성되고 NAP-25 컬럼(Pharmacia) 상에서 탈염된)를 1-10uM 또는 심지어는 1-20uM의 농도로 스트렙트애비딘 아가로오스(50%(v/v) 아가로오스, Pierce, Rockford, IL)와 함께 실온에서 1시간 동안 TE(10mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EDTA) 내에서 인큐베이션한 후, 세정하였다. 그런 다음, 아가로오스의 결합용량을 비오틴-dT25가 용액으로부터 사라지는 것에 의해 및/또는 수지를 알려진 양의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 적정함으로써 광학적으로 측정하였다.
이. 콜라이 유래의 추출물 및 리보솜을 사용한 해독 반응. 일반적으로, 해독 반응은 구입한 키트(예를 들면, E. coli S30 Extract for Linear Templates, Promega, Madison, WI)를 사용하여 수행되었다. 그러나, 이. 콜라이 MRE600(ATCC, Rockville, MD로부터 구입한)을 간행된 프로토콜(예를 들면, Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301 (1991))에 따른 S30 추출물 제조와 쿠들리키 등(Kudlicki et al., Anal. Biochem. 206:389 (1992))에 의해 기술된 바와 같은 리보솜 분획 제조에 사용하기도 하였다. 표준반응은 50ul 부피내에서 20-40uCi의 35S-메티오닌을 마커로 사용하여 수행되었다. 반응혼합물은 30%(v/v) 추출물, 9-18mM MgCl2, 40%(v/v) 프리믹스 마이너스 메티오닌(Promega), 및 5uM 주형(예를 들면, 43-P)을 함유하였다. 동시인큐베이션(coincubation) 실험의 경우, 올리고 13-P 및 25-P를 5uM의 농도로 첨가하였다. 리보솜을 사용한 실험의 경우, 용해질 대신에 반응당 3ul의 리보솜 용액 을 첨가하였다. 모든 반응은 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 되었다. 주형을 효소 반응하에서 상술한 바와 같이 정제하였다.
밀 배아 해독 반응. 도 8의 해독 반응은 메티오닌이 결여된 구입된 키트(Promega)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행되었다. 주형 농도는 43-P의 경우 4uM이었고, LP77 및 LP154의 경우 0.8uM이었다. 반응은 25℃에서 총 부피 25ul 내에 30uCi 35S-메티오닌을 가지고 수행되었다.
망상적혈구 해독 반응. 해독 반응은 구입된 키트(Novagen, Madison, WI)를 사용하여 또는 간행된 프로토콜(Jackson and Hunt, Meth. Enzymol. 96:50 (1983)) 에 따라 제조된 추출물을 사용하여 수행되었다. 망상적혈구가 풍부한 혈액(reticulocyte-rich blood)은 Pel-Freez Biologicals(Rogers, AK)로부터 구입되었다. 두 경우 모두, 반응조건은 Red Nova Lysate(Novagen)를 사용하는 경우에 권장되는 조건이었다. 반응액은 100mM KCl, 0.5mM MgOAc, 2mM DTT, 20mM HEPES pH 7.6, 8mM 크레아틴 포스페이트, 각 아미노산 25uM(단, 35S Met이 사용된 경우 메티오닌은 제외하고) 및 40%(v/v) 용해질을 함유하였다. 인큐베이션은 30℃에서 1시간 동안 수행되었다. 주형 농도는 실험마다 달랐으나, 43-P가 4uM 이었던 것을 제외하고는(도 6h) 일반적으로 50nM 내지 1uM이었다.
랜덤화된 풀을 생산하기 위해, 10ml의 해독 반응이 ~0.1uM(주형 1.25nmole)의 주형 농도에서 수행되었다. 또한, 정제 및 선별 과정의 각 단계에서 존재하는 물질을 정량하기 위해 32P-표지된 주형이 포함되었다. 30℃에서 1시간 동안 해독한 후, 반응액을 얼음 위에서 30-60분간 냉각시켰다.
dT 25 스트렙트애비딘 아가로오스 또는 올리고 dT 셀룰로오스를 사용한 융합체 분리. 인큐베이션 후에, 해독 반응액을 dT25 농도가 ~10uM인 10X 이상 몰수의 dT25-비오틴-스트렙트애비딘 아가로오스(용해질 부피와 동일하거나 더 큰 슬러리 부피) 또는 올리고 dT 셀룰로오스(Pharmacia)를 함유하는 분리 버퍼(1.0M NaCl, 0.1M Tris-Cl pH 8.2, 10mM EDTA, 및 1mM DTT 또는 0.2% Triton X-100)으로 약 150배 희석한 다음, 4℃에서 1시간 동안 교반(agitation)하면서 인큐베이션하였다. 이어 서, 여과(Millipore ultrafree MC filters) 또는 원심분리에 의해 혼합물로부터 아가로오스를 제거한 다음, 차가운 분리 버퍼로 2-4회 세정하였다. 그런 다음, 주형을 15mM NaOH, 1mM EDTA의 50-100ul 분취량으로 4℃에서 반복적으로 세정하거나 또는 순수한 물로 실온에서 반복적으로 세정하여 dT25 스트렙트애비딘 아가로오스로부터 분리하였다. 용출액을 즉시 3M NaOAc pH 5.2, 10mM 스퍼미딘으로 중화시킨 다음, 에탄올침전시키거나 또는 다음 정제 단계에 곧바로 사용하였다. 풀 반응의 경우, 회수된 총 방사능은 입력(input) 주형의 약 50-70%가 회수되었음을 암시하였다.
티오프로필 세파로오스를 사용한 융합체 분리. 시스테인을 함유하는 융합체는 도 13에서와 같이 티오프로필 세파로오스 6B(Pharmacia)를 사용하여 정제될 수 있다. 본원에 기술된 실험에서, 분리는 해독 반응액으로부터 직접 수행되거나 또는 융합체의 초기 분리(예를 들면, 스트렙트애비딘 아가로오스를 사용한) 이후에 수행되었다. 직접 정제된 시료의 경우, 용해질:세파로오스의 비율은 1:10(v/v)이었다. 풀의 경우, 세파로오스 슬러리 0.5ml이 5ml 반응혼합물로부터 모든 융합체를 분리하는데 사용되었다. 시료를 DNase free RNase(Boehringher Mannheim)를 함유하는 1X TE 8.2(10mM Tric-Cl, 1mM EDTA, pH 8.2) 내의 티오프로필 세파로오스 슬러리에 50:50(v/v)으로 희석한 후, 4℃에서 1-2시간 동안 회전시키면서 인큐베이션하여 반응이 완결되도록 하였다. 과량의 액체를 제거하고, 세파로오스를 20mM DTT를 함유하는 분리 버퍼로 반복적으로 세정한 다음, 원심분리 또는 여과에 의해 회수하였다. 융합체는 10mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EDTA 내의 25-30mM 디티오트레이톨(DTT) 용액을 사용하여 세파로오스로부터 용출되었다. 융합체는 이어서 고진공하 증발 및 상술한 바와 같은 에탄올침전에 의해 농축되었으며, 원하는 경우, SDS-Tricine-PAGE에 의해 분석되었다. 풀 반응의 경우, 회수된 총 방사능은 주형의 약 1%가 융합체로 전환되었음을 암시하였다.
어떤 응용예의 경우, dT25를 이 용출액에 첨가후 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 아가로오스를 차가운 분리 버퍼로 3회 세정후 여과에 의해 분리한 다음 결합된 물질을 상술한 바와 같이 용출하였다. 담체 tRNA를 첨가한 다음, 융합 생성물을 에탄올침전시켰다. 시료를 DNase free RNase를 함유한 TE pH 8.2 내에 재현탁하여 주형의 RNA 부분을 제거하였다.
면역침강 반응. 해독 반응액으로부터 펩티드의 면역침강(도 10)이 4ul 망상적혈구 해독 반응액, 2ul 정상 마우스 혈청, 및 20ul 프로테인 G+A 아가로오스(Calbiochem, La Jolla, CA)를 200ul PBS(58mM Na2HPO4, 17mM NaH2
PO4, 68mM NaCl), 희석 버퍼(10mM Tris-Cl pH 8.2, 140mM NaCl, 1% v/v Triton X-100) 또는 PBSTDS(PBS+1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS) 중의 하나와 혼합함으로써 수행되었다. 시료를 4℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 2500rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하여, 10ul c-myc 단클론 항체 9E10(Calbiochem, La Jolla, CA) 및 15ul 프로테인 G+A 아가로오스를 첨가한 다음, 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 시료를 PBS, 희석 버퍼 또는 PBSTDS 1ml 로 2회 세정하였다. 겔 로딩 버퍼 (Calbiochem Product Bulletin) 40ul를 상기 혼합물에 첨가한 다음, 20ul를 샤거 및 폰 야고브(Schagger and von Jagow, Anal. Biochem. 166:368 (1987))에 의해 기술된 바와 같은 변성 PAGE에 로딩하였다.
융합체 면역침강(도 11에 도시됨)은 8ul의 망상적혈구 해독 반응액을 300ul의 희석 버퍼(10mM Tris-Cl pH 8.2, 140mM NaCl, 1% v/v Triton X-100), 15ul 프로테인 G 세파로오스(Sigma) 및 10ul(1ug) c-myc 항체 9E10(Calbiochem)과 함께 혼합한 다음, 4℃에서 수시간 동안 교반함으로써 수행되었다. 분리 후에, 시료를 세정하고, DNase free RNase로 처리하고, 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 γ-32P ATP로 표지한 다음, 변성 우레아 PAGE로 분리하였다(도 11).
융합체 풀의 역전사. 역전사 반응은, 주형, 물 및 프라이머를 70℃에서 겨우 2분 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, SuperscriptII(Gibco BRL, Grand Island, NY)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행되었다. 신장을 모니터하기 위해, 50uCi α-32P dCTP가 일부 반응에 포함되었으며, 나머지 반응에서는 α-32P ATP(New England Nuclear, Boston, MA) 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 제조된 5'이 32P로 표지된 프라이머를 사용하여 역전사를 모니터하였다.
프로테인 G 및 항체 세파로오스 제조. 프로테인 G 세파로오스 슬러리(50%(v/v) 고체)(Sigma)의 50ul 분취량 2개를 희석 버퍼(10mM Tris-Cl pH 8.2, 140mM NaCl, 1% v/v Triton X-100)로 세정한 후 윈심분리로 분리하였다. 첫 번째 분취량은 선별 매트릭스 이전의 예비컬럼(precolumn)으로 사용하기 위해 보관하였다. 두 번째 분취량을 희석 버퍼에 현탁한 후, 40ug의 c-myc AB-1 단클론 항체(Oncogene Science)를 첨가하고, 4℃에서 밤새 교반하면서 인큐베이션하였다. 이어서, 항체 세파로오스를 마이크로원심분리기에서 1500-2500rpm으로 15분 동안 원심분리하여 정제하고, 희석 버퍼로 1-2회 세정하였다.
선별. 융합체 분리 및 상보적 가닥 합성 후에, 전체 역전사효소 반응액을 곧바로 선별 과정에 사용하였다. 두 가지 프로토콜이 여기에 기술된다. 1 라운드에서는, 역전사효소 반응액을 상술한 바와 같이 제조된 항체 세파로오스에 직접 가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 라운드에서는, 고정된 항체보다는 오히려 프로테인 G와 상호작용하는 결합체의 수를 줄이고자 항체 컬럼에 앞서 반응물을 프로테인 G 세파로오스와 함께 ~2시간 동안 인큐베이션하였다.
매트릭스로부터 풀을 용출하기 위해, 몇 가지 접근법이 채택되었다. 첫 번째는 선별 매트릭스를 4% 아세트산으로 세정하는 것이다. 이 과정은 펩티드를 매트릭스로부터 유리시킨다. 대안으로, 더 높은 스트린젠트 세정(예를 들면, 우레아 또는 다른 변성제를 사용하는)이 상기 아세트산 방법 대신에 또는 그에 더하여 사용될 수 있다.
선별 융합체의 PCR. 선별된 분자들을, 상기에서 풀 구성(construction)에 대해 기술한 바와 같이, 표준 프로토콜(예를 들면, Fitzwater and Polisky, Meth. Enzymol. 267:275 (1996); 및 Conrad et al., Meth. Enzymol. 267:336 (1996))을 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 단계에서 PCR 조절을 수행하는 것이, 증폭된 풀이 수행된 선별로부터 결과되는 것을 보장하는데 바람직할 수 있다. 프라이머 순도가 가장 중요하다. 풀 서열 또는 대조 컨스트럭트에 의한 오염이 발생할 수 있기 때문에, 프라이머 쌍은 입력 주형의 부재하에 증폭되어야 한다. 분리된 융합체는 또한 그들이 cDNA로 오염되지 않았음을 확인하기 위해 RT 단계 이전에 PCR에 적용되어야 한다. 마지막으로, 선별 이전 및 이후의 PCR 반응에 필요한 사이클(cycle) 수가 비교되어야 한다. 주어진 서열을 증폭하는데 필요한 사이클 수가 크다는 것(25-30회 이상의 PCR 반응)은 RT 반응의 실패 또는 프라이머 쌍의 결함을 암시한다.
β-글로빈 융합체의 합성 및 시험
β-글로빈 융합체 컨스트럭트를 합성하기 위해, 200pmole의 프라이머 18.155 (5'-GTG GTA TTT GTG AGC CAG-3')(서열 29) 및 Superscript 역전사효소(Gibco BRL)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 역전사를 수행하여 2.5ug 글로빈 mRNA로부터 β-글로빈 cDNA를 제조하였다. 프라이머 서열은 β-글로빈의 종결 코돈에 대해 5'인 18 뉴클레오티드에 상보적이었다. T7 프로모터를 부가하기 위해, 20ul의 역전사 반응액을 취하여 프라이머 18.155 및 40.54 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C-3')(서열 30)을 사용한 6 사이클의 PCR에 적용하였다. 이어서, 밀리간 및 울렌벡의 문헌(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51 (1989))에 따른 T7 런오프(runoff) 전사에 의해 "syn-β-글로빈" mRNA를 생산한 다음, RNA 겔 정제하고, 전기용출한 후, 본원에 기술된 바와 같이 탈염하였 다. 이어서, 무어 및 샤프(Moore and Sharp, Science 256:992(1992))의 방법에 따라 스플린트로서 프라이머 20.262(5'-TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G-3')(서열 31)를 사용하여 syn-β-글로빈 컨스트럭트를 30-P에 리게이션함으로써 "LP-β-글로빈"이 생성되었다. 리게이션 반응 생성물을 겔 정제하고, 전기용출한 후, 상기와 같이 탈염하였다. 최종 생성물의 농도는 260nm에서의 흡광도로 결정되었다.
이러한 β-글로빈 주형들은 이어서 표 1에 나타낸 바와 같이 각각 25ul의 총 부피로 시험관내 해독되었다. 모든 반응은 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었으며, -20℃에서 밤새 방치되었다. 그런 다음, dT25 침강가능 CPM(dT25 precipitable CPM)을 6ul 용해질을 사용하여 2회 측정한 후 배경값(background)을 빼고 평균내었다.
| 반응 | 주형 | Mg2+ (mM) | 35S Met (ul) | TCA CPM (2ul) | dT25 CPM (6ul) |
| 1 | --- | 1.0 | 2.0 (20 uCi) | 3312 | 0 |
| 2 | 2.5ug syn-β-글로빈 | 0.5 | 2.0 (20 uCi) | 33860 | 36 |
| 3 | 2.5ug syn-β-글로빈 | 1.0 | 2.0 (20 uCi) | 22470 | 82 |
| 4 | 2.5ug syn-β-글로빈 | 2.0 | 2.0 (20 uCi) | 15696 | 86 |
| 5 | 2.5ug LP-β-글로빈 | 0.5 | 2.0 (20 uCi) | 32712 | 218 |
| 6 | 2.5ug LP-β-글로빈 | 1.0 | 2.0 (20 uCi) | 24226 | 402 |
| 7 | 2.5ug LP-β-글로빈 | 2.0 | 2.0 (20 uCi) | 15074 | 270 |
겔 분석을 위한 시료를 준비하기 위해, 각 해독 반응액 6ul를 1000ul의 분리 버퍼(1.0M NaCl, 100mM Tris-Cl pH 8.2, 10mM EDTA, 및 0.1mM DTT), 1M RNase A(DNase free, Boehringer Mannheim) 및 20ul의 20uM dT25 스트렙트애비딘 아가로오스와 함께 혼합하였다. 시료를 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 과량의 분리 버퍼를 제거한 다음, 잔여 분리 버퍼를 제거하기 위해 시료를 Millipore MC 필터에 가하였다. 이어서, 시료를 50ul H2O로 4회 세정하고, 15mM NaOH 1mM EDTA 50ul로 2회 세정하였다. 시료(300ul)를 100ul의 TE pH 6.8(10mM Tris-Cl, 1mM EDTA)로 중화시키고, 1mg/ml RNase A(상기와 같은) 1ul를 첨가한 다음, 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 10ul의 2X SDS 로딩 버퍼(125mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 2% β-머캡토에탄올, 20% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)를 가하고, 시료를 동결건조시킨 후, 20ul H2O 및 1% β-머캡토에탄올에 재현탁하였다. 그런 다음, 시료를 샤거 및 폰 야고브(Schagger and von Jagow, Analytical Biochemistry 166:368 (1987))에 의해 개시된 바와 같은 펩티드 분석 겔(peptide resolving gel)에 로딩하고, 자동방사선사진술로 가시화하였다.
이들 실험의 결과가 도 15a 및 도 15b에 도시되어 있다. 도 15a에 나타난 바와 같이, 35S-메티오닌이 syn-β-글로빈 융합체 및 LP-β-글로빈 융합체의 단백질 부분에 삽입되었다. 단백질은 이종(heterogeneous)이었으나, 하나의 강력한 밴드가 β-글로빈 mRNA에 대해 예상되는 이동성을 시현하였다. 또한, 도 15b에 도시된 바와 같이, dT25 분리 및 RNaseA 처리 후에, syn-β-글로빈 레인에는 35S-표지된 물 질이 전혀 남아있지 않았다(도 15b, 레인 2-4). 이와 대조적으로, LP-β-글로빈 레인에서는, 균일한 크기를 가진 35S-표지된 생성물이 관찰되었다.
이러한 결과들은, 상술한 바와 같이, 주형이 3' 퓨로마이신을 함유한 경우에만 융합 생성물이 올리고뉴클레오티드 친화성 크로마토그래피에 의해 분리되었음을 암시한다. 이는 액체섬광계수(scintillation counting)에 의해 확인되었다(표 1). 수득된 물질은 β-글로빈의 일부에 융합된 30-P 링커를 함유하고 있는 것으로 추측된다. 융합 생성물은 겔 분석 결과 크기 면에서 상당히 균일한 것으로 나타났다. 그러나, 융합 생성물이 천연 β-글로빈(도 15a 및 도 15b, 대조 레인)과 매우 유사한 이동성을 시현하였기 때문에, 융합 생성물의 단백질 부분의 정확한 길이를 결정하는 것은 어려웠다.
RNA-단백질 융합체 형성의 추가적인 최적화
어떤 인자들이 RNA-펩티드 융합체 형성 효율을 더 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 융합체 형성, 즉 신생 펩티드 사슬의 그의 tRNA로부터 mRNA의 3' 말단에 있는 퓨로마이신 단위체로의 전달은, 신생 펩티드를 생산하는 초기의 상대적으로 신속한 오픈 리딩 프레임 해독에 뒤이은 느린 반응이다. 융합체 형성 정도는 증가된 Mg2+ 조건(바람직하게는, 50-100mM 범위의)에서의 해독후 인큐베이션에 의해, 및/또는 보다 유연한 mRNA와 퓨로마이신 단위체 사이의 링커 사용에 의해 충분히 향상될 수 있다. 또한, 저온(바람직하게는 -20℃)에서의 긴 인큐베이션(12-48시간)도 30℃에 서의 인큐베이션 동안 발생하는 것보다 더 적은 mRNA 분해와 함께 증가된 융합 수율을 초래한다. 이들 인자를 조합함으로써, 후술하는 바와 같이, 입력 mRNA의 40% 이상이 mRNA-펩티드 융합 생성물로 전환될 수 있다.
mRNA-퓨로마이신 접합체의 합성. 이들 최적화 실험에 있어서, 대체로 상술한 바와 같이 퓨로마이신-함유 링커 올리고뉴클레오티드가 상보적인 DNA 스플린트 존재하에 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제를 사용하여 mRNA의 3' 말단에 리게이션되었다. T4 DNA 리가아제가 리게이션 연결부(junction) 부근에서의 정확한 염기쌍 짝짓기(base-pairing)를 선호하고, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리메라제에 의한 런오프 전사 생성물이 종종 그들의 3' 말단에서 불균일하기 때문에(Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), 정확한 3' 말단 뉴클레오티드를 함유하는 RNA들 만이 효과적으로 리게이션되었다. 표준 DNA 스플린트가 사용된 경우, 런오프 전사 생성물의 약 40%가 퓨로마이신 올리고에 리게이션되었다. 리게이션 생성물의 양은 과량의 RNA 사용에 의해 증가되었으나, 과량의 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드 사용에 의해서는 증가되지 않았다. 특정 이론을 고수하지 않고, 리게이션의 제한요소는 DNA 스플린트의 상응하는 영역에 완전히 상보적인 RNA의 양인 것으로 보였다.
3' 말단에서 여분의 비주형 뉴클레오티드(extra non-templated nucleotide)로 끝나는 전사체(transcript)("N+1 생성물"이라 함)들의 리게이션을 허용하기 위해, 리게이션 연결부에 추가의 임의의 염기를 포함하는 새로운 DNA 스플린트를 가진 표준 DNA 스플린트 혼합물이 사용되었다. 그러한 혼합 DNA 스플린트의 존재하 에 예시적인 myc RNA 주형(즉, RNA 124)의 경우 리게이션 효율이 70% 이상이 증가하였다.
이러한 변형된 DNA 스플린트 접근법 이외에, mRNA-퓨로마이신 접합체 형성 효율은 다음과 같은 세 가지 요소를 고려함으로써 더 최적화되었다. 첫째, 바람직하게는, mRNA가 스플린트 올리고뉴클레오티드에 어닐링(annealing)되는 것을 저해하는 임의의 심각한 안정적인 2차 구조를 갖는 3'-말단이 결여된 mRNA가 설계되거나 사용되었다. 또한, 고농도의 염은 종종 리게이션 반응의 실패를 초래하므로, 바람직하게는, NAP-25 컬럼을 통한 완벽한 탈염 단계가 포함되었다. 마지막으로, 리게이션 반응이 비교적 신속하고 일반적으로 실온에서 40분 이내에 완결되므로 일반적으로 상당히 긴 인큐베이션 기간이 사용되지 않았으며, 긴 인큐베이션 기간은 종종 불필요한 RNA 분해를 초래하였다.
상기 조건을 사용하여, mRNA-퓨로마이신 접합체가 다음과 같이 합성되었다. myc RNA 서열(RNA124)의 퓨로마이신-함유 올리고뉴클레오티드에의 리게이션이 표준 DNA 스플린트(예를 들면, 5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA-3')(서열 32) 또는 리게이션 연결부에 임의의 염기(N)를 가진 스플린트(예를 들면, 5'-TTTTTTTTTTGCGCAAGA-3')(서열 33)를 사용하여 수행되었다. 반응액은 mRNA, DNA 스플린트, 및 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드를 1.0:1.5-2.0:1.0의 몰비로 함유하였다. 1.0:1.2:1.4의 다른 몰비도 사용되었다. 이들 성분의 혼합물을 우선 94℃에서 1분 동안 가열한 다음 얼음 위에서 15분 동안 냉각시켰다. 리게이션 반응은 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25ug/ml BSA, 15uM 퓨로마이신 올리고, 15uM mRNA, 22.5-30uM DNA 스플린트, 1U/ul의 RNasin(Promega) 및 1.6-2.5U T4 DNA 리가아제/퓨로마이신 올리고 pmole 내에서 실온에서 1시간 동안 수행되었다. 인큐베이션 다음에, EDTA를 최종 농도가 30mM이 되도록 첨가하고, 반응혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 전장(full length) 접합체를 변성 PAGE로 정제한 다음, 전기용출로 분리하고, 탈염하였다.
일반적인 망상적혈구 해독 조건. mRNA-퓨로마이신 접합체의 합성을 향상시키는 이외에, 해독 반응도 다음과 같이 더욱 최적화되었다. 반응은 상이한 제조업체들(Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Ambion, Austin, TX; 및 Promega, Madison, WI)로부터 구입한 토끼 망상적혈구 용해질 내에서 수행되었다. 전형적인 반응혼합물(최종부피 25ul)은 20mM HEPES pH 7.6, 2mM DTT, 8mM 크레아틴 포스페이트, 100mM KCl, 0.75mM Mg(OAc)2, 1mM ATP, 0.2mM GTP, 각 아미노산 25uM(만일 35S-메티오닌이 사용된 경우 0.7uM 메티오닌), RNasin 1U/ul, 및 60%(v/v) 용해질로 구성되었다. 주형의 최종 농도는 50nM 내지 800nM 범위이었다. 각 인큐베이션시, 용해질을 제외한 모든 성분을 얼음위에서 조심스럽게 혼합하고, 냉동된 용해질을 사용 직전에 해동시켰다. 용해질 첨가후, 반응혼합물을 살살 파이펫팅(pipetting)하여 완전히 혼합하고 해독이 개시되도록 30℃에서 인큐베이션하였다. Mg2+와 K+의 최적농도는 mRNA 의 종류에 따라 각각 0.25mM-2mM과 75mM-200mM의 범위내에서 변화되었으며, 바람직하게는 예비실험에서 결정되었다. 특히 해독이 잘 되지않는 mRNA의 경우, 때때로 헤민(hemin), 크레아틴 포스페이트, tRNA, 및 아미노산의 농도도 최적화되었다. 융합반응에는 일반적으로 아세트산칼륨 보다 염화칼륨이 선호되었으나, 때때로 KCl과 KOAc의 혼합물이 더 좋은 결과를 낳았다.
30℃에서 90분 동안 해독한 다음, 반응액을 얼음에서 40분간 냉각시키고, Mg2+ 또는 K+를 첨가하였다. 이 단계에서 첨가된 Mg2+의 최종 농도 역시 mRNA의 종류에 따라 최적화되었으나, 일반적으로 50mM 내지 100mM이었다(혼합 주형 풀의 경우 50mM가 바람직하게 사용되었다). 첨가된 K+의 양은 일반적으로 125mM-1.5M 이었다. Mg2+ 반응의 경우, 결과되는 혼합물은 바람직하게는 20℃에서 16-48시간 동안 인큐베이션되었으나, 적게는 12시간 동안 인큐베이션 될 수도 있었다. K+ 또는 Mg2+/K+가 첨가된 경우, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다.
표지된 융합 생성물을 가시화하기 위해, 반응혼합물 2ul를 로딩 버퍼 4ul와 혼합하고, 그 혼합물을 75℃에서 3분 동안 가열하였다. 결과되는 혼합물을 6% 글리신 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하거나(32P-표지된 주형의 경우), 8% 트리신 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하였다(35S-Met-표지된 주형의 경우). 이 접근법에 대한 대안으로, 융합 생성물은 또한 dT25 스트렙트애비딘 아가로오스 또는 티오 프로필 세파로오스(또는 양자)를 사용하여 대체로 상술한 바와 같이 분리될 수도 있다.
뒤이은 SDS-PAGE 분석을 위해 RNA-링커-퓨로마이신-펩티드 접합체의 RNA 부분을 제거하고자, 적당량의 EDTA를 해독후 인큐베이션에 첨가하고, 그 반응혼합물을 microcon-10(또는 microcon-30) 컬럼을 사용하여 탈염하였다. 결과되는 혼합물(총 약 25ul) 2ul를 RNase H 버퍼(30mM Tris-HCl pH 7.8, 30mM(NH4)2SO4
, 8mM MgCl2, 1.5mM β-머캡토에탄올, 및 적당량의 상보적 DNA 스플린트)과 혼합하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, RNaseH를 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 절단(digestion)을 수행하였다.
퓨로마이신 올리고의 품질. 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드의 품질 역시 효율적인 융합 생성물 생산에 중요하였다. 5'-DMT, 2'-숙시닐, N-트리플루오로아세틸 퓨로마이신과 CPG의 커플링(coupling)은 표준 뉴클레오티드들의 커플링 만큼 효율적이지 못했다. 따라서, 지나치게 낮은 농도의 퓨로마이신이 커플링된 CPG의 형성을 피하고자, 커플링 반응을 주의깊게 모니터하고, 3'-말단 퓨로마이신이 결여된 올리고뉴클레오티드의 합성을 방지하고자 CPG 상의 반응하지 않은 아미노기를 완전히 동결(quenching)시켰다. 매우 미세한 망상(mesh) 미립자를 함유하는 CPG는 뒤이은 자동 올리고뉴클레오티드 합성 단계 동안 밸브가 막히는 문제를 야기할 수 있으므로, 이들의 사용을 피하는 것도 중요하다.
또한, 합성된 퓨로마이신 올리고는, 바람직하게는, 3' 말단에 퓨로마이신이 있는지를 확인하기 위해 대규모 사용(large scale use) 이전에 검사되었다. 본 발명자들의 실험에서, 3' 말단에서 퓨로마이신이 일차 아미노기를 함유한 디옥시아데노신으로 대체되어 있다면, 융합체가 전혀 검출되지 않았다. 3' 수산기의 존재(즉, 3'-말단 퓨로마이신이 결여된 올리고의 원하지 않은 합성)를 검사하기 위해, 우선 퓨로마이신 올리고를 방사성표지(예를 들면, 5'-인산화에 의해)한 다음, 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스페라제에 의한 신장에 프라이머로 사용하였다. 3'-말단 퓨로마이신 단위체가 존재하는 경우, 신장 생성물이 관찰되지 않아야 한다.
해독 및 해독후 인큐베이션의 타임 코스(time course). 해독 반응은 비교적 신속하며, 일반적으로 30℃에서 25분 내에 완결된다. 그러나, 융합반응은 더 느리다. 표준링커(dA27dCdCP)가 30℃에서 사용되었을 때, 융합체 합성은 추가적인 45분 이후에 최대수준에 도달하였다. 해독후 인큐베이션은 더 낮은 온도에서, 예를 들면, 실온, 0℃, 또는 -20℃에서 수행가능하였다. -20℃에서 mRNA의 더 적은 분해가 관찰되었으며, 최상의 융합 결과는 -20℃에서 2일 동안 인큐베이션한 후에 관찰되었다.
Mg 2+ 또는 K + 농도의 효과. 해독후 인큐베이션시 고농도의 Mg2+ 또는 K+는 융합체 형성을 상당히 촉진하였다. 예를 들면, 상술한 myc RNA 주형의 경우, -20℃에서 16시간 동안 인큐베이션 하는 중에 50mM의 Mg2+의 존재하에 표준링커(dA27dCdCP)를 사용한 경우 3-4배의 융합체 형성 촉진이 관찰되었다(도 17, 레인 3과 4를 비교). 효율적인 융합체 형성은 또한 50-100mM 농도의 Mg2+의 존재하에 실온에서 30-45분 동안 해독후 인큐베이션을 한 경우에도 관찰되었다. 유사하게, 250-500mM K+는 K+가 전혀 첨가되지 않은 대조구에 비하여 7배 이상 융합체 형성을 증가시켰다. 최적의 K+ 농도는 일반적으로 300mM 내지 600mM(풀의 경우에는 500mM)이었다. NH4Cl의 해독후 첨가 역시 융합체 형성을 증가시켰다. 음이온으로서 아세트산 이온과 염화이온 중 어느 것을 선택하더라도 융합체 형성에 크게 영향을 미치지 않았다.
링커 길이 및 서열. 링커길이와 융합반응의 상관관계 또한 조사되었다. 21 내지 30 뉴클레오티드(n=18-27)의 범위에서는 융합반응 효율의 변화가 거의 관찰되지 않았다(상술한 바와 같이). 유사한 결과가 19 내지 30 뉴클레오티드 길이의 링커에서도 얻어졌으며, 가장 높은 효율의 융합체 형성은 25 뉴클레오티드 길이의 링커에서 관찰되었다(도 23). 더 짧은 링커(예를 들면, 13 또는 16 뉴클레오티드 길이)와 더 긴 링커(예를 들면, 40 뉴클레오티드 이상의 길이)는 훨씬 더 낮은 효율의 융합체 형성을 초래하였다. 또한, 더 긴 길이(즉, 45 뉴클레오티드 또는 54 뉴클레오티드)의 특정 링커 역시 다소 낮은 융합 효율을 초래하긴 하였으나, 훨씬 더 긴 링커도 융합반응 효율을 최적화하는데 사용될 수 있을 가능성은 남아있다.
링커 서열과 관련하여, 3' 말단 근처의 디옥시리보뉴클레오티드 잔기의 리보뉴클레오티드 잔기로의 치환은 융합 효율에 심각하게 영향을 미치지 않았다. 그러 나, 링커의 3' 말단의 dCdCP(또는 rCrCP) 서열은 융합체 형성에 중요하였다. dCdCP의 dUdUP로의 치환은 융합체 형성 효율을 심각하게 감소시켰다.
링커의 유연성(flexibility). 링커의 유연성과 융합반응의 상관관계 또한 조사되었다. 이들 실험에서, 링커의 경직도(rigidity)가 3' 말단 부근에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 증가된 경우 융합 효율이 낮다는 사실이 확인되었다. 유사하게, 보다 더 유연한 링커(예를 들면, dA21C9C9C9
dAdCdCP, 여기서 C9은 HO(CH2CH2O)3PO2임)가 사용된 경우에는 융합 효율이 현저히 향상되었다. 표준링커(dA27dCdCP)와 비교하여, 보다 더 유연한 링커(dA21C9C9C
9dAdCdCP)의 사용은 RNA124의 경우 융합 효율을 4배 이상 증가시켰다(도 17, 레인 1과 9를 비교). 또한, 고농도의 Mg2+ 부재시에는 해독후 융합이 잘 일어나지 않는 표준링커를 가진 주형(도 17의 레인 3 및 4)과 대조적으로, 유연성 링커를 가진 주형은 -20℃에서의 연장된 해독후 인큐베이션시 양호한 수율로 융합 생성물을 생성하는데 증가된 Mg2+ 를 필요로 하지 않았다(도 17, 레인 11과 12를 비교). 따라서, 이러한 링커는 고농도의 Mg2+의 해독후 첨가를 원치 않는 경우에 매우 유용하였다. 게다가, 유연성 링커는 증가된 Mg2+의 존재하에서도 최적의 융합 수율을 시현하였다.
융합 효율의 정량. 융합 효율은 융합 생성물로 전환되는 해독된 펩티드 분율(fraction), 또는 융합 생성물로 전환되는 입력 주형 분율로서 표현될 수 있다. 융합 생성물로 전환되는 해독된 펩티드의 분율을 결정하고자, 해독된 펩티드의 35S-Met 표지가 사용되었다. 이러한 실험에서, dA27dCdCP 또는 dA27rCrCP 링커가 사용된 경우, 30℃에서 1시간 동안 해독 인큐베이션한 후 해독된 펩티드의 약 3.5%가 그의 mRNA에 융합되었다. 이러한 수치는 -20℃에서 밤새 인큐베이션 한 후, 12%로 증가되었다. 해독후 인큐베이션을 고농도의 Mg2+의 존재하에 수행한 경우에는, 해독된 펩티드의 50% 이상이 주형에 융합되었다.
유연성 링커를 가진 주형의 경우, 30℃에서 1시간 동안 해독한 후 해독된 펩티드의 약 25%가 주형에 융합되었다. 이러한 수치는 -20℃에서 밤새 인큐베이션한 후 50% 이상으로 증가하였으며, 해독후 인큐베이션을 50mM Mg2+의 존재하에 수행한 경우 75% 이상으로 증가하였다.
융합 생성물로 전환되는 입력 주형의 퍼센티지를 결정하기 위해, 32P-표지된 mRNA-링커 주형을 사용하여 해독을 수행하였다. 유연성 링커를 사용하고 해독후 인큐베이션을 Mg2+를 첨가하지 않고 -20℃에서 수행한 경우, 입력 RNA 주형의 농도가 800, 400, 200, 100 및 50nM인 경우 각각 입력 주형의 약 20%, 40%, 40%, 35% 및 20%가 mRNA-펩티드 융합체로 전환되었다(도 18). 해독후 인큐베이션을 50mM Mg2+의 존재하에 수행한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 최상의 결과는 노바젠, 아머샴 또는 암비온으로부터 구입한 용해질을 사용한 경우에 얻어졌다(도 19).
SDS-PAGE에 의한 측정시 mRNA와 mRNA-펩티드 융합체 간의 이동성의 차이는 mRNA 주형이 긴 경우 매우 작을 것이다. 그러한 경우에, 주형은 링커의 5' 말단에 32P로 표지될 수 있다(예를 들면, mRNA-퓨로마이신 접합체의 리게이션 이전에 [32P] γATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여). 이어서, 긴 RNA 부분을 해독/인큐베이션 후에 상보적인 DNA 스플린트의 존재하에 RNaseH로 절단한 후, 변형되지 않은 링커와 링커-펩티드 융합체의 비율을 정량함으로써 융합 효율이 결정될 수 있다. 3'-P 및 5'-OH를 생성하는 RNaseA 절단과 비교하여, 이러한 접근법은 링커의 5' 말단에 있는 32P가 제거되지 않는다는 장점을 가지고 있다.
RNaseH 절단시, 리보솜을 파괴하기 위해 해독후 인큐베이션 후에 EDTA를 첨가하고, 반응혼합물을 microcon-10(또는 microcon-30) 컬럼을 사용하여 탈염하였다. 결과되는 혼합물 2ul를 RNase H 버퍼(30mM Tris-HCl pH 7.8, 30mM(NH4)2SO4
, 8mM MgCl2, 1.5mM β-머캅토에탄올, 및 과량의 상보적 DNA 스플린트) 18ul와 혼합하고, 4℃에서 45분간 인큐베이션하였다. 이어서, RNaseH를 첨가하고, 37℃에서 20분간 절단을 수행하였다.
해독후 인큐베이션 동안의 분자내 vs. 분자간 반응. 상기 실험들에 더하여, 본 발명자들은 Mg2+의 존재하에 -20℃에서 일어나는 융합반응이 원래 분자내 반응인지 또는 분자간 반응인지를 조사하였다. 유리 링커(dA21C9C9C9dAdCdCP, 여기서 C9은 HO(CH2CH2O)3PO2임)를 DNA 링커는 가지고 있으나 3' 말단의 퓨로마이신이 없는 주형 과 함께 상술한 바와 같은 해독 및 해독후 인큐베이션 조건하에서 동시에 인큐베이션하였다. 이러한 실험에서, 검출가능한 양의 35S-Met이 링커-펩티드 생성물 내로 삽입되지 않았으며, 이는 해독후 융합이 주로 신생 펩티드와 동일한 리보솜에 결합된 mRNA 사이에 일어남을 제시하였다.
추가적인 실험에서, 주형을 그의 융합 생성물 및 교차-생성물(cross-product)(틀린 단백질에 융합된 주형)이 전기영동에 의해 분리가능한 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드와 함께 동시에 인큐베이션하였다. 시험된 임의의 주형 및 링커 조합에 대해서는 교차-생성물(cross-product) 형성이 관찰되지 않았다. 이들 실험에서, 융합 교차-생성물은 두 가지 상이한 트랜스(trans) 메카니즘을 통해 형성될 수 있다: (1) 유리 주형 또는 링커와 펩티드-mRNA-리보솜 복합체 내의 펩티드와의 반응 또는 (2) 한 복합체 내의 주형과 다른 복합체내의 펩티드와의 반응. 후자의 가능성을 시험하기 위한 한 특정 실시예가 도 24에 도시되어 있다. 거기에서, 221 아미노산 길이의 단백질을 합성하는 람다 단백질 포스파타아제(λPPase) 주형이 33 아미노산 펩티드를 생성하는 myc 주형과 함께 인큐베이션되었다. 단독으로, 두 주형은 해독후 인큐베이션 후의 융합체 형성을 입증하였다. 함께 혼합시, 오로지 독립적인 융합 생성물만이 관찰되었다. λPPase 단백질과 myc 주형의 융합으로부터 결과되는 교차-생성물은 전혀 관찰되지 않았다. 다음과 같은 몇몇 상이한 조합을 사용한 유사한 실험도 교차-생성물 형성을 시현하지 않았다: myc 주형 + 단일 코돈 주형, 20:1 비율의 표준 링커 + myc 주형, 및 유연성 링커 + myc 주형. 이들 실험은 두 가지 가능한 트랜스 융합체 형성 메카니즘을 강력히 반박하였다.
융합체 형성에 링커 길이가 미치는 영향 또한 시스(cis) 메카니즘과 일치하였다. 링커 길이를 19 뉴클레오티드에서 13 뉴클레오티드로 감소시키자, 펩티드 사슬이 더 이상 디코드화 부위로부터 펩티드 트랜스페라제 센터에 도달할 수 없는 경우에 예상되는 융합 생성물량의 급격한 감소가 초래되었다(도 23). 그러나, 이러한 효과는 트랜스 메카니즘이 우세한 경우(즉, 리보솜-결합 주형이 트랜스 메카니즘을 통해 융합체를 형성하는 경우) 리보솜 내의 퓨로마이신의 차단(occlusion)에 기인할 수도 있다. 일단 퓨로마이신이 리보솜으로부터 유리되면 트랜스 반응의 경우 감소가 전혀 관찰될 수 없기 때문에, 더 긴 링커를 사용하는 경우의 융합체 형성 감소는 또다시 이러한 유형의 반응을 반박하였다.
최적화 결과. 상술한 바와 같이, 유연성 링커를 사용하고/하거나 고농도의 Mg2+의 존재하에 해독후 인큐베이션을 수행함으로써, 융합 효율이 입력 mRNA의 약 40%까지 증가하였다. 이러한 결과들은, 시험관내 해독 반응믹스 ml당 1014개의 mRNA-펩티드 융합체 분자가 생성되어 시험관내 선별 실험에 사용하기 위한 매우 높은 복잡성을 가진 mRNA-펩티드 융합체 풀을 생산할 수 있음을 암시하였다.
RNA-단백질 융합체의 선별적인 증대(enrichment)
본 발명자들은 코드화된 펩티드에 근거하여 랜덤 서열 융합체(random sequence fusion)들로 구성된 복잡한 풀로부터 특정한 RNA-펩티드 융합체를 증대시킴으로써 선별 및 진화 실험에 RNA-펩티드 융합체를 사용할 수 있는 가능성을 주장해왔다. 특히, 본 발명자들은 소량의 공지된 서열(이 경우에는 긴 myc 주형인 LP154)이 소량의 랜덤 서열 풀(즉, LP160)과 혼합된 일련의 혼합물들을 제조하였다. 이들 혼합물을 해독한 후, RNA-펩티드 융합 생성물을 본원에 기술한 바와 같이 올리고뉴클레오티드 및 이황 친화성 크로마토그래피를 사용하여 선별하였다. myc-주형 융합체를 항-myc 단클론 항체를 사용하여 선별적으로 면역침강시켰다(도 16a). 이러한 선별단계에서 이루어진 증대(enrichment)를 측정하기 위해, 면역침강 전후의 cDNA/mRNA-펩티드 융합체 혼합물의 분취량을 방사성표지된 프라이머의 존재하에 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 DNA를, myc 주형 서열은 절단하나 풀은 절단하지 않는 제한효소로 처리하였다(도 16b 및 16c). 절단된 DNA와 절단되지 않은 DNA의 비율의 정량은 면역침강에 의해 myc 서열이 랜덤 라이브러리에 비해 20-40배 증대되었음을 암시하였다.
이들 실험은 다음과 같이 수행되었다.
해독 반응. 해독 반응은 대체로 상술한 바와 같이 수행되었다. 구체적으로, 반응은 제조자(Novagen)의 지시에 따라 30℃에서 1시간 동안 수행되었으며, -20℃에서 밤새 냉동되었다. 6개의 시료로 구성된 두 버전을 준비하였는데, 각각의 버전은 52uM의 최종 농도로 첨가된 35S-메티오닌 또는 콜드(cold) 메티오닌을 함유하였다. 반응 1-6은 표 2에 나타낸 바와 같은 양의 주형을 함유하였다. 표 2에 있는 모든 수치는 반응혼합물 25ul 당 주형 pmole을 나타낸다.
| 반응 | LP154 | LP160 |
| 1 | --- | --- |
| 2 | 5 | --- |
| 3 | 1 | 20 |
| 4 | 0.1 | 20 |
| 5 | 0.01 | 20 |
| 6 | --- | 20 |
dT 25 스트렙트애비딘 아가로오스의 제조. 스트렙트애비딘 아가로오스(Pierce)를 TE(10mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EDTA)로 3회 세정하고, TE 8.2 내에 1:1(v/v) 슬러리로 재현탁하였다. 이어서, Bioteg CPG(Glen Research)를 사용하여 합성된 3' 비오틴 T25를 원하는 최종 농도(일반적으로 10 또는 20uM)로 첨가하고, 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션을 수행하였다. 그런 다음, dT25 스트렙트애비딘 아가로오스를 TE 8.2로 3회 세정하고 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.
해독 반응액으로부터 주형의 정제. 해독 반응액으로부터 주형을 정제하기 위해, 각 반응액 25ul를 덜어 7.5ml의 분리 버퍼(1.0M NaCl, 100mM Tris-Cl pH 8.2, 10mM EDTA, 및 0.1mM DTT) 및 20uM dT25 스트렙트애비딘 아가로오스 125ul에 첨가하였다. 이 용액을 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 시험관을 원심분리한 다음 상청액을 제거하였다. 분리 버퍼 1ml을 첨가하여 슬러리를 재현탁하고, 그 혼합물을 1.5ml 마이크로원심분리 관으로 옮겼다. 이어서, 시료를 차가운 분리 버퍼 1ml로 세정하였다. 그런 다음, 동일하게 반응된 핫(hot) 시료 및 콜드(cold) 시료를 Millipore MC 필터 유닛 내에 취합하고, 2배 부피의 100ul H2O, 0.1mM DTT, 그리고 2배 부피의 15mM NaOH, 1mM EDTA(4℃)로 세정하고 중화하여 dT25 아가로오스로부터 용출하였다.
이 용출액에 세정된 티오프로필 세파로오스(Pharmacia) 50% 슬러리를 40ul 가하고, 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 상기 시료를 TE 8.2 1ml로 3회 세정하고, 용출액을 제거하였다. 1M DTT 1ul를 고체(총부피 약 20-30ul)에 가하고, 시료를 수 시간 동안 인큐베이션한 다음 20ul H2O로 4회(총부피 90ul) 세정하였다. 용출액은 UV 흡광도 측정결과 2.5mM의 티오피리돈(thiopyridone)을 함유하였다. 이 시료 50ul에 6ul 3mM NaOAc pH 5.2, 10mM 스퍼미딘, 1ul 글리코겐(10mg/ml, Boehringer Mannheim) 및 170ul 100% EtOH을 가하고 -70℃에서 30분간 인큐베이션한 다음, 마이크로원심분리기에서 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 에탄올침전시켰다.
역전사 반응. 에탄올침전된 시료 및 티오피리돈 용출액 시료 양자에 대해 다음과 같이 역전사 반응을 수행하였다. 에탄올침전된 시료의 경우, 재현탁된 주형 30ul에 48ul의 물을 가하고 200pmole의 프라이머 21.103(서열 22)을 70℃에서 5분 동안 어닐링한 다음 얼음에서 냉각시켰다. 이 시료에, 16ul의 제 1 가닥 버퍼(first strand buffer: 250mM Tris-Cl pH 8.3, 375mM KCl, 및 15mM MgCl2; Gibco BRL, Grand Island, NY로부터 입수가능함), 8ul의 100mM DTT, 및 4ul의 10mM NTP를 첨가하고 42℃에서 평형시킨 다음, 4ul의 Superscript II 역전사효소(Gibco BRL, Grand Island, NY)를 첨가하였다. TP 세파로오스 용출액(35ul)은 물(13ul)을 가한 후, 상술한 바와 같이 반응시켰다. 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 동일한 번호가 매겨진 시료를 취합하였다(총 160ul). 시료 10ul를 각각의 선별되지 않은 시료의 PCR을 위해 보관하였으며, 시료 150ul는 면역침강을 위해 보관하였다.
면역침강. 면역침강을 수행하기 위해, 170ul의 역전사 반응액을 1ml의 희석버퍼(10mM Tris-Cl pH 8.2, 140mM naCl, 1% v/v Triton X-100) 및 20ul의 프로테인 A/G 접합체(Calbiochem, La Jolla, CA)에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하여 예비정화(preclear)하였다. 용출액을 취하여 20ul G/A 접합체 및 20ul 단클론 항체를 첨가한 다음, 그 시료를 4℃ 에서 2시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 접합체를 2,500rpm에서 5분 동안 마이크로원심분리하여 침전시킨 다음, 상청액을 제거하고, 접합체를 차가운 희석 버퍼 1ml로 3회 세정하였다. 이어서, 시료를 1ml의 차가운 10mM Tris-Cl pH 8.2, 100mM NaCl로 세정하였다. 결합된 단편을 3배 부피의 냉동된 4% HOAc를 사용하여 제거하고 시료를 동결건조시켰다.
선별된 시료 및 선별되지 않은 시료의 PCR. 선별되지 않은 시료 10ul 및 선별된 시료 전체에 농축된 NH4OH 20ul를 가하고, 55℃, 70℃ 및 90℃에서 각각 5분씩 인큐베이션하여 시료 내에 존재하는 모든 RNA를 파괴함으로써 PCR 반응을 수행하였다. 이어서, 시료를 스피드백을 사용하여 건조할 때까지 증발시켰다. PCR 혼합물(1uM 프라이머 21.103 및 42.108, PCR 버퍼 플러스 Mg2+ 내의 200uM dNTP(Boehringer Mannheim), 및 2ul Taq 폴리메라제(Boehringer Mannheim)) 200ul를 각 시료에 첨가하였다. 선별되지 않은 시료 2번에 대해서는 16 사이클의 PCR을 수행하였고, 모든 다른 시료에 대해서는 19 사이클의 PCR을 수행하였다.
이어서, 시료들을 표 3에 따라 5' 32P-표지된 프라이머 21.103의 존재하에 증폭시키고, 모든 프라이머 및 더 짧은 단편들을 제거하기 위해 Wizard direct PCR 정제 키트(Promega)를 사용하여 각각 2회씩 정제하였다.
| 시료 | 타입 | 부피 | 사이클 |
| 1 | 선별되지 않음 | 20 ul | 5 |
| 2 | 선별되지 않음 | 5 ul | 4 |
| 3 | 선별되지 않음 | 20 ul | 5 |
| 4 | 선별되지 않음 | 20 ul | 5 |
| 5 | 선별되지 않음 | 20 ul | 5 |
| 6 | 선별되지 않음 | 20 ul | 5 |
| 1 | 선별됨 | 20 ul | 5 |
| 2 | 선별됨 | 5 ul | 4 |
| 3 | 선별됨 | 20 ul | 5 |
| 4 | 선별됨 | 20 ul | 7 |
| 5 | 선별됨 | 20 ul | 7 |
| 6 | 선별됨 | 20 ul | 7 |
제한절단(Restriction digests). 상기 PCR 반응 각각으로부터 제조된 32P-표지된 DNA를 동량(cpm 단위로)으로 표 4에 따른 제한절단 반응액에 첨가하였다. 각 반응액의 총 부피는 25ul이었다. AlwnI(5 유닛, New England Biolabs) 0.5ul를 각 반응액에 첨가하였다. 시료를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 65℃에서 20분간 인큐베이션하여 효소를 열불활성화(heat-inactivation)시켰다. 이어서, 시료를 10ul 변성 로딩 버퍼(1ml 초순수 포름아마이드(USB), 20ul 0.5M EDTA, 및 20ul 1M NaOH)와 혼합하고 90℃까지 1분간 가열한 다음, 8M 우레아가 함유된 12% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에 로딩하였다. 전기영동후, 겔을 10%(v/v) HOAc, 10%(v/v) MeOH, H2O로 고정하였다.
| 시료 | 타입 | 반응액에 첨가된 DNA 부피 | 총부피 |
| 1 | 선별되지 않음 | 20 ul | 25 ul |
| 2 | 선별되지 않음 | 4 ul | 25 ul |
| 3 | 선별되지 않음 | 20 ul | 25 ul |
| 4 | 선별되지 않음 | 20 ul | 25 ul |
| 5 | 선별되지 않음 | 4 ul | 25 ul |
| 6 | 선별되지 않음 | 20 ul | 25 ul |
| 1 | 선별됨 | 20 ul | 25 ul |
| 2 | 선별됨 | 8 ul | 25 ul |
| 3 | 선별됨 | 12 ul | 25 ul |
| 4 | 선별됨 | 12 ul | 25 ul |
| 5 | 선별됨 | 20 ul | 25 ul |
| 6 | 선별됨 | 20 ul | 25 ul |
절단 정량. 시료내에 존재하는 myc 대 풀 DNA의 양을 포스포이메이저(Molecular Dynamics)를 사용하여 정량하였다. 각 밴드내에 존재하는 물질의 양은 겔 밴드 둘레에 그려진 동일한 직사각형의 적분된 부피로서 결정되었다. 각 밴드 내에 존재하는 총 cpm은 상기 부피 마이너스 배경값으로 계산되었다. 세 가지 배경값이 사용되었다: (1) 카운팅된 영역 외부의 동일한 정사각형의 평균; (2) myc 밴드가 나타났어야 하는 선별되지 않은 풀 레인에 존재하는 cpm(겔 의 이 위치에서는 아무런 밴드도 나타나지 않는다); 및 (3) 선별되지 않은 레인 간에 10배 주형 증가에 가장 근접한 수치를 재현한 표준화된 수치(normalized value). 도 16b 및 16c의 레인 2,3 및 4는 풀 서여과 대비하여 타겟의 증대를 입증하였다. 레인 3에서의 명백한 증대(선별되지 않음/선별됨)가, 이 시료의 시그널 대 노이즈 비율의 최적화에 기인하여, 최고치(방법 1-3을 사용한 경우 각각 17, 43 및 27배)를 보였다. 이러한 결과들이 표 5에 요약되어 있다.
| 방법 | 레인 2 (20) | 레인 3 (200) | 레인 4 (2000) |
| 1 | 7.0 | 16.6 | 5.7 |
| 2 | 10.4 | 43 | 39 |
| 3 | 8.7 | 27 | 10.2 |
제 2 세트의 실험에서, 동일한 PCR 생성물들을 일단 Wizard direct PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 다음, 절단체(digest)들을 상기 방법 (2)로 정량하였다. 이들 실험에서, 유사한 결과가 얻어졌다; 상기 레인 2, 3 및 4의 시료와 동등한 시료에 대해 각각, 10.7배, 38배 및 12배의 증대가 측정되었다.
거대 RNA-펩티드 융합체 라이브러리로부터의 시험관내 선별
거대한 라이브러리로부터 원하는 융합체 분자의 선별을 예증하는 다른 실험에서, 2x103개의 랜덤화된 RNA-펩티드 융합체 레퍼토리가 상술한 방법의 변형을 통 해 제조되었다. 합성 스킴 5'-(NNS)27-3'(여기서 N은 동일몰수의 A, G, C 및 T이고, S는 G 또는 C임)에 근거한 27개의 랜덤화된 코돈을 함유하는 DNA 라이브러리가 제조되었다. 각각의 NNS 코돈은 모든 20가지 천연 아미노산에 대한 코돈을 포함하는 32 트리플렛(triplet)의 혼합물이었다. 랜덤화된 영역에는 역전사와 PCR을 위한 두 개의 프라이머 결합부위 뿐만 아니라 T7 프로모터 코드화 서열 및 해독 개시 부위가 측접하고 있었다. 시험관내 전사에 의해 합성된 RNA는, 그의 3' 말단에 퓨로마이신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 링커 dA27dCdC-P에의 주형-지향 리게이션(template-directed ligation)에 의해 변형되었다.
정제된 리게이션된 RNA는 다음과 같이 토끼 망상적혈구 추출물 내에서 시험관내 해독되어 RNA-단백질 융합체를 생성하였다: 123-머 DNA PP.01 (5'-AGC TTT TGG TGC TTG TGC ATC (SNN)27 CTC CTC GCC CTT GCT CAC CAT-3', N=A, G, C, T; S=C, G)(서열 34)을 합성후 6% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 정제하였다. 정제된 DNA(6x1014 분자) 1nmol을 총부피 5ml(50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH 9.0, 0.1% Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 0.25mM dNTPs, 500 유닛 Promega Tag Polymerase) 내에서 1uM 프라이머 P1F (5'-AGC TTT TGG TGC TTG TGC ATC-3')(서열 35) 및 PT7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3')(서열 36)을 사용하여 3 라운드의 PCR(94℃, 1분; 65℃, 1분; 72℃, 2분)로 증폭하였다. 침전 후에, DNA를 100ul TE(100mM Tris-Cl pH 7.6, 1mM EDTA pH 8.0)에 재용해시켰다. DNA(60ul)를 암비온사의 Megashortscript In Vitro Transcription 키트를 사용한 반응(1ml)에서 RNA로 전사하였다. 상기 반응액을 페놀/클로로포름으로 2회 추출하고, 과량의 NTPs를 NAP-25 컬럼(Pharmacia)으로 정제하여 제거하였다. 퓨로마이신-함유 링커 30-P(5'-dA27dCdCP)를 본원에 기술된 바와 같이 합성한 후, 주형-지향 리게이션에 의해 RNA 라이브러리의 3'-말단에 부가하였다. RNA(25nmol)를 T4 DNA 리가아제 버퍼(Promega) 및 1200U T4 DNA 리가아제(Promega)가 함유된 반응액(1.5ml) 내에서 동일 몰수의 링커 및 스플린트(5'-TTT TTT TTT TNA GCT TTT GGT GCT TG-3')(서열 37)와 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 리게이션된 RNA를 6% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 리게이션되지 않은 RNA로부터 분리하고, 겔로부터 용출한 다음, 재용해(200ul ddH2O)시켰다. mRNA-펩티드 융합체 분자를 생성하기 위해, 리게이션된 RNA(1.25nmole)를 암비온사의 Rabbit Reticulocyte IVT 키트를 사용하여 3.7uCi 35S-메티오닌의 존재하에 총부피 7.5ml 내에서 해독하였다. 인큐베이션(30℃에서 30분) 후에, 반응액 중의 KCl과 MgCl2의 최종 농도를 각각 530mM과 150mM로 맞추고, 실온에서 1시간 더 인큐베이션하였다. 융합체 형성은 이와 같이 해독 반응이 완료된 후 530mM KCl 및 150mM MgCl2를 첨가함으로써 약 10배 증가되었다.
이러한 향상된 방법을 사용하여, ml당 약 1013개의 정제된 융합분자들이 수득 되었다. RNA-펩티드 융합체를 올리고뉴클레오티드 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되지 않은(crude) 해독 반응액으로부터 정제한 후, 선별 단계 이전에 RNase H-free 역전사효소를 사용하여 다음과 같이 역전사시켰다. 해독된 융합 생성물을 인큐베이션 버퍼(100mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA pH 8.0, 1M NaCl 및 0.25% Triton X-100; 4℃에서 1시간) 내에서 dT25 셀룰로오스(Pharmacia)와 함께 인큐베이션하였다. 셀룰로오스를 여과에 의해 분리하여 인큐베이션 버퍼로 세정한 다음, 융합 생성물을 ddH2O로 용출하였다. RNA를 5배 과량의 스플린트를 프라이머로 사용하여 역전사하였다(25mM Tris-HCl pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM dNTPs, 및 2U Superscript II Reverse Transcriptase(Gibco BRL)).
RNA-단백질 융합체 선별기술의 위력을 조사해보기 위해, 상기 라이브러리가 면역침강을 선별수단으로 사용하여 c-myc 단클론 항체에 결합된 펩티드를 선별하는데 사용되었다. 5 라운드의 반복된 선별 및 증폭은 융합분자 집단의 항-myc 단클론 항체 9E10(Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610(1985))에의 증가된 결합을 초래하였다. 처음 세 라운드의 매 선별단계에서는 선별단계에 적용된 라이브러리의 1% 미만이 용출에 의해 회수되었다; 그러나, 네 번째 선별 라운드에서는 라이브러리의 약 10%가 항체에 결합하고 용출되었다. 결합한 분자의 비율은 다섯 번째 선별 라운드에서는 34%로 증가하였다. 이러한 결과는 이러한 조건하에서 항-myc 항체에 결합하는 야생형 c-myc 융합 컨스트럭트의 퍼센티지(35%)와도 잘 일치하였다. 여섯 번째 선별 라운드에서는 더 이상의 증대가 관찰되지 않았으며, 다섯 번째와 여섯 번째 라운드로부터의 융합분자가 선별된 펩티드의 특성화 및 서열결정에 사용되었다.
이러한 실험을 수행하기 위해, 2x1013개의 분자들로 구성된 출발 라이브러리를 선별 버퍼(1X PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween) 내에서 12배 과량의 c-myc 결합 항체 9E10(Chemicon)과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 펩티드 융합체 -항체 복합체를 프로테인 A-세파로오스 첨가에 의해 침전시켰다. 4℃에서 1시간 동안 더 인큐베이션한 다음, 세파로오스를 여과에 의해 분리하고, 통과액(flow through, "FT")을 수집하였다. 세파로오스를 5배 부피의 선별 버퍼로 세정하여(W1-W5) 비-특이적 결합체를 제거하고, 결합된 펩티드를 4배 부피의 15mM 아세트산으로 용출하였다(E1-E4). 용출된 융합분자의 cDNA 부분을 PCR로 증폭하고, 결과되는 DNA를 추가적인 선별단계에 사용될 증대된 융합 생성물 집단을 생산하는데 사용하였다. 프로테인 A-세파로오스에 대한 친화성을 가진 펩티드를 풀로부터 제거하기 위해, 프로테인 A-세파로오스 상에서의 예비선별(pre-selection)이 두 번째 선별 라운드에 도입되었다. 선별과정은 아세트산에 의해 면역침강물로부터 용출된 35S-표지된 RNA-펩티드 융합체의 퍼센티지를 측정함으로써 모니터되었다. 이러한 결과들이 도 20에 도시되어 있다.
선별된 펩티드 풀은 선별에 사용된 항-myc 항체에 특이적으로 결합함이 입증되었다. 제 6 라운드의 융합되지 않은 펩티드를 사용한 결합 실험은 융합된 펩티드와 비교하여 항체에 대해 유사한 결합을 시현하였으며, 이는 융합분자의 핵산 부 분이 결합에 필요치 않음을 암시하였다(데이터는 도시하지 않음).
여섯 번째 선별 라운드로부터의 융합 생성물을 다음과 같은 세 가지 상이한 면역침강 조건하에서 평가하였다: (1) 항-myc 항체 부재하에, (2) 동일한 이소타입(isotype)이지만 myc 에피톱에 결합하지 않는, 항-인테그린 단클론 항체 ASC-3 존재하에, 그리고 (3) 항-myc 항체 9E10 존재하에. 실험은 여섯 번째 선별 라운드로부터의 35S-표지된 RNA-펩티드 융합 생성물(0.2pmole)을 선별 버퍼(1X PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween) 내에서 항-myc 단클론 항체 9E10(100pmol) 또는 항-인테그린 β4 단클론 항체 ASC-3(100pmole; Chemicon)와 함께, 또는 항체 없이 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 수행되었다. 펩티드 융합체-항체 복합체는 프로테인 A-세파로오스를 사용하여 침전되었다. 세파로오스를 5배 부피의 선별 버퍼로 세정한 다음, 결합종을 15mM 아세트산 첨가에 의해 용출하였다.
항체가 없는 대조 실험에서 의미있는 결합이 검출되지 않음에 따라 선별된 펩티드가 프로테인 A-세파로오스에 비특이적으로 결합하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한, 항-인테그린 단클론 항체에 대한 결합이 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 선별된 펩티드가 항-myc 항체에 특이적임을 암시하였다. 선별된 펩티드 융합분자가 항-myc 항체 9E10의 항원결합부위와 상호작용을 하는지 여부를 결정하기 위해 합성 myc 펩티드를 사용한 경쟁(competition)실험이 수행되었다. 여섯 번째 선별 라운드로부터의 35S-표지된 융합분자를 항-myc 단클론 항체 및 증가하는 양의 표지되지 않은 myc 펩티드와 인큐베이션하였을 때, 결합분자의 퍼센티지가 감소하였다. 이러한 결과가 도 21에 도시되어 있다. 도 21에서, 여섯 번째 선별 라운드로부터의 35S-표지된 RNA-펩티드 융합 생성물 0.2pmole이 0, 0.2, 1, 2 또는 10nmol의 합성 myc 펩티드(Calbiochem)의 존재하에 100pmol의 항-myc 단클론 항체 9E10과 함께 인큐베이션되었다. 펩티드 융합체-항체 복합체는 프로테인 A-세파로오스 첨가에 의해 침전되었다. 수치들은 3세트의 중복 결합반응(triplicate binding reactions)에서 측정된, 항체에 결합하고 15mM 아세트산으로 용출가능하였던 융합분자들의 평균 퍼센티지를 나타낸다. 상기 경쟁 데이터는 분리된 융합분자들의 대다수가 myc 결합부위에 특이적임을 입증하였다.
다섯 번째 및 여섯 번째 선별 라운드로부터 유래된 116개의 개별 클론들의 서열분석은 두 번 발생하고 야생형 c-myc 에피톱 EQKLISEEDL(서열 2)을 포함하는 한 서열을 동정하였다. 세 번째 서열은 나머지 두 서열과 거의 동일하였으나, 뉴클레오티드 수준에서 2개의 점돌연변이(point mutation)를 시현하였는데, 그 중 하나는 보존된(conserved) myc 에피톱 영역에 있는 Ile의 Val으로의 변이를 초래하였다. 모든 서열은 c-myc 에피톱과 매우 유사한 공통 모티프(consensus motif) X(Q,E)XLISEXX(L,M)(서열 38)을 포함하였다. 네 개의 아미노산으로 구성된 핵심영역 LISE가 가장 보존적이었다. 도 22는 랜덤 27-머 라이브러리로부터 분리된 12개의 선별된 펩티드들의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도의 상단에는 c-myc 에피톱의 아미노산 서열이 도시되어 있다. 도시된 서열들 중에서, 공통 모티프를 함유한 영역만이 포함된다. 공통 모티프와 일치하는 잔기들은 강조되어 있다. 클론 R6-63은 야생형 myc 에피톱을 함유하였다. 공통 잔기들이 도 22의 하단에 도시되어 있다.
상기 보존된 모티프가 한정된 5' 프라이머 영역에 의해 코드화되는 한 아미노산을 함유하고 있음을 고려하여, 본 발명자들은 공지의 10 아미노산 c-myc 에피톱이 2x1013 분자로 된 출발 풀(strating pool)에서 겨우 약 60회 정도 나타난 것으로 추정하였다. 다섯번의 선별 라운드에서 관찰된 야생형 에피톱의 증대는 일련의 개별 실험에서 확인된 선별 라운드 당 200배 이상의 증대율과 잘 일치하였다.
도 22에 도시된 12개의 선별된 서열에 대해 수행된 면역침강분석은, 라이브러리-유래의 RNA-펩티드 융합체의 항-myc 단클론 항체의 항원결합부위에 대한 특이적인 결합을 확인시켜주었다. RNA-펩티드 융합체와 마찬가지로, 12개 서열 모두 항-myc 항체에 결합하였으며 프로테인 A-세파로오스에 대한 결합을 시현하지 않았다. 또한, 35S-표지된 융합 생성물(상기 12개의 서열로부터 유래된)과 표지되지 않은 합성 myc 펩티드 간의 항-myc 항체에 대한 경쟁적인 결합이 비교되었다. 사용된 조건하에서, 표지된 야생형 myc 융합체는 표지되지 않은 myc 펩티드의 존재하에 9% 수준으로 결합하였으며, 결합 퍼센티지는 시험된 12개의 서열에 대해 0.4%와 12% 사이에서 변화하였다. 이러한 데이터는 상기 서열들이 야생형 myc 융합체와 유사한 친화도로 myc 항체에 결합함을 암시하였다.
팔(arm) 모티프 펩티드의 정제 및 고정된 RNA와의 융합
λ-boxBR(Cilley and Williamson, RNA 3:57-67 (1997)), BIV-TAR(Puglisi et al., Science 270:1200-1203 (1995)) 및 HIV-RRE(Battiste et al., Science 273:1547-1551 (1997))에 대한 RNA 결합부위를 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 3' 비오틴 단위체를 함유하게 합성하였다. 합성 RNA 시료를 본원에 기술된 바와 같이 탈보호, 탈염 및 겔 정제하였다. 그런 다음, 농축된 RNA 스톡(stock)을 1X TE 8.2 내의 50%(v/v) ImmunoPure 스트렙트애비딘 아가로오스 슬러리(Pierce)와 최종 RNA 농도가 5mM이 되도록 25℃에서 2시간 동안 교반하면서 혼합하여, 3' 비오틴-RNA 부위를 고정하였다. (1) 1N 펩티드 단편을 코드화하는 주형 또는 (2) 대조구로서 글로빈 mRNA를 함유하는 두 가지 해독 반응을 수행하였다. 각 고정된 RNA의 분취량(50% v/v 슬러리 50ul)을 세정한 다음, 500ul의 결합 버퍼(100mM KCl, 1mM MgCl2, 10mM HEPES·KOH pH 7.5, 0.5mM EDTA, 0.01% NP-40, 1mM DTT, 50ug/ml 효모 tRNA)에 재현탁하였다. N 펩티드 또는 글로빈 주형을 함유하는 해독 반응액 15ul를 상기 세 가지 고정된 결합부위 중 어느 하나를 함유하는 시험관에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 결합반응이 수행되었다. 비드를 원심분리로 침전시키고, 100ul의 결합 버퍼로 2회 세정하였다. RNaseA(DNase free, 1ul, 1mg/ml)(Boehringer Mannheim)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 결합된 분자들을 유리시켰다. 상청액을 취하여 SDS 로딩 버퍼 30ul와 혼합한 후, SDS·Tricine PAGE로 분석하였다. 융합체 형성을 촉진하기 위해 해독 반응 후에 35mM MgCl2를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, 동 일한 프로토콜이 P 펩티드 융합체 분리에 사용되었다.
이러한 실험의 결과는 N 펩티드가 시험관내 합성되었을 때와 그 자신의 mRNA와 RNA-펩티드 융합체로서 생산되었을 때 모두 그의 정상적인 결합 특이성을 보유하고 있음을 입증하였다. 이러한 결과는 매우 중요한 것이다. 긴 핵산서열의 펩티드 또는 단백질의 C 말단에의 부착(즉, 융합체 형성)은 융합되지 않은 서열에 비하여 폴리펩티드 기능을 파괴할 가능성이 있다. 아르기닌-풍부 모티프(arginine rich motif, "ARM") 펩티드는 그들의 비교적 높은 비특이적 핵산결합 특성 때문에 융합시스템의 엄격한 기능시험(functional test)을 대표한다. N 펩티드-mRNA 융합체(cDNA 합성 이전의)가 유리 펩티드(free peptide)의 기능을 보유하고 있다는 사실은, 자가 복합체(self-complex) 또는 비특이적 복합체를 형성할 가능성이 있을 때 조차도 특이성이 유지됨을 암시한다.
단백질 선별 시스템의 사용
본 발명의 선별 시스템은 치료, 진단 또는 산업상 문제를 해결하기 위해 단백질 공학이 사용되는 임의의 영역에 상업적으로 응용될 수 있다. 이러한 선별기술은 기존의 단백질을 개선하거나 또는 변형시키는데 뿐만 아니라 목적으로 하는 기능을 가진 새로운 단백질을 분리하는데도 유용하다. 이들 단백질은 자연발생적인 서열이거나, 자연발생적인 서열이 변형된 형태이거나, 또는 일부 또는 전체가 합성서열일 수 있다. 또한, 이러한 방법은 유용한 핵산 또는 작은 표적분자를 분리 또는 동정하는데도 사용될 수 있다.
신규 결합제의 분리. 한 특정 응용예에서, 본원에 기술된 RNA-단백질 융합 기술은 특이적 결합(예를 들면, 리간드 결합) 특성을 보유한 단백질 분리에 유용하다. 매우 특이적인 결합 상호작용을 시현하는 단백질들은 비-항체 인식 시약(non-antibody recognition reagent)으로 사용될 수 있으며, 따라서 RNA-단백질 융합기술이 종래의 단클론 항체 기술을 능가할 수 있다. 이러한 방법에 의해 분리된 항체타입 시약은 종래의 항체가 사용되는 임의의 영역, 예를 들면 진단 및 치료분야에 사용될 수 있다.
인간 항체의 개량. 본 발명은 또한 인간의 또는 인간화된(humanized) 항체를 다양한 임의의 질병을 치료하기 위한 목적으로 개량하는데 사용될 수 있다. 이러한 응용예에서는, 항체 라이브러리가 개발되고 시험관내에서 스크리닝되므로, 세포융합 또는 파아지 디스플레이(phage display)와 같은 기술을 사용할 필요가 없게 된다. 한 중요한 응용예에서, 본 발명은 단일쇄(single chain) 항체 라이브러리를 개선하는데 유용하다(Ward et al., Nature 341:544 (1989); 및 Goulot et al., J. Mol. Biol. 213:617 (1990)). 이러한 응용의 경우, 가변 영역(variable region)은 인간 소스로부터 구성되거나(수혜자의 가능한 역면역반응을 최소화하기 위해), 또는 전적으로 랜덤화된 카세트를 포함할 수 있다(라이브러리의 복잡성을 최대화하기 위해). 개량된 항체분자를 스크리닝하기 위해, 후보분자 풀이 표적분자(예를 들면, 도 2에 도시된 바와 같은 고정된 항원)에 대한 결합에 대해 시험된다. 이때, 선별단계가 한 라운드에서 다음 라운드로 진행됨에 따라 점점 더 높은 스트린젠시(stringency)가 결합단계에 적용된다. 스트린젠시를 증가시키기 위해, 세정단계 횟수, 과량의 경쟁자의 농도, 버퍼 조건, 결합반응 시간 및 고정된 매트릭스와 같은 조건이 변화된다.
단일쇄 항체는 치료에 직접적으로 사용되거나, 또는 표준 항체를 고안하는데 간접적으로 사용될 수 있다. 그러한 항체는, 항-자가면역 항체, 면역억제, 및 AIDS와 같은 바이러스성 질병용 백신의 개발을 포함하는 다양한 잠재적인 응용가능성을 가지고 있다.
신규 촉매의 분리. 본 발명은 또한 신규 촉매단백질을 선별하는데 사용될 수 있다. 시험관내 선별 및 진화는 종래에는 신규한 촉매 RNA 및 DNA들을 분리하는데 사용되어 왔으며, 본 발명에서는 신규한 단백질 효소를 분리하는데 사용된다. 이러한 접근법의 한 특별한 예에서, 촉매는 그 촉매의 전이상태(transition state)의 화학적 유사체에의 결합에 대해 선별함으로써 직접적으로 분리될 수 있다. 다른 특정예에서, 직접적인 분리는 기질과의 공유 결합 형성에 대해 선별함으로써(예를 들면, 친화성 태그에 연결된 기질을 사용하여) 또는 절단(예를 들면, 특이적 결합을 파괴함으로써 고형 지지체로부터 라이브러리의 촉매성 구성원을 유리시키는 능력에 대해 선별함으로써)에 의해 달성될 수 있다.
신규 촉매를 분리하기 위한 이러한 접근법은 촉매성 항체 기술[catalytic antibody technology](Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)에서 리뷰됨)에 비하여 적어도 2가지의 중요한 이점을 가지고 있다. 첫째, 촉매성 항체 기술에서는, 초기 풀이 일반적으로 면역글로블린 무리에 제한된다; 이와 대조적으로, RNA-단백질 융합체의 출발 라이브러리는 완전히 랜덤하거나 또는, 제한 없이, 공지된 효소 구조물(enzymatic structures) 또는 단백질 비계(scaffolds)의 변이체들로 구성될 수 있다. 또한, 촉매성 항체의 분리는 일반적으로 활성 항체에 대한 노동집약적인 스크리닝이 뒤따르는 전이상태 반응 유사체에의 결합에 대한 초기선별에 의존한다; 역시 이와 대조적으로, RNA 라이브러리를 사용하여 앞서 입증한 바와 같이, RNA-단백질 융합체 라이브러리 접근법을 사용하면 촉매작용에 대한 직접적인 선별이 가능하다. 단백질 효소를 분리하기 위한 대안적인 접근법에서는, 전이상태 유사체 및 직접적인 선별 접근법이 함께 사용된다.
이러한 방법에 의해 수득된 효소는 매우 귀중하다. 예를 들면, 현재, 개선된 화학공정의 개발을 가능케하는 신규하고 효과적인 산업용 촉매에 대한 필요성이 커지고 있다. 본 발명의 주요 장점은 선별이 임의의 조건에서 수행될 수 있으며, 예를 들면, 생체내(in vivo) 조건에 한정되지 않는다는 것이다. 따라서, 본 발명은 선결된 환경(predetermined environments), 예를 들면, 상승된 온도, 압력 또는 용매농도의 환경에서 기능하면서도 매우 특이적인 변환(transformation)을 수행할 수 있는(그리고 그럼으로써 원하지 않는 부생성물의 형성을 최소화할 수 있는) 신규 효소 또는 기존 효소의 개량된 변이체(variant)의 분리를 촉진한다.
시험관내 상호작용 트랩(trap). RNA-단백질 융합 기술은 또한 단백질-단백질 상호작용에 기초하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 신규 유전자를 클로닝하는데도 유용하다. 이러한 방법에 따르면, cDNA 라이브러리가 원하는 소스로부터 제조된다(예를 들면, Ausubel et al., supra, chapter 5의 방법에 의해). 후보 cDNA 각각에 펩티드 수용체(예를 들면, 퓨로마이신 꼬리)가 연결된다(예를 들면, LP77, LP154 및 LP160 생산에 대해 상술한 기술을 사용하여). 이어서, RNA-단백질 융합체를 본원에 기술한 바와 같이 생산한 다음, 이들 융합체(또는 그 융합체의 개량된 버전)가 특정 분자와 상호작용하는 능력을 상술한 바와 같이 시험한다. 만일 원한다면, 이 단계에서 (i) 억제자(suppressor) tRNA를 첨가하여 종결영역을 지나치도록 하거나, (ii) 면역침강에 의해 해독 반응액으로부터 방출인자(release factor)를 제거하거나, (iii) (i)과 (ii)를 조합하거나, 또는 (iv) DNA 서열로부터 종결 코돈 및 3' UTR을 제거함으로써, 종결 코돈 및 3' UTR을 피할 수 있다.
상호작용 단계가 시험관내에서 발생한다는 사실은 비특이적 경쟁자, 온도 및 이온 조건을 사용하여 반응 스트린젠시를 세심하게 조절하는 것을 가능케 한다. 비가수분해성 유사체에 의한 보통의 소분자의 개질(예를 들면, ATP 대 ATPgS)은 동일 분자의 상이한 이형태체(conformer) 간을 구별하는 선별을 제공한다. 이러한 접근법은, 선별된 결합 파트너의 RNA 서열이 공유 결합되어 있고 따라서 용이하게 분리될 수 있기 때문에, 많은 단백질의 클로닝 및 기능적 동정에 유용하다. 또한, 상기 기술은 현재 인간게놈프로젝트에 의해 서열을 결정중인 ~50-100,000 인간 유전자의 기능 및 상호작용을 동정하는데 유용하다.
마이크로칩 포맷에의 RNA-단백질 융합체의 사용
"DNA 칩"은 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 클로닝된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편의 공간적으로 규정된 배열(spatially defined arrays)로 구성되며, 급속 서열결정(rapid sequencing) 및 전사체 프로파일링(transcript profiling)에 응용될 수 있다. RNA-단백질 융합체 혼합물(예를 들면, 세포 DNA 또는 RNA 풀로부터 생산된)을 그러한 DNA 칩에 어닐링함으로써, "단백질 디스플레이 칩(protein disply chip)"을 생산하는 것이 가능한데, 상기 DNA 칩에서 하나의 고정된 서열에 해당하는 각각의 점(spot)은 RNA-단백질 융합체 풀 내의 상응하는 RNA 서열에 어닐링될 수 있다. 이러한 접근법에 의해, 상응하는 단백질은 그 자신의 mRNA에 결합되어 있는 이유로 인하여 공간적으로 규정된 방식으로 고정되고, DNA 서열 세트를 함유한 칩은 상응하는 단백질 세트를 디스플레이한다. 이와 달리, 만일 융합체 라이브러리가 더 작은 cDNA 또는 게놈 DNA 단편으로부터 생산된 경우, 이들 단백질의 펩티드 단편이 디스플레이될 수도 있다.
단백질 및 펩티드의 그러한 정렬된 디스플레이는 많은 용도를 지닌다. 예를 들면, 그들은 예전에 알려지지 않은 단백질-단백질 상호작용을 동정할 수 있는 강력한 도구를 제공한다. 한 특수한 포맷에서는, 프로브 단백질을 검출가능하게 표지(예를 들면, 형광염료에 의해)한 다음, 표지된 단백질을 단백질 디스플레이 칩과 인큐베이션 한다. 이러한 접근법에서, 프로브 단백질에 결합할 수 있는 단백질의 정체는 프로브의 결합 때문에 표지된 칩 상의 점의 위치로부터 결정된다. 다른 응용예는 변형효소(modifying enzyme)(예를 들면, 키나아제, 아실 트랜스페라제, 및 메틸 트랜스페라제)의 작용에 의해 화학적으로 변형된 단백질의 신속한 결정이다. 단백질 디스플레이 칩을 관심있는 효소 및 방사성표지된 기질과 함께 인큐베이션하고 세정한 다음 자동방사선사진술로 분석함으로써, 변형효소의 기질인 단백질의 위치 및 정체가 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 이러한 접근법을 작은 펩티드들의 정렬된 디스플레이와 함께 사용함으로써 그러한 변형 부위(modification site)의 위치를 파악할 수도 있다.
단백질 디스플레이 기술은 임의의 적절한 고형 지지체 상에 고정된 핵산(RNA를 포함하나 바람직하게는 DNA) 배열을 사용하여 이루어질 수도 있다. 예시적인 고형 지지체는 유리(예컨대, 유리판), 실리콘 또는 실리콘 유리(예컨대, 마이크로칩), 또는 금(예컨대, 금판)과 같은 재료로 된 것일 수 있다. 핵산을 그러한 고체표면 상의 정확한 영역에 부착하는 방법, 예를 들면, 포토리소그래피(photolithography) 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에 사용하기 위한 고형 지지체(DNA 칩과 같은)를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 방법에는, 제한 없이, 쉐나 등(Schena et al., Science 270:467-470 (1995)); 코잘 등(Kozal et al., Nature Madicine 2:753-759 (1996)); 쳉 등(Cheng et al., Nucleic Acids Research 24:380-385 (1996)); 립슈츠 등(Lipshutz et al., BioTechniques 19:442-447 (1995)); 피아제 등(Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026 (1994)); 포도르 등(Fodor et al., Nature 364:555-556 (1993)); 파이룽 등(Pirrung et al., 미국특허 제 5,143,854호); 및 포도르 등(Fodor et al., 국제공개 제 92/10092호)의 방법들이 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The General Hospital Corporation
<120> SELECTION OF PROTEINS USING RNA-PROTEIN
FUSIONS
<130> 00786/350KR5
<150> US 09/247,190
<151> 1999-02-09
<160> 38
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 1
gggaggacga aauggaacag aaacugaucu cugaagaaga ccugaacaaa aaaaaaaaaa 60aaaaaaaaaa aaaacc 76
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10
<210> 3
<211> 153
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 3
gggacaauua cuauuuacaa uuacaauggc ugaagaacag aaacugaucu cugaagaaga 60ccugcugcgu aaacgucgug aacagcugaa acacaaacug gaacagcugc guaacucuug 120cgcuaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acc 153
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Random peptide
<221> VARIANT
<222> (1)...(27)
<223> Xaa is any amino acid.
<221> VARIANT
<222> (1)...(34)
<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Leu Arg Asn Ser 20 25 30 Cys Ala
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> Tobacco Mosaic Virus
<400> 5
gggacaauua cuauuuacaa uuaca 25
<210> 6
<211> 10
<212> RNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
ggaggacgaa 10
<210> 7
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys 1 5 10 15 Arg Arg Glu Gln Lys Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser 20 25 30 Cys Ala
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc 29
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 9
aaaaaaaaaa cc 12
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 10
cgcggttttt attttttttt ttcc 24
<210> 11
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 11
ggaggacgaa augaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc 42
<210> 12
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 12
ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc 42
<210> 13
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 13
ggaggacgaa augaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc 42
<210> 14
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 14
ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacc 36
<210> 15
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 15
ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa acc 33
<210> 16
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<400> 16
ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaacc 30
<210> 17
<211> 159
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Translation template
<221> misc_feature
<222> (1)...(289)
<223> n = A,T,C or G
<400> 17
gggacaauua cuauuuacaa uuacaaugnn snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn 60snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsnnsnnsc agcugcguaa 120cucuugcgcu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc 159
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gttcaggtct tcttgagaga tcagtttctg ttccatttcg tcctccctat agtgagtcgt 60atta 64
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
taatacgact cactatag 18
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10
<210> 21
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
agcgcaagag ttacgcagct gttccagttt gtgtttcagc tgttcacgac gtttacgcag 60caggtcttct tcagagatca gtttctgttc ttcagccat 99
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
agcgcaagag ttacgcagct g 21
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatggctga agaacagaaa 60ctg 63
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys 1 5 10 15 Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys 20 25 30 Ala
<210> 25
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primers for RNA pool
<223> n = a, t, c, or g. s = g or c.
<400> 25
ccctgttaat gataaatgtt aatgttacnn snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn 60snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsnnsgtcg acgcattgag 120ataccga 127
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primers for RNA pool
<400> 26
taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta ca 42
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primers for RNA pool
<400> 27
agcgcaagag ttacgcagct g 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA splint
<400> 28
tttttttttt agcgcaaga 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
gtggtatttg tgagccag 18
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Phage T7
<400> 30
taatacgact cactataggg acacttgctt ttgacacaac 40
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA splint
<400> 31
tttttttttt gtggtatttg 20
<210> 32
<211> 124
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
gggacaauua cuauuuacaa uuacaauggc ugaagaacag aaacugaucu cugaagaaga 60ccugcugcgu aaacgucgug aacagcugaa acacaaacug gaacagcugc guaacucuug 120cgcu 124
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA splint
<223> n = a, t, c, or g.
<400> 33
tttttttttt nagcgcaaga 20
<210> 34
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> n = a, g, t, or c. s = c or g.
<400> 34
agcttttggt gcttgtgcat csnnsnnsnn snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn 60snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnctcctcgc ccttgctcac 120cat 123
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
agcttttggt gcttgtgcat c 21
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatggtgag caagggcgag 60gag 63
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA splint
<223> n = a, t, c, or g.
<400> 37
tttttttttt nagcttttgg tgcttg 26
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus my c epitope
<223> Xaa at 2 is Gln or Glu; Xaa at 10 is Leu or Met;
Xaa in all other positions can be any amino acid.
<400> 38
Xaa Xaa Xaa Leu Ile Ser Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10
Claims (23)
- 다음의 단계들을 포함하는 단백질 라이브러리 생산 방법:(a) 각각 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고, 각각이 상기 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결된 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;(b) 상기 단백질 코드화 서열을 시험관내(in vitro) 해독하여 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계; 및(c) 상기 RNA-단백질 융합체 집단을 고염(high salt) 조건하에서 더 인큐베이션하여 단백질 라이브러리를 생산하는 단계.
- 다음의 단계들을 포함하는 DNA 라이브러리 생산 방법:(a) 각각 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고, 각각이 상기 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결된 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;(b) 상기 단백질 코드화 서열을 시험관내(in vitro) 해독하여 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계;(c) 상기 RNA-단백질 융합체 집단을 고염(high salt) 조건하에서 더 인큐베 이션하는 단계; 및(d) 상기 융합체의 RNA 부분 각각으로부터 DNA 분자를 생성하여 DNA 라이브러리를 생산하는 단계.
- 다음의 단계들을 포함하는 목적 단백질 또는 상기 단백질을 코드화하는 핵산의 선별 방법:(a) 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고, 각각이 상기 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩티드 수용체에 작동가능하게 연결된 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;(b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 시험관내(in vitro) 해독하여 후보 RNA-단백질 융합체의 집단을 생성하는 단계;(c) 상기 후보 RNA-단백질 융합체 집단을 고염(high salt) 조건하에서 더 인큐베이션하여 단백질 라이브러리를 생산하는 단계; 및(d) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합체를 선별하여 목적으로 하는 단백질 및 상기 단백질을 코드화하는 핵산을 선별해내는 단계.
- 제 1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 고염이 1가(monovalent) 양이온을 포함하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 1가 양이온이 약 125mM 내지 1.5M 사이의 농도로 존재하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 1가 양이온이 약 300mM 내지 600M 사이의 농도로 존재하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 1가 양이온이 K+ 또는 NH4 +인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 1가 양이온이 Na+인 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계가 대략 실온에서 수행되는 방법.
- 제 1항 내지 3항에 있어서, 상기 고염이 2가(divalent) 양이온을 포함하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 2가 양이온이 약 25mM 내지 200mM 사이의 농도로 존재하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 2가 양이온이 Mg2+인 방법.
- 제 1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 고염이 1가 및 2가 양이온 양자를 포함하는 방법.
- 제 1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자 각각이 정지 서열(pause sequence)을 추가로 포함하거나 또는 상기 RNA 분자의 3' 말단에 공유 결합된 DNA 또는 DNA 유사체 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열의 길이가 리보솜의 디코딩 부위와 펩티드 전달 센터 간의 거리에 걸치기에 충분한 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열이 리보솜의 디코딩 부위에서 펩티드 전달 센터까지의 거리에 걸치며, 상기 거리가 약 60 내지 70Å인 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열의 길이가 약 80 뉴클레오티드 이하인 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열의 길이가 약 45 뉴클레오티드 이하인 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열의 길이가 약 21 내지 30 뉴클레오티드인 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열이 DNA 스플린트(splint)를 사용하여 상기 RNA 분자에 연결되는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 정지 서열 또는 상기 DNA 또는 DNA 유사체 서열이 비뉴클레오티드 단위체(non-nucleotide moiety)를 포함하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 비뉴클레오티드 단위체(non-nucleotide moiety)가 하나 이상의 HO(CH2CH2O)3PO2(폴리에틸렌 글리콜 포스페이트) 단위체인 방법.
- 제 1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-단백질 융합체가 상기 펩티드 수용체에 인접하여 위치한 유연성을 증가시키는 핵산 또는 핵산 유사체 서열을 추가로 포함하는 방법.
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