JP2004535193A - 鋳型化された分子およびかかる分子の使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は鋳型化された分子の合成方法に関する。本発明の一の態様において、鋳型化された分子はその合成をテンプレートした鋳型に連結される。本発明は、例えば、治療活性について、スクリーニングすることのできるライブラリの生成を可能とする。

Description

【０００１】
（技術分野）
生体系では鋳型に依存するα−ペプチドの合成が可能である。本発明は他の型のポリマーならびにα−ペプチドの鋳型に依存する合成を可能とする一の系に関する。本発明は鋳型化された分子（templated molecules）および所定の鋳型に連結される鋳型化された分子に関する。その鋳型化された分子は相互に連結される一連の官能基を含む。各官能基は、まず、鋳型の所定のコード因子を補足する能力を有する因子に連結される。コード因子を補足した後、付着した官能基を連結させ、鋳型化された分子を形成する。
【０００２】
（背景技術）
生物学におけるセントラルドグマは、情報の流れをＤＮＡからＲＮＡへ、そしてポリペプチドへの片道方向として記載する。従って、ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡに転写され、その後当該ｍＲＮＡはリボソームおよびｔＲＮＡにより蛋白に翻訳される。
ＤＮＡと蛋白の間の直接の関係が、すなわち、三重コドンがポリペプチドにおけるα−アミノ酸残基の配列を定義するという事実が、多くの分子生物学的方法の発展を可能としてきた。かかる方法において、実験者はＤＮＡを操作（変異誘発、組換え、削除、挿入等）し、ついでインビボ系（例えば、微生物）またはインビトロ系（例えば、ズバイインビトロ発現系）を用いてその得られた変化をＤＮＡレベルから鋳型化ポリペプチドのレベルに移し、ポリペプチドを変異誘発し、組換え、削除、挿入等する。
【０００３】
ポリペプチドからＤＮＡへの情報の流れを可能とするいくつかの系が創作されている。これらの系はファージ提示、リボソーム／ポリソーム提示、ペプチド−オン−プラスチド提示および他の系である。これらの系は鋳型（例えば、ＤＮＡ）と鋳型化された分子（ポリペプチド）の間に物理結合を導入する。その結果、分子の合成をテンプレートした鋳型に連結された鋳型化された分子の集団から、まず鋳型化された分子の所望の特性を豊富にし（例えば、鋳型化された分子のアフィニティカラムへの結合により）、ついでその鋳型（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の増幅を介してその特性に富んだ鋳型化された分子の集団を増幅させ、つづいてその増幅した鋳型を翻訳することが可能である。これらの方法を用い、百万個ないし約１０１５個のポリペプチドからなるライブラリより、新規および／または改善された特徴を有するポリペプチドを同定した。
【０００４】
従来技術における臨界的特徴は、その鋳型の増幅を介する、鋳型化された分子の増幅性にある。すなわち、所望の特性を有する分子を富ませる選択工程の後で、その特性に富んだ集団を増幅させ、ついでさらに選択工程等に付す。選択−増幅の工程を何度も繰り返す。この方法においては、選択アッセイにおける「ノイズ」は数ラウンドの選択−増幅にわたって平均化され、たとえ個々の選択工程で例えば１０倍に富裕させるだけとしても、１２回の選択−増幅ラウンドの後には理論的に１０１２の富裕に達することができる。分子が増幅されないとすれば、同じ富裕が単一のスクリーニング工程にて達成されなければならず、このことはこの一回の工程での富裕が１０１２でなければならないこと、および該アッセイが全体として同じ厳格性（精度）を有しなければならないことを意味する。これは、実際、現在の技法では不可能である。
【０００５】
化学の分野においては、異なるコンビナトリアル方法が開発されている。この方法は、一のアレイ（各位置に特定の化合物を限定する）にてまたはビーズ（一のビーズが同じ化合物の多くのコピーを担持する）にて数百万個の関連化合物を並列して合成することを含むものである。ついで、化合物の集団を所望の特徴についてスクリーニングする。重要なことは、この型のコンビナトリアルライブラリは増幅の手段がないことであり、したがって上記したように極めて厳格なスクリーニング方法を使用する必要がある。最近では、例えば、医薬品化学における傾向は、多様性はそれほどないが、より特徴付けられたライブラリを用いることである。
化学ライブラリをタグ化するための原理も開発された。例えば、ＤＮＡオリゴを利用して分子ライブラリをタグ化する系が以下に示すように開発された。タグは同定の手段として用いられるが、タグ化された分子の合成を鋳型化するのに用いることはできない。したがって、タグにもかかわらず、これらの系は非常に効率的なスクリーニング法を必要とする。
【０００６】
以下に列挙した文献は本発明の分野における先行技術の上記したいくつかの欠点を示す。
ＥＰ０６０４５５２Ｂ１はオリゴマーの多様的収集物を合成するための方法に関する。該発明はオリゴマーにおけるモノマーの配列を同定するための識別子タグの使用に関する。その識別子タグは、一のライブラリの種々の合成化合物のメンバーが成分方式により成分中に合成される、その後の反応の同定を容易にする。
ＥＰ０６４３７７８Ｂ１はコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリに関する。ポリペプチドの収集物の各々は、各ポリペプチドを特定する「レトロ−遺伝的」方法を提供するための、化学合成により構築された「遺伝的」タグその物の付加によって標識化される。
ＥＰ０７７３２２７Ａ１は、成分方式により成分中に合成することで得られる異なる合成化合物のライブラリを、リガンドまたは受容体に対して、スクリーニングする工程を含む、新規な医薬または診断薬の製法に関する。
【０００７】
米国特許第４８６３８５７号は原ペプチドまたは蛋白の少なくとも一部に相補的なポリペプチドのアミノ酸配列の測定方法に関する。一の態様において、該方法は：（ａ）原ペプチドまたは蛋白の少なくとも一部の生合成をコードする第１核酸の第１ヌクレオチド配列を決定し；（ｂ）該第１核酸の第１ヌクレオチド配列と塩基対を形成する第２核酸の第２ヌクレオチド配列を確かめ、第１および第２核酸を逆平行方向に対合させ；および（ｃ）第１ヌクレオチド配列と同じ読み枠にて読み取った場合に相補的ポリペプチドのアミノ酸配列を第２ヌクレオチド配列により決定する、ことを含む。
【０００８】
米国特許第５１６２２１８号は、特定のリガンドに特異的な結合部位を有し、さらにその結合部位に隣接して活性な機能性部位を有するポリペプチド組成物に関する。その活性な機能性部位は受容体分子であり、その場合、ポリペプチド組成物は標的リガンドのアッセイを行うのに有用である。その結合部位の近くに活性な機能性部位を有するポリペプチドを調製する方法であって、標的リガンドに特異的なポリペプチドをそこに付着する結合基を有するアフィニティ標識と結合させる工程を含む方法も開示する。ついで、反応基をその結合部位に隣接するアミノ酸側鎖に共有結合させ、基質より切断する。その後、ポリペプチドに共有結合した反応基の部分を残して、基質を溶出させる。ついで、活性な機能性部位をその部分に結合させる。
【０００９】
米国特許第５２７０１７０号は宿主細胞をＤＮＡ結合蛋白およびランダムペプチドを含む融合蛋白をコードし、ＤＮＡ結合蛋白の結合部位をもコードする組換えベクターの収集物で形質転換することで構築されたランダムペプチドライブラリに関する。その融合蛋白はリガンドをスクリーニングするのに用いることができる。スクリーニング方法はランダムペプチドを介して受容体に、ＤＮＡ結合蛋白を介して組換えＤＮＡベクターに結合した融合蛋白を含む複合体の形成をもたらす。
米国特許第５５３９０８２号は、相補的一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖と対応するＤＮＡよりも強く結合する能力を有するペプチド核酸として知られている一連の新規な化合物に関する。ペプチド核酸は、一般に、適当なリンカーを介してペプチド骨格に結合した天然に存在するＤＮＡ塩基などのリガンドを含む。
【００１０】
米国特許第５５７４１４１号は、鋳型依存性酵素性核酸合成のためのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを同時合成し、直接標識化するための機能性キャリア物質に関する。そのポリマーキャリアを、順次、標識基またはその前駆体を含有する、核酸のビルディングブロックで負荷させる。このように負荷されたポリマーキャリアは、配列決定分析におけるような、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるような、鋳型依存性酵素性核酸合成のためのプライマーとして用いることのできる、オリゴヌクレオチドの構築のための固相または液相として用いることができる。
米国特許第５５７３９０５号は化学ポリマーとその化学ポリマーの構造を限定する識別子オリゴヌクレオチド配列の両方を有する複数の二官能性分子を含むコード化コンビナトリアル化学ライブラリに関する。そのライブラリの二官能性分子および当該ライブラリを用いてそのライブラリ内にある予め選択された結合相互作用において生物学的に活性な分子に結合する化学構造を同定する方法も記載されている。
【００１１】
米国特許第５５９７６９７号は、ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性核酸ポリメラーゼの阻害剤および活性化剤のスクリーニングアッセイに関する。この発明はＲＮＡおよびＤＮＡ依存性核酸ポリメラーゼの阻害剤または活性化剤である物質を同定および発見するための方法を提供する。該発明の本質的特徴は機能的ポリメラーゼ結合部位配列（ＰＢＳ）を核酸分子中に組み込むことであり、それはＰＢＳの組込みが核酸分子を所定のＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型依存性核酸ポリメラーゼとするように、その配列特異的活性を介して認識できる特性を付与するその能力について選択される。ポリメラーゼ、適当なプライマー分子およびいずれか必須のアクセサリ分子の存在において、鋳型に相補的な核酸の鎖の触媒伸長が起こり、相補鎖または他のポリメラーゼ介在作用のアンチセンス作用により記載されるレポータ−鋳型分子の活性を付与する特徴の部分的または全体的削除（または増加）がもたらされる。
【００１２】
米国特許第５６３９６０３号は、化合物を合成するための一般的な確率論的方法により分子多様性を合成し、スクリーニングする方法に関する。該方法を用いて、有用な特性を有する化合物を同定し、単離するのにスクリーンすることのできる、標的化合物の大きな集合物を生成することができる。
米国特許第５６９８６８５号はモルホリノ−サブ単位コンビナトリアルライブラリおよび選択される巨大分子リガンドと特異的に相互作用する能力を有する化合物を生成する方法に関する。該方法はリガンドを種々のヌクレオバーゼおよび非ヌクレオバーゼ側鎖を有するモルホリノサブ単位からなるオリゴマーのコンビナトリアルライブラリと接触させることを含む。受容体に特異的に結合するオリゴマー分子を単離し、その基底部分の配列を決定する。その方法に有用なオリゴマーのコンビナトリアルライブラリおよび新規なモルホリノサブ単位ポリマー組成物も開示されている。
【００１３】
米国特許第５７０８１５３号は、粒子上にランダムオリゴマーを合成するための一般的な確率論的方法により標識された化合物の多様的集合を合成する方法に関する。当該発明のさらなる態様は粒子上の同定された標識を用い、オリゴマー中のモノマーの配列の同定を容易にすることに関する。
米国特許第５７１９２６２号は、対応するＤＮＡまたはＲＮＡよりも強く相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に結合し、配列特異性および溶解性の増加を示す、ペプチド核酸として知られている、一連の新規な化合物に関する。当該ペプチド核酸は天然に存在するヌクレオバーゼ、およびポリアミド骨格に結合し、アルキルアミン側鎖を含有する、天然に存在しないヌクレオバーゼからなる群より選択されるリガンドを含む。
【００１４】
米国特許第５７２１０９９号はタグでコードされるコード化コンビナトリアルライブラリに関する。コードされるコンビナトリアル化学も提供され、それによれば、同一または異なる情報のビットとして、反応体の選択および段階を特定する有機分子を用いて連続的な合成反応式が記録される。種々の生成物、例えば、オリゴマーおよび合成非反復有機分子、が多段階合成にて生成できる。特に、複数の識別子を用いて、２ないし３個の取り外し可能なタグだけを有する複数の選択肢を定めるのに、二進コードまたはより大きなコードを提供することができる。粒子を目的とする特性、特に結合アフィニティについて、生成物が粒子から取り外されているか、または粒子上に保持されているかについて、スクリーンに付してもよい。その特徴について積極的である粒子の反応歴は、タグの切り離しおよび粒子の反応暦を定める分析により決定することができる。
【００１５】
米国特許第５７２３５９８号は、化学ポリマーおよびその化学ポリマーの構造を定める識別子であるオリゴヌクレオチド配列の両方を有する複数の二官能性分子を含むコードされたコンビナトリアル化学ライブラリに関する。該ライブラリの二官能性分子および該ライブラリを用いて予め選択された結合相互作用にて生物学的に活性な分子に結合するライブラリ内にある化学構造を同定する方法も記載する。
米国特許第５７７０３５８号はラグ化された合成オリゴマーライブラリおよびランダムオリゴマーを合成するための一般的な確率論的方法に関する。この方法を用いて化合物を合成し、所望の特性についてスクリーンすることができる。オリゴマーにおける同定タグの使用は所望の特性を有するオリゴマーの同定を容易にする。
【００１６】
米国特許第５７８６４６１号はアミノ酸側祖を有するペプチド核酸に関する。ペプチド核酸として知られている、一連の新規な化合物は、対応するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖よりも強固に相補性ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖に結合し、増大した配列特異性および溶解性を示す。ペプチド核酸はポリアミド骨格に結合した天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基からなる群より選択されるリガンドを含み、アルキルアミン側鎖を含有する。
米国特許第５７８９１６２号はオリゴマーの多様性集合物の合成方法に関する。粒子上のランダムオリゴマーを合成する一般的な確率論的方法が開示されている。当該発明のさらなる態様は粒子上にて同定タグを用い、オリゴマー中のモノマーの配列の同定を容易にすることである。
【００１７】
米国特許第５８４０４８５号は位相的に分離されたコードされた固相ライブラリに関する。合成試験化合物のライブラリを、合成試験化合物の構造をコードするコード分子をも含有する、別の相合成支持体に結合させる。該分子はポリマーであっても、複合的非ポリマー分子であってもよい。合成試験化合物はアミド、ウレア、カルバメート（すなわち、ウレタン）、エステル、アミノ。スルフィド、ジスルフィドまたはアルカンおよびアルケンなどの炭素−炭素、あるいはそのいずれかの組合せ等の結合を有する骨格構造を有することができる。合成試験化合物はまた分子骨格とすることができ、あるいは骨格としての作用能を有する他の構造物とすることもできる。当該発明はまた、かかるライブラリの合成方法および合成試験化合物のライブラリの中からかかるライブラリを用いて目的とする分子を同定し、特徴付けることに関する。
【００１８】
米国特許第５８４３７０１号は、逆翻訳による系統的ポリペプチド進化に、および標的分子のポリペプチドリガンドの調製方法であって、リボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーを含む候補混合物をその標的とのアフィニティに相関して区分し、増幅させて標的に対してアフィニティを有するリボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーに富む新規な候補混合物を創製する方法に関する。
米国特許第５８４６８３９号はコードされた合成ライブラリをハードタグ化する方法に関する。特定のアミンタグを用いることにより固体支持体にインサイチュにて形成された化合物の構造を決定するための化学的暗号方法であって、化合物を合成した後、支持体上に見られる化合物の構造を解読することのできる方法を開示する。
米国特許第５９２２５４５号は所定の受容体またはエピトープと結合するペプチドおよび一本鎖抗体を同定するための方法および組成物に関する。かかるペプチドおよび抗体は未完成ペプチドを提示するポリソームをアフィニティについてスクリーニングする方法により同定される。
【００１９】
米国特許第５９５８７０３号は、細胞受容体と結合する能力などの、所望の特性を有する化合物について、複合体のライブラリをスクリーニングする方法に関する。かかるライブラリの複合体は、試験化合物、化合物の合成中少なくとも一工程にて記録するタグ、および受容体分子による修飾に感受的なテザーを含む。そのテザーの修飾を用いて一の複合体が所望の特性を有する化合物を含有することを示す。タグを解読して係る化合物の合成中の少なくとも一工程を明らかにすることができる。
米国特許第５９８６０５３号は２個のペプチド核酸鎖と１個の核酸鎖のペプチド核酸の複合体に関する。ペプチド核酸およびペプチド核酸アナログを用いて二本鎖、三本鎖および核酸との他の構造物を形成し、核酸を修飾する。また、ペプチド核酸およびそのアナログを用いて、例えば、核酸の転写停止、転写開始および部位特異的切断を介して蛋白活性を制御している。
【００２０】
米国特許第５９９８１４０号は、二本鎖ＤＮＡとヘテロサイクルのオリゴマーの間で細胞内に複合体、脂肪性アミノ酸、特にオメガアミノ酸および極性末端基を形成する方法および組成物に関する。標的配列およびオリゴマーの組成を適宜選択することにより、解離定数の小さな複合体が得られる。
米国特許第６０６０５９６号は、化学ポリマーおよび化学ポリマーの構造を定義する識別子のオリゴヌクレオチド配列の両方を有する、複数の二官能性分子を含むコードされたコンビナトリアル化学ライブラリに関する。二官能性分子のライブラリも開示されており、そのライブラリの中で予め選択された結合の相互作用にて生物学的に活性な分子に結合する化学構造を同定するのに当該ライブラリを用いる方法も開示されている。
【００２１】
米国特許第６０８０８２６号は鋳型依存性の官能基を導入したジエンの閉環メタセシスおよび開環メタセシス重合に関する。官能基を導入した環状オレフィンおよびそのオレフィンを製造する方法が開示されている。方法は官能基導入の非環状ジエンの鋳型依存性閉環メタセシス（「ＲＣＭ」）および不飽和の部位を一定間隔にて有する官能基導入のポリマーの鋳型依存性脱重合を含む。鋳型種はいずれのアニオン、カチオンまたは二極性化合物であってもよいが、カチオン種、特にアルカリ金属が好ましい。不飽和の部位を一定間隔で有する官能基導入したポリマーおよびそのポリマーの製法も開示されている。これらのポリマーを合成する方法は官能基導入された環状オレフィンの開環メタセシス重合（「ＲＯＭＰ」）によるものである。
売国特許第６１２７１５４号は、生体分子などの所望の分子に相補的な構造を有する化合物に関するものであり、特にインビボまたはインビトロにおける診断薬および治療薬として有用なポリマーまたはオリゴマー化合物が得られる。かかる化合物を生成する種々の方法も提供される。
【００２２】
米国特許第６１４０４９３号はオリゴマーの多様な集合物の合成方法に関する。ランダムオリゴマーを合成する一般的な確率論的な方法が開示されており、所望の特性についてスクリーンするための化合物を合成するのに用いることができる。オリゴマー上にある同定タグは所望の特性を有するオリゴマーの同定を容易にする。
米国特許第６１４０４９６号は、ワトソン−クリック構造に適合するように、相補的非標準的核酸塩基と対をなすことのできる、非標準的核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのビルディングブロックに関する。得られた塩基対は、５員環が６員環と縮合してなる縮合二環式環系と対をなす単環式６員環と、相互に、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られる骨格鎖と類似する骨格鎖に関して、ヘテロサイクルの配向にて結合するが、ＡＴおよびＧＣ塩基対（「非標準塩基対」）に見られるパターンと異なる塩基対を一緒に保持する水素結合のパターンで結合する。
【００２３】
米国特許第６１４３４９７号は、一般的な確率論的な方法により、粒子上にランダムオリゴマーの多様な集合物を合成する方法に関する。その粒子上に配置され、オリゴマー中のモノマーの配列の同定を容易にするのに使用される同定タグも開示されている。
米国特許第６１６５７１７号は粒子上にランダムオリゴマーを合成する一般的な確率論的方法に関する。オリゴマー中のモノマーの配列の同定を容易にする粒子上に配置された同定タグも開示されている。
米国特許第６１７５００１号は官能基導入されたピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオチドならびにＤＮＡを組み入れるその物に関する。修飾されたピリミジンヌクレオチドは、天然に存在するアミノ酸残基の特性を真似る官能基を含有するように、Ｃ５で誘導化されている。その修飾ヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子もまた提供される。
【００２４】
米国特許第６１９４５５０号Ｂ１は逆翻訳による系統的ポリペプチド進化に、および標的分子のポリペプチドリガンドの調製方法であって、リボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーを含む候補混合物をその標的とのアフィニティに相関して区分し、増幅させて標的に対してアフィニティを有するリボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーに富む新規な候補混合物を創製する方法に関する。
米国特許第６２０７４４６号Ｂ１はＲＮＡ−蛋白融合を用いる蛋白分子を選択するための方法および試薬に関する。
米国特許第６２１４５５３号Ｂ１はＲＮＡ−蛋白融合を用いる蛋白分子を選択するための方法および試薬に関する。
【００２５】
ＷＯ９１／０５０５８は新規な遺伝子およびポリペプチドを無細胞合成し、単離する方法に関する。発現単位を構築し、その上にセミランダムヌクレオチド配列を結合させる。まず、セミランダムヌクレオチド配列を転写してＲＮＡを産生し、ついでポリソームが産生される条件下で翻訳する。ついで、目的とする物質に結合するポリソームを単離して分離し；切り離されたｍＲＮＡを回収する。ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを構築し、それを発現させて新規なポリペプチドを産生する。
ＷＯ９２／０２５３６は、標的分子のポリペプチドリガンドを調製する方法であって、リボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーからなる候補混合物をその標的に対するアフィニティについて区分し、標的に対してアフィニティを有するリボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーに富む新規な候補混合物を創製する方法に関する。
【００２６】
ＷＯ９３／０３１７２は、標的分子のポリペプチドリガンドを調製する方法であって、リボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーからなる候補混合物をその標的に対するアフィニティについて区分し、標的に対してアフィニティを有するリボソーム複合体またはｍＲＮＡ：ポリペプチドのコポリマーに富む新規な候補混合物を創製する方法に関する。
ＷＯ９３／０６１２１は粒子上にランダムオリゴマーを合成する一般的な確率論的方法に関する。粒子上に置いて、オリゴマー中のモノマーの配列の同定を容易にする同定タグも開示されている。
ＷＯ００／４７７７５は、塩高含量の翻訳後工程を含む、ＲＮＡ−蛋白の融合体の製法に関する。
【００２７】
さらに、本発明と関連する文献として、Ｂａｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３５６、１９９２、５３７−５３９；Ｂａｒｂａｓら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｖｏｌ．３７、１９９８、２８７２−２８７５；Ｂｅｎｎｅｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ；Ｂｌａｎｃｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１６３、１９８７、５３７−５４５；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８９、１９９２、５３８１−５３８３；Ｂｒｅｓｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．１５５、１９６８、４６５−４７５；Ｄｅｗｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１１７、１９９５、８４７４−８４７５；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ４９、１９８９、１２１−１２９；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１１５、１９９３、３８０８−３８０９；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２１、１９９３、１４０３−１４０８；Ｅｌｍａｒ Ｇｏｃｋｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２４８、１９９１、１３５−１４３；Ｈａｅｕｐｔｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４、１９８６、１４２７−１４４８；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２１３、１９７０、１１５−１２３；Ｈａｍｚａ Ａ．Ｅｌ−Ｄｏｒｒｙ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．８６７、１９８６、２５２−２５５；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、７、１９８８、４０５５−４０６２；Ｈｅｙｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．５７、１９６７、１００２−１００９；Ｈｅｙｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７、１９６８、３２８９−３２９６；Ｈｏｏｐｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｖｏｌ．１０、１９９１、２２３−２３１；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６３、１９７６、９−１４；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２５、１９８６、５５１８−５５２５；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．３４、１９９５、２０１−２０２；Ｌｅｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６、１９８７、７１１３−７１２１；Ｍａｃｌｅａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９４、１９９７、２８０５−２８１０；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９１、１９９４、９０２２−９０２６；Ｍｅｎｎｉｎｇｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２１、１９８２、８１１−８１８；Ｍｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２４０、１９７１、２３７−２４３；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１７０、１９８９、３８６−４０８；Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．１６、１９８８、５１９−５３５；Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２４、１９８９、１８２−１８８；Ｐａｓｈｅｖら、ＴＩＢＳ Ｖｏｌ．１６、１９９１、３２３−３２６；Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３、１９８８、７６７８−７６８５；Ｐａｎｓｅｇｒａｕら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６５、１９９０、１０６３７−１０６４４；Ｐｅｅｔｅｒｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．３６、１９７３、２１７−２２１；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９４、１９９７、１２２９７−１２３０２；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２５、１９９７、４７９７−４８０２；Ｓｃｈｕｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４、１９７７、７１−８４；Ｓｏｌｏｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８２．１９８５、６４７０−６４７４；Ｓｕｇｉｎｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８、１９８０、３８６５−３８７４；Ｔａｒａｓｏｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．４８、１９９８、２９−３７；Ｗｉｅｇａｎｄら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４、１９９７、６７５−６８３；およびＷｏｗｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１９８９、５２３２−５２３６；が挙げられる
【００２８】
（発明の開示）
本発明は従来技術における上記した問題および欠点を一般的方法にて解決する。本発明は、一般に、ポリマーなどの分子を鋳型化する系に関するものであり、鋳型によってポリマーの鋳型化合成が可能となり、好ましい具体例においては、ポリマーを増幅させる。従って、本発明の系は、全体として天然の系と同じ特徴（鋳型から鋳型化された分子への情報の流れ）を有し、ならびに最近になって見出されたリゾソーム介在系の特徴（例えば、ファージ提示）を有する、すなわち、鋳型と鋳型化された分子の間には物理的な関係がある。しかしながら、本発明はリボソームまたはｔＲＮＡに関連するものではなく、したがって核酸のリゾソーム介在翻訳に基づく天然の系では合成できないポリマーを含む、多種多様なポリマーを鋳型化することができる。
【００２９】
本発明の鋳型化法は従来技術に比べて有意な効果を有する。回収される分子（すなわち、その鋳型）の増幅は、回収される鋳型がすべて同じ区画（例えば、試薬管またはマイクロタイタープレートウェル）にあり、その分子が比例して増幅されるところの、並行処理により行うことができるため、個々の分子の配列決定のようなヒトの介入は必要ではない。第１ラウンドの選択後の典型的な回収物には、例えば、１０１０個の異なる分子が含まれているため、出発物質が、例えば、１０１５個の分子のライブラリである場合に、このことは極めて大きな利点である。このような多数の分子を用いる場合、１０１０個の分子を一度にコピーすることで当該分子を「増幅」することは、すなわち、一連の工程にて当該分子を「増幅」することは、実際には不可能である。
本発明は、一般に、鋳型化された分子に、およびその鋳型化された分子の鋳型依存性合成に定方向性の一の鋳型に連結されているかかる分子を含む複合体に関する。一の態様において、本発明の方法によれば、鋳型化された分子および複合体を得ることができる。
【００３０】
本発明はまた、かかる鋳型化された分子および／または複合体の合成方法、かかる分子および／または複合体を標的種に標的化させる方法を開示する。鋳型化された分子は、官能基と共有結合し、鋳型化された分子を形成する能力を有する反応基を含む、機能的部分（functional entity）からなるビルディングブロックから合成されることが好ましい。ビルディングブロックの機能的部分は切断可能なリンカーまたは選択的に切断可能なリンカーにより相補因子から分離されている。その相補因子は鋳型の所定のコード因子を補足する能力を有し、それによりコード因子または相補因子と、機能的部分または官能基の間の一対一の関係が保証される。
さらには、鋳型化された分子の官能基の配列を同定する方法ならびに本発明に係る鋳型化された分子を有効に利用する治療および診断方法も開示される。
【００３１】
本発明の方法はリボ核酸のリボソーム介在翻訳を含まない。また、鋳型化された分子がｉ）独占的にα−アミノ酸、またはｉｉ）少なくとも８０％などの、例えば９０％の、９５％などの実質的には独占的に天然に存在するアミノ酸、のいずれかを含むペプチドである場合、鋳型はリボ核酸を含まないか、本質的にリボ核酸からなるものではない。
鋳型とは、コード因子の配列であって、各コード因子が隣接するコード因子に連結しているものをいう。相補鋳型とは、相補因子の配列であって、各相補因子が隣接する相補因子に連結しているものという。
【００３２】
一の相補因子で一のコード因子を補完するか、あるいは複数の相補因子で複数のコード因子を補完すると、各相補因子は、相補鋳型の一部そのものを形成することなく、隣接する相補因子により限定される隣接する官能基との結合能を有する付加される官能基を定義するであろう。したがって、一の好ましい具体例において、官能基は、コード因子と官能基の間で直接反応またはハイブリッド形成が起こらない限り、コード因子の補完に関与しない。「反応」なる語は、官能基とコード因子の間の、相互作用−共有または非共有−の形成をもたらす反応的接触を意味する。もうひとつ別の具体例においては、鋳型化された分子の官能基は相補的意柄の一部を形成する。
相補因子は、各々、鋳型の所定のコード因子を認識する能力を有し、かつコード因子は、各々、順次、所定の官能基を定義するため、鋳型のコード因子の配列は一連の所定の共有結合した官能基を含む鋳型された分子の合成を定型化するであろう。
【００３３】
本発明の好ましい具体例によれば、以下のこと：
ｉ）複数の官能基を含む鋳型化された分子を鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結させること、
ｉｉ）隣接する官能基を定義する相補因子によって隣接するコード因子を補完すると同時にその隣接する官能基を連結させること、
ｉｉｉ）隣接する官能基を定義する相補因子によって隣接するコード因子を補完した後、その隣接する官能基を連結させること、
ｉｖ）相補鋳型を形成すると同時に隣接する官能基を連結させること、
ｖ）相補鋳型を形成した後に隣接する官能基を連結させること、
ｖｉ）鋳型化された分子の官能基の間の連結を切断することなく、相補鋳型の相補因子の間の相補因子間の１またはそれ以上の結合を切断すること、逆も同様である、
ｖｉｉ）相補鋳型を切断することなく、少なくとも１つの機能的部分を一のビルディングブロックの少なくとも１つの相補因子から分離する少なくとも１つのリンカーを切断すること、
ｖｉｉｉ）鋳型化された分子の官能基間の連結を切断することなく、少なくとも１つの機能的部分を一のビルディングブロックの少なくとも１つの相補因子から分離する少なくとも１つのリンカーを切断すること、および
ｉｘ）相補鋳型を切断することなく、かつ鋳型化された分子の官能基間の連結を切断することなく、少なくとも１つの機能的部分を一のビルディングブロックの少なくとも１つの相補因子から分離する少なくとも１つのリンカーを切断すること
が可能である。
【００３４】
ただし、隣接するコード因子の補完がなされたならば、鋳型化された分子の隣接する官能基は、相補鋳型が形成されるかどうかとは関係なく、連結能を有する。また、隣接する官能基を連結させ、その後、鋳型化された分子の隣接する官能基間の連結を切断することなく、機能的部分をその機能的部分を特定する相補因子から分離する切断可能なリンカーを切断することも可能である。切断可能なリンカーは、選択的に切断可能なリンカーが切断できないような条件下で切断可能である。したがって、同じ鋳型化された分子内にある、相補因子および官能基の一部を連結している選択的に切断可能なリンカーを同時に切断することなく、相補因子および鋳型化された分子中の官能基を連結する切断可能なリンカーを切断することが可能である。かくして、鋳型化された分子と、その鋳型化された分子の鋳型介在合成を指令する鋳型を含む複合体であって、鋳型および鋳型化された分子が１またはそれ以上の、好ましくは１つの、選択的に切断可能なリンカーにより連結されている複合体を得ることが可能である。
【００３５】
付加的な鋳型化された分子の生成は、配列決定することなく、あるいは他の形態の特徴化をすることなく、鋳型により指令されうる。このことは段階的合成により生成される従来技術の「タグ」を用いてはできない。したがって、鋳型に連結されている鋳型化された分子を含む本発明の複合体は、所望の鋳型化された分子を速やかに選択かつ増幅することを可能とする。
【００３６】
第１の態様において、本発明は、複数の官能基を含む鋳型化された分子を合成する方法であって、以下の工程：
（ｉ）一の配列がｎ個のコード因子を含む少なくとも１つの鋳型を準備し、
ここで各コード因子は所定の相補因子を認識する能力を有する少なくとも１個の認識基を含み、かつｎは１より大きい整数であり；
（ｉｉ）複数のビルディングブロックを準備し、
ここでビルディングブロックは、各々、
ａ）所定のコード因子を認識する能力を有する少なくとも１個の認識基を含む少なくとも１個の相補因子と、
ｂ）少なくとも１個の官能基および少なくとも１個の反応基を含む少なくとも１個の機能的部分と、
ｃ）少なくとも１個の機能的部分を少なくとも１個の相補因子から分離する少なくとも１個のリンカーとを、含み；
（ｉｉｉ）各コード因子をそのコード因子の認識能を有する相補因子と接触させ；
（ｉｖ）相補因子を得てもよく；
（ｖ）反応基の関与する反応によって、少なくとも１個の機能的部分の官能基を別の機能的部分の官能基に連結させることで、共有結合した官能基を含む鋳型化された分子を得、
ここでその鋳型化された分子は、一のリンカーにより、その相補鋳型に、または鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結される能力を有し、
ここで鋳型化された分子の合成は核酸のリボゾーム介在翻訳を含まない；
工程を含む、鋳型化された分子の合成方法を提供する。
【００３７】
もうひとつ別の態様において、本発明は、一の鋳型化された分子、複数の同じまたは異なる鋳型化された分子に関するものであり、鋳型化された分子は、各々、本発明にかかる鋳型化された分子の合成方法により得られることが好ましい。
鋳型化された分子と鋳型は単一のリンカーにより連結されうる別個の実体であるため、本発明はまた、鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結されている鋳型化された分子を含む鋳型に関する。鋳型化された分子の合成を定型化しうる鋳型はコード因子の配列または相補因子の配列のいずれかを含み、その場合において、当該鋳型は相補鋳型である。したがって、相補鋳型または鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型を切断することなく、鋳型化された分子の官能基の間の結合を切断することが可能である。
【００３８】
もうひとつ別の態様において、鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結されている鋳型化された分子を含む複合体の合成方法であって、鋳型化された分子および鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結されている鋳型化された分子を含む複合体は、本発明に係るその合成方法により得ることができる、方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、複数の鋳型化された分子を含む組成物であって、鋳型化された分子の各々が、あるいはその少なくともいくつかが鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結されている一の組成物が提供され、かかる場合には、各々が一の鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型に連結されているその鋳型化された分子を含む複数の複合体が提供される。組成物はまた、鋳型化された分子、およびそれに連結されていない、鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型を含む。
【００３９】
ライブラリの鋳型化された分子の増幅能は独特な特徴を有するライブラリを提供する。この独特な特徴は、例えば、選択と増幅の工程を繰り返すことを通して、ライブラリを、分子のライブラリを全体として処理し、選択と増幅のラウンドの間に個々の分子を（あるいは分子の集合さえも）特徴付ける必要のない並行工程に置くことによって、膨大な数の鋳型化された分子をスクリーニングできることを含む。
本発明の種々の好ましい具体例によれば、例えば、約１０３種以上の鋳型化された分子を、約１０４種以上の鋳型化された分子などを、
例えば、約１０５種以上の鋳型化された分子を、約１０６種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０７種以上の鋳型化された分子を、約１０８種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０９種以上の鋳型化された分子を、約１０１０種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０１１種以上の鋳型化された分子を、約１０１２種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０１３種以上の鋳型化された分子を、約１０１４種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０１５種以上の鋳型化された分子を、約１０１６種以上の鋳型化された分子などを、例えば、約１０１７種以上の鋳型化された分子を、約１０１８種以上の鋳型化された分子などをスクリーニングすることが可能である。
【００４０】
並行選択および並行増幅の繰り返しラウンドを何回も行うことができるため、各ラウンドにて例えば１００倍だけ豊富化させ、多数の選択と増幅のラウンドを通して例えば１０１４倍の極めて効果的な豊富化を得ることも可能である（各々、１００倍に豊富化するラウンドを７回行うと、理論的には、１０１４倍の豊富化が得られる）。増幅できないライブラリを用いて１０１４倍の同じような豊富化を獲得するには、一回の「ラウンド」にて１０１４倍の豊富化を可能とする条件が必要とされ、実際、現状のスクリーニング技法を用いて行うことはできない。鋳型化された分子および／または鋳型はその上固体または半固体支持体に結合させることもできる。
【００４１】
さらなる態様において、本発明の方法は、個々にまたは集合的に、以下の方法：
所定の活性を有する可能性のある複合体または鋳型化された分子の組成物をスクリーニングする方法、
複合体または鋳型化された分子と結合する可能性のある所定の活性をアッセイする方法、
所定の活性を有する複合体または鋳型化された分子を選択する方法、
所定の活性を有するまたは有する可能性のある鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型を増幅する方法、および
所定の活性を有するまたは有する可能性のある鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型を増幅する方法であって、少なくとも２倍増加した量の鋳型化された分子を得るさらなる工程を含む方法、に関する。
【００４２】
もうひとつ別の態様において、新しいまたは改変された官能基の配列を含む鋳型化された分子を生成することを含む、鋳型化された分子の配列を改変する方法であって、最初の鋳型化された分子の合成を定型化する鋳型を変異させる工程を含む方法が提供される。当該方法は、以下の工程：
ｉ）第１鋳型化された分子を定型化することのできる第１鋳型あるいは複数の第１鋳型分子を定型化することのできる複数のかかる鋳型を準備する工程；
ｉｉ）第１鋳型または複数の第１鋳型の配列を修飾し、第２鋳型または複数の第２鋳型を生成する工程であって、
ここで、当該第２鋳型は第２鋳型化された分子または複数の第２鋳型化された分子の合成を定型化することができ、
当該第２鋳型化された分子は、第１鋳型化された分子の官能基の配列と同じでない、共有結合した官能基の配列を含む、工程；所望により、
ｉｉｉ）当該第２鋳型により、第２鋳型化された分子または複数のかかる第２鋳型化された分子を定型化する工程、を含むことが好ましい。
【００４３】
上記した方法は、一の具体例において、鋳型化合成（図１）が鋳型の形態の一本鎖の修飾可能な中間体と関係していることを有効に利用するものである。この鋳型がデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むヌクレオチド鎖を含む場合において、大抵の分子生物学的方法は鋳型を修飾するのに用いることができ、したがって鋳型化ポリマーを修飾するのに用いることができる。
したがって、本発明の鋳型化ポリマーに適用することができる以下に列挙する分子生物学的方法は、決して包括的なものではなく、少しでも関係する分子生物学的方法は本発明の結果として鋳型化ポリマーに適用できることを説明するのに役立つにすぎない。
【００４４】
天然に存在しない塩基を有するヌクレオチドが鋳型の一部である場合において、分子生物学的方法のいくつかは利用することができない。このことは、主に、関連する酵素（例えば、ＰＣＲ反応のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ；ＵＳＥプロトコルの制限酵素など）の基質特異性によるものであろう。また、インビボ工程（例えば、プラスミドＤＮＡを増幅するためのイー・コリの形質転換）にて関与する方法はこれらのヌクレオチドについて一定の実現可能性があるだけかもしれない。しかし、天然に存在しない数種のヌクレオチドは、数種の野生型および変異型のポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドに組み込まれ、したがって天然に存在しない塩基を有するヌクレオチドの使用は鋳型化された分子に適用することのできるインビトロにおける分子生物学的方法の数を著しく制限しないことが知られている。
【００４５】
表１ 本発明の鋳型化ポリマーに適用可能な分子生物学
・インビボおよびインビトロ増幅、組換えおよび変異誘発
・一または複数（例えば、５０個）の種々の変異原性オリゴを飽和濃度以下で使用する、すなわちコンビナトリアルライブラリを作製する、クンケル部位特異的変異誘発
・一または複数（例えば、５０個）の種々の変異原性オリゴを飽和濃度以下で使用する、すなわちコンビナトリアルライブラリを作製する、ＵＳＥ（独特な部位特異的排除）
・ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
・ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）
・ファミリーシャフリング（特定の相同性を有するブロックを含有する配列をシャッフルする）およびシャフリング工程を特定の方向に向けるのにオリゴをその反応中にスパイクする定方向性シャフリングを含む、ＰＣＲシャフリング
・他の型のシャフリング、例えば、酵母における相同的組換え；会社Ｐｈｙｌｏｓ、Ｅｎｅｒｇｙ Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅｒｍｓ、ＤｉｖｅｒｓａおよびＦｒａｎｃｅｓ Ａｒｎｏｌｄで開発されたシャフリングプロトコル
・カセット変異誘発
・他のポリメラーゼ−またはＰＣＲを基礎とする方法、例えば、オーバーラップ伸長法、遺伝子合成および変異性ＰＣＲ
・化学的またはＵＶ誘発的変異誘発
・野生型または変異型鋳型合成および鋳型化ポリマーへの翻訳（野生型は、この点に関して、既知の（「野生型」）ポリマーの合成を定型化するであろう鋳型配列を意味する；変異型は、この点に関して、既知のポリマーの変種の合成を定型化するであろう一部無作為のまたはスパイクされた配列を意味する）
・制限酵素による特異的切断
・ＤＮＡまたハＲＮＡリガーゼによるライゲーション；「遺伝子スプライシング」
・アフィニティ選択（鋳型−鋳型化ポリマー複合体を用いる）
・配列決定
・ＤＮＡアレイと結合するタグとして鋳型を用いることによる、「ＤＮＡチップ」上のポリマーのアレイニング
【００４６】
（誘導化されていない）鋳型鎖を単離するのではなく、分子生物学的方法を鋳型−相補鋳型二重螺旋に、または誘導された相補鋳型のいずれかに適用することが望ましい。その誘導された鋳型はこの時点で重合されていない機能的部分；重合された機能的部分；または切断の後で微量に残っている機能的部分と相補因子をつなぐリンカーを含有していてもよい。多くのポリメラーゼおよび他の酵素が高度に誘導されているＤＮＡ−またはＲＮＡ−鋳型を許容することが知られている。したがって、ポリメラーゼおよび他の酵素と関係する多くのインビトロ方法は出発点としての（誘導化されている）相補鋳型の使用を実施可能とするようである。それは主として、問題の分子生物学的方法の出発点として誘導化されている相補鋳型を用いることが実施可能であるかどうかを含め、酵素の基質−または鋳型特異性に依存するであろう。当業者はこの点に関して種々の実践方法の実施可能性を評価できるであろう。
【００４７】
本発明はまた、鋳型化された分子を合成するために用いられるビルディングブロックに、およびかかるビルディングブロックを含む複合体に関する。もうひとつ別の態様において、本発明の鋳型化された分子を合成するためのビルディングブロックの使用が提供される。この態様の好ましい具体例において、鋳型化された分子は標的分子実体または結合パートナーの形態の他の分子実体との結合能を有する分子実体を含むまたは本質的にその実体からなる。
鋳型化された分子は、医薬上有効な量の医薬組成物を一の個体に投与することができ、かかる治療を必要とする当該個体にて病状を治療することのできる医薬であることが好ましい。
【００４８】
本発明の他の態様において、除草組成物、殺虫組成物、殺菌組成物および殺真菌組成物ならびにかかる組成物を調製する方法およびその使用が提供される。この場合、各組成物は所望の効果を得るのに効果的な量の本発明の鋳型化された分子を含む。
さらなる態様において、医薬または診断薬を同定する方法が提供される。ここで、該方法は複数の標的薬物を少なくとも１個の所定の鋳型化された分子を用いてスクリーニングし、当該標的薬剤と相互作用することのできる候補鋳型化された分子の形態の医薬または診断薬を同定する工程を含む。
【００４９】
もうひとつ別の態様において、標的薬剤を含む、標的物を同定する方法であって、複数のリガンドまたは受容体部分を少なくとも１個の所定の鋳型化された分子を用いてスクリーニングし、当該鋳型化された分子と相互作用しうるリガンドまたは受容体部分の形態の薬物標的を同定する工程を含む、方法が提供される。
本発明はまた、薬物標的を含む、所定の標的に対してアフィニティを有する単離または精製された鋳型化された分子に、ならびに薬物標的を含む、リガンド、受容体部分、酵素、細胞表面、固体または半固体表面の形態の標的に、ならびに所定の鋳型化された分子に対してアフィニティを有する他の物理的または分子的存在もしくは表面に関する。
【００５０】
さらにもうひとつ別の態様において、それを必要とする個体の治療方法であって、当該個体に医薬上有効量の本発明の方法により同定され、薬物標的を含む、所定の標的に対してアフィニティを有する分子を投与することを含む、方法が提供される。
さらなる態様において、それを必要とする個体の治療方法であって、当該個体に医薬上有効量の本発明の所定の鋳型化された分子に対してアフィニティを有する単離または精製されたリガンドまたは受容体部分を投与することを含む方法が提供される。当該単離または精製されたリガンドまたは受容体部分は本発明の上記した同定方法により同定されることが好ましい。
【００５１】
本発明はいくつかの具体例により行うことができる。第１の具体例において、相補因子をコード因子と接触させる工程は１またはそれ以上のポリメラーゼまたはトランスクリプターゼが関与する。かくして、この具体例によれば、ビルディングブロックはヌクレオチド誘導体である。この第１の具体例の一の態様において、モノヌクレオチドであるが、ビルディングブロックはジ−またはオリゴヌクレオチドであってもよい。モノヌクレオチドはポリメラーゼおよびトランスクリプターゼについての天然の基質であり、ＷＯ０１／１６３６６の方法に従ってオリゴヌクレオチドを組み込むことができる。そのモノ−またはオリゴヌクロチド誘導体は補足因子として供する。１またはそれ以上のリンカーは一端でモノ−またはオリゴヌクレオチド誘導体に結合され、別の端部で機能的実在に結合される。特に、相補因子がモノヌクレオチド誘導体である場合において、機能的実在が二重鎖螺旋の主溝中に突出し、隣接する機能的実体が相互に連結を形成するように、リンカーが結合していることが好ましい。
【００５２】
本発明の第２の具体例において、相補因子としてのモノ−またはオリゴヌクレオチドを含むビルディングブロックを化学的に相互にライゲートさせる。５’−ホスホイミダゾリドなどの、化学的ライゲートの方法がいくつか当該分野にて公知である（Ｖｉｓｓｃｈｅｒ，Ｊ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｗ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ １９８８、２８、３−６；Ｚｈａｏ，Ｙ．；Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ． Ｊ．おｒｇ。Ｃｈｅｍ．１９９８、６３、７５６８−７５７２）または３’−ホスホチオエート法（Ａｌｖａｒｅｚら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、６４、６３１９−２８、Ｐｉｒｒｕｎｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）、６３、２４１−４６）。）。
本発明の第３の具体例において、相補因子としてのオリゴヌクレオチドを含むビルディングブロックがリガーゼ酵素を用いて相互にライゲートされる。
【００５３】
本発明の第４の具体例において、ビルディングブロックは相補因子としてオリゴヌクレオチドを含み、そのオリゴヌクレオチドはプライマーまたは他の相補因子にライゲートさせる必要がなく、鋳型に付着させるのに十分な長さを有する。
ビルディングブロックは、一般に、相補因子を鋳型と接触させるのに使用される方法および鋳型化された分子の製造に適合される。一例として、モノヌクレオチド誘導体を用いる場合、リンカーは相対的に短くすることができるが、それに対してビルディングブロックとしてオリゴヌクレオチドが用いられる場合、リンカーはかなり長いことが必要である。
【００５４】
（図面の簡単な記載）
次の記号を以下の図面において当該システムの一般的特徴を示すのに用いる。図１、７Ｃ、８Ｃ、１１、１１ｅｘ．１、１７、１７ｅｘ．１、１２、１３、１４、１４ｅｘ．１−２、１５、１５ｅｘ．１−７、１７、１７ｅｘ．１−２、１９、１９ｅｘ．１−３、２０、２１および２２Ａにおいて、長い横線は、鋳型、相補鋳型または鋳型と相補鋳型との複合体を示す。明確にするために、いくつかの図では、活性化工程ではなく、重合工程だけを示す。Ｒｘは官能基を示す。
【００５５】
図１ 鋳型化された分子の化学的提示−原理
鋳型化された分子の化学的提示のプロトコルは、６工程、ｉ）組込み、ｉｉ）重合、ｉｉｉ）活性化、ｉｖ）選択／スクリーニング、ｖ）増幅、およびｖｉ）特徴化に分けることができる。組込みとはビルディングブロックを相補鋳型に組み込むことを意味し、その配列は鋳型により決定される。
組込みはポリメラーゼまたはリガーゼなどの酵素により媒介される。鋳型は一端または両端に（鋳型の増幅を可能とする）プライマー結合部位を含む。鋳型の残りの部分はランダムであっても、部分的にランダムであってもよく、または所定の配列とすることもできる。相補因子は、好ましくは、機能的部分と、相補因子と、機能的部分および相補因子を連結するリンカーとを含む。選択される相補因子、その組込み、重合および活性化の例を詳細に記載する（図７および８）。
【００５６】
重合とは、組み込まれたビルディングブロックを反応させ、それにより既に相補因子との間に存在する機能的結合に加えて、機能的部分の間に共有結合を形成することを意味する。活性化とは、一連の機能的部分を鋳型に、または機能的部分を含む鋳型化された分子を鋳型化する相補鋳型に連結するリンカーのいくつか、一つだけを除いてすべて、またはすべてを切断することを意味する。活性化はまた、機能的部分と相補鋳型を連結するリンカーを切断することなく、鋳型と相補鋳型とを分離することを意味する。
選択およびスクリーニングとは、鋳型−鋳型化された分子の対の個体群を所望の特性について豊富にさせることを意味する。
【００５７】
増幅は、鋳型または相補鋳型を増幅することにより、より多くの鋳型−鋳型化された分子の対を産生し、選択／スクリーニングのさらなるラウンドのために、あるいは配列決定または他の特徴化のためにより多くの鋳型−鋳型化された分子の対を産生することを意味する。
クローニングおよび配列決定は、単離された鋳型または相補鋳型をクローニングし、つづいて特徴化することを意味する。あるケースでは、単離された鋳型または相補鋳型の個体群を配列決定することが望ましく、そのため、個々の配列のクローニングは不要である。
【００５８】
図２Ａおよび２Ｂ 広範囲に及ぶ塩基対の配列
当該図は、ワトソン−クリック水素結合則に従う、天然および天然以外の塩基対の配列を開示する。この塩基対は、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第６０３７１２０号に開示されている。
【００５９】
図３ モノマービルディングブロック
ビルディングブロックは、選択的に切断可能なリンカーを介して相補因子に連結した、機能的部分からなるか、または本質的にそれらからなる。相補因子は、各々、２つの別の相補因子と反応しうる、２つの反応基（Ｉ型）を有する。その相補因子は相補的コード因子と相互作用する認識基を含有する（コード因子は図示せず）。この場合の機能的部分は、他の機能的部分の反応基と反応しうる、２つの反応基（ＩＩ型）と、官能基（機能性とも言われる）とからなるか、または本質的にそれらからなる。ＩＩ型反応基およびその反応基と連結する分子部分は得られるコード化されたポリマーの骨格（の一部）となるであろう。
【００６０】
図４ ＩＩ型反応基を一つだけ有するモノマービルディングブロック
ビルディングブロックは、選択的に切断可能なリンカーを介して相補因子に連結した、機能的部分からなるか、または本質的にそれらからなる。相補因子は、各々、別の相補因子と反応しうる、２つの反応基（Ｉ型）を有する。その相補因子は相補的コード因子と相互作用する認識基を含有する（コード因子は図示せず）。この場合の機能的部分は、他の機能的部分の反応基と反応しうる、一つの反応基（ＩＩ型）と、官能基（機能性とも言われる）とからなるか、または本質的にそれらからなる。ＩＩ型反応基は得られるコード化されたポリマーの骨格（の一部）となるであろう。
【００６１】
図５ ビルディングブロックおよびビルディングブロックの鋳型指令の組込みから得られるポリマーならびにその重合および活性化
図３は個々のビルディングブロックの外観の詳細な記載を開示する。３つの異なる相補因子が示されており、その各々が個々の機能的部分に連結する。図の右半分は相補的塩基対合によりビルディングブロックの組込みを指令する鋳型を含む。
Ａ）相補因子の反応基Ｉ型が反応し、その反応基の一部を喪失する（例えば、ヌクレオシド三リン酸の組込みのＰＰｉ）。図示されている例示において、ＩＩ型反応基の重合もまた、反応基の一部の喪失をもたらす。得られたポリマーの骨格は最初のＩＩ型反応基の一部および反応基と結合する分子存在とからなるか、または本質的にそれらからなる。リンカーの一部は機能的部分に付着して残っている。
Ｂ）Ｉ型反応基を（Ａ）と同様に反応させる。ＩＩ型反応基は直接反応せず、むしろ「架橋分子」が加えられる。この架橋分子を反応させると、反応基の一部を喪失する。この例において用いられる切断可能なリンカーはいわゆる「トレースレスリンカー」であり、そのためわずかなリンカー分子も残さず機能的部分より切り離される。
Ｃ）このケースにおいて、組込みは個々の相補因子のカップリングを意味するものではない。すなわち、Ｉ型反応基の反応に至るものではない。ＩＩ型反応基は（Ｂ）と同様に架橋分子と反応している。
Ｄ）機能的部分はＩＩ型反応基を一つだけ含有する。ＩＩ型反応基は架橋分子と反応している。
【００６２】
図６ ビルディングブロックとしての誘導化ヌクレオチド
ヌクレオチドビルディングブロックは、相補因子（ヌクレオチド）と、選択的に切断可能なリンカー（この場合、ジスルフィド）で連結されている機能的部分（この場合にはカルボン酸）とからなるか、または本質的にそれらからなる。ヌクレオチドのＩ型反応基は、図示されているように、三リン酸およびヒドロキシル基である。ヌクレオチドの認識基は塩基である。機能的部分は、一の官能基（ヒドロキシル）、二つのＩＩ型反応基（カルボン酸）および二つの反応基を連結する一の骨格構造（芳香族環）からなるか、または本質的にそれらからなる。最後に、リンカー（ジスルフィド）は例えばＤＴＴで切断可能である。
【００６３】
ビルディングブロックとしての誘導化ジヌクレオチド
相補因子は、認識基を含む修飾ｄＡ−ｄＵジヌクレオチド、この場合、アデニンおよびウラシル塩基である。それを切断可能なプロパルギルエステル結合を介して機能的部分に連結する。塩基切断されると、当該リンカーは官能基、カルボン酸を切り離す。ジヌクレオチドのＩ型反応基はヒドロキシル基およびホホロ（２−メチル）イミダゾリドである。ＩＩ型反応基は図示されるようにアミノ基およびアミノ酸のカルボン酸である。
【００６４】
ビルディングブロックとしての誘導化オリゴ−ヌクレオチド
相補因子は少なくとも２０個の塩基の図示されるオリゴヌクレオチドである。それは、５’−リン酸基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分に連結したメルカプトヘキサンスペーサーで修飾されているシトシンデオキシリボヌクレオチドを含む市販のホスホルアミダイト（Glen researchの10-1853-95）を用い、４０個の塩基（Ｂは内部ビオチンである）を含むオリゴヌクレオチドを介して機能的部分、Ｎ−Ｂｏｃβアミノ酸に連結される。ＩＩ型反応基はＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分の酸素原子に結合したカルボン酸である。それは、例えば、アミンによる求核攻撃に対して感受的である。
【００６５】
図７ β−ジペプチドのＣ−末端タグ付加−組込み、重合および活性化
Ａ）プライマーおよび２つのモノマービルディングブロックの構造。開始分子をプライマーの３’−末端ｄＵの５−位に結合させる。開始剤はＦｍｏｃ−保護アミンである。ｄＵＴＰ−誘導体は光保護されたヒドロキシル基を有する。そのヒドロキシル基をＮ−チオカルボキシアンヒドリド（ＮＴＡ）環構造にカップリングさせる。ｄＡＴＰ誘導体を７位で修飾する。光保護されたアミンをそのＮＴＡとカップリングさせる。
【００６６】
Ｂ）ポリメラーゼによりｄＵＴＰおよびｄＡＴＰを組み込むことでプライマー（鋳型とアニールする；図示せず）をその３’−末端から伸長させる。ついで、開始剤をピペリジンにより活性化させ、第一アミンを切り離す。その第一アミンは隣のＮＴＡを攻撃し、ＮＴＡ環を開環させ、ＣＳＯを切り離し、その結果、第一アミンを生成する。この第一アミンはアレイにある次のＮＴＡ単位を攻撃する。その結果、その官能基（ＯＨおよびＮＨ２）を介してＤＮＡ鎖に結合するポリマーが形成される。最後に、ＤＮＡ鎖とＮＴＡ単位を連結するリンカーを切断する。この場合に得られるポリマーは、ＤＮＡ配列ｄＵｄＡによりコード化される、官能基ＯＨおよびＮＨ２を有する、β−ペプチドである。図示される具体例において、配列５’−ｄＵｄＡ−３’は、５’から３’へのＲＮＡがＮ−からＣ−末端方向にてα−ペプチドをコードする天然のコード化システムとは逆に、β−ペプチドをＣ−末端からＮ−末端方向にコード化する。そのβ−ペプチドをそのＣ−末端を介してコード化ＤＮＡに結合させる。
【００６７】
Ｃ）組み込み、重合および活性化の模式図
コードされたポリマーはその開始分子を介してコード化分子（ＤＮＡ）に結合するようになる。
【００６８】
図８ β−ジペプチドのＮ−末端タグ付加−組込み、重合および活性化
Ａ）プライマー、２つのモノマービルディングブロックおよびオリゴの構造。開始分子をプライマーの３’−末端Ｕの５−位に結合させる。プライマーは鋳型の上流部分に相補的である。開始剤はＦｍｏｃ−保護アミンである。ＵＴＰ−誘導体は光保護されたヒドロキシル基を有する。そのヒドロキシル基をＮ−チオカルボキシアンヒドリド（ＮＴＡ）環構造に結合させる。ＡＴＰ誘導体を７位で修飾する。光保護されたアミンをそのＮＴＡと結合させる。オリゴは鋳型の下流配列と相同的である。オリゴはそのオリゴの５’末端でＵに結合する反応性チオエステルを有する。水中でのチオエステルの安定性はチオエステル−成分の構造を変えることにより所望により修飾することができる（具体例において、チオール−成分はチオフェノールである）。
【００６９】
Ｂ）ポリメラーゼによりＵＴＰおよびＡＴＰを組み込むことでプライマー（鋳型とアニールする；図示せず）をその３’−末端から伸長させる。ついで、開始剤をピペリジンにより活性化させ、第一アミンを切り離す。その第一アミンは隣のＮＴＡを攻撃し、ＮＴＡ環を開環させ、ＣＳＯを切り離し、その結果、第一アミンを生成する。この第一アミンはアレイにある次のＮＴＡ単位を攻撃する。その結果、その官能基（ＯＨおよびＮＨ２）を介してＲＮＡ鎖に結合するポリマーが形成される。最後に、ＲＮＡ鎖とＮＴＡ単位を連結するリンカーを切断する。得られるポリマーは、リボ核酸配列ＵＡによりコード化される、官能基ＯＨおよびＮＨ２を有する、β−ペプチドである。天然物がα−ペプチドをコードするのと同様に、５’−ＵＡ−３’配列はβ−ジペプチドをＮ−末端からＣ−末端方向にコード化する。そのβ−ペプチドをそのＮ−末端を介してコード化ＲＮＡに結合させる。
【００７０】
Ｃ）組み込み、重合および活性化の模式図
リンカーの一部を切断すると、コードされたポリマーは下流のオリゴヌクレオチドに結合するようになる。
【００７１】
図９ ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡまたはＤＮＡ鎖に組み込まれることが知られているヌクレオチド誘導体
上図：ヌクレオチド、４つの塩基および分子部分の結合部位（Ｒ）。
中図：ポリメラーゼにより基質として許容される付加物（Ｒ）を有するヌクレオチド。
下図：本発明で用いることのできる付加物（Ｒ）を有するヌクレオチド。化合物（ａ）は例えばフィル・イン実験に用いることができる（図１５を参照のこと）。化合物（ｂ）は例えば重合反応をジップするのに用いることができる（図１４および１４の例１を参照のこと）。化合物（ｃ）は例えば重合反応物を開環するのに用いることができる（図１８および図１８の例１を参照のこと）。
【００７２】
図１０ 切断可能なリンカーおよび保護基
切断可能なリンカーおよび保護基、その切断に用いることができる物質および切断生成物
【００７３】
図１１ 隣接するＩＩ型反応基の間の反応による重合
明確にするために、重合反応だけ（活性化ではない）を図示する。Ｘは機能的部分のＩＩ型反応基を意味する。この場合、２つのＩＩ型反応基は同じである。
重合（ＸとＸを反応させてＸＸを形成する）は、モノマービルディングブロックが組み込まれて同時に生じるか、あるいは条件（例えば、ｐＨ）の変化により、または誘発因子の付加（例えば、化合物またはＵＶ照射）により誘発されるかのいずれかである。
【００７４】
図１１の例１ クマリンをベースとする重合
クマリン単位を光誘発反応に付し、つづいて活性化（リンカーの切断）させて、芳香族および脂肪族環構造のポリマー骨格を得る。官能基の例（ホスフェート、カルボン酸およびアニリン）を示す。
【００７５】
図１２ 隣接する同じでないＩＩ型反応基の間の重合
この例においては、Ｘを別のＸではなくＹと反応させる。同様に、ＹはＹと反応しない。重合は、ビルディングブロックを組み込む間に（図示するように）、または数個のビルディングブロックを組み込んだ後のいずれかで起こりうる。
【００７６】
図１３ 方向性重合反応のないクラスター形成
組み込まれたモノマーが機能的部分を相補因子と連結する結合の周りで回転することについて固定されていないと、図示するようにクラスター形成が生じる。
大きなポリマーにとってこのことは有意な問題である。この問題は（ｉ）組み込まれたモノマーをＸとＹにアレイにて位置を交換させない好ましい配向で固定し（例えば、機能的部分および相補因子を二重結合または２つの結合を介して結合させることで、例えば機能的部分をヌクレオチドのベースおよびリボースの両方に、あるいはジヌクレオチドの２つのベースの両方にカップリングさせることで固定し）、（ｉｉ）方向性重合（「ジッピング」、例えば図１７を参照のこと）または（ｉｉｉ）相補鋳型に組み込む間または組み込んだ直後にモノマーを反応させること、すなわち、各モノマーが次のモノマーが組み込まれる前の以前に組み込まれたモノマーと反応させること（例えば、例と一緒に図１４を参照のこと）ができるように条件を設定することで解決することができる。
【００７７】
図１４ ジッピング−重合および同時活性化
重合はポリマーの活性化をもたらす。ＸとＹの間の反応の幾何学はこの例において重合に関与するすべてのモノマーにて同じである。
【００７８】
図１４の例１ 同時組み込み、重合および活性化−ペプチドの形成
（Ａ）アミノ酸チオエステルが付加されているヌクレオチド誘導体を組み込む。ヌクレオチド誘導体を組み込む間またはその後に、アミンは（予め組み込まれている）隣のヌクレオチドのカルボニルを攻撃する。このことはアミン結合の形成をもたらし、ペプチドの一つの単位を伸長させる。次のモノマーが組み込まれると、これはチオエステルカルボニルを攻撃し、ジペプチドをヌクレオチドから切断させ、トリペプチドを形成する。この工程は、ヌクレオチド誘導体の組み込みが終わるまで、さらに相補鋳型の下流に向かって続く。重要なことは、求核攻撃の幾何学は普遍性を保つことである。求核アミンの鋳型上での局所濃度が溶液中の濃度よりもずっと高いと、溶液中の反応が正確にコード化されるポリマーの形成に有意に影響を及ぼすとは考えられない。さらには、アミンとエステルとの反応性は数種の方法にて調整することができる。反応性に影響を及ぼす変数として、（ｉ）ｐＨおよび温度、（ｉｉ）ヌクレオチドの長さ、結合点およびエステルとヌクレオチドを連結するリンカーの特性（電荷、剛性、疎水性、構造）、（ｉｉｉ）エステル（チオ−、ホスホ−またはヒドロキシ−エステル）の特性、（ｉｖ）硫黄上の置換基の特性（下記（Ｂ）を参照のこと）が挙げられる。加えて、正確なポリマー形成の効率もまた、組み込み速度および組み込まれた後の反応速度によって影響を受ける。組み込み速度はＫｃａｔおよびＫｍで決定される。ＫｃａｔおよびＫｍ値は条件（ｐＨ、ヌクレオチド、塩、鋳型および酵素の濃度）を変えることで、酵素を選択することで、または蛋白質工学により酵素の特性を変えることで調整することができる。
【００７９】
ビルディングブロックを組み込む間の、またはその直後の組み込み、重合および活性化を含む、この一般的スキームは、類似する構造物を用いて、種々の型のペプチド、アミド、およびアミド様ポリマー（例えば、モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−置換のα−、β−、γ−およびΩ−ペプチド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリカルバメート、ポリウレア）の形成を含め、大抵の求核重合反応に適用することができる。
（Ｂ）異なる置換基を有する、したがって求核物質に対して異なる反応性を有する４種のチオエステルである。
【００８０】
図１４の例２ 同時組み込み、重合および活性化−ポリアミンの形成
この図は、ＤＮＡ部分を脱離基として用いる、求核中心を含有する鎖がこのＤＮＡ部分に結合した求電子物質を攻撃する、「ローリング・サークル重合反応」を示す。
【００８１】
図１５ 「フィル・イン」型重合（対照型ＸＸモノマー）
ＩＩ型反応基（図中の「Ｘ」）と架橋分子（図中のＹ−Ｙ）の間の反応によるフィル・イン型重合
明らかにするために、重合反応だけ（重合を示すことなく）を図示する。太腺は二本鎖または一本鎖核酸または核酸アナログを示す。Ｘは機能的部分のＩＩ型反応基を意味する。この場合には、２つのＩＩ型反応基は同一である。モノマービルディングブロックを組み込む前、中または後に、（Ｙ−Ｙ）を当該混合物に添加する。同様に、ＸおよびＹの間の有意な反応がモノマーの組み込みの間または後に起こるかもしれない。
【００８２】
図１５の例１ フィル・イン型重合によるポリイミン形成
過剰量のジアルデヒドを組み込まれたジアミンに加える。その結果、ポリイミンが形成される。一例において、当該ポリマーは次の一連の官能基：シクロペンタジエニル、ヒドロキシル、およびカルボン酸を有する。
【００８３】
図１５の例２ ポリアミド形成
ジアミンが付加されているヌクレオチドを組み込んだ後、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）およびジカルボン酸を過剰量にて標準的カップリング条件を用いてオリゴヌクレオチド上の第一アミンに添加する。別法として、ジ−（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル）を過剰量にて７−１０のｐHで添加してもよい。結果として、２つのアミド結合が２つの隣接するヌクレオチド付加物の間に形成される。この重合の後、付加物をオリゴヌクレオチド骨格から分離し（活性化し）、一のリンカーをそのままにしておき、保護された官能基を脱保護して官能基を暴露する。最終結果はＤＮＡ標識されたポリアミドである。
ポリアミドに至るもうひとつ別の経路は、ジカルボン酸が付加されたヌクレオチドを組み込む、ついでジアミンおよびＥＤＣを添加し、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドの間にアミド結合を形成することである。また、ヌクレオチド誘導体は、ＥＤＣを加える必要がなく、添加したアミンと反応する、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを含有していてもよい。最初、組み込みがポリメラーゼにより介在される場合には、ＮＨＳ−エステルはポリメラーゼのアミンと反応し、そのポリメラーゼの活性を阻害する可能性があるため、この後者の方法は問題であると考えられた。しかし、実際に実験して、ＮＨＳ−誘導化されたヌクレオチドを組み込むことが可能であることが実際の実験から明らかにされた。
【００８４】
（Ａ）得られたポリマーの骨格はアミド結合した芳香族環を含むかまたは本質的にその芳香族環からなる。この例の置換基は置換された第一アミン、分岐したペンチル基であり、第三アミンおよびピリミジルである。第一アミンはジカルボン酸との反応を回避するために保護されている。適当な保護基は、例えば、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ、ｃｂｚ）、トリフルオロアセチル、フタロイルまたは他のアミノ保護基（T. W. GreenおよびPeter G. M. Wuts（１９９１）、Protective Groups in Organic Synthesis）である。
【００８５】
（Ｂ）骨格は、アミド結合により連結されている、芳香族環を含むか、あるいは本質的にその芳香族環からなる。置換基はインダニル、ジフェニルホスフィニル、カルボキシアミドエチルおよびグアニジルプロピルであり、後の二つは、各々、アスパラギン側鎖およびアルギニン側鎖である。グアニジル官能基は、標準的アミンよりも反応性に富むため、保護されている。適当な保護基はＭｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｍｔｓ（メシチレン−２−スルホニル）またはＰｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンジフラン−５−スルホニル）であろう。
【００８６】
実施例１５の例３ ポリウレア形成
組み込まれたヌクレオチド誘導体をホスゲンまたはホスゲン等価物、例えば、ＣＤＩと反応させてポリウレアを形成させる。リンカーを切断し、保護されたヒドロキシルを脱保護する。
適当な脱離基（Ｌｖ）はクロリド、イミダゾール、ニトロトリアゾールまたは有機合成にて一般に利用される他の良好な脱離基である。
【００８７】
図１５の例４ キラルおよびアキラルポリウレア骨格形成
この例においては、切断可能なリンカーとして官能基Ｒｘを用い、活性化で所望の官能基を生成する。（Ａ）および（Ｂ）の両方において、ポリウレアが形成される。
【００８８】
（Ａ）において、キラル炭素を介して官能基を骨格に結合させる。この炭素上の水素を示し、この炭素をはっきりさせる。重合する前の、キラル炭素と官能基を連結する結合の回りには自由回転がある。ＩＩ型反応基（アミン）をホスゲン等価物（例えば、カルボニルジイミダゾール）と反応させてポリマーを形成させる場合、ビルディングブロックは（水素の位置で示されるような）二つの配向のいずれでも挿入することができる。その結果、ポリマーの残りは、各々、二つの可能なキラル形態を有する。したがって、所定のコード化分子は残りの特異的な配列のポリマーをコードするであろうが、５または１５個の残基のコード化されたポリマーは、各々、２５＝３２または２１５＝３２７６８個の立体異性体を有するであろう。ある場合には、そのような多様性を付加した構造物をライブラリーに組み込むことが有利である（例えば、ポリマーが比較的短い場合である）。他の場合には、スクリーニング効率が弱められ、あるいは同じコード化分子によりコードされる他の立体異性体と一緒になって、複雑すぎてスクリーニング工程にて単離されたポリマーの構造を解すことができないため、そのような付加的な多様性は望ましくない（例えば、ポリマーが長い場合である）。
【００８９】
（Ｂ）において、（Ａ）のキラル炭素が窒素と置き換えられている。その結果、得られるポリマー骨格はアキラルであり、コード化分子は一の特異的構造をコードする。
【００９０】
図１５の例５ ポリホスホジエステル形成
組み込まれたヌクレオチド誘導体が活性化されたホスホジエステルと反応し、ポリホスホジエステルを形成する。ついで、リンカーを切断し、ポリホスホジエステルを得、リンカーを介してコード化分子に結合させる。適当な脱離基（Ｌｖ）の一例がイミダゾールである。
【００９１】
図１５の例６ 各モノマービルディングブロック中の一個のＩＩ型反応基でのポリホスホジエステル形成
組み込まれたヌクレオチドは、各々、一の活性化されたホスホジエステルを含有する。１，３−ジヒドロキシピリジンなどのジヒドロキシル化化合物を添加して、官能基導入されたポリホスホジエステルを形成する。最後に、官能基Ｒｘをオリゴヌクレオチドに連結する保護基／切断可能なリンカーを切断することによりその官能基を相補鋳型から自由にする。
【００９２】
図１５の例７ ペリサイクリック（pericyclic）「フィル・イン」型重合
ヌクレオチド誘導体を組み込んだ後、過剰量の１，４−ベンゾキノンを加えると、多環式化合物の形成がもたらされる。最後に、ポリマーをヌクレオチドに連結しているリンカーを（一のリンカーが切断されないでそのまま保持されることを除いて）切断することによりポリマー構造物が活性化される。
【００９３】
図１６ コード化による「フィル・イン」
コード化によるフィル・インは図示される方法により行われる。コード化されるフィル・イン部分が第２ビルディングブロックのＹ−Ｒｘ−Ｙである。この方法を用いて、２つの機能的部分Ｘ−Ｒｘ−Ｘを所定の官能的存在Ｙ−Ｒｘ−Ｙで連結することが可能である。ある具体例において、図１５に示される方法と同様に、コード化されるフィル・イン機能的部分Ｙ−Ｒｘ−Ｙは分子全体を通して同じである必要はないため、このことは有利であるかもしれない。
【００９４】
図１７ 「フィル・イン」重合（非対称性ＸＳモノマー）
ＩＩ型反応基（図中の「Ｘ」および「Ｓ」）と架橋分子（図中の「Ｔ−Ｙ」との間の反応によるフィル・イン重合
明瞭にするために、（活性化ではなく）重合反応だけを図示する。太線は二本鎖または一本鎖核酸または核酸アナログを示す。ＸおよびＳは機能的部分のＩＩ型反応基を示す。この場合、２つのＩＩ型反応基は同じではない。モノマービルディングブロックを組み込む前、中または後に（Ｔ−Ｙ）を混合物に加える。同様に、モノマーを組み込む間または後に、ＸおよびＹの間で、およびＳおよびＴの間で有意な反応が起こるかもしれない。
【００９５】
図１７の例１ シュタウディンガー・ライゲーションの修飾およびケトン−ヒドラジド反応によるフィル・イン重合
ビルディングブロックの反応基（ＩＩ型）ＸおよびＳはアジドおよびヒドラジドである。ビルディングブロックの間のギャップを埋める添加分子はケトンおよびホスフィン部分を有する。ケトンとヒドラジドの間の反応およびアジドとホスフィンの間の反応は極めて化学選択的である。したがって、大抵の官能基Ｒｘは、重合反応の間、保護を必要とすることなく、利用することができる。分子部分Ｒ、Ｒ１、ＸおよびＹの例は、Mahalら（１９９７）、Science ２７６、１１２５−１１２８頁；Saxonら（２０００）、Organic Letters ２、２１４１−２１４３頁に見出すことができる。
【００９６】
図１８ 「ジッピング」重合
例えば、脱保護することで、あるいはｐＨを変えることで、開始剤分子（典型的には、未完成ポリマーの一端に位置する）を活性化させる。ついで、この開始剤を隣接するモノマーの反応基Ｘと反応させる。このことが隣接するＸを攻撃する反応基Ｙを活性化する。ついで、所望するすべてのモノマーが連結するまで、重合が「ジッピング」形式にて当該分子の別の端部にまで伝わる。開始剤（および反応基Ｙ）の活性化はそれが隣接する反応基を攻撃するためのものであってもよく、あるいは隣接する反応基による攻撃のためのものであってもよい。
【００９７】
図１８の例１ ラジカル重合
開始剤分子であるヨーダイドは、ラジカル開始剤、例えば、過硫酸アンモニウム、ＡＩＢＮ（アゾビス−イソブチロニトリル）または他のラジカル鎖反応開始剤を添加することで活性化される。ラジカルは隣接するモノマーを攻撃し、新しいラジカルおよび最初の２つのモノマーの間に結合を形成する。そのうち、ポリマー全体が形成され、ポリマーを活性化させ、同時に官能基Ｒｘを創り出す。
【００９８】
図１８の例２ カチオン重合
アレイをルイス強酸に曝すことでカチオンを創り出す。隣接するモノマーの二重結合をこのカチオンと反応させ、それによってこの正電荷が隣接するモノマーに移動する。そのうち、ポリマー全体が形成され、最終的にこのポリマーを活性化させる。
【００９９】
図１９ 開環によるジッピング重合
開始剤を環構造中の反応基Ｘと反応させ、開環させ、それにより同じ機能的部分中の反応基Ｙが活性化され、隣接する機能的部分中の反応基Ｘと反応する。
【０１００】
図１９の例１ β−ペプチドを形成するためのＮ−チオカルボキシアンハイドライドの「ジッピング」重合
ビルディングブロックを組み込んだ後、開始剤を脱保護する。ついで、第一アミンを隣接するＮ−チオカルボキシアンハイドライド（ＮＴＡ）単位のカルボニルと結合させる。その結果、ＣＳＯが切り離され、第一アミンが形成される。このアミンはアレイの隣にあるＮＴＡ単位と反応するであろうし、そのうちすべてのＮＴＡ単位が反応してβ−ペプチドを形成するであろう。最後に、オリゴマーが活性化される。このセットアップに対する多くの変更が予想可能である。例えば、チオカルボキシアンハイドライドの代わりに、カルボキシアンハイドライドを用いてもよい。開始剤をベース−不安定基または感光基で保護してもよい。ベース−不安定保護基を選択するならば、カルボキシアンハイドライドの安定性を考慮しなければならない。ｐＨが高くなればなるほど、チオカルボキシアンハイドライドよりもカルボキシアンハイドライドを用いることが有利である。最後に、開始剤は脱保護され、例えば、プライマーにカップリングされていてもよい。この場合、溶液中の開始剤の濃度は極めて低く（典型的には、ナノモルないしマイクロモル）、したがって微々たる量の開始剤がカルボキシアンハイドライドと反応するに過ぎないであろう。ビルディングブロックを組み込んだ後または組み込む間、重合を効果的に行うため、開始剤およびカルボキシアンハイドライドの局所濃度はずっと高いであろう。
同様の環状構造物を用いて、別の型のペプチドおよびペプチド様ポリマー（例えば、モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−置換のα−、β−、γ−およびΩ−ペプチド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリカルバメート、ポリ尿素）を製造することができる。例えば、α−ペプチドは５員のカルボキシアンハイドライド環を重合することにより製造することができる。
【０１０１】
図１９の例２ β−ペプチドを形成するための２，２−ジフェニルチアジナノン単位の「ジッピング」重合
脱保護された求核物質である第一アミンが隣接するチオエステルのカルボニルを攻撃し、それによりアミド結合が形成される。切り離されたチオールを並びかえ、チオケトンを形成する。その結果、遊離第一アミンが形成され、それが隣接するチオエステルなどのカルボニルを攻撃する。そのうち、そのＣ−末端を介して連結した、α−置換のβ−ペプチドが形成される。第一アミンとエステルとの反応性は、例えば、エステル（チオエステルまたはレギュラーエステル）を選択すること、重合反応の間のｐＨを選択すること、および芳香族環上の置換基を選択することにより修飾することができる。環状部分に含まれる第二アミンおよび開環の際に切り離される第一アミンの相対的反応性は、第二アミンとチオエステルの間の炭素の嵩で調整してもよい。例えば、２つの芳香族環を１つの環と置き換えることで、第二アミンの周りの嵩を減少させ、より求核性としてもよく、それに対して開環の際に形成される第一アミンの求核性はこの位置の体積により影響を受けない。他のペプチドおよびアミド様ポリマーはこの原理で形成することができる。例えば、７−員のチアジナノン環を重合することでγ−ペプチドを形成してもよい。
【０１０２】
図１９の例３ 開環重合によるポリエーテル形成
開始剤を、例えば、塩基または酸で脱保護する。その形成されたアニオンは、ついで隣接するモノマーのエポキシドを攻撃し、エーテル結合を形成する。その結果、隣接する単位にてアニオンが形成される。これはアレイ中の隣のモノマーを攻撃し、そのうちに全長ポリエーテルが形成される。条件の応じて、エポキシドのヒンダー炭素が（酸性条件下または塩基性条件下で）、各々、最大限または最低限で攻撃されるであろう。
最終工程において、コード化されるポリエーテルが得られる。この場合、ポリエーテルはコード化分子から完全に切り離されている。関連する特徴（例えば、細胞をベースとするアッセイまたは酵素学的活性における作用）についてのスクリーニングは、マイクロタイターウェルまたはミセルにて行うことができ、コンパートメントは、各々、多くのコピーの特異的鋳型分子および鋳型化ポリエーテルを含有する。この場合、鋳型および鋳型化された分子は（コンパートメントの境界により）物理的に関連付けられ、したがって、興味深い特徴を有するポリエーテルをコードする鋳型をそれらのコンパートメントから集め、プールし、増幅させ、ポリエーテルのさらなるコピーに「翻訳」し、ついで新たなラウンドのスクリーニングに付してもよい。
【０１０３】
図２０ ジッピング重合および並びかえによる活性化
Ｙによる攻撃のために開始剤を活性化する。開始剤とＹの反応は相補因子からの開始剤の切り離しをもたらす。開始剤との反応に際し、ビルディングブロックの並びかえが生じ、Ｙとの反応のためのＸの活性化がもたらされる。多くの反応および並びかえを経て、ポリマーが形成される。
【０１０４】
図２１ ジッピング重合および開環のよる活性化
開始剤と環構造中のＸとの反応により環が開かれ、Ｙの活性化がもたらされる。すると、Ｙは隣接する機能的部分中のＸと反応することができる。開環の結果として、その機能的部分は相補因子から切り離される。
【０１０５】
図２２ 固定された機能単位を用いる方向性ポリマー形成
（Ａ）ビルディングブロックの機能的部分は２つのリンカーを介して相補因子に結合されうる。これにより機能的部分が相補鋳型に対して所定の配向に固定されうる。その結果、（図１３に示すような）機能的部分および相補因子を連結するリンカーを中心とする回転はできなく、したがってクラスタ形成は起こりそうにない。
【０１０６】
（Ｂ）２つのリンカーが、ジヌクレオチド誘導体の２つの塩基を、この場合にはジペプチドである機能単位に結びつけている。このようなジヌクレオチド誘導体を二重螺旋構造に組み込むことで、アミン（上記した（Ａ）のＸ）がエステル（上記した（Ａ）のＹ）に接近して位置付けられるであろう。このエステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化することができる。アミンおよびエステルの反応を介して、ポリペプチドが形成される。このポリペプチドは、Ｎ−末端からＣ−末端への方向性を有する、方向性ポリマーであろう。この場合には、エステルが連結している塩基から、重合反応によりエステルが切断されるであろう。したがって、形成されたポリマーの活性化はジヌクレオチドの３’−末端で塩基を機能的部分のアミノ−末端と結びつけるリンカーを切断するだけである。
【０１０７】
機能的部分の相補因子に対する回転の固定は別の方法で達成することもできる。例えば、機能的部分を二重結合を介して相補因子にカップリングさせるか、または２つの結合を介して、各々、ヌクレオチドの塩基およびリボース部分に結合させてもよく、あるいはリボースまたは塩基の異なる位置にカップリングさせてもよい。最後に、特にジヌクレオチドのホスフェート部分に連結させることも可能である。
【０１０８】
図２３は単一のリンカーを介して親ヌクレオチドに結合した二機能性ＦＥ（左図）または第２結合点を用いてさらなるリンカーで結合した二機能性ＦＥ（右図）の４種の例示を示す。第２結合は、隣接するヌクレオチド上（Ａ）、親ヌクレオチドの糖部分上（Ｂはエステル官能基を介して結合しているか、あるいはＣは遊離エステル官能基をもって、Ｄもまた遊離エステル官能基をもって）のどこであってもよく、親ヌクロチドの別の塩基位置とすることもでき（図示せず）、あるいはＦＥをホスフェート骨格に連結させることもできる（図示せず）。
【０１０９】
図２４は種々の方法にて結合したリンカー−ＦＥ１Ａを有する二重鎖ＤＮＡ（上鎖５’−ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧ−３’）を示す。ＤＮＡ骨格を矢印で示し、糖および塩基を環で示す。リンカー−ＦＥ原子を棒提示で示し、原子により着色する。Ａは結合の弱いＦＥを有する構造例を示す。ＢはＡの最も可能性の高い生成物を示す。Ｃはクラスターが生じ、不完全な生成物Ｄに至る結合の弱いＦＥ配置の例を示す。Ｅは二重結合したＦＥを有する最小エネルギーの構造であって、生成物Ｆは可能性にすぎない。ＧはＦから切り離される生成物の棒提示である。ＨはＢから切り離される生成物の棒提示である。ＩはＤから切り離される生成物の棒提示である。
【０１１０】
図２５は種々の方法にて結合したリンカー−ＦＥ１Ｂを有する二重鎖ＤＮＡ（上鎖５’−ＧＣＴＴＴＴＡＧ−３’）を示す。ＤＮＡ骨格を矢印で示し、糖および塩基を環で示す。リンカー−ＦＥ原子を棒提示で示し、原子により着色する。Ａは結合の弱いＦＥを有する最小エネルギー構造を示す。ＢはＡの最も可能性の高い生成物を示す。Ｃはクラスターが生じ、不完全な生成物Ｄに至る結合の弱いＦＥ配置の例を示す。Ｅは二重結合したＦＥを有する最小エネルギーの構造であって、生成物Ｆは可能性にすぎない。ＧはＢおよびＦから切り離される生成物の棒提示である。ＨはＤから切り離される生成物の棒提示である。
【０１１１】
図２６ 分子の鋳型化−原理と変化
図２６−２７、２９−３１、３３−３５、３７−４９および５３において、鋳型、相補鋳型、鋳型および相補鋳型を共に、または相補鋳型を横線（太線）で示す。図２６−２８、３５−３７および３９において、機能的部分を円で示す。
【０１１２】
Ａ．この図にて用いるモノマービルディングブロックを示す。黒色点は切断可能なリンカーを示す。
Ｂ．一般的原理
工程１−組み込み モノマービルディングブロックを、（鋳型の）コード因子と（モノマービルディングブロックの）相補因子の間の特異的相互作用により相補鋳型に特異的に組み込む。
工程２−反応 ＩＩ型反応基の反応によって、個々のモノマービルディングブロックの機能的部分（ＦＥ）がカップリングされるようになることで反応が誘発される。
工程３−活性化 ＦＥ単位を相補因子に連結する数個またはすべてのリンカーを切断し、それにより鋳型化された分子を部分的または完全に切り離す。
工程４（図示せず）−スクリーニング、増幅および修飾
鋳型−鋳型化された分子の複合体を、所望の特性を有する複合体をプールして豊富化する、スクリーニング工程に付して取り出してもよい。ついで、豊富化されたプールの鋳型を増幅させ、例えば、変異形成ＰＣＲにより修飾し、そして鋳型化された分子を工程１−３を行うことで再生する。
【０１１３】
Ｃ．線状、分岐状および環状鋳型の鋳型化
線状、分岐状および環状の鋳型は、線状、分岐状および環状の鋳型化された分子を生成することができる。図示される例において、分岐した鋳型は、修飾されたヌクレオチド（例えば、チオールを有する）をオリゴヌクレオチドに組み込み、つづいてチオール反応性成分（例えば、一端にマレイミド単位）を含有するオリゴヌクレオチドと反応させることにより生成することができる。環状鋳型も同様に、一端にて反応して共同的に環化する反応基を有するオリゴヌクレオチドであってもよい（例えば、オリゴヌクレオチドの両端にあるチオールはジスルフィド結合を形成することができる）。ＦＥと相補因子を連結するリンカーの一つだけを除いてすべてのリンカーを切断すると、一点で鋳型に結合されている、環状の鋳型化された分子が形成される。
【０１１４】
Ｄ．線状鋳型による線状、分岐状、環状およびスクランブル線状分子の鋳型化
（ａ）モノマービルディングブロックを組み込んだ後であるが、反応させる前に得られるようなＦＥと同じ配列を有する線状の鋳型化された分子。（ｂ）スクランブルされた配列、すなわち、鋳型化された分子のＦＥの配列を有する線状の鋳型化された分子は、ＦＥを組み込んだ直後であるが、反応させる前に得られる配列とは対応しない。（ｃ）次のＦＥ相互の対をなす反応により得られる環状の鋳型化された分子：ＦＥ１／ＦＥ２、ＦＥ２／ＦＥ３、ＦＥ３／ＦＥ５、ＦＥ５／ＦＥ４、ＦＥ４／ＦＥ１。（ｄ）次の機能的部分相互の対をなす反応により得られる分岐した分子：ＦＥ１／ＦＥ２、ＦＥ２／ＦＥ３、ＦＥ２／ＦＥ４およびＦＥ４／ＦＥ５。（ｅ）次の機能的部分相互の対をなす反応により得られる分岐した分子：ＦＥ１／ＦＥ２、ＦＥ２／ＦＥ４、ＦＥ２／ＦＥ５およびＦＥ２／ＦＥ３。
【０１１５】
図２７ 等しくない数の反応基（Ｘ）および（Ｙ）
反応基（Ｘ）の数は、反応基（Ｙ）の数よりも多く、等しくまたは少なくすることができる。（Ｘ）と（Ｙ）の数が異なる場合、スクランブル化が生じる。図において、足場（モノマービルディングブロックの官能基が結合されるようになった分子部分）が、直接、鋳型に結合されている。足場はモノマービルディングブロックの一部であってもよい、すなわち、モノマービルディングブロックの機能的部分は、ＩＩ型反応基（Ｙ）を含む、足場部分を含んでいてもよい。
【０１１６】
（Ａ）鋳型当たりのコードされた反応基Ｘの数は、固定点（足場とも言われる）にある反応基（Ｙ）の数と同じである。
（Ｂ）鋳型当たりのコードされた反応基Ｘの数は、足場にあるコード可能な置換基の位置Ｙの数よりも少ない。このことが、足場（固定点）にある反応基（Ｙ）がモノマービルディングブロックにある（Ｘ）と反応することに関して、スクランブル化をもたらす。
（Ｃ）鋳型当たりのコードされた反応基Ｘの数は、足場にある反応基の数よりも多い。このことが、足場（固定点）にある反応基（Ｙ）がモノマービルディングブロックにある反応基（Ｘ）と反応することに関して、スクランブル化をもたらす。
【０１１７】
図２８ モノマービルディングブロック
（Ａ）官能基（Ｒｘ）を相補因子と連結する、一のＩＩ型反応基（Ｘ）を有するモノマービルディングブロック。この型のモノマービルディングブロックは同時反応および活性化プロトコル（図１４）に用いることができる。
（Ｂ）相補因子を官能基（Ｒｘ）と連結する、二のＩＩ型反応基（ＸおよびＹ）を有するモノマービルディングブロック。
（Ｃ）一のＩＩ型反応基（Ｘ）を有するモノマービルディングブロック。反応基（Ｘ）は官能基（Ｒｘ）と相補因子を連結せず、そのため、リンカー（Ｌ）が（相補因子から機能的部分を離すために）活性化工程にて必要とされる。
（Ｄ）四つのＩＩ型反応基（Ｙ）を有するモノマービルディングブロック。四つの反応基および官能基Ｒｘは足場として供され、その上に、これらモノマービルディングブロックにある反応基（Ｘ）とこのモノマービルディングブロックにある反応基（Ｙ）との反応を介して、置換基（同じ鋳型を補完するモノマーによってコードされている）をカップリングさせる。この例においては、切断可能なリンカーを図示していない。したがって、鋳型化反応の後で、鋳型化された分子を鋳型にこのモノマービルディングブロックのリンカーを介して結合させてもよい。
【０１１８】
図２９ 反応および活性化を同時に行うことに関する鋳型化
その各々が一のＩＩ型反応基（Ｘ）を有する四つのモノマービルディングブロックおよび四つの反応基（Ｙ）を有する固定点を用いる鋳型化。ＸとＹの反応は、相補因子からＸを切り離す、同時活性化（切断）を含む。
（Ａ）ＩＩ型反応基（Ｘ）は同種のものである。
（Ｂ）ＩＩ型反応基（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４）は異種のものであり、すなわち、反応Ｘ１／Ｙ１、Ｘ２／Ｙ２、Ｘ３／Ｙ３およびＸ４／Ｙ４の間の対をなす反応は直交または部分的に直交している。例えば、Ｘ１は、好ましくは、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４ではなく、Ｙ１と反応する。固定点を鋳型と、あるいは相補鋳型と直接結合させてもよい。固定点を相補因子に結合させる場合において、全体としてモノマービルディングブロックが考えられる。
【０１１９】
図３０ 反応および活性化を同時に行うことを可能とする反応型
一のモノマービルディングブロックから別のモノマービルディングブロックへの、あるいは固定点への官能基の転位を媒介する異なる種の反応を図示する。反応は３種の異なる種類：求核置換、付加−脱離反応および遷移金属触媒反応に分類される。これらの反応は反応および活性化を同時に行う処理（図１４にて一般的用語として記載されている）に適合している。
【０１２０】
（Ａ）求核物質とカルボニルとの反応。求核置換の結果、官能基Ｒは初めに求核物質を有するモノマービルディングブロックに転位される。
（Ｂ）アミンのチオエステルに対する求核攻撃によりアミド結合が形成され、実際においてチオエステルの官能基Ｒが他のモノマービルディングブロックに転位する。
（Ｃ）ヒドラジンとβ−ケトエステルを反応させてピラゾロンを形成させ、実際において、ＲおよびＲ’官能基が他のモノマービルディングブロックに転位する。
（Ｄ）ヒドロキシルアミンとβ−ケトエステルを反応させてイソキサゾロンを形成させ、それによりＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｅ）チオウレアをβ−ケトエステルと反応させてピリミジンを形成させ、それによりＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｆ）尿素をマロネートと反応させてピリミジンを形成させ、それによりＲ基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
【０１２１】
（Ｇ）ＺがＯであるか、またはＺがＮＨであるかに応じて、ヘック（Ｈｅｃｋ）反応に付し、つづいて求核置換反応に付し、クマリンまたはキノリノンを形成させ、それによりＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｈ）ヒドラジンをフタルイミドと反応させてフタルヒドラジドを形成させ、それによりＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｉ）アミノ酸エステルを反応させてジケトピペラジンを形成させ、それによりＲ基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｊ）尿素とα−置換エステルを反応させてヒダントインを形成させ、ＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｋ）種々の求核物質をスルホナートと反応させることでアルキル化を達成することもできる。この操作はＲおよびＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｌ）電子求引基および脱離基を含有する活性化ジアルケンを反応させて、アルケンを求核物質に転位させる。
（Ｍ）ジスルフィドをメルカプタンと反応させてジスルフィドを形成させ、それによりＲ’基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
【０１２２】
（Ｎ）アミノ酸エステルをアミノケトンと反応させてベンゾジアゼピノンを形成させ、それによりＲ基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｏ）ホスホネートをアルデヒドまたはケトンと反応させて置換アルケンを形成させ、それによりＲ”基を他のモノマービルディングブロックに転位させる。
（Ｐ）ボロネートをアリールまたはヘテロアリールと反応させ、（ビアリールを形成するのに）アリール基を他のモノマービルディングブロックに移動させる。
（Ｑ）アリールスルホナートをボロナートと反応させてアリール基を移動させる。
（Ｒ）ボロナートをビニル（またはアルキン）と反応させてビニルアレン（またはアルキルアレン）を形成させる。
（Ｓ）脂肪族ボロナートとアリールハライドを反応させて、それによりアリール基を転位させ、アルキルアレンを得る。
（Ｔ）エノールエーテルとアリールハライドの間の反応を介して遷移金属触媒α−アルキル化に付し、それにより脂肪族部分を転位させる。
【０１２３】
（Ｕ）例えば、エナミンまたはエノールエーテルとアルデヒドとの間で縮合させ、アルファ−ヒドロキシカルボニルまたはアルファ，ベータ−不飽和カルボニルを形成させる。該反応は求核部分を転位させる。
（Ｖ）例えば、エナミンまたはエノールエーテルのよるアルキルハライドのアルキル化。該反応は求核部分を転位させる。
（Ｗ）［２＋４］付加環化に付し、ジエン部分を転位させる。
（Ｘ）［２＋４］付加環化に付し、エン部分を転位させる。
（Ｙ）［３＋２］アジドとアルケンの間の付加環化に付し、エン部分を転位させることでトリアゾールを得る。
（Ｚ）［３＋２］二トリルオキシドとアルケンの間の付加環化に付し、エン部分を転位させることでイソキサゾールを得る。
【０１２４】
図３１ 反応および活性化を同時に行わない処理に関する鋳型化：
反応基（ＩＩ型）を反応させ、つづいて機能的部分を相補因子と連結するリンカーを切断する。
その各々が一のＩＩ型反応基（Ｘ）を有する四つのモノマービルディングブロックおよび四つの反応基（Ｙ）を有する固定点を用いる鋳型化。ＸとＹの反応は、同時活性化（切断）を含まず、ＸおよびＹを反応させ、つづいてリンカーＬを切断し、官能基Ｒｘを相補因子から切り離す。
（Ａ）ＩＩ型反応基（Ｘ）は同種のものであり、すなわち、それらは同じ型の反応基（Ｙ）と反応しうる。（Ｂ）ＩＩ型反応基（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４）は異種のものであり、すなわち、Ｘ１／Ｙ１、Ｘ２／Ｙ２、Ｘ３／Ｙ３およびＸ４／Ｙ４の間の反応は直交または部分的に直交している。例えば、Ｘ１は、好ましくは、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４ではなく、Ｙ１と反応する。固定点を鋳型と、あるいは相補鋳型と直接結合させてもよい。固定点を相補因子に結合させる場合において、全体としてモノマービルディングブロックが考えられる。
【０１２５】
図３２ 反応基（Ｘ）および（Ｙ）の対、その結果得られる結合（ＸＹ）
鋳型化合成に用いることのできる一群の反応基を、その反応で形成される結合と共に示す。反応させた後、活性化（切断）が必要とされるかもしれない（図３１を参照のこと）。
【０１２６】
図３３ 鋳型化された分子の固定部位
鋳型化された分子は、（Ａ）鋳型の末端近くにある、鋳型に直接連結されるリンカーを介して、または（Ｂ）鋳型のより中心にある、鋳型に直接連結されるリンカーを介して、または（Ｃ）固定点（鋳型化された分子に連結するようになる反応基）を有するモノマービルディングブロックにより、それをコードする鋳型に結合させることができる。
【０１２７】
図３４ スクランブル化
モノマービルディングブロックを組み込んだ後、機能的部分を反応させると、鋳型化された分子中の官能基の位置または配列は、いつもがいつも、鋳型の配列により独自に決定されるものではない。
（１）官能基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は足場分子の四つのいずれの位置にあってもよい（すなわち、モノマービルディングブロックの反応基Ｘは固定点のいずれの反応基Ｙと反応してもよい）。
（２）この分岐した分子の一のアームの配列は、（図示されるように）Ｒ５−Ｒ３−Ｒ２であるか、またはＲ５−Ｒ２−Ｒ３（図示せず）であるか、またはＲ５−Ｒ４−Ｒ３（図示せず）であるか、あるいは他の多くの可能性のある配列のいずれであってもよい。さらに、例えば、分子の左部分にカップリングされる官能基の同一性はＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４のいずれであってもよい。
（３）（２）と同様に、図示されている配列Ｒ１−Ｒ２−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３に加えて、多くの可能性のある官能基の配列が可能である。
（４）ここでは、スクランブル化されていない鋳型化された分子を示す。組み込まれた場合のその機能的部分の配列は鋳型化された分子の配列に相当する（Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５）。所望により、方向性コード化または例えば、リンカーにてジッパーボックス（図４０、４４−４７を参照のこと）を用いることにより、スクランブル化を部分的にまたは完全に回避することができる。
（５）（２）および（３）と同様に、多くの可能性のある機能的部分の配列および配置が可能である。
【０１２８】
図３５ モノマービルディングブロック−リンカー設計の例
種々の鋳型化のスキームにて用いられる、異なる設計のモノマービルディングブロックを図示する。
相補因子はオリゴヌクレオチドにより表すことができ、それに機能的部分を有するリンカーが結合している。リンカーは相補因子に対して内部位置を占めていてもよく、あるいはまた末端位置を占めていてもよい。相補因子およびリンカーは共にオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モノマービルディングブロックのリンカーとハイブリッド形成能を有する他のオリゴマーおよびその混合物）でできていてもよい。横線は相補因子を示し、縦線はリンカーを示す。「ａ」と特徴付けられたリンカーの部分は存在してもしなくてもよい。「ａ」領域は相互作用領域をいい、その好ましい具体例の一つがヌクレオチドの配列である。リンカーを強固にするために、「ａ」領域を相補的一重鎖ヌクレオチド配列「ａ」にアニールしてもよい。別に、他のモノマービルディングブロック（すなわち、ジッパーブロック、図４２を参照のこと）との相互作用のために「ａ」領域を用いてもよく、それによりかかる二つのモノマービルディングブロックの機能的部分はすぐ近い状態となり、これら二つの機能的部分の間で反応する可能性は増大するであろう。かかる領域の他の使用は異なるモノマービルディングブロックの間の相互作用を包含し、それにより方向性コード化が達成される。「Ｎｕ」は電子求引基と反応しうる求核物質である。
【０１２９】
種々の鋳型化のスキームにて使用される、モノマービルディングブロックの異なる設計を図示する。
（Ａ）相補因子がオリゴヌクレオチドであり、機能的部分を有するリンカーをそのオリゴヌクレオチドの中心部に結合させることができる。「ａ」と提示されたリンカーの部分はヌクレオチド配列を意味し、リンカーをより強固にするために、それに一重鎖ヌクレオチドをアニールしてもよい。
（Ｂ）相補因子およびリンカーの両方がオリゴヌクレオチドでできていてもよい。ここで横線の部分はリンカーを意味する。リンカーはジッパーボックスとして機能する配列「ａ」を含有していてもよい（図４２を参照のこと）。
（Ｃ）（Ｃ）のモノマービルディングブロックは開始剤であるかまたは固定点であり、コード化工程を開始するのに用いることができる。
【０１３０】
図３６ 機能的部分のオリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロックとする調製
オリゴヌクレオチドの修飾されていない部分と有意に反応することなく、あるいはまた、リンカーを相補因子に連結するための結合反応を行うことなく、機能的部分を修飾されたオリゴヌクレオチド（チオール、カルボン酸、ハライドまたはアミンで修飾されている）にカップリングさせるのに用いることのできる反応および試薬を示す。経済的に、上記した修飾のなされている開始オリゴヌクレオチドを生成するためにモノヌクレオチドが利用される。
【０１３１】
図３７ オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロック リンカーおよび機能的部分（ＦＥ）の設計および合成の例
モノマービルディングブロックの相補因子が約８−２０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを太い黒線で示す）を含む、例を示す。オリゴヌクレオチドの一部または全部が相補因子を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドの一部だけが相補因子を意味する場合には、オリゴヌクレオチドの残りの部分はリンカーを構成してもよい。一例として、リンカーはオリゴヌクレオチドの３’−または５’−末端の塩基に結合されている。このリンカーはオリゴヌクレオチド配列中のいずれのヌクレオチドに結合されてもよく、また、相補因子と鋳型の特異的相互作用を無駄にしない限り、オリゴヌクレオチドのいずれの分子部分に結合してもよい。
【０１３２】
（Ａ）リンカー（Ｌ）が機能的部分を有する末端ヌクレオチドに連結しているモノマービルディングブロック
（Ｂ）１と２１個の間のエチレングリコール単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーが相補因子を求核物質（第一アミン）を含有する機能的部分と連結させるところのモノマービルディングブロック
（Ｃ）リンカーが電子求引基（エステルまたはチオエステル）を含有する機能的部分と連結するところの、モノマービルディングブロック
（Ｄ）Ｂｏｃ−保護アミン（温和な酸で脱保護することのできるアミン）およびエステルを含む、モノマービルディングブロック。その保護アミンを別のモノマービルディングブロックのエステルと反応させ、アミド結合を得ることができる。
【０１３３】
図３８ オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロック 高いモノマー多様性を可能とする、コード化および相補因子の設計例
（Ａ）６個のコード因子（ボックス１−６）を有する鋳型であり、各々、一部ランダムな配列（ＸはＣまたはＧのいずれかを特定する）およびその群のすべての配列について同じである不変配列（例えば、ボックス１の配列はすべて中央にＡＴＡＴＴＴ配列を有する）を含有する。ＣとＧだけを用いることで（あるいはまた、ＡとＴだけを用いることで）、個々の配列（例えば、ＢＯＸ１配列の群に属する配列）はほとんど同じアニーリング温度を有し、そのためアニーリングの失敗は取るに足らないものである。一例として、ボックス２およびボックス３は同一であり、そのためボックス２およびボックス３は同型の機能的部分（同型のＩＩ型の反応基を含む）をコードすることができる。相補因子と機能的部分とを連結するリンカーの固定点は図にて特定されていない。アニーリング工程におけるバイアスを回避するため、リンカーを不変領域のヌクレオチドに結合させるのが理想的である。
【０１３４】
（Ｂ）コード因子の配列の例であって、例示的ボックス１とボックス６の配列を示す。例示的ボックス１の配列は、対応するボックス１の相補因子に特異的にアニールする、異なる１０２４種の配列のうちのわずか一つの配列を示す；例示的ボックス６の配列は、対応するボックス６の相補因子にアニールする異なる１２８種の配列のうちの一の特異的配列を示す。
【０１３５】
（Ｃ）６つのモノマーを用いる鋳型化を示す。５種のコード因子を用いる（ボックス２と３は同種であり、すなわち、この種の対応する相補因子はボックス２および３の両方にアニールすることができる）。ＩＩ型反応基、ＸおよびＹを反応させ；ＳおよびＴを反応させ；ＡおよびＢを反応させ、そしてＣおよびＤを反応させる。例えば、Ｘ／Ｙ対は、Ｃ／Ｄに対して直交しているＡ／Ｂに対して直交しているＳ／Ｔに対して直交している。ＸとＹの反応はＲ１を相補因子から切断させ、Ｒ４へ転位させる。ＳとＴを反応させ、つづいてリンカーＬを切断し、Ｒ２およびＲ３をＲ４に転位させる。ＡとＢおよびＣとＤを反応させてＲ５およびＲ６をＲ４に転位させる。一例として、ボックス４と結合するモノマーの機能的部分は足場として供され、その上に種々の置換基が付加される。
【０１３６】
図３９：鋳型化された分子を選択するための典型的なパニングプロトコル
種々の小型分子の変種を提示する鋳型をＤＮＡコード化技法により産生する。これらの鋳型化された分子を固定された標的分子と一緒にインキュベートする。当該標的に対してアフィニティの低い鋳型化された分子を洗い流す。残りの鋳型化された分子を溶出し、鋳型をＰＣＲを用いて増幅させる。その場合、その強化鋳型はすぐにでも次のサイクルのコード化鎖として使用されるであろう。
【０１３７】
図４０：鋳型化された分子のアレイ
当該図面は鋳型化された分子のチップを示す。ＤＮＡライブラリーを適当な面のアレイフォーマットにスポットする。鋳型化された分子ライブラリー（一重鎖鋳型ＤＮＡ）を加え、相補ＤＮＡ鎖にハイブリッド形成させる。これにより鋳型化された分子の部位特異的固定がなされるであろう。標的分子を含有する生物学的試料を加え、未結合物質を洗い流す。最終工程は各単一スポットでの結合物質を検出することである。
【０１３８】
図４１ 組み込まれたモノマービルディングブロックの機能的部分の間での反応の可能性を増大させるための強固または一部強固なリンカーの使用
（Ａ）一またはそれ以上の柔軟領域（「ヒンジ」）および一またはそれ以上の強固な領域を含むリンカーを用いることによって、二つの機能的部分が反応するように接触する可能性を高くすることができる。
（Ｂ）一の強固な部分と二つの柔軟なヒンジを有するモノマービルディングブロックに使用される記号
【０１３９】
（Ｃ）（Ｂ）に記載される特徴を有するモノマービルディングブロック：モノマービルディングブロックは相補因子（横線）としてオリゴヌクレオチドを、機能的部分（ＦＥ）を相補因子と連結するリンカーとしてオリゴヌクレオチドを含有する。相補配列のリンカーの中心へのアニーリングは強固な二重螺旋の形成をもたらし；リンカーの両端では、一重鎖領域が保持され、それで二つの柔軟なヒンジが構成される。
【０１４０】
図４２ 組み込まれたモノマービルディングブロックの機能的部分の間の反応の可能性を増大させるためのジッパーボックスの使用
（Ａ）この例のリンカーは、相補的関係にある、ジッパーボックス（ａ）または（ａ’）を有する。（ａ）および（ａ’）の一時的相互作用を可能とする温度で操作することにより、反応基ＸおよびＹは、数回のアニーリング事象の間に、すぐ近くにある状態となる。それは他の手段で達成されるよりも長時間にわたってＸおよびＹをすぐ近くにある状態を維持する効果を有する。また、低温（ジッパーボックスが安定的に対をなして相互作用するところの温度）および高温（ジッパーボックスは別々の状態であるが、相補因子が鋳型のコード因子に安定して結合しつづける温度）の間の温度を循環させてもよい。高温と低温の間を数回循環させることで、所定の反応基Ｘが数個の反応基Ｙに曝され、実際に反応してＸＹ結合を形成するであろう。
（Ｂ）二つのオリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロックの配列を示す。相補因子、リンカーおよびジッパーボックスを構成する領域を提示する。
【０１４１】
図４３ 有機化合物の鋳型化合成−例示
（Ａ）三つのモノマービルディングブロックを用いる。各モノマービルディングブロックは活性化されたエステル（ＩＩ型反応基、（Ｘ））を含み、そのエステル部分は官能基Ｒｘを有する。足場（足場は鋳型に結合されていてもよい）にてエステルとアミンを反応させる際に、アミド結合が形成され、Ｒｘ基もアミド結合を介して足場にカップリングされる。これが同時に行う反応（アミド形成）および活性化（相補因子からのＲｘ部分の切り離し）の一例である。図２９を参照のこと。
【０１４２】
（Ｂ）（Ａ）と同様に、三つのアミンを三つのエステルと反応させ、三つのアミド結合を形成させ、それにより官能基Ｒｘを足場部分にカップリングさせる。しかしながら、（Ａ）とは反対に、足場はここでは鋳型によってコードされる。
（Ｃ）三つのモノマービルディングブロックを用いる。右端（固定点の一部）にある求核アミンは第３モノマーのエステルカルボニルを攻撃し；第３モノマーのアミンが第２モノマーのチオエステルを攻撃し、第１モノマーのホルナー−ウィッチ・エマンス（Ｈｏｒｎｅｒ−Ｗｉｔｔｉｇ Ｅｍｍａｎｓ）試薬はアルカリ性条件下で第３モノマーのアルデヒドと反応させる。この操作により鋳型化された分子を形成する。二重結合は、鋳型化の後に、飽和結合を形成するように水素添加により、あるいはまたミカエル付加に付すことにより修飾されてもよい。
【０１４３】
（Ｄ）足場のチオールをモノマー１のピリジン−ジスルフィドと反応させる。足場のアミンを第２モノマーのエステルと反応させる。二つのニトリルで活性化されたアルファ−位を、塩基の存在下、モノマー３’−チオエステルでアシル化する。アリールヨーダイドはモノマー４のアリールボロナートによりスズキカップリング（Ｓｕｚｕｋｉ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）に付され、ビアリール基を形成する。
（Ｅ）モノマー１は第１アミンをアシル化する。アリールヨーダイドはモノマー２によってスズキカップリングに付され、ベンジルアミンがモノマー３によりアシル化される。
【０１４４】
（Ｆ）ヒドラジンをアシル化し、つづいて環化してヒドロキシピラゾールを形成させる。アリールブロミドをモノマー１のアリールボロナートによるスズキカップリングに付し、最後にアルデヒドをモノマー４のホルナー−ウィッチ・エマンス試薬と反応させて、アルファ−、ベータ−非置換アミドを得、さらにＨ２／Ｐｄ−Ｃを用いて還元するか、または求核物質でミカエル付加に付すことで官能基を導入してもよい。
【０１４５】
図４４ α−およびβ−ペプチド、ヒドラジノペプチドおよびペプトイド オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロックを用いてのコード化
α−およびβ−ペプチド、ヒドラジノペプチドおよびペプトイドを生成するのに、鋳型化合成をどのように用いるかを示す。
【０１４６】
図４５ α−、β−、γ−およびω−ペプチドの環状無水物の使用を介する鋳型化
環状無水物の使用を介して、α−、β−、γ−およびω−ペプチドを生成するのに、鋳型化合成をどのように用いるかを示す。
【０１４７】
図４６ 反応基ＸおよびＹの反応で生じる新たな反応基
ＸおよびＹが反応して新しい反応基Ｚを形成する場合において、このことは、Ｚと反応する反応基Ｑを有するモノマービルディングブロックを組み込むことにより、鋳型化された分子の多様性を増加させるのに利用されうる。
（Ａ）ＸとＹが反応して、それ自体が相補因子から切り離れる、Ｚを形成する。ＺをＱと反応させ、Ｚを相補因子と連結させるリンカーを切断すると、鋳型化された分子が形成される。
（Ｂ）この場合は、ＸとＹが反応してＺを形成すると同時に、Ｘを相補因子に連結しているリンカーを切断する。ＺのＱとの反応で、鋳型化された分子が形成される。
【０１４８】
図４６の例１ 新しい反応基を形成することによる鋳型化合成
最初の三つのモノマービルディングブロックの機能的部分の反応は、第２工程において加えられるモノマービルディングブロックに保持される二つのヒドロキシルアミンと反応することができる、二つの二重結合の形成をもたらし、そして第２工程において加えられるモノマーに保持される一つのヒドロキシルアミンと反応することができる、一つのエステルの形成をもたらす。最後に、リンカーを剪断し、鋳型化された分子を形成する。
【０１４９】
図４７ 切断可能なリンカー
切断可能なリンカー、その切断のための条件、および得られる生成物を図示する。
【０１５０】
図４８ 鋳型化された分子の鋳型後の修飾
鋳型化工程に付した後、鋳型化された分子を修飾し、新しい特性を導入することができる。このリストはこれら鋳型化後のいくつかの修飾を記載する。
【０１５１】
図４９は実施例６４の結果を示す。
図５０は実施例６５の結果を示す。
図５１は実施例６６の結果を示す。
図５２は実施例６７の結果を示す。
図５３は実施例６８の結果を示す。
図５４は実施例７２の結果を示す。
図５５は相補鋳型に結合された鋳型化された分子を図示する。
図５６は実施例９９の結果を示す。
図５７ＡおよびＢは実施例９９の結果を示す。
図５８ＡおよびＢは実施例９９の結果を示す。
図５９は実施例９９の結果を示す。
図６０は実施例１０２の結果を示す。
図６１は実施例１０４の結果を示す。
図６２は実施例１０５の結果を示す。
図６３は実施例１０６の結果を示す。
図６４は実施例１１２の結果を示す。
【０１５２】
定義
α−ペプチド：ペプチド結合を含め、リンカーにより相互に連結した少なくとも二つのα−アミノ酸からなる、または本質的にそれらのみからなるペプチドをいう。
アミノ酸：少なくとも一つの側鎖または官能基を含む、一の炭素原子または炭素原子の鎖を含む中心部で分離されているアミノ末端部（ＮＨ２）とカルボキシル末端部（ＣＯＯＨ）を含む存在をいう。ＮＨ２はアミノ酸またはペプチドのアミノ末端に存在するアミノ基をいい、ＣＯＯＨはアミノ酸またはペプチドのカルボキシ末端に存在するカルボキシ基をいう。アミノ酸という一般名は天然および天然に存在しないアミノ酸の両方を含む。J. Biol. Chem., ２４３：３５５２−５９（１９６９）に列挙されており、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ、Ｓｅｃｔｉｏｎ１．８２２（ｂ）（２）に採用されている正式名称の天然アミノ酸は、以下の表２に列挙される一群のアミノ酸に属する。天然に存在しないアミノ酸として、例えば、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ、Ｓｅｃｔｉｏｎ１．８２２（ｂ）（４）に列挙されるものが挙げられ、そのすべてを出典を明示することで本明細書の一部とする。天然に存在しないアミノ酸のさらなる例を以下に示す。本明細書に記載するアミノ酸残基は「Ｄ」または「Ｌ」の異性体の形態であってもよい。
【０１５３】
記号
１文字 ３文字 アミノ酸
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
表２． 天然アミノ酸およびその各コード
【０１５４】
アミノ酸先駆体：その先駆体をペプチドに組み込むと、アミノ酸残基の生成能を有するものをいう。
増幅：鋳型化された分子のコピー数を増やす工程または工程のコンビネーションをいう。鋳型化された分子の増幅は、限定されるものではないが、各鋳型のコピー数を増やすためのポリメラーゼ連鎖反応を含む、鋳型により鋳型化されている鋳型化された分子の合成に由来の一連の官能基を含む鋳型化された分子のさらなるコピーを合成するために鋳型を用いる、現状のいずれの方法で行うこともできる。当該分野にて公知のいずれの増幅反応またはかかる反応のコンビネーションも当業者により適宜容易に認識されるように用いることができる。したがって、鋳型化された分子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、クローン化されたＤＮＡのインビボ増幅等を用いることにより増幅されうる。増幅方法は、好ましくは、結果として、増幅された混合物の割合が、本質的に、増幅前の混合物中の異なる配列の鋳型の割合を表すことが好ましい。
【０１５５】
塩基：天然または天然に存在しないヌクレオチドの窒素含有塩基、別の糖またはホスフェート基を含むかかるヌクレオチドの誘導体をいう。塩基の部分は、天然に存在する部分と異なり、二重螺旋の対向するヌクレオチド鎖の１またはそれ以上の塩基を補完することのできるいずれの部分も包含する。
ビルディングブロック：ａ）所定のコード因子の認識能を有する少なくとも一つの認識基を含む少なくとも一つの相補因子；ｂ）一の官能基および一の反応基を含む少なくとも一の機能的部分；およびｃ）少なくとも一の相補因子から少なくとも一の機能的部分を分離する少なくとも一のリンカー；を含む種であって、ビルディングブロックがリボソームを含まないところの、種をいう。好ましいビルディングブロックはヌクレオチド鎖に組み込まれる能力を有し、および／または本明細書に記載されるようにＩ型および／またはＩＩ型の反応基を含む反応により連結される能力を有する。
【０１５６】
切断可能なリンカー：所定の条件下で切断されうる残基または結合をいう。
切断：化学結合を破壊することをいう。結合は共有結合または非共有結合であってもよい。
【０１５７】
コード因子：認識基を含み、ビルディングブロックの所定の相補因子の認識能を有する鋳型の因子をいう。認識は共有結合に由来するものであってもよく、あるいは相互に相互作用することのできるコード因子と相補因子の対応する対の間の非共有結合の形成に由来するものであってもよい。
コード因子の相補性：コード因子を当該コード因子の認識能を有する所定の相補因子と密着することをいう。
相補化：コード因子を当該コード因子の認識能を有する所定の相補因子と接触する反応基に持ち込む工程をいう。コード因子および相補因子が塩基部分を含む天然ヌクレオチドを含む場合、所定のヌクレオチドのセットは塩基部分の間で形成される水素結合により相互に相補する能力を有する。
相補因子：ビルディングブロックの因子をいう。リンカーにより少なくとも一の機能的部分に連結される。コード因子を参照のこと。
【０１５８】
相補鋳型：各相補因子が隣の相補因子に連結されている相補化因子の配列をいう。相補化因子は所定のコード因子の認識能を有する。相補鋳型は線状であっても分岐状であってもよい。
複合体：鋳型化された分子の合成を鋳型化する鋳型に連結された鋳型化された分子をいう。鋳型は、本明細書に記載の、ハイブリッド形成されていてもよく、あるいは連結されているコード因子の対応する鋳型に結合されている相補鋳型とすることができる。
接触化：例えば、対応する反応基または対応する結合パートナーもしくはハイブリダイゼーションパートナーを相互に反応的に接触させることをいう。その反応的接触は反応あるいはパートナー間の結合またはハイブリダイゼーションの形成から明らかである。
対応する結合パートナー：相互に反応することのできる結合パートナーをいう。
対応する反応基：相互に反応することのできる反応基をいう。
【０１５９】
機能的部分：ビルディングブロックの一部を形成する存在をいう。機能的部分は官能基および隣接する官能基との連結能を有する反応基をいう。
官能基：鋳型化された分子の一部を形成する基をいう。鋳型化された分子の官能基の順序は、鋳型化された分子の合成をテンプレートする鋳型の能力の結果である。
相互作用化：接触化と互換的に使用される。例えば、コード因子と相補因子の形態の対応する結合パートナーなどの種を相互に反応的に接触させることをいう。反応は共有結合または非共有結合により対応する結合パートナーを形成する認識基により媒介されてもよい。相互作用は複数のコード因子を含む一の鋳型と複数のビルディングブロックを混合した結果として生じるかもしれない。
リガンド：本明細書においては、標的分子を標的とすることのできる鋳型化された分子をいうのに用いる。候補となる鋳型分子の個体群において、リガンドは大部分の個体群よりもより大きなアフィニティで結合するものである。候補となる混合物において、所定の標的に対して１個より多くのリガンドが存在しうる。リガンドは標的分子に対するその結合アフィニティにて相互に区別することができる。
【０１６０】
リンカー：
少なくとも二つの種を分離する残基または化学結合をいう。種は本質的に一定の距離で保持されていてもよく、あるいはリンカーが柔軟であって、種が相互に関連してある程度自由に動くことのできるものであってもよい。連結は共有結合であっても非共有結合であってもよい。連結される種として、例えば、ビルディングブロックの相補因子および機能的部分、鋳型の隣接するコード因子、相補鋳型の隣接する相補因子、および鋳型化された分子の隣接する官能基が挙げられる。
【０１６１】
天然ヌクレオチド：４種のデオキシリボヌクレオチド、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＣ（ＤＮＡの構成要素）および４種のリボヌクレオチド、Ａ、Ｇ、ＵおよびＣ（ＲＮＡの構成要素）が天然ヌクレオチドである。各天然ヌクレオチドは、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）、リン酸部分および天然／標準の塩基部分とからなるか、あるいは本質的にそれらのみからなる。天然のヌクレオチドは周知の塩基対律（ワトソンおよびクリック）、すなわち、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と対をなし、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対をなす、塩基対律に従って相補的ヌクレオチドに結合し、ここで対応する塩基対は相補的な逆平行鎖のヌクレオチドである。塩基対合は所定のヌクレオチドと相補的ヌクレオチドの間で特異的なハイブリダイゼーションをもたらす。塩基対合は、酵素が鋳型オリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドの合成を触媒することのできる原理原則である。この合成において、ビルディングブロック（通常、Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣまたはＧのリボまたはデオキシリボ誘導体の三リン酸）は、鋳型のオリゴヌクレオチドにより方向付けられ、正確かつ相補的な配列を有する相補的オリゴヌクレオチドを形成する。その相補的配列によるオリゴヌクレオチド配列の認識は、塩基対を形成する対応かつ相互作用する塩基により媒介される。自然界において、塩基対合に至る特異的相互作用は塩基の大きさならびに塩基のドナーおよびアクセプターの水素結合のパターンにより支配される。大きなプリン塩基（ＡまたはＧ）は小さなピリミジン塩基（Ｔ、ＵまたはＣ）と対をなす。加えて、塩基間の塩基対認識は塩基の間で形成される水素結合による影響を受ける。ワトソン−クリックの塩基対を幾何学的に表すと、６員環（天然オリゴヌクレオチドにおけるピリミジン）を、縮合した６員環と５員環からなる環系（天然オリゴヌクレオチドにおけるプリン）と並列させており、ドナー基がアクセプター基と対合するよう、中央の水素結合で二つの環原子が連結され、その両側の水素結合で各環に付した官能基が結合されている。
【０１６２】
隣接している：配列中で相互に隣り合う因子、基、存在または残基は隣接している。その各々が機能的部分に連結されている、二つの相補因子が機能的部分に連結されていない一の（またはそれ以上の）相補因子を介して相互に連結されている場合には、上記した相補因子は隣接しており、この二つの相補因子は、直接的または一の（またはそれ以上の）コード因子を介して、相互に連結されうる隣接する機能的部分および隣接するコード因子を特定する。
【０１６３】
天然に存在しないアミノ酸：上記した表２に列挙されていないアミノ酸をいう。天然に存在しないアミノ酸は、限定されるものではないが、修飾アミノ酸、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の立体異性体を包含する。
天然に存在しない塩基対合：天然に存在しないヌクレオチドの間での、あるいは天然ヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの間での塩基対合をいう。一例が米国特許第６０３７１２０号に記載されており、そこには８種の標準的でないヌクレオチド塩基が記載されており、天然の塩基が天然に存在しない塩基で置換されている。天然ヌクレオチドの場合と同様に、天然に存在しない塩基対は、単環式の６員環の、５員環と６員環の縮合した、縮合系の二環式の複素環式環系との対合を包含する。しかし、塩基対合を確立する水素結合のパターンは天然のＡＴ、ＡＵおよびＧＣ塩基対に見られるパターンと異なる。ワトソン−クリックの水素結合律に従うこの拡張されたセットの塩基対において、ＡはＴ（またはＵ）と対をなし、ＧはＣと対をなし、イソ−Ｃはイソ−Ｇと対をなし、ＫはＸと対をなし、ＨはＪと対をなし、そしてＭはＮと対をなす（図２）。ワトソン−クリック水素結合律に従うことなく塩基対合する能力を有するヌクレオベースもまた記載されている（Ｂｅｒｇｅｒら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８、２９１１−２９１４頁）。
【０１６４】
天然に存在しないヌクレオチド：天然ヌクレオチドの定義の範囲内にないヌクレオチドをいう。
ヌクレオチド：本明細書中で用いられるヌクレオチドは、鋳型方向性方法にて、天然または組換えＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの変種および機能的均等物を含む、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ活性を含む酵素により、オリゴヌクレオチドに組み込むことのできる、天然ヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方をいう。ヌクレオチド部分を含む、コード因子および相補因子の形態の対応する結合パートナーは、水素結合により相互に相互作用する能力を有する。相互作用は、一般に、「塩基対合」と称される。ヌクレオチドは、異なる燐酸部分、糖部分および／または塩基部分を有することで天然ヌクレオチドと異なっていてもよい。したがって、ヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の形態の天然の結合により、あるいは例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）の場合に見られるペプチド結合などの天然に存在しない結合の形態にて、鋳型または相補鋳型にあるその各々の隣接するヌクレオチドに結合してもよい。
【０１６５】
ヌクレオチドアナログ：別のヌクレオチドと塩基対合する能力を有するが、鋳型または相補鋳型に酵素的に組み込むことのできない、ヌクレオチドをいう。ヌクレオチドアナログは、時に、鋳型依存的方法にて、オリゴヌクレオチドへの組み込みを促進しない、天然に存在しない塩基または天然に存在しない骨格構造を有するモノマーまたはオリゴマーを包含する。しかしながら、特異的塩基対合を介して他のモノマーおよび／またはオリゴマーと相互作用することも可能である。特異的に塩基対合する能力を有するが、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼあるいはその変異体または機能的均等物などの酵素の基質として供することのできない、別のオリゴマーを、本明細書においてはヌクレオチドアナログと定義する。オリゴヌクレオチドアナログは、例えば、天然オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル−糖骨格が別の骨格、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリンを含む骨格で置換されているヌクレオチドを包含する。
【０１６６】
ヌクレオチド誘導体：ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはさらに付加された分子存在を含む。誘導化されたビルディングブロック（分子存在が付加されているヌクレオチド）は、誘導化されたヌクレオシドの三リン酸を基質として用い、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼによって、オリゴヌクレオチドに酵素的に組み込むことができることも多い。多くの場合、そのような誘導化されたヌクレオチドは、高い特異性で、成長しているオリゴヌクレオチド鎖の中に組み込まれる。このことは、この誘導体が鋳型の所定のヌクレオチドの反対側に挿入されることを意味する。そのような組み込みは特異的組み込みであると理解されるであろう。ヌクレオチドは、塩基、リボース／デオキシリボース単位またはリン酸上で誘導化されうる。塩基上の誘導化の好ましい部位として、アデニンの８−位、ウラシルの５−位、シトシンの５−または６−位およびグアニンの７−位が挙げられる。以下に記載のヌクレオチドアナログはその対応する位置で誘導化されていてもよい（Ｂｅｎｎｅｒ、米国特許第６０３７１２０号）。誘導化が塩基対合特異性を崩壊させない限り、誘導化で別の部位を用いてもよい。リボースまたはデオキシリボース部分を誘導化する好ましい部位は５’、４’または２’位置である。特定の場合には、核酸を分解に対して安定化させることが望ましく、２’−修飾されたヌクレオチドを用いることが有利である（米国特許第５９５８６９１号）。塩基対合特異性が崩壊されない限り、再度、別の部位を利用することもできる。最後に、リン酸を誘導化させてもよい。好ましい誘導化はチオリン酸化である。ヌクレオチドアナログ（後記する）もヌクレオチドと同様に誘導化されてもよい。ｉ）誘導化およびｉｉ）天然の塩基または天然に存在する骨格構造物の天然に存在しない塩基あるいはまた天然に存在しない骨格構造物との置換を含む、上記した種々の型の修飾を、各々、同じ分子中で一回またはそれ以上の回数適用できることは明らかである。
【０１６７】
オリゴヌクレオチド：本明細書においてポリヌクレオチドと互換的に使用される。オリゴヌクレオチドなる語は、天然および／または天然に存在しないヌクレオチドの両方（その組合せを含む）のオリゴヌクレオチドを含む。天然および／または天然に存在しないヌクレオチドは天然のホスホジエステル結合で連結されていてもよく、あるいは非天然の結合により連結されていてもよい。オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【０１６８】
オリゴマー：同一の型の、または異なる型であってもよい、複数のモノマーを含む分子をいう。オリゴマーは２以上のモノマーを含む分子を記載するためにポリマーと同意語として用いられる。オリゴマーは複数の同じモノマーを含むホモオリゴマー、同じ型の異なるモノマーを含むオリゴマー、または異なる型のモノマー（各型のモノマーは同一であっても異なっていてもよい）を含むヘテロオリゴマーであってもよい。
【０１６９】
分割：鋳型化された分子または一の鋳型に連結されたそのような分子を含む複合体を標的分子に優勢的に結合させ、かかる標的分子に対してアフィニティを有さず、その結果として、その標的分子に結合されていない、鋳型化された分子または一の鋳型に連結されたかかる分子を含む複合体より分離する方法をいう。分割は当該分野にて公知の種々の方法により達成され得る。唯一の要件は一の標的分子に結合された標的の鋳型化された分子を標的分子に結合されていない鋳型化された分子から分離するための手段である。分割する方法の選択は、標的分子の特性および鋳型化された分子の特性に依存するであろうし、当業者に公知の原理および特性に従って製造することができる。
【０１７０】
ペプチド：配列を特定する、アミド結合で連結されている、複数の共有結合したアミノ酸残基をいう。この用語はオリゴペプチドおよびポリペプチドにも同様に用いられる。アミノ酸は天然のアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸のいずれであってもよく、その組合せも包含する。天然のおよび／または天然に存在しないアミノ酸はペプチド結合または非ペプチド結合により連結されていてもよい。ペプチドなる語は、当該分野にて知られているように、化学的または酵素触媒的反応により誘発される翻訳後の修飾も包含する。かかる翻訳後の修飾は、所望により、分割の前に導入することができる。本明細書にて特定されるアミノ酸は、優先的には、Ｌ−立体異性体の形態である。２０種の天然に存在するアミノ酸の代わりに、アミノ酸アナログを使用することができる。フルオロフェニルアラニン、ノルロイシン、アゼチジン−２−カルボン酸、Ｓ−アミノエチルシステイン、４−メチルトリプトファン等を含む、数種類のそのようなアミノ酸は公知である。
【０１７１】
複数：少なくとも二つをいう。
ポリマー：その各々が一の官能基を含む、一連の共有結合した残基により特徴付けられる鋳型化された分子をいう。本発明のポリマーは少なくとも二つの残基を含む。
ポリヌクレオチド：オリゴヌクレオチドを参照のこと。
先駆体：一の残基を含み、一の鋳型化された分子の鋳型依存的合成の間に反応を受けることのできる部分をいい、その先駆体の残りの部分は鋳型化された分子の中に組込まれる。
反応基：相互に接触して反応する状態にあり、例えば、コード因子とその相補因子を連結するか、または鋳型化された分子の官能基をカップリングさせる、化学結合の形成能を有する対応する反応基をいう。
【０１７２】
認識基：コード因子の一部およびコード因子の認識能を有する補足因子の認識に関与する部分をいう。好ましい認識基は天然および天然に存在しないヌクレオチドの天然および天然に存在しない窒素塩基である。
組換え：組換え技法は一の方法により２またはそれ以上の配列を組み換えるものであり、その生成物は２またはそれ以上の各々の配列から由来の配列を含む一の配列を有する。ヌクレオチドに関する場合、組換えは、同じヌクレオチド配列の部位で、あるいは同一でないヌクレオチド配列の部位で、２またはそれ以上のヌクレオチド分子の間でヌクレオチド配列を変更することを含み、その場合、組換えは無作為に起こりうる。ヌクレオチド配列の中で組み換える一の型は、当該分野にて、遺伝子シャフリングと言われる。
【０１７３】
繰返し配列：分子中で１回より多く存在する、少なくとも２つの因子、基、または残基の配列をいう。
残基：各残基が一の官能基を含む、共有結合した残基の配列を含むポリマーをいう。
【０１７４】
リボース誘導体：鋳型または相補鋳型に酵素的に組み入れられる能力を有するヌクレオチドの一部を形成するリボース部分をいう。例えば、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）およびシチジン（Ｃ）を含め、リボース誘導体を天然のリボヌクレオチドと区別する誘導体が挙げられる。リボース誘導体のさらなる例が米国特許第５７８６４６１号に記載されている。該用語はデオキシリボースの誘導体を含み、上記した開示と同様に、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシチミジン（ｄＴ）およびデオキシシチジン（ｄＣ）を含め、デオキシリボース誘導体と天然に存在するデオキシリボヌクレオシドと区別する場合の誘導体を含む。
【０１７５】
選択的に切断可能なリンカー：選択的に切断可能なリンカーは一の切断可能なリンカーが切断される条件下では切断され得ない。したがって、同じ鋳型化された分子中で、下位群の相補因子と官能基を連結する選択可能なリンカーを同時に切断することなく、相補因子と鋳型化された分子の官能基を連結する切断可能なリンカーを切断することが可能である。すなわち、鋳型化された分子と、鋳型化された分子の鋳型介在の合成を指令する鋳型を含む複合体であって、鋳型と鋳型化された分子が一またはそれ以上の、好ましくは一の選択的に切断可能なリンカーで連結されている複合体を得ることが可能である。
【０１７６】
特異的認識：例えば、コード因子と、好ましくは一の所定の相補因子との相互作用をいう。認識基のコード因子の相補基との親和性が優勢的に一つだけの型の対応する結合パートナーをもたらす場合に、特異的認識が生じる。単なる誤対合の組み込みは対応する結合パートナーの特異的認識を排除しない。特異的認識とは、臨機応変に定められる語である。所定の結合パートナー、例えば、鋳型化された分子と標的分子の間の所定の相互作用の関連で、標的分子と候補標的分子の混合物の間で観察されるよりも大きな親和性の鋳型化された分子と標的分子の結合相互作用が観察される。結合親和性を比較するために、結合反応の両方の条件は本質的に同様で、好ましくは同一でなければならず、その条件は意図する使用条件に匹敵するものでなければならない。間違いなく比較するために、鋳型化された分子全体と標的分子全体の間の相互作用を反映する測定が行われるであろう。本発明の鋳型化された分子は、必要な特異性を要求する選択条件を確立することで、あるいは鋳型化された分子を調整または修飾することで、要すれば特異的であるように選択することができる。
【０１７７】
サブ単位：少なくとも一つのそのようなサブ単位を含むコード因子のモノマーをいう。
支持体：例えば、少なくとも一つのビルディングブロックの相補因子との相互作用の間にコード因子が結合されうる固体または半固体部材をいう。機能性分子または標的分子もまた、標的化の間に固体支持体に結合させることができる。支持体の例として、シリコンウェハーならびにビーズを含む、平面が挙げられる。
タグ：それの結合する化合物の同定能を有する存在をいう。
【０１７８】
標的分子：リガンドの形態の鋳型化された分子が望ましい、目的とする化合物をいう。標的分子は蛋白、融合蛋白、ペプチド、酵素、核酸、核酸結合蛋白、炭水化物、多糖類、糖蛋白、ホルモン、受容体、受容体リガンド、細胞膜成分、抗原、抗体、ウイルス、ウイルス成分、基質、代謝産物、遷移状態アナログ、共同因子、阻害剤、薬物、制御物質、色素、栄養素、成長因子、トキシン、糖脂質など（限定されるものではない）とすることができる。
【０１７９】
鋳型：
鋳型は、特記しない限り、コード因子の鋳型および相補因子の（相補）鋳型の両方をいう。コード因子の鋳型をいう場合、各コード因子は隣接するコード因子に共有結合されている。各コード因子は所定の相補因子の認識能を有している。コード因子は、各々、所定の相補因子の認識脳を有する。鋳型は線状であっても、直鎖状であってもよい。コード因子の鋳型は鋳型化された分子の合成において一定の役割を有し、相補的活性はコード因子：コード因子ハイブリッドの形態の特異的ペアリングパートナーの形成に関与する。ここで、相補因子は鋳型化された分子の一部を形成する官能基をも含むビルディングブロックの一部を形成する。鋳型は、好ましくは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのストリングである。鋳型がヌクレオチドのストリングを含む場合、ヌクレオチドは天然であってもなくてもよく、チオリン酸結合により、あるいは天然のホスホジエステル結合により連結されていてもよい。ヌクレオチドアナログは、例えば、アミド結合、ペプチド結合、ヌクレオチドアナログストリングがヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの別のストリングと特異的にハイブリッド形成するようにヌクレオチドアナログと連結する能力を有するいずれか均等な手段により連結させることができる。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、リボース誘導体あるいは鋳型または相補鋳型をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの別のストリングと特異的にハイブリッド形成させることのできるいずれか別の分子部分であってもよい。
【０１８０】
鋳型依存性合成：鋳型依存性組み込みおよび鋳型化合成と同異議に用いられる。鋳型依存性合成は、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子の形成が、コード因子のストリングと個々の相補因子との接触によって生じる、ところの方法である。すなわち、当該方法はコード因子と官能基の一対一の関係を定めるものであり、鋳型の接触されたコード因子が官能基の一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子への組み込みを方向付ける。したがって、鋳型化された分子の官能基の配列と、鋳型化された分子の合成をテンプレートする鋳型のコード因子の配列の間には所定の一対一の関係がある。かくして、鋳型化された分子を鋳型化合成する間、一の官能基はまず、リンカー部分および／または相補因子あるいは別の手段により、個々の官能基を鋳型化された分子にテンプレートする能力を有するコード因子と接触している。鋳型がヌクレオチドまたは本質的にヌクレオチドのみからなる場合、オリゴヌクレオチドの鋳型依存性合成は、各ヌクレオチドが鋳型にあるその対合パートナーと、一塩基に対する一塩基の対合形式にて、相互作用することを基礎とするものである。その相互作用は、鋳型にあるその塩基対合パートナーに対向する相補ヌクレオチドの組み込みを特定する。結果として、各オリゴヌクレオチド鎖からの、複素環塩基を含む、一の塩基が相互作用して特定の塩基対を形成する。この塩基対合特異性は塩基間のワトソン−クリック水素結合相互作用を介してなすことができる。ここで、塩基は天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）および／または天然に存在しない塩基、例えば、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第６０３７１２０号に開示される塩基であってもよい。さらには、天然に存在しない塩基の例は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロック核酸）およびモルホリノである。非標準的塩基対を含有するオリゴヌクレオチドの塩基対合は水素結合以外の別の手段（例えば、疎水性ヌクレオ塩基と「相補性」構造物との相互作用；Bergerら、２０００、Nucleic Acids Research、２８、２９１１−２９１４頁）により達成することができる。相互作用しているオリゴヌクレオチドならびに個々のヌクレオチドは相補関係にあるようである。オリゴマーの間の相互作用の特異性は、ヌクレオチドと他のヌクレオチドとの、あるいは所定のサブセットのヌクレオチドとの特異的塩基対合、例えば、ＡのＵとの塩基対合、およびＣとＧとの塩基対合から由来するものである。
【０１８１】
鋳型化された：鋳型化された分子に連結した鋳型を含む複合体の鋳型化された分子の特徴をいい、その鋳型化された分子は鋳型を用いる鋳型依存性合成により得ることができる。かくして、複合体の一の成分（鋳型）は他の成分（鋳型化された分子）の合成をテンプレートする能力を有する。かかる語はまた、官能基の鋳型化された分子への組み込みによって生じる鋳型化された分子の合成を記載するのにも用いることができる。ここで、各官能基の組み込みはコード因子を個々の官能基と、あるいは当該官能基を含むビルディングブロックと接触させることに伴って生じる。ここに、接触される鋳型のコード因子は、このように、鋳型化された分子の合成をテンプレートする鋳型に連結されている鋳型化された分子へ官能基を組込むことを指令する。かくして、鋳型化された分子の鋳型化合成の間、一の官能基はまず、直接的にまたはリンカー部分および／または相補因子により、その個々の官能基を鋳型化された分子にテンプレートする能力を有するコード因子と接触する。
【０１８２】
鋳型化された分子：共有結合した官能基の配列を含む分子であって、その鋳型化された分子が鋳型を用いる鋳型依存性合成により得ることができる分子をいう。かくして、複合体の一の成分（鋳型）は他の成分（鋳型化された分子）の合成をテンプレートする能力を有する。鋳型がヌクレオチドからなるか、または本質的にヌクレオチドのみからなる場合、鋳型は増幅させることができ、ここでこの鋳型の増幅は複数の鋳型化された分子をもたらす。ここに、各鋳型化された分子は鋳型を用いる鋳型依存性合成により得られる。鋳型または相補鋳型を増幅した後、鋳型化された分子は、コード因子の鋳型または相補因子の相補鋳型を、鋳型化された分子の鋳型依存性合成のための鋳型として用いる鋳型依存性合成により得ることができる。
鋳型化：鋳型化された分子を生成する方法をいう。
変種：所定の鋳型または鋳型化された分子と、各々、ある程度の同一性または相同性を示す、鋳型または鋳型化された分子をいう。
【０１８３】
発明の詳細な記載
本発明の一の好ましい具体例において、膨大な量（例えば、約１０３ないし約１０１８以上）の「鋳型化されたポリマー」の生成を可能とする、「鋳型化された分子の化学提示」が提供される。ここで、各鋳型化された分子は、個々に、その個々のポリマーを同定するのに、ならびに増幅の手段（その分子の多くのコピーは鋳型を複製する操作により調製することができる）として供する「鋳型」に連結される。本発明の好ましい具体例を、本発明の種々の工程を示す図１にて開示する。
【０１８４】
工程１． 合成
異なるモノマービルディングブロックを合成する。ビルディングブロックは機能的部分および相補因子を含み、切断可能なリンカーにより連結されている（図３および４）。好ましいビルディングブロックは一のヌクレオチドを含み、そこに切断可能なリンカーを介して機能的部分が付加されており、その機能的部分は「活性化可能な」ポリマー単位を含んでいても、あるいは本質的にその単位からのみなっていてもよい（図６）。
【０１８５】
工程２． 組込み
ビルディングブロックを鋳型依存性ポリマー合成にて基質として用いる。一の具体例において、ビルディングブロックはヌクレオチド誘導体であり、ポリメラーゼを用いてそのヌクレオチド誘導体をオリゴヌクレオチド鎖にオリゴヌクレオチドの鋳型の方向に従って組み込むのが好ましい。その結果、相補鋳型（組み込まれたビルディングブロックのストリング）が形成され、そこから機能的部分がはみ出ている。機能的部分の配列を、鋳型のヌクレオチドなどのコード因子の配列により決定する。
【０１８６】
図１は、重合および活性化の後、鋳型化されたポリマーをその鋳型に連結することのできる、選択的に切断可能なリンカーを有するビルディングブロックの使用を記載する。また、選択的に切断可能なリンカーは、鋳型のポリマーをコード化する部分の上流または下流にてアニールすることのできるオリゴを含んでいてもよく（図７または８を参照のこと）、あるいは鋳型に直接連結されていてもよい。
ビルディングブロックは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆トランスクリプターゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼ、クレノーフラグメントなどの酵素あるいはモノ−、ジ−またはポリ−ヌクレオチドなどの相補因子の組込みを触媒するであろう他の酵素により組み込まれるのが好ましい。これらのうちいくつかのケース（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）においては、プライマーが必要とされる。他のケース（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）においては、プライマーは必要とされない。
【０１８７】
工程３． 重合化
機能的部分は、各々、隣接する機能的部分と反応し、相補鋳型を形成する間またはその後でポリマーを形成することが好ましい。条件の変化、例えば、光分解、温度変化またはｐＨ変化は、相補鋳型の形成の間にまたはその後で重合を開始する可能性がある。
【０１８８】
工程４． 活性化
形成されたポリマーは、単一の位置を含め、一またはそれ以上の所定の位置で、リンカーを切断できないことを除き、残りのリンカーの切断をもたらす条件下で、少なくとも一つのポリマーまたは複数の切断可能なポリマーを切断することにより相補因子から切り離すことが好ましい。その結果として、鋳型化されたポリマーが一またはそれ以上の位置で、好ましくはわずか一つの位置で、それをコードする鋳型に結合されている。
【０１８９】
工程５． 選択および増幅
その後、選択工程を行う。ここでは、その各々がその合成を方向付ける鋳型に結合されている、膨大な量の異なる鋳型化された分子を、一の分子または物理的標的（例えば、生物学的受容体または表面）で攻撃するか、または特定のスクリーンに曝す。まず鋳型を増幅させ、ついでその鋳型を新ラウンドの鋳型化されたポリマーの合成のために用いることにより所望の特性（例えば、一の受容体との結合）を有する鋳型化された分子を回収して増幅させる。選択および増幅の工程は、適当な特性（例えば、受容体に対して高アフィニティ）を有するポリマーが単離されるまで、数回することができる。
【０１９０】
典型的な選択プロトコルは、鋳型−鋳型化された分子の複合体の集団（ライブラリー）を、特定の分子標的（例えば、受容体）を固定したアフィニティカラムに添加することを含む。そのカラムを洗浄した後、結合剤を溶出させる。この溶出液は固定された標的分子と親和性を有する鋳型−鋳型化された分子の複合体に富む集団からなる。その富化集団を増幅ラウンドに付し、さらに選択ラウンドに付す。その場合の条件はさらに厳格であってもよい。そのような多くの選択および増幅ラウンドに付した後、アフィン変換の高い結合剤に富む集団が得られる。
【０１９１】
鋳型化された分子の細胞内に吸収されるようになる能力について選択する場合、その選択工程は鋳型−鋳型化された分子の複合体の集団と細胞とを軽く混合することを必要とするかもしれない。（鋳型−鋳型化された分子の複合体の吸収を可能とするように）インキュベーションした後、細胞を洗浄し、吸収された鋳型−鋳型化された分子の複合体を細胞を溶解させることで回収することもできる。上記したように、鋳型−鋳型化された分子の複合体を増幅させ、選択および増幅のさらなるラウンドに付すこともできる。多くの選択および増幅のラウンドに付した後、吸収される能力を有する鋳型化された分子に富む集団が得られる。
【０１９２】
ビルディングブロック−モノマー設計
ビルディングブロック（「モノマー」ともいう）は、図３および４に示される一般的な設計であることが好ましい。一の具体例におけるモノマーは次の因子：相補因子−リンカー−ＩＩ型反応基を含む骨格−官能基を含み、ここで相補因子は認識基およびＩ型反応基を含むか、または本質的にそれらのみからなる。この場合、リンカーは、好ましくは、「跡を残さないリンカー」、すなわち、機能的部分上にいずれの（望ましくない）分子存在も残さないリンカーである。この組成のビルディングブロックが、例えば（図１５の例７）にて用いられている。
【０１９３】
また、モノマーは相補因子−リンカー−官能基−ＩＩ型反応基を含有する骨格の組成を有していてもよく、そのような場合には、リンカーを切断した結果として、望ましい官能基が創製される。この組成のビルディングブロックが、例えば（図１７の例１）にて用いられている。
官能基は、相補因子を組み込む、その重合および活性化の方法に適合するものでなければならない。これらの工程において鋳型および鋳型化された分子の完全性を保持することが重要であることは言うまでもない。
【０１９４】
組込み、重合または活性化の条件と適合しない官能基は、これらの工程の間、保護する必要があり、あるいはまた、これらの工程を行った後に官能基を導入するようにしなければならない。後者は、組込み、重合および活性化と適合し、活性化の後で加えられる、二機能性分子（例えば、所望の官能基、Ｒｘと連結されたチオール）と特異的に反応するであろう、官能基（例えば、活性化されたジスルフィド）をテンプレートすることでなされる。別法として、機能性は、例えば、活性化した後の組込まれた機能的部分を酸化または他の形態の処理により導入することもできる。この方法にて、天然のエフェクター分子の成分またはそうしないと取り扱いが困難である合成薬物などの機能性を組み込むこともできる。
上記した本発明の方法の具体例において、重合反応はリンカーの切断を含んでいるため、リンカーを切断する必要なない（図１４および図１４の例１）。
【０１９５】
ヌクレオチドである場合、相補因子は１個、２個または数個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含有してもよい。ジ−、トリ−またはより大きなオリゴヌクレオチドの使用には、多くの利点がある。第一に、モノマーのより高度の多様性が当該鋳型によってコードされる。第二に、機能的部分の相補因子との結合部位の要件がより緩和されるようになる。第三に、形成されるポリヌクレオチドにおいて、モノヌクレオチド当たりの体積が小さくなり、より高度の提示効率に至る可能性がある。第四に、より大きな長さの残基単位のポリマーの提示を可能とする。また、より大きな官能基の提示を可能とする。
ポリメラーゼがビルディングブロックを含むヌクレオチドの組み込みに利用される場合には、その増殖鎖に特異的かつ効率的に組み込まれるように、ヌクレオチドは誘導化されていることが好ましい。
【０１９６】
１００種以上のヌクレオシド−およびヌクレオチド−誘導体が利用可能であり、あるいは簡単な技法（Eaton、Current Opinion in Chemical Biology、１９９７、１：１０−１６）を用いて製造することができる。その上、塩基またはリボース上で修飾された、多くのヌクレオチド−誘導体が、種々のポリメラーゼ、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび逆トランスクリプターゼを用いて効率的かつ特異的に組み込まれる（図９）。３００Ｄａまでの追加物を有するヌクレオチドは特異的かつ効率的に組み込まれた（Wiegandら、Chemistry and Biology、１９９７、４：６７５−６８３；FennおよびHerman、Analytical Chemistry、１９９０、１９０：７８−８３；TarasowおよびEaton、Biopolymers、１９９８、４８：２９−３７）。４種の塩基対（ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＣＧ、ＧＣ）に加えて、少なくとも８種の塩基対が特異的にハイブリッド形成することが知られており、そのうちのいくつかは鋳型依存的方法にてポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドに組み込まれる。
【０１９７】
相補因子の組込みは化学的または生物学的触媒により触媒され得る。ビルディングブロックがヌクレオチドである場合、特に関連する触媒は、逆トランスクリプターゼを含む、鋳型依存性ＤＮＡ−およびＲＮＡ−ポリメラーゼ、ならびにＤＮＡ−およびＲＮＡ−リガーゼ、リボザイムおよびデオキシリボザイムである。特定の例として、ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼ、ＡＭＶ逆トランスクリプターゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡ変異体Ｙ６３９Ｆ、シークエナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント）、ＤＮＡ−リガーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、イー・コリＲＮＡポリメラーゼ、ｒＴｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｅＤＮＡポリメラーゼ、（Johnstonら、Science、２００１年５月１８日、１３１９−１３２５頁に記載されるような）リガーゼおよびレプリカーゼ活性を有するリボザイム、およびヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを基質として受け入れる他の酵素が挙げられる。改良された特徴、例えば、拡張されたヌクレオチド基質特異性を有する変異体または操作されたポリメラーゼ、および校正機能が（例えば、ヌクレアーゼ活性を除外することによって）除去されている変異体が特に関連するものである。ポリメラーゼは鋳型として一重鎖または二重鎖ヌクレオチドを用い、一重鎖または二重鎖ヌクレオチド産物を産生することができる。
【０１９８】
ポリメラーゼにより許容されることが明らかにされた修飾の部位として、次に限定的に列挙した例示が挙げられる（図９も参照のこと）：
ヌクレオチド 修飾部位
ｄＡＴＰ ３−位
ｄＡＴＰ ７−位
ｄＡＴＰ ８−位
ｄＡＴＰ ２’（デオキシリボース部分）
ｄＴＴＰ ４’（デオキシリボース部分）
ｄＧＴＰ ７−位
ｄＣＴＰ ２’（デオキシリボース部分）
ｄＵＴＰ ２’（デオキシリボース）
ＵＴＰ ５−位
ＡＴＰ ８−位
【０１９９】
ターミナルトランスフェラーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼならびに遺伝子操作された変種または変異体を含む、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを基質として許容する他の鋳型依存性酵素を、本発明に記載する用途および変形した方法に用いることができる。
ハイブリダイゼーションまたは組込み特異性を削除することなく、機能的部分をヌクレオチドの他の部位に取り付けることも可能である。特に、ジ−、トリ−またはポリヌクレオチドである相補因子を用いる場合、特異的な組込みを阻害することなく、機能的部分をこれらの別個の部位に組み込むことも可能である。
【０２００】
切断可能なリンカーおよび切断できないリンカー
切断可能なリンカーおよび保護基ならびにそれらを切断する試薬の選択は図１０に説明されている。本発明の一の態様において、リンカーは以下のリスト：炭化水素および置換炭化水素；ビニル、ポリビニルおよび置換ポリビニル；アセチレン、ポリアセチレン；アリール／ヘテロアリール、ポリアリール／ポリヘテロアリールおよび置換ポリアリール／ポリヘテロアリール；エーテル、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコールおよび置換ポリエーテル；アミン、ポリアミンおよび置換ポリアミン；二重鎖、一重鎖または部分二重鎖の天然および天然に存在しないポリヌクレオチドおよび置換された二重鎖、一重鎖または部分二重鎖の天然および天然に存在しないポリヌクレオチド；ポリアミドおよび天然および天然に存在しないポリペプチドおよび置換されたポリアミドおよび天然および天然に存在しないポリペプチドから選択することができる。
【０２０１】
本発明の一の態様において、リンカーは、同じモノマーにて、または別のモノマーにて、他のリンカー、相補因子または機能的部分と反応しないことが好ましい。さらに、本明細書に提案されているいくつかのスキームにおいて、リンカーは重合条件で切断されないことが望ましい。最後に、リンカー切断の条件は、鋳型、相補鋳型または機能的部分の一体性に影響を及ぼさないことが好ましい。
リンカーは、所定の条件に付されると、かなり多くの方法で切断することができる。リンカーは、例えば、酸、塩基、光分解、高温、試薬の添加、酵素、リボザイムまたは他の触媒で切断することができる。切断可能なリンカーおよびその各保護基の例を、リンカー切断の条件および切断生成物と共に図１０に示す。
鋳型と鋳型化された分子の間の物理的連結を維持するには、少なくとも一つの切断できないリンカーが必要とされる。この切断されないリンカーは、鋳型を鋳型化された分子に最適な方向にて暴露することができるように可撓性であることが好ましい。
【０２０２】
官能基
機能的部分にある一またはそれ以上の官能基は、鋳型化された分子に所望の特性を付与する、あるいは別の有用な目的に役立つ、回収を目的とした脂肪親和性を有する、化学的な種々の基より選択できる。限定されるものではない、官能基の選択を以下に示す：ヒドロキシ；アルコキシ；水素；第一、第二、第三アミン；カルボン酸；カルボン酸エステル；ホスフェート、ホスホネート；スルホネート、スルホンアミド；、アミド；カルバメート；カルボネート；ウレア；アルカン、アルケン、アルキン；無水物；ケトン；アルデヒド；ニトレート、ニトライト；イミン；フェニルおよび他の芳香族基；ピリジン、ピリミジン、プリン、インドール、イミダゾールおよび複素環式塩基；複素環；多環；フラビン；ハライド；金属；キレート；機構的阻害剤；小型分子触媒；デキストリン、糖類；フルオレセイン、ローダミンおよび他のフルオロホール；ポリケチド、ペプチド、種々のポリマー；酵素およびリボザイムならびに他の生物学的触媒；重合後／活性化後の官能基のカップリングのための官能基；薬物、例えば、タクソール成分、アシクロビル成分、「天然生成物」、超分子構造物、例えば、ナノクラスター；脂質；およびオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ）。
【０２０３】
ＩＩ型反応基
種々の反応基ＩＩを鋳型化合成に用いることができる。反応基の例として、限定されるものではないが、Ｎ−カルボキシアンハイドライド（ＮＣＡ）、Ｎ−チオカルボキシアンハイドライド（ＮＴＡ）、アミン、カルボン酸、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、エステル、チオエステル、二重結合のコンジュゲート系、アルキルハライド、ヒドラジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、エポキシド、ハロアセチル、ＵＤＰ−活性化糖、スルフィド、シアネート、カルボニルイミダゾール、チアジナノン、ホスフィン、ヒドロキシルアミン、スルホネート、活性化ヌクレオチド、ビニルクロリド、アルケンおよびキニンが挙げられる。
【０２０４】
重合
ポリマーを形成するに至る反応を重合反応という。主な反応の種類は、アニオン性重合、カチオン性重合、ラジカル重合およびペリ環状重合である。
溶液中の重合反応は最先端の方法で達成することができるが、本明細書に記載されるような機能的部分のアレイへの重合は標準型反応を構成するものではない。現時点では、ほんの二、三の例の重合反応がアレイフォーマットでなされているが、本発明の方法と関連するものではない。結果的に、これは機能的部分の分子設計とそのリンカーおよび相補因子との結合点（例えば、塩基、リボースまたはヌクレオチドのリン酸への結合）の問題であり、ならびに溶液中で起こる望ましくない反応を、好ましくは、減少させ、最小にし、あるいはまさに無くし、その一方でアレイでの正確な鋳型依存的重合を増加させ、あるいは最大とするために、重合条件を最適化する問題である。
【０２０５】
本発明は、一の具体例において、液体合成スキームにて慣用的に使用されるという意味で、基本的には、最先端の技術より知られている重合反応を利用する。しかしながら、本発明においては、反応物（反応基）はそれが相補鋳型の因子と結合することにより近接して保持される。このことは局所濃度を有意に増加させる。典型的な合成スキームは溶液中で１μＭ−１ｍＭの濃度の反応物を用いる。本明細書にて開示されているようにアレイされていると、その局所濃度は、典型的には、千ないし百万倍高いであろう。その結果、反応は、基本的に、ずっと効率的となる。しかし、反応は、望ましくない副反応の発生が回避されるように、設計されることが好ましい。本発明の分子設計および重合条件はこのことを反映しており、当業者であれば、溶液中で関連する鋳型依存性重合反応を最大とする重合条件および分子設計を検索し、最適とすることができる。
【０２０６】
開始剤および反応基の型に応じて、ｐＨおよび／または温度を変更することにより、反応物または触媒、酵素またはリボザイム、または光、ＵＶあるいは他の電磁放射線などを付加することにより、重合を開始および／または触媒することができる。特に関連する酵素は、プロテアーゼ、蛋白リガーゼ（例えば、サブチリガーゼ）、ＵＤＰ−グリコーゲンシンセターゼ、ＣＧＴアーゼおよびポリケチドシンターゼを包含する。条件および分子設計が細かく調整されている場合において、溶液では有意に反応しないが、相補鋳型上にアレイされている反応物の重合を効果的にするのに、重合を起こす必要はない。アレイでの高い局所濃度は簡単に重合を推進する。
【０２０７】
モノマービルディングブロックの組込みが酵素によりなされる場合には、この酵素を上記した酵素の一つ（例えば、ＵＤＰ−グリコーゲンシンセターゼ）と融合させてもよい。このことは融合蛋白がまずそのＩ型反応基との反応を介してモノマーを組み込むことを可能とし、その直後（今、組み込まれたモノマーは酵素の活性部位からはみ出しているため）、その融合蛋白の残りの半分（例えば、ＵＤＰ−グリコーゲンシンセターゼ）はモノマーの機能的部分を相補鋳型にある前のモノマーの機能的部分に連結するであろう。
【０２０８】
官能基（または骨格構造物）は、組込み、重合および活性化の間、該系の反応基または他の成分と反応しないように、保護されていなければならない。このことは、そのいくつかが図１０に示されている、標準的な保護基を用いて行うことができる。
本明細書に記載の重合反応は、機能的部分が相補鋳型に対して配向が固定されているか否かに応じて、二つの主要なグループに分けることができる。
【０２０９】
グループ１：機能的部分は相補因子に対して回転することができる（したがって、相補鋳型に対して回転することができる）
反応基の直接連結：一のモノマーのＩＩ型反応基はもうひとつ別のモノマーのＩＩ型反応基と直接反応する。
【０２１０】
ａ）一例として、機能的部分は二つの同種の反応基Ｘ１およびＸ２を有する。この「同種」なる語は所定のＸ１が同じＸ１および同じでないＸ２の両方と反応しうることを意味する。図１１において、Ｘ１およびＸ２は同一であり、したがってそれらは共にＸの記号で表す。Ｘはもうひとつ別のＸと反応してＸＸを形成することもできる（図１１）。一例として、Ｘがチオール（−ＳＨ）であり、得られた生成物がジスルフィド（−ＳＳ−）であってもよい。もうひとつ別の例として、Ｘは光導入にて隣接するモノマーのクマリン成分と反応するクマリン成分とすることができる（図１１の例１）。
大抵の場合、ＸとＸの反応は原子または分子成分の喪失をもたらす；チオールの場合、例えば、ジスルフィド形成の際に二つのプロトンが失われる。（二つのＩＩ型反応基の間の反応の結果としての）ＸＸがＸとＸの成分のすべてを含有するものではないということが図５のＡに示されており、実際、両方の型（Ｉ型およびＩＩ型）の反応基は、反応して、反応基と少し違う化合物を形成する（図において円を重ねることで記号で示す）。
【０２１１】
ｂ）二つのＩＩ型反応基は異種のものであってもよい。本明細書に示す「異種」なる語はそれらが異なる型の分子と反応することを意味する。例えば、ＸとＹは、各々、求核物質および求電子物質であってもよい。ＸとＹは反応してＸＹを形成する（図１２）。さらに長い鋳型化された分子の場合、機能的部分が多数のモノマーが組み込まれるまで反応しないならば、機能的部分の相補鋳型に対して自由に回転することは問題となる可能性がある。この場合、クラスター形成（図１３）は全長の鋳型化ポリマーの量を減少させる結果をもたらす。しかしながら、この問題はより長いポリマーにとって有意であるにすぎず；ファージ提示およびポリソーム提示などのα−ペプチドの生物学的提示を用いる実験から、１％と低い提示効率で所定の標的について高い結合アフィニティを有するペプチドを単離するのに十分であることが知られている。
【０２１２】
特定の場合には、相補鋳型に組み込まれた直後にその組み込まれたモノマーを反応させる（その時点で、相補鋳型にある隣のモノマーは未だ組み込まれていない）。したがって、最後に組み込まれたモノマーは（既に相補鋳型の一部である）第２の最後に組み込まれたモノマーと反応するであろう。その結果、クラスター形成はこの場合には有意な問題ではないであろう。
ＸおよびＹはアミンおよびカルボン酸であってもよい。カルボキシイミドの存在にて、ＸおよびＹは反応してアミドＸＹを形成するであろう。
【０２１３】
この型の重合のもうひとつ別のバージョンはポリマーの同時の重合および活性化を伴うことである（図１４）。モノマーは分離されるリンカー成分を含有しておらず；むしろ、重合反応が活性化（機能的部分の相補鋳型からの切り離し）をもたらす。このスキームにおいては、各モノマーを組み込み、前に組み込まれたモノマーと反応させ、その前に組み込まれたモノマーの相補鋳型からの切り離しを誘導し、次のモノマーを組み込む。図１４の例１は、この原理を用いて、ポリアミド、この場合にはβ−ペプチドの形成を示す。この方法は他のペプチドならびにまたいずれの種類のポリアミドに使用できることも明らかである。
モノマーを適当に設計することにより、求核置換反応により、アミド、エステル、カルバメート、カルボネート、ホスホネート、ホスホジエステル、スルホンアミド、ウレア、カルボペプチド、グリコペプチド、サッカライド、ヒドラジド、ジスルフィドおよびペプチド結合を含む、他の型のポリマー結合を形成することができる。
【０２１４】
図１４の例２においては、同じ原理を型の異なる反応、「ローリング・サークル・ポリメリゼーション・リアクション」に適用している。効果的な脱離基としてアルキルスルホネートを用い、第２アミンを形成させる。その結果がその合成を方向付ける鋳型に対して一端にて官能基導入されているポリアミンを結合させることである。同様の方法において、類似する設計のモノマーを用いてポリエーテルおよびポリチオエーテルを生成することもできる。図１４および図１４の例１および２に記載の原理を用いて生成することのできるポリマーとして、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ）、ペプトイド、ポリペプチドおよびβ−ペプチドが挙げられる。
【０２１５】
「フィル−イン」重合：付加分子が隣接するモノマーのＩＩ型反応基の間の連結を媒介する
ａ）機能的部分が一または二つの同じ種類の反応基Ｘ１およびＸ２を有する（Ｘ１は別のＸ１またはＸ２と反応できない）。例えば、Ｘ１およびＸ２は、各々、第１アミンおよび第２アミンとすることができる。重合させるために、一の種類のＹ１−リンカー−Ｙ２の化合物を付加する（Ｙ１およびＹ２は同種のものである）。ＹはＸと反応するが、他のＹとの反応は立体的にまたは化学的に除外される。その結果、Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｘが形成される（図１５）。一例として、Ｘはアミンとすることができ、Ｙは活性化エステルとすることができる。反応の際に、これは二つの機能的部分の間でエステル−エステル結合（Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｘ）を形成する。
一のモノマーの二つのＸは同じＹ−リンカー−Ｙ分子と何ら有意な程度まで反応しないことが好ましい。このことは、例えば、該分子に立体的制限を課すことにより、例えば、Ｙ−リンカー−Ｙ分子中の二つのＹをモノマー中の二つのＸとかなり離すことにより、防止することができる。
【０２１６】
図１５の例２はポリアミドの「フィル−イン」重合の二つの例を示す。図１５の例２のＡおよびＢにおいて、ＩＩ型反応基はアミンであり、Ｙ−リンカー−Ｙ分子はジカルボン酸または活性化ジエステルである。いずれの場合においても、得られる生成物はジアミドポリマーである。一例としてＸがカルボン酸であり、Ｙがアミンであるように、ＸとＹの種類を交換できることは明らかである。ＸおよびＹの別の組合せ、およびその得られる結合を図２５に示す。そこでは、本明細書に記載の種々の重合原理で生成することのできる種々のポリマーを要約する。
特定の反応では、連結分子は一の反応基Ｘを含有する必要があるだけである。一例を図１５の例４Ａに示す。ここでは機能的部分は二つのＩＩ型反応基（アミン）を含有し、添加される分子は１，１’−カルボニルジイミダゾールなどのホスゲン均等物である。得られる結合は尿素結合である。図１５の例５において、モノマーは二つのヒドロキシル基を含有し、そこに活性化されたホスホジエステルまたはビスアミノホスフィンなどの活性化されたホスフィン誘導体を付加し、つづいてテトラゾールで活性化し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドで酸化する。その結果がホスホジエステル結合である。
【０２１７】
機能的部分は、特定の場合には、ＩＩ型反応基を一つだけ含有するものであってもよい。一例を図１５の例６に示す。ここでは、活性化されたホスホジエステルはモノマーのＩＩ型反応基だけを形成する。ジヒドロキシとの反応の際に、ホスホジエステル骨格が形成される。
フィル・イン重合のもうひとつ別の例（図１５の例７）はジエン（機能的部分）をアルケン（連結分子）と反応させ、ポリ環状化合物を形成するペリ環状反応を示す。
【０２１８】
フィル・イン重合の原理を用いる場合に一般に考えることは、同じ鋳型によりテンプレートされる立体異性体の数である。例えば、図１５の例４のＡにおいて、機能的部分は二つの第一アミンを含有する。機能的部分はキラル炭素を介して相補鋳型に結合される。その機能的部分はこのキラル原子を相補鋳型と結びつける結合の回りを自由に回転することができる。したがって、アミン（Ｘ）と連結分子（活性化されたカルボニル（Ｙ））との反応は、２ｎ種の異なる異性体の形成をもたらす（ここで、ｎはポリマーの残基の数である）。
異性体は多様性が有意に増加する。例えば、１０量体のポリマーでは、キラリティは多様性において１０２４倍増加する。このことは、ある場合には、例えば、モノマーの多様性が低い場合、あるいはその望みが短いポリマーを作成することである場合に、有利な点である。しかしながら、遺伝的コードのこのような「スクランブリング」（すなわち、一の鋳型が異なるポリマー構造体をコードする）はまた、選択工程の厳格性を減少させる。したがって、特定の場合では、スクランブリングは望ましくない。その場合、機能的部分を相補因子に非キラル原子を介して結びつけることを選択してもよい。図１５の例４のＢにおいて、機能的部分を相補鋳型と結びつけるキラル原子（窒素）の例を示す。スクランブリングは（上記したように）一の相補因子が異なる異性体を特異化する場合に影響を及ぼす可能性があり、またスクランブリングは一の相補因子がわずかに異なるまたは全く異なる機能的部分を特異化する場合にも影響を及ぼす可能性がある。
【０２１９】
ｂ）機能的部分は二つの異なるＩＩ型の反応基、ＸおよびＳを有する（図１６）。ＸはＸまたはＳと反応せず、その逆も言える。モノマーを組み込む前、間または後に、Ｔ−リンカー−Ｙの形態の分子を付加する。ＸはＹと反応することができ、ＳはＴと反応することができ、機能的部分の間にＸ−Ｓ−Ｔ−Ｙ連結の形成をもたらす。一の機能的部分のＸとＳが一の連結分子のＴおよびＹと反応できないようにすることが重要である。これは機能的部分および連結分子の構造を適宜設計することにより行うことができる。図１６の例１は、この場合にはアジドとヒドラジド（ＸおよびＳ）の異なるＩＩ型反応基を有する機能的部分、およびこの場合にはホスフィンとケトン（Ｔ−リンカー−Ｙ）の異なる反応基を有する連結分子の一例を示す。
【０２２０】
より長い鋳型化された分子の場合、機能的部分の相補鋳型に対する自由な回転は、機能的部分が多くのモノマーが組み込まれるまで反応しない場合には、問題となる可能性がある。この場合には、クラスター形成（図１３）が生じ、全長の鋳型化されたポリマーの量が減少する。しかしながら、この問題は前に説明したように、より長いポリマーの場合に有意なだけである。連結分子が、相補因子を組み込む間に、存在する場合、あるいはは酵素が介在する組込みの場合には、それらは酵素の活性部位から現れるとすぐに、その組み込まれたモノマーはその組込みの直後に連結分子と反応する可能性がある。クラスター形成はこれらの場合においても重要な問題ではないであろう。
【０２２１】
「ジッピング」重合： 鋳型の一方から他方への重合の移行
この方法では、重合反応は定方向的であり、すなわち、反応カスケードは相補鋳型の一端を出発し、相補鋳型の他端に反応が移動して、それで鋳型化ポリマーが形成される。
【０２２２】
ａ）原則（図１８）
モノマービルディングブロックをいくつかまたはすべて組み込んだ後、重合を鋳型の一端から開始させ、鋳型の下流方向に移動させる。例えば、開始物質を組み込まれた最初のまたは最後の相補因子にカップリングさせるか、またはヌクレオチド誘導体のＤＮＡポリメラーゼ媒介の組込みに使用されるプライマーにカップリングさせることができる。いずれにしても、開始物質が隣接するモノマーのＩＩ型反応基と反応し、それがそのモノマーの機能的部分に変化を誘発し、このモノマーがその鎖の隣のモノマーと反応するようになるであろう。最終的に、すべてのモノマーが反応し、ポリマーが形成される。
【０２２３】
開始物質を保護し、組込みが完了するまで開始物質が隣接するモノマーと反応しないようにし、その後で開始物質を脱保護する。これにより実験者は開始物質を活性化する前に組み込まれていないすべての開始物質および相補因子を除去することができ、溶液中の開始物質と相補因子の間の反応を排除することができる。
開始物質は、ｐＨまたは温度を変化させるか、電磁放射線に曝すか、または試薬（保護基を除去するか、または開始物質を特定の位置に導入するか、またはより強力な開始物質とするために未反応の開始物質とライゲートするか協調する試薬）を添加することで脱保護することができる。試薬は化学触媒または酵素、例えば、エステラーゼまたはペプチダーゼとすることができる。
【０２２４】
ｂ）ラジカル重合によるジッピング（図１８の例１）
開始物質はアルキルヨーダイドであり、機能的部分は二重結合を含有する。ラジカル開始物質、例えば、過硫酸アンモニウム、ＡＩＢＮ（アゾビス−イソブチロニトリル）または他のラジカル連鎖反応開始物質を添加して、ラジカル連鎖反応を開始させ、それによりアルケンを反応させて伸長した官能化アルカンを形成する。最終的に、ポリマーが製造され、活性化される（一点を除き、相補因子から切断される）。ポリマーの末端にあるラジカルをラジカル停止反応によりクエンチする。
【０２２５】
ｃ）カチオン重合によるジッピング（図１８の例２）
開始物質はルイス酸である。酸または他の開始物質で脱保護し、カチオンを生成する。その炭素カチオンは隣接するモノマーの二重結合を攻撃し、カチオンが生成される。その炭素カチオンは隣接するモノマーの二重結合を攻撃し、その結果、このモノマーに炭素カチオンが生成される。最終的に、全長のポリマーが形成され、そのポリマーを活性化する。
【０２２６】
ｄ）求核（アニオン）重合によるジッピング（図１８の例３）
この例においては、開始物質は保護されたヒドロキシルアニオンである。機能的部分はペルオキシドを有する。開始物質を脱保護して、（例えば、アルカリ性脱保護に付して）ヒドロキシル−アニオンを形成する。塩基性条件下、開始物質を環においてヒンダーの最も小さい炭素にある隣接するエポキシドを攻撃させる。これは、順次、ヒドロキシルアニオンを生成させ、それは隣接するエポキシドを攻撃する。最終的に、全長のポリマーが形成され、ポリエーテルを活性化することができる。この例においては、ポリエーテルを相補鋳型に連結するリンカーはすべて切断されている。この型の重合はまた、開環重合の一例でもある。
【０２２７】
ｅ）開環によるジッピング重合（図１９）
開環重合の原則を図示する。開始物質が隣接するモノマーの反応基Ｘを攻撃する。Ｘは環構造物の一部であり、開始物質とＸの間の反応の結果として、環は開化し、それによりモノマーの他の反応基がアレイの隣のモノマーを攻撃するのに活性化される。重合は鎖の下流に移動し、最終的に全長ポリマーが形成される。
【０２２８】
ｆ）無水カルボキシの開環重合によるβ−ペプチド形成（図１９の例１）
脱保護された開始物質、求核アミンは無水Ｎ−チオカルボキシの大部分の求核性カルボキシを攻撃し、アミドを形成する。ＣＳＯが切り離され、第一アミンを生成し、それが次にアレイの隣のモノマーを攻撃する。最終的に、重合が完結し、ポリマーが活性化され、そのＣ−末端を介して相補鋳型または鋳型に結合されているβ−ペプチドを形成する。この原理を用いて他の型のペプチド、例えば、Ｄ−およびＬ−形態のモノ−およびジ−置換のα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、カルボペプチドおよびペプトイド（ポリＮ−置換グリシン）および他の型のポリアミドを形成することができる。また、他のポリマー、例えば、ポリエステル、ポリ尿素およびポリカルバメートを生成するのに、この原理を利用することもできる。
【０２２９】
ｇ）チアジナノン単位の開環重合によるβ−ペプチド形成（図１９の例２）
脱保護された開始物質は環状チオエステルを攻撃してアミドを形成する。その結果、環は壊れ、遊離チオケトンを切り離す。この操作はアミンを生成し、それはアレイの隣のモノマーのチオエステルを攻撃する。重合が鋳型の他方の端に移動すると、それは活性化され、Ｃ−末端を介してその鋳型に結合したβ−ペプチドを生成する。
この原理を用いて他の型のペプチド、例えば、Ｄ−およびＬ−形態のモノ−およびジ−置換のα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、カルボペプチドおよびペプトイド（ポリＮ−置換グリシン）および他の型のポリアミドを形成することができる。また、他のポリマー、例えば、ポリエステル、ポリ尿素およびポリカルバメートを生成するのに、この原理を利用することもできる。
【０２３０】
ｈ）転位によるジッピング重合（図２０）
この場合には、求核物質とすることができる、開始物質を活性化すると、隣接するモノマーのＩＩ型反応基が開始物質を攻撃し、その結果、相補因子から開始物質が切り離される。モノマーの攻撃においては、Ｙと開始物質との反応はモノマーの転位をもたらし、それはＸおよびモノマーの他のＩＩ型反応基の活性化をもたらす（例えば、並びかえは求核物質を作り出す）。次に、アレイの隣のモノマーはこの求核物質を攻撃する。最終的に、その合成を方向付ける鋳型に一端で結合されている、全長のポリマーが形成される。
【０２３１】
ｉ）一工程でのジッピングおよび活性化（図２１）
開環重合に用いるための機能的部分を適宜設計することにより、重合反応の直接的な結果として、活性化を達成することができる。機能的部分を上下逆にするだけで、すなわち、最終ポリマーに組み込まれ最終ポリマーを形成しない環の部分を相補鋳型に結合させることにより、実験者は活性化工程をセーブすることができる（図２１と図１９を比較のこと）。一例として、図１９の例２の２，２−ジフェニルチアジナノン環構造物をフェニル基の一つを介して相補因子に結合させ、重合反応の結果として活性化に至るであろう。
【０２３２】
グループ２： 機能的部分は相補因子に対して自由に回転することができない
この具体例においては、ＸおよびＹのＩＩ型反応基は、相補鋳型に対して所望の配向に保持されている（図２２Ａ）。したがって、ＸおよびＹは、クラスターを形成する危険がなく、相互に反応することができ、あるいはリンカー分子と反応することができる（図１３と比較のこと）。
機能的部分は、相補因子中の二重結合により、あるいは別々の原子との結合により、配向を固定して保持することができる。図２２Ｂは、機能的部分がジヌクレオチドの二つの塩基に共有結合している一例である（相補因子がジヌクロチドであり、機能的部分がジペプチドを含有し、反応基が、各々、アミンおよびエステル成分である）。
この方法で製造できるポリマーは、上記した非ジッピング重合に記載のすべてのポリマー、例えば、ペプチド、アミド、エステル、カルバメート、オキシム、ホスホジエステル、第２アミン、エーテル等を包含する。
図２３ないし２５は、クラスター形成が共有結合の制限によりどのように回避され得るかに関する。
【０２３３】
リンカー−ヌクレオチド結合の回りを自由に回転する可能性があるため、二官能性の機能的部分（ＦＥ）を利用するという特殊な状況が生じる。二官能性ＦＥは二つの異なる反応基「Ｘ」および「Ｙ」、例えば、求核物質および求電子物質の両方を有し、ここで一のＦＥ上の「Ｘ」は直接的にまたは架橋剤を介して隣接するＦＥ上の「Ｙ」と反応することを意味する。すべてのリンカー−ＦＥ単位が親ヌクレオチドと同じ方向にある場合、方向性重合が起こり、いわゆる、５単位の完全な生成物が形成されるであろう（図１３の上図）。しかしながら、すべてではないが、いくつかのリンカー−ＦＥ存在がリンカー結合の回りで回転すると、二つの官能基が相対的に逆配向となり、クラスターを形成する状況、すなわち、反応基が二つの異なる方向にて生じ得るように配列される状況がもたらされる（図１３の下図）。この望ましくない状況は機能的部分を固定して用いることにより回避することができ、それによりヌクレオチド−リンカー結合の回りでの回転が防止される。ＦＥを一つではなく、二つの共有結合で（すなわち、二つのリンカーで）ヌクレオチドに結合させることで、ＦＥを固定してもよい。その付加結合は官能基の一つで直接形成されてもよく、あるいは二つの反応基が固定された骨格上の別々の「アーム」に結合してもよい。第一の状況下にある付加結合は反応の間に壊されてもよいのに対して、後者の付加結合はこの結合が反応後に切断され、最終生成物を形成するように構築されなければならない。
【０２３４】
リンカー−ＦＥ単位の主たる結合点は、典型的には、ヌクレオチドの塩基内、好ましくは、Ｔ／ＵおよびＣのＣ５位に、またはデアザＡおよびデアザＧのＣ７位にある。リンカー−結合の回転を効率的に阻害するために、結合点から離れたいずれかの位置に第２の結合を設けるべきである。すなわち、第２結合を隣接するヌクレオチド、好ましくは塩基または糖部のいずれかの位置に設けることができる；それは同じ塩基、好ましくは、Ｔ／ＵおよびＣのＣ６位に、または（デアザ）Ａまたは（デアザ）ＧのＣ８またはＮ６位にある別の原子とすることができ、あるいは糖成分の原子、好ましくはＣ２またはＣ３位の原子とすることができる。明確な例示を図２３に示す。
【０２３５】
これらの二重結合リンカーをいくつか有するヌクレオチドは、ポリメラーゼを用いるよりも他の手段で組み込む必要があることに留意すべきである。ポリメラーゼ組込みに代わる別法は本明細書に記載のイミダゾール方法である。
方向性重合を保証するＦＥの共有結合の制限の効果を明らかにするために、一連のコンピュータ算定を図２３Ａおよび２３Ｂに示される二つの例にて行った。その目的は、各リンカー−ＥＦ構築物に関する種々のモードの攻撃を分析し、最も可能性のある反応を推定し、それにより最も可能性のある生成物を推定することにある。したがって、リンカー−ＦＥ単位により覆われる配座空間および反応基により占められる域を推定する必要がある。
【０２３６】
特異的なリンカー−ＦＥ系の配座空間、すなわち、ＦＥの範囲は、配座検索を行うことで推定することができる。配座検索は種々の異なるソフトウェアおよび異なる検索方法を用いるこれらの中のプログラムを利用して行うことができる。これは当該分野の標準的な知識である。この明細書に示す大きさの系では、集中型の配座検索を行うことができず、すなわち、完全な位置エネルギー面がカバーされ、それにより最低のエネルギー配座の位置付けが実際に分子についてグローバルミニマム（global minimum）であるように十分な工程を確保することができない。しかしながら、これらの算定の目的はリンカー−ＦＥ単位によりカバーされる空間の画像を取り、それにより二つのＦＥの間で結合する最も有望な方法、および反応基が反応距離の範囲内にある可能性を推定することである。かなり限定された数の工程を利用して効果的な配座検索を行う方法はこの目的を満たすものである。
【０２３７】
本明細書にいう配座なる語は、単結合の回りの単純回転により区別される個々の構造的配向を意味する。加えて、異なる配座が、反応の一の特定の方向に起こるすべての修飾されたヌクレオチドに対する二つの反応基の全体としての配置を意味する、異なる全体の構造にて生じる可能性がある。すなわち、同じ方法にてすべての「Ｘ」でアレンジされている四つのリンカーＦＥ単位は一の特異的な構造に対応し、例えば、一の方向にて二つの「Ｘ」および反対方向にて残りの二つでアレンジされている四つのリンカー−ＦＥ単位はもうひとつ別の構造に対応する。一の構造の範囲内で、多くの異なる配座が可能であるが、反応基がすべての配向（方向）が保存されているため、これらの結果はすべて、同じ「最も可能性のある」生成物をもたらすものである。
【０２３８】
この研究で行われた算定はＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＩｎｃからのＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ７．２ソフトウェア（ＭＭＯＤ７２）を利用して行った。このプログラムパッケージの範囲内で、大きな複雑な系のエネルギーを最低に位置づけるのに非常に効果的であるとされている「Ｍｉｘｅｄ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ／Ｌｏｗ Ｍｏｄｅ’」法（ＭＣＭＭ／ＬＭ）を含め、一連の異なる検索プロトコルが利用可能である。
【０２３９】
コンピュータ・ディテイル
塩基配列 ５’−ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧ−３’（上鎖）（例えば、図２４に提示されるように）または５’−ＧＣＴＴＴＴＡＧ−３’（上鎖）（例えば、図２５に提示されるように）の二本鎖ＤＮＡを、ＨｙｐｅｒＣｕｂｅ ＩｎｃからのＨｙｐｅｒＣｈｅｍ７を用い、最も頻度の高いＢ−配座にて製造した。リンカー−ＦＥ単位をＣｈｅｍＯｆｆｉｃｅからのＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ６．０およびＣｈｅｍ３Ｄ Ｕｌｔｒａ６．０を用いて製造した。リンカー−ＦＥ単位およびＤＮＡをＭＭＯＤ７２の中に取り込んだ。ついで、リンカーをＭＭＯＤ７２のビルド特性を用いて対応するヌクレオチドに融合させ、Ｔヌクレオチドのメチル炭素原子を適当なリンカー原子と融合させ、実質的に、修飾されたＵヌクレオチドを形成させた。すべての算定において、ＤＮＡ原子はすべて、系の大きさを小さくし、ＤＮＡ鎖内での歪みを回避するために、凍結状態にて保存されており、すなわち、動くことができない。全体の系はＭＭＯＤ７２にて供給されるＯＰＬＳ ＡＡ力場を利用してエネルギーを最低とする（ＤＮＡ原子は凍結されたままである）。ヌクレオチドとリンカーを架橋する捩れ角を制限する、すなわち、Ｎ１、Ｃ６、Ｃ５と第１リンカー原子の捩れを１８０．０度にセットし、１００と１０００の間の力定数を加える、必要があった。制限しなければ、おそらく、この特定の捩れの面外力定数は非常に弱いため、ＭＭＯＤ７２力場は平面を保持しなかった。
【０２４０】
５０ｋＪ／モルのエネルギーをカットオフして、最速原子が、各々、３および８オングストロームの最小および最大行程距離を動く、２０００工程を行う、ＭＣＭＭ／ＬＭ方法を用いて配座解析を行った。系の個々の大きさに応じて、１１−１９の捩れが変化し、最終的に各配座異性体は５００−１０００ＰＲのコンジュゲート・グラジエント工程により最低となった（このことは、大抵の配座異性体が０．０５ｋＪ／モルの収束閾値の範囲内で最低となる結果をもたらす）。キラル原子のキラリティはこの算定の間保持された。加えて、共有結合により制限されたリンカーの系では、各環の中で一の閉環結合（形成されたアミド結合または塩基−Ｓ結合のいずれか）が選択された。
【０２４１】
結果
第２の結合点を作製する一の方法は、破壊可能な結合を介して機能的部分の一つを隣接するヌクレオチドに連結することである。これは、実質的に、モノヌクレオチドの代わりにジヌクレオチドを利用し、ＦＥの長さも伸長されたことを意味する。このプロトコルを用いた場合、一連の有効な結合点が存在する；図２３Ａは隣接する塩基の同じ位置に結合する一例である。リンカー１Ａは、還元切断し易いジスルフィド結合を介して５’塩基に連結したアミノ末端および３’塩基に直接連結されているカルボキシ末端を有する、β−ジペプチドから構築されている。反応が起こると、一のジヌクレオチド−リンカー−ＦＥ単位からのアミノ基は先行するジヌクレオチド−リンカー−ＦＥのエステル結合を破壊するであろう。第２の結合点にて同じリンカー−ＦＥ単位を利用することは、一のヌクロチドでスペースを付したモノヌクレオチドのジペプチドを利用することに相当する。かかるリンカー−ＦＥは別のアーム上に二つの反応基を有し、ヌクレオチド−リンカー結合の回りで自由に回転し、したがって方向性重合を欠く場合の、クラスターを形成する危険性のある、二機能性リンカー−ＦＥの一例である。単独で結合したリンカーを２０００回の配座検索工程に付すことは、一度「グローバル」ミニマムを示す、４９０個の独特な配座（５００回の最低工程後で８４９個、さらに５００回の工程の後では４９０個の配座）を有する。完全な生成物をもたらす最低エネルギーの配座はランク８であり、図２４Ａで示され、得られる最も可能性の高い生成物（まだＤＮＡ骨格に結合している）を図２４Ｂに示す。図示されているように、反応基はアミノ基はすべて上向に、カルボキシ基はすべて下方に配置しており、完全な生成物を得るのに必要な二つの反応はストレートフォワードである。切り離された完全な生成物を図２４Ｈに示す。しかしながら、「グローバル」ミニマムを含む、ほとんどすべての配座はこの全体の配置を有しない。図２４Ｃは２番目に高いランクの配座を示し、その可能性の高い生成物を図２４Ｄに示す。図示されているように、この反応基の配置は不完全な生成物の形成をもたらす。３’末端の二つのリンカー−ＦＥ単位はアミド結合を形成するが、５’リンカー−ＦＥ単位は全体として反対方向に配向しており、二つの近接する反応基であって、反応することができない、二つのカルボキシ基が生じる（５’リンカー−ＦＥ単位からのものと、組み合わされた３’リンカー−ＦＥ単位からのもの）。したがって、この生成物の切り離しはダイマー（およびモノマー）をもたらす；ダイマーを図２２に記載する。ミニマムを位置づける１０ｋＪ／モル内にある３６４の独特な配座のうち、３３０が種々の不完全な生成物の形成をもたらす。
【０２４２】
二重に結合したリンカーの配座検索工程を２０００回行って、「グローバル」ミニマムと９回位置付けられる、１２５個の独特な配座を得る。この最低エネルギー配座を図２４Ｅに示す。ＦＥはすべて、上方にアミノ基を、そして下方にカルボキシ基が配置されていることがわかる。明らかなように、この全体の配置が、図２４Ｆに示されるたった一つだけ可能な生成物（まだＤＮＡ骨格に結合している）を生じさせる、二重に結合したリンカーでたった一つだけ可能なものである。この生成物を切り離すと、完全なスリー・単位の産物、図２４Ｇが得られる。
【０２４３】
かくして、この例は、何はさておき、ヌクレオチド−リンカー結合の回りの回転が完全な生成物を形成できなくする（多くの）配置をもたらすことを示す。しかしながら、もうひとつ別の問題が形成される完全な生成物における違いである。この例にて利用されるＦＥは置換されていないβ−アミノ酸から構築されており、したがって図２４ＧとＨに示される完全な生成物の間に違いはない。しかし、一本結合のＦＥを用いた場合、形成される生成物の極性は変化することができ（すなわち、３’結合したＦＥからの遊離アミノ基または５’結合したＦＥからの遊離アミノ基）、それにより潜在的にかなり異なる生成物を形成することができる。固定した機能的部分を利用することで、全体として一つだけの配置が可能であり、一の特異的な極性を有する一つだけの生成物を形成することができる。
【０２４４】
もうひとつ別の可能性のある結合点が、図２３Ｂ、ＣおよびＤに示されるように、親ヌクレオチドの糖である。この選択により、上記したように連結したジヌクレオチドの代わりにモノヌクレオチドを利用することが可能となる。Ｃ２の水素は両方共リンカー原子と置き換えることができるが、小さな環構造物の場合、塩基と同様に同じ平面にある原子を用いることが好ましい。糖成分の炭素３はリン酸基への結合を形成するが、リンカーの固定を目的として利用することのできる、結合の可能性がなおも残っている。同じことがＣ１についても言えるが、この置換を可能とする周辺の空間が限定されている。糖成分の炭素原子４および５は塩基の結合点から遠く離れており、この目的に利用されるには大きな環系を必要とする。
【０２４５】
リンカー−ＦＥ１Ｂは、還元切断し易いジスルフィド結合を介してＴ／ＵのＣ５位に結合されているγ−アミノ酸から構築されている。したがって、リンカー−ＦＥ単位１Ｂは、重合の方向性を欠くためにクラスターを形成する危険性のある、ヌクレオチド−リンカー結合の回転能を有する二機能性のリンカー−ＦＥ系のもう一つの典型的な例である。このＦＥの固定を例１Ｂ（右側）に示す。塩基と同様に同じ側の平面のＣ２位を利用する。ＦＥはカルボキシル基を介して加水分解可能なエステル結合により糖に連結されているγ−アミノ酸を含有し、そのアミノ末端で酸化し易いジスルフィド結合を介してＴ／ＵのＣ５位に結合する。したがって、二重結合したリンカー−ＦＥ単位１Ｂは、一の遊離反応基と第２の結合を提供する別の反応基を有する、二機能性リンカー−ＦＥである。ほとんど同じであるが、加水分解可能なリンカーとして第２のエステル基を導入することでカルボキシル末端を遊離状態としたリンカー−ＦＥ単位を例１Ｃに示す。リンカー−ＦＥ１Ｂと１Ｃのコンピュータ解析の結果は同様の結論をもたらす。以下の結果はリンカー１Ｂについて言及する。
【０２４６】
二つの異なるスキームの配座検索は、共有結合を付加することでリンカー結合の回転を防止する効果を証明する。単独で結合したリンカー−ＦＥを２０００回の配座検索工程に付すことで、一度「グローバル」ミニマムを示す、４４５個の独特な配座が得られる。この配座を図２５Ａに示し、得られる可能性の大きな生成物（まだＤＮＡ骨格に結合したまま）を図２５Ｂに示す。見てわかるように、この生成物は完全な生成物、すなわち、四つの単位すべてがアミド結合を介して連結している。切り離される完全な生成物を図２５Ｇに示す。しかし、他の多くの全体としての配置もこの系では可能であり、その一例を図２５Ｃに示す。３Ｃの配置から得られる可能性の最も高い生成物を図２５Ｄに示す。見て分かるように、この反応基の並べ方が不完全な生成物の形成をもたらす。すなわち、リンカー−ＦＥ単位は二つと二つが一緒に連結し、反応が一つにまとまる可能性はない。この生成物を切り離せば、図２５Ｈに示される二つのダイマーが得られる。ミニマムを位置づける１０ｋＪ／モル内にある３３４の独特な配座のうち、およそ２１５が種々の不完全な生成物の形成をもたらす。
【０２４７】
二重に結合したＦＥの配座検索工程を２０００回行って、「グローバル」ミニマムと２回位置付けられる、３８６個の独特な配座を得る。この配座を図２５Ｅに示す。得られる可能性の最も高い生成物（まだＤＮＡ骨格に結合したまま）を図２５Ｆに示す。しかしながら、反応基の交換する可能性はないため、その配座は二平面においてわずかな変化で異なるだけである（例えば、ＣＨ２ＮＨ２基の回転）。明らかなように、この全体の配置が、たった一つだけ可能な生成物、完全な四つの単位の生成物（図２５Ｇ）を生じさせる、二重に結合したＦＥでたった一つだけ可能なものである。
【０２４８】
すなわち、コンピュータ分析は、ヌクレオチド−リンカー結合の回りで広範囲に及ぶ回転があり、この柔軟性により有意な割合の形成された生成物が完全でない結果をもたらすと結論付けている。その算定は、共有結合で固定した機能的部分を用いることがリンカーの回転を防止する一の方法であり、それにより効果的に重合の一の方向性を確保できることを示している。加えて、拘束されていないＦＥを用いて得られる完全な生成物は多様化した基を形成する。というのも、すべての単位の間で反応が起こるように、反応基を並べる可能性が１より多くあるからである。ましてや、天然には、これらの傾向は、これらの例で示されるように、三つないし四つより多くのリンカー−ＦＥ単位を用いて強調されている。
【０２４９】
機能的部分の移動能を有するビルディングブロック
以下のセクションは、機能的部分を一のモノマービルディングブロックから別のモノマービルディングブロックに移動させることのできる、すなわち、二つのモノマービルディングブロックの二つの機能的部分を反応させ、それにより適用される条件下で一の機能的部分をそのモノマービルディングブロックから切断する、モノマービルディングブロックの形成および使用を記載する。
【０２５０】
一般的セクション
マレイミド誘導体の保護および脱保護
【化１】
Figure 2004535193
マレイミド誘導体（例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリール、アルコキシなど）は、後記するいずれの工程で、保護された形態にて存在してもよい。保護はフランとの反応でなすことができる。脱保護は、Ｍａｓａｙａｓｕら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９８０）２１２２二記載されるように、熱分解によりなすことができる。
【０２５１】
Ａ． アシル化反応
アシル化モノマービルディングブロックを形成する一般的経路およびその使用：
【化２】
Figure 2004535193
【０２５２】
Ｎ−ヒドロキシマレイミド（１）はアシルクロリド、例えば、アセチルクロリドを用いることによりアシル化してもよく、あるいはまた、ジクロロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドおよび酸、例えば酢酸を用いることにより、例えば、ＴＨＦ中でアシル化してもよい。中間体を過剰量の１，３−プロパンジオールを用いてミカエル付加に付し、つづいて４，４’−ジピリジルジスルフィドまたは２，２’−ジピリジルジスルフィドのいずれかと反応させてもよい。ついで、この中間体（３）をチオールハンドルを有するオリゴヌクレオチド上に負荷し、モノマービルディングブロックを生成することができる。このモノマービルディングブロックとアミンを有するモノマービルディングブロックとの反応を次のように行う：
【０２５３】
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、ビルディングブロックを負荷したチオオリゴヌクレオチド、例えば（４）（１ナノモル）およびアミノオリゴヌクレオチド（１ナノモル）と、ヘペスバッファー（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液２０μＬ、ｐＨ＝７．５）および水（３９μＬ）中で混合する。５０℃に加熱し、３０℃に冷却（２℃／秒）することにより、オリゴヌクレオチドを鋳型にアニールする。ついで、該混合物を変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置（ｏ／ｎ）し、鋳型結合体（５）を得る。
【０２５４】
Ｂ． アルキル化および Ｃ． バニル化反応
アルキル化モノマービルディングブロックは次の一般構造式を有する：
【化３】
Figure 2004535193
【０２５５】
Ｒ１およびＲ２を用いて、サルフェートの反応性を調整し、適宜反応させるようにする。クロロおよびニトロは反応性を増加させるであろう。アルキル基は反応性を減少させるであろう。サルフェートに対してオルト位にある置換基は、立体構造が原因で、この次の求核物質がＲ−基を選択的に攻撃するように方向付け、硫黄を攻撃することを回避するであろう。
【０２５６】
例えば、
【化４】
Figure 2004535193
【０２５７】
３−アミノフェノール（６）を無水マレイン酸と反応させ、つづいて酸、例えば、Ｈ２ＳＯ４またはＰ２Ｏ５と反応させ、加熱してマレイミド（７）を得る。マレイミドを作製する閉環は、酸安定性Ｏ−保護基を用いる場合、Ａｃ２Ｏと反応させ、加熱するかまたはしないで、つづいてＯ−脱保護することによりなされる。別法として、Ａｃ２Ｏ中で還流し、つづいて熱水／ジオキサン中でＯ−脱保護し、（７）を得てもよい。さらに、ジクロロメタンまたは高沸点溶媒中、トリエチルアミンまたは炭酸カリウムとともにまたはなしで（７）をＳＯ２Ｃｌ２と反応させると中間体（８）が得られるであろう。それを単離してもよく、あるいはさらに適当なアルコール、この場合はＭｅＯＨでクエンチすることによりアリールアルキルサルフェートに変形してもよく、それにより（９）が形成されるであろう。その有機ビルディングブロック（９）を以下のようにオリゴヌクレオチドに連結してもよい。
【０２５８】
バッファーである５０ｍＭ ＭＯＰＳまたはＨｅｐｅｓまたはホスフェート（ｐＨ７．５）中のチオールを有するオリゴヌクレオチドを、有機ビルディングブロック（９）のＤＭＳＯあるいはまたＤＭＦ中１−１００ｍＭ溶液、好ましくは７．５ｍＭ溶液と、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるように、反応させる。混合物を１−１６時間、好ましくは２−４時間、２５℃で放置して、アルキル化、この場合にはメチル化モノマービルディングブロック（１０）を得る。
【０２５９】
アルキル化モノマービルディングブロック（１０）とアミンを有するモノマービルディングブロックとの反応は、以下のように行うことができる：
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、ビルディングブロックを負荷したチオオリゴヌクレオチド（１ナノモル）（１０）およびアミノオリゴヌクレオチド（１ナノモル）と、ヘペスバッファー（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液２０μＬ、ｐＨ＝７．５）および水（３９μＬ）中で混合する。５０℃に加熱し、３０℃に冷却（２℃／秒）することにより、オリゴヌクレオチドを鋳型にアニールする。ついで、該混合物を変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置（ｏ／ｎ）し、鋳型結合したメチルアミン（１１）を得る。
【０２６０】
ビニル化モノマービルディングブロックは、アルキル化モノマービルディングブロックについて上記したのと同様に製造かつ用いることができる。クロロスルホネート（上記した８）をアルコールと反応させる代わりに、その中間体のクロロサルフェートを単離して、フルオリドと共にまたはなしで、エノラートまたはＯ−トリアルキルシリルエノラートと反応させる。例えば、
【０２６１】
【化５】
Figure 2004535193
【０２６２】
バリル化モノマービルディングブロック（１３）の形成：
バッファーである５０ｍＭ ＭＯＰＳまたはＨｅｐｅｓまたはホスフェート（ｐＨ７．５）中のチオールを有するオリゴヌクレオチドを、有機ビルディングブロック（１２）のＤＭＳＯあるいはまたＤＭＦ中１−１００ｍＭ溶液、好ましくは７．５ｍＭ溶液と、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるように、反応させる。混合物を１−１６時間、好ましくは２−４時間、２５℃で放置して、ビニル化モノマービルディングブロック（１３）を得る。
【０２６３】
スルホニルエノラート（１３）をアミンを有するモノマービルディングブロックと反応させてエナミン（１４ａおよび／または１４ｂ）を得、あるいは例えば、カルバニオンと反応させて１５ａおよい／または１５ｂを得る。例えば、
【０２６４】
【化６】
Figure 2004535193
【０２６５】
ビニル化モノマービルディングブロック（１３）とアミンまたはニトロアルキルを有するモノマービルディングブロックとの反応は、以下のように行うことができる：
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、ビルディングブロックを負荷したチオオリゴヌクレオチド（１ナノモル）（１３）およびアミノオリゴヌクレオチド（１ナノモル）またはニトロアルキルオリゴヌクレオチド（１ナノモル）と、０．１Ｍ ＴＡＰＳ、ホスフェートまたはヘペスバッファーおよび３００ｍＭ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝８．５）中で混合する。５０℃に加熱し、３０℃に冷却（２℃／秒）することにより、オリゴヌクレオチドを鋳型にアニールする。ついで、該混合物を変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置（ｏ／ｎ）し、鋳型結合体（１４ａ／ｂまたは１５ａ／ｂ）を得る。上記したアルキルおよびビニルサルフェートに代えて、例えば、後記する（３１）のように同等の効果を有するスルホネート（ただし、アルキルまたはビニルの代わりにＲ”を有する）を（２８、アルキル基で置換されたフェニル基を有する）および（２９）より調製し、アルキル化物質およびビニル化物質として用いてもよい。
【０２６６】
Ｄ．アルケニル化反応
ウィッチヒおよびＨＷＥモノマービルディングブロックを形成する一般経路およびこれらの使用：
市販されているビルディングブロック（１６）を標準的手段、すなわち、ＤＣＣまたはＤＩＣカップリング手段によりＮＨＳエステル（１７）に変形することができる。
バッファーである５０ｍＭ ＭＯＰＳまたはＨｅｐｅｓまたはホスフェート（ｐＨ７．５）中のアミンを有するオリゴヌクレオチドを、有機ビルディングブロックのＤＭＳＯあるいはまたＤＭＦ中１−１００ｍＭ溶液、好ましくは７．５ｍＭ溶液と、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％であるように、反応させる。混合物を１−１６時間、好ましくは２−４時間、２５℃で放置して、ホスフィン結合したモノマービルディングブロック（１８）を得る。このビルディングブロックは、適当なアルキルハライド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ヨードアセトアミドを、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ中の１−１００ｍＭ、好ましくは７．５ｍＭとして、ＤＭＳＯ／ＤＭＦ濃度が５−５０％、好ましくは１０％となるように、添加することによりさらに変形される。この混合物を１−１６時間、好ましくは２−４時間、２５℃で放置して、モノマービルディングブロック（１９）を得る。これに代えて、有機ビルディングブロック（１７）をアルキルハライドでＰ−アルキル化し、ついでアミンを有するオリゴヌクレオチドにカップリングさせ、（１９）を得てもよい。
【０２６７】
例えば、上記した条件と同様の条件を用いて、４−ホルミル安息香酸のＮＨＳエステルとアミンを有するオリゴヌクレオチドの間の反応により形成される、アルデヒド結合のモノマービルディングブロック（２０）を、（１９）と、わずかにアルカリ性の条件下で反応させ、アルケン（２１）を得る。
【０２６８】
【化７】
Figure 2004535193
【０２６９】
モノマービルディングブロック（１９）と（２０）の反応は次のように行うことができる：
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、０．１Ｍ ＴＡＰＳ、ホスフェートまたはヘペスバッファーおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝８．５）中のモノマービルディングブロック（１９）（１ナノモル）および（２０）（１ナノモル）と混合する。その反応混合物を３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一夜にわたって放置し、鋳型結合体（２１）を得る。
別法として、（１７）の代わりにホスホネート（２４）を用いてもよい。当該化合物はジエチルクロロホスファイト（２２）と適当なカルボキシを有するアルコールを反応させることで調製することができる。ついで、カルボン酸をＮＨＳエステル（２４）に変換し、上記した方法および変法を適用してもよい。単純なＰ−アルキル化の代わりに、このホスファイトをアルブゾフ（Ａｒｂｕｚｏｖ）反応に付し、ホスホネートを生成してもよい。モノマービルディングブロック（２５）は、それがそのホスホニウム対応物（１９）よりも反応性に富むということから、有益である。
【０２７０】
【化８】
Figure 2004535193
【０２７１】
Ｅ． 遷移金属触媒のアリール化、ヘタイル化（ hetaylation ）およびビニル化反応
アリール、ヘトアリールまたはビニル官能基の移動能を有する求電子物質のモノマービルディングブロック（３１）は、マレイミド誘導体を上記したＳＨを有するオリゴヌクレオチドにカップリングする操作を用いて、有機ビルディングブロック（２８）および（２９）より調製することができる。マレイミドの代わりに、例えば、カルボキシベンゼンスルホン酸誘導体より調製した、それをアミンを有するオリゴヌクレオチドにカップリングさせることで調製した、ＮＨＳ−エステル誘導体を用いてもよい。（２８）および（２９）のＲ−基を用いてスルホナートの反応性を調整し、適当な反応性を得る。
【０２７２】
遷移金属触媒の架橋反応は次にように行う：
１５分間放置した１．４ｍＭ Ｎａ２ＰｄＣｌ４および２．８ｍＭ Ｐ（ｐ−ＳＯ３Ｃ６Ｈ４）３の水中プレ混合物を、鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）およびモノマービルディングブロック（３０）および（３１）（共に１ナノモル）の０．５Ｍ ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ＝５）および７５ｍＭ ＮａＣｌ中混合物に添加した（最終［Ｐｄ］＝０．３ｍＭ）。ついで、その混合物を３５−６５℃、好ましくは５８℃で放置（ｏ／ｎ）し、鋳型結合体（３２）を得る。
【０２７３】
【化９】
Figure 2004535193
【０２７４】
アリール、ヘトアリールまたはビニル官能基の移動能を有する対応する求核モノマービルディングブロックは有機ビルディングブロック型（３５）より調製することができる。
これは、ボロン酸をジオール、例えば（３３）でエステル化し、つづいてＮＨＳ−エステル誘導体に変換することで行うことができる。ついで、該ＮＨＳ−エステル誘導体を、オリゴヌクレオチドに、上記したＮＨＳ−エステル誘導体をアミンを有するオリゴヌクレオチドにカップリングさせる操作を用いて、カップリングさせ、モノマービルディングブロック型（３７）を得てもよい。また、上記したマレイミド誘導体を調製し、ＳＨを有するオリゴヌクレオチド上に負荷させてもよい。
【０２７５】
遷移金属触媒の架橋カップリング反応は次にように行う：
１５分間放置した１．４ｍＭ Ｎａ２ＰｄＣｌ４および２．８ｍＭ Ｐ（ｐ−ＳＯ３Ｃ６Ｈ４）３の水中プレ混合物を、鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）およびモノマービルディングブロック（３６）および（３７）（共に１ナノモル）の０．５Ｍ ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ＝５）および７５ｍＭ ＮａＣｌ中混合物に添加した（最終［Ｐｄ］＝０．３ｍＭ）。ついで、その混合物を３５−６５℃、好ましくは５８℃で放置（ｏ／ｎ）し、鋳型結合体（３８）を得る。
【０２７６】
【化１０】
Figure 2004535193
【０２７７】
Ｆ． エナミンとエノールエーテルのモノマービルディングブロックの反応
エナミンおよびエノールエーテルを負荷したモノマービルディングブロックを以下のように調製する：
Ｚ＝ＮＨＲ（Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリール、ヘトアリール）の場合、２−メルカプトエチルアミンをジピリジルジスルフィドと反応させて活性化ジスルフィド（４０）を得、ついでそれを、脱水条件下で、ケトンまたはアルデヒドに縮合させてエナミン（４１）を得ることができる。
Ｚ＝ＯＨである場合、２−メルカプトエタノールをジピリジルジスルフィドと反応させ、つづいてＯ−トシル化（Ｚ＝ＯＴｓ）させる。ついで、トシレート（４０）をエノラートと、あるいはフルオリドの存在下、Ｏ−トリアルキルシリルエノラートと直接反応させてエノラート（４１）を得てもよい。ついで、エナミンまたはエノラート（４１）を上記したＳＨを有するオリゴヌクレオチドにカップリングさせ、モノマービルディングブロック（４２）を得ることができる。
【０２７８】
【化１１】
Figure 2004535193
【０２７９】
モノマービルディングブロック（４２）は、次のように、カルボニルを有するオリゴヌクレオチド型（４４）あるいはまたアルキルハライドを有するオリゴヌクレオチド型（４３）と反応することができる：
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ホスフェートまたはヘペスバッファーおよび２５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝７．５）中のモノマービルディングブロック（４２）（１ナノモル）および（４３）（１ナノモル）と混合する。その反応混合物を３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一夜にわたって放置するか、あるいはまた変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置し、鋳型結合体（４６）（Ｚ＝ＯまたはＮＲ）を得る。Ｚ＝ＮＲである化合物の場合、Ｚ＝Ｏと比べて、わずかに酸性な条件を用いて生成物（４６）を得る。
【０２８０】
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、０．１Ｍ ＴＡＰＳ、ホスフェートまたはヘペスバッファーおよび３００ｍＭ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝８．０）中のモノマービルディングブロック（４２）（１ナノモル）および（４４）（１ナノモル）と混合する。その反応混合物を３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一夜にわたって放置するか、あるいはまた変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置し、鋳型結合体（４５）（Ｚ＝ＯまたはＮＲ）を得る。Ｚ＝ＮＲである化合物の場合、Ｚ＝Ｏと比べて、わずかに酸性な条件を用いて生成物（４５）を得る。
【０２８１】
【化１２】
Figure 2004535193
【０２８２】
エノールエーテル型（１３）を触媒と共にまたはなしでシクロ付加に付してもよい。同様に、ジエノールエーテルを調製して用いてもよい。例えば、（８）をα，β−不飽和ケトンまたはアルデヒドのエノラートまたはトリアルキルシリルエノラート（フルオリドの存在）と反応させることにより、（４７）を生成し、それをＳＨを有するオリゴヌクレオチド上に負荷し、モノマービルディングブロック（４８）を得てもよい。
【０２８３】
【化１３】
Figure 2004535193
【０２８４】
ジエン（４９）、エン（５０）および１，３−ダイポール（５１）は、アミノを有するオリゴヌクレオチドと対応する有機ビルディングブロックのＮＨＳ−エステルの間の簡単な反応により形成することができる。（１３）あるいはまた（３１、Ｒ”＝ビニル）と、例えば（４９）のようなジエンとの反応で（５２）を得、あるいは例えば１，３−ダイポール（５１）との反応で（５３）を得、（４８）または（３１、Ｒ”＝エチル）と、例えば（５０）のようなエンとの反応で（５４）を得ることは以下のように行うことができる：
【０２８５】
鋳型オリゴヌクレオチド（１ナノモル）を、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ホスフェートまたはヘペスバッファーおよび２．８Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ＝７．５−８．５、好ましくはｐＨ＝７．５）中のモノマービルディングブロック（１３）または（４８）（１ナノモル）および（４９）または（５０）または（５１）と混合する。その反応混合物を３５−６５℃で、好ましくは５８℃で一夜にわたって放置するか、あるいはまた変動する温度（１０℃で１秒間、ついで３５℃で１秒間）で放置し、鋳型結合体（４２）、（５３）または（５４）を得る。
【０２８６】
【化１４】
Figure 2004535193
【０２８７】
切断可能なリンカー
活性化（相補因子と機能的部分を連結するリンカーにいくつかまたはすべてを切断する活性化）は、ｐＨおよび／または温度を変えることで、反応物を添加することで、あるいは触媒、酵素またはリボザイムにより、あるいは光、ＵＶまたは他の電磁放射等により行うことができる。特に関連する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼおよびヌクレアーゼを包含する。切断可能なリンカーのリストおよび切断条件を図示する（図１０）。
他の切断可能なリンカーは、酸により切断される４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸部、フルオリドで切断可能な２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）メチル］安息香酸部、およびアルカリ性ホスファターゼ処理に付し、つづいて穏やかなアルカリ性処理を組み合わせることで切断可能なリンカーを提供する２−ヒドロキシメチル安息香酸部のホスフェートを包含する。
【０２８８】
大抵の場合、相補因子と機能的部分を連結する少なくとも二つの異なる型のリンカーを有することが望ましい。この方法では、相補鋳型と機能的部分の間のリンカーの一つを除いてすべてを選択的に切断し、それによりその合成をテンプレートする鋳型に物理的にわずか一つのリンカーを介して連結されているポリマーを得ることが可能である。この無傷のリンカーは結合したポリマーの活性にほんの少ししか影響を及ぼさないはずであり、それ以外で、リンカーの特性が本発明の本質をなすとは考えられない。鋳型と鋳型化されたポリマーの間の長さについてポリマーの大きさは広範囲に変化することができるが、本発明の目的のためには、好ましくはその長さはたった一つの結合から、約２０個の原子の長さの鎖長の範囲にある。
【０２８９】
鋳型化された分子の選択およびスクリーニング
所望の活性（例えば、特定の標的との結合、触媒活性または活性検定における個々の効果）を有する鋳型化された分子の選択またはスクリーニングは、いずれか標準的なプロトコルに従って行うことができる。例えば、アフィニティ選択は、ファージ提示ペプチド、ポリソーム提示ペプチドまたはｍＲＮＡ−蛋白融合提示ペプチドに用いられる原理に従って行うことができる。触媒活性の選択は遷移状態アナログアフィニティカラムに対するアフィニティ選択により行うことができ（Ｂａｃａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７；９４（１９）：１００６３−８）、あるいは機能性を基礎とする選択スキームにより行うことができる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５（１８）：１０５２３−８）。所望の特性についてのスクリーニングは、標準マイクロタイタープレートを基礎とする検定に従って、あるいはＦＡＣＳ−ソート検定により行うことができる。
【０２９０】
鋳型化された分子のライブラリの使用
既知の標的に結合するであろう鋳型提示分子の選択
本発明はまた、異なる標的との結合能を有する小型分子の選択を可能とする方法に関係付けられる。鋳型提示分子技法は、直接的な選択および増幅のためのビルトイン機能を含有する。選択された分子との結合はそれらが特異的な標的とのみ組み合わさるという意味で選択的でなければならず、それにより特異的生物学的作用が防止または誘発される。最終的に、これらの結合分子は、例えば、治療薬として、あるいは診断薬として用いることができるものでなければならない。
【０２９１】
鋳型提示分子ライブラリは、スクリーニング、選択または標的の機能についてリガンド分子の結合の効果を評価する検定と容易に組み合わせることができる。ある特定の具体例において、鋳型提示方法は、超分子、マクロ超分子、マクロ分子および低分子の構造物（例えば、核酸および酵素、受容体、抗体および糖蛋白を含む蛋白）；シグナル分子（例えば、ｃＡＭＰ、イノシトールトリホフフェート、ペプチド、プロスタグランジン）；および表面（例えば、金属、プラスチック、合成物、ガラス、セラミック、ラバー、皮膚、組織）に結合するリガンド分子を単離かつ同定するための迅速な手段と提供する。
【０２９２】
特に、この文脈において、選択または分割化なる語は、標的分子に結合した鋳型提示分子複合体、複合体標的対が、標的分子に結合されていない鋳型提示分子から分離することができる、方法を意味する。選択は当該分野にて知られている種々の方法により達成することができる。
【０２９３】
選択方法は、いずれのどのような標的に対しても選択できるように行うことができる。重要なことは、この選択方法では、ライブラリの標的または分子の構造の詳細な情報を必要とする工程はないということである。全工程は、ライブラリ中の分子の所定の標的に対する特定の認識／調整に関与する結合アフィニティによりなされる。しかしながら、ある場合において、必要であるならば、ファージ提示を用いて触媒活性を選択するのと同様に官能基を導入することもできる（Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３７：４１５−２２；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９８）ＰＮＡＳ．１８：１０５２３−１０５２８）。種々の選択操作の例を以下に記載する。
【０２９４】
このビルトイン鋳型提示分子選択方法は、選択工程が結合分子の選択で開始し、結合分子の最適化で終える、一連の工程でなされる、最適化に十分に適している。各工程の単一操作は種々のロボットシステムを用いて自動化することが可能である。これは、事象に一連の流れがあり、各事象を別々に行うことができるからである。大部分の好ましいセッティングにおいて、適当な鋳型提示分子ライブラリおよび標的分子は、最終的に最適化された結合分子を生成する、完全自動化システムに供給される。ましてやより好ましくは、この方法は全工程のロボットシステムの範囲外でも外部作業を全く必要としないで行うことができる。
【０２９５】
鋳型提示分子のライブラリは、潜在的に既知または未知の標的と協調しうる分子を含有するであろう。標的と結合する領域は、酵素の触媒部位、受容体上の結合ポケット（例えば、ＧＰＣＲ）、蛋白−蛋白の相互作用に関連する蛋白表面域（特に、ホットスピン領域）およびＤＮＡ上の特異部位（例えば、主溝）の中にあるとすることもできる。鋳型提示分子技法は、主に、標的分子と協調する分子を同定するであろう。その標的の機能特性は刺激（作動化）または減少（拮抗化）されることができ、あるいは鋳型提示分子の結合により影響を受けないとされることもできる。これは正確な結合モードおよび鋳型提示分子が標的を占める個々の結合部位に依存するであろう。しかしながら、異なる蛋白上の機能部位（例えば、蛋白−蛋白相互作用または触媒部位）は一の蛋白上の別のさらに中立の面にある分子と結合する傾向にあることが知られている。加えて、これらの機能部位は、通常、主として結合エネルギーと関与していると考えられるさらに小さいな領域、いわゆるホットスポット領域を含有する（Ｗｅｌｌｓら（１９９３）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．４８；２５３−２６２）。この現象は特定の標的の生物学的機能に影響を及ぼすであろう小型分子を直接選択する可能性を増大させるであろう。
【０２９６】
本発明の鋳型提示分子技法はファージ提示（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５−１３１７）などの他の提示方法と類似する選択操作を容認するであろう。ファージ提示選択は、ペプチド（Ｗｅｌｌｓ＆Ｌｏｗｍａｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、５９７−６０４）、蛋白（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０）および抗体（Ｗｉｎｔｅｒら（１９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５）について用いるのに成功している。同様の選択操作もまた、リボソーム提示（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９０２２−９０２６）およびｍＲＮＡ提示（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−３０２）などの別の型の提示システムにて活用されている。しかしながら、開示されている発明である、鋳型提示分子技法は、初めて、リボソーム複合体の翻訳工程の標的特異的小型非ペプチドを独立して直接的に選択することを可能とするものである。本発明に必要な工程は鋳型を増幅すること、モノマービルディングブロックを組み込むことと反応させることである。増幅と組込みおよび組込みと反応は同じ工程で、あるいは連続工程で行うかのいずれかである。
【０２９７】
鋳型化された分子（提示された分子）とＤＮＡ複製単位（コード化鋳型）の間の連結は、種々の選択方法に用いる結合分子の迅速な同定を可能とする。本発明は既知の標的に対する結合分子を同定するにおいて広範囲に及ぶ戦略を可能とする。加えて、この技法はまた、未知の抗体（エピトープ）に対する結合分子を単離することにより新規な未知の標的の発見を可能とし、これら結合分子を同定および検証に使用することを可能とする（「標的の同定および検証」のセクションを参照のこと）。
【０２９８】
認識されているように、結合分子の鋳型提示分子ライブラリからの選択は、最適結合分子を同定するいずれのフォーマットでも行うことができる。精製された標的を選択する典型定な操作は以下の主要な工程：鋳型提示分子ライブラリの作製；適当な固定方法を用いての標的分子の固定；鋳型提示された分子を結合させるためのライブラリの添加；結合していない鋳型提示された分子の除去；固定された標的に結合した鋳型提示された分子の溶出；シーケンスにより同定するためのあるいは次の選択ラウンドに入力するための鋳型に富む提示分子の増幅、を含むであろう。
【０２９９】
好ましい具体例において、鋳型提示分子ライブラリを用いる標準的選択プロトコルはバイオパニング法を用いるものである。この技法において、標的（例えば、蛋白またはペプチドコンジュゲート）を固体支持体に固定し、標的と潜在的に協調する鋳型提示された分子が、選択かつ増幅される分子である。しかしながら、結合された鋳型提示された分子を結合されていない分子、すなわち、溶液中の分子と分離することのできる選択操作が必要である。当業者に公知のように、これを達成するには多くの方法がある。
【０３００】
アフィニティ強化サイクルにおける第１工程（図１に記載の１ラウンド）は、固定された標的と低アフィニティの鋳型提示された分子を洗い流し、標的と強く結合した鋳型提示された分子を残すものである。ついで、厳格な洗浄の後も標的と結合している強化集団を、例えば、酸、カオトロピック塩、熱、既知のリガンドとの競合溶出または標的／鋳型分子の蛋白分解性放出に付すことで溶出させる。溶出された鋳型提示された分子は、多数の次数の増幅、すなわち、第１選択ラウンドにて強化された一つ一つの鋳型提示された分子がさらなる選択ラウンドにてかなり多数のコピー数で関与している、ＰＣＲに適している。典型的には、３ないし１０ラウンドの強化に付すと、標識と最も強固に結合する鋳型提示された分子が非常に富んでいる、一集団の分子が得られる。これは固定された標的に結合したままである鋳型提示分子の集団を検定することにより定量される。ついで、変異鋳型配列を個々に決定する。
【０３０１】
標的（ペプチド、蛋白、ＤＮＡまたは他の抗体）のビーズへの固定化は、標的（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出される折りたたまれていない標的）が管に吸着するであろう疑いのある場合に有用である。ついで、その誘導化されたビーズは、単にそのビーズをベンチ遠心分離にて沈殿させることにより、鋳型提示分子を選択するのに用いることができる。また、ビーズを用いてアフィニティカラムを製造することも、該カラムを通して再循環した鋳型提示ライブラリの懸濁液を製造することもできる。例えば、−ＮＨ２基および−ＳＨ基との結合を含め、標的分子を固定するのに利用することのできる多くの反応性マトリックスがある。磁気ビーズは本質的にはその上が変異しており；選択に用いることのできる磁気ビーズと標的が結合している。（カップリングに用いることのできる）−ＮＨ２または−ＣＯＯＨ基との結合部位を有する活性化されたビーズが利用可能である。標的をニトロセルロースまたはＰＶＤＦ上にブロットすることができる。ブロッティング法を用いる場合、標的を（例えば、ＢＳＡまたは類似蛋白で）固定した後に、使用されるブロットのストリップが確実に遮断されるようにすることが重要である。
【０３０２】
もうひとつ別の好ましい具体例において、選択または分割はまた、例えば：免疫沈降法または間接的免疫沈降法（標的分子が鋳型提示分子と一緒に捕獲される）；アフィニティカラムクロマトグラフィ（標的をカラムに固定し、型提示ライブラリを流し、標的結合分子を捕獲する）；ゲルシフト（アガロースまたはポリアクリルアミド）（選択された鋳型提示分子がそのゲルにて標的と一緒に移動する）；鋳型提示分子と協調する細胞を局部にとどめるように分離するＦＡＣＳ；鋳型提示結合分子と一緒に標的分子を単離するためのＣｓＣｌ勾配遠心分離；鋳型提示分子で標識された標的分子を同定するための質量分析；などを用いて行うことができるが、これに限定されるものではない。一般に、鋳型提示分子／標的の複合体と結合していない鋳型提示分子とを分離することができるいずれの方法も有用である。
【０３０３】
表２：鋳型提示技法を用いて結合分子を同定するのに使用することが可能な選択方法の例
Figure 2004535193
【０３０４】
鋳型提示された分子の溶出は種々の方法で行うことができる。結合分子は変性、酸またはカオトロピック塩により標的分子から切り離し、ついで増幅を介してもうひとつ別のバイアルに移すことができる。別法として、溶出はより特異的であってもよく、骨格を還元することができる。溶出は蛋白分解を用いて行い、標的と固定表面との間の、または提示分子と鋳型との間のリンカーを切断することができる。また、既知のリガンドと競合させることで溶出を行うこともできる。別法として、選択反応の最後で、洗浄されたウェルにてＰＣＲ反応を直接行うこともできる。
【０３０５】
本発明の考えうる特徴は、結合分子そのものが必要ではなく、さらに増幅またはクローニングされるのにコード因子ＤＮＡが必要とされるだけであるから、結合分子が選択可能である標的から溶出可能である必要のないことである。溶出が非常に困難であるくらい気密に最も強烈なリガンドと結合することのできるいくつかの選択操作が知られている。しかしながら、本発明の方法を実施して、共有結合リガンドであっても、強烈なリガンドを首尾よく生成することができる。
別の選択プロトコルは、既知のリガンドをライブラリにて各々提示されている分子のフラグメントとして包含する。この既知のリガンドは、標的分子の所定の部分と協調することで選択の指針を与えるものであり、その同じ部位に結合する分子に選択の焦点を合わせるものである。これは所望の生物学的機能を有するが、強度が低すぎるリガンドに対するアフィニティを増加させるのに特に有用であるとすることができる。
【０３０６】
本発明のさらなる態様は、選択された結合分子の単一物または混合物の多様性または複合性を増加させる方法に関する。最初の選択をした後、強化された分子を改変し、さらにその提示された分子の化学的多様性または複合性を増大させることができる。これは当該分野にて公知の種々の方法を用いて、例えば、ランダムに合成されたオリゴヌクレオチド、スパイク化されたオリゴヌクレオチドまたはランダム変異誘発を用いて行うことができる。ランダム化は好ましいコドンに焦点を合わせることができ、または鋳型ヌクレオチド配列の所定の部分またはサブ配列の局部に限定することもできる。他の好ましい方法は蛋白の相同遺伝子に用いられるＤＮＡシャフリングと同様の方法を用いて結合分子をコードする鋳型を組み合わせる方法である（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１）。この方法を用いて最初のライブラリを組み換えてもよく、あるいは強化されたコード鋳型を組み換えることがより好ましい。
【０３０７】
本発明のもうひとつ別の好ましい具体例において、細胞表面上で、例えば、イオンチャネルまたは膜貫通受容体でのみ発現することのできる特異的抗原に対する結合分子が必要とされる場合、細胞粒子そのものを選択物質として用いることもできる。このような方法において、特異的標的を欠く細胞を用いて一またはそれ以上のラウンドのネガティブの選択を行うか、またはその選択工程において大過剰で存在すべきである。ここで、関係のない鋳型提示される分子が除去される。例えば、ネガティブな選択が全細胞にて発現される受容体に対するものである場合、ネガティブな選択は変更されていない細胞に対するものであろう。この方法はまたサブトラクション選択とも言われ、抗体ライブラリでのファージ提示に使用するのに適している（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．４：１−２０）。
【０３０８】
選択操作の一例として、受容体が選択された結合分子と一緒になって細胞質または細胞核までの道を作ることができるように、膜から吸収されるようになる細胞表面受容体の選択が挙げられる。特定の選択された結合分子の解離速度定数に応じて、これらの細胞は、吸収された後、細胞質または核のいずれかに広く定住する。
当業者であれば、選択工程が、鋳型が鋳型提示分子上のおとりとして用いられる、いずれかのセットアップにて行うことができることを理解するであろう。
【０３０９】
本発明の選択方法は、第２の選択またはスクリーニングと組み合わせて、結合の際に標的分子の機能を修飾することのできるリガンド分子を同定することができる。かくして、本明細書に記載の方法を利用して、蛋白または核酸に結合し、その機能を修飾する結合分子を単離または産生することができる。本発明の方法を利用して、標的酵素の触媒活性に影響を及ぼすであろう、すなわち、触媒作用を阻害し、または基質結合を修飾し；蛋白受容体の官能基導入に影響を及ぼすであろう、すなわち、受容体との結合を阻害するか、または受容体との結合の特異性を修飾し；蛋白多量体の形成に影響を及ぼし、すなわち、蛋白サブ単位の四次構造を崩壊させ；および蛋白の輸送特性を修飾し、すなわち、蛋白により小型分子またはイオンの輸送を崩壊させる、結合分子を同定し、単離しまたは産生することができる。
【０３１０】
本発明のさらなる態様は選択工程において官能性を含ませることのできる方法に関する。例えば、特定の標的に対する強化が多くの異なるヒットの生成にてなされる場合、これらのヒットは官能性（例えば、細胞シグナル化）について直接試験することができる。これは、例えば、蛍光活性化された細胞分離法（ＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。
【０３１１】
改変表現型は広範囲に及ぶ方法で検出することができる。一般に、改変された表現型は、例えば：細胞形態学の顕微分析；細胞死の増加および細胞生存の増加の両方を含む、標準的細胞生存検定；ＦＡＣＳまたは他の染色技法を含む、一定レベルの特定の細胞または分子の存在についての蛍光指示検定などの標準的標識検定；細胞を殺した後の標的化合物の発現の生化学的検出；などを用いて検出される。ある場合には、種々の受容体遺伝子構築物を用いて特異的シグナル化経路をプローブすることができる。
【０３１２】
鋳型提示分子技法と組み合わせることができる第２の選択方法は、とりわけ、酵素阻害の選択またはスクリーン、基質結合の改変、官能性の喪失、構造物の崩壊などを包含する。当業者は、本明細書に記載の方法と適合しうる選択またはスクリーニング方法の種々の改変を選択することができる。
【０３１３】
本発明の結合分子は、結合に加えて、他の特性について選択することもできる。例えば、選択の間の、最終生成物の特定の所望の作業環境の条件に対する安定性を選択基準として含めることができる。特定のプロテアーゼの存在下で安定している結合分子が望ましいならば、そのプロテアーゼは、ある意味で、選択の間に使用されるバッファー媒体であるとすることができる。同様に、選択はまた、血清または細胞抽出液中で、あるいはある型の媒体中で行うことができる。認識されているように、この鋳型提示方法を利用する場合、その鋳型を崩壊または分解する条件は増幅を行うために回避すべきである。他の望ましい特性も、当業者に認識されるように、その提示分子中に直接組み込むことができる。例えば、膜アフィニティは、一の特性として、疎水性の高いビルディングブロックを利用することで含めることができる。
【０３１４】
鋳型提示分子技法により選択される分子は種々の合成方法により製造することができる。選択される結合分子の構造はコード化鋳型の核酸配列から容易に得ることができるため、化学合成を行うことができる。結合分子を組み合わせる化学反応に加えてそれらを構成するビルディングブロックも知られているから 選択される分子の化学合成もまた可能である。
好ましい具体例においては、選択される結合分子を合成し、種々の適当なインビトロおよびインビボ試験で試験し、選択された候補物を生物学的作用および効能について確認する。このことは、当業者に知られており、その生体活性な分子の組成に応じて、種々の方法で行うことができる。
【０３１５】
標的の同定および確認
もう一つ別の態様において、本発明は、病理学的工程または他の生物学的事象に関与する標的を同定または単離する方法を提供する。この態様において、標的分子は再び蛋白または核酸であることが好ましいが、とりわけ、炭水化物および特定のリガンド分子結合を達成することのできる種々の分子をも包含する。原理的には、この標的提示分子技法を用いて、細胞、組織またはインビボに見られる特異的なエピトープまたは抗原を選択することができる。これらのエピトープは重要な生物学的事象に関連する標的に属するかもしれない。加えて、これらのエピトープはまた、標的の生物学的機能に関連するかもしれない。
【０３１６】
新規な細胞性抗原を同定するのに、抗体およびペプチドライブラリでのファージ提示が数え切れないくらい使用されている（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：７２２−７２７；Ｓｃｈｅｆｆｅｒら（２００２）Ｂｒ J Ｃａｎｃｅｒ８６：９５４−９６２；Ｋｕｐｓｃｈら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：９２５−９３１；Ｔｓｅｎｇ−Ｌａｗら（１９９９）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：９３６−９４５；Ｇｅｖｏｒｋｉａｎら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８６：３０５−３０９）。細胞特異的抗原を発現すると考えられる細胞を直接選択するのに特に効果的である。細胞表面抗原を選択する場合、鋳型分子を細胞の外側に維持できることが重要である。このことは鋳型分子が細胞表面から切り離された後に無傷である可能性を増大させるであろう。
【０３１７】
鋳型提示分子のインビボでの選択には多大な可能性がある。鋳型提示された分子をライブラリからインビボで選択することにより、正常な細胞および他の病理学的組織（例えば、腫瘍）に特異的に帰巣する能力を有する分子を単離することが可能である。この原理はペプチドライブラリのファージ提示を用いて説明されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ＆Ｒｕｏｓｌａｔｈｉ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ２８０：３６４−３６６）。このシステムは異なる器官に局在化されたペプチドのモチーフを同定するのにヒトにおいても用いられる（Ａｒａｐら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１２１−１２７）。鋳型提示ライブラリについても同様の選択操作を用いることができた。ファージ提示におけるコード化ＤＮＡは、インビボでの選択を可能とするファージ提示により効果的に保護することができる。したがって、インビボでの鋳型の安定性は増幅および同定に重要であろう。鋳型は、インビボにて用いるためにアプタマーを安定化させるのに使用されるのと同様の方法にて、種々のヌクレオチド誘導体を用いて安定化させることができる（Ｎｏｌｔｅ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１６−１１２１；Ｐａｇｒａｔｉｓら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７２）。しかしながら、鋳型構造は提示された分子をコードするために用いられる修飾された塩基であるため、それが分解に対して安定化されると考えるのが合理的である。鋳型分子を種々の方法を用いて溶解性についてシールドする場合に、他の型の保護も可能である。これは、例えば、リポソームのペグ化、結合蛋白または他の種の保護を包含する。鋳型分子はまた、外部操作から鋳型を保護する別の設計された構造物に組み込むこともできる。例えば、リンカーを、鋳型がビヒクルの内側に位置し、提示分子がその外側に位置するように、ビヒクルに組み込ませることができる。その並べ方は鋳型分子を外部操作から保護し、同時に提示分子を暴露し、選択を可能とさせるであろう。
【０３１８】
大抵の抗体は大きな凹形結合領域を有し、それは抗原上のエピトープが、ある程度、突出していることを要求する。さらに、抗体分子は大きな巨大分子（１５０ｋＤａ）であり、立体的に、（例えば、細胞表面上の）多くの異なる抗原のアクセスを減少させるであろう。鋳型提示技法は抗体にアクセスすることのできないエピトープとアクセスし、それを認識することができる。小さな結合分子は活性部位、溝および抗原上の他の領域に結合することができるであろう。そのコード化鋳型因子もまた、鋳型結合分子平均の物理的アクセスを増加させるであろう抗体よりも小さい。加えて、鋳型結合分子ライブラリの多様性および複合性はペプチドライブラリと比べてずっと大きいであろう。このことは化学的に十分でないためペプチドにアクセスできないエピトープと協調しうる分子を見つけ出す可能性を増大させるであろう。同時に、鋳型提示分子技法は抗体またはペプチドで同定することができない新しい高原を同定する可能性がある。当業者であれば、種々の型の細胞が選択操作にて用いることができることを認識するであろう。また、新しい抗原の選択を上記した控除法を用いて行うことができることを理解するであろう。
【０３１９】
本発明のもう１つ別の態様は、同定された標的を確認する方法に関する。同定された結合分子が標的の生物学的応答を変化させているならば、それらを直接用いることも可能である。これは直接または細胞を基礎とするアッセイを用いてインビトロにて行うこともできるし、いずれかの表現型応答をインビボにて研究することで行うこともできる。この方法の強みは同じ分子が種々の標的の同定および確認の両方に使用されることである。最も好ましいことは、その結合分子が治療剤として直接用いることができることである。
【０３２０】
もう一つ別の好ましい具体例において、鋳型提示分子を用いて標的分子を取り出すことができる。これは、例えば、バクテリオファージ上で発現される、ｃＤＮＡライブラリに対して選択することで達成されうる（ライブラリ対ライブラリ）。鋳型提示分子ライブラリをｃＤＮＡライブラリと混合することにより、鋳型提示分子ライブラリにある小型分子と、ｃＤＮＡライブラリからの蛋白との間の結合対を見つけることができるであろう。一の可能性はファージ提示ライブラリと鋳型提示ライブラリを混合することであり、ファージまたは鋳型ライブラリのいずれかについて選択することである。ついで、選択されたライブラリを局在化されたファージクローンに置く。その場合、ファージおよび鋳型提示分子をコードするＤＮＡはＰＣＲを用いて同定することができる。核酸、炭水化物、合成ポリマーなどの、ｃＤＮＡ以外の型のライブラリを用いることもできる。
【０３２１】
本発明のもう一つ別の具体例において、鋳型提示分子技法を用いてインビボおよびインビトロにおける薬物代謝機構を説明することができる。これはＩ期（活性化）およびＩＩ期（無毒化）反応の両方を含みうる。主たる反応は酸化、還元および加水分解である。他の酵素はコンジュゲーションに触媒作用を及ぼす。これらの酵素は、これらの酵素と協調する傾向にある提示された分子を削除する選択工程において標的として用いることができる。その後、これらの提示された分子に対応する鋳型を用いて、鋳型提示分子ライブラリを作製する時にこれらの分子を競合または削除することができる。
【０３２２】
こうして得られたライブラリは、Ｉ−ＩＩ期と関連付けられる酵素に結合する傾向を有するであろう分子がなく、より早く削除される可能性がある。例えば、各々別個の酵素またはチトクロームＰ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、加水分解酵素、還元酵素、脱水素酵素、オキシダーゼＵＤＰグルクロノシル変換酵素、グルタチオンＳ−変換酵素ならびに他の関連酵素の組み合わせについての選択を行い、これらの代謝酵素に協調する傾向にあるこれらの結合分子を同定することができる。阻害剤は、その結合親和性から、容易に選択されるが、基質は同定されるのに少なくともマイクロモルの親和性を必要とする。
【０３２３】
本発明のもう一つ別の具体例として、興味のあることに、上皮原形質膜または他の膜を介して受動的または能動的に移動できるようになる分子を直接的に選択する可能性のあることである。一の可能性のある選択検定は、ＣａＣＯ−２細胞、ヒト結腸上皮細胞系を用いるものであり、一般に、胃腸における上皮バリアについての優れた実験として受け入れられているものである。ＣａＣＯ−２検定は、その得られた単層が先端コンパートメントと基底外側のコンパートメントの間に生物学的バリアを形成するように、ヒト結腸上皮細胞系を組織培養ウェル挿入物上で増殖させることを含む。鋳型提示分子ライブラリをその細胞単層のいずれかの側面に置き、その細胞単層を通過することのできる分子を集め、増幅させる。活性分子が同定されるまでこの工程を繰り返すことができる。この検定において他の細胞系または組織も可能であり、当業者にとって明らかである。
【０３２４】
本発明のさらなる態様は、選択された分子の安定性を選択する方法に関する。これは、結合分子に富んだプールを、その結合分子の構造をおそらく分解する、または変化させるであろう環境に供することで行うことができる。種々の条件は、特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼの混合物、細胞抽出液、および例えば、胃腸からの種々の流体とすることができる。他の条件は、種々の塩または酸の環境、または高温とすることができる。もう一つ別の可能性は既知のリガンドのライブラリを作製し、そのライブラリを安定性試験および選択に供し、上記した特定の条件下で安定な分子を同定することである。
【０３２５】
治療用途
本発明の治療用途の可能性は大きい。例えば、本発明の鋳型提示分子方法は種々の標的を遮断または刺激するのに用いることができる。治療関連の標的は、機能不全とする、すなわち病態に至る、制御工程に関与していることが知られている、あるいは関与していると考えられる物質である。かかる工程として、例えば、受容体−リガンド相互作用、転写−ＤＮＡ相互作用、および接着分子を含む細胞−細胞相互作用、共同因子−酵素相互作用、および細胞内シグナル化での蛋白−蛋白相互作用がある。標的分子とは目的とする化合物を意味する。リガンド分子が望ましい。このように、標的として、例えば、化合物、化合物の混合物、一連の空間的に特定の部位に限定される化合物、ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの生体巨大分子、バクテリオファージペプチド提示ライブラリ、リボソームペプチド提示ライブラリ、生体物質、例えば、細菌、植物、真菌または動物（例えば、哺乳動物）細胞または組織から形成される抽出物、蛋白、融合蛋白、ペプチド、酵素、受容体、受容体リガンド、ホルモン、抗原、抗体、薬物、色素、成長因子、脂質、基質、毒素、ウイルスなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。標的の他の例として、例えば、全細胞、全組織、関連または関連しない蛋白の混合物、ウイルスまたは細菌系統の混合物などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３２６】
治療薬の標的は機能に応じて種々のクラス；受容体、酵素、ホルモン、転写因子、イオンチャネル、核受容体、ＤＮＡに分類することができる（Ｄｒｅｗｓ， Ｊ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：１９６０−１９６４）。とりわけ、受容体、核受容体および代謝酵素が、現存する薬物の既知の標的の大部分を圧倒的多数で示す。特に、Ｇ蛋白結合受容体（ＧＰＣＲ）が薬理介入のためのプロテアーゼと共に最も重要なクラスの薬物標的の一つを構成する。上記した例は最も関連する標的に照準を合わせているが、当業者にとって他の治療標的を目的とするものであってもよいことは自明のことであろう。
【０３２７】
鋳型提示分子方法を利用する本発明は、各標的が有する特異的特性に応じて、これらすべてのクラスの薬物標的についてのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに用いることができる。標的の大部分は直接選択操作のための精製された形態にて得ることが可能である。組み込まれた細胞表面受容体のように他の標的が天然の環境中にある場合でも、それらを用いなければならない。、そのような状況において、鋳型提示分子ライブラリを用いる選択は、上記したような控除−選択を用いて行うことができる。
【０３２８】
本発明における鋳型提示分子技法の一の特異的な用途は、受容体と一またはそれ以上のリガンドの間の相互作用を遮断する、アンタゴニストとして機能しうる分子を生成することである。もう一つ別の用途として、細胞を標的とすることが挙げられる。例えば、特異的表面蛋白または受容体を認識する生成された分子はある特定の細胞型に結合しうるであろう。かかる分子は、加えて、（例えば、癌治療のための）効能を増大させ、副作用を減少させるもう一つ別の治療薬を有していてもよい。抗ウイルス薬として用いる用途も含まれる。例えば、ウイルス粒子上のエピトープと強固に結合する、生成された分子は、抗ウイルス剤として有用である可能性がある。本発明の鋳型提示分子技法のもう一つ別の特異的な用途は、受容体を刺激するか、または活性化し、細胞性シグナル化経路を作動させる、アゴニストとして機能しうる分子を生成することである。
【０３２９】
鋳型提示分子アレイ
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の方法により単離することのできるリガンド分子を利用する、試料中の標的分子の存在または不存在を検出する方法、および／またはその分子の量を測定する方法に関する。これらのリガンド分子は、別々に、あるいは複数を測定するためのアレイシステムにて用いることができる。
【０３３０】
蛋白構造、蛋白の蛋白に対する相互作用、経路および蛋白が疾患の発生にどのように影響を与えているかを理解することは、極めて重要である。研究者は核酸マイクロアレイを利用し、遺伝子型の特定を介して新しいバイオマーカを追跡することができる。しかしながら、大きな障害として、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現のレベルと、細胞内で発現される対応する蛋白の量との間には相関関係が欠如している（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｒｅｓｉｓ１８：５３３−５３７）。ＤＮＡおよびＲＮＡ分析とは反対に、蛋白融合研究と並行しての生体素子の使用はよりずっと困難である。直鎖状配列の結合または相互作用を基礎とするハイブリッド形成反応と異なり、蛋白の相互作用は３Ｄに折り畳まれたアミノ酸配列より生じるポリペプチド表面が関与する。実質的に３Ｄに折り畳まれた蛋白を調製する要件は、蛋白のマイクロアレイの作成を困難にする。蛋白マイクロアレイは非常に感受的であって、熱処理および強い化学薬品を用いることにより簡単に分解され得る。その上、折り畳まれた蛋白の相互作用は、ＤＮＡ／ＲＮＡ生体素子に使用されるハイブリッド形成反応と比べて、配列にかなり大きく依存している。蛋白の相互作用の配列依存性は反応速度をさらに複雑にするであろう。
【０３３１】
本明細書に記載の発明は、蛋白またはペプチドを検出分子として使用することなく、種々の量の蛋白のレベルを測定することのできるアレイを製造する、一の可能性のある方法を提供する。鋳型提示分子技法を用いて多数の標的への小型結合分子を同定することができる。ついで、これらの結合分子を特定の位置に並べ、検出分子として作動させ、種々のバイオマーカの量を測定することができる。例えば、特定の経路に関与することが知られているサイトカインまたは酵素に拮抗する結合分子は、記載されている技法を用いて生成することができる。ついで、これらの結合分子を使用されるべきアレイフォーマットにスポットし、サイトカインまたは酵素の各々の絶対量または相対量を測定する。
【０３３２】
このシステムを用いる一の主たる利点は、ＤＮＡアレイに使用されるスポット法がこのシステムに完全に同じように適用され得るということである。鋳型提示された分子はスポットされたＤＮＡに直接適用することができる。もう一つ別の可能性は、その合成がポリメラーゼおよびヌクレオチドアナログを用いて予め被覆された鋳型上で行うことができることである。この技法でのアドレス可能マイクロアレイは、数千の異なる機能分子を一の素子の異なる配置にハイスループット沈降にて導くようにするであろう。その原理を全体として図４０に示す。
【０３３３】
鋳型提示分子技法は天然に存在する２０種のアミノ酸の化学に限定されるものではない。この技法は種々の標的に結合するであろうより強固で安定した分子の鋳型上で合成することもできるであろう。これらの分子の安定性が大きくなればなるほど、一の表面に固定され、熱、低または高ｐＨの界面活性剤などのきつい条件に曝されるのに適するようになるであろう。加えて、アレイの寿命も蛋白で製造されるアレイよりもずっと長くなるであろう。
【０３３４】
分子生物学的ツール
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸を増幅する代表的方法である。ＰＣＲ技法の記載は以下の文献にて見出される（Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０−１３５４；Ｓｃｈａｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：１０７６−１０７８；米国特許第４６８３２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）。別の増幅法は、とりわけ、選択されたＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、そのベクターを宿主生物に導入し、そこでベクターおよびクローン化ＤＮＡを複製し、そうして増幅することを含む（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４−１８７８）。加えて、選択された核酸配列の正確かつ効果的な増幅を可能とするであろういずれの手段も本発明の方法にて利用することができる。増幅後の配列の比例的発現量は、必然的に、増幅前の混合物中の配列の相対的割合を反映しているにすぎない。
【０３３５】
本発明の鋳型変種は、当該分野にて既知の適用な方法により産生することができる。かかる方法は化学合成または化学合成と組換えＤＮＡ技法の組み合わせによりヌクレオチド配列を構築することを含む。
本発明の鋳型変種をコードするヌクレオチド配列は、適当な提示分子をコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、ついで提示された分子の関連する機能的部分を導入（すなわち、挿入または置換）あるいは除去（すなわち、欠失または置換）するためにヌクレオチド配列を変更することにより構築され得る。
【０３３６】
鋳型分子に対応するヌクレオチド配列は、都合よくは、慣用的方法に従って、部位特異的変異誘発により修飾される。また、ヌクレオチド配列は化学合成により、例えばオリゴヌクレオチド合成装置（オリゴヌクレオチドは所望の鋳型の配列に基づいて設計される）を用いることにより調製される。例えば、所望の鋳型の一部をコードする小型オリゴヌクレオチドはＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ、ＰＮＡＳ８８：１８９−１９３、１９９１）により合成され、組み立てられる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的アセンブリのために５’または３’に突出部を有する。
【０３３７】
ヌクレオチド配列を修飾する別の方法は、ハイスループットスクリーニングまたは選択のための鋳型変種を産生するのに利用できる。例えば、米国特許第５０９３２５７号に開示されているような相同交差に関する方法、および遺伝子をシャフリングする、すなわち、２またはそれ以上の相同ヌクレオチド配列の間の組み換えに関する方法は、開始時のヌクレオチド配列と比較した場合に、多くのヌクレオチドが変形した新しいヌクレオチド配列をもたらす。遺伝子シャフリング（ＤＮＡシャフリングとしても知られている）は、一またはそれ以上のサイクルの無作為な断片化に付し、ヌクレオチド配列を再構築し、つづいて選択し、所望の特性を有する分子を提示する変種をコードするヌクレオチド鋳型配列を選択することを含む。
【０３３８】
適当なインビトロ遺伝子シャフリング方法の例が、Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９１、１０７４７−１０７５１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７０、３８９−３９１頁；Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３７０、３２４−３２５頁；Ｚｈａｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８８、Ｍａｒ，１６（３）：２５８−６１；Ｚｈａｏ Ｈ．およびＡｒｎｏｌｄ，ＦＢ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．６、１３０７−１３０８頁；Ｓｈａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８８、Ｊａｎ １５、２６（２）：６８１−８３頁；およびＷＯ ９５／１７４１３に開示されている。
【０３３９】
合成シャフリングは、例えば、フランキング配列を基礎とするオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドのライブラリを提供することを含む。その合成により生成されたオリゴヌクレオチドを組み換え、得られた組換え核酸配列をスクリーンに付し、所望により、さらにシャフリングサイクルに用いてもよい。
コンピュータシステムを用いて行われるか、またはモデル処理される、組換え操作は理論的に計算することができ、そのため核酸を物理的に操作する必要性は一部または完全に回避することができる。
【０３４０】
（合成、部位特異的変異誘発、ＤＮＡシャフリングまたは他の方法により）一旦組み立てられた、鋳型をコードするヌクレオチド配列を用いて、鋳型提示ライブラリが作製される。
本発明のさらに別の態様は、本発明のコンジュゲートまたは変種を含む医薬組成物、ならびに本発明のコンジュゲートおよび変種を産生する方法および使用する方法に関する。
【０３４１】
「親和性」なる語は、本明細書において、分子−標的の相互作用を記載する定性的用語として用いられる。親和性についての定量的尺度は結合定数（ＫＡ）で表わされる。結合定数と解離定数は式：ＫＤ＝１／ＫＡで互いに関連付けられる。高親和性が低解離定数と対応するのは明らかである。「特異的標的に結合する」なる語は、適当な結合または機能アッセイにて試験した場合に、測定可能な応答が得られるように、鋳型提示分子技法を用いて得られた結合分子が選択される標的に結合することを意味する。この文脈において、「治療薬」なる語は、意図して、生物学的または薬理学的に活性な物質または抗原を含む物質を意味し；当該用語は動物およびヒトに影響を及ぼす疾患または障害を治療または予防するのに、あるいは動物またはヒトの生理学的症状を制御するのに有用性を有する物質を包含し、それはまた、有効量を投与した場合に、生存細胞または生物に対して効果を有する、生物学的に活性な化合物または組成物を包含する。
【０３４２】
鋳型提示ライブラリを構築した後、所望のリガンドを有する鋳型提示分子を以下に記載のプロトコルを用いて捕獲することができる。二つの底部の平坦なマイクロタイタープレートの二つのウェルをＴＢＳバッファー中のストレプトアビジン（約１μｇ）で被覆する。４℃で一夜インキュベートする。ストレプトアビジン溶液を取り出し、該ウェルをＴＢＳで少なくとも６回洗浄する。直ちに２％ＢＳＡを添加し、ウェルを遮断し、３７℃で約３０分間インキュベートする。プレートをＴＢＳバッファーで少なくとも３回洗浄する。約０．１μｇのビオチニル化標的分子（ビオチニル化は文献の記載に従って行うことができる）をウェルの一方（他方は対照として用いる）に添加し、２０℃で約３０分間インキュベートし、ついでＴＢＳバッファーで少なくとも６回洗浄することで過剰物を取り除く。遊離ストレプトアビジン分子を１ｍＭビオチンで５分間遮断し、過剰物を少なくとも６回ＴＢＳバッファーで洗い流す。ついで、鋳型提示分子ライブラリを両方のウェルに添加し、２０℃で約１時間インキュベートすることで結合させる。ウェルをＴＢＳバッファーで少なくとも６回洗浄し、固定された標的分子と協調しない鋳型提示分子を取り除く。結合分子を取り除く条件を用いて協調されている鋳型提示分子を溶出させる。後の選択サイクルにて、標的分子を含むウェルと含まないウェルの間で溶出された分子の数を比較し、標的を含むウェルにて溶出される鋳型提示分子が多いことを確信する。このことは選択工程にて特異的な強化のあることを示すものであろう。選択操作の他の型および多くの変形を文献にて見出すことができる（例えば、「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（２０００）Ｂａｒｂａｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０３４３】
上記した捕獲に代わるものとして、鋳型提示されたライブラリを構築した後、以下のプロトコルを用いて所望のリガンドを有する鋳型提示分子を捕獲するものが挙げられる。鋳型提示分子の選択は、磁気活性化された細胞を分類する方法を用いて行うことができる（Ｓｉｅｇｅｌら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：７３−８５）。正の細胞（目的とする抗原を有する細胞）はスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて細胞表面がビオチニル化されている。約１０６個のビオチニル化された細胞を１０μｌのストレプトアビジン被覆の常磁性マイクロビーズ（Ｄｙｎａｌ）に添加し、結合させる。約１０８個の負の細胞（目的とする抗原を有しない細胞）を添加する。これらの負の細胞は非特異的鋳型提示分子のシンクとして作用し、標的細胞が特異的鋳型提示分子を捕獲する。細胞混合物をペレット状にし、上澄を捨て、鋳型提示ライブラリ懸濁液に懸濁させる。回転器上、３７℃で約２時間インキュベートし、細胞を懸濁状に維持する。細胞／鋳型提示ライブラリ溶液を磁気カラムにローディングし、負の細胞をすべて洗浄することで正の細胞を回収する。最終的に、磁場を取り除くことで正の細胞を溶出させ、ＰＣＲを用いて溶出された鋳型を増幅させる。この選択プロトコルは必要ならば数回繰り返すことができる。
【０３４４】
鋳型化された分子の合成のテンプレート能を有する鋳型の増幅
一の態様において、本発明は、標的に結合と結合することのできる、または結合することのできない鋳型化された分子の増幅方法に関する。増幅方法の選択はコード化または相補因子の選択に依存する。天然のオリゴヌクレオチドは最先端の方法により増幅することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ならびに例えば、核酸配列を基礎とする増幅（例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３５０、９１−９２（１９９１））、アンチセンスＲＮＡの増幅（例えば、ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら、ＰＮＡＳ ８５：７７６５２−７７６５６（１９８８）；自律的配列複製システム（例えば、Ｇｎａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔら、ＮＡＲ２５：４７９７−４８０２（１９９７）に記載されるようなポリメラーゼ独立性増幅、ならびにクローン化ＤＮＡ断片を有するプラスミドのインビボ増幅を包含する。リガーゼ介在増幅方法、例えば、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）を用いてもよい。
【０３４５】
天然に存在しないヌクレオチドのための、効果的な増幅手段を選択することはほとんどない。定義されるところの天然に存在しないヌクレオチドは、ポリメラーゼを含む、特定の酵素により組み込むことができるため、拡張サイクルの各々の間にポリメラーゼを添加することでポリメラーゼ連鎖反応を手動で行うことが可能であろう。
ヌクレオチドアナログを含有するオリゴヌクレオチドのための、増幅方法はほとんど存在しない。その一つが酵素の介在しない増幅スキームの使用である（Ｓｃｈｍｉｄｔら、ＮＡＲ２５：４７９７−４８０２（１９９７））。ＰＮＡおよびＬＮＡなどの骨格修飾されたオリゴヌクレオチドアナログの場合、この増幅方法を用いることができる。増幅の前、間に、鋳型または相補鋳型を変異させるか組み合わせ、次の選択またはスクリーニングのラウンドのために多様性を創作することもできる。
【０３４６】
選択またはスクリーニング検定により単離されるポリマーの特徴化
最終ラウンドの選択の後、個々の鋳型化されたポリマーの配列を測定するために、個々の鋳型を配列決定することが望ましいことが多い。鋳型が天然のヌクレオチドを含有する場合、単離された鋳型を、所望によりＰＣＲにより増幅させることは一般に慣用的なことであり（鋳型がＲＮＡ分子であるならば、ＰＣＲ増幅に付す前にｃＤＮＡを産生するために逆転写酵素を用いる必要がある）、ついでそのＤＮＡ断片を、例えば、プラスミド中にクローンさせ、これらを形質転換させ、ついで一または複数のタンダムＤＮＡ配列を含有する個々のプラスミドクローンを配列決定する。この場合において、鋳型の中央のランダムまたは部分的にランダムな配列に隣接する配列の両側に（すなわち、プライマー結合部位に）制限部位を設けることが実用的である。このことは単離されたヌクレオチドのクローニングを容易にするであろう。配列決定は、標準的なジデオキシ連鎖停止方法により、あるいはより古典的な手段、例えば、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケシングにより行うことができる。
【０３４７】
鋳型が天然に存在しないヌクレオチドを含有する場合、個々の配列を微生物である宿主を介して移動させることでクローンすることは不可能である。しかしながら、各ビーズが一のオリゴヌクレオチド配列を有するビーズ集団を用いた場合、インビトロにてクローンすることが可能であり、その後、特定のビーズに結合したヌクレオチドすべてを増幅させ、ついで配列決定してもよい（Ｂｒｅｎｎｅｒら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７、１６６５−１６７０）。別法として、単離物の集団を適宜希釈し、ついでウェルが平均して、例えば、０．１鋳型を含有するように、マイクロタイタープレートにアリコートしてもよい。単一の鋳型を、例えば、ＰＣＲで増幅させることで、標準的方法を用いて配列決定することも可能であろう。もちろん、これには、天然に存在しないヌクレオチドがＰＣＲに使用される熱安定性ポリメラーゼの基質であることが要求される。
【０３４８】
より短いオリゴヌクレオチドを必要とする別の方法を用いる場合、鋳型のコード化／鋳型化領域の両側に制限部位を含めるように最初の鋳型を設計することが望ましい。それにより、最終選択ラウンドの後で、鋳型を制限し、鋳型化されたポリマーをコードする短いオリゴヌクレオチドを得、ついでこれらのショートオリゴを種々の分析手段に適用することができる。
所定の配列であるが、ランダムな配列を有するオリゴのＤＮＡアレイを用いることで単離物を配列決定することも可能である。
【０３４９】
例えば、配列が見当に合っていると考えられる場合、例えば、最初のライブラリは既知の（比較的高い）所望の活性を有するポリマー配列を基礎として変質した配列のみからなるため、単離物の集団をプールとして配列決定することも望ましい。したがって、すべての単離物は選択前の鋳型の原配列と類似する配列を有すると考えられる。単離物の集団を全体として配列決定できるのは、全体として集団のコンセンサス配列を含有するためである。
【０３５０】
鋳型化された分子
本明細書に記載の種々の原理により鋳型化することのできるオリゴマーの、包括的でなく、かつ限定するものではない、リストを以下に示す：
アルファ−、ベータ−、ガンマ−およびオメガ−ペプチド類
モノ−、ジ−およびトリ−置換されたペプチド類
Ｌ−およびＤ−形態のペプチド類
シクロヘキサン−およびシクロペンタン−骨格の修飾されたベータ−ペプチド類
ビニル性ポリペプチド類
グリコポリペプチド類
ポリアミド類
ビニル性スルホンアミドペプチド
ポリスルホンアミド
コンジュゲートペプチド（すなわち、補欠分子基を有するペプチド）
ポリエステル類
多糖類
ポリカルバメート類
ポリカルボネート類
ポリウレア類
【０３５１】
ポリ−ペプチジルホスホネート類
アザチド類
ペプトイド類（オリゴＮ−置換グリシン）
ポリエーテル類
エトキシホルムアセタールオリゴマー類
ポリ−チオエーテル類
ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）
ポリエチレン類
ポリジスルフィド類
ポリアリレンスルフィド類
ポリヌクレオチド類
ＰＮＡ
ＬＮＡ
モルホリノ類
オリゴピロリノン
ポリオキシム類
ポリイミン類
ポリエチレンイミン
【０３５２】
ポリアセテート類
ポリスチレン類
ポリアセチレン
ポリビニル
脂質
リン脂質
糖脂質
ポリサイクル（脂肪族）
ポリサイクル（芳香族）
ポリへテロサイクル
プロテオグリカン
ポリシロキサン類
ポリイソシアニド類
ポリイソシアネート類
ポリメタクリレート類
一機能性、二機能性、三機能性およびオリゴ機能性開鎖炭化水素類
一機能性、二機能性、三機能性およびオリゴ機能性非芳香族炭素サイクル
【０３５３】
単環、二環、三環および多環式炭化水素類
架橋多環式炭化水素類
一機能性、二機能性、三機能性およびオリゴ機能性非芳香族へテロサイクル
単環、二環、三環および多環式へテロサイクル
架橋多環式へテロサイクル
一機能性、二機能性、三機能性およびオリゴ機能性芳香族炭素サイクル
単環、二環、三環および多環式芳香族炭素サイクル
一機能性、二機能性、三機能性およびオリゴ機能性芳香族へテロサイクル
単環、二環、三環および多環式芳香族へテロサイクル
キレート
フラーレン
上記した物質の組み合わせ
【０３５４】
該リストは、上記した一またはそれ以上の骨格構造を含有する、および／または同種のいくつかの結合（例えば、アミド結合）を含有する線状、分岐または環状構造物をいう。ヘテロポリマー（異なる型のポリマーのハイブリッド）もまた本発明により鋳型化されうる。
本発明に従って製造することのできるポリマー、ならびにそのポリマーの製造に必要な機能的部分／反応基を以下の表にて示す。関連する図面に言及する。
【０３５５】
【表１】
Figure 2004535193
【表２】
Figure 2004535193
【表３】
Figure 2004535193
【０３５６】
鋳型
一具体例において、鋳型化された分子は、一つのリンカーにより、または鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合する。もう一つの具体例において、鋳型化された分子をテンプレートする方法は、鋳型化された分子をテンプレートした鋳型または相補鋳型を解放し、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合していない鋳型化された分子を得るさらなる工程を含む。
【０３５７】
鋳型は好ましくは直線状配列においてｎ個のコード因子を含む。ｎ個のコード因子を含む鋳型は分岐していてもよい。ｎは好ましくは２〜２００であり、例えば２〜１００、例えば２〜８０、例えば２〜６０、例えば２〜４０、例えば２〜３０、例えば２〜２０、例えば２〜１５、例えば２〜１０、例えば２〜８、例えば２〜６、例えば２〜４、例えば２、例えば３〜１００、例えば３〜８０、例えば３〜６０、例えば３〜４０、例えば３〜３０、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１５、例えば３〜１０、例えば３〜８、例えば３〜６、例えば３〜４、例えば３、例えば４〜１００、例えば４〜８０、例えば４〜６０、例えば４〜４０、例えば４〜３０、例えば４〜２０、例えば４〜１５、例えば４〜１０、例えば４〜８、例えば４〜６、例えば４、例えば５〜１００、例えば５〜８０、例えば５〜６０、例えば５〜４０、例えば５ 〜３０、例えば５〜２０、例えば５〜１５、例えば５〜１０、例えば５〜８、例えば５〜６、例えば５、例えば６〜１００、例えば６〜８０、例えば６〜６０、例えば６〜４０、例えば６〜３０、例えば６〜２０、例えば６〜１５、例えば６〜１０、例えば６〜８、例えば６、例えば７〜１００、例えば７〜８０、例えば７〜６０、例えば７〜４０、例えば７〜３０、例えば７〜２０、例えば７〜１５、例えば７〜１０、例えば７〜８、例えば７、例えば８〜１００、例えば８〜８０、例えば８〜６０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、例えば８〜１５、例えば８〜１０、例えば８、例えば９、例えば１０〜１００、例えば１０〜８０、例えば１０〜６０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１０〜２０、例えば１０〜１５、例えば１０〜１２、例えば１０、例えば１２〜１００、例えば１２〜８０、例えば１２〜６０、例えば１２〜４０、例えば１２〜３０、例えば１２〜２０、例えば１２〜１５、例えば１４〜１００、例えば１４〜８０、例えば１４〜６０、例えば１４〜４０、例えば１４〜３０、例えば１４〜２０、例えば１４〜１６、例えば１６〜１００、例えば１６〜８０、例えば１６〜６０、例えば１６〜４０、例えば１６〜３０、例えば１６〜２０、例えば１８〜１００、例えば１８〜８０、例えば１８〜６０、例えば１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば１８〜２０、例えば２０〜１００、例えば２０〜８０、例えば２０〜６０、例えば２０〜４０、例えば２０〜３０、例えば２０〜２５、例えば２２〜１００、例えば２２〜８０、例えば２２〜６０、例えば２２〜４０、例えば２２〜３０、例えば２２〜２５、例えば２５〜１００、例えば２５〜８０、例えば２５〜６０、例えば２５〜４０、例えば２５〜３０、例えば３０〜１００、例えば３０〜８０、例えば３０〜６０、例えば３０〜４０、例えば３０〜３５、例えば３５〜１００、例えば３５〜８０、例えば３５〜６０、例えば３５〜４０、例えば４０〜１００、例えば４０〜８０、例えば４０〜６０、例えば４０〜５０、例えば４０〜４５、例えば４５〜１００、例えば４５〜８０、例えば４５〜６０、例えば４５〜５０、例えば５０〜１００、例えば５０〜８０、例えば５０〜６０、例えば５０〜５５、例えば６０〜１００、例えば６０〜８０、例えば６０〜７０、例えば７０〜１００、例えば７０〜９０、例えば７０〜８０、例えば８０〜１００、例えば８０〜９０、例えば９０〜１００である。
【０３５８】
本発明のいくつかの具体例において、鋳型は固体または半固体支持体に結合しているのが好ましい。
一具体例の鋳型は、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
もう一つの具体例において、コード因子の鋳型は、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらからなり、相補因子は、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
本発明の様々な具体例において、鋳型は次の特徴の１以上により特徴づけることができるのが好ましい：ｉ）鋳型は増幅可能である、ｉｉ）鋳型は一本鎖コード因子、好ましくは一本鎖相補因子を含む相補鋳型とのハイブリダイゼーションにより二重螺旋を形成できる一本鎖コード因子を含む、ｉｉｉ）鋳型はプライミング部位を含む。
【０３５９】
コード因子
各コード因子は好ましくは共有化学結合により隣接するコード因子と結合する。各コード因子はまた、共有二重結合によりそれぞれの隣接するコード因子とも結合できる。共有結合は好ましくは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される。さらに好ましくは、共有化学結合は、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合からなる共有結合の群から選択される。
好ましい具体例において、少なくとも一つのコード因子は固体または半固体支持体に結合している。
【０３６０】
コード因子は、本発明の一態様において、ヌクレオチド（その類似体または誘導体を包含する）、アミノ酸、抗体、および抗原からなる群から選択され、好ましくは、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、およびヌクレオチド類似体（その組み合わせを包含する）から選択される。もう一つの具体例において、コード因子は、ヌクレオチド（アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸、およびアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸などのヌクレオチドを包含する）からなる群から選択される。さらに、この場合において、各ヌクレオチドは共有結合により隣接するヌクレオチドと結合できるか、または共有結合によりそれぞれの隣接するヌクレオチドと結合する。共有結合は好ましくはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合である。
【０３６１】
他の具体例において、コード因子は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群から選択される天然および非天然のヌクレオチドである。
【０３６２】
コード因子および対応する相補因子
コード因子が好ましくは、塩基部分および／またはホスフェート部分および／またはリボースまたはデオキシリボース部分の１以上が別の分子により置換されているヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチド類似体からなる群から選択される場合、対応する相補因子は、前記コード因子と相互作用でき、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。各ヌクレオチドは共有化学結合により隣接するヌクレオチドと結合するか、または共有化学結合によりそれぞれの隣接するヌクレオチドと結合する。共有化学結合は、好ましくは、ホスホジエステル結合およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される。
【０３６３】
コード因子サブユニット
一態様におけるコード因子は、好ましくは、１〜１００サブユニット、例えば１〜８０サブユニット、例えば１〜６０サブユニット、例えば１〜４０サブユニット、例えば１〜２０サブユニット、例えば１〜１８サブユニット、例えば１〜１６サブユニット、例えば１〜１４サブユニット、例えば １〜１２サブユニット、例えば１〜１０サブユニット、例えば１〜９サブユニット、例えば１〜８サブユニット、例えば１〜７サブユニット、例えば１〜６サブユニット、例えば１〜５サブユニット、例えば１〜４サブユニット、例えば１〜３サブユニット、例えば１〜２サブユニット、例えば１サブユニット、例えば２〜１００サブユニット、例えば２〜８０サブユニット、例えば２〜６０サブユニット、例えば２〜４０サブユニット、例えば２〜２０サブユニット、例えば２〜１８サブユニット、例えば２〜１６サブユニット、例えば２〜１４サブユニット、例えば２〜１２サブユニット、例えば２〜１０サブユニット、例えば２〜９サブユニット、例えば２〜８サブユニット、例えば２〜７サブユニット、例えば２〜６サブユニット、例えば２〜５サブユニット、例えば２〜４サブユニット、例えば２〜３サブユニット、例えば２サブユニット、例えば３〜１００サブユニット、例えば３〜８０サブユニット、例えば３〜６０サブユニット、例えば３〜４０サブユニット、例えば３〜２０サブユニット、例えば３〜１８サブユニット、例えば３〜１６サブユニット、例えば３〜１４サブユニット、例えば３〜１２サブユニット、例えば３〜１０サブユニット、例えば３〜９サブユニット、例えば３〜８サブユニット、例えば３〜７サブユニット、例えば３〜６サブユニット、例えば３〜５サブユニット、例えば３〜４サブユニット、例えば３サブユニット、例えば４〜１００サブユニット、例えば４〜８０サブユニット、例えば４〜６０サブユニット、例えば４〜４０サブユニット、例えば４〜２０サブユニット、例えば４〜１８サブユニット、例えば４〜１６サブユニット、例えば４〜１４サブユニット、例えば４〜１２サブユニット、例えば４〜１０サブユニット、例えば４〜９サブユニット、例えば４〜８サブユニット、例えば４〜７サブユニット、例えば４〜６サブユニット、例えば４〜５サブユニット、例えば４サブユニット、例えば５〜１００サブユニット、例えば５〜８０サブユニット、例えば５〜６０サブユニット、例えば５〜４０サブユニット、例えば５〜２０サブユニット、例えば５〜１８サブユニット、例えば５〜１６サブユニット、例えば５〜１４サブユニット、例えば５〜１２サブユニット、例えば５〜１０サブユニット、例えば５〜９サブユニット、例えば５〜８サブユニット、例えば５〜７サブユニット、例えば５〜６サブユニット、例えば５サブユニット、例えば６〜１００サブユニット、例えば６〜８０サブユニット、例えば６〜６０サブユニット、例えば６〜４０サブユニット、例えば６〜２０サブユニット、例えば６〜１８サブユニット、例えば６〜１６サブユニット、例えば６〜１４サブユニット、例えば６〜１２サブユニット、例えば６〜１０サブユニット、例えば６〜９サブユニット、例えば６〜８サブユニット、例えば６〜７サブユニット、例えば６サブユニット、例えば７〜１００サブユニット、例えば７〜８０サブユニット、例えば７〜６０サブユニット、例えば７〜４０サブユニット、例えば７〜２０サブユニット、例えば７〜１８サブユニット、例えば７〜１６サブユニット、例えば７〜１４サブユニット、例えば７〜１２サブユニット、例えば７〜１０サブユニット、例えば７〜９サブユニット、例えば７〜８サブユニット、例えば７サブユニット、例えば８〜１００サブユニット、例えば８〜８０サブユニット、例えば８〜６０サブユニット、例えば８〜４０サブユニット、例えば８〜２０サブユニット、例えば８〜１８サブユニット、例えば８〜１６サブユニット、例えば８〜１４サブユニット、例えば８〜１２サブユニット、例えば８〜１０サブユニット、例えば８〜９サブユニット、例えば８サブユニット、例えば９〜１００サブユニット、例えば９〜８０サブユニット、例えば９〜６０サブユニット、例えば９〜４０サブユニット、例えば９〜２０サブユニット、例えば９〜１８サブユニット、例えば９〜１６サブユニット、例えば９〜１４サブユニット、例えば９〜１２サブユニット、例えば９〜１０サブユニット、例えば９サブユニット、例えば１０〜１００サブユニット、例えば１０〜８０サブユニット、例えば１０〜６０サブユニット、例えば１０〜４０サブユニット、例えば１０〜２０サブユニット、例えば１０〜１８サブユニット、例えば１０〜１６サブユニット、例えば１０〜１４サブユニット、例えば１０〜１２サブユニット、例えば１０サブユニット、例えば１１〜１００サブユニット、例えば１１〜８０サブユニット、例えば１１〜６０サブユニット、例えば１１〜４０サブユニット、例えば１１〜２０サブユニット、例えば１１〜１８サブユニット、例えば１１〜１６サブユニット、例えば１１〜１４サブユニット、例えば１１〜１２サブユニット、例えば１２〜１００サブユニット、例えば１２〜８０サブユニット、例えば１２〜６０サブユニット、例えば１２〜４０サブユニット、例えば１２〜２０サブユニット、例えば１２〜１８サブユニット、例えば１２〜１６サブユニット、例えば１２〜１４サブユニット、例えば１３〜１００サブユニット、例えば１３〜８０サブユニット、例えば１３〜６０サブユニット、例えば１３〜４０サブユニット、例えば１３〜２０サブユニット、例えば１３〜１８サブユニット、例えば１３〜１６サブユニット、例えば１３〜１４サブユニット、例えば１４〜１００サブユニット、例えば１４〜８０サブユニット、例えば１４〜６０サブユニット、例えば１４〜４０サブユニット、例えば１４〜２０サブユニット、例えば１４〜１８サブユニット、例えば１４〜１６サブユニット、例えば１５〜１００サブユニット、例えば１５〜８０サブユニット、例えば１５〜６０サブユニット、例えば１５〜４０サブユニット、例えば１５〜２０サブユニット、例えば１５〜１８サブユニット、例えば１５〜１６サブユニット、例えば１６〜１００サブユニット、例えば１６〜８０サブユニット、例えば１６〜６０サブユニット、例えば１６〜４０サブユニット、例えば１６〜２０サブユニット、例えば１６〜１８サブユニット、例えば１７〜１００サブユニット、例えば１７〜８０サブユニット、例えば１７〜６０サブユニット、例えば１７〜４０サブユニット、例えば１７〜２０サブユニット、例えば１７〜１８サブユニット、例えば１８〜１００サブユニット、例えば１８〜８０サブユニット、例えば１８〜６０サブユニット、例えば１８〜４０サブユニット、例えば１８〜２０サブユニット、例えば１９〜１００サブユニット、例えば１９〜８０サブユニット、例えば１９〜６０サブユニット、例えば１９〜４０サブユニット、例えば１９〜３０サブユニット、例えば１９〜２５サブユニット、例えば２０〜１００サブユニット、例えば２０〜８０サブユニット、例えば２０〜６０サブユニット、例えば２０〜４０サブユニット、例えば２０〜３０サブユニット、例えば２０〜２５サブユニットを含むか、または本質的にこれらから構成される。
【０３６４】
好ましい具体例において、各コード因子サブユニットは、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含むかまたは本質的にこれらから構成される。ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸であるか、またはアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸であり得る。各ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体と共有結合により結合するか、または共有結合（ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる群から選択される共有結合を包含する）によりそれぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体と結合する。
一具体例において、前記ヌクレオチドの少なくともいくつかは、デオキシリボ核酸誘導体およびリボ核酸誘導体を含むヌクレオチド誘導体からなる群から選択される。
【０３６５】
コード因子サブユニットおよび対応する相補因子サブユニット
コード因子サブユニットは好ましくは、１以上の塩基部分および／またはホスフェート部分および／またはリボース部分および／またはデオキシリボース部分が別の分子により置換されているヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチド類似体から選択なる群から選択され、前記コード因子サブユニットと相互作用できる対応する相補因子サブユニットは、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
各ヌクレオチド誘導体は、共有化学結合により隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体と結合できるか、または各ヌクレオチド誘導体は共有化学結合によりそれぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体と結合することができる。共有化学結合は、好ましくは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される。
【０３６６】
相補因子
一態様における相補鋳型は、好ましくは、直鎖配列または分岐鎖配列においてｎ個の相補因子を含む。ｎは、好ましくは、２〜２００、例えば２〜１００、例えば２〜８０、例えば２〜６０、例えば２〜４０、例えば２〜３０、例えば２〜２０、例えば２〜１５、例えば２〜１０、例えば２〜８、例えば２〜６、例えば２〜４、例えば２、例えば３〜１００、例えば３〜８０、例えば３〜６０、例えば３〜４０、例えば３〜３０、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１５、例えば３〜１０、例えば３〜８、例えば３〜６、例えば３〜４、例えば３、例えば４〜１００、例えば４〜８０、例えば４〜６０、例えば４〜４０、例えば４〜３０、例えば４〜２０、例えば４〜１５、例えば４〜１０、例えば４〜８、例えば４〜６、例えば４、例えば５〜１００、例えば５〜８０、例えば５〜６０、例えば５〜４０、例えば５〜３０、例えば５〜２０、例えば５〜１５、例えば５〜１０、例えば５〜８、例えば５〜６、例えば５、例えば６〜１００、例えば６〜８０、例えば６〜６０、例えば６〜４０、例えば６〜３０、例えば６〜２０、例えば６〜１５、例えば６〜１０、例えば６〜８、例えば６、例えば７〜１００、例えば７〜８０、例えば７〜６０、例えば７〜４０、例えば７〜３０、例えば７〜２０、例えば７〜１５、例えば７〜１０、例えば７〜８、例えば７、例えば８〜１００、例えば８〜８０、例えば８〜６０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、例えば８〜１５、例えば８〜１０、例えば８、例えば９、例えば１０〜１００、例えば１０〜８０、例えば１０〜６０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１０〜２０、例えば１０〜１５、例えば１０〜１２、例えば１０、例えば１２〜１００、例えば１２〜８０、例えば１２〜６０、例えば１２〜４０、例えば１２〜３０、例えば１２〜２０、例えば１２〜１５、例えば１４〜１００、例えば１４〜８０、例えば１４〜６０、例えば１４〜４０、例えば１４〜３０、例えば１４〜２０、例えば１４〜１６、例えば１６〜１００、例えば１６〜８０、例えば１６〜６０、例えば１６〜４０、例えば１６〜３０、例えば１６〜２０、例えば１８〜１００、例えば１８〜８０、例えば１８〜６０、例えば１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば１８〜２０、例えば２０〜１００、例えば２０〜８０、例えば２０〜６０、例えば２０〜４０、例えば２０〜３０、例えば２０〜２５、例えば２２〜１００、例えば２２〜８０、例えば２２〜６０、例えば２２〜４０、例えば２２〜３０、例えば２２〜２５、例えば２５〜１００、例えば２５〜８０、例えば２５〜６０、例えば２５〜４０、例えば２５〜３０、例えば３０〜１００、例えば３０〜８０、例えば３０〜６０、例えば３０〜４０、例えば３０〜３５、例えば３５〜１００、例えば３５〜８０、例えば３５〜６０、例えば３５〜４０、例えば４０〜１００、例えば４０〜８０、例えば４０〜６０、例えば４０〜５０、例えば４０〜４５、例えば４５〜１００、例えば４５〜８０、例えば４５〜６０、例えば４５〜５０、例えば５０〜１００、例えば５０〜８０、例えば５０〜６０、例えば５０〜５５、例えば６０〜１００、例えば６０〜８０、例えば６０〜７０、例えば７０〜１００、例えば７０〜９０、例えば７０〜８０、例えば８０〜１００、例えば８０〜９０、例えば９０〜１００である。
【０３６７】
いくつかの具体例において、相補鋳型は、固体または半固体支持体と結合している。
一具体例における相補鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
他の具体例において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれからなる相補鋳型が提供され、ここにおいて、鋳型の対応するコード因子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
【０３６８】
相補鋳型は好ましくは増幅可能である、および／または一本鎖相補因子を含む、および／または一本鎖コード因子を含む鋳型とハイブリッド形成することにより二重螺旋を形成できる相補因子の一本鎖を含む、および／またはプライミング部位を含む。
各相補因子は、好ましくは共有化学結合により隣接する相補因子と結合するか、または各相補因子は共有化学結合によりそれぞれの隣接する相補因子と結合する。共有化学結合は、一具体例において、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される。他の具体例において、共有結合の群は、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合からなる。
【０３６９】
少なくとも一つの相補因子は固体または半固体支持体に結合できる。
相補因子は、ヌクレオチド（その任意の類似体または誘導体を包含する）、アミノ酸、抗体、および抗原からなる群から選択でき、好ましくは、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、およびヌクレオチド類似体（その任意の組み合わせを包含する）からなる群から選択される。一具体例において、相補因子は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸、およびアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸を包含するヌクレオチドからなる群から選択されるのが好ましい。
【０３７０】
各ヌクレオチドは、共有結合により、隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と結合できるか、または各ヌクレオチドは、共有結合により、それぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体と結合できる。共有結合は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合であり得る。
もう一つの具体例において、相補因子は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸からなる群から選択される天然または非天然ヌクレオチドである。
【０３７１】
相補因子および対応するコード因子
相補因子が、１以上の塩基部分および／またはホスフェート部分および／またはリボースおよび／またはデオキシリボース部分が別の分子により置換されているヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチド類似体からなる群から選択される場合、前記相補因子と相互作用できるコード因子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
各ヌクレオチドは、共有化学結合により隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と結合できるか、または共有化学結合によりそれぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と結合できる。共有化学結合は、好ましくは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される。
【０３７２】
相補因子は一具体例においてヌクレオチドから選択され、相補因子は好ましい具体例において、鋳型依存性ＤＮＡ−およびＲＮＡ−ポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）、ＤＮＡ−リガーゼおよびＲＮＡ−リガーゼ、リボザイムおよびデオキシリボザイム（ＨＩＶ−１逆転写酵素を含む）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ６３９Ｆ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント）、ＤＮＡ−リガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、イー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、ｒＴｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｅ ＤＮＡポリメラーゼ、およびリガーゼまたはレプリカーゼ活性を有するリボザイムからなる群から選択される酵素を用いることにより酵素的に結合させることができる。
【０３７３】
さらに好ましくは、酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ６３９Ｆ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントを含む）、ＤＮＡ−リガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼからなる群から選択される。ヌクレオチドは組み込まれると好ましくは鋳型または相補鋳型を形成する。
もう一つの具体例において、相補因子はクレオチドから選択でき、化学試薬、ｐＨ変化、光、触媒、照射、例えば電磁放射を使用することにより、あるいは互いに反応するように接触させられた場合に自発的にカップリングすることにより結合できる。
【０３７４】
相補因子サブユニット
相補因子は好ましくは、１〜１００サブユニット、例えば１〜８０サブユニット、例えば１〜６０サブユニット、例えば１〜４０サブユニット、例えば１〜２０サブユニット、例えば１〜１８サブユニット、例えば１〜１６サブユニット、例えば１〜１４サブユニット、例えば１〜１２サブユニット、例えば１〜１０サブユニット、例えば１〜９サブユニット、例えば１〜８サブユニット、例えば１〜７サブユニット、例えば１〜６サブユニット、例えば１〜５サブユニット、例えば１〜４サブユニット、例えば１〜３サブユニット、例えば１〜２サブユニット、例えば１サブユニット、例えば２〜１００サブユニット、例えば２〜８０サブユニット、例えば２〜６０サブユニット、例えば２〜４０サブユニット、例えば２〜２０サブユニット、例えば２〜１８サブユニット、例えば２〜１６サブユニット、例えば２〜１４サブユニット、例えば２〜１２サブユニット、例えば２〜１０サブユニット、例えば２〜９サブユニット、例えば２〜８サブユニット、例えば２〜７サブユニット、例えば２〜６サブユニット、例えば２〜５サブユニット、例えば２〜４サブユニット、例えば２〜３サブユニット、例えば２サブユニット、例えば３〜１００サブユニット、例えば３〜８０サブユニット、例えば３〜６０サブユニット、例えば３〜４０サブユニット、例えば３〜２０サブユニット、例えば３〜１８サブユニット、例えば３〜１６サブユニット、例えば３〜１４サブユニット、例えば３〜１２サブユニット、例えば３〜１０サブユニット、例えば３〜９サブユニット、例えば３〜８サブユニット、例えば３〜７サブユニット、例えば３〜６サブユニット、例えば３〜５サブユニット、例えば３〜４サブユニット、例えば３サブユニット、例えば４〜１００サブユニット、例えば４〜８０サブユニット、例えば４〜６０サブユニット、例えば４〜４０サブユニット、例えば４〜２０サブユニット、例えば４〜１８サブユニット、例えば４〜１６サブユニット、例えば４〜１４サブユニット、例えば４〜１２サブユニット、例えば４〜１０サブユニット、例えば４〜９サブユニット、例えば４〜８サブユニット、例えば４〜７サブユニット、例えば４〜６サブユニット、例えば４〜５サブユニット、例えば４サブユニット、例えば５〜１００サブユニット、例えば５〜８０サブユニット、例えば５〜６０サブユニット、例えば５〜４０サブユニット、例えば５〜２０サブユニット、例えば５〜１８サブユニット、例えば５〜１６サブユニット、例えば５〜１４サブユニット、例えば５〜１２サブユニット、例えば５〜１０サブユニット、例えば５〜９サブユニット、例えば５〜８サブユニット、例えば５〜７サブユニット、例えば５〜６サブユニット、例えば５サブユニット、例えば６〜１００サブユニット、例えば６〜８０サブユニット、例えば６〜６０サブユニット、例えば６〜４０サブユニット、例えば６〜２０サブユニット、例えば６〜１８サブユニット、例えば６〜１６サブユニット、例えば６〜１４サブユニット、例えば６〜１２サブユニット、例えば６〜１０サブユニット、例えば６〜９サブユニット、例えば６〜８サブユニット、例えば６〜７サブユニット、例えば６サブユニット、例えば７〜１００サブユニット、例えば７〜８０サブユニット、例えば７〜６０サブユニット、例えば７〜４０サブユニット、例えば７〜２０サブユニット、例えば７〜１８サブユニット、例えば７〜１６サブユニット、例えば７〜１４サブユニット、例えば７〜１２サブユニット、例えば７〜１０サブユニット、例えば７〜９サブユニット、例えば７〜８サブユニット、例えば７サブユニット、例えば８〜１００サブユニット、例えば８〜８０サブユニット、例えば８〜６０サブユニット、例えば８〜４０サブユニット、例えば８〜２０サブユニット、例えば８〜１８サブユニット、例えば８〜１６サブユニット、例えば８〜１４サブユニット、例えば８〜１２サブユニット、例えば８〜１０サブユニット、例えば８〜９サブユニット、例えば８サブユニット、例えば９〜１００サブユニット、例えば９〜８０サブユニット、例えば９〜６０サブユニット、例えば９〜４０サブユニット、例えば９〜２０サブユニット、例えば９〜１８サブユニット、例えば９〜１６サブユニット、例えば９〜１４サブユニット、例えば９〜１２サブユニット、例えば９〜１０サブユニット、例えば９サブユニット、例えば１０〜１００サブユニット、例えば１０〜８０サブユニット、例えば１０〜６０サブユニット、例えば１０〜４０サブユニット、例えば１０〜２０サブユニット、例えば１０〜１８サブユニット、例えば１０〜１６サブユニット、例えば１０〜１４サブユニット、例えば１０〜１２サブユニット、例えば１０サブユニット、例えば１１〜１００サブユニット、例えば１１〜８０サブユニット、例えば１１〜６０サブユニット、例えば１１〜４０サブユニット、例えば１１〜２０サブユニット、例えば１１〜１８サブユニット、例えば１１〜１６サブユニット、例えば１１〜１４サブユニット、例えば１１〜１２サブユニット、例えば１２〜１００サブユニット、例えば１２〜８０サブユニット、例えば１２〜６０サブユニット、例えば１２〜４０サブユニット、例えば１２〜２０サブユニット、例えば１２〜１８サブユニット、例えば１２〜１６サブユニット、例えば１２〜１４サブユニット、例えば１３〜１００サブユニット、例えば１３〜８０サブユニット、例えば１３〜６０サブユニット、例えば１３〜４０サブユニット、例えば１３〜２０サブユニット、例えば１３〜１８サブユニット、例えば１３〜１６サブユニット、例えば１３〜１４サブユニット、例えば１４〜１００サブユニット、例えば１４〜８０サブユニット、例えば１４〜６０サブユニット、例えば１４〜４０サブユニット、例えば１４〜２０サブユニット、例えば１４〜１８サブユニット、例えば１４〜１６サブユニット、例えば１５〜１００サブユニット、例えば１５〜８０サブユニット、例えば１５〜６０サブユニット、例えば１５〜４０サブユニット、例えば１５〜２０サブユニット、例えば１５〜１８サブユニット、例えば１５〜１６サブユニット、例えば１６〜１００サブユニット、例えば１６〜８０サブユニット、例えば１６〜６０サブユニット、例えば１６〜４０サブユニット、例えば１６〜２０サブユニット、例えば１６〜１８サブユニット、例えば１７〜１００サブユニット、例えば１７〜８０サブユニット、例えば１７〜６０サブユニット、例えば１７〜４０サブユニット、例えば１７〜２０サブユニット、例えば１７〜１８サブユニット、例えば１８〜１００サブユニット、例えば１８〜８０サブユニット、例えば１８〜６０サブユニット、例えば１８〜４０サブユニット、例えば１８〜２０サブユニット、例えば１９〜１００サブユニット、例えば１９〜８０サブユニット、例えば１９〜６０サブユニット、例えば１９〜４０サブユニット、例えば１９〜３０サブユニット、例えば１９〜２５サブユニット、例えば２０〜１００サブユニット、例えば２０〜８０サブユニット、例えば２０〜６０サブユニット、例えば２０〜４０サブユニット、例えば２０〜３０サブユニット、例えば２０〜２５サブユニットを含むか、または本質的にこれらから構成される。
【０３７５】
好ましい具体例において、各サブユニットは、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含むか、または本質的にこれらから構成される。ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸、またはアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸であり得る。
前記ヌクレオチドのそれぞれは隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と、共有結合により結合できるか、またはそれぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と共有結合により結合できる。共有結合は好ましくは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる群から選択される。
一具体例において、前記ヌクレオチドの少なくともいくつかは、デオキシリボ核酸誘導体およびリボ核酸誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド誘導体を包含するヌクレオチド誘導体からなる群から選択される。
【０３７６】
相補因子サブユニットおよび対応するコード因子サブユニット
相補因子サブユニットが、１以上の塩基部分および／またはホスフェート部分および／またはリボース部分および／またはデオキシリボース部分が別の分子により置換されているヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、およびヌクレオチド類似体からなる群から選択される場合、前記相補因子サブユニットと相互作用できるコード因子サブユニットは、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（その任意の類似体または誘導体を包含する）からなる群から選択されるヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらから構成される。
各ヌクレオチド誘導体が隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体と共有化学結合により結合するか、またはそれぞれの隣接するヌクレオチド、またはヌクレオチドと共有化学結合により結合するのが好ましい。共有化学結合は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択できる。
【０３７７】
ビルディングブロック、切断可能なリンカーおよび選択的に切断可能なリンカー
一態様において、
ｉ）認識基を有するコード因子を特異的に認識できる相補因子（ヌクレオチド、アミノ酸、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、およびヌクレオチド認識能力を有する分子から選択される）、
ｉｉ）α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、一置換−、二置換および三置換α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形またはＤ−形であるペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば配合団を含む複合ペプチド、ポリエステル、ポリサッカライド、ポリカーバメート、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリチオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリーレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族環を含む多環式化合物（多複素環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサンの前駆体から選択される少なくとも一つの機能的部分、および
ｉｉｉ）機能的部分を相補因子から分離するリンカーまたは選択的に可能なリンカーを含むビルディングブロックが提供される。
【０３７８】
ビルディングブロックの相補因子は、ヌクレオチド配列、例えば１〜８ヌクレオチド、例えば１〜６ヌクレオチド、例えば１〜４ヌクレオチド、例えば１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドまたは例えば３ヌクレオチドの配列から選択される。
機能的部分は、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、二置換アミノ酸、多置換アミノ酸、ビニル性アミノ酸、Ｎ−置換グリシン誘導体および他の修飾されたアミノ酸から選択されるアミノ酸の前駆体から選択できる。
本発明において定義されるようなビルディングブロックの組成物も提供され、該組成物の少なくとも２つのビルディングブロックは異なる。
複数のビルディングブロックの少なくとも１つのサブセットは、１つの相補因子 および１つの機能的部分および１つのリンカーを含む。
【０３７９】
一具体例において、各ビルディングブロックは、少なくとも一つのＩ型反応基および／または少なくとも一つのＩＩ型反応基（１つのＩ型反応基、２つのＩ型反応基、１つのＩＩ型反応基、および２つのＩＩ型反応基を含む）を含む。
機能的部分の前記ＩＩ型反応基の少なくとも一つは、好ましくは、Ｎ−カルボキシアンヒドリド（ＮＣＡ）、Ｎ−チオカルボキシアンヒドリド（ＮＴＡ）、アミン、カルボン酸、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、エステル、チオエステル、二重結合の任意の共役系、ヒドラジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびエポキシドからなる群から選択される。
いくつかの具体例において、ＩＩ型反応基は、求電子性、求核性、またはラジカルである。
【０３８０】
前記の複数のビルディングブロックの少なくとも一つのサブセットは、機能的部分を相補因子から分離する選択的に切断可能なリンカーを含み、前記の選択的に切断可能なリンカーは、選択的に切断可能なリンカーを含むビルディングブロックのサブセットに属さないビルディングブロックの相補因子から機能的部分を分離する切断可能なリンカーが切断されるような条件下では切断されない。ビルディングブロックの切断可能なリンカーは、鋳型化された分子を相補鋳型、または相補因子と結合させる少なくとも一つの切断可能なリンカーを切断させるか、または前記鋳型分子を鋳型因子、または鋳型分子の合成をテンプレートした鋳型と結合させることなく切断される。
リンカーおよび選択的に切断可能なリンカーは、切断可能なリンカーの切断の結果、これが望ましい場合を除いては選択的に切断可能なリンカーの切断が起こるという条件で、例えば、酸、塩基、化学試薬、光、電磁放射、酵素、または触媒により切断させることができる。
【０３８１】
一具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約０．８Å〜約７０Åの範囲、例えば０．８Å〜約６０Åの範囲、例えば０．８Å〜約５０Åの範囲、例えば０．８Å〜約４０Åの範囲、例えば０．８Å〜約３０Åの範囲、例えば０．８Å〜約２５Åの範囲、例えば０．８Å〜約２０Åの範囲、例えば０．８Å〜約１８Å、例えば０．８Å〜約１６Åの範囲、例えば０．８Å〜約１４Åの範囲、例えば０．８Å〜約１２の範囲、例えば０．８Å〜約１０Åの範囲、例えば０．８Å〜約８Åの範囲、例えば０．８Å〜約７Åの範囲、例えば０．８Å〜約６Åの範囲、例えば０．８Å〜約５Åの範囲、例えば０．８Å〜約４Åの範囲、例えば０．８Å〜約３．５Åの範囲、例えば０．８Å〜約３．０Åの範囲、例えば０．８Å〜約２．５Åの範囲、例えば０．８Å〜約２．０Åの範囲、例えば０．８Å〜約１．５Åの範囲、例えば０．８Å〜約１．０Åの範囲である。
【０３８２】
もう一つの具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約１Å〜約６０Åの範囲（例えば１Å〜約４０Åの範囲）、例えば１Å〜約３０Åの範囲（例えば１Å〜約２５Åの範囲）、例えば１Å〜約２０Åの範囲（例えば１Å〜約１８Åの範囲）、例えば１Å〜約１６Åの範囲（例えば１Å〜約１４Åの範囲）、例えば１Å〜約１２Åの範囲（例えば１Å〜約１０Åの範囲）、例えば１Å〜約８Åの範囲（例えば１Å〜約７Åの範囲）、例えば１Å〜約６Åの範囲（例えば１Å〜約５Åの範囲）、例えば１Å〜約４Åの範囲（例えば１．０Å〜約３．５Åの範囲）、例えば１．０Å〜約３．０Åの範囲（例えば１．０Å〜約２．５Åの範囲）、例えば１．０Å〜約２．０Åの範囲（例えば１．０Å〜約１．５Åの範囲）、例えば１．０Å〜約１．２Åの範囲である。
さらにもう一つの具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約２Å〜約４０Åの範囲（例えば２Å〜約３０Åの範囲、例えば２Å〜約２５Åの範囲）、例えば２Å〜約２０Åの範囲（例えば２Å〜約１８Åの範囲）、例えば２Å〜約１６Åの範囲（例えば２Å〜約１４Åの範囲）、例えば２Å〜約１２Åの範囲（例えば２Å〜約１０Åの範囲）、例えば２Å〜約８Åの範囲（例えば２Å〜約７Åの範囲）、例えば２Å〜約６Åの範囲（例えば２Å〜約５Åの範囲）、例えば２Å〜約４Åの範囲（例えば２．０Å〜約３．５Åの範囲）、例えば２．０Å〜約３．０Åの範囲（例えば２．０Å〜約２．５Åの範囲）、例えば２．０Å〜約２．２Åの範囲である。
【０３８３】
さらにもう一つの具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約４Å〜約４０Åの範囲（例えば４Å〜約３０Åの範囲、例えば４Å〜約２５Åの範囲）、例えば４Å〜約２０Åの範囲（例えば４Å〜約１８Åの範囲）、例えば４Å〜約１６Åの範囲（例えば４Å〜約１４Åの範囲）、例えば４Å〜約１２Åの範囲（例えば４Å〜約１０Åの範囲）、例えば４Å〜約８Åの範囲（例えば４Å〜約７Åの範囲）、例えば４Å〜約６Åの範囲（例えば４Å〜約５Åの範囲）である。
さらにもう一つの具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約６Å〜約４０Åの範囲（例えば６Å〜約３０Åの範囲、例えば６Å〜約２５Åの範囲）、例えば６Å〜約２０Åの範囲（例えば６Å〜約１８Åの範囲）、例えば６Å〜約１６Åの範囲（例えば６Å〜約１４Åの範囲）、例えば６Å〜約１２Åの範囲（例えば６Å〜約１０Åの範囲）、例えば６Å〜約８Åの範囲（例えば６Å〜約７Åの範囲）である。
さらにもう一つの具体例において、リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さは、約８Å〜約４０Åの範囲（例えば８Å〜約３０Åの範囲、例えば８Å〜約２５Åの範囲）、例えば８Å〜約２０Åの範囲（例えば８Å〜約１８Åの範囲）、例えば８Å〜約１６Åの範囲（例えば８Å〜約１４Åの範囲）、例えば８Å〜約１２Åの範囲（例えば８Å〜約１０Åの範囲）である。
【０３８４】
鋳型化された分子
鋳型化された分子は、鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型と結合することができるか、または結合できない。
一具体例において、本発明は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ω−アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸を含むか、または本質的にこれらから構成される。
様々な好ましい具体例において、鋳型化された分子は、α−アミノ酸、一置換α−アミノ酸、二置換α−アミノ酸、一置換β−アミノ酸、二置換β−アミノ酸、または三置換β−アミノ酸、四置換β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ω−アミノ酸、ビニル性アミノ酸、およびＮ−置換グリシンの１以上の天然のアミノ酸残基を含むか、または本質的にこれらから構成される。
β−アミノ酸を含む前記の鋳型化された分子は、好ましくはシクロヘキサン主鎖および／またはシクロペンタン主鎖を含むか、または本質的にこれらから構成される主鎖構造を有する。
【０３８５】
他の具体例において、鋳型化された分子は、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、一置換、二置換および三置換α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形またはＤ−形であるペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば配合団を含む複合ペプチド、ポリエステル、ポリサッカライド、ポリカーバメート、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリチオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリーレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリジン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば、多複素環式化合物を包含する脂肪族または芳香族環を含む多環式化合物、プロテオグリカン、およびポリシロキサン（その任意の組み合わせを包含する）の群から選択される分子または分子要素を含むか、または本質的にこれらから構成される。
【０３８６】
本発明の鋳型化された分子の隣接する残基は、ペプチド結合、スルホンアミド結合、エステル結合、サッカライド結合、カーバメート結合、カーボネート結合、尿素結合、ホスホネート結合、ウレタン結合、アザチド結合、ペプトイド結合、エーテル結合、エトキシ結合、チオエーテル結合、炭素一重結合、炭素二重結合、炭素三重結合、ジスルフィド結合、スルフィド結合、ホスホジエステル結合、オキシム結合、イミン結合、イミド結合（その任意の組み合わせを包含する）からなる化学結合の群から選択される化学結合により結合させることができる。
【０３８７】
さらに、本発明の鋳型化された分子の主鎖構造は、一態様において、−ＮＨＮ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＢ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＣ（ＲＲ’）ＣＯ−；−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ）ＣＯ−；−ＮＨＣ６Ｈ４ＣＯ−；−ＮＨＣＨ２ＣＨＲＣＯ−；−ＮＨＣＨＲＣＨ２ＣＯ−；−ＣＯＣＨ２−；−ＣＯＳ−；−ＣＯＮＲ−；−ＣＯＯ−；−ＣＳＮＨ−；−ＣＨ２ＮＨ−；−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２Ｓ−；−ＣＨ２ＳＯ−；−ＣＨ２ＳＯ２−；−ＣＨ（ＣＨ３）Ｓ−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＮＨＣＯ−；−ＮＨＣＯＮＨ−；−ＣＯＮＨＯ−；−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−；−ＰＯ２ −ＮＨ−；−ＰＯ２ −ＣＨ２−；−ＰＯ２ −ＣＨ２Ｎ＋−；−ＳＯ２ＮＨ−−；およびラクタム（その任意の組み合わせを包含する）から選択される分子群を含むか、または本質的にこれらから構成される。
【０３８８】
本発明の他の態様において、鋳型化された分子はポリマー特性を有するものではない。
前駆体は、一具体例において、好ましくは、α−アミノ酸前駆体、β−アミノ酸前駆体、γ−アミノ酸前駆体、およびω−アミノ酸前区外からなる前駆体の群から選択される。
いくつかの具体例において、鋳型化された分子は、鋳型化された分子において少なくとも２回繰り返す少なくとも３つの官能基などの、官能基の少なくとも一つの繰り返し配列を含むオリゴマーまたはポリマーである。鋳型化された分子はさらに、少なくとも３つの官能基の配列が１回だけ生じる分子を含む。
【０３８９】
いくつかの好ましい鋳型化された分子は、好ましくは少なくとも２の異なる機能的部分（例えば少なくとも３の異なる官能基）、例えば、少なくとも４の異なる官能基（例えば少なくとも５の異なる官能基）、例えば少なくとも６の異なる官能基（例えば少なくとも７の異なる官能基）、例えば少なくとも８の異なる官能基（例えば少なくとも９の異なる官能基）、例えば少なくとも１０の異なる官能基（例えば１０より多くの異なる官能基）を含むか、または本質的にこれらから構成される。官能基は同一であってもよい。
本発明の好ましい一態様において、それぞれが少なくとも１つの残基を含む複数の共有結合した官能基を含むポリマーを含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、複数の残基は、好ましくは２〜２００、例えば２〜１００、例えば２〜８０、例えば２〜６０、例えば２〜４０、例えば２〜３０、例えば２〜２０、例えば２〜１５、例えば２〜１０、例えば２〜８、例えば２〜６、例えば２〜４、例えば２、例えば３〜１００、例えば３〜８０、例えば３〜６０、例えば３〜４０、例えば３〜３０、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１５、例えば３〜１０、例えば３〜８、例えば３〜６、例えば３〜４、例えば３、例えば４〜１００、例えば４〜８０、例えば４〜６０、例えば４〜４０、例えば４〜３０、例えば４〜２０、例えば４〜１５、例えば４〜１０、例えば４〜８、例えば４〜６、例えば４、例えば５〜１００、例えば５〜８０、例えば５〜６０、例えば５〜４０、例えば５〜３０、例えば５〜２０、例えば５〜１５、例えば５〜１０、例えば５〜８、例えば５〜６、例えば５、例えば６〜１００、例えば６〜８０、例えば６〜６０、例えば６〜４０、例えば６〜３０、例えば６〜２０、例えば６〜１５、例えば６〜１０、例えば６〜８、例えば６、例えば７〜１００、例えば７〜８０、例えば７〜６０、例えば７〜４０、例えば７〜３０、例えば７〜２０、例えば７〜１５、例えば７〜１０、例えば７〜８、例えば７、例えば８〜１００、例えば８〜８０、例えば８〜６０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、例えば８〜１５、例えば８〜１０、例えば８、例えば９、例えば１０〜１００、例えば１０〜８０、例えば１０〜６０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１０〜２０、例えば１０〜１５、例えば１０〜１２、例えば１０、例えば１２〜１００、例えば１２〜８０、例えば１２〜６０、例えば１２〜４０、例えば１２〜３０、例えば１２〜２０、例えば１２〜１５、例えば１４〜１００、例えば１４〜８０、例えば１４〜６０、例えば１４〜４０、例えば１４〜３０、例えば１４〜２０、例えば１４〜１６、例えば１６〜１００、例えば１６〜８０、例えば１６〜６０、例えば１６〜４０、例えば１６〜３０、例えば１６〜２０、例えば１８〜１００、例えば１８〜８０、例えば１８〜６０、例えば１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば１８〜２０、例えば２０〜１００、例えば２０〜８０、例えば２０〜６０、例えば２０〜４０、例えば２０〜３０、例えば２０〜２５、例えば２２〜１００、例えば２２〜８０、例えば２２〜６０、例えば２２〜４０、例えば２２〜３０、例えば２２〜２５、例えば２５〜１００、例えば２５〜８０、例えば２５〜６０、例えば２５〜４０、例えば２５〜３０、例えば３０〜１００、例えば３０〜８０、例えば３０〜６０、例えば３０〜４０、例えば３０〜３５、例えば３５〜１００、例えば３５〜８０、例えば３５〜６０、例えば３５〜４０、例えば４０〜１００、例えば４０〜８０、例えば４０〜６０、例えば４０〜５０、例えば４０〜４５、例えば４５〜１００、例えば４５〜８０、例えば４５〜６０、例えば４５〜５０、例えば５０〜１００、例えば５０〜８０、例えば５０〜６０、例えば５０〜５５、例えば６０〜１００、例えば６０〜８０、例えば６０〜７０、例えば７０〜１００、例えば７０〜９０、例えば７０〜８０、例えば８０〜１００、例えば８０〜９０、例えば９０〜１００である。
【０３９０】
本発明のもう一つの好ましい態様において、それぞれが残基を含む複数の共有結合した官能基を含むポリマーを含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、共有結合した残基は、単独でまたは追加の部分との組み合わせにおいて、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、一置換、二置換および三置換α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形またはＤ−形であるペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば配合団を含む複合ペプチド、ポリエステル、ポリサッカライド、ポリカーバメート、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリ−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリーレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族環を含む多環式化合物（多複素環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサンからなるポリマー部分の群から選択される少なくとも一つの部分を含むポリマーを生成でき、ここにおいて、複数の残基は好ましくは、２〜２００、例えば２〜１００、例えば２〜８０、例えば２〜６０、例えば２〜４０、例えば２〜３０、例えば２〜２０、例えば２〜１５、例えば２〜１０、例えば２〜８、例えば２〜６、例えば２〜４、例えば２、例えば３〜１００、例えば３〜８０、例えば３〜６０、例えば３〜４０、例えば３〜３０、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１５、例えば３〜１０、例えば３〜８、例えば３〜６、例えば３〜４、例えば３、例えば４〜１００、例えば４〜８０、例えば４〜６０、例えば４〜４０、例えば４〜３０、例えば４〜２０、例えば４〜１５、例えば４〜１０、例えば４〜８、例えば４〜６、例えば４、例えば５〜１００、例えば５〜８０、例えば５〜６０、例えば５〜４０、例えば５〜３０、例えば５〜２０、例えば５〜１５、例えば５〜１０、例えば５〜８、例えば５〜６、例えば５、例えば６〜１００、例えば６〜８０、例えば６〜６０、例えば６〜４０、例えば６〜３０、例えば６〜２０、例えば６〜１５、例えば６〜１０、例えば６〜８、例えば６、例えば７〜１００、例えば７〜８０、例えば７〜６０、例えば７〜４０、例えば７〜３０、例えば７〜２０、例えば７〜１５、例えば７〜１０、例えば７〜８、例えば７、例えば８〜１００、例えば８〜８０、例えば８〜６０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、例えば８〜１５、例えば８〜１０、例えば８、例えば９、例えば１０〜１００、例えば１０〜８０、例えば１０〜６０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１０〜２０、例えば１０〜１５、例えば１０〜１２、例えば１０、例えば１２〜１００、例えば１２〜８０、例えば１２〜６０、例えば１２〜４０、例えば１２〜３０、例えば１２〜２０、例えば１２〜１５、例えば１４〜１００、例えば１４〜８０、例えば１４〜６０、例えば１４〜４０、例えば１４〜３０、例えば１４〜２０、例えば１４〜１６、例えば１６〜１００、例えば１６〜８０、例えば１６〜６０、例えば１６〜４０、例えば１６〜３０、例えば１６〜２０、例えば１８〜１００、例えば１８〜８０、例えば１８〜６０、例えば１８〜４０、例えば１８〜３０、例えば１８〜２０、例えば２０〜１００、例えば２０〜８０、例えば２０〜６０、例えば２０〜４０、例えば２０〜３０、例えば２０〜２５、例えば２２〜１００、例えば２２〜８０、例えば２２〜６０、例えば２２〜４０、例えば２２〜３０、例えば２２〜２５、例えば２５〜１００、例えば２５〜８０、例えば２５〜６０、例えば２５〜４０、例えば２５〜３０、例えば３０〜１００、例えば３０〜８０、例えば３０〜６０、例えば３０〜４０、例えば３０〜３５、例えば３５〜１００、例えば３５〜８０、例えば３５〜６０、例えば３５〜４０、例えば４０〜１００、例えば４０〜８０、例えば４０〜６０、例えば４０〜５０、例えば４０〜４５、例えば４５〜１００、例えば４５〜８０、例えば４５〜６０、例えば４５〜５０、例えば５０〜１００、例えば５０〜８０、例えば５０〜６０、例えば５０〜５５、例えば６０〜１００、例えば６０〜８０、例えば６０〜７０、例えば７０〜１００、例えば７０〜９０、例えば７０〜８０、例えば８０〜１００、例えば８０〜９０、例えば９０〜１００である。
【０３９１】
本発明の一態様において鋳型化された分子は、共有結合した残基がα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、一置換、二置換および三置換α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形またはＤ−形であるペプチド、およびビニル性ポリペプチドからなるポリマー部分の群から選択される少なくとも一つの部分を単独または追加の部分との組み合わせにおいて含むポリマーを生成できるものである。
一具体例において、鋳型化された分子は、共有結合した残基がポリサッカライドを生成できるものである。
【０３９２】
もう一つの態様において、隣接する官能基が前記官能基に本来関連しない分子部分により結合する官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供される。
本発明のさらにもう一つの態様は、ｉ）共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子（ここにおいて、鋳型化された分子はα−ペプチドまたはヌクレオチドを含まないかまたはこれらから構成されない）、ｉｉ）共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子（ここにおいて、鋳型化された分子は一置換α−ペプチドまたはヌクレオチドを含まないかまたはこれらから構成されない）、およびｉｉｉ）共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子（ここにおいて、鋳型化された分子はペプチドまたはヌクレオチドを含まないかまたはこれらから構成されない）に関する。
【０３９３】
鋳型化された分子の組成物
本明細書において直前に記載したものを包含する本発明の鋳型化された分子は、鋳型化された分子の組成物において存在でき、ここにおいて、前記組成物は複数の１０３以上または約１０３の異なる鋳型化された分子、例えば１０４以上または約１０４の異なる鋳型化された分子、例えば１０５以上または約１０３の異なる鋳型化された分子、例えば１０６以上または約１０６の異なる鋳型化された分子、例えば１０７以上または約１０７の異なる鋳型化された分子、例えば１０８以上または約１０８の異なる鋳型化された分子、例えば１０９以上または約１０９の異なる鋳型化された分子、例えば１０１０以上または約１０１０の異なる鋳型化された分子、例えば１０１１以上または約１０１１の異なる鋳型化された分子、例えば１０１２以上または１０１２の異なる鋳型化された分子、例えば１０１３以上または約１０１３の異なる鋳型化された分子、例えば１０１４以上または約１０１４の異なる鋳型化された分子、例えば１０１５以上または約１０１５の異なる鋳型化された分子、例えば１０１６以上または約１０１６の異なる鋳型化された分子、例えば１０１７以上または約１０１７の異なる鋳型化された分子、例えば１０１８以上または約１０１８の異なる鋳型化された分子を含む。
【０３９４】
いくつかの具体例において、組成物は好ましくはさらに、それぞれの鋳型化された分子、またはそのサブセットをテンプレートすることができる鋳型を含む。従って、本発明の好ましい一態様において、ｉ）鋳型化された分子および鋳型化された分子をテンプレートすることができる鋳型を含む組成物、またはｉｉ）鋳型化された分子および鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型を含む組成物が提供される。
ｉ）鋳型化された分子の合成をテンプレートできる鋳型に結合しているか、またはｉｉ）鋳型化された分子の合成をテンプレートできる鋳型をさらに含む組成物中に存在するかのいずれかである鋳型化された分子の様々な好ましい特徴を以下に記載する。
【０３９５】
かかる組成物中に存在する場合、ｉ）鋳型化された分子が一置換α−アミノ酸のみを含むペプチドであるならば、鋳型化された分子は天然のヌクレオチドのみから構成されないこと、ｉｉ）鋳型化された分子が天然のα−ペプチドであるならば、鋳型は天然のヌクレオチドでないこと、ｉｉｉ）鋳型化された分子が天然のα−ペプチドであるならば、鋳型はヌクレオチドではないこと、ｉｖ）鋳型化された分子が一置換α−ペプチドであるならば、鋳型はヌクレオチドではないこと、ｖ）鋳型化された分子がα−ペプチドであるならば、鋳型はヌクレオチオドではないこと、ｖｉ）鋳型化された分子がペプチドであるならば、鋳型は天然のヌクレオチドではないこと、およびｖｉｉ）鋳型化された分子がペプチドであるならば、鋳型はヌクレオチドではないことが好ましい。
【０３９６】
鋳型と結合した鋳型化された分子および鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型
本発明の好ましい一態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子の配列が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子はα−ペプチドを含まないか、またはα−ペプチドから構成されない。
本発明のもう一つの好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子は一置換α−ペプチドを含まない。
本発明のさらにもう一つの態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子はα−ペプチドまたはヌクレオチドを含まないか、またはこれらから構成されない。
【０３９７】
本発明のさらにもう一つの態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない。
本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、相補鋳型または鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型と結合し、鋳型化された分子が一置換α−アミノ酸のみを含むペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない。
【０３９８】
本発明のさらにもう一つの態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない。
本発明のさらに好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて鋳型化された分子は、リンカーにより鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型は鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合にヌクレオチドではない。
【０３９９】
本発明のさらにもう一つの態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて、鋳型化された分子はリンカーにより、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型されたヌクレオチドが一置換α−ペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない。
本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて鋳型化された分子はリンカーにより鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない。
【０４００】
本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて鋳型化された分子はリンカーにより鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子がペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない。
本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、共有結合した官能基の配列を含む鋳型化された分子が提供され、ここにおいて鋳型化された分子はリンカーにより鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型と結合し、鋳型化された分子がペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない。
鋳型化された分子を本明細書においてすでに記載した方法に従って得ることができる。
【０４０１】
さらなる態様において、
ｉ）共有結合したビルディングブロックの配列を含む鋳型化された分子；
ｉｉ）共有結合したビルディングブロックの配列を含む鋳型化された分子（ここにおいて、共有結合したビルディングブロックの配列は、鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型を補完できる相補鋳型を形成する相補因子の配列を含み、鋳型化された分子は相補鋳型またはその合成をテンプレートした鋳型と結合する）；および
ｉｉｉ）前記請求項のいずれかに記載の鋳型化された分子（ここにおいて、鋳型化された分子は、少なくとも一つの官能基、および所望により少なくとも一つのＩＩ型反応基を含む機能的部分の配列を含み、各機能的部分は相補因子または鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型と結合する）
が提供される。
【０４０２】
鋳型化された分子の使用
本発明の鋳型化された分子は様々な商業的目的に関して使用できる。
一態様において、所定の活性を潜在的に有する鋳型化された分子をスクリーニングする方法であって、標的分子または標的実体（表面を含む）を提供する工程、および前記標的分子または標的実体に対して親和性を有する（または影響を及ぼす）鋳型化された分子を得る工程を含む方法が提供される。
もう一つの態様は、鋳型化された分子に潜在的に関連する活性を分析する方法であって、標的分子または標的実体（表面を含む）を提供する工程、および前記標的分子または標的実体に対して親和性を有する（または影響を及ぼす）鋳型化された分子を得る工程、および鋳型化された分子の活性を測定する工程を含む方法が提供される。
さらにもう一つの態様は、所定の活性を有する複合体または鋳型化された分子を選択する方法であって、選択処理を実施する工程および所定の選択基準に基づいて鋳型化された分子を選択する工程を含む方法を提供する。
【０４０３】
所定の活性を有する分子の組成物をスクリーニングする方法であって：
ｉ）前記の、または鋳型化された分子を調製するための方法により前記のようにして産生された鋳型化された分子の第一の組成物を確立し、
ｉｉ）前記の第一の組成物を所定の活性を有する鋳型化された分子で富化する条件に第一の組成物をさらし、
ｉｉｉ）所望により富化された組成物の鋳型化された分子を増幅して、第二の組成物を得、
ｉｖ）さらに所望により工程ｉｉ）からｉｉｉ）を繰り返し、
ｖ）特異的な所定の活性を有する鋳型化された分子を高比率で有するさらに別の組成物を得ることを含む方法が提供される。
【０４０４】
一具体例において、方法はさらに鋳型化された分子の突然変異工程を含み、ここにおいて、前記突然変異誘発は、工程ｉｉｉ）を行う前、工程ｉｉｉ）を行うのと同時、または工程ｉｉｉ）を行った後に起こり得る。突然変異誘発はランダムまたは部位特異性突然変異誘発として行うことができる。
該方法の工程ｉｉｉ）は好ましくは１０１〜１０１５倍の増幅を含み、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、例えば少なくとも２回、３回、５回、または少なくとも１０回、例えば少なくとも１５回繰り返すことができる。
【０４０５】
該方法は、所定の活性を有する鋳型化された分子を同定するさらに別の工程を含み得、前記同定は、例えば鋳型および／または相補鋳型を物理的に、または分子に関連する他の手段により分析することにより行うことができる。
第一組成物を富化する条件は、所定の活性を有する前記の鋳型化された分子との結合パートナーをさらに提供することを含み、ここにおいて、前記結合パートナーは支持体上に直接または間接的に固定される。
【０４０６】
組成物を富化する条件は、電気泳動分離、ゲル濾過、免疫沈降、等電点電気泳動、遠心分離、および固定化のうちの１以上を含む任意の最先端の方法を含み得る。組成物を富化する条件は、鋳型化された分子の内面化、または所定の活性を有する鋳型化された分子との任意の相互作用を行うことができる細胞を提供するさらに別の段階を含むこともできる。
鋳型化された分子の所定の活性は、好ましくは酵素活性または触媒活性である。
【０４０７】
もう一つの態様において、所定の活性を有するか、または潜在的に有する鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅する方法であって、鋳型を増幅手段と接触させ、鋳型を増幅させることを含む方法が提供される。所定の活性を有するかまたは潜在的に有する鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅する方法は、好ましくは、ｉ）鋳型を増幅手段と接触させ、鋳型を増幅させ、ｉｉ）鋳型化された分子を少なくとも２倍増大した量において得る工程を含む。
【０４０８】
もう一つの態様において、鋳型化された分子の配列を変更する方法であって、官能基の新規または変更された配列を含む鋳型化された分子を生成することを含む方法が提供され、ここにおいて、前記方法は好ましくは：
ｉ）第一の鋳型化された分子をテンプレートできる第一相補鋳型または第一鋳型、あるいは複数の第一の鋳型化された分子をテンプレートできる複数のこのような第一相補鋳型または第一鋳型を提供する工程、
ｉｉ）第一の相補鋳型または第一鋳型の配列、あるいは複数の第一相補鋳型または第一鋳型を突然変異させるかまたは修飾し、第二鋳型または第二相補鋳型、あるいは複数の第二鋳型または第二相補鋳型を生成する工程
（ここにおいて、前記第二鋳型または相補鋳型は第二の鋳型化された分子、または複数の第二の鋳型化された分子の合成をテンプレートでき、
前記の第二の鋳型化された分子は、第一の鋳型化された分子の官能基の配列と同一でない共有結合した官能基の配列を含む）、
ｉｉｉ）前記の第二の鋳型または相補鋳型により、第二の鋳型化された分子、または複数のこのような第二の鋳型化された分子をテンプレートする工程を含む。
【０４０９】
さらにもう一つの態様において、鋳型化された分子の配列を変更する方法であって、官能基の新規または変更された配列を含む鋳型化された分子を生成することを含む方法が提供され、前記方法は好ましくは：
ｉ）複数の第一の鋳型化された分子をテンプレートできる複数の第一の相補鋳型または第一の鋳型を提供する工程、
ｉｉ）複数の第一相補鋳型または第一鋳型の配列を組み換え、第二の鋳型または第二の相補鋳型、あるいは複数の第二の鋳型または第二の相補鋳型を生成する工程（ここにおいて、前記の第二鋳型または相補鋳型は第二の鋳型化された分子、または複数の第二の鋳型化された分子の合成をテンプレートでき、
前記の第二の鋳型化された分子は、第一の鋳型化された分子の官能基の配列と同一でない共有結合した官能基の配列を含む）、および所望により、
ｉｉｉ）前記の第二鋳型または相補鋳型により第二の鋳型化された分子、または複数のこのような第二の鋳型化された分子をテンプレートする工程を含む。
【０４１０】
該方法は、好ましくは、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅させるさらに別の工程を含むことができ、ここにおいて前記増幅工程は、突然変異誘発または組み換え工程の前、同時、または後に行う。
突然変異誘発が用いられる場合、部位特異性突然変異誘発、カセット突然変異誘発、化学的突然変異誘発、ユニークサイトエリミネーション（ＵＳＥ）、変異導入型ＰＣＲ、変異導入型ＤＮＡシャッフリングのいずれかとして用いることができる。突然変異誘発は、好ましくはＤＮＡシャッフリングおよび／または任意の形態の組み換えを含む（インビボまたはインビトロのいずれかのホモローガスな組み換えを含む）。
【０４１１】
鋳型化された分子の変異体および機能的等価物
本発明はさらに、鋳型化された分子の任意の変異体および機能的等価物にも関する。変異体および機能的等価物は、ペプチドを包含するポリマーの形態の鋳型化された分子を修飾するための最新の方法により得ることができる。
本発明の鋳型化された分子に関して、分子が類似した主鎖構造および／または類似した官能基を含むならば、これらはホモローガスであるとされる。官能基、または官能基の分子は３つのホモロジー群：荷電した機能的部分、疎水性基、および親水性基に分類される。官能基が異なるホモロジー群に属する２または３の分子を含む場合、官能基は２または３の異なるホモロジー群に属するとされる。
ホモロジーは百分率（％）で測定される。一例として、配列ＡＡＢＢＣＡＣＡＡＡおよびＢＢＡＡＣＡＣＢＢＢ（ここにおいて、Ａ、ＢおよびＣはそれぞれホモロジー群Ａ、Ｂ、およびＣに属する官能基を意味する）は３０％ホモローガスである。
【実施例】
【０４１２】
実施例１〜７：モノヌクレオチドビルディングブロック（Ｉ）の調製
ビルディングブロックＩを以下に示す一般的なスキームにしたがって調製することができる：
【化１５】
Figure 2004535193
【０４１３】
実施例１：３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸（Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニン）（１ａ）の調製
【化１６】
Figure 2004535193
β−アラニン（２．２５ｇ、２５ミリモル）の水性ＮａＨＣＯ３中溶液にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４．３６ｇ、２０ミリモル）およびアセトニトリル（２５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、ＮａＨ２ＰＯ４を添加することによりｐＨを４〜５に調節した。生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出し（３×５０ｍＬ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発乾固させて３．７１ｇを得た（９８％）。
1H NMR (CDCl3)δ 11 (1H, br s, COOH), 5,07 (1H, br s, NH), 3,40 (2H, m), 2,58 (2H, m), 1,44 (9H, s, tBu)
【０４１４】
実施例２：Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニンプロパルギルエステル（１ｂ）の調製
【化１７】
Figure 2004535193
Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニン（１．９１ｇ、１０．１ミリモル）およびプロパルギルアルコール（０．６７５ｇ、１２ミリモル）をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）中に溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．０６ｇ、１０ミリモル）を溶液に添加し、１６時間室温で撹拌した後、反応混合物を濾過し、真空下で蒸発乾固させた。粗生成物収率
【０４１５】
実施例３：５−ヨード−２’−デオキシウリジン−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（１ｃ）の調製
【化１８】
Figure 2004535193
【０４１６】
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，２．３９ｇ、６．７ミリモル）およびイミダゾール（２．０２５ｇ、２９．７ミリモル）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．２４ｇ、１４．９ミリモル）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液を添加し、結果として得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。
反応混合物をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）中に注ぎ、ＮＨ４Ｃｌ（５０％飽和水溶液、８０ｍＬ）、続いて水（８０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ＥｔＯＡｃを減圧下で除去すると、無色油状物が残り、これは静置すると固化した。ｎ−ヘキサン（１４ｍＬ）中再結晶して、２．６４ｇ、８０％を得た。
【０４１７】
1H NMR (CDCl3)δ 8.18 (1H, br s, NH); 8.10 (1H, s); 6,23 (1H, dd); 4,40 (1H, dt); 4.05 (1H, dd); 3.92 (1H, dd); 3.78 (1H, dd); 2,32 (1H, ddd); 2.05 (1H, ddd); 0.95(9H, s, tBu); 0.90(9H, s, tBu); 0.15 (3H, s, CH3); 0.13 (3H, s, CH3); 0.08 (3H, s, CH3); 0.07 (3H, s, CH3).
【０４１８】
実施例４：化合物（１ｄ）の調製
【化１９】
Figure 2004535193
化合物（１ｄ）
【０４１９】
ヨードシリルエーテル（１ｃ）（１．６２ｇ、２．７ミリモル）、Ｎ−Ｂｏｃ−β-アラニン（１ａ）（２．０３ｇ、８．９ミリモル）およびトリエチルアミン（０．５８５ｇ、５．８ミリモル）の１０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中溶液を室温で撹拌した。Ｎ２を溶液に２０分間通した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２６９ｍｇ、０．２ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（９０ｍｇ、０．４ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で３２時間撹拌した。
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を反応混合物中に注ぎ、続いて水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）；食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空蒸発により溶媒を除去した。
粗生成物（２．４ｇ）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（１：２）−（５：３）（ｖ／ｖ）で溶出）により精製した。生成物収率１．１５ｇ、６０％。
【０４２０】
1H NMR (CDCl3)δ 8.45 (1H, s), 8.05 (1H, s, 6-H), 7.35 (1H, bs, NH), 6.25 (1H, dd, 1'-H), 4.82 (2H, s, CH2O), 4,39 (1H, m, 3'-H), 3.97 (1H, m, 4'-H), 3.80 (2H, dd, 5',5''-H), 3.40 (2H, m, CH2N), 2.58 (2H, t, CH2), 2,2 (1H, m, 2'-H), 2.0 (1H, m, 2''-H), 1.45 (9H, s, tBu), 0.93 (9H, s, tBu), 0.89 (9H, s, tBu), 0.15 (3H, s, CH3), 0.13 (3H, s, CH3), 0.08 (3H, s, CH3), 0.07 (3H, s, CH3).
【０４２１】
実施例５：化合物（１ｅ）の調製
【化２０】
Figure 2004535193
化合物（１ｅ）
【０４２２】
Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニンシリルエーテル（１ｄ）（１００ｍｇ、０．１５ミリモル）、氷酢酸（７５ｍｇ、１．２５ミリモル）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（ＴＢＡＦ）（１８９ｍｇ、０．６ミリモル）の２ｍＬ乾燥ＴＨＦ中溶液を室温で３日間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン（ＤＣＭ）：メタノール（ＭｅＯＨ）勾配（９５：５）−（８８：１２）（ｖ／ｖ）で溶出）により精製した。生成物収率２６ｍｇ、３８％。
【０４２３】
1H NMR (CD3OD)δ 8.35 (1H, s, 6-H), 6.15 (1H, t, 1'-H), 4.80 (2H, s, CH2O), 4,32 (1H, dt, 3'-H), 3.86 (1H, q, 4'-H), 3.70 (2H, dd, 5',5''-H), 3.24 (2H, m, CH2N), 2.47 (2H, t, CH2), 2,28-2.10 (1H, m, 2',2''-H), 1.44 (9H, s, tBu).
【０４２４】
実施例６：化合物（１ｆ）の調製
【化２１】
Figure 2004535193
化合物１ｆ
【０４２５】
Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニンヌクレオシド（１ｅ）（２６ｍｇ、５７マイクロモル）を２００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却した後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（１００μＬストック溶液（１０４ｍｇ／ｍＬ）、６８マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。続いて、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ｐ−８５３３）（３００μＬ乾燥ＤＭＦ中６７．８ｍｇ、１４３マイクロモル）およびトリブチルアミン（１５０μＬ乾燥ＤＭＦ中２６．９ｍｇ、１４５マイクロモル）の溶液を０℃で添加した。反応を室温で３分間撹拌し、次いで１ｍｌの１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムを添加することにより停止させた。
【０４２６】
実施例７：化合物Ｉの調製
【化２２】
Figure 2004535193
化合物Ｉ
【０４２７】
Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去
リン酸化後、ＨＣｌを用いて５０μｌのリン酸化反応混合物をｐＨ＝１に調節し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＬＣ上での精製の前に等モル量のＮａＯＨおよび酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて混合物をｐＨ５．５に調節した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたヌクレオチド誘導体の精製
粗混合物から、２μｌの２０サンプルをｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ）上にスポットした。１００％メタノールをランニング溶液として使用して、有機溶媒および非リン酸化ヌクレオシドをヌクレオチド誘導体から分離した。その後、ＴＬＣプレートを空気乾燥させ、ヌクレオチド誘導体をＵＶ−シャドウイングにより同定した。ヌクレオチド誘導体を含有するｋｉｅｓｅｌｇｅｌを単離し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）を溶媒として用いて２回抽出した。ｋｉｅｓｅｌｇｅｌを遠心分離により除去し、上清を真空中で乾燥させた。ヌクレオチド誘導体を５０〜１００μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁させて、最終濃度を１〜３ｍＭにした。各ヌクレオチド誘導体の濃度を、ポリメラーゼエクステンション反応において使用する前にＵＶ吸収により評価した。
【０４２８】
実施例８〜１３：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＩＩ）の調製
ビルディングブロックＩＩを以下に示す一般的スキームにしたがって調製することができる：
【化２３】
Figure 2004535193
【０４２９】
実施例８：Ｎ−Ｂｏｃ-3-フェニル−β−アラニン（２ａ）の調製
【化２４】
Figure 2004535193
化合物２ａ
【０４３０】
３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（３．３０ｇ、２０ミリモル）のＮａＨＣＯ３（５０％飽和水性溶液、２５ｍＬ）中溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４．３６ｇ、２０ミリモル）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４．３６ｇ、２０ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、ＮａＨ２ＰＯ４の添加によりｐＨを４〜５に調節した。生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出し（３×１００ｍＬ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発乾固させて、５．６ｇ（１０５％）の粗生成物を得た。
【０４３１】
実施例９：５−（３−ヒドロプロピン−１−イル）−２’−デオキシウリジン３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（２ｂ）の調製
【化２５】
Figure 2004535193
化合物２ｂ
【０４３２】
ヨードシリルエーテル（３）（１．３０ｇ、２．２ミリモル）、プロパルギルアルコール（０．３８６ｇ、６．９ミリモル）およびトリエチルアミン（０．４３８ｇ、４．３ミリモル）の７ｍＬの乾燥ＤＭＦ中溶液をＮ２で脱気した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２２８ｍｇ、０．２ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（１２０ｍｇ、０．４ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で３２時間撹拌した。
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を反応混合物中に注ぎ、続いて洗浄し（水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）；食塩水（５０ｍＬ））、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）真空蒸発により溶媒を除去した。
粗生成物（１．７３ｇ）をシリカカラムクロマトグラフィーで、ＥｔＯＡｃ−ヘプタ勾配（２：３）−（３：２）（ｖ／ｖ）で溶出することにより精製した。生成物収率０．７１３ｇ、６３％。
【０４３３】
1H NMR (CDCl3)δ 8.47 (1H, s), 8.05 (1H, s, 6-H), 6.29 (1H, dd, 1'-H), 4,42 (2H, s, CH2), 4,39 (1H, m, 3'-H), 3.98 (1H, m, 4'-H), 3.83 (2H, dd, 5',5''-H), 2,32 (1H, m, 2'-H), 2.02 (1H, m, 2''-H), 0.93 (9H, s, tBu), 0.89 (9H, s, tBu), 0.15 (3H, s, CH3), 0.13 (3H, s, CH3), 0.08 (3H, s, CH3), 0.07 (3H, s, CH3)
【０４３４】
実施例１０：化合物（２ｃ）の調製
【化２６】
Figure 2004535193
化合物２ｃ
【０４３５】
Ｎ−Ｂｏｃ−３−フェニル−β−アラニン（８）（２６５ｍｇ、１．０ミリモル）および化合物（２ｂ）（２５５ｍｇ、０．５ミリモル）をＴＨＦ（１５ｍＬ）中に溶解させた。ジイソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ、１２６ｍｇ、１ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０ｍｇ）を溶液に添加し、室温で１６時間撹拌後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に注ぎ、ＮａＨＣＯ３（５０％飽和水溶液、５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空下で蒸発させた。
粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（１：２）〜（２：３）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収率３３５ｍｇ、８８％。
【０４３６】
1H NMR (CDCl3)δ 8.49 (1H, s), 8.04 (1H, s, 6-H), 7.29 (5H, m, Ph), 6.27 (1H, dd, 1'-H), 5.5 (1H, bd), 5.09 (1H,m), 4,80 (2H, s, CH2), 4,39 (1H, m, 3'-H), 3.98 (1H, m, 4'-H), 3.82 (2H, dd, 5',5''-H), 2,87 (2H, d), 2.29 (1H, m, 2'-H), 2.01 (1H, m, 2''-H), 1.41 (9H, s, tBu ), 0.91 (9H, s, tBu), 0.89 (9H, s, tBu), 0.15 (3H, s, CH3), 0.13 (3H, s, CH3), 0.08 (3H, s, CH3), 0.07 (3H, s, CH3)
【０４３７】
実施例１１：化合物２ｄの調製
【化２７】
Figure 2004535193
化合物２ｄ
【０４３８】
化合物（２ｃ）（３３４ｇ、４４０マイクロモル）、氷酢酸（１９０ｍｇ、３．１５ミリモル）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（ＴＢＡＦ）（５００ｍｇ、１．５８ミリモル）の６ｍＬの乾燥ＴＨＦ中溶液を室温で１８時間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーで、（ＤＣＭ）：（ＭｅＯＨ）勾配（９５：５）−（９：１）（ｖ／ｖ）で溶出することにより精製した。生成物収率１２２ｍｇ、５２％。
【０４３９】
1H NMR (CDCl3)δ 10.1 (1H, s), 8.24 (1H, s, 6-H), 7.3 (5H, m, Ph), 6.37 (1H, dd, 1'-H), 5.6 (1H, bs), 5.09 (1H,m), 4,79 (2H, s, CH2), 4,52 (1H, m, 3'-H), 4.0 (1H, m, 4'-H), 3.85 (2H, dd, 5',5''-H), 2,87 (2H, d), 2.4 (1H, m, 2'-H), 2.25 (1H, m, 2''-H), 1.4 (9H, s, tBu )
【０４４０】
実施例１２：化合物２ｅの調製
【化２８】
Figure 2004535193
化合物２ｅ
【０４４１】
化合物（２ｄ）（１２２ｍｇ、２３０マイクロモル）を４００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（４００μＬストック溶液（１０５ｍｇ／ｍＬ）、２７６マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。
次に、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（１．２ｍＬ乾燥ＤＭＦ中２７３ｍｇ、５７６マイクロモル）およびトリブチルアミン（６００μＬ乾燥ＤＭＦ中１０９ｍｇ、５８７マイクロモル）を０℃で添加した。反応を室温で１０分間撹拌し、次いで１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（１ｍＬ）の添加により停止させた。
【０４４２】
実施例１３：化合物ＩＩの調製
【化２９】
Figure 2004535193
化合物ＩＩ
【０４４３】
Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去
リン酸化後、ＨＣｌを用いて５０μＬのリン酸化反応混合物をｐＨ＝１に調節し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＬＣ上での精製の前に、等モル量のＮａＯＨおよび酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて混合物をｐＨ５．５に調節した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたヌクレオチド誘導体の精製
粗混合物から、２μＬの２０サンプルをｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ）上にスポットした。１００％メタノールをランニング溶液として用いて、有機溶媒および非リン酸化ヌクレオシドをヌクレオチド誘導体から分離した。続いて、ＴＬＣプレートを空気乾燥させて、ＵＶシャドウイングによりヌクレオチド誘導体を同定した。ヌクレオチド誘導体を含有するｋｉｅｓｅｌｇｅｌを単離し、溶媒として１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）を溶媒として用いて２回抽出した。遠心分離によりｋｉｅｓｅｌｇｅｌを除去し、上清を真空中で乾燥した。ヌクレオチド誘導体を５０〜１００μＬのＨ２Ｏ中に再懸濁させて、最終濃度を１〜３ｍＭにした。ポリメラーゼエクステンション反応において使用する前に、各ヌクレオチド誘導体の濃度をＵＶ吸収により評価した。
【０４４４】
実施例１４〜１８：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＩＩＩ）の調製
以下に示す一般的スキームに従って、ビルディングブロックＩＩＩを調製した：
【化３０】
Figure 2004535193
【０４４５】
実施例１４：Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニンプロパルギルアミド（３ａ）の調製
【化３１】
Figure 2004535193
化合物２ａ
【０４４６】
Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニン（１ａ）（１．０５ｇ、５．５ミリモル）およびプロパルギルアミン（０．９０ｇ、１６．５ミリモル）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。ジイソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ、６９５ｇ、５．５ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。水を添加し（２０ｍＬ）、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×３０ｍＬ）。合したＥｔＯＡｃを乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（２：３）〜（３：２．５）で溶出して精製した。生成物収率０．９２５ｇ、７４％。
1H NMR (CDCl3)δ 6.69 (1H, bs, NH), 5,32 (1H, bs, NH), 4.04 (2H, bs), 3,41 (2H, dd), 2,45 (2H, t), 2.24 (1H, s), 1,44 (9H, s, tBu).
【０４４７】
実施例１５：化合物（３ｂ）の調製
【化３２】
Figure 2004535193
化合物３ｂ
【０４４８】
５−ヨード−２’−デオキシシチジン（１７６ｍｇ、０．０５ミリモル）、Ｎ−Ｂｏｃ−β−アラニンプロパルギルアミド（１４）およびトリエチルアミン（１００ｍｇ、１．０ミリモル）の乾燥ＤＭＦ中溶液（５ｍＬ）中溶液を室温で撹拌した。Ｎ２を溶液に２０分間通した。
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６６．５ｍｇ、０．０５７ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（２０．７ｍｇ、０．１０８ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で５日間撹拌した。
イミダゾール（１１２ｍｇ、１．６ミリモル）を添加した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２３４ｍｇ、１．５ミリモル）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液を添加し、結果として得られる混合物を室温で１６時間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）を添加した。結果として得られる混合物を濾過し、溶媒を真空蒸発により除去した。
粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによりＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９２．５−７．５）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収率８４ｍｇ、２５％。
【０４４９】
1H NMR (CDCl3)δ 8.13 (H, s), 6.21 (1H, dd, 1'-H), 4.66 (1H, m), 4,16 (2H, s, CH2), 4,04-3.85 (4H, m), 3.35-3.31 (2H, m), 2,43-2.36 (2H, m), 2.12-1.99 (1H, m), 1.44 (9H, s, tBu ), 0.95 (9H, s, tBu), 0.92 (9H, s, tBu), 0.17 (3H, s, CH3), 0.15 (3H, s, CH3), 0.13 (3H, s, CH3), 0.12 (3H, s, CH3).
【０４５０】
実施例１６：化合物（３ｃ）の調製
【化３３】
Figure 2004535193
化合物３ｃ
【０４５１】
化合物（３ｂ）（８４ｍｇ、０．１２ミリモル）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（ＴＢＡＦ）（１５５ｍｇ、０．４５ミリモル）の２ｍＬの乾燥ＴＨＦ中溶液を室温で撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーによりＤＣＭ：ＭｅＯＨ勾配（９：１）−（８：２）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収率２７ｍｇ、４８％。
1H NMR (CDCl3)δ 8.32 (1H, s), 6.20 (1H, dd, 1'-H), 4.35 (1H, dt), 4,15 (2H, s, CH2), 3.95 (1H, q), 3.83 (1H, dd), 3.72 (1H, dd), 3,36-3.30 (3H, m), 2.42-2.36 (3H, m), 2.13 (1H, dt), 1.40 (9H, s, tBu ).
【０４５２】
実施例１７：化合物（３ｄ）の調製
【化３４】
Figure 2004535193
化合物３ｄ
【０４５３】
化合物（３ｃ）（２７ｍｇ、６０マイクロモル）を１００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却した後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（１００μＬストック溶液（１１０ｍｇ／ｍＬ）、７２マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。
続いて、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（３００μＬ乾燥ＤＭＦ中７１ｍｇ、１５０マイクロモル）およびトリブチルアミン（１５０μＬ乾燥ＤＭＦ中２８．３ｍｇ、１５３マイクロモル）の溶液を０℃で添加した。反応を室温で３分間撹拌し、次いで１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（１ｍＬ）を添加することにより停止させた。
【０４５４】
実施例１８：化合物ＩＩＩの調製
【化３５】
Figure 2004535193
化合物ＩＩＩ
【０４５５】
Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去
リン酸化後、ＨＣｌを用いて５０μｌのリン酸化反応混合物をｐＨ＝１に調節し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＬＣ上での精製の前に、等モル量のＮａＯＨおよび酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて混合物をｐＨ＝５．５に調節した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたヌクレオチド誘導体の精製
粗混合物から、２μｌの２０サンプルをｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ）上にスポットした。１００％メタノールをランニング溶液として使用して、有機溶媒および非リン酸化ヌクレオシドをヌクレオチド誘導体から分離した。その後、ＴＬＣプレートを空気乾燥させ、ヌクレオチド誘導体をＵＶ−シャドウイングにより同定した。ヌクレオチド誘導体を含有するｋｉｅｓｅｌｇｅｌを単離し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）を溶媒として用いて２回抽出した。ｋｉｅｓｅｌｇｅｌを遠心分離により除去し、上清を真空中で乾燥させた。ヌクレオチド誘導体を５０〜１００μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁させて、最終濃度を１〜３ｍＭにした。ポリメラーゼエクステンション反応において使用する前に各ヌクレオチド誘導体の濃度をＵＶ吸収により評価した。
【０４５６】
実施例１９〜２２：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＩＶ）の調製
ビルディングブロックＩＶを以下に示す一般的スキームに従って調製することができる：
【化３６】
Figure 2004535193
【０４５７】
実施例１９：Ｎ−アセチル−β−アラニン（４ａ）の調製
【化３７】
Figure 2004535193
化合物４ａ
【０４５８】
β−アラニン（２．２５ｇ、２５ミリモル）の水性ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）中溶液にアセトニトリル（１５ｍＬ）および無水酢酸（２．５５ｇ、２５ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。無水酢酸（２．５５ｇ、２５ミリモル）を添加し、２時間後、ＮａＨ２ＰＯ４を添加することによりｐＨを４〜５に調節した。
生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出し（３×５０ｍＬ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発乾固させて１．９６ｇを得た（６０％）。
【０４５９】
実施例２０：Ｎ−アセチル−β−アラニンプロパルギルエステル（４ｂ）の調製
【化３８】
Figure 2004535193
化合物４ｂ
【０４６０】
Ｎ−アセチル−β−アラニン（４ａ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中溶液に、プロパルギルアルコール（８４０ｍｇ、１５ミリモル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．０３５ｇ、５．３９ミリモル）、トリエチルアミン（５４０ｍｇ、５．４ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。
反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に注ぎ、ＮａＨ２ＰＯ４（５０％飽和水溶液、２×５０ｍＬ）、次いでＮａＨＣＯ３（５０％飽和水溶液、５０ｍＬ）で洗浄した。乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）後、ＥｔＯＡｃを減圧下で除去すると、無色油状物が残り、これは静置すると凝固した。生成物収率５３６ｍｇ、５９％。
【０４６１】
実施例２１：化合物（４ｃ）の調製
【化３９】
Figure 2004535193
化合物４ｃ
【０４６２】
５−ヨード−２’−デオキシシチジン（２００ｍｇ、０．５６ミリモル）、トリエチルアミン（１００ｍｇ、１ミリモル）および化合物（４ｂ）（１９０ｍｇ、１．１３ミリモル）の無水ＤＭＦ（７ｍＬ）中溶液を室温で撹拌した。Ｎ２を溶液に２０分間通した。
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（７０ｍｇ、０．０６ミリモル）およびヨウ化銅（２２ｍｇ、０．１２ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で４日間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーにより、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ勾配（９：１）〜（８：２）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収率１４１ｍｇ、６３％。
【０４６３】
1H NMR (CD3OD)δ 8.41 (1H, s), 6.20 (1H, dd, 1'-H), 4.97 (2H, s), 4.38 (1H, dt), 3.97 (1H, q), 3.85 (1H, dd), 3.75 (1H, dd), 3,46 (2H, t), 2.61 (2H, t), 2.39 (1H, m), 2.18 (1H, m)
【０４６４】
実施例２２：化合物ＩＶの調製
【化４０】
Figure 2004535193
化合物ＩＶ
【０４６５】
化合物（４ｃ）（１４０ｍｇ、３５５マイクロモル）を６００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（６００μＬストック溶液（１０８ｍｇ／ｍＬ）、４２０マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。
次に、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（１．８ｍＬ乾燥ＤＭＦ中４２２ｍｇ、８９０マイクロモル）およびトリブチルアミン（０．９ｍＬ乾燥ＤＭＦ中１６８ｍｇ、９００マイクロモル）を０℃で添加した。反応を室温で３分間撹拌し、次いで１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（１ｍＬ）の添加により停止させた。
粗混合物から、２μｌの２０サンプルをｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ）上にスポットした。１００％メタノールをランニング溶液として使用して、有機溶媒および非リン酸化ヌクレオシドをヌクレオチド誘導体から分離した。その後、ＴＬＣプレートを空気乾燥させ、ヌクレオチド誘導体をＵＶ−シャドウイングにより同定した。ヌクレオチド誘導体を含有するｋｉｅｓｅｌｇｅｌを単離し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）を溶媒として用いて２回抽出した。ｋｉｅｓｅｌｇｅｌを遠心分離により除去し、上清を真空中で乾燥させた。ヌクレオチド誘導体を５０〜１００μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁させて、最終濃度を１〜３ｍＭにした。各ヌクレオチド誘導体の濃度を、ポリメラーゼエクステンション反応において使用する前にＵＶ吸収により評価した。
【０４６６】
実施例２３〜２７：モノヌクレオチドビルディングブロック（Ｖ）の調製
以下に示す一般的なスキームに従ってビルディングブロックＶを調製することができる：
【化４１】
Figure 2004535193
【０４６７】
実施例２３：２−アミノキシ−酢酸エチルエステル（５ａ）の調製
【化４２】
Figure 2004535193
化合物５ａ
【０４６８】
アセチルクロリド（５ｍｌ）を無水エタノール（５０ｍＬ）に添加し、溶液を室温に冷却した。２−アミノキシ−酢酸塩酸塩（２：１）（１．１０ｇ、１０ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、Ｋ２ＣＯ３水溶液（２Ｍ）（１０ｍＬ）を添加し、生成物をジエチルエーテル中に抽出し（５×２０ｍＬ）、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させ、冷却して、１．００７ｇ（８４％）を得た。
1H NMR (CDCl3)δ 4.24 (2H, s), 4.22 (2H, q), 1.30 (3H, t)
【０４６９】
実施例２４：ペント−４−イノイルアミノオキシ−酢酸エチルエステル（５ｂ）の調製
【化４３】
Figure 2004535193
化合物５ｂ
【０４７０】
２−アミノキシ−酢酸エチルエステル（５７３ｍｇ、４．８ミリモル）および４−ペンチン酸（４４１ｍｇ、４．５ミリモル）の１５ｍＬ ＥｔＯＡｃ中溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（９２８ｍｇ、４．５ミリモル）を添加し、結果として得られる混合物を室温で１６時間撹拌した。
反応混合物を濾過し、濾液をＥｔＯＡｃで洗浄した（２×５ｍＬ）。合したＥｔＯＡｃをＮａＨ２ＰＯ４水溶液およびＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、９５０ｍｇの粗生成物を得た。
粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによりＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（１：３）−（１：１）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収率７００ｍｇ、７８％。
1H NMR (CDCl3)δ 4.41 (2H, s), 4.18 (2H, q), 2.77 (1H, t), 2.34 (2H, dt), 2.17 (2H, bt), 1.40 (3H, t)
【０４７１】
実施例２５：化合物５ｃの調製
【化４４】
Figure 2004535193
化合物５ｃ
【０４７２】
７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（１２５ｍｇ、０．３３ミリモル）（Seela, F.; Synthesis 1996, 726-730により記載されているようにして調製）、トリエチルアミン（６７ｍｇ、０．６６ミリモル）および化合物（５ｂ）（３０５ｍｇ、１．５３ミリモル）の無水ＤＭＦ（７ｍＬ）中溶液を室温で撹拌した。Ｎ２を溶液に２０分間通した。
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（７５ｍｇ、０．０６５ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（２４ｍｇ、０．３３ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーによりＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）（ｖ／ｖ）で溶して精製した。生成物収率１２９ｍｇ、８６％。
【０４７３】
1H NMR (d6 DMSO)δ 11.6 (1H, s), 8.09 (1H, s), 7.63 (1H, s), 6.47 (1H, dd), 5.26 (1H, d), 5.08 (1H, t), 4.42 (2H, s), 4.32 (1H, m), 4.08 (2H, q), 3.81 (1H, m), 3.54 (2H, m), 2.66 (1H, t), 2.46 (1H, m), 2.30 (2H, t), 2.15 (2H, ddd), 1.15 (3H, t)
【０４７４】
実施例２６：化合物５ｄの調製
【化４５】
Figure 2004535193
化合物５ｄ
【０４７５】
化合物（５ｃ）（１１７ｍｇ、２６０マイクロモル）を５００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却した後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（４００μＬストック溶液（１２０ｍｇ／ｍＬ）、３１０マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。
続いて、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（１．００ｍＬ乾燥ＤＭＦ中２００ｍｇ、４２０マイクロモル）およびトリブチルアミン（５００μＬ乾燥ＤＭＦ中１２３．６ｍｇ、６７０マイクロモル）の溶液を０℃で添加した。反応を室温で３分間撹拌し、次いで１ｍｌの１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムを添加することにより停止させた。
【０４７６】
実施例２７：化合物Ｖの調製
【化４６】
Figure 2004535193
化合物Ｖ
【０４７７】
化合物（５ｄ）の反応混合物（２．０ｍＬ）を水（６．０ｍＬ）で希釈し、ＮａＯＨ（２Ｍ、水溶液）を用いてｐＨ１３に調節した。５℃で６４時間インキュベートした後、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（５×５ｍＬ）、ＨＣｌ（２Ｍ、水溶液）を用いてｐＨ７．０に調節し、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（５００μＬ、０．１Ｍ水溶液）で希釈した。
次の緩衝液システムを用いたＷａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム上ＨＰＬＣによりトリホスフェートの粗生成物を精製した：（Ａ）水性酢酸トリエチルアンモニウム（０．１Ｍ、ｐＨ７）および（Ｂ）酢酸トリエチルアンモニウム（０．１Ｍ）を含有するアセトニトリル：水（８０：２０）。勾配タイムテーブルは８項目を含み、それらは次の通りである：
時間 Ａ％ Ｂ％
０．００ ９８ ２
１．００ ９８ ２
１０．００ ９０ １０
１６．００ ８５ １５
１８．００ ６５ ３５
２０．００ ０ １００
２５．００ ０ １００
２５．１０ １００ ０
化合物Ｖおよび化合物５ｄの保持時間は２６０ｎｍでのＵＶ吸収をモニターすることにより測定すると、それぞれ４．８２分および７．２９分であった。純粋な生成物を含有するフラクションをため、水（３ｍＬ）から２回凍結乾燥した。
【０４７８】
実施例２８〜３０：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＶＩ）の調製
実施例２８：ペント−４−イン酸４−オキソ−４Ｈ−ベンゾ［１，２，３］トリアジン−３−イルエステル（６ａ）の調製
【化４７】
Figure 2004535193
【０４７９】
ペンチン酸（２００ｍｇ、２．０４ミリモル）をＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解させた。溶液を食塩水−氷水浴中で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４２１ｍｇ、２．０４ミリモル）のＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液を添加した。５分後、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（３３３ｍｇ、２．０４ミリモル）を添加した。反応混合物を１０℃で１時間撹拌し、次いで室温で２時間撹拌した。ＴＬＣは３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンが完全に変換したことを示した（溶離剤：酢酸エチル）。沈殿した塩を濾過した。濾液を真空中で濃縮し、ヘキサン（４ｍＬ）から結晶化した。結晶を濾過し、乾燥した。収率：４５０ｍｇ、９３％。ＲＦ＝０．８（酢酸エチル）。
【０４８０】
実施例２９：２−ペント−４−イノイルアミノ−コハク酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル４−イソプロピルエステル（６ｂ）の調製
【化４８】
Figure 2004535193
【０４８１】
Ｌ−アスパラギン酸α，β−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０４−１２−５０６６，２００ｍｇ、０．７１ミリモル）をＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。活性化されたエステル６ａ（１７３ｍｇ、０．７１ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１５ｍＬ、０．８６ミリモル）を添加した。混合物を一夜攪拌した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）を添加した。有機相をクエン酸（２×１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液、１０ｍＬ）、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して、シロップを得た。ＮＭＲスペクトルは、該シロップがさらなる合成に十分純粋であることを示した。
1H-NMR (CDCl3):δ 6.6 (1H, NH), 4.6 (1H, CH), 2.8 (2H, CH2), 2.4 (4H, 2 x CH2), 1.9 (1H, CH), 1.2 (18H, 6 x CH3)
【０４８２】
実施例３０：２−｛５−［１−（４−ヒドロキシ−５−（Ｏ−トリホスフェート−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ピリミジン−５−イル］−ペント−４−イノイルアミノ｝−コハク酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＶＩ）の調製
【化４９】
Figure 2004535193
【０４８３】
ヌクレオチド（２０ｍｇ、０．０２２ミリモル）を水−エタノール（１：１、２ｍＬ）中に溶解させた。溶液を脱気し、アルゴン雰囲気下に保持した。A.L. Casalnuovo et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4324-4330に従って調製した触媒Ｐｄ（ＰＰｈ２（ｍ−Ｃ６Ｈ５ＳＯ３Ｎａ＋））４（２０ｍｇ、０．０１６ミリモル）、トリエチルアミン（０．０２ｍＬ、０．１ミリモル）およびアルキン（化合物６ｂ）（２０ｍｇ、０．０６１ミリモル）を添加した。Ｃｕｌの結晶を若干添加した。反応混合物を６時間攪拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム→１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム中２０％アセトニトリル）による精製後に、ＬＨ８０３７のトリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR (D2O): δ 8.1 (1H, CH), 6.2 (1H, CH), 4.8 (1H, CH), 4.6 (1H, CH), 4.1 (3H, CH, CH2), 2.8 (2H, CH2), 2.7 (2H, CH2), 2.5 (2H, CH2), 2.3 (2H, CH2), 1.4 (18H, 6 x CH3)
組み込み直前または組み込み後に、保護ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル基を切断させて、対応する遊離カルボン酸を得ることができる。
【０４８４】
実施例３１〜３２：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＶＩＩ）の調製
実施例３１：２−｛５−［４−アミノ−１−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−５−イル］−ペント−４−イノイルアミノ｝−コハク酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ａ）の調製
【化５０】
Figure 2004535193
【０４８５】
化合物ＶＩの合成について記載された手順を用いて、化合物（６ｂ）（１４０ｍｇ、０．４３ミリモル）および５−ヨード−２−デオキシシチジン（１００ｍｇ、０．２８ミリモル）から化合物（７ａ）（３０ｍｇ、１９％）を得た。1H-NMR (MeOD-D3): δ 8.3 (1H, CH), 6.2 (1H, CH), 4.8 (1H, CH), 4.6 (1H, CH), 4.4 (1H, CH), 4.0 (1H, CH), 3.8 (2H, CH2), 2.8 (4H, 2 x CH2), 2.7 (2H, CH2), 2.4 (1H, CH2), 2.2 (1H, CH2), 1.4 (18H, 6 x CH3)
【０４８６】
実施例３２：２−｛５−［４−アミノ−１−（４−ヒドロキシ−５−（Ｏ−トリホスフェート−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−５−イル］−ペント−４−イノイルアミノ｝−コハク酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物ＶＩＩ）の調製
【化５１】
Figure 2004535193
【０４８７】
ホスホロキシクロリド（６．０μｌ、０．０５９ミリモル）を、７ａ（３０ｍｇ、０．０５４ミリモル）のトリメチルホスフェート（１ｍＬ）中冷却溶液（０℃）に添加した。混合物を１時間撹拌した。ビス−ｎ−トリブチルアンモニウムピロホスフェート（７７ｍｇ、０．１６ミリモル）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液およびトリブチルアミン（４０μｌ、０．１６ミリモル）を添加した。水（２ｍＬ）を添加した。溶液のｐＨを測定すると中性であった。溶液を室温で３時間、５℃で一夜撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：１００ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート→１００ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート中２０％アセトニトリル）による精製後、少量の化合物ＶＩＩ（数ミリグラム）を得た。７ａ（１８ｍｇ）を回収した。
組み込み直前または組み込み後に、保護ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル基を切断させて、対応する遊離カルボン酸を得ることができる。
【０４８８】
実施例３３および３４：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＶＩＩＩ）の調製
実施例３３：２−ペント−４−イノイルアミノ−６−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）−ヘキサン酸（８ａ）の調製
【化５２】
Figure 2004535193
【０４８９】
化合物６ａ（２５０ｍｇ、１．０ミリモル）を、Ｎ−ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−５２４５）（２５０ｍｇ、１．０ミリモル）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に添加した。エチルジイソプロピルアミン（０．２ｍＬ、１．２ミリモル）を添加した。溶液を室温で一夜撹拌し、ＲＰ−ＨＰＬＸ（溶離剤：水→メタノール）により分析した。収率；５０ｍｇ、１５％。1H-NMR (D2O): δ 4.4 (1H, CH), 3.4 (2H, CH2), 2.5 (4H, 2 x CH2), 2.3 (1H, CH), 1.9 (1H, CH2), 1.8 (1H, CH2) 1.6 (2H, CH2), 1.5 (2H, CH2)
【０４９０】
実施例３４：２−｛５−［１−（４−ヒドロキシ−５−（Ｏ−トリホスフェート−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−２，４−ジオキソ１，２，３，４−テトラヒドロ−ピリミジン−５−イル］−ペント−４−イノイルアミノ｝−６−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（化合物ＶＩＩＩ）の調製
【化５３】
Figure 2004535193
【０４９１】
化合物８ａ（５０ｍｇ、０．１５ミリモル）および５−ヨード−２−デオキシウラシル（５０ｍｇ、０．０６ミリモル）から、化合物ＶＩの合成について記載された方法を用いて、化合物ＶＩＩＩのトリエチルアンモニウム塩（１１ｍｇ）を得た。
【０４９２】
実施例３５〜３９：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＩＸ）の調製
実施例３５：ジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルアミド（化合物９ａ）Ｃ１９Ｈ３３Ｎ３Ｏ５Ｍｗ３８３．４８の調製
【化５４】
Figure 2004535193
【０４９３】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＳｕ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０４−１２−００１７、０．８８７ｇ、２ミリモル）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。プロパルギルアミン（０．４１２ｍｌ、６ミリモル）を添加し、溶液を２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘプタン１：１）は生成物が１つであることを示した。ジクロロメタン（２０ｍｌ）を添加し、混合物を連続して、クエン酸（１Ｍ、１０ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム（１０ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて、無色シロップ状の化合物９ａ（０．７３０ｇ）を得た。
1H-NMR: d 6.55 (1H, NH), 5.15 (1H, NH), 4.6 (1H, CH-NH), 4.05 (2H, CH-C-CH 2 -N), 3.75 (1H, NH), 3.1 (2H, CH 2 -NH) 2.25 (1H, CH-C-CH2), 1.9-1.3 (6H, 3 x CH2), 1.4 (18H, 6 x CH3)
【０４９４】
実施例３６：５−ヨード−３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−２’−デオキシウリジン（化合物９ｂ）Ｃ１７Ｈ２７ＩＮ２Ｏ６ＳｉＭｗ５１０．４０の調製
【化５５】
Figure 2004535193
【０４９５】
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−７１２５、２．５０ｇ、７．０６ミリモル）およびイミダゾール（０．９６１ｇ、１４．１２ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。０℃に冷却し、ＴＢＤＭＳＣｌ（ｔ−ブチル−ジメチル−クロリド、１．１２ｇ、７．４１ミリモル）のジクロロメタン（５．０ミリモル）中溶液を２０分にわたって流した。撹拌を室温で１８時間続け、混合物を蒸発させた。粗モノシリル化ヌクレオシドをピリジン（４０ｍｌ）中に溶解させ、０℃に冷却した。無水酢酸（４．０ｍｌ、４２．３ミリモル）を３０分にわたって添加し、撹拌を室温で１８時間続けた。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン（２０ｍｌ）中に溶解させ、クエン酸（２Ｍ、２０ｍｌ）を添加した。水性相をジクロロメタンで逆抽出した（２×２０ｍｌ）。合した有機相を飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた（５．８５ｇ）。酢酸エチル／ＥｔＯＨから再結晶して、９ｂ（２．５４ｇ）を得、合成ＴＬＣ（酢酸エチル）について純粋であった。さらに、再結晶により分析的に純粋なサンプルを得た（融点１７２．４〜１７３．１℃）。
【０４９６】
実施例３７：５−ヨード−３’−アセチル−２’−デオキシウリジン（化合物９ｃ）Ｃ１１Ｈ１３ＩＮ２Ｏ６Ｍｗ３９６．１４の調製
【化５６】
Figure 2004535193
【０４９７】
ＴＨＦ（２５ｍｌ）中に溶解させた５−ヨード−３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−２’−デオキシウリジン（化合物９ｂ）（２．５４ｇ、４．９８ミリモル）、テトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（ＴＢＡＦ、３．２ｇ、１０．１ミリモル）を添加し、室温で１８時間撹拌した。反応混合物に水（２５ｍｌ）を添加し、１時間撹拌した。イオン交換樹脂ＩＲ−１２０Ｈ＋（２６ｍｌ）を次に添加し、撹拌を１時間続けた。溶液を濾過し、真空中で約１０ｍｌに濃縮した。結晶を集め、真空中で乾燥させた（１．２９６ｇ）。
【０４９８】
実施例３８：５−ヨード−５’−トリホスフェート−２’−デオキシウリジン、トリエチルアンモニウム塩（化合物９ｄ）Ｃ９Ｈ１４ＩＮ２Ｏ１４Ｐ３＋ｎ−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３Ｍｗ８９７．６１の調製
【化５７】
Figure 2004535193
【０４９９】
５−ヨード−３’−Ｏ−アセチル−２’−デオキシウリジン（化合物９ｃ）（２．５４ｇ、４．９８ミリモル）をピリジン（３．２ｍｌ）およびジオキサン（１０ｍｌ）中に溶解させた。２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのジオキサン中溶液（３．６０ｍｌ、１Ｍ、３．６０ミリモル）を撹拌下で添加した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、続いて同時に、ＤＭＦ中ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート（９．８１ｍｌ、０．５Ｍ、４．９１ミリモル）およびトリ−ｎ−ブチルアミン（３．１２ｍｌ、１３．１ミリモル）を添加した。撹拌を１０分間続け、ヨウ素の色が変わらなくなるまでヨウ素溶液（９０ｍｌ、１％ｗ／ｖピリジン／水（９８／２、ｖ／ｖ）中）を添加することにより、中間体を酸化した。反応混合物を１５分間放置し、次いでチオ硫酸ナトリウム（５％水性溶液、ｗ／ｖ）で脱色した。反応混合物を蒸発させて、黄色油状物を得た。油状物を水（２０ｍｌ）中で３０分間撹拌し、濃アンモニア水（１００ｍｌ、２５％）を添加した。この混合物を１．５時間室温で撹拌し、次いで蒸発させて、粗トリホスフェート生成物の油状物を得た。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５カラム（約１００ｍｌ）を用い、０．０５Ｍ〜１．０Ｍ（ｐＨ約７．０〜７．５）の炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）の直線的勾配で溶出して（流れ８ｍｌ／フラクション／１５分）、粗物質を精製した。ＲＰ１８ＨＰＬＣにより、１０ｍＭの水中ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）から１０ｍＭ ＴＥＡＡ２０％アセトニトリル中水で溶出して、正のフラクションを同定した。適当なフラクションをプールし、蒸発させた。収量約１０４２ｍｇ。
【０５００】
実施例３９：５−（リシン−プロパルギルアミド）−５’−トリホスフェート−２’−デオキシシチジン、トリエチルアンモニウム塩（化合物ＩＸ）Ｃ１８Ｈ３０Ｎ５Ｏ１５Ｐ３＋ｎ・Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３Ｍｗ９５２．９５（ｎ＝３）の調製
【化５８】
Figure 2004535193
【０５０１】
５−ヨード−３’−アセチル−５’−トリホスフェート−２’−デオキシウリジン、トリエチルアンモニウム塩（化合物９ｄ）（０．００８７ｇ、９．７マイクロモル）を水（１００μｌ）中に溶解させた。空気を注意してアルゴンと置換した。ジオキサン（１００μｌ）中に溶解させたジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルアミド（化合物９ａ）（１８．６ｍｇ、４８．５マイクロモル）、トリエチルアミン（２．７μｌ、１９．４μｌ）、Ｐｄ（（ＰＰｈ２）（ｍ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ＋）・（Ｈ２Ｏ））４（化合物９ｄ）（５ｍｇ、４．４マイクロモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（５ｍｇ、４．４マイクロモル）を表示した順序で添加した。反応混合物を室温で１８時間不活性雰囲気中で撹拌し、次いで蒸発させた。粗物質を水性塩酸（０．２Ｍ、１ｍｌ）で１５分間３０℃で処理した。ＨＰＬＣ Ｃ１８ １０ｍＭ 水中ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）から１０ｍＭ ＴＥＡＡ２０％アセトニトリル中水により、（化合物ＩＸ）を得た。ゲル濾過（ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇ−１０、０．７ｍｌ）を用いて適当なフラクションを脱塩した。
【０５０２】
実施例４０〜４５：モノヌクレオチドビルディングブロック（Ｘ）の調製
実施例４０：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨ（化合物１０ａ）Ｃ１６Ｈ３０Ｎ２Ｏ６Ｍｗ３４６．４２の調製
リシン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０４−１０−００２４；３．６５ｇ、２０ミリモル）を水酸化ナトリウム（２Ｍ、４０ｍｌ）中に溶解させ、ジオキサン（６０ｍｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（８．７３ｇ、４０ミリモル）を表示した順序で添加した。混合物を１．７５時間６０℃で撹拌した。水（５０ｍｌ）を添加し、溶液をジクロロメタンで洗浄した（４×２５ｍｌ）。水性相を氷で０℃に冷却し、２Ｍ ＨＣｌ（ｐＨ＝３）で酸性にし、ジクロロメタンで抽出した（４×２５ｍｌ）。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発により、無色油状物として化合物１０ａ６．８ｇを得た。
1H-NMR: d 9.5 (1H, COOH), 5.3 (1H, CH), 4.7 (1H, NH), 4.3 (1H, NH), 3.1 (2H, CH2-NH), 1.8 (2H, CH 2 -CH), 1.5(6H, 3xCH2), 1.45 (18H, 6 x CH3)
【０５０３】
実施例４１：ジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルエステル（化合物１０ｂ）Ｃ１９Ｈ３２Ｎ２Ｏ６Ｍｗ３８４．４７の調製
【化５９】
Figure 2004535193
【０５０４】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨ（化合物１０ａ）（３．４６ｇ、１０ミリモル）をＴＨＦ（２５ｍｌ）中に溶解させた。０℃で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０２ｇ、１０ミリモル）のＴＨＦ（２５ｍｌ）中溶液およびトリエチルアミン（１．３９ｍｌ）を表示した順序で添加した。混合物を室温まで暖め、１８時間撹拌した。結果として得られる懸濁液を濾過し、蒸発させた。油状物（５．４５ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル３：１）により予備精製した。
ＨＰＬＣ−Ｃ１８ １０％ＭｅＯＨ：９０％Ｈ２Ｏ→１００％ＭｅＯＨにより、純粋な１０ｂを得た。
1H-NMR: d 5.1 (1H, NH), 4.75 (2H, CH-C-CH 2 -O), 4.6 (1H, NH), 4.35 (1H, CH-NH), 3.1 (2H, CH 2 -NH) 2.5 (1H, CH-C-CH2), 1.9-1.4 (6H, 3 x CH2), 1.5 (18H, 6 x CH3)
【０５０５】
実施例４２：５−ヨード−３’，５’−ジ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−２’−デオキシシチジン（化合物１０ｃ）Ｃ２１Ｈ４０ＩＮ３Ｏ４Ｓｉ２Ｍｗ５８１．６４の調製
【化６０】
Figure 2004535193
【０５０６】
５−ヨード−２−デオキシ−シチジン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−７０００、０．３５３ｇ、１ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ）中に溶解させ、ｔ−ブチル−ジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、０．３３２ｇ、２．２ミリモル）およびイミダゾール（０．２０４ｇ、３ミリモル）を添加した。溶液を１５時間５０℃で撹拌し、続いて蒸発させた。ジクロロメタン（２５ｍｌ）およびクエン酸（２Ｍ、１０ｍｌ）を乾燥混合物に添加した。水性相をジクロロメタンで逆抽出した（２×１０ｍｌ）。合した有機相を飽和炭酸水素ナトリウム（１５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。ＥｔＯＨ／酢酸エチルから再結晶することにより、化合物１０ｃ（０．４０５ｇ）を得た。
1H-NMR: d 8.1 (1H, H-6), 6.25 (1H, H-1'), 4.35 (1H, H-4'), 4.0 (1H, H-4'), 3.9 (1H, H-5'), 3.75 (1H, H-5'), 2.5 (1H, H-2'), 1.95 (1H, H-2'), 1.85 (2H, NH), 0.95 (9H, 3 x CH3), 0.9 (9H, 3 x CH3), 0.15 (6H, 2 x CH3), 0.1 (6H, 2 x CH3)
【０５０７】
５−（ジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルエステル）−３’，５’−ジ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−２’−デオキシウリジン（化合物１０ｄ）Ｃ４０Ｈ７１ＩＮ５Ｏ１０Ｓｉ２Ｍｗ８３８．１９の調製
【化６１】
Figure 2004535193
【０５０８】
化合物１０ｃ（０．１１６ｇ、０．２ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍｌ）中に溶解させた。空気を注意深くアルゴンと置換した。ジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルエステル（化合物１０ｂ）（０．２３２、０．６ミリモル）、トリエチルアミン（０．０８３ｍｌ、０．６ミリモル）、ジ−クロロ−ビス−トリフェニルホスフィン−パラジウムＩＩ（０．００７４ｇ、０．０１ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（０．００３８ｇ、０．０２ミリモル）を表示した順序で添加した。反応混合物を１５時間室温で不活性雰囲気中で撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ１：１中に再溶解させ、ＨＰＬＣ−Ｃ１８４５％Ｈ２Ｏ：５５％ＭｅＣＮ→１００％ＭｅＣＮを用いて精製した。
【０５０９】
1H-NMR: d 1H-NMR: d 8.2 (1H, H-6), 6.25 (1H, H-1'), 5.15 (1H, NH), 4.9 (2H, C-CH 2 -O), 4.6 (1H, NH), 4.4 (1H, H-4'), 4.3 (1H, CH-NH), 4.0 (1H, H-4'), 3.9 (1H, H-5'), 3.75 (1H, H-5'), 2.5 (1H, H-2'), 3.1 (2H, CH 2 -NH), 1.95 (1H, H-2'), 1.9-1.4 (6H, 3 x CH2), 1.85 (2H, NH), 1.5 (18H, 6 x CH3), 0.95 (9H, 3 x CH3), 0.9 (9H, 3 x CH3), 0.15 (6H, 2 x CH3), 0.1 (6H, 2 x CH3)
【０５１０】
実施例４４：５−（ジ−Ｂｏｃ−リシン−プロパルギルエステル）−２’−デオキシシチジン（化合物１０ｅ）Ｃ２８Ｈ４３ＩＮ５Ｏ１０Ｍｗ６０９．６７の調製
【化６２】
Figure 2004535193
【０５１１】
化合物１０ｄ（０．０２４６ｇ、０．０２９ミリモル）をＴＨＦ（１ｍｌ）中に溶解させ、連続して酢酸（０．０１６５ｍｌ、０．２８８ミリモル）およびテトラｎ−ブチルアンモニウムフルオリド三水和物（０．０４５４ｇ、０．１４４ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌し、その後、蒸発させた。ジクロロメタン中に再溶解させ、シリカ（１×１８ｃｍ）上で精製した。ジクロロメタン／ＭｅＯＨ８：２。ＴＬＣ上でＵＶ吸収を示すフラクションをプールし、蒸発させて、無色油状物として（０．０１２８ｇ）を得た。
【０５１２】
実施例４５：５−（リシン−プロパルギルエステル）−５’−トリホスフェート−２’−デオキシシチジンＣ１８Ｈ３０Ｎ５Ｏ１５Ｐ３Ｍｗ６４９．３８の調製
【化６３】
Figure 2004535193
【０５１３】
化合物１０ｅ（０．０１２８ｇ、０．０２１ミリモル）をトリメチルホスフェート（０．１５０ｍｌ）中に溶解させ、０℃に冷却した。トリメチルホスフェート中ホスホロキシクロリド（１Ｍ、０．０２４６ｍｌ）を、温度を上昇させないようにゆっくりと添加した。撹拌を２時間０℃で続け、温度を周囲温度まで上昇させた。ＤＭＦ中ピロホスフェート（０．５Ｍ、０．１０２５ｍｌ、０．０５１ミリモル）およびＤＭＦ中トリ−ｎ−ブチルアミン（１Ｍ、０．０１２２ｍｌ、０．０５１ミリモル）を同時に添加した。撹拌を１５分間室温で続け、ＴＥＡＢ（炭酸水素トリエチルアンモニウム、１Ｍ、ｐＨ＝７．３、０．５０ｍｌ）を添加した。撹拌を３時間続け、次いで蒸発させた。
【０５１４】
実施例４６：化合物Ｘの調製
【化６４】
Figure 2004535193
【０５１５】
粗物質を水性塩酸（０．２Ｍ、１ｍｌ）で１５分３０℃で処理した。ＨＰＬＣ Ｃ１８１０ｍＭ 水中ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）から１０ｍＭ ＴＥＡＡ２０％アセトニトリル中水により、化合物Ｘを得た。ゲル濾過（ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇ−１０、０．７ｍｌ）を用いて適当なフラクションを脱塩した。
【０５１６】
実施例４７〜５１：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＸＩ）の調製
実施例４７：３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（化合物１１ａ）の調製。Ｃ３２Ｈ３１ＩＮ２Ｏ８。Ｍｗ６９８．５１ｇ／モル。（”Oligonucleotide Synthesis - a practical approach”(1984) Gait, M.J. (Ed.), IRL Press, Oxford.と類似）
【化６５】
Figure 2004535193
【０５１７】
ピリジン（２５ｍｌ、３回）と同時蒸発させることにより、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３．５４ｇ、１０ミリモル）を乾燥した。ピリジン（１００ｍｌ）を添加し、短時間蒸発させて、体積を減少させた（８０ｍｌ）。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、３．３８ｇ、１０ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。２０時間後、追加のＤＭＴ−Ｃｌ（０．６８ｇ、２ミリモル）を添加し、反応混合物をさらに４時間撹拌した。過剰のＤＨＴ−Ｃｌをメタノール（５ｍｌ、１０分間撹拌）で不活化し、反応混合物を蒸発乾固させた。油状物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解させ、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ）で抽出した。水性相をジクロロメタンで逆抽出し、合したジクロロメタンのフラクションを無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させた。粗油状物をジクロロメタン（７５ｍｌ）中に溶解させ、ペンタン（２５０ｍｌ）で磨砕した。酢酸エチル（７５ｍｌ）中に溶解させ、ペンタン（２５０ｍｌ）を添加することにより、粗油状物を再磨砕して、蒸発後に赤色泡状物を得た。粗５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンの収量は５．８４ｇであった。シリカ（Ｍｅｒｃｋ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ、ａｒｔ．９３８５）上ジクロロメタン中カラムクロマトグラフィー（メタノールの勾配（０〜５％ジクロロメタン中メタノール）で溶出）により、純粋なＳ’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｓ−ヨード−２’−デオキシウリジンを得た。精製５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンの収量は４．２６ｇ（６．５ミリモル、６５％）であった。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（６．０ｇ、９．１ミリモル）をピリジン（１０ｍｌ、２回）と同時に蒸発させることにより乾燥した。ピリジン（５０ｍｌ）を添加し、無水酢酸（５ｍｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、触媒量）を添加した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。過剰の無水酢酸をメタノール（１０ｍｌ、１５分撹拌）で不活化し、反応混合物を蒸発乾固した。油状物をジクロロメタン（１５０ｍｌ）中に溶解させ、水性飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍｌ）で抽出した。水性相をジクロロメタンで逆抽出し、合したジクロロメタンのフラクションを無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させた。シリカ（Ｍｅｒｃｋ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ、ａｒｔ．９３８５）上ジクロロメタン／メタノール（９８／２、ｖ／ｖ）中カラムクロマトグラフィー（メタノールの勾配（２〜６％ジクロロメタン中メタノール）で溶出）により精製３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンを得た。収量は５．７５ｇ（８．２ミリモル）であった。ジクロロメタン／ペンタン（８０／２０、ｖ／ｖ）中再クロマトグラフィー（メタノール（２〜６’）の勾配で溶出）により、所望の精製３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（４．１８ｇ、６．０ミリモル、６０％）を得た。
【０５１８】
実施例４８；Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミドプロピン（化合物１１ｂ）の調製。Ｃ５Ｈ４Ｆ３ＮＯ。Ｍｗ１５１．０９ｇ／モル。（参考文献：Cruickshank et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29, 5221-5224）
【化６６】
Figure 2004535193
【０５１９】
プロパルギルアミン（７．０ｍｌ、５．８８ｇ、０．１１モル）を１００ｍｌの氷冷されたメタノール中に溶解させ、トリフルオロ酢酸エチル（１８ｍｌ、１９．２ｇ、０．１３５モル）を氷上撹拌しながらゆっくり添加した。氷浴をはずし、反応混合物を室温まで昇温させ、撹拌を一夜続けた。２４時間後、ＴＬＣ分析（シリカ、ジクロロメタン／メタノール、９／１、ｖ／ｖ）は、プロパルギルアミンが完全に変換したことを示した（１１０℃、ニンヒドリン試験で陽性の呈色反応の消失により観察された）。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン（１００ｍｌ）中に再溶解させ、水性炭酸水素ナトリウムで抽出した。水性相をジクロロメタン（２５ｍｌ）で逆抽出し、合したジクロロメタン相を水（１００ｍｌ）で抽出した。水性相をジクロロメタン（２５ｍｌ）で逆抽出し、合したジクロロメタン相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて、黄色油状物を得た。油状物を蒸留により精製し、３８〜３９℃／１ｍｍＨｇで精製された生成物を集めた。収量１１．０ｇ（７３ミリモル、６６％）。
【０５２０】
実施例４９：３’−Ｏ−アセチル−５’−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（化合物１１ｃ）の調製。Ｃ３５Ｈ３５Ｎ３Ｏ８。Ｍｗ６２５．６７ｇ／モル。
【化６７】
Figure 2004535193
【０５２１】
３’−Ｏ−アセチル−５’−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（４．１５ｇ、６．０ミリモル）を酢酸エチル（２４０ｍｌ）中に溶解させ、Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミノプロピン（１．８１ｇ、１２ミリモル）、トリエチルアミン（３．０９ｇ、４．２３ｍｌ、３０．５ミリモル）、ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（ＩＩ）クロリド（０．０９１ｇ、０．１３ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（０．０９１ｇ、０．４８ミリモル）を表示した順序で添加した。反応混合物を窒素でフラッシュした。周囲温度で栓をし、撹拌した。反応をＴＬＣ分析（シリカ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）により追跡し、２４時間後停止させると、全ての出発物質は消費されていた。反応混合物を水性ＥＤＴＡ（５％ｖ／ｖ、３００ｍｌ）で２回、水性チオ硫酸ナトリウム（５％ｖ／ｖ、３００ｍｌ）で１回抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、酢酸エチルの合したフラクションを乾燥し（無水ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。ジクロロメタン／ペンタン（８０／２０、ｖ／ｖ）中カラムクロマトグラフィー（メタノールの勾配（０〜５％）で溶出）により、褐色油状物として粗３’−Ｏ−アセチル−５’−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（４．２ｇ）を得た。酢酸エチル／ペンタン（５０／５０〜６０／４０、ｖ／ｖ）中再クロマトグラフィーにより、所望の精製された生成物を得た（１．９９ｇ、３．２ミリモル）。
【０５２２】
実施例５０：３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミドプロピニル）−２’−デオキシウリジンの調製。Ｃ１６Ｈ１６Ｆ３Ｎ３Ｏ７。Ｍｗ４１９．３１ｇ／モル。
【化６８】
Figure 2004535193
【０５２３】
３’−Ｏ−アセチル−５’−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミドプロピニル）−２’−デオキシウリジン（１．９９ｇ、２．８ミリモル）をジクロロメタン（１３３ｍｌ）中に溶解し、０℃に冷却した。トリクロロ酢酸のジクロロメタン中溶液（３％ ｗ／ｖ）をゆっくりと添加し、反応混合物を１５分間０℃で撹拌した。ＴＬＣ分析（シリカ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５／５ｖ／ｖ）により、全体的な脱トリチル化が確認され、２−プロパノール（１０ｍｌ）の添加により反応を停止させ、ＤＭＴ＋の消滅は、オレンジから無色への色の変化により観察された。撹拌を２分間続け、反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ）中に注ぎ、ジクロロメタンで２回抽出した。水性相をジクロロメタンで逆抽出し、合したジクロロメタンのフラクションを乾燥し（無水ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。泡状物をジクロロメタン（５０ｍｌ）中に溶解させ、ペンタン（２００ｍｌ）で磨砕した。磨砕を繰り返し、沈殿を再溶解させ、はじめにメタノールから、次いでクロロホルムから蒸発させ、黄色泡状物を得た。ジクロロメタン／メタノール（勾配：９５／５から８９／１１、ｖ／ｖ）中シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、精製された３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミドプロピニル）−２’−デオキシウリジンを得た。収量は、再クロマトグラフィー後（ジクロロメタン／メタノール（９８／２から９５／５、ｖ／ｖ）中勾配で溶出）、０．３７ｇであった。
【０５２４】
実施例５１：５−（３−アミノプロピル）−５’−トリホスフェート−２’−デオキシウリジン、トリエチルアンモニウム塩（化合物ＸＩ）の調製。Ｃ１２Ｈ１８Ｎ３Ｏ１４Ｐ３＋ｎ−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３。ｎ＝３についてＭｗ８２４．７８ｇ／モル。（Ludwig, J. and Eckstein, F. (1989) J. Org. Chem. 54, 631-635）
【化６９】
Figure 2004535193
【０５２５】
３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミドプロピニル）−２’−デオキシウリジン（４２．５ｍｇ、０．１０ミリモル）を無水ピリジン（２ｍｌ）中に溶解させ、蒸発させた。油状物を無水ピリジン（１００μｌ）および無水ジオキサン（３００μｌ）中に溶解させた。２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのジオキサン中溶液（１１０μｌ、１Ｍ、０．１１ミリモル）を撹拌下に添加し、３０秒後、ピリジニウムヒドロクロリドの沈殿が観察された。反応混合物を１０分間室温で撹拌し、続いて同時にＤＭＦ中ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート（３００μｌ、０．５Ｍ）およびトリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）を添加した。撹拌を１０分間続け、ヨウ素溶液（３ｍｌ、ピリジン／水中１％ｗ／ｖ（９８／２、ｖ／ｖ））をヨウ素の色が変わらなくなるまで添加することにより中間体を酸化した。反応混合物を１５分間放置し、次いでチオ硫酸ナトリウム（４滴、５％水性溶液、ｗ／ｖ）で脱色した。反応混合物を水を用いて丸底フラスコ（５０ｍｌ）に移し、蒸発させて、黄色油状物を得た。油状物を水（１０ｍｌ）中３０分間撹拌し、濃アンモニア水（２０ｍｌ、３２％）を添加した。この混合物を１時間室温で撹拌し、次いで蒸発させて、粗トリホスフェート生成物の油状物を得た。粗物質を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５カラム（約１００ｍｌ）（０．０５Ｍから１．０Ｍ（ｐＨ約７．５〜８．０）；流れ８ｍｌ／フラクション／１５分）の炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）の直線的勾配で溶出）を用いて精製した。ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（水中１０ｍＭ ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）から１０ｍＭＴＥＡＡ２０％アセトニトリル中水の勾配で溶出）により陽性のフラクションを同定した。適当なフラクションをプールし、蒸発させた。収量約９０ｍｇ。
【０５２６】
実施例５２〜５４：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＸＩＩ）の調製
実施例５２：コハク酸モノ−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピル）エステル（化合物１２ａ）の調製
【化７０】
Figure 2004535193
【０５２７】
トリエチルアミン（５．０ｍＬ、３６ミリモル）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（７．０ｇ、３２ミリモル）を３−アミノプロパノール（１．０ｇ、２６．６ミリモル）のメタノール（１０ｍＬ）中溶液に添加した。溶液を２時間室温で撹拌した。メタノールを蒸発させ、残留物を水（５０ｍＬ）中に溶解させ、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。粗物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解させた。トリエチルアミン（５．０ｍＬ、３６ミリモル）および無水コハク酸（３．０ｇ、３０ミリモル）を数回に分けて溶液に添加した（発熱反応）。反応混合物を２時間撹拌し、次いで濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：水→メタノール）により分析した。収率６．０ｇ、８２％。1H-NMR (CDCl3): δ 4.2 (2H, CH2), 3.2 (2H, CH2), 2.7 (4H, 2 x CH2), 1.8 (2H, CH2), 1.4 (9H, 3 x CH3)
【０５２８】
９−［４−（イソプロピル−ジメチル−シラニルオキシ）−５−（イソプロピル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−テトラヒドロ−フラン−２−イル］−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（化合物１２ｂ）
【化７１】
Figure 2004535193
【０５２９】
イミダゾール（２．０ｇ、２９．４ミリモル）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３．０ｇ、１９．９ミリモル）をデオキシアデノシン一水和物（１．３３、４．９４モル）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液に添加した。溶液を６０℃で一夜撹拌した。混合物を真空中で濃縮して固体にした。フラッシュクロマトグラフィーにより分析して、結晶性化合物１２ｂを２．１ｇ、９５％の収率で得た。1H-NMR (CDCl3): δ 8.3 (1H, HC=), 8.1 (1H, HC=), 6.4 (1H, CH), 6.0 (2H, 2 x OH), 4.6 (1H, CH), 4.1 (1H, CH), 3.9 (1H, CH), 3.8 (1H, CH), 2.6 (1H, CH2), 2.4 (1H, CH2), 0.9 (18H, 6 x CH3), 0.0 (12H, 4 x CH3)
【０５３０】
実施例５３：Ｎ−［９−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−スクシナミン酸３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピルエステル（化合物１２ｄ）
【化７２】
Figure 2004535193
【０５３１】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（３６６ｍｇ、１．７８ミリモル）の酢酸エチル（１５ｍＬ）中溶液を、氷水で冷却した、１２ａ（４８８ｍｇ、１．７８ミリモル）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中溶液に添加した。４−ジメチルアミノピリジンと１２ｂ（８５０ｍｇ、１．７８ミリモル）のわずかな結晶を添加した。反応温度をゆっくりと室温まで上昇させ、混合物を一夜撹拌した。沈殿した塩を濾過した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して固体にした。フラッシュクロマトグラフィー後、約２０ｍｇの１２ｃを単離し、５１０ｍｇの出発物質１２ｂを回収した。１２ｃ（２０ｍｇ）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解させた。テトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（１００ｍｇ）および酢酸（０．２ｍＬ）を添加した。混合物を１日間撹拌し、次いで真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより分析した。収量１０ｍｇ。化合物１２ｃ 1H-NMR (CDCl3): δ 8.4 (1H, HC=), 8.2 (1H, HC=), 6.4 (1H, CH), 5.8 (2H, 2 x OH), 4.6 (1H, CH), 4.2 (2H, CH2), 4.1 (1H, CH), 3.8 (1H, CH), 3.7 (2H, CH2), 3.0 (4H, 2 x CH2), 2.7 (3H, 2 x CH2), 2.4 (1H, CH2), 1.8 (2H, CH2), 1.4 (9H, 3 x CH3), 0.9 (18H, 6 x CH3), 0.0 (12H, 4 x CH3). Selected NMR data for 12d: 1H-NMR (MeOD-D3): δ 4.6 (1H, CH), 4.1 (2H, CH2), 3.8 (1H, CH), 3.7 (1H, CH), 3.6 (2H, CH2), 3.2 (2H, CH2), 3.0 (2H, CH2),
2.8 (3H, 2 x CH2), 2.5 (1H, CH2), 1.8 (2H, CH2), 1.4 (9H, 3 x CH3)
【０５３２】
実施例５４：Ｎ−［９−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル］スクシナミン酸３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロリルエステル
【化７３】
Figure 2004535193
【０５３３】
化合物ＶＩＩの合成に関して記載した手順を用いてＬＨ８０７５ｂ（１０ｍｇ）を対応するトリホスフェートＬＨ８０７５ｃに変換した。ＴＬＣは化合物１２ｄが完全に変換されたことを示した。
組み込み直前に、ｔｅｒｔ−ブトキシ基を加水分解して遊離カルボン酸を放出させることができる。鋳型分子の形成後に別法として、ｔｅｒｔ−ブトキシ基を切断させることができる。
【０５３４】
実施例５５：Ｎ−［９−（４−ヒドロキシ−５−（Ｏ−トリホスフェート−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−スクシナミン酸（化合物ＸＩＩＩ）
【化７４】
Figure 2004535193
【０５３５】
ｄＡＴＰ（５マイクロモル）をＤＭＦ（４×１ｍＬ）中に懸濁させ、真空中で４回濃縮して固体にした。固体をＤＭＦ（１ｍＬ）中に懸濁した。無水コハク酸（５ｍｇ、０．０５ミリモル）を−２０℃で添加した。混合物を３時間撹拌し、次いで濃縮して固体にし、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：０．１％水中ＨＣＯＯＨ→１０％メタノール、０．１％水中ＨＣＯＯＨ）により精製した。精製された物質を水性アンモニア（２５％、１ｍＬ）中に溶解させ、３時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：０．１％水中ＨＣＯＯＨ→１０％メタノール、０．１％水中ＨＣＯＯＨ）により分析した。出発物質との比較により、生成物は出発物質よりも４０秒遅くカラムから溶出されることが示された。
【０５３６】
実施例５６および５７：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＸＩＶ）の調製
実施例５６：ベンジルオキシ−エチニル−ジイソプロイル−サリン（化合物１４ａ）
【化７５】
Figure 2004535193
【０５３７】
ベンジルアルコール（０．１ｍＬ、１．０ミリモル）のＴＨＦ（０．５ｍＬ）中溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）、ジクロロジイソプロピルシラン（０．３ｍＬ、１．６２ミリモル）のＴＨＦ（４ｍＬ）中冷却（−７８℃）溶液に滴下した。溶液を３時間撹拌した（−７８→−２０℃）。混合物を−７８℃に冷却し、リチウムアセチリド−エチレンジアミン複合体（２５０ｍｇ、２．７１ミリモル）を添加した。反応混合物を５時間撹拌した（−７８→２０℃）。水（４ｍＬ）を添加した。混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー後に化合物１４ａ（１００ｍｇ、４１％）を得た。1H-NMR (CDCl3): δ 7.4 (5H, 5 x HC=), 5.0 (2H, CH2), 2.6 (1H, CH), 1.0 (14H, 2 x CH, 2 x CH3)
【０５３８】
実施例５７：５−｛［ジイソプロピル−（２−メチレン−ペント−３−エニルオキシ）−シラニル］−エチニル｝−１−（４−ヒドロキシ−５−（Ｏ−トリホスフェートヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン（化合物ＸＩＶ）
【化７６】
Figure 2004535193
【０５３９】
５−ヨード−ｄＵＴＰ（２００ｍｇ、０．５６ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ）および１４ａ（１００ｍｇ、０．４１ミリモル）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解させた。アルゴンを溶液に５分間吹き込んだ。テトラキスパラジウム（５７ｍｇ、０．４９ミリモル）およびＣｕＩ（１９ｍｇ、０．１ミリモル）を添加し、混合物を５０℃で５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、１４ｂをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ＮＭＲスペクトルにより、シロップは６６％であることが明らかになった。化合物ＶＩＩの合成について記載された手順を用いて、シロップ（４０ｍｇ）を対応するトリホスフェート（化合物ＸＩＶ）に変換した。ＴＬＣにより１４ｂが完全に変換されたことが示された。ＬＨ８０６１ａについて選択されたＮＭＲデータ：1H-NMR (MeOD-D3): δ: 8.3 (1H, HC=), 7.3 (5h, HC=), 6.2 (1H, CH), 5.0 (2H, CH2), 4.3 (1H, CH), 3.8-3.2 (3H, CH2, CH), 2.3 (1H, CH2), 2.2 (1H, CH2), 1.0 (14H, 2 x CH, 4 x CH3)
【０５４０】
実施例５８〜６３：モノヌクレオチドビルディングブロック（ＸＶ）の調製
ビルディングブロックＸＶは以下に示す一般的スキームにしたがって調製することができる：
【化７７】
Figure 2004535193
【０５４１】
実施例５８：化合物１５ａの調製
【化７８】
Figure 2004535193
化合物１５ａ
【０５４２】
３−アミノ−酪酸（２．０６ｇ、２０ミリモル）のＮａＨＣＯ３（５０％飽和水性溶液２５ｍＬ）中溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４．３６ｇ、２０ミリモル）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４．３６ｇ、２０ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、ＮａＨ２ＰＯ４の添加により、ｐＨを４〜５に調節した。生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出し（３×１００ｍＬ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発乾固させて、４．６ｇ（１１３％）の粗生成物を得た。
【０５４３】
実施例５９：化合物１５ｂの調製
【化７９】
Figure 2004535193
化合物１５ｂ
【０５４４】
化合物２８（１．０２３ｇ、５．０ミリモル）、３−エチル−フェノール（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、０．６７５ｇ、１２ミリモル）および４−ジメチルアミノ−ピリジン（ＤＭＡＰ、３００ｍｇ、２．５ミリモル）をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中に溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．０６ｇ、１０ミリモル）を溶液に添加し、１６時間室温で撹拌後、反応混合物を濾過し、真空下で蒸発乾固させた。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによりＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（１：３）−（１：２）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収量７２０ｍｇ、７３％。
1H NMR (CDCl3)δ 7.36-7.09 (4H, m, Ph), 4.89 (1H, bs, NH), 4.22 (1H, bm,CH), 3.10 (1H, s), 2.77 (2H, d), 1.40 (3H, t), 1.32 (3H, d)
【０５４５】
実施例６０：化合物１５ｃの調製
【化８０】
Figure 2004535193
化合物１５ｃ
【０５４６】
５−ヨード−２’−デオキシウリジン３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（７３０ｍｇ、１．２５ミリモル）、トリエチルアミン（２５０ｍｇ、２．５ミリモル）および化合物（１５ｂ）（４５６ｍｇ、１．５ミリモル）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液を室温で撹拌した。Ｎ２を溶液に２０分間通した。
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０９ｍｇ、０．０９４ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（３６ｍｇ、０．１８８ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で３日間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーによりＥｔＯＡｃ：ヘプタン勾配（１：３）−（１：２）（ｖ・ｖ）で溶出して精製した。生成物収量８０７ｍｇ、８５％。
【０５４７】
1H NMR (CDCl3)δ 8.38 (1H, s), 8.08 (1H, s, 6-H), 7.39-7.1 (4H, m, Ph), 6.33 (1H, dd, 1'-H), 4.9 (1H, bs), 4.45 (1H, dt), 4,80 (2H, s, CH2), 4,2 (1H, m), 4.02 (1H, m, 4'-H), 3.95 (1H, dd, 5'-H), 3.79 (1H, dd, 5''-H), 2,78 (2H, d), 2.36 (1H, m, 2'-H), 2.07 (1H, m, 2''-H), 1.46 (9H, s, tBu ), 0.93 (9H, s, tBu), 0.91 (9H, s, tBu), 0.15 (3H, s, CH3), 0.13 (3H, s, CH3), 0.11 (3H, s, CH3), 0.09 (3H, s, CH3)
【０５４８】
実施例６１：化合物１５ｄの調製
【化８１】
Figure 2004535193
化合物１５ｄ
【０５４９】
化合物（１５ｃ）（８０７ｍｇ、１．０６ミリモル）、氷酢酸（１．０ｇ、１６ミリモル）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物（ＴＢＡＦ）（２．３６ｇ、７．５ミリモル）の２０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中溶液を室温で３日間撹拌した。
反応混合物を蒸発させ、シリカカラムクロマトグラフィーにより（ＤＣＭ）：（ＭｅＯＨ）（９：１）（ｖ／ｖ）で溶出して精製した。生成物収量４０８ｇ、７２％。
1H NMR (CD3OD)δ 8.46 (1H, s, 6-H), 7.39 (2H, m, Ph), 7.28 (1H, m, Ph), 7.12 (1H, m, Ph), 6.75 (1H, bd), 6.27 (1H, dd, 1'-H), 4.44 (1H, dt, 4'-H), 3.96 (1H, t, 3'-H), 3.86 (1H, dd, 5'-H), 3.77 (1H, dd, 5''-H), 2,72 (2H, d), 2.35-2.27 (2H, m, 2', 2''-H), 1.46 (9H, s, tBu ), 1.27 (3H, d)
【０５５０】
実施例６２：化合物１５ｅの調製
【化８２】
Figure 2004535193
化合物１５ｅ
【０５５１】
化合物（１５ｄ）（１３８．５ｍｇ、２６０マイクロモル）を５００μＬの乾燥トリメチルホスフェート中に溶解させた。０℃に冷却した後、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）の乾燥トリメチルホスフェート中溶液を添加した（４００μＬストック溶液（１２０ｍｇ／ｍＬ、３１０マイクロモル）。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。
続いて、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（１．００ｍＬの乾燥ＤＭＦ中２００ｍｇ、４２０マイクロモル）およびトリブチルアミン（５００μＬの乾燥ＤＭＦ中１２３ｍｇ、６７０ミリモル）を０℃で添加した。反応物を室温で３分間撹拌し、次いで１ｍＬの１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムの添加により停止させた。
【０５５２】
実施例６３：化合物ＸＶの調製
【化８３】
Figure 2004535193
化合物ＸＶ
【０５５３】
Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去
リン酸化後、ＨＣｌを用いて５０μｌのリン酸化反応混合物をｐＨ＝１に調節し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＬＣ上で精製する前に、ＮａＯＨおよび酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて混合物をｐＨ５．５に調節した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたヌクレオチド誘導体の精製
粗混合物から、２μｌの２０サンプルをｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ）上にスポットした。１００％メタノールをランニング溶液として用いて、有機溶媒および非リン酸化ヌクレオシドをヌクレオチド誘導体から分離した。続いて、ＴＬＣプレートを空気乾燥し、ＵＶシャドウイングによりヌクレオチド誘導体を同定した。ヌクレオチド誘導体を含有するｋｉｅｓｅｌを単離し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）を溶媒として用いて抽出した。ｋｉｅｓｅｌｇｅｌを遠心分離により除去し、上清を真空乾燥した。ヌクレオチド誘導体を５０〜１００μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁して、最終濃度１〜３ｍＭにした。ポリメラーゼエクステンション反応に使用する前に、各ヌクレオチドの濃度をＵＶ吸収により評価した。
【０５５４】
実施例６４：異なるヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込み
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、異なるエクステンションプライマーを３２Ｐで５’−標識した。エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中それぞれ０．１および３ピコモルを用い、８０℃に２分間加熱し、次いでゆっくりと約２０℃に冷却することにより、これらのエクステンションプライマーを鋳型プライマーにアニールした。野生型ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。野生型ヌクレオチドと比較したヌクレオチド誘導体についての異なる移動度シフトにより組み込みを確認できる。図４９は、様々なヌクレオチド誘導体の組み込みを示す。レーン１〜５において、エクステンションプライマー５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’を鋳型プライマー５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’と共に使用し、レーン６〜１１において、エクステンションプライマー５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’を鋳型プライマー５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’と共に使用し、レーン１２〜１５において、エクステンションプライマー５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’を鋳型プライマー５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＣＧＴ ＡＡＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＣＡＧ ＴＡＧ Ｃ−３’と共に使用した。レーンＣＧＧＴ−３’は鋳型プライマー５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣ−３’と共に使用した。レーン１、ｄＡＴＰ；レーン２、化合物ＸＩ；レーン３、化合物ＩＸ；レーン４、化合物Ｉ；レーン５、化合物ＩＩ；レーン６、ヌクレオチドなし；レーン７、ｄＣＴＰ；レーン８、化合物ＶＩＩ；レーン９、化合物Ｘ；レーン１０、化合物ＩＶ；レーン１１、化合物ＩＩＩ；レーン１２、ヌクレオチドなし；レーン１３，ｄＴＴＰ；レーン１４、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ；レーン１５、ｄＴＴＰおよび化合物Ｘ。これらの結果は、異なるリンカーおよび機能的部分を用いてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの様々なヌクレオチド誘導体を取り込む可能性を示す。他のポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ、Ｍ−ＭＬＶおよびＨＩＶも試験すると陽性の結果が得られた。
【０５５５】
実施例６５：ポリメラーゼ組み込みおよび切断可能なエステルリンカーを含有するヌクレオチド誘導体の加水分解
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中それぞれ０．１および３ピコモルを用い、８０℃に２分間加熱し、次いでゆっくりと約２０℃に冷却することにより、これらのエクステンションプライマーを鋳型プライマー（５’−ＴＡＡ ＧＡＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＣＡＧ ＴＡＧ Ｃ−３’）にアニールした。野生型ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。加水分解されたサンプルを０．１Ｍ ＮａＯＨで５０℃で約１５分間処理し、次いで等モルのＨＣｌおよびＮａＯＡｃ（ｐＨ６．５）で滴定し、ミクロスピンゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）により精製した。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。野生型ヌクレオチドと比較したヌクレオチド誘導体についての異なる移動度シフトにより組み込みを確認できる。図５０は、様々なヌクレオチド誘導体の組み込みを示す。レーン１、化合物ＩＩＩおよび化合物ＩＩ；レーン２、化合物ＩＩＩおよび２つの化合物ＩＩ；レーン３、化合物ＩＩＩおよび化合物ＩＩの加水分解；レーン４、化合物ＩＩＩおよび２つの化合物ＩＩの加水分解。結果は、これらのヌクレオチド誘導体がポリメラーゼによりこの順序で取り込まれることができることを示す。また、エステルリンカーを有する組み込まれた化合物ＩＩヌクレオチド誘導体の一方または両方は、ＤＮＡ鋳型上で特異的に分解されることができ、エステルリンカーを有さない組み込まれた化合物ＩＩＩヌクレオチド誘導体はそのままであることを示す。これは、１つのヌクレオチド誘導体が結合点（非切断可能なリンカー）として機能でき、同時にＤＮＡ鋳型から他の組み込まれたヌクレオチド誘導体を放出し（切断可能なリンカー）、表示分子（ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を形成することが可能であることを示す。加えて、この実験データは、切断可能なエステルを含有するリンカーを有するヌクレオチド誘導体は、ポリメラーゼの活性部位におけるアミンとの反応無しにポリメラーゼにより挿入できるか、または組み込みプロセス中に加水分解されるようになることを示す。
【０５５６】
実施例６６：ポリメラーゼ組み込みおよびヌクレオチド誘導体の架橋
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中それぞれ０．１および３ピコモルを用い、８０℃に２分間加熱することにより、これらのエクステンションプライマーを鋳型プライマー（５’−ＴＡＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＧＣ）にアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。ヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。ミクロスピンゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてオリゴヌクレオチドを次いで精製した。１０ｍＭＢＳ３［ビス（スルホニルスクシンイミド）スベラート］（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ＃２１５８０）を用いて３０℃で約１時間架橋を行った。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。図５１Ａおよび５１Ｂは様々なヌクレオチド誘導体の組み込みおよび架橋（ＣＬ）を示す。図５１Ａ：レーン１、化合物ＩＩＩおよび化合物Ｉ；レーン２、架橋化合物ＩＩＩおよび化合物ＩＩ。図５１Ｂ：レーン１、化合物ＩＩＩおよび化合物Ｉ；レーン２、架橋化合物ＩＩＩおよび化合物Ｉ．結果から、これらのヌクレオチド誘導体はこの順序でポリメラーゼにより取り込まれ得ることが示される。また、化合物ＩＩＩ、化合物ＩＩおよび化合物Ｉは架橋試薬ＢＳ３により修飾され（移動度シフト）、これにより、ＤＮＡ鋳型によるヌクレオチド誘導体化合物ＩＩＩ−化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ−化合物Ｉ上の反応基間の架橋（ＣＬ）が可能になることがわかる。重要なことには、主溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）中のヌクレオチド誘導体のアミド基は、ＤＮＡ鋳型上の異なる組み込まれたヌクレオチド誘導体間の架橋を促進する修飾について選択的に影響をうけやすい。
【０５５７】
実施例６７：様々なヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込み
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中それぞれ０．１および３ピコモルを用い、８０℃に２分間加熱することにより、これらのエクステンションプライマーを鋳型プライマー（５’−ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＧＣ−５’）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。伸張を防止するために、この鋳型プライマーを３’ビオチンＣ６−標識した。ヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。図５２は様々なヌクレオチド誘導体の取り込を示す。レーン１、野生型ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ；レーン２、化合物ＸＩ；レーン３；化合物ＸＩおよび化合物ＩＩＩ；レーン４、化合物ＸＩ、化合物ＩＩＩおよびｄＡＴＰ；レーン５、化合物ＸＩ、化合物ＩＩＩおよび化合物ＸＩＩＩ。結果は、ポリメラーゼを用いてそれぞれの後に少なくとも３つの異なるヌクレオチド誘導体を取り込むことができることを示す。従って、ポリメラーゼは様々なヌクレオチド誘導体が著しく触媒活性が減少することなく同時に活性部位にあることを許容する。
【０５５８】
実施例６８：様々なヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込み
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中それぞれ０．１および３ピコモルを用い、８０℃に２分間加熱することにより、これらのエクステンションプライマーを鋳型プライマー（５’−ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＧＣ−３’）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。伸張を防止するために、この鋳型プライマーを３’ビオチンＣ６−標識した。ヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。図５３は野生型ヌクレオチド誘導体と比較した様々なヌクレオチド誘導体の取り込を示す。レーン１、野生型ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ；レーン２、化合物ＩＩ、化合物ＩＩＩおよび化合物ＸＩＩＩ。結果は、ポリメラーゼを用いて互いの後に少なくとも３つの異なるヌクレオチド誘導体を取り込むことが可能であることを示す。従って、ポリメラーゼは様々なヌクレオチド誘導体が著しく触媒活性が減少することなく同時に活性部位にあることを許容する。
【０５５９】
実施例６９〜７４：ポリメラーゼにより鋳型化された分子の調製
実施例６９：尿素結合形成によるエンコードされたアミノ酸基の架橋
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、プライマー（５’−ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＧＧＸ−３’）（ここにおいて、Ｘはデオキシ−チミジン−Ｃ６−ＮＨ２を表す）（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ＃１０−１０３９−９０）を３２Ｐで５’−標識し、ミクロスピンゲル濾過により精製した。このプライマー（０．１ピコモル）および２ピコモルの第二のプライマー（５’ＸＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＧＣ− ３´）を、８０℃で２分間加熱することによりハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、１ピコモルの鋳型プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’）と同時アニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。その後、１０ｍＭのＮ’，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、サンプルを３０℃で２時間インキュベートした。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【化８４】
Figure 2004535193
【０５６０】
結果は、ＣＤＩとの反応により、隣接するＮＨ２基が共有尿素結合を形成できることを示す。鋳型配列の非存在下では反応は観察されず、このことは、反応が鋳型配列により左右されるＮＨ２基に近接性に依存することを示す。尿素結合形成は、０．５％ホルムアルデヒドが架橋試薬として使用される場合にも観察される（データは省略）。
【０５６１】
実施例７０：ジアミノリンカーを使用した「フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）」反応によるアミド結合の形成
この実験において、ＤＮＡ−エンコードされたカルボン酸は、１，４−ジアミノブタンにより架橋される。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、プライマー（５’−ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＧＧＹ−３’）（ここにおいて、Ｙはデオキシ−チミジン−Ｃ２−ＣＯＯＨを表す）（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ＃１０−１０３５−９０）を３２Ｐで５’−標識し、ミクロスピンゲル濾過により精製した。このプライマー（０．１ピコモル）および２ピコモルの第二のプライマー（５’ＹＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＧＣ− ３´）を、８０℃で２分間加熱することによりハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、１ピコモルの鋳型プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’）と同時アニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。その後、１００ｍＭのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０ｍＭの１，４ジアミノブタン（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、サンプルを３０℃で２時間インキュベートした。サンプルをホルムアミド染料と混合し、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【化８５】
Figure 2004535193
【０５６２】
結果から、エンコードされたＣＯＯＨ基は、アミド結合の形成により二機能性リンカーにより共有結合させることができることがわかる。鋳型配列の非存在下で反応は観察されず、このことは、反応は鋳型配列により得られるＣＯＯＨ基の近接性により支配されることを示す。他のジアミノリンカー、例えば１．６ジアミノヘキサン、スペルミンおよびスペルミジンを用いて同様の結果が得られる（データは省略）。
【０５６３】
実施例７１：ヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込みおよび鋳型された固定点との架橋
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。このエクステンションプライマーを、８０℃で２分間加熱することにより、エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、それぞれ０．１ピコモルおよび３ピコモル用いて鋳型プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。ヌクレオチド誘導体を次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を３０℃で１時間用いて取り込んだ。オリゴヌクレオチド複合体を次いでミクロスピンゲル濾過（ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製した。第二のプライマー（５−ＹＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＧＣ−３’）（ここにおいて、Ｙは固定点反応基デオキシチミジン−Ｃ２−ＣＯＯＨを表す）をエクステンション複合体とアニールした。緩衝液組成を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５に調節した。１００ｍＭ ＥＤＣおよび１０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて約２時間３０℃で架橋を行った。関連するサンプルをアルカリ加水分解に供した（０．１Ｍ ＮａＯＨ、５０℃で１５分）。サンプルをホルムアミド染料と混合し、変性１０％尿素ポリアクリルアミドゲル上にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【０５６４】
【化８６】
Figure 2004535193
【０５６５】
結果から、ポリメラーゼにより組み込まれたヌクレオチド誘導体からの反応基は、アミド結合を形成する「フィルイン」反応により固定点反応基と架橋することができることがわかる。さらに、ヌクレオチド誘導体のエステルリンカーは特異的に切断され、このことにより鋳型された機能的部分が鋳型された第二の機能的部分に移される（固定点）。
【０５６６】
実施例７２：ヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込みおよび「フィルイン」反応による鋳型された固定点との架橋
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。このエクステンションプライマーを、８０℃で２分間加熱することにより、エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、それぞれ０．１ピコモルおよび３ピコモル用いて鋳型プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。化合物ＩＩ（ヌクレオチド誘導体）を次いで添加し（約１００μＭ）、３０℃で１時間、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて取り込んだ。オリゴヌクレオチド複合体を次いでミクロスピンゲル濾過（ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製した。第二のプライマー（５−ＸＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＧＣ−３’）（ここにおいて、Ｘは固定点反応基デオキシチミジン−Ｃ６−ＮＨ２を表す）をエクステンション複合体とアニールした。１０ｍＭ ＢＳ３［ビス（スルホニルスクシンイミド）スベラート］（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ＃２１５８０）を用いて約２時間３０℃で架橋を行った。関連するサンプルをアルカリ加水分解に供した（０．１Ｍ ＮａＯＨ、５０℃で１５分）。サンプルをホルムアミド染料と混合し、変性１０％尿素ポリアクリルアミドゲル上にかけた。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【０５６７】
【化８７】
Figure 2004535193
【０５６８】
ゲルの図を５４に示す。レーン１：ヌクレオチドなし、レーン２：ｄＴＴＰ、レーン３：化合物Ｉ、レーン４：ｄＴＴＰその後にアルカリ加水分解、レーン５：化合物Ｉその後にアルカリ加水分解、レーン６：ｄＴＴＰその後ＢＳ３架橋、レーン７：化合物Ｉその後にＢＳ３架橋、レーン８：ｄＴＴＰその後にＢＳ３架橋およびアルカリ加水分解、およびレーン９：化合物Ｉその後にＢＳ３架橋およびアルカリ加水分解。結果から、ポリメラーゼにより取り込まれるヌクレオチド誘導体からの反応基は、アミド結合を形成する「フィルイン」反応により固定点反応基と架橋できることがわかる。さらに、ヌクレオチド誘導体のエステルリンカーは特異的に切断され、これにより鋳型された機能的部分は鋳型された第二の機能的部分に移される（固定点）。
【０５６９】
実施例７３：２つのヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込みおよび３つのエンコードされた機能的部分間の架橋
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）を３２Ｐで５’−標識した。このエクステンションプライマーを、８０℃で２分間加熱することにより、エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、それぞれ０．１ピコモルおよび３ピコモル用いて鋳型プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＴＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−３’）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。ヌクレオチド誘導体ＶおよびＸを次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を３０℃で１時間用いて取り込んだ。オリゴヌクレオチド複合体を次いでミクロスピンゲル濾過（ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製した。第二のプライマー（５−ＹＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＧＣ−３’）（ここにおいて、Ｙは固定点反応基デオキシチミジン−Ｃ２−ＣＯＯＨを表す）をエクステンション複合体とアニールした。１００ｍＭ ＥＤＣおよび１０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加する前に、緩衝液組成を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５に調節した。この結果、ＭＧ９１のＮＨ２基およびＶのＣＯＯＨ基および第二のプライマーＣＯＯＨの架橋が起こる。適当なサンプルをアルカリ加水分解に供した（０．１Ｍ ＮａＯＨ ５０℃、１５分）。１０％尿素ポリアクリルアミドゲルにかける前に、ホルムアミド染料をサンプルに添加した。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【０５７０】
【化８８】
Figure 2004535193
【０５７１】
この結果から、３つのエンコードされた機能的部分を架橋できることがわかる。さらに、特異的リンカーを選択的に切断できる。
【０５７２】
実施例７４：ポリメラーゼ組み込みおよびβ−アミノ酸転移（ジッピング（ｚｉｐｐｉｎｇ））
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、標準的プロトコルを用いて（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃４１０３）、エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’)を３２Ｐで５’−標識した。このエクステンションプライマーを、８０℃で２分間加熱することにより、エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、それぞれ０．１ピコモルおよび３ピコモル用いて鋳型プライマー（５’−ＴＡＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＧＣ）とアニールし、次いでゆっくりと約２０℃に冷却した。ヌクレオチド誘導体ＩＩおよびＩＩＩを次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を３０℃で１時間用いて取り込んだ。ヌクレオチド誘導体ＩＩおよびＩＩＩを次いで添加し（約１００μＭ）、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。オリゴヌクレオチドを次いでミクロスピンゲル濾過（ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製し、続いて凍結乾燥した。オリゴヌクレオチド複合体をピリジン中に溶解させ、ピリジン中スカンジウムトリフルオロメタンスルホネート（触媒）を添加して、最終濃度１０ｍＭにし、反応混合物を５０℃で１時間インキュベートした。０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、５０℃で１５分間、関連するサンプルをアルカリ加水分解に供した。１０％尿素ポリアクリルアミドゲルにかける前に、ホルムアミド染料をサンプルに添加した。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開した。この実験の概略図を以下に示す：
【０５７３】
【化８９】
Figure 2004535193
【０５７４】
結果から、機能的部分の反応基は、アミド結合を形成する他の機能的部分の反応基と反応できることがわかる。反応の結果、機能的部分が第二の機能的部分上に移動し、同時に第一の機能的部分と前記機能的部分をエンコードするヌクレオチド誘導体を結合させるリンカーが切断する。この実験的セットアップにおいて、２つのβ−アミノ酸を含むジペプチドが生じる。従って、β−アミノ酸を機能的部分として含むいくつかの（３以上）ヌクレオチド誘導体上のＤＮＡ鋳型上の組み込みにより、複数の移動事象が起こり、３以上のβ−アミノ酸を含むβ−ペプチド酸が生じる。この実施例において、機能的部分反応基間の反応は、非水性環境において起こる。好ましい態様において、機能的部分反応基間の反応は、「ジッピング」反応により前記機能的部分を含むヌクレオチド誘導体の組み込みにより直接起こる。これは、様々な化学的基、例えば、チオエステル、フェノールエステル、チオフェノールエステル、ジ−、トリ−またはテトラ−フルオロ活性化フェノールまたはチオフェノールエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを導入することによりエステル結合の反応性を増大させることにより達成できる。
【０５７５】
実施例７５：ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ実験 ヌクレオチド誘導体のポリメラーゼ組み込みを用いて生じる鋳型表示分子の構造的説明
本発明の一態様は、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチド誘導体の特異的組み込みに適したポリメラーゼを利用する。この組み込みは、コード因子を含有する鋳型を用いて達成される。鋳型は、これらのコード因子に基づいて特定の順序でヌクレオチド誘導体を取り込むためにポリメラーゼにより利用される（図５５）。このプロセスはヌクレオチド誘導体における認識基のために特異的である。
【０５７６】
異なるヌクレオチドは特定の位置（例えば、図９）でポリメラーゼによる組み込みを可能にし、同時に、図５５Ａに示すように溶媒にさらされたＤＮＡ鎖の主溝の中または外側の結合した機能的部分を露出させるために修飾される。ポリメラーゼによるヌクレオチド誘導体の連続的な組み込みにより、結合した機能的部分間に様々な反応が起こる。反応は、各機能的部分中に組み込まれた反応基の種類により決められる（図１１〜２１に示す例）。加えて、ＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡ鋳型の螺旋構造に応じて機能的部分を特定の形態に配列させるであろう。この形態は、例えば、機能的部分および相補因子を結合させる異なる種類のリンカーにより制御することができる。従って、リンカーはヌクレオチド誘導体上の反応基間の反応に有利なように設計される。リンカーの設計は、どの種類の反応基がどのように機能的部分において配列されるかによって異なる。リンカーはまた、特定の方向に反応基間の反応を導くために設計することができる。様々な反応基も反応基間の反応を行うために使用できる。ヌクレオチドの近接性および最適化された形態は、異なる機能的部分における反応基間の反応速度を大きく増大させる。反応基間の反応速度は、ＤＮＡ鋳型分子上の組み込まれたヌクレオチド誘導体の濃度が局所的に高いために、溶液中に自由に拡散できる場合と比べて速い。
【０５７７】
図５５Ａは、ヌクレオチド誘導体化合物ＩＩ、化合物Ｘおよび化合物Ｖが同じＤＮＡ鋳型上で互いの後にポリメラーゼにより取り込まれる一例を示す。これらのヌクレオチド誘導体の合成はすでに詳細に記載されている。これらのヌクレオチド誘導体のＡＭＶ逆転写酵素組み込みを示す実験データは実施例６４において見ることができる。これらの組み込まれたヌクレオチド誘導体は、相補因子と機能的部分を結合させるリンカーにより、各ヌクレオチド誘導体上の反応基間の反応を促進するために構造的に配列される。リンカーの正確な配列およびＤＮＡ鋳型上の機能的部分によって、化合物ＩＩにおけるアミンおよび長側鎖における化合物Ｘアミン間の距離を計算すると、３．１Åと１７．５Åの間であり、化合物ＩＩにおけるアミンと短側鎖における化合物Ｘアミン間の距離を計算すると、３．０Åと１４．６Åの間である。ヌクレオチド誘導体化合物Ｖのカルボニル炭素とヌクレオチド誘導体化合物Ｘにおける長側鎖アミン間の距離を計算すると、４．２Åと１９．８Åの間であり、短側鎖化合物Ｘアミンまでの距離を計算すると３．７Åと１６．５Åの間であり、これも正確な配向に依存する。ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチド誘導体化合物ＩＩ、化合物Ｘおよび１９７３の近接性は、これらのヌクレオチド誘導体における反応基の化学結合を促進するであろう。
【０５７８】
これらの３つのヌクレオチド誘導体は様々な化学試薬を用いてその反応基により結合させることができる。使用できる試薬の一例は、ＢＳ３［ビス（スルホニルスクシンイミド）スベラート］（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ＃２１５８０）である。典型的には、約０．２５〜１０ｍＭの濃度のこの類似体が用いられる。この試薬は、ヌクレオチド誘導体化合物ＩＩと化合物間の２つのアミンを架橋する。この特定の試薬は、反応基間に炭素８個のスペーサーを挿入し、延長されたコンフォメーションにおいて１１．２Åの距離を橋かけできる。従って、ＢＳ３リンカーは化合物ＩＩのアミンと化合物Ｘのアミンのいずれかを結合できる。反応性アミン基間にほとんどあらゆる種類のスペーサーを得るために使用できる（長いかまたは短い）他の試薬がある。ヌクレオチド誘導体化合物Ｖ上のカルボン酸およびヌクレオチド誘導体化合物Ｘ上のアミンの１つは、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて結合させることができる。この反応は、ヌクレオチド誘導体化合物Ｘおよび化合物Ｖ上の反応基間の直接的結合を形成する。これらの２つの反応の結果、カップリング試薬により互いに共有結合するこれらのヌクレオチド誘導体からなる新規分子が得られる（図５５Ｂ）。この特定のＤＮＡ鋳型介在分子は、フィルイン（ＢＳ３）および直接カップリング（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学反応の両方を用いて生成される。組み込まれたヌクレオチド誘導体間の架橋の例はすでに示されている。使用できる他の種類のカップリング法は、転移によるジッピングまたは開環である。これらのカップリング法は、本発明に記載するような他の種類のリンカーデザインを必要とする。
【０５７９】
この段階で、全ての機能的部分は、機能的部分と相補因子を結合させるリンカーによりＤＮＡ鋳型に依然として結合している。ヌクレオチド誘導体化合物ＩＩおよび化合物Ｘのリンカー中に組み込まれたエステル因子は特異的に加水分解され（実験の詳細については実施例６５参照）、ＤＮＡ鋳型からこれらの２つのヌクレオチド誘導体の機能的部分を遊離させることができる。この加水分解反応の結果、化合物Ｖヌクレオチド誘導体においてリンカーによりＤＮＡ鋳型と結合するだけの新規分子が得られる（図５５Ｃ）。この分子を次いでＤＮＡ鋳型から溶液中に伸張させ、溶液中の他の分子との相互作用について利用可能（表示）にすることができる。
この鋳型化された分子は、多くの異なる鋳型化された分子のライブラリーの一部として、様々な標的と結合する分子を同定するための選択法において最終的に用いることができる。選択法の詳細な記載は、本明細書の他の部分に見いだすことができる。
【０５８０】
実施例（モデル）７６：ＰＮＡ合成−ベース結合
ＰＮＡモノマーは、各ＰＮＡモノマーの基本的部分と結合する切断可能なベンジルまたはベンジルオキシカルボニル部分により相補因子と結合される。カルボン酸はオリゴヌクレオチド複合体に対する固定点として使用される。各ビルディングブロックをオリゴヌクレオチド鋳型とアニールする（図示せず）。
【０５８１】
工程Ａ：重合
オリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ６〜１０、好ましくは７〜９）に、適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、ペプチドカップリング試薬（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢｏＰ、ＰｙＢｒｏＰまたはＮ−メチル−２−クロロピリジニウムテトラフルオロボレートおよびペプチドカップリング修飾剤（０．１ｍＭ〜１ｕＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＮＨＳ、スルホ−ＮＨＳ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、またはＤｈｂｔＯＨを添加する。反応は−２０℃から６０℃の間の温度で行われる。反応時間は１時間から１週間の間であり、好ましくは１時間から２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールの重合を例にあげるが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の他の反応体積を用いることができる。
【０５８２】
工程Ｂ：リンカー切断および脱保護
Ｃｂｚ−およびベンジル保護基を様々な方法により除去することができる[Greene;1999; ]。その穏やかさのために、接触還元が最上の方法であることが多い。不溶性水素化触媒、例えば、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｄ／ＣａＣＯ３、Ｐｄ／Ｃ、ＰｔＯ２、または可溶性触媒、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎｓ触媒および水素供給源、例えばこれらに限定されないが、Ｈ２、アンモニウムホルミネート、蟻酸、１，４−シクロヘキサジエン、およびシクロヘキサンを、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリル、酢酸またはこれらの混合物などの適当な溶媒中、オリゴヌクレオチド複合体と組み合わせることにより、Ｃｂｚ−およびベンジル保護基を除去する。
【０５８３】
【化９０】
Figure 2004535193
Figure 2004535193
は、１０〜２０ヌクレオチドの配列を示す。結合は、ＰＮＡ単位からの塩基の結合を可能にする一端で修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、４０ｍｅｒ）である。
ビルディングブロック合成のスキーム：
【０５８４】
【化９１】
Figure 2004535193
【０５８５】
工程Ａ、Ｂ：
氷／水浴上で冷却された４−ニトロフェノールクロロホルミネート（５ミリモル）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中に溶解させた（４−エチニルフェニル）メタノール（５ミリモル）を滴下する。１時間後氷浴をはずす。反応をＴＬＣによりモニターする。完了すると、ピリジン（２０ｍＬ）中（６−アミノプリン−９−イル）−酢酸エチルエステル（５ミリモル）を添加し、１６時間室温で反応させる。揮発物質を真空中で除去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
工程Ｃ、Ｄ：
工程Ｃ[Hyrup;1996; Bioorganic & medicinal chemistry; 5-23]およびＤ[Schmidt;1997; Nucleic Acids Research; 4792-4796,Bohler;1995; Nature; ]は文献から公知である。
工程Ｅ
保護されたヨウ素置換ヌクレオチド（０．３４ミリモル）、アルキン（０．６９ミリモル、２当量）、ＤＩＥＡ（０．２５ｍＬ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）をＡｒで５分間パージする。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．０３ミリモル、０．１当量）およびＣｕＩ（０．０７ミリモル、０．２当量）を添加し、混合物を５０℃に加熱し、この温度で２０時間保持する。揮発物質を蒸発させ、続いてクロマトグラフィーにより、所望の修飾されたヌクレオシドを得、これをその対応するホスホルアミダイトに変換し、オリゴヌクレオチド中に取り込む。
【０５８６】
実施例（モデル）７７：ＰＮＡ合成−結合窒素
各ＰＮＡモノマーの塩基部分と結合した切断可能なベンジル部分によりＰＮＡモノマーを相補因子と結合させる。アミンをオリゴヌクレオチド複合体の固定点として用いる。各ビルディングブロックをオリゴヌクレオチド鋳型とアニールする（図示せず）。
【０５８７】
【化９２】
Figure 2004535193
Figure 2004535193
は修飾されたヌクレオチド間の原子価結合を表す。
【０５８８】
工程Ａ：重合
オリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ６〜１０、好ましくは７〜９）に、適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、ペプチドカップリング試薬（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢｏＰ、ＰｙＢｒｏＰまたはＮ−メチル−２−クロロピリジニウムテトラフルオロボレートおよびペプチドカップリング修飾剤（０．１ｍＭ〜１ｕＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＮＨＳ、スルホ−ＮＨＳ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、またはＤｈｂｔＯＨを添加する。反応は−２０℃から６０℃の間の温度で行われる。反応時間は１時間から１週間の間であり、好ましくは１時間から２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールの重合を例にあげたが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の他の反応体積を用いることができる。
【０５８９】
工程Ｂ：
Ｃｂｚ−およびベンジル保護基を様々な方法により除去することができる[Greene and Wuts;1999; ]。その穏やかさのために、接触還元が最上の方法であることが多い。不溶性水素化触媒、例えば、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｄ／ＣａＣＯ３、Ｐｄ／Ｃ、ＰｔＯ２、または可溶性触媒、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎｓ触媒および水素供給源、例えばこれらに限定されないが、Ｈ２、アンモニウムホルミネート、蟻酸、１，４−シクロヘキサジエン、およびシクロヘキサンを、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリル、酢酸またはこれらの組み合わせなどの適当な溶媒中、オリゴヌクレオチド複合体と組み合わせることにより、Ｃｂｚ−およびベンジル保護基を除去する。
【０５９０】
実施例７８（モデル）：ポリサッカライド
ポリサッカライド合成の一般的スキーム
【０５９１】
【化９３】
Figure 2004535193
【０５９２】
工程Ａ
２−アミノ糖に結合したカルボン酸で修飾されたプライマー配列（例えば、グレンリサーチカルボキシ−ｄＴ ｃａｔＮｏ．１０−１０３５−）を鋳型（省略）にアニールし、ヘキソース単位を有する修飾ヌクレオチドで伸張する。Ｐｇは保護基［Seeberger;2000; Chem. Rev.; 4349-4393,Seeberger;2001;］であり、例えばこれらに限定されないが、Ａｃ、Ｂｚ、Ｌｅｖ、Ｐｉｖ、シラン（ＳｉＲ３、ここにおいてＲは低級アルキルである）が挙げられ、Ｌｇは炭水化物化学反応に典型的な脱離基であり、例えばこれらに限定されないが、ハロゲン、トリクロロアセトアミド、メルカプタン、フェノール、リン酸エステルおよび酵素による［Wong;1994; Tetrahedron Organic Chemistry Series;］炭化水素合成については糖ヌクレオチドホスフェートまたは糖ホスフェートが挙げられる。
【０５９３】
工程Ｂ：リンカー活性化
エステル結合を、ｐＨ９〜１２、室温で１６時間、適当な溶媒、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、水性水酸化物で切断させる。ＰｇがＡｃまたは他の塩基反応性保護基であるならば、これらは同様に除去される。
炭水化物は、いくつかのＯＨ機能的部分を有し、これにより相補因子との結合が可能になる。この実施例は、１〜６のカップリングした三量体を示すが、任意のビルディングブロックの組み合わせを用いることができる。
鋳型に対して炭化水素単位を結合させることにより、これらの単位が折り畳まれて二次構造になる傾向が軽減され、従ってポリサッカライドの合成が促進される。
【０５９４】
実施例（モデル）７９：アクリルアミド
ポリアクリルアミド合成の一般的スキーム
【化９４】
Figure 2004535193
ヨウ素原子を有する末端が修飾されたプライマー配列をオリゴヌクレオチド鋳型（省略）とアニールし、Ｎ−置換アクリルアミド単位を有する修飾ヌクレオチドで伸張する。
【０５９５】
工程Ａ：重合
炭素原子ベースのラジカルを形成するラジカル開始剤によるヨウ素原子の抽出により開始するカスケードラジカル反応においてアクリルアミドを重合する。Ｎ−置換アクリルアミド単位を有するオリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ６〜１０、好ましくは７〜９）に、ラジカル開始剤（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないがペルオキシモノスルフェート、ＡＩＢＮ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔブチルペルオキシド、過酸化水素または酢酸鉛を適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、任意にＵＶ光、超音波またはマイクロ波を適用しながら添加する。反応は−２０℃から１００℃の間の温度で行われる。反応時間は１時間から１週間の間であり、好ましくは１時間から２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールの重合を例にあげるが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の他の反応体積を用いることができる。
【０５９６】
工程Ｂ：活性化
Ｎ−Ｏ結合は、水素触媒および適当な水素供給源を用いるか、またはある種の金属塩の存在下での還元による切断を受けやすい。オリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ４〜１０、好ましくは４〜７）に、反応物質（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ヨウ化サマリウム（ＩＩ）、塩化スズ（ＩＩ）または塩化マンガン（ＩＩＩ）を、適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中添加する。反応は−２０℃から６０℃の間の温度で行われる。反応時間は１時間から１週間の間であり、好ましくは１時間から２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールの重合を例にあげるが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の他の反応体積を用いることができる。
【０５９７】
ビルディングブロック合成：
【化９５】
Figure 2004535193
工程Ａ：
保護されたヨウ素置換ヌクレオシド（３．４ミリモル）、アルキン（６．９ミリモル、２当量、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ５１３８８）、ＤＩＥＡ（２．５ｍＬ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）にＡｒを５分間パージする。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．３ミリモル、０．１当量）およびＣｕＩ（０．７ミリモル、０．２当量）を添加し、混合物を５０℃に加熱し、この温度で２０時間保持する。冷却しながら、混合物に７００ｍＬのジエチルエーテルを添加する。有機相を塩化アンモニウム（飽和水溶液、２５０ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）で洗浄する。揮発物質を蒸発させ、次いでトルエン（４００ｍＬ）でストリップして、所望の修飾されたヌクレオシドを得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン／酢酸エチル溶離剤）により精製する。
【０５９８】
工程Ｂ：
エタノール（３０ｍＬ）中、工程Ａにおいて得られた修飾されたヌクレオシド（２ミリモル）に、ヒドラジン水和物（４００ｍｇ、８ミリモル、４当量）を添加し、混合物を２０℃で撹拌する。反応をＴＬＣによりモニターする。完了したら、揮発物質を真空中で除去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【０５９９】
工程Ｃ：
工程Ｂにおいて得られたアミン（０．５ミリモル）にＤＭＦ（１０ｍＬ）、ベンズアルデヒド（０．６ミリモル、１．２当量）、酢酸（１００ｕＬ、１％）およびナトリウムシアノボロヒドリド（０．６ミリモル）を添加する。２０℃で１６時間反応させ、ＮａＨＣＯ３（水性、１０ｍＬ、５％）で失活させ、酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ）。合わせた有機相をＮＨ４Ｃｌ（飽和水性溶液、５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥する。酢酸エチルを蒸発させ、残留物をクロマトグラフィーにより精製することができる。
【０６００】
工程Ｄ：
工程Ｃにおいて得られた生成物（０．１ミリモル）を、２，６−ジ−ｔｅｒｔブチルピリジン（０．４ミリモル）の存在下でジクロロメタン中に溶解させ、０℃に冷却し、ここでジクロロメタン（２ｍＬ）中アクリルクロリド（０．１５ミリモル）を滴下する。１時間０℃で反応させ、温度を２０℃まで上昇させ、反応を１時間後ＮａＨＣＯ３（水性、３ｍＬ、５％）で停止させる。相を分離し、有機相を真空下で濃縮する。残留物を酢酸エチル中に溶解させ、ＨＣｌ（水性）（０．１Ｍ、３ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（水性、３ｍＬ、５％）および水（３ｍＬ）で洗浄する。酢酸エチルを蒸発させ、生成物をトルエンでストリップし（２×２０ｍＬ）、クロマトグラフィーにより精製し、所望のビルディングブロックタイプ、例えば、５’−トリホスフェートに変換する。
【０６０１】
実施例（モデル）８０：β−ペプチドの合成
β−ペプチド合成の一般的スキーム：
【化９６】
Figure 2004535193
【０６０２】
工程Ａ
アミン前駆体は、保護基［Greene and Wuts;1999; ]、例えば、これらに限定されないが、ベンジルカーバメート、パラメトキシベンジルカーバメート、２−トリメチルシリルエチルカーバメート、２，２，２−トリクロロエチルカーバメートを有するアミンであってよい。これらの保護基はそれぞれ水素化分解、穏やかな酸処理、フッ素化物処理および亜鉛末での処理により除去される。別法として、アミン前駆体はニトロ基またはアジドであってもよい。両方とも還元によりアミンに変換される。後者はまた、ホスフィンを用いて穏やかな条件下で還元される。
工程Ｂ
工程Ａで生じた遊離アミンは隣接するＮＴＡ単位を攻撃し、カスケードが開始する。
工程Ｃ
リンカー切断は、オリゴヌクレオチド複合体の緩衝溶液（ｐＨ５〜１０）に対してＵＶ照射（２５６０〜５００ｎｍ）を用いて行われ、部分的にβペプチドが放出される。
【０６０３】
実施例（モデル）８１：β−ペプチド合成
β−ペプチド合成の一般的スキーム
【化９７】
Figure 2004535193
【０６０４】
工程Ａ
アミン前駆体は、保護基［Greene and Wuts;1999; ]、例えば、これらに限定されないが、ベンジルカーバメート、パラメトキシベンジルカーバメート、２−トリメチルシリルエチルカーバメート、２，２，２−トリクロロエチルカーバメートを有するアミンであってよい。これらの保護基はそれぞれ水素化分解、穏やかな酸処理、フッ素化物処理および亜鉛末での処理により除去される。別法として、アミン前駆体はニトロ基またはアジドであってもよい。両方とも還元によりアミンに変換される。後者はまた、ホスフィンを用いて穏やかな条件下で還元される。
工程Ｂ
工程Ａで生じた遊離アミンは隣接する［１，３］オキサジナン−６−オン単位を攻撃し、開環によりまず不安定なアミナルが形成される。これは分解してアルデヒドになり、第二アミンを放出し、これはカスケードを継続でき、この場合はβペプチドになる。
【０６０５】
ビルディングブロック合成
【化９８】
Figure 2004535193
【０６０６】
実施例（モデル）８２：ポリアミド合成
タイプＸ−ＸおよびＹ−Ｙの交互モノマービルディングブロックを組み込み（原理は図５６に示す）、その後重合段階により、隣接するモノマー上のＸおよびＹ間に結合が形成される。
ビルディングブロック合成
【化９９】
Figure 2004535193
【０６０７】
工程Ａ：２＋２シクロ付加
２−アリル−マロン酸ジメチルエステル（１ミリモル）およびクロロスルホニルイソシアネート（１ミリモル）をＴＨＦ中２０℃で混合し、７日間反応させる。粗生成物を精製せずに使用する。
工程Ｂ：ジアミン保護
１，３−ジアミノ−プロパン−２−オール（１ミリモル）および無水トリフルオロ酢酸（２ミリモル）をジエチルエーテル中、０℃で混合し、この温度で４時間反応させる。反応混合物を１Ｍ ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３（水性）および水で抽出する。有機相を蒸発させることにより生成物を得る。
工程Ｃ：カーバメート形成
工程Ｂにおいて得られた２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−プロピル］アセトアミド（１．５ミリモル）をＴＨＦ中にクロロスルホニルイソシアネート（１．５ミリモル）と共に溶解させ、２０℃で１６時間反応させる。粗生成物を精製せずに使用する。
【０６０８】
【化１００】
Figure 2004535193
【０６０９】
工程Ｄ：還元的アミノ化
アルデヒド（５ミリモル）を最小量のＭｅＯＨ中に溶解させ、アミン（６ミリモル）、ナトリウムシアノボロヒドリド（６ミリモル）および酢酸を添加する。一夜撹拌し、揮発性物質を除去し、生成物を結晶化またはクロマトグラフィーにより精製する。
工程Ｅ：スルホンアミド形成
ＴＨＦ中工程Ａまたは工程Ｃからの粗生成物を、水／ＴＨＦ混合物中工程Ｄにおいて得られたアミンに塩基の存在下で添加し、２０℃で４時間反応させる。次いで、混合物を一夜還流する。冷却して、溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【０６１０】
【化１０１】
Figure 2004535193
【０６１１】
オリゴビルディングブロックの調製
水性緩衝液（ｐＨ５〜８、好ましくは６〜７）中、ＥＤＣおよびＮＨＳを用いて、保護されたジアミンおよび二酸を、一次アミノ機能的部分を有する修飾されたオリゴヌクレオチドに結合させる。保護基（メチルエステルおよびトリフルオロアセトアミドの両方）を水性緩衝液（ｐＨ１０〜１２）中除去する。別法として、保護基はビルディングブロック上に残存し、オリゴヌクレオチド鋳型にアニールした後に除去される。
ライブラリー調製
【０６１２】
【化１０２】
Figure 2004535193
【０６１３】
重合：
ジアミンおよびジカルボン酸を有するオリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ６〜１０、好ましくは７〜９）に、適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、ペプチドカップリング試薬（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢｏＰ、ＰｙＢｒｏＰまたはＮ−メチル−２−クロロピリジニウムテトラフルオロボレートおよびペプチドカップリング修飾剤（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えば、これらに限定されないが、ＮＨＳ、スルホ−ＮＨＳ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、またはＤｈｂｔＯＨを添加する。反応は−２０℃から６０℃の間の温度で行われる。反応時間は１時間から１週間の間であり、好ましくは１時間から２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールの重合を例にあげるが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の他の反応体積を用いることができる。
【０６１４】
活性化（リンカー切断）：
酸（ｐＨ０〜５）で、０〜４０℃で１０分〜１０時間処理することによりリンカーを切断させる。
参考文献
(1) Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd ed.; John Wiley & Sons: New York, 1999.
(2) Hyrup, B.; Nielsen, P. E. Bioorganic & medicinal chemistry 1996, 4, 5-23.
(3) Schmidt, J. G.; Christensen, L.; Nielsen, P. E.; Orgel, L. E. Nucleic Acids Research 1997, 25, 4792-4796.
(4) Bohler, C.; Nielsen, P. E.; Orgel, L. E. Nature 1995, 376.
(5) Seeberger, P. H.; Haase, W. C. Chem. Rev. 2000, 100, 4349-4393.
(6) Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries; Seeberger, P. H., Ed.; Wiley-Interscience: New York, 2001.
(7) Wong, C.-H.; Whitesides, G. M. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry; Pergamon: Oxford, 1994.
【０６１５】
実施例（モデル）８３ 鋳型されたα−ペプチドのライブラリーからのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に対するα−ペプチドリガンドの単離
（Ａ）ヌクレオチド誘導体の合成
３つのヌクレオチド誘導体の合成法を以下のスキームにおいて合成の説明と共に示す。他の合成されたα−アミノ酸ヌクレオチド誘導体の例は文献に見いだすことができる（例えば、Ito et al. (1980) J. Amer. Chem. Soc. 102: 7535-7541; Norris et al. (1996) J. Amer. Chem. Soc. 118: 5769-5803; Celewicz et al (1998) Pol. J. Chem. 72: 725-734）。
【化１０３】
Figure 2004535193
【０６１６】
ＬＨ１、ＬＨ７の合成；ＥＤＣ（３．２ミリモル）を氷冷されたＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ｔｅｒｔ−ブトキシグルタメート（３．０ミリモル）またはＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−グリシン（３．０ミリモル）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液に添加する。４−ジメチルアミノピリジン（０．３ミリモル）および５−ヘキシノール（４．６ミリモル）のジクロロメタン（１ｍＬ）中溶液を添加する。反応混合物を１時間０℃で、次いで室温で一夜撹拌する。溶媒を蒸発させ、残留物をジエチルエーテル中に溶解させる。スラリーをＨＣｌ（０．１Ｍ、２５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで濃縮して油状物を得る。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
ＬＨ４の合成：６−ヨードヘキシン（６ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（６ミリモル）を、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−システイン（３ミリモル）のメタノール（５ｍＬ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に添加する。反応混合物を４０℃で１日撹拌し、次いで濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより分析する。
【０６１７】
ＬＨ２、ＬＨ５およびＬＨ８の合成：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．６ミリモル）およびＣｕＩ（０．２ミリモル）を、ヨードヌクレオシド（１ミリモル）、アルキン（２ミリモル）およびエチルジイソプロピルアミン（２ミリモル）のＤＭＦまたはエタノール（４ｍＬ）中脱気溶液に添加する。反応混合物をアルゴン雰囲気下で撹拌する。反応をＴＬＣにより追跡する。室温で反応が起こらないならば、反応物を５０℃で撹拌する。反応混合物を濃縮してシロップにし、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：水→メタノール）により分析する。一次ヒドロキシル基が反応中にアシル化される場合、対応するｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル保護ヨードヌクレオシドを未保護ヌクレオシドの代わりに使用する。エタノールおよび酢酸（８当量）の溶液中、化合物をテトラブチルアンモニウムフルオリド（４当量）で１日処理することにより、Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリング後にシリルエーテルを切断させ、続いて濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：水→メタノール）により分析する。
【０６１８】
ＬＨ３、ＬＨ６およびＬＨ９の合成：オキシ塩化リン（０．１１ミリモル）を氷水で冷却したヌクレオシド（０．１ミリモル）のトリメチルホスフェート（１ｍＬ）中溶液に添加する。反応混合物をアルゴン雰囲気下で０℃で１時間撹拌する。ビス−ｎ−トリブチルアンモニウムピロホスフェート（０．２ミリモル）のＤＭＦ（１ｍＬ）およびｎ−トリブチルアミン（１ｍＬ）中溶液を次いで添加する。反応混合物を１０分間撹拌し、次いで水（１ｍＬ）を添加した。混合物をトリエチルアミンで中和し、室温で６時間撹拌し、次いで真空中で濃縮し、イオン対交換ＲＰ ＨＰＬＣ（溶離剤１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム→８０％アセトニトリル中１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム）により分析する。水（１００μｌ）を混合物に添加し、次いでスラリーを０．１ｍｍＨｇで数回濃縮し、最後にゲル濾過（溶離剤：水）することにより、緩衝塩をヌクレオシドから除去する。
【０６１９】
（Ｂ）ライブラリーデザインおよびヌクレオシド誘導体の組み込み
鋳型プライマーにアニールされたプライマーの伸張により、鋳型されたライブラリーを製造することができる。鋳型プライマーはライブラリーをエンコードし、標準的方法、例えば、ホスホルアミダイトを用いた有機合成により調製することができる。様々な種類のオリゴヌクレオチドライブラリーを生成するために、例えば、オリゴヌクレオチドの合成において重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）、混合ホスホルアミダイトまたはドーピングを用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドライブラリーは、顧客の決めたオリゴヌクレオチドを製造する供給業者から購入することができる（例えば、DNA Technology A/S, Denmark or TAG Copenhagen A/S, Denmark）。
【０６２０】
エクステンションプライマー（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’）は鋳型プライマー（５’−ＧＴＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＣＤＤ ＤＡＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＣＡＧ ＴＡＧ Ｃ−３’）と共に用いられる。ここにおいて、Ｄ（下線部、国際生化学連合からの曖昧な定義を使用）はＡ、ＧまたはＴのいずれかである。エクステンションプライマーは以下に示すように鋳型プライマーと相補性である。エクステンション中、プライマーはＤＤＤ配列を越えて伸び、個々の鋳型の配列に従って、３つの位置でＴ−、Ｃ−、またはＡ−ヌクレオチド誘導体が挿入される。α−アミノ酸およびヌクレオチドに結合した前駆体の重合、およびアミノ酸およびヌクレオチドに結合したリンカーの切断により、少なくとも３３＝２７の異なるペプチドの理論的多様性を有するライブラリーが生じる。
【０６２１】
【化１０４】
Figure 2004535193
【０６２２】
８０℃に２分間加熱し、次いでゆっくりと約２０℃に冷却することにより、エクステンション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、約３ピコモルの各プライマーを用いて、エクステンションプライマーを鋳型プライマーにアニールする。ヌクレオチド誘導体を次いでそれぞれ濃度約２００μＭまで添加し、５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐａｒｔ＃９ＰＩＭ５１０）を用いて３０℃で１時間取り込んだ。スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて取り込まれないヌクレオチド誘導体を除去する。ヌクレオチド誘導体について記載したのと同じ条件を用いて、野生型ｄＮＴＰを添加することによりさらにエクステンションを行うことができる。別法として、ＤＤＤ配列の下流の配列にアニールされたオリゴヌクレオチドはエクステンションの前に添加される。二本鎖生成物を精製し、スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて別の緩衝液（１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）に移す。
【０６２３】
（Ｃ）重合およびリンカー切断
組み込まれたヌクレオチド誘導体の反応基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と一緒に結合する。これは共有結合アミンおよびカルボキシル基について慣例的方法である。カップリング条件の例は文献に記載されている（例えば、ＮＨＳカップリングキット、IAsys, code # NHS-2005）。
ＥＤＣおよびＮＨＳを精製された二本鎖エクステンション生成物に、それぞれ約１００ｍＭおよび１０ｍＭの適当な最終濃度で添加する。この反応物を３０℃で２〜１６時間インキュベートする。スピンカラムを用いて過剰の結合試薬を除去する。加水分解可能なリンカーの加水分解は、サンプルをｐＨ１１（例えば、０．２Ｍ ＮａＯＨ）で１５分間５０℃でインキュベートすることにより達成される。
【０６２４】
（Ｄ）選択
この特定のライブラリー中の可能な鋳型化された分子の一例は、ヌクレオチド誘導体ＬＨ３、ＬＨ６およびＬＨ９を使用する場合、グルタチオン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）である。ＤＮＡ鋳型上にグルタチオンを生成するための組み込み、反応基間の反応およびリンカーの切断を以下のスキームに示す。グルタチオンは特異的に、高い親和力で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と結合し、一般にＧＳＴ−融合タンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の精製に用いられることが知られている。グルタチオンはＧＳＴとの結合を妨害することなく硫黄原子により固定化することができることも公知である。従って、標的分子としてＧＳＴに対して選択を行うことにより、ライブラリー中の他の表示された分子の中で鋳型表示されたグルタチオンを濃縮することが可能である。ＧＳＴは文献に記載されているように組み換え形態において製造することができるか（例えば、Jemth et al. (1997) Arch. Biochem. Biophys. 348: 247-54）、または様々な供給業者（例えば、Sigma, product #, G5524）から入手することができる。別法として、グルタチオンに対する抗体（例えば、Abcam, product name ab64447 or Virogen, product # 101-A）を標的分子として用いることができる。
【０６２５】
【化１０５】
Figure 2004535193
【０６２６】
マイクロタイター鋳型を、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中約１μｇのストレプトアビジンで一夜４℃でコートする。ストレプトアビジン溶液を除去し、ウェルを少なくとも６回ＴＢＳ緩衝液で洗浄する。ウェルをＴＢＳ緩衝液中２％ＢＳＡ（使用できるブロッキング剤の他の例は、カゼイン、ゼラチン、ポリビニルピロリドンまたは乾燥スキンミルクである）で約３０分間３７℃でブロックする。プレートをＴＢＳ緩衝液で少なくとも３回洗浄する。０．１μｇのビオチニル化ＧＳＴをウェルに添加し、約３０分間２０℃でインキュベートする。少なくとも６回ＴＢＳ緩衝液で洗浄することにより未結合ビオチニル化ＧＳＴを除去する。文献に記載されているようにスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用して、ＧＳＴのビオチニル化を行う（Ellis et al. (1998) Biochem. J. 335; 277-284）。遊離ストレプトアビジン分子を１ｍＭビオチンで５分間ブロックし、ＴＢＳ緩衝液で少なくとも６回洗浄することにより過剰のビオチンを除去する。次いで鋳型化された分子ライブラリーをウェルに添加し、２０℃で約１時間インキュベートすることにより固定化ＧＳＴと結合させる。固定化ＧＳＴに配位結合しない鋳型化された分子を除去するために、ウェルをＴＢＳ緩衝液で少なくとも６回洗浄する。２０ｍｍ還元グルタチオンとともに約１０〜６０分間インキュベートすることによりＧＳＴに結合した鋳型化された分子を溶出し、次いでサンプルをウェルから新しい試験管に移す。
【０６２７】
溶出（選択）された鋳型は、２つの増幅プライマー（順、５’−ビオチン−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ−３’； ｒｅｖｅｒｓｅ， ５’−ＧＴＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＧＣ−３’）を用いて標準的ＰＣＲプロトコル（例えば、５ピコモルの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および２．５Ｕの熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ）で増幅される。ＰＣＲは、９４℃で５分間初期変性し、９４℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間のエクステンション、および７２℃で１０分間の最終エクステンションを３５サイクル行う。順プライマーにおける５’ビオチンはセンス鎖を除去するために用いられる。これは、ＰＣＲ生成物をストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（Dynabeads; Dynal Biotech, Norway）と共にインキュベートすることにより行われ、一本鎖鋳型を製造業者により記載されたようにして精製する。精製されたアンチセンス鎖を最終的に前記のようなエクステンションプライマーと共に鋳型プライマーとして使用して、さらにもう１ラウンドの選択のための鋳型化された分子の濃縮されたライブラリーが生じる。
【０６２８】
選択および増幅は、適当な濃縮が得られるまで繰り返される。濃縮は、回収された鋳型配列のキャラクタライゼーション（配列化）により追跡できる。鋳型のヌクレオチド配列は、標準的配列化プロトコルおよびＤＮＡシーケンサー（例えば、MegaBase, Amersham Pharmacia Biotech）を用いて得られる。グルタチオンをコードする配列（鋳型プライマーのＤ−Ｄ−Ｄ領域におけるＣ−Ａ−ＴまたはＴ−Ａ−Ｃ）の数が選択後のライブラリーにおける他の配列に比べて増大している場合に、濃縮される。
【０６２９】
このプロトコルは、３つの異なるモノヌクレオチド誘導体の組み込みを記載する。しかしながら、全てのモノヌクレオチド（ｄＧＴＰを含む）は前記のような鋳型化された分子のビルディングライブラリーにおいて用いることができる。さらに、これは異なるヌクレオチド誘導体の数を４に制限し、従ってライブラリーのサイズに４Ｎの限界が設定される（ここにおいて、Ｎは鋳型化された分子におけるサブユニットの数である）。しかしながら、例えば、ライブラリーサイズを１６Ｎに増大させるために、ビルディングブロックとしてジヌクレオチド誘導体を用いることができる。ジヌクレオチドのポリメラーゼによる組み込みは、すでに記載されている（ＷＯ０１／１６３６６Ａ２）。ライブラリーの多様性は、トリヌクレオチドまたはテトラヌクレオチドの組み込みを用いてさらに増大させることができる。
【０６３０】
実施例８４〜９９：オリゴヌクレオチドビルディングブロック合成の中間体化合物の調製
一般的実験法
【化１０６】
Figure 2004535193
【０６３１】
方法１ アミノ酸のＮ−トリフルオロアセチル保護の一般的手順
０℃のアミノ酸（２０ミリモル）のＣＦ３ＣＯＯＨ（１０ｍＬ）中撹拌溶液にゆっくりと（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（２４ミリモル）を添加した。反応混合物をゆっくりと室温まで上昇させ、撹拌しながら一夜放置した。反応混合物を蒸発乾固させた。固体の粗生成物をＥｔＯＡｃ／ヘプタンから再結晶させた。液体の粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１０：１またはＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２：１）により精製した。収率は一般的に８５％より高かった。
【０６３２】
方法２ アミノ酸のＮ−ベンジルオキシカルボニルおよびＮ−ビニルオキシカルボニル保護の一般的手順
アミノ酸（７．６ミリモル）の飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中撹拌溶液または微懸濁液に２Ｍ ＮａＯＨ（水性、３ｍＬ）を添加し、次いでベンジルクロロホルメートまたはビニルオキシクロロホルメート（８．４ミリモル）いずれかのＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中溶液を添加した。反応混合物を撹拌しながら室温で一夜放置した。ＴＬＣにより完全に変換されたことが示されたら、反応混合物にＨ２Ｏ（９０ｍＬ）を添加し、２Ｍ ＮａＯＨ（水性）を用いてｐＨを１０に調節した。反応混合物をＥｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、１Ｍ ＨＣｌ（水性）を用いてｐＨを２〜３に調節し、次いでＥｔ２ＯまたはＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）用いて抽出した。合した抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発乾固させて固体生成物を得、これをさらに精製せずに使用した。収率は一般に７０％よりも高かった。
【０６３３】
方法３ アミノ酸のＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護の一般的手順
アミノ酸（１５ミリモル）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）およびジオキサン（５ｍＬ）中微懸濁液に２Ｍ ＮａＯＨ（水性、６ｍＬ）を添加した。混合物を冷却し、０℃（氷浴）で撹拌し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートを添加した。さらに、２Ｍ水性ＮａＯＨ（４ｍＬ）を添加した。混合物をゆっくりと室温に加熱し（５時間にわたる）、撹拌しながら室温で一夜放置した。反応混合物にジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、２Ｍ ＨＣｌ（水性）を用いてｐＨを調節した（〜１０ないし〜３）。ジエチルエーテル（３×２０ｍＬ）を用いて水性相を抽出した。合した抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発乾固させて、白色固体生成物を得、これをさらに精製せずに使用した。収率は典型的には６０〜７５％であった。
【０６３４】
方法４ Ｎ−保護アミノ酸のＮＨＭエステルを形成するための一般的手順
０℃、Ｎ２下のＮ−保護アミノ酸（０．５ミリモル）およびＮ−ヒドロキシマレイミド（０．６２ミリモル）の無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中撹拌溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．６４ミリモル）を添加し、溶液をゆっくりと室温まで上昇させ、撹拌しながら一夜放置した。反応混合物を濾過し、沈殿を少量のＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２／１で洗浄した。濾液をほとんど乾固するまで蒸発させ、最少量のＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２／１）にかけ、典型的には６０〜７０％で白色固体として生成物を得た。
方法５：カルボン酸塩化物からＮＨＭエステルを形成するための一般的手順
０℃のＮ−ヒドロキシマレイミド（４ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（１６ｍＬ）中撹拌溶液にカルボン酸塩化物（４ミリモル）を添加した。反応混合物を室温にゆっくりと上昇させ、一夜撹拌しながら放置した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１６ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸（水性、３×２５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（水性、２×２５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（水性、１×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発乾固させて、ワックスまたは液状物として４０〜６０％の収率で生成物を得た。生成物はさらに精製を必要とせず使用した。
【０６３５】
【化１０７】
Figure 2004535193
【０６３６】
方法６ メルカプタンのＳ−トリチル化の一般的手順
室温のメルカプタン（２０ミリモル）およびピリジン（４０ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（７４ｍＬ）中溶液にトリチルクロリド（２２ミリモル）を添加し、反応物を撹拌しながら一夜放置した。反応混合物の体積を最少量まで減少させ、次いでフラッシュクロマトグラフィーにかけた（カラムに充填する前にピリジンで前処理されたＳｉＯ２）（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１０／０．５）。生成物を油状物または場合によっては粘稠性ワックスとして単離した。
【０６３７】
方法７ ４−ヒドロキシベンズアルデヒドのＯ−アシル化の一般的手順
０℃のヒドロキシベンズアルデヒド（２０ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中撹拌溶液に、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）中酸塩化物（２５ミリモル）をゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で１５分間、室温で１時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を添加し、反応混合物をエーテルで抽出した（３×１０ｍＬ）。合した有機相を水で洗浄し（２×１０ｍＬ）、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をジクロロメタン（５ｍＬ）中に再溶解させ、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒を真空中で除去した。収率は一般に７５％よりも高かった。
【化１０８】
Figure 2004535193
【０６３８】
方法８：ジアミノポリエチレングリコールの形成の一般的手順
Baker et al. J. Org. Chem. (1999), 64, 6870-6873により記載されてるようにして得られた対応するポリエチレングリコール−ジオール（０．８ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。トシルクロリド（２．４４ミリモル）を添加し、反応混合物を氷上で冷却した。水（２ｍＬ）中に溶解させたＮａＯＨ（５．５ミリモル）を滴下し、反応混合物を室温で一夜撹拌した。反応混合物をジエチルエーテルで抽出し（３×５ｍＬ）、合した有機相をＮａＣｌ（飽和、３×３ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。粗生成物を乾燥アセトニトリル（３ｍＬ）中に再溶解させ、ＮａＮ３（２．８ミリモル）で処理した。反応混合物を７５℃に一夜加熱した。白色固体を濾過し、アセトニトリル（２×２ｍＬ）で抽出した。トリフェニルホスフィン（２．８ミリモル）および水（２ｍＬ）を合した有機相に添加し、反応混合物を一夜撹拌した。ＩＲＡ−１２０Ｈ＋（１ｇ）を添加し、反応混合物を１時間撹拌した。ビーズを濾過し、ジクロロメタンで洗浄し（１０×３ｍＬ）、最終化合物を６Ｍ ＨＣｌ（水性、１０×３ｍＬ）で溶出した。溶液を真空中で蒸発させて、ジアミノポリエチレングリコールを４０〜５０％の収率で得た。
【０６３９】
実施例８４：３−フェニル−３−ｔｅｒｔブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステル（ＸＶＩ）の調製
【化１０９】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能なＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸から、方法３、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 7.28-7.42 (m, 5H(ar)); 6.74 (s, 2H); 5.1-5.3 (m, 2H (NH+CH)); 3.24 (dd, 1H); 3.13 (dd, 1H); 1.46 (s, 9H)
【０６４０】
実施例８５：３−ｔｅｒｔブトキシカルボニルアミノ−ブタン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１０】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能なＤＬ−３−アミノ酪酸から方法３、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 6.80 (s, 2H); 4.83 (br s, 1H(NH)), 4.05-4.15 (m, 1H); 2.8-2.95 (m, 2H); 1.46 (s, 9H); 2.56 (d, 3H)
【０６４１】
実施例８６：３−ｔｅｒｔブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１１】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能なベータ−アラニンから方法３、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 6.80 (s, 2H); 5.09 (br s, 1H(NH)); 3.48-3.54 (m, 2H); 2.84 (t, 2H); 1.45 (s, 9H)
【０６４２】
実施例８７：３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−フェニル−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステル３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−フェニル−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１２】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能なＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸から方法２、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 7.55-7.20 (m, 10H); 6.75 (s, 2H); 5.55 (br., 1H); 5.35-5.25 (m, 1H); 5.15 (s, 2H); 3.35-3.10 (m, 2H)
【０６４３】
実施例８８：３−フェニル−３−ビニルオキシカルボニルアミノ−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１３】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能なＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸から方法２、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 7.45-7.30 (m, 5H); 7.20 (dd, 1H); 6.75 (s, 2H); 5.75-5.60 (br., 1H); 5.30 (q, 1H); 4.70 (d, 1H); 4.50 (d, 1H); 3.30-3.15 (m, 2H)
【０６４４】
実施例８９：トリチルスルファニル酢酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１４】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能な２−メルカプト酢酸から方法６、続いて方法４を用いて調製した。
1H-NMR (CDCl3): 7.45-7.20 (m, 15H); 6.75 (s, 2H); 3.20 (s, 2H)
【０６４５】
実施例９０：（Ｒ）−２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−３−トリチルスルファニル−プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステル（ＸＸＩＩ）
【化１１５】
Figure 2004535193
化合物を３段階で商業的に入手可能なＬ−システインから方法１、続いて方法６および方法４を用いて調製した。
【０６４６】
実施例９１：酢酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１６】
Figure 2004535193
化合物を１段階で商業的に入手可能なアセチルクロリドおよびＮ−ヒドロキシマレイミドから方法５を用いることにより調製した。
1H-NMR (CDCl3): 6.75 (s, 2H); 2.35 (s, 3H)
【０６４７】
実施例９２：プロピオン酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１７】
Figure 2004535193
化合物を１段階で商業的に入手可能なプロパノイルクロリドおよびＮ−ヒドロキシマレイミドから方法５を用いることにより調製した。
1H-NMR (CDCl3): 6.75 (s, 2H); 2.65 (q, 2H); 1.80 (t, 3H)
【０６４８】
実施例９３：酪酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１８】
Figure 2004535193
化合物を１段階で商業的に入手可能なブタノイルクロリドおよびＮ−ヒドロキシマレイミドから方法５を用いることにより調製した。
1H-NMR (CDCl3): 6.75 (s, 2H); 2.60 (t, 2H); 1.80 (sxt, 2H); 1.05 (t, 3H)
【０６４９】
実施例９４：Ｓ−トリチル−４−メルカプト安息香酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステルの調製
【化１１９】
Figure 2004535193
化合物を２段階で商業的に入手可能な４−メルカプト安息香酸から、方法６に従ってＳ−トリチル化し、続いて方法４に従ってエステル化することにより調製した。
1H-NMR (CDCl3): 8.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45-7.20 (m, 15H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.80 (s, 2H)
【０６５０】
実施例９５：テトラキス（アミノメチル）メタンテトラヒドロクロリドの調製
【化１２０】
Figure 2004535193
テトラキス（アミノメチル）メタンテトラヒドロクロリドを、Fleischer et al. J. Org. Chem. (1971), 36, 3042-44と比べて若干変更した方法により調製した。ペンタエリスリトール（２．０１ｇ；１４．７６ミリモル）を乾燥ピリジン（５０ｍＬ）中トシルクロリド（１４．０７ｇ；７３．８１モル）と混合した。混合物を一夜攪拌した。粗反応混合物を水（１００ｍＬ）に移した。ＭｅＯＨ（２００ｍｌ）および濃ＨＣｌ（８０ｍＬ）を添加し、白色沈殿を濾過し、水（１００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で洗浄した。ＬＣ−ＭＳはペンタエリスリトールテトラトシレートを示した。ペンタエリスリトールテトラトシレート（４．０ｇ、５．３１ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＮ３（３．４５ｇ；５３．１ミリモル）を添加した。反応混合物を１００℃に一夜加熱した。水（１００ｍＬ）を添加し、反応混合物をジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。ＴＨＦ（３００ｍＬ）を添加し、ジエチルエーテルを真空中で除去した。トリフェニルホスフィン（６．９５ｇ、２６．５ミリモル）および濃ＮＨ３（２５ｍＬ）をＴＨＦ溶液に添加し、反応混合物を一夜攪拌した。溶媒を真空中で除去し、ジクロロメタン（５００ｍＬ）中に再溶解させ、２Ｍ ＨＣｌ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。水性相をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で蒸発させた。ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を添加し、白色固体を濾過し、ＭｅＯＨ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。収量１．１２ｇ（７６％）。
1H-NMR (D2O): 3.28 (s)
【０６５１】
実施例９６：４−ホルミル−フェニルエステルの調製
【化１２１】
Figure 2004535193
化合物を方法７に従って商業的に入手可能な４−ヒドロキシベンズアルデヒドから調製した。
1H-NMR (CDCl3): 10.00 (s, 1H), 7.90 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.65 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.32 (d, J = 7.5 Hz, 3H)
【０６５２】
実施例９７：ブタン酸４−ホルミル−フェニルエステルの調製
【化１２２】
Figure 2004535193
化合物を方法７に従って商業的に入手可能な４−ヒドロキシベンズアルデヒドから調製した。
1H-NMR (CDCl3): 9.95 (s, 1H), 7.94 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.80 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.00 (d, J = 7.5 Hz, 3H)
【０６５３】
実施例９８：３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカノキサペンタトリアコンタン−１，３５−ジアミンの調製
【化１２３】
Figure 2004535193
方法８に従って収率４８％で調製した。ＭＳ−Ｈ＋＝５４５．２（予想ＭＳ−Ｈ＋＝５４４．６）。
【０６５４】
実施例９９：３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９−トリデカノキサヘンテトラコンタン−１，４１−ジアミンの調製
【化１２４】
Figure 2004535193
（０５０２８）方法８に従って収率４０％で調製した。ＭＳ−Ｈ＋＝６３３．３（予想ＭＳ−Ｈ＋＝６３２．８）。
【０６５５】
実施例１００：ジッパーボックスを有するオリゴヌクレオチドリンカーの設計および試験
異なるデザインのジッパーボックスの有効性を試験するために、実験１００−１から１００−４を行った。データをすぐ下に記載し、続いてデータの考察を記載する。
物質
緩衝液
緩衝液Ａ：（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ＝７．５、１Ｍ ＮａＣｌ）
緩衝液Ｂ：（１００ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ＝６、１Ｍ ＮａＣｌ）
緩衝液Ｃ：（１００ｍＭ ホウ酸ナトリウム ｐＨ＝９、１Ｍ ＮａＣｌ）
緩衝液Ｄ：（１００ｍＭ ホウ酸ナトリウム ｐＨ＝１０、１Ｍ ＮａＣｌ）
緩衝液Ｅ：（５００ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ＝７、１Ｍ ＮａＣｌ）
緩衝液Ｆ：（５００ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ＝８、１Ｍ ＮａＣｌ）
ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアニーリング
【０６５６】
関連する緩衝液中オリゴを混合し、８０℃に加熱し、次いで２８℃に冷却した（−２℃／３０秒）
３２Ｐでの５’−標識
２００ピコモルのオリゴヌクレオチド、２μｌ １０×リン酸化緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａｃａｔ＃４１０３）、１μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃４１０３）、１μｌ γ−３２Ｐ ＡＴＰ、Ｈ２Ｏを２０μｌまで混合する。３７℃で１０〜３０分間インキュベートする。
ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
サンプルをホルムアミド染料と１：１で混合し（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０．０２５％キシレンシアノール、０．０２５％ブロモフェノールブルー）、８０℃で２分間インキュベートし、変性１０％ポリアクリルアミドゲルにかける。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘフィルム）を用いてゲルを展開する。
【０６５７】
オリゴヌクレオチドビルディングブロック
Figure 2004535193
ジッパーボックス配列に下線を施す。
【０６５８】
【化１２５】
Figure 2004535193
【０６５９】
実験１００−１（図５６）
２μｌの緩衝液Ｂ、５μｌのＡｈ３６（０．４ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３７（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＨ２Ｏを混合する。
２μｌの緩衝液Ｂ、５μｌのＡｈ３６（０．４ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３７（２ピコモル／ｕｌ）、２μｌのＨ２Ｏを混合する。
８０℃に加熱することによりアニールし、次いで４４℃に冷却する（−２℃／３０秒）
１μｌの１００ｍＭ ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ ＥＤＣを添加する。表示された温度（以下を参照）で４５分間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。約２時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度：
４５℃、４８．２℃、５３．０℃、５８．５℃、６３．１℃、６５．６℃
【０６６０】
実験１００−２（図５７、ＡおよびＢ）
２μｌの緩衝液Ｂ、１μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する。
２μｌの緩衝液Ｂ、１μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、６μｌのＨ２Ｏを混合する。
８０℃に加熱することによりアニールし、次いで３５℃に冷却するか（−２℃／３０秒）（温度１〜６）、または８０℃に加熱し、ついで１５℃に冷却する（−２℃／３０秒）（温度７〜１２）。
１μｌの１００ｍＭ ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ ＥＤＣを添加する。表示された温度（以下を参照）で１時間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。１時間インキュベートし、次いで前記のように１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【０６６１】
インキュベーション温度：
１）３４．９℃、２）３６．３℃、３）４０．３℃、４）４５．７℃、５）５１．０℃、６）５５．７７、７）１４．９℃、８）１７．８℃、９）２２．７℃、１０）２８．３℃、１１）３１．０℃、１２）３６℃
２μｌの緩衝液Ｂ、０．５μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、５．５μｌのＨ２Ｏを混合する。
２μｌの緩衝液Ｂ、０．５μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、６．５μｌのＨ２Ｏを混合する。
８０℃に加熱することによりアニールし、次いで５℃に冷却する（−２℃／３０秒）。
１μｌの１００ｍＭ ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ ＥＤＣを添加する。異なる温度（以下を参照）で１時間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。１時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【０６６２】
インキュベーション温度：
１）５．９℃、２）９．９℃、３）１２．６℃、４）１８．３℃、５）２３．３℃、６）２７．９℃、７）３５．６℃、８）４５．９℃
【０６６３】
実験１００−３（図５８、ＡおよびＢ）
２μｌの緩衝液Ａ、１μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する。（下記の表参照）。前記のようにアニールする。
１μｌの１００ｍＭ ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ ＥＤＣを添加する。異なる温度でインキュベートする。１）７．７℃、２）１５．４℃、３）２１．０℃、４）２６．２℃で約２時間、５）１０℃で１秒間、次いで３５℃で１秒間、９９回繰り返す。１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【０６６４】
【表４】
Figure 2004535193
【０６６５】
実験１００−４（図５９）
２．５μｌの緩衝液Ａ、１μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、４．５μｌのＨ２Ｏを混合する。（下記の表参照）。８０℃に加熱することによりアニールし、次いで３０℃または５５℃に冷却する。１μｌの１００ｍＭ ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ ＥＤＣを添加する。３０℃または５５℃でインキュベートする。次いで、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【０６６６】
【表５】
Figure 2004535193
【０６６７】
結果の考察
反応基（アミンまたはカルボン酸）を有するオリゴ（ここにおいて、反応基とアニーリング領域を結合するリンカーは約２５ヌクレオチドであった）を用いて架橋効率を調べた。
実験において、オリゴヌクレオチドＡｈ３６（カルボン酸を有する）およびＡｈ６７（アミンを有する）を用いた。使用した鋳型（Ａｈ３８）は、直接隣接する、すなわち塩基対の間隔が０の２つのオリゴヌクレオチドをアニールする。実験の条件下で、５％未満の架橋効率が観察され、試験した最高の温度のみで観察される（図５８、ＡおよびＢ、レーン５）。
【０６６８】
架橋効率を向上させるために、本発明者らはいわゆるジッパーボックス配列をそれぞれオリゴＡｈ６７およびＡｈ３６の５’−および３’−末端（反応基を有する同じ末端）に導入した。ジッパーボックスは相補配列であり、従って２つのオリゴの反応基を近づける。２つの長さが異なるジッパーボックス、すなわち、１０’ｍｅｒジッパーボックス（１０塩基対のＤＮＡ二本鎖を形成するＡｈ３７／Ａｈ３６）および５’ｍｅｒジッパーボックス（５塩基対のＤＮＡ二本鎖を形成するＡＨ３６／Ａｈ５１）を試験した。以下の図を参照のこと。
【０６６９】
【化１２６】
Figure 2004535193
【０６７０】
さらに、たとえば、反応基がジッパーボックスに直接隣接して結合するか（Ａｈ３６、Ａｈ３７およびＡｈ３６／Ａｈ５１）、またはジッパーボックスから２ヌクレオチド上流にあるか（Ａｈ６５／Ａｈ６６）、またはジッパーボックスの真ん中にある（Ａｈ６７）オリゴなどの異なるデザインのジッパーボックスを試験した。
本発明者らは、架橋効率に関して５’ｍｅｒジッパーボックスの効果をまず試験した。わかるように、５’ｍｅｒジッパーボックスは大きく架橋効率を向上させる（図５８、ＡおよびＢ、レーン３とレーン５を比較）。鋳型は試験されたすべての温度で架橋に絶対的に必要である。最高の架橋効率は、温度が１０℃と３５℃の間で９９回上下する際に得られる（図５８Ｂ）。温度が２１℃または２６℃に一定に保たれる場合にも高い架橋効率が得られる（図５８ＡおよびＢ、レーン３）。架橋効率は２６℃より高い温度ではさらに向上されない（図５７、ＡおよびＢ）。
【０６７１】
本発明者らは次に１０’ｍｅｒジッパーボックスフォーマットにおいて架橋の効率を試験した。オリゴＡｈ３６およびＡｈ３７を鋳型Ａｈ３８にアニールし、架橋効率を様々な温度で試験した。鋳型の不在下で驚くほど高度の架橋が観察された（図５５、４５℃および４８．２℃）。しかしながら、５８．５℃より高い温度では、鋳型の不在下で架橋は観察されない。
次に、ジッパーボックスに対して異なる位置の反応基を試験した。図５８、ＡおよびＢ、レーン７に示すように、２つの反応基の一方がジッパーボックスの真ん中に位置する場合（すなわち、反応基が、ＤＮＡ二重螺旋形成に関与するヌクレオチドと結合する；Ａｈ６７）に架橋効率は大きく減少する。
ジッパーボックスに対する反応基の位置を１０’ｍｅｒジッパーボックスに関連しても試験した。これに関連して、両反応基はジッパーボックスから２ヌクレオチド（Ａｈ６５、Ａｈ６６）により隔てられ、架橋効率は若干減少する（図５９、レーン１と３を比較）。Ａｈ６５、ＡＨ６６、ＡＨ３６およびＡｈ３７の異なる組み合わせを試験する場合（すなわち、反応基がジッパーボックスのすぐ隣にあるか、または２ヌクレオチド上流にある場合）に架橋効率は大きく変化しない。鋳型は１０’ｍｅｒジッパーボックスに関連してすべての温度で絶対的には必要ではない。この鋳型独立性は低い温度で特に顕著である（たとえば、図５９、３０℃）。
【０６７２】
実施例１０１〜１０４：オリゴヌクレオチドビルディングブロックを調製するための一般的方法
実施例１０１：カルボン酸を含むオリゴヌクレオチドをアミノまたはアミノメチル末端のリンカーに変換する手順
【０６７３】
修飾された核塩基とカルボン酸部分を含む次のオリゴを慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した。
Figure 2004535193
Ｘを商業的に入手可能なカルボキシ−ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３５−９０）を用いて組み込んだ。下線の核塩基は、ジッパー領域を表す。
【０６７４】
変換の概略図
【化１２７】
Figure 2004535193
【０６７５】
オリゴ（２０ピコモル）をジアミノ化合物（０．１Ｍ溶液を２０ｕＬ）、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ溶液を１５ｕＬ、ｐＨ＝６）、ＮＨＳ（１００ｍＭ溶液を５ｕＬ）およびＥＤＣ（新たに調製された１Ｍ溶液を５ｕＬ）と混合した。混合物を３０℃で４５分間放置し、ホウ酸ナトリウム（１００ｍＭ溶液を２０ｕＬ、ｐＨ＝１０）で処理し、さらに４５分間３０℃で放置した。オリゴを慣例のＥｔＯＨ沈殿により精製した。生成物を３２Ｐで末端標識し、ＰＡＧＥにより純度を分析した。すべての場合において、出発オリゴは検出されず、ゲル上でよりゆっくりと移動する新しいバンドが出現した。
使用したジアミノ化合物の例：ＸＸＸ、ＸＸＸＩおよび商業的に入手可能なＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られるＤ１５，７８０−５）。
【０６７６】
実施例１０２：カルボン酸含有オリゴヌクレオチドをトリスアミンスカフォード（ｓｃａｆｆｏｌｄ）ビルディングブロックに変換する方法
修飾された核塩基と、カルボン酸部分を含有する次のオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した：
Figure 2004535193
Ｘを商業的に入手可能なカルボキシ−ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３５−９０）を用いて組み込んだ。下線の核塩基は、ジッパー領域を表す。
【０６７７】
反応の概略図
【化１２８】
Figure 2004535193
【０６７８】
１つの修飾された核塩基とカルボン酸部分（１ナノモル）を含有するオリゴを、水（１００ｕＬ）、ｈｅｐｅｓ緩衝液（２００ｍＭを４０ｕＬ、ｐＨ＝７．５）、ＮＨＳ（１００ｍＭ溶液を２０ｕＬ）、ＥＤＣ（新たに調製された１Ｍ溶液を２０ｕＬ）およびテトラアミン（ＸＸＶＩＩ）（１００ｍＭ溶液を２０ｕＬ）と混合した。反応混合物を室温で一夜放置した。反応混合物を室温で一夜放置した。真空中で蒸発させることにより体積を６０ｕＬに減少させた。濃ＮＨ３（２０ｕＬ）を添加し、続いてＨＰＬＣ精製することにより純粋なオリゴが得られた。次の勾配を用いて約６分後にピークを単離できた：０〜３分１００％Ａ、次いで３〜１０分１５％Ａと８５％Ｂ、次いで１０〜１５分１００％Ｂ、次いで１５分〜２０分１００％Ａ。Ａ＝１０ｍＭ ＴＥＡＡ中２％アセトニトリル、Ｂ＝１０ｍＭ ＴＥＡＡ中８０％アセトニトリル。
ＨＰＬＣ精製後、２〜３ピコモルを３２Ｐで末端標識し、ＰＡＧＥゲルにより純度を分析した（図６０参照）。ＰＡＧＥゲルにより、テトラアミン（ＸＸＶＩ）が修飾された核塩基とカルボン酸部分を含有するオリゴと結合することがわかる。
レーン１：参考オリゴＦ
レーン２：オリゴＦのＨＰＬＣ精製されたトリスアミン生成物
レーン３：参考オリゴＧ
レーン４：オリゴＧのＨＰＬＣ精製されたトリスアミン生成物
レーン５：参考オリゴＨ
レーン６：オリゴＨのＨＰＬＣ精製されたトリスアミン生成物
【０６７９】
実施例１０３：機能的部分をチオオリゴと結合させるための一般的手順
修飾された核塩基と、Ｓ−トリフェニルメチル保護チオ部分を含有する次のオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した：
Figure 2004535193
【０６８０】
Ｗを商業的に入手可能なチオ修飾剤ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１９２６−９０）を用いて組み込んだ。Ｂは、商業的に入手可能なホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１９５３−９５）を用いて組み込まれた内部ビオチンである。下線およびイタリック体の核塩基は、ジッパー領域を表す。
Ｓ−トリフェニルメチル保護されたチオオリゴ（１０ナノモル）を真空中で蒸発させて、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を２００ｕＬ、ｐＨ＝６．４）中に再懸濁させた。ＡｇＮＯ３（１Ｍ溶液を３０ｕＬ）を添加し、混合物を室温で１〜２時間放置した。ＤＴＴ（１Ｍ溶液を４６ｕＬ）を添加し、５〜１０分間放置した。反応混合物をスピンダウンし（２０．０００Ｇで２０分間）、上清を集めた。固体を追加のＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を１００ｕｌ、ｐＨ＝６．４）で抽出した。慣例のＥｔＯＨ沈殿により純粋なチオオリゴを得た。
【０６８１】
反応の概略図：
【化１２９】
Figure 2004535193
チオオリゴ（１ナノモル）を真空中で乾燥し、ジメチルホルムアミド（０．１Ｍ溶液を５０ｕｌ）中、機能的部分（０５０８７）を含むビルディングブロックで処理し、一夜室温で放置した。チオオリゴをスピンダウンし（２０．０００Ｇで１０分間）、上清を除去した。ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）を添加し、ロードされたチオオリゴをスピンダウンした（２０．０００Ｇで１０分間）。ジメチルホルムアミドを除去し、ロードされたチオオリゴをＴＥＡＡ緩衝液中に再懸濁し（０．１Ｍ溶液を２５ｕｌ、ｐＨ＝６．４）、ＨＰＬＣにより分析した。
使用したビルディングブロックの例：ＸＸＶＩ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ）
【０６８２】
実施例１０４：アミノまたはアミノメチル末端オリゴに機能的部分を結合させるための一般的方法
Figure 2004535193
修飾された核塩基とアミノ基を含有する次のオリゴを慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した：
Ｚは、商業的に入手可能なアミノ修飾剤Ｃ６ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３９−９０）を用いて組み込まれたアミノ基を有する修飾された核塩基を含む。
さらに、すでに記載したようにしてオリゴＣ−Ｅを対応するアミノメチル末端オリゴに変換した。
【０６８３】
以下に概略図を示す次の実験においてオリゴを使用した：
【化１３０】
Figure 2004535193
アミノまたはアミノメチルオリゴ（３ピコモル）をリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ溶液３ｕＬ、ｐＨ＝６）およびＮａＢＨ３ＣＮ（ＭｅＯＨ中１Ｍ溶液を３ｕＬ）と混合した。機能的部分を含むビルディングブロック（ＭｅＯＨ中１Ｍ溶液を３ｕｌ）を添加し、混合物を一夜室温で放置した。生成物の形成をＰＡＧＥゲルにより分析した（図６１参照）。
使用したビルディングブロックの例：ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、および商業的に入手可能な４−アセトキシベンズアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られる２４，２６０−８）。
【０６８４】
図６０は修飾された核塩基とアミノ基を含有するオリゴのローディングのＰＡＧＥ分析を示す（化合物ＸＸＩＶ）。
レーン１は参考アミノオリゴ（Ｎ）を示す。
レーン２は機能的部分を含むビルディングブロックをロードした後のアミノオリゴ（Ｎ）を示す。
レーン３は、ｐＨ＝１１で１時間処理することによる、レーン２において結合した機能的部分の除去を示す。
【０６８５】
実施例１０５：スカフォードおよび置換基が鋳型によりエンコードされる有機化合物のテンプレートされた合成のための一般的方法
【化１３１】
Figure 2004535193
【０６８６】
鋳型オリゴ（１ナノモル）を、機能的部分をロードされたチオオリゴ（ＬまたはＭ）（ＸＸＩＩＩまたはＸＶＩＩ、それぞれ１ナノモル）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液を２０ｕＬ、ｐＨ＝７．５）中アミノオリゴＯおよび水（最終体積１００ｕＬまで添加）と混合した。５０℃に加熱し、３０℃に冷却する（−２０℃／３０秒）ことにより、オリゴを鋳型にアニールした。混合物を次いで一夜温度を変動させて放置した（１０℃で１秒、次いで３５℃で１秒）。ストレプトアビジンビーズ（１００ｕＬ、２×１ｍＬ １００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液および１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５であらかじめ洗浄）の添加により、オリゴ複合体をストレプトアビジンと結合させた。ビーズをｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＬ）で洗浄した。水（２００ｕＬ）を添加し、続いて７０℃で１分間加熱することにより、アミノオリゴをストレプトアビジン結合複合体から分離した。水を移し、真空中で蒸発させ、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を４５ｕｌ）中に再懸濁し、生成物の形成をＨＰＬＣにより分析した（図６２参照）。
【０６８７】
図６２は、機能的部分の、修飾された核塩基とアミノ基を含有するオリゴへの移動を示す。
Ａ）上のクロマトグラムは、参考アミノオリゴO: 5'-GAC CTG TCG AGC ATC CAG CTT CAT GGC TGA GTC CAC AAT GZを示す。Ｚは、商業的に入手可能なアミノ修飾剤Ｃ６ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３９−９０）を用いて組み込まれた修飾された核塩基とアミノ基を含む。
Ｂ）真ん中のクロマトグラムは、機能的部分（ＸＸＩＩＩ）の部分的移動後のストレプトアビジン精製アミノオリゴＯを示す。
Ｃ）下のクロマトグラムは、さらに親油性の機能的部分（ＸＶＩＩ）が完全に移動した後のストレプトアビジン精製アミノオリゴＯを示す。次の勾配を使用した：０〜３分１００％Ａ、次いで３〜１０分１５％Ａおよび８５％Ｂ
鋳型オリゴが省略された実験では、非鋳型生成物の形成は示されなかった。この結果から、テンプレートされた合成の有効性は８０〜１００％であることがわかる。効率が１００％よりも少ない理由は、おそらくは、機能的部分の加水分解切断による。
【０６８８】
実施例１０６：スカフォードおよび２つの同一の置換基が鋳型によりエンコードされる、スカフォード分子のテンプレートされた合成の一般的方法
【化１３２】
Figure 2004535193
【０６８９】
鋳型オリゴ（１ナノモル）を、同じ機能的部分（ＸＸＶＩ；１ナノモル）でロードされた２つのチオオリゴ（ＫおよびＬ）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（１００ｍＭ ｈｅｐｅｓおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ＝７．５を２０ｕｌ）中トリスアミンオリゴＨ（１ナノモル）および水（最終体積１００ｕＬまで添加）と混合した。５０℃に加熱することによりオリゴを鋳型とアニールし、３０℃に冷却した（−２℃／３０秒）。混合物を温度を変動させて一夜放置した（１０℃で１秒間、次いで３５℃で１秒間）。ストレプトアビジンビーズ（１００ｕＬ、２×１ｍＬの１００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液および１Ｍ Ｎａｃｌ、ｐＨ＝７．５であらかじめ洗浄）の添加により、オリゴ複合体をストレプトアビジンと結合させた。ビーズをｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＬ）で洗浄した。水（２００ｕＬ）を添加し、続いて７０℃に加熱することにより、トリスアミンスカフォードオリゴＨをストレプトアビジン結合複合体から分離した。水を移し、真空中で蒸発させ、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を４５ｕＬ）中に再懸濁させ、生成物形成をＨＰＬＣにより分析した（図６３参照）。
【０６９０】
ＨＰＬＣクロマトグラムは、２つの機能的部分の３つのアミノ基を有するスカフォードオリゴへの移動を示す。
Ａ）上のクロマトグラムは、参考スカフォードオリゴＧを示す。
Ｂ）下のクロマトグラムは、１（７．９５分でのピーク）および２（１０．７６分でのピーク）の同一の機能的部分（ＸＸＶＩ）の部分的移動後のストレプトアビジン精製スカフォードオリゴＧを示す。次の勾配を使用した：０〜３分１００％Ａ、次いで３〜１０分１５％Ａおよび８５％Ｂ、次いで１０〜１５分１００％Ｂ。Ａ＝１０ｍＭ ＴＥＡＡ中２％アセトニトリル、Ｂ＝１０ｍＭ ＴＥＡＡ中８０％アセトニトリル。
機能的部分の親油性のために、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、２つの機能的部分を有するスカフォード分子の保持時間は１つの機能的部分と比較して長かった。２つの同一の機能的部分（ＸＸＶＩ）を有するスカフォード分子のテンプレートされた合成の効率は約２５％であった（図６３において１０．７６分でのピーク）。
【０６９１】
実施例１０７：スカフォードおよび３つの置換基が鋳型によりエンコードされるスカフォード分子の鋳型合成の方法
【化１３３】
Figure 2004535193
【０６９２】
方法Ａ（５−ｍｅｒジッパーボックス）：鋳型オリゴ（１ナノモル）を、３つの異なる機能的部分（ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩ、それぞれ：１ナノモル）をロードした３つのオリゴ（Ｊ−Ｌ）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（１００ｍＭ ｈｅｐｅｓおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ＝７．５を２０ｕＬ）中トリスアミンスカフォードオリゴＨ（１ナノモル）および水（最終体積１００ｕＬまで添加）と混合した。５０℃に加熱することにより、オリゴを鋳型にアニールし、３０℃に冷却した（−２℃／３０秒）。混合物を、一夜温度を変動させて放置した（１０℃で１秒、次いで３５℃で１秒）。ストレプトアビジンビーズ（１００ｕＬ、２×１ｍＬ １００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液および１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５であらかじめ洗浄）の添加により、オリゴ複合体をストレプトアビジンと結合させた。ビーズをｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＬ）で洗浄した。水（２００ｕＬ）を添加し、続いて７０℃に加熱することにより、トリスアミンスカフォードオリゴをストレプトアビジン結合複合体から分離した。水を移し、真空中で蒸発させ、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を４５ｕＬ）中に再懸濁させ、エンコードされた分子の形成をＨＰＬＣにより確認した。
【０６９３】
方法Ｂ（９−ｍｅｒジッパーボックス）：鋳型オリゴ（１５ピコモル）を３つの異なる機能的部分（ＸＸＶＩＩ、ＸＸＩＸおよび４−アセトキシベンズアルデヒド、それぞれ：２０ピコモル）をロードした３つのメチルアミノオリゴ（Ｃ−Ｅ）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（１００ｍＭ ｈｅｐｅｓおよび１Ｍ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ＝７．５を６．５ｕＬ）中Ｐ３２標識されたトリスアミンスカフォードオリゴ１（１５ピコモル）と混合した。混合物を５８．５℃に加熱し、５８．５℃で５日間放置した。エンコードされた分子の形成をＰＡＧＥにより確認した。
【０６９４】
実施例１０８（モデル）：３−ｍｅｒβ−アミノ酸ライブラリー調製の説明
Ａ）β−アミノ酸ビルディングブロックの合成
Ｎ−末端保護：Ｎｖｏｃ基１（３，６−ジメトキシ−６−ニトロベンジルオキシカルボニル）を光切断可能なＮ−保護基として使用し、次の方法に従ってβ−アミノ酸上に導入した：
【化１３４】
Figure 2004535193
【０６９５】
３−アミノ酪酸（１４７ｍｇ、１．４３ミリモル）を水（１０ｍＬ）、ジオキサン（１０ｍＬ）および２Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）と混合した。混合物を０℃に冷却し、Ｎｖｏｃ−Ｃｌ（１．５８ミリモル）で処理した。７５分間で２Ｍ ＮａＯＨを少量ずつ添加した（８×１．２５ｍＬ）。冷却浴をはずし、反応混合物を室温で一夜放置した。水（３０ｍＬ）を添加し、混合物を濾過した。２Ｍ ＨＣｌ（水性）で水性相をｐＨ＝４に調節し、ジエチルエーテルで抽出した（３×５０ｍＬ）。固体を水（５０ｍＬ）およびジエチルエーテル（５０ｍＬ）中に溶解させた。合した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空中で蒸発させて、１７６ｍｇ（３６％）の純粋な３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−酪酸を得た。1H-NMR (CDCl3): 7.72 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.51 (s, 2H), 5.40-5.30 (br s, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 2.60 (d, 2H), 1.31 (d, 3H)1Burgess et al. J. Org. Chem. (1997), 62, 5165-68, Alvarez et al. J. Org. Chem. (1999), 64, 6319-28
【０６９６】
β−アラニン、シス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、トランス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、シス−２−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、シス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−アミノ−４−メチルペンタン酸、ＤＬ−３−アミノイソ酪酸一水和物、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、２−フルオロ−３−アミノプロピオン酸塩酸塩は同様に保護される。
Ｃ−末端活性化：Ｎ−Ｎｖｏｃ保護されたβ−アミノ酸のＮＨＭ（Ｎ−ヒドロキシマレイミド）エステルを使用し、次の方法に従って、例えば３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−フェニル−プロピオン酸：
【化１３５】
Figure 2004535193
を調製した。
【０６９７】
３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−酪酸（４１８ｍｇ、１．２２ミリモル）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（１．２２ミリモル）を添加し、混合物を０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２２ミリモル）を添加し、混合物を室温で一夜放置した。溶媒を真空中で蒸発させることにより除去し、溶離剤としてＥｔＯＡｃ−ヘプタン（１：４、次いで１：２、次いで１；１）を使用したシリカカラム精製により生成物を単離した。収量２１９ｍｇ（４２％）の純粋な３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−酪酸２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イルエステル。1H-NMR (CDCl3): 7.73 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.81 (s, 2H), 5.55 (dd, 2H), 5.30-5.20 (br s, 1H), 4.25 (m, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 2.86 (m, 2H), 1.39 (d, 3H)
【０６９８】
β−アラニンのＮ−Ｎｖｏｃ保護された類似体、シス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、トランス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、シス−２−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、シス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−アミノ−４−メチルペンタン酸、ＤＬ−３−アミノイソ酪酸一水和物、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、２−フルオロ−３−アミノプロピオン酸塩酸塩は同様に活性化される。
【０６９９】
Ｂ）ビルディングブロックオリゴの調製
【化１３６】
Figure 2004535193
【０７００】
チオオリゴ（１ナノモル）を３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−フェニル−プロピオン酸、２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イルエステル（ＤＭＦ中０．１Ｍ溶液を５０ｕＬ）で処理する。混合物を室温で一夜放置する。ビルディングブロックオリゴをスピンダウンし（２０．０００Ｇで１５分間）、ＤＭＦを除去する。ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、ビルディングブロックオリゴをスピンダウンし（２０．０００Ｇで１５分間）、ＤＭＦを除去する。
β−アラニンのＮ−Ｎｖｏｃ保護されたＣ−末端ＮＨＭ活性化類似体、シス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、トランス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、シス−２−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、シス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−４−シクロヘキサン−１−カルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−アミノ−４−メチルペンタン酸、ＤＬ−３−アミノイソ酪酸一水和物、ＤＬ−ベータ−アミノ酪酸、２−フルオロ−３−アミノプロピオン酸塩酸塩は同様に１１の異なるチオオリゴ上にロードされる。
以下の４の調製されたビルディングブロックを選択し、ライブラリー産生のために使用する。
【０７０１】
Ｃ）６４−メンバー（４３）３−ｍｅｒβ−ペプチドライブラリーの産生：
【化１３７】
Figure 2004535193
【０７０２】
ビルディングブロックオリゴの配列を以下に示す。太字のヌクレオチドは相補因子を構成し、下線は５−ｍｅｒジッパーボックスを構成する。ＦＥ１−４は結合した機能的部分（４の異なるＮ−Ｎｖｏｃ保護されたβ−アミノ酸）であり、Ｂは内部ビオチンである。
【表６】
Figure 2004535193
【０７０３】
３のコーディング領域からなる６４鋳型オリゴ（それぞれ２ピコモル）を４の異なるビルディングブロックオリゴ（１〜４、それぞれ２００ピコモル）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｕＬ、１００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液と１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）と混合する。水を最終体積１０００ｕＬにまで添加する。５０℃に加熱することによりオリゴを鋳型にアニールし、２０℃に冷却する（−２℃／３０秒）。Ａｒで完全に脱気することによりＮｖｏｃ保護基を除去し、続いて水銀ランプ（４５０Ｗ ＨＰＬＣ水銀ランプ、パイレックスフィルター、カットオフ＜３００ｎｍ）に１〜２時間露光する。混合物を、一夜温度を変動させて放置する（１０℃で１秒、次いで３５℃で１秒）。
ライブラリー産生におけるエンコードされた分子の形成は、２の異なる実験により取り扱われ、ここにおいて各実験においては１つの鋳型のみを使用する。第一の鋳型（３’−ＣＧＴ ＡＴＧ ＴＴＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＴＡ ＴＧＴ ＴＧＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＡＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＡＣＡ Ｔ）は、β−アラニンの３−ｍｅｒβ−ペプチドの形成をエンコードし、他の鋳型（３−ＣＧＴ ＡＴＧ ＣＣＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＴＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＣＡ Ｔ）は３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸の３−ｍｅｒβ−ペプチドの形成をエンコードする。
【０７０４】
３のコーディング領域からなる鋳型オリゴ（２ピコモル）を４の異なるビルディングブロックオリゴ（１〜４、それぞれ２００ピコモル）およびｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｕＬ、１００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液と１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）と混合する。水を最終体積１００ｕＬにまで添加する。５０℃に加熱ことによりオリゴを鋳型にアニールし、２０℃に冷却する（−２℃／３０秒）。Ａｒで完全に脱気することによりＮｖｏｃ保護基を除去し、続いて水銀ランプ（４５０Ｗ ＨＰＬＣ水銀ランプ、パイレックスフィルター、カットオフ＜３００ｎｍ）に１〜２時間露光する。混合物を、一夜温度を変動させて放置する（１０℃で１秒、３５℃で１秒）。ストレプトアビジンビーズ（１００ｕＬ、２×１ｍＬの１００ｍＭ ｈｅｐｅｓ緩衝液および１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５であらかじめ洗浄）を添加することにより、オリゴ複合体をストレプトアビジンビーズに結合させる。ビーズをｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＬ）で洗浄する。水（２００ｕＬ）を添加し、続いて７０℃に加熱することにより、エンコードされた生成物を含有するビルディングブロックオリゴをストレプトアビジン結合複合体から分離する。水を移し、生成物の形成をＭＳ分析により検証する。
【０７０５】
実施例１０９（モデル）：３−ｍｅｒβ−アミノ酸ライブラリーの調製の説明
Ａ）β−アミノ酸ビルディングブロックの合成
Ｎ−末端保護：Ｎｖｏｃ基（３，６−ジメトキシ−６−ニトロベンジルオキシカルボニル）を光切断可能なＮ−保護基として使用し、前記の方法に従ってβ−アミノ酸上に導入した。
Ｃ−末端活性化：公知１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン（Choi et al. Mol.Cryst.Liq.Cryst.Sci.Technol.Sect.A (1996), 280, 17-26）を使用し、以下の方法に従って、Ｎ−Ｎｖｏｃ保護されたβ−アミノ酸を活性化した：
【０７０６】
【化１３８】
Figure 2004535193
【０７０７】
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン（１ミリモル）、ＮＨＳ（１．０ミリモル）および３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−酪酸（１ミリモル）をＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解させる。溶液を０℃に冷却し、ＤＩＣ（１．２ミリモル）を滴下して処理する。１時間後冷却浴をはずし、反応混合物を一夜室温で放置する。溶媒を真空中で蒸発させ、純粋な生成物（３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニル−アミノ）−酪酸４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−フェニルエステル）を、ＥｔＯＡｃ−ヘプタン（１：４、次いで１：２、次いで１：１）を溶離剤として使用するシリカカラムクロマトグラフィーにより単離する。
【０７０８】
β−アラニンのＮ−Ｎｖｏｃ保護された類似体、シス−２−アミノ−１−シクロヘキサン−カルボン酸、トランス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、シス−２−アミノ−１−シクロペンタン−カルボン酸、シス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−アミノ−４−メチルペンタン酸、ＤＬ−３−アミノイソ酪酸一水和物、ＤＬ−β−アミノ酪酸、２−フルオロ−３−アミノプロピオン酸塩酸塩は同様にＣ−末端活性化される。
【０７０９】
Ｂ）ビルディングブロックオリゴの調製
【化１３９】
Figure 2004535193
【０７１０】
水（２５ｕＬ）中チオオリゴ（２ナノモル）を、３−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニル−アミノ）−酪酸４−（２，４−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−フェニルエステル（ＭｅＯＨ中１０ｍＭ溶液を２５ｕＬ）で処理する。混合物を室温で一夜放置する。ビルディングブロックオリゴを公知ＥｔＯＨ沈殿により精製する。ペレットをジクロロメタン（３×３００ｕＬ）で洗浄し、真空中で乾燥する。
β−アラニンのＮ−Ｎｖｏｃ保護されたＣ−末端活性化類似体、シス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、トランス−２−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、シス−２−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、シス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、トランス−２−アミノ−４−シクロヘキセン−１−カルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−アミノ−４−メチルペンタン酸、ＤＬ−３−アミノイソ酪酸一水和物、ＤＬ−β−アミノ酪酸、２−フルオロ−３−アミノプロピオン酸塩酸塩は同様に１１の異なるチオオリゴ上にロードされる。
任意の４の調製されたビルディングブロックオリゴが選択され、前記のようにライブラリー産生に使用される。
【０７１１】
実施例１１０（モデル）：以下において、オリゴヌクレオチド鋳型および５’−ホホイミダゾリドヌクレオシドビルディングブロックに基づくライブラリー産生法を説明する。
ビルディングブロックの調製
【化１４０】
Figure 2004535193
【０７１２】
工程Ａ：末端アルキンを有するエステルリンカーの調製
酸誘導体（１０．３７ミリモル）をＤＣＭ（２０ｍＬ）中に溶解させ、氷浴上で０℃に冷却する。ＥＤＣ（１２．４４ミリモル、１．２当量）、続いてＤＭＡＰ（１．０４ミリモル、０．１当量）およびＤＣＭ（５ｍＬ）中アルコール（１５．５５ミリモル、１．５当量）を添加する。氷浴上で１時間反応後、混合物を２０℃にし、１６時間反応させる。揮発性物質を除去し、残留物をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）およびＨＣｌ（水性、０．１Ｍ、７５ｍＬ）中に溶解させる。相を分離し、有機相をまずＮａＨＣＯ３（飽和、３５ｍＬ）および水（３５ｍＬ）の混合物、次いで水（７５ｍＬ）で洗浄する。ジエチルエーテルを蒸発させ、トルエン（２×１２０ｍＬ）を用いて生成物を共沸乾燥し、所望のエステルを得、これは必要ならばクロマトグラフィーにより精製することができる。
【０７１３】
工程Ｂ：ヨード置換ヌクレオシド上への保護基の導入
ヌクレオシド（５．６５ミリモル、１当量）、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（２．０４ｇ、１３．５６ミリモル、２．４当量）およびイミダゾール（１．８５ｇ、２７．１１ミリモル、４．８当量）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中混合し、２５℃で一夜撹拌する。ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）を添加し、有機相をＮＨ４Ｃｌ（水性）（飽和、４０ｍＬ）＋Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）の混合物、次いでＨ２Ｏ（８０ｍＬ）で洗浄する。有機相をストリップし、残留物をトルエン中に溶解させ、濾過し、ストリップして、所望の保護されたヌクレオシドが残る。化合物をさらに再結晶により精製することができる。
【０７１４】
工程Ｃ：保護されたヨード置換ヌクレオシドと末端アルキンのＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリング
保護されたヨード置換ヌクレオシド（３．４ミリモル）、アルキン（６．９ミリモル、２当量）、ＤＩＥＡ（２．５ｍＬ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）をＡｒで５分間パージする。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．３ミリモル、０．１当量）およびＣｕＩ（０．７ミリモル、０．２当量）を添加し、混合物を５０℃に加熱し、この温度で２０時間保持する。冷却し、混合物に７００ｍＬのジエチルエーテルを添加する。有機相を塩化アンモニウム（飽和、水性、２５０ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）で洗浄する。揮発性物質を蒸発させ、続いてトルエン（４００ｍＬ）でストリップして、所望の修飾されたヌクレオシドを得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン／酢酸エチル溶離剤）により精製する。
工程Ｄ：ＯＨ保護基の除去
前記生成物のＴＨＦ溶液（３０ｍＬ中１．８ミリモル）に酢酸（０．８ｍＬ、１４．１ミリモル、８当量）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド（７ミリモル、４当量）を添加する。２０℃で２０時間撹拌し、有機物質を真空中で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／メタノール溶離剤）により精製する。
【０７１５】
【化１４１】
Figure 2004535193
【０７１６】
工程Ｅ：モノホスフェート合成
工程Ｄにおいて得られた修飾されたヌクレオシド（１．６５ミリモル）のトリメチルホスフェート（５ｍＬ）中スラリーを０℃に冷却し、ホスホルオキシトリクロリド（１９０ｕＬ、３０７ｍｇ、２ミリモル、１．２当量）を添加する。反応を０℃で２時間保持する。トリブチルアミン（１ｍＬ）を添加し、反応を２０℃にする。追加のトリブチルアミン（１．３ｍＬ）を添加してｐＨを上昇させ、続いて水を添加する。揮発性物質を真空中で除去し、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５、テトラエチルアンモニウムブロミド緩衝液０．０５−１．５Ｍ、ｐＨ７）を用いて残留物を精製することができる。
工程Ｆ：ホスホイミダゾリド合成
前記モノホスフェート誘導体（０．１Ｍ）の溶液に、２−メチルイミダゾール（０．５Ｍ）およびＥＤＣ（０．５Ｍ）をｐＨ６．５、０℃で添加する。温度を０℃に維持しながら反応物を２時間撹拌する。混合物をライブラリー合成において直接使用することができる[Visscher;1988; Journal of Molecular Evolution; 3-6]。別法として、ホスフェートのカルボニルジイミダゾールでの処理は、ホホイミダゾリドももたらす[Zhao;1998; J. Org. Chem.; 7568-7572]。
【０７１７】
ビルディングブロックのコレクション
以下のスキームにおいて、ライブラリー合成において有用な多くのビルディングブロックを示す。全てのビルディングブロックはカルボン酸エステルにより認識因子に結合した機能的部分を有し、前記のようにして合成することができる。
【化１４２】
Figure 2004535193
【０７１８】
ライブラリー調製
以下のスキームは、前記のオリゴヌクレオチド鋳型およびホスホルイミダゾリドビルディングブロックを用いたポリアミドのライブラリーを調製する方法を例示する。オリゴヌクレオチドプライマー配列と（任意に）保護されたアミン（例えば、Glen Researchアミノ修飾剤C2 dT, cat no 10-1019-）を有する配列修飾剤をライブラリーにおいて使用される鋳型にアニールする。さらに、もう１つのオリゴヌクレオチド配列を末端配列としてアニールし、かくして、ビルディングブロック組み込みをコードする鋳型の一部のみが露出している。明確にするために、ホスホイミダゾリドビルディングブロックの塩基を太字の大文字コードと置換した。
【０７１９】
【化１４３】
Figure 2004535193
【化１４４】
Figure 2004535193
【化１４５】
Figure 2004535193
【０７２０】
組み込み
鋳型上のビルディングブロックのオリゴマー化の典型的な条件は、ｐＨ＝７．２に調節された０．２Ｍ２，６−ルチジン・ＨＣｌ緩衝液、０．１Ｍ塩化ナトリウム０．２Ｍ塩化マグネシウムを含有する緩衝液中、０．０５Ｍ鋳型、０．１〜０．２Ｍビルディングブロックである。温度を０℃に１〜２１日間保持する。[Inoue;1984; Journal of Molecular Biology; 669-676]。ミクロスピンゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてオリゴヌクレオチド複合体を精製する。
アミン脱保護
様々な方法によりＣｂｚ保護基を除去することができる[Greene;1999; ]。その穏やかさのために、接触還元が最上の方法であることが多い。水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリル、酢酸またはこれらの混合物などの適当な溶媒中、不溶性水素化触媒、例えば、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｄ／ＣａＣＯ２、Ｐｄ／Ｃ、ＰｔＯ２、または可溶性触媒、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎｓ触媒および水素供給源、例えばこれらに限定されないが、Ｈ２、アンモニウムホルミエート、蟻酸、１，４−シクロヘキサジエン、およびシクロヘキセンとオリゴヌクレオチド複合体を組み合わせることによりＣｂｚ保護基を除去する。
【０７２１】
重合
ジカルボン酸、ペプチドカップリング試薬を用い、所望によりペプチドカップリング修飾剤の存在下、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物などの適当な溶媒中、ジアミンを結合させる。遊離ジアミンを有するオリゴヌクレオチド複合体（０．１〜１００ｕＭ、好ましくは０．５〜１０ｕＭ）の水性緩衝溶液（１０ｕＬ、１Ｍ ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭ緩衝液 ｐＨ６〜１０、好ましくは７〜９）に、適当な溶媒（１ｕＬ）、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物中、ペプチドカップリング試薬（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えばこれらに限定されないが、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢｏＰ、ＰｙＢｒｏＰまたはＮ−メチル−２−クロロピリジニウムテトラフルオロボレートおよびペプチドカップリング修飾剤（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えばこれらに限定されないが、ＮＨＳ、スルホ−ＮＨＳ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＤｈｂｔＯＨと混合したジカルボン酸（０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ）、例えばこれらに限定されないが、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、ペンタン二酸またはヘキサン二酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、Ｎ−保護グルタミン酸またはＮ−保護アスパラギン酸を添加する。
反応を−２０℃から１００℃の間、好ましくは０℃〜６０℃の間で行う。反応時間は１時間から１週間の間、好ましくは１時間〜２４時間である。
前記方法は、１１ｕＬスケールに関する重合を例に挙げるが、１．１ｕＬから１．１Ｌの間の任意の他の反応体積も用いることができる。
【０７２２】
リンカー切断
エステル結合は、ｐＨ９〜１２、室温で、１６時間、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、アセトニトリルまたはこれらの混合物などの適当な溶媒中、水性水酸化物で切断される。
ＭＳ分析
質量分析を用いてライブラリーメンバーを分析することができる。
前記配列において、ジアミンはＣｂｚ保護基を有し、オリゴヌクレオチド上で脱保護される。他の保護スキームもアミン保護に関連性がある。[Greene and Wuts;1999; ]いくつかの場合において、アミン上に保護基を有さないビルディングブロックと配列を並べるので十分であり、従ってアミノ脱保護工程が省略される。鋳型されたライブラリー合成について記載された方法はさらに、修飾されたジ−およびトリ−ヌクレオチドならびにモルホリノ、ＬＮＡおよびＰＮＡなどの修飾された核酸類似体を使用できる。後者の場合、組み込み中の反応条件は、ペプチドカップリング反応に適応するように変更すべきである。[Schmidt;1997; Nucleic Acids Research; 4792-4796]このような別のビルディングブロックの例を下記のスキームにおいて示す。もとのＰＮＡ単位と比較して修飾されたＰＮＡ単位の合成は修飾された塩基を使用することのみが異なる。
【０７２３】
【化１４６】
Figure 2004535193
【０７２４】
さらに、５’−ホスホイミダゾリド−ヌクレオシドを使用する代わりに、ビス−３’，５’−ホスホイミダゾリド−ヌクレオシド[Visscher and Schwartz;1988; Journal of Molecular Evolution; 3-6]およびヌクレオシドをライブラリー産生において用いることができる。以下参照。各ビルディングブロックタイプを交互に組み込むことが必要とされるが、認識段階の可逆性と例えば２つのビス−３’，５’−ホスホイミダゾリド−ヌクレオシドが互いの隣に配置されているならば反応は起こらないという事実のために、両方のビルディングブロックタイプが混合物中に存在しさえすればよい。
【０７２５】
【化１４７】
Figure 2004535193
【０７２６】
参考文献
Figure 2004535193
【０７２７】
実施例１１１（モデル）：機能的部分を含むジヌクレオチドの非酵素結紮による鋳型化された分子のライブラリーの合成
核酸またはＰＮＡ鋳型上のヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの非酵素化学結紮を可能にするいくつかのシステムが開発されてきた。(Xu et al., 2001, Nat Biotechnol 19, 148-152; 2000, J Am Chem Soc, 122, 9040-41)。１つプロトコルは、以下に示すように３’−ホスホチオエートとヨウ素脱離基を含む５’部分の自己結紮を説明する。
【０７２８】
【化１４８】
Figure 2004535193
非酵素結紮プロトコルは、分子のライブラリーのテンプレートされた合成に使用できる。ここでは、それぞれが独自の機能的部分を含む１対のジヌクレオチドを以下に記載するように修飾されたホスホアミダイトヌクレオチド化学反応により合成した。配列ｄＵｄＮｐを有する４−ジヌクレオチドビルディングブロックを合成した。各ジヌクレオチドは、隣接する反応基と共有結合を形成できる５’−ヨード−および３’−ホスホチオエート基を含む。
【０７２９】
ＤＮＡ鋳型上のジヌクレオチドの組み込み：
それぞれ１ピコモルのエクステンションプライマーＡ（５’−ＧＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＸＧ−３’−ホスホチオエート、ここにおいてＸはデオキシチミジン−Ｃ６−ＮＨ２を表す、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔ＃：１０−１０３５−９０）およびＢ（５’−ヨード−ＧＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ−３’）を結合緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ＝７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ中鋳型オリゴ（５’ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＮＡＮＡＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣ−３’）にアニールし、８０℃で２分間インキュベートした後、ゆっくりと２０℃まで冷却する。プライマーＡおよびＢの鋳型との結合は、以下に示すように中心に４ヌクレオチド一本鎖を有する二本鎖ＤＮＡ複合体を形成する。１０ピコモルのジヌクレオチドを添加し、反応混合物を４℃で３０分間インキュベートし、続いて３０秒間２５℃に短時間加熱する。反応混合物を２４時間、連続した温度振幅サイクルに供する。この工程は正しくアニールされたジヌクレオチドとプライマーＡおよびＢの間の化学結紮を促進する。
鋳型の補完および化学結紮後、ジヌクレオチドおよび緩衝液をミクロスピンゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）により除去する。
【０７３０】
機能的部分の架橋と鋳型化された分子の活性化
機能的部分を含むＤＮＡ複合体を緩衝液２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ＝７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ中でインキュベートする。５ｍＭビス［スルホスクリンイミジル］スベラート（ＢＳ３、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し、サンプルを３０℃で２〜８時間インキュベートする。緩衝液と過剰のＢＳ３をミクロスピンゲル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）により除去する。等モル量のＨＣｌを添加する前に０．２Ｍ ＮａＯＨを５０℃で１５分間用いてエステル結合を切断させることにより、鋳型化された分子を活性化する。透析によりサンプルを適当な緩衝液に移す。
【０７３１】
【化１４９】
Figure 2004535193
【０７３２】
このプロトコルにより、それぞれが選択／増幅実験に利用可能なその鋳型に結合した１６の異なる分子の小さなライブラリーの合成が可能になる。機能的部分を含むトリ−、テトラ−、または他のオリゴヌクレオチドを用いて、および／またはＤＮＡ鋳型上の非酵素結合によりカップリングされるビルディングブロックの数を増大させることにより、さらに大きなライブラリーを合成することができる。
【０７３３】
ビルディングブロックの合成：
機能的部分が結合した５’−ヨード−３’−ホスホノチオエート二量体の合成
【化１５０】
Figure 2004535193
【０７３４】
ａ）慣例のホスホルアミダイトカップリング；ｂ）ピリジン中Ｓ８；ｃ）５−Ｉ−ｄＵを導入するためのホスホルアミダイトカップリング；ｄ）ＣＦ３ＣＯＯＨ、次いでＩ２／ピリジン／水；ｅ）ＦＥ−スペーサーおよびＴＨＦ−Ｅｔ３Ｎ中Ｐｄ（０）；ｆ）Ｐｈ３ＰおよびＤＭＦ中Ｉ２；ｇ）光分解＞３００ｎｍ。
Ｂは光反応性保護基Ｎｖｏｃ２で適切に保護されたＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかである。リンカーは、光反応性ＣＰＧ固体支持体である３。Ｒは光反応性ホスフェート保護基である４。
Figure 2004535193
【０７３５】
核塩基上のリンカーの結合点（矢印により示す）の例。
【化１５１】
Figure 2004535193
【０７３６】
リンカー（点線で示す）および機能的部分の例
【化１５２】
Figure 2004535193
【０７３７】
実施例１１２：中心ヌクレオチドで誘導化されたＤＮＡオリゴヌクレオチドの結紮
Ｔ４ＤＮＡリガーゼについて様々なＤＮＡオリゴ誘導体の基質有効性を調べるために、オリゴ誘導体Ａｈ１７およびＡｈ１９をそれぞれ鋳型Ａｈ１８およびＡｈ２０にアニールした。鋳型のそれぞれは適当なオリゴの２つのアニーリング部位を含む。オリゴ誘導体は中心ヌクレオチドの位置に修飾されたヌクレオチドを含む（以下の図参照）。
反応は以下に示すような概略図で表すことができる：
【０７３８】
【化１５３】
Figure 2004535193
Ｘ＝アミノ−修飾剤Ｃ６ｄＴ
【表７】
Figure 2004535193
【０７３９】
０．５μｌの緩衝液Ａ、０．５μｌのＡｈ１８またはＡｈ２０（１ピコモル／μｌ）、および２μｌのＡｈ１７またはＡｈ１８（３２Ｐ−標識）（１ピコモル／μｌ）を混合する。８０℃に加熱することによりアニールし、次いで１０℃に冷却する。３μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＴＡＫＡＲＡ、コード番号６０２２）を添加する。４．７℃で約４８時間インキュベートする。次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
図６４においてみられるように、ＤＮＡリガーゼは、試験した両方のオリゴ誘導体を効率よく結紮することができる。すなわち、長さが７ヌクレオチドで、４位に修飾を有する最短のオリゴ（Ａｈ１７）についてさえも、結紮は約５０％に達する。
【図面の簡単な説明】
【０７４０】
【図１】鋳型化された分子の化学的提示−原理を示す。
【図２】広範囲に及ぶ塩基対の配列を示す。
【図３】モノマービルディングブロックを示す。
【図４】ＩＩ型反応基を一つだけ有するモノマービルディングブロックを示す。
【図５】ビルディングブロックおよびビルディングブロックの鋳型指令の組込みから得られるポリマーならびにその重合および活性化を示す。
【図６】ビルディングブロックとしての誘導化ヌクレオチドを示す。
【図７】β−ジペプチドのＣ−末端タグ付加−組込み、重合および活性化を示す。
【図８】β−ジペプチドのＮ−末端タグ付加−組込み、重合および活性化を示す。
【図９】ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡまたはＤＮＡ鎖に組み込まれることが知られているヌクレオチド誘導体を示す。
【図１０】切断可能なリンカーおよび保護基を示す。
【０７４１】
【図１１】隣接するＩＩ型反応基の間の反応による重合を示す。
【図１２】隣接する同じでないＩＩ型反応基の間の重合を示す。
【図１４】ジッピング−重合および同時活性化を示す。
【図１５】「フィル・イン」型重合（対照型ＸＸモノマー）を示す。
【図１６】コード化による「フィル・イン」を示す。
【図１９】開環によるジッピング重合を示す。
【図２０】ジッピング重合および並びかえによる活性化を示す。
【０７４２】
【図２２】固定された機能単位を用いる方向性ポリマー形成を示す。
【図２３】単一のリンカーを介して親ヌクレオチドに結合した二機能性ＦＥ（左図）または第２結合点を用いてさらなるリンカーで結合した二機能性ＦＥ（右図）の４種の例示を示す。
【図２４】種々の方法にて結合したリンカー−ＦＥ１Ａを有する二重鎖ＤＮＡ（上鎖５’−ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧ−３’）を示す。
【図２５】種々の方法にて結合したリンカー−ＦＥ１Ｂを有する二重鎖ＤＮＡ（上鎖５’−ＧＣＴＴＴＴＡＧ−３’）を示す。
【図２７】等しくない数の反応基（Ｘ）および（Ｙ）での反応を示す。
【図２８】モノマービルディングブロックを示す。
【図２９】反応および活性化を同時に行うことに関する鋳型化を示す。
【図３０】反応および活性化を同時に行うことを可能とする反応型を示す。
【０７４３】
【図３２】反応基（Ｘ）および（Ｙ）の対、その結果得られる結合（ＸＹ）を示す。
【図３４】スクランブル化を示す。
【図３６】機能的部分のオリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロックとする調製例を示す。
【図３７】オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロック リンカーおよび機能的部分（ＦＥ）の設計および合成の例を示す。
【図３８】オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロック、高いモノマー多様性を可能とする、コード化および相補因子の設計例を示す。
【図３９】鋳型化された分子を選択するための典型的なパニングプロトコルを示す。
【０７４４】
【図４１】組み込まれたモノマービルディングブロックの機能的部分の間での反応の可能性を増大させるための強固または一部強固なリンカーの使用を示す。
【図４２】組み込まれたモノマービルディングブロックの機能的部分の間の反応の可能性を増大させるためのジッパーボックスの使用を示す。
【図４３】有機化合物の鋳型化合成−例示を示す。
【図４４】α−およびβ−ペプチド、ヒドラジノペプチドおよびペプトイド、オリゴヌクレオチドをベースとするモノマービルディングブロックを用いてのコード化を示す。
【図４５】α−、β−、γ−およびω−ペプチドの環状無水物の使用を介する鋳型化を示す。
【図４７】切断可能なリンカーを示す。
【図４８】鋳型化された分子の鋳型後の修飾を示す。
【図４９】実施例６４の結果を示す。
【図５０】実施例６５の結果を示す。
【０７４５】
【図５１】実施例６６の結果を示す。
【図５２】実施例６７の結果を示す。
【図５３】実施例６８の結果を示す。
【図５４】実施例７２の結果を示す。
【図５５】相補鋳型に結合された鋳型化された分子を図示する。
【図５６】実施例９９の結果を示す。
【図５７】実施例９９の結果を示す。
【図５８】実施例９９の結果を示す。
【図５９】実施例９９の結果を示す。
【図６０】実施例１０２の結果を示す。
【０７４６】
【図６１】実施例１０４の結果を示す。
【図６２】実施例１０５の結果を示す。
【図６３】実施例１０６の結果を示す。
【図６４】実施例１１２の結果を示す。

Claims (316)

  1. 複数の官能基を含む鋳型化された分子の合成方法であって、以下の工程：
    （ｉ）ｎ個のコード因子の配列を含む少なくとも一個の鋳型を準備し、
    ここで各コード因子は所定の相補因子を認識する能力を有する少なくとも一個の認識基を含み、かつｎは１より大きい整数であり；
    （ｉｉ）複数のビルディングブロックを準備し、
    ここでビルディングブロックは、各々、
    ａ）所定のコード因子を認識する能力を有する少なくとも一個の認識基を含む少なくとも一個の相補因子と、
    ｂ）少なくとも一個の官能基および少なくとも一個の反応基を含む少なくとも一個の機能的部分と、
    ｃ）少なくとも一個の機能的部分を少なくとも一個の相補因子から分離する少なくとも一個のリンカーとを、含み；
    （ｉｉｉ）各コード因子をそのコード因子の認識能を有する相補因子と接触させ；
    （ｉｖ）相補鋳型を得てもよく；
    （ｖ）反応基の関与する反応によって、少なくとも一個の機能的部分の官能基を別の機能的部分の官能基に連結させることで、共有結合した官能基を含む鋳型化された分子を得、
    ここでその鋳型化された分子は、一のリンカーにより、その相補鋳型との、または鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型との結合能を有する；
    ことを含む、鋳型化された分子の合成方法。
  2. 鋳型された分子が単一のリンカーで相補鋳型にあるいは鋳型された分子の合成をテンプレートした鋳型に連結されている、請求項１記載の方法。
  3. 工程ｉｉｉ）ないしｖ）を繰り返す、請求項１記載の方法。
  4. ｎ個のコード因子を含む鋳型が線状のコード因子の配列である、請求項１記載の方法。
  5. ｎ個のコード因子を含む鋳型が分岐されている、請求項１記載の方法。
  6. ｎが、好ましくは、２ないし２００の、例えば２ないし１００の、２ないし８０などの、例えば２ないし６０の、２ないし４０などの、例えば２ないし３０の、２ないし２０などの、例えば２ないし１５の、２ないし１０などの、２ないし８などの、例えば２ないし６の、２ないし４などの、例えば２の、３ないし１００などの、例えば３ないし８０の、３ないし６０などの、３ないし４０などの、例えば３ないし３０の、３ないし２０などの、３ないし１５などの、例えば３ないし１５の、３ないし１０などの、３ないし８などの、例えば３ないし６の、３ないし４などの、例えば３の、４ないし１００などの、例えば４ないし８０の、４ないし６０などの、４ないし４０などの、例えば４ないし３０の、４ないし２０などの、４ないし１５などの、例えば４ないし１０の、４ないし８などの、４ないし６などの、例えば４の、例えば５ないし１００の、５ないし８０などの、例えば５ないし６０の、５ないし４０などの、例えば５ないし３０の、５ないし２０などの、例えば５ないし１５の、５ないし１０などの、５ないし８などの、例えば５ないし６の、例えば５の、６ないし１００などの、例えば６ないし８０の、６ないし６０などの、６ないし４０などの、例えば６ないし３０の、６ないし２０などの、６ないし１５などの、例えば６ないし１０の、６ないし８などの、６などの、例えば７ないし１００の、７ないし８０などの、例えば７ないし６０の、７ないし４０などの、例えば７ないし３０の、７ないし２０などの、例えば７ないし１５の、７ないし１０などの、７ないし８などの、例えば７の、例えば８ないし１００の、８ないし８０などの、例えば８ないし６０の、８ないし４０などの、例えば８ないし３０の、８ないし２０などの、例えば８ないし１５の、８ないし１０などの、８などの、例えば９の、例えば１０ないし１００の、１０ないし８０などの、例えば１０ないし６０の、１０ないし４０などの、例えば１０ないし３０の、１０ないし２０などの、例えば１０ないし１５の、１０ないし１２などの、１０などの、例えば１２ないし１００の、１２ないし８０などの、例えば１２ないし６０の、１２ないし４０などの、例えば１２ないし３０の、１２ないし２０などの、例えば１２ないし１５の、１４ないし１００などの、１４ないし８０などの、例えば１４ないし６０の、１４ないし４０などの、例えば１４ないし３０の、１４ないし２０などの、例えば１４ないし１６の、１６ないし１００などの、１６ないし８０などの、例えば１６ないし６０の、１６ないし４０などの、例えば１６ないし３０の、１６ないし２０などの、１８ないし１００などの、１８ないし８０などの、例えば１８ないし６０の、１８ないし４０などの、例えば１８ないし３０の、１８ないし２０などの、例えば２０ないし１００の、２０ないし８０などの、例えば２０ないし６０の、２０ないし４０などの、例えば２０ないし３０の、２０ないし２５などの、例えば２２ないし１００の、２２ないし８０どの、例えば２２ないし６０の、２２ないし４０などの、例えば２２ないし３０の、２２ないし２５などの、例えば２５ないし１００の、２５ないし８０などの、例えば２５ないし６０の、２５ないし４０などの、例えば２５ないし３０の、３０ないし１００などの、例えば３０ないし８０の、３０ないし６０などの、例えば３０ないし４０の、３０ないし３５などの、例えば３５ないし１００の、３５ないし８０などの、例えば３５ないし６０の、３５ないし４０などの、例えば４０ないし１００の、４０ないし８０などの、例えば４０ないし６０の、４０ないし５０などの、例えば４５ないし４５の、４５ないし１００などの、例えば４５ないし８０の、４５ないし６０などの、例えば４５ないし５０の、５０ないし１００などの、例えば５０ないし８０の、５０ないし６０などの、例えば５０ないし５５の、６０ないし１００などの、例えば６０ないし８０の、６０ないし７０などの、例えば７０ないし１００の、７０ないし９０などの、例えば７０ないし８０の、８０ないし１００などの、例えば８０ないし９０の、９０ないし１００などの数値を有する、請求項１記載の方法。
  7. 鋳型が固体または半固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
  8. 鋳型が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体も含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
  9. 鋳型がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体も含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなり、相補因子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体も含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
  10. 鋳型が増幅可能である、請求項１記載の方法。
  11. 鋳型が一本鎖のコード因子を含む、請求項１記載の方法。
  12. 一本鎖のコード因子が一本鎖の相補因子を含む相補鋳型とハイブリッド形成することで二重螺旋を形成することのできる、請求項１１記載の方法。
  13. 鋳型がプライミング部位を含む、請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。
  14. プライミング部位がコード因子の上流にあり、ビルディングブロックの組み込みを開始し、および／または鋳型のコード因子を増幅するためのプライマーとの結合能を有する、請求項１３記載の方法。
  15. プライミング部位がコード因子の下流にあり、オリゴヌクレオチドとの結合能を有する、請求項１３記載の方法。
  16. オリゴヌクレオチドが一の固定点を含み、それが鋳型化された分子と結合しうる、請求項１５記載の方法。
  17. オリゴヌクレオチドがビルディングブロックのさらなる組み込みを停止する能力を有する、請求項１５記載の方法。
  18. プライミング部位が可逆プライマーと結合する能力を有する、請求項１５記載の方法。
  19. コード因子が、各々、化学的共有結合により隣接する一のコード因子に連結される、請求項１記載の方法。
  20. コード因子が、各々、化学的共有結合により隣接する各コード因子に連結される、請求項１記載の方法。
  21. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる共有結合の群より選択される、請求項１４または１５記載の方法。
  22. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合からなる共有結合の群より選択される、請求項１４または１５記載の方法。
  23. 少なくとも一個のコード因子が固体または半固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
  24. コード因子がヌクレオチド（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）、アミノ酸、抗体および抗原からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  25. コード因子がヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる、そのいずれの組み合せをも含む、群より選択される、請求項１９記載の方法。
  26. コード因子がヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
  27. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸である、請求項２１記載の方法。
  28. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸である、請求項２１記載の方法。
  29. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する一のヌクレオチドに連結されている、請求項２１記載の方法。
  30. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する各ヌクレオチドに連結されている、請求項２１記載の方法。
  31. 共有結合がリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合である、請求項２４または２５記載の方法。
  32. コード因子がデオキシリボ核酸からなる群より選択される天然または天然に存在しないヌクレオチドである、請求項２１記載の方法。
  33. コード因子がリボ核酸からなる群より選択される天然または天然に存在しないヌクレオチドである、請求項２１記載の方法。
  34. コード因子がヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる群より選択され、そのうちの１個またはそれ以上の塩基部分および／またはリン酸部分および／またはリボースまたはデオキシリボース部分が別の分子部分により置換されている、請求項１９記載の方法。
  35. コード因子との相互作用能を有する相補因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項２９記載の方法。
  36. ヌクレオチドが、各々、化学的共有結合により隣接する一のヌクレオチドに連結されている、請求項２７ないし３０のいずれかに記載の方法。
  37. ヌクレオチドが、各々、化学的共有結合により隣接する各ヌクレオチドに連結されている、請求項２７ないし３０のいずれかに記載の方法。
  38. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される、請求項３１または３２のいずれかに記載の方法。
  39. コード因子が、好ましくは、１ないし１００個のサブユニットの、１ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１ないし６０個のサブユニットの、１ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１ないし２０個のサブユニットの、１ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１ないし１６個のサブユニットの、１ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１ないし１２個のサブユニットの、１ないし１０個のサブユニットなどの、例えば１ないし９個のサブユニットの、１ないし８個のサブユニットなどの、例えば１ないし７個のサブユニットの、１ないし６個のサブユニットなどの、例えば１ないし５個のサブユニットの、１ないし４個のサブユニットなどの、例えば１ないし３個のサブユニットの、１ないし２個のサブユニットなどの、例えば１個のサブユニットの、２ないし１００個のサブユニットの、２ないし８０個のサブユニットなどの、例えば２ないし６０個のサブユニットの、２ないし４０個のサブユニットなどの、例えば２ないし２０個のサブユニットの、２ないし１８個のサブユニットなどの、例えば２ないし１６個のサブユニットの、２ないし１４個のサブユニットなどの、例えば２ないし１２個のサブユニットの、２ないし１０個のサブユニットなどの、例えば２ないし９個のサブユニットの、２ないし８個のサブユニットなどの、例えば２ないし７個のサブユニットの、２ないし６個のサブユニットなどの、例えば２ないし５個のサブユニットの、２ないし４個のサブユニットなどの、例えば２ないし３個のサブユニットの、２個のサブユニットなどの、３ないし１００個のサブユニットの、３ないし８０個のサブユニットなどの、例えば３ないし６０個のサブユニットの、３ないし４０個のサブユニットなどの、例えば３ないし２０個のサブユニットの、３ないし１８個のサブユニットなどの、例えば３ないし１６個のサブユニットの、３ないし１４個のサブユニットなどの、例えば３ないし１２個のサブユニットの、３ないし１０個のサブユニットなどの、例えば３ないし９個のサブユニットの、３ないし８個のサブユニットなどの、例えば３ないし７個のサブユニットの、３ないし６個のサブユニットなどの、例えば３ないし５個のサブユニットの、３ないし４個のサブユニットなどの、例えば３個のサブユニットの、例えば４ないし１００個のサブユニットの、４ないし８０個のサブユニットなどの、例えば４ないし６０個のサブユニットの、４ないし４０個のサブユニットなどの、例えば４ないし２０個のサブユニットの、４ないし１８個のサブユニットなどの、例えば４ないし１６個のサブユニットの、４ないし１４個のサブユニットなどの、例えば４ないし１２個のサブユニットの、４ないし１０個のサブユニットなどの、例えば４ないし９個のサブユニットの、４ないし８個のサブユニットなどの、例えば４ないし７個のサブユニットの、４ないし６個のサブユニットなどの、例えば４ないし５個のサブユニットの、例えば４個のサブユニットの、５ないし１００個のサブユニットの、５ないし８０個のサブユニットなどの、例えば５ないし６０個のサブユニットの、５ないし４０個のサブユニットなどの、例えば５ないし２０個のサブユニットの、５ないし１８個のサブユニットなどの、例えば５ないし１６個のサブユニットの、５ないし１４個のサブユニットなどの、例えば５ないし１２個のサブユニットの、５ないし１０個のサブユニットなどの、例えば５ないし９個のサブユニットの、５ないし８個のサブユニットなどの、例えば５ないし７個のサブユニットの、５ないし６個のサブユニットなどの、例えば５個のサブユニットの、６ないし１００個のサブユニットの、６ないし８０個のサブユニットなどの、例えば６ないし６０個のサブユニットの、６ないし４０個のサブユニットなどの、例えば６ないし２０個のサブユニットの、６ないし１８個のサブユニットなどの、例えば６ないし１６個のサブユニットの、６ないし１４個のサブユニットなどの、例えば６ないし１２個のサブユニットの、６ないし１０個のサブユニットなどの、例えば６ないし７個のサブユニットの、６個のサブユニットなどの、７ないし１００個のサブユニットの、７ないし８０個のサブユニットなどの、例えば７ないし６０個のサブユニットの、７ないし４０個のサブユニットなどの、例えば７ないし２０個のサブユニットの、７ないし１８個のサブユニットなどの、例えば７ないし１６個のサブユニットの、７ないし１４個のサブユニットなどの、例えば７ないし１２個のサブユニットの、７ないし１０個のサブユニットなどの、例えば７ないし９個のサブユニットの、７ないし８個のサブユニットなどの、例えば７個のサブユニットの、８ないし１００個のサブユニットの、８ないし８０個のサブユニットなどの、例えば８ないし６０個のサブユニットの、８ないし４０個のサブユニットなどの、例えば８ないし２０個のサブユニットの、８ないし１８個のサブユニットなどの、例えば８ないし１６個のサブユニットの、８ないし１４個のサブユニットなどの、例えば８ないし１２個のサブユニットの、８ないし１０個のサブユニットなどの、例えば８ないし９個のサブユニットの、例えば８個のサブユニットの、９ないし１００個のサブユニットの、９ないし８０個のサブユニットなどの、例えば９ないし６０個のサブユニットの、９ないし４０個のサブユニットなどの、例えば９ないし２０個のサブユニットの、９ないし１８個のサブユニットなどの、例えば９ないし１６個のサブユニットの、９ないし１４個のサブユニットなどの、例えば９ないし１２個のサブユニットの、９ないし１０個のサブユニットなどの、９個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１００個のサブユニットの、１０ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１０ないし６０個のサブユニットの、１０ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１０ないし２０個のサブユニットの、１０ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１６個のサブユニットの、１０ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１２個のサブユニットの、１０個のサブユニットなどの、１１ないし１００個のサブユニットなどの、１１ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１１ないし６０個のサブユニットの、１１ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１１ないし２０個のサブユニットの、１１ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１１ないし１６個のサブユニットの、１１ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１１ないし１２個のサブユニットの、１２ないし１００個のサブユニットなどの、１２ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１２ないし６０個のサブユニットの、１２ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１２ないし２０個のサブユニットの、１２ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１２ないし１６個のサブユニットの、１２ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１３ないし１００個のサブユニットの、１３ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１３ないし６０個のサブユニットの、１３ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１３ないし２０個のサブユニットの、１３ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１３ないし１６個のサブユニットの、１３ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１４ないし１００個のサブユニットの、１４ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１４ないし６０個のサブユニットの、１４ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１４ないし２０個のサブユニットの、１４ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１４ないし１６個のサブユニットの、１５ないし１００個のサブユニットなどの、１５ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１５ないし６０個のサブユニットの、１５ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１５ないし２０個のサブユニットの、１５ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１５ないし１６個のサブユニットの、１６ないし１００個のサブユニットなどの、１６ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１６ないし６０個のサブユニットの、１６ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１６ないし２０個のサブユニットの、１６ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１７ないし１００個のサブユニットの、１７ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１７ないし６０個のサブユニットの、１７ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１７ないし２０個のサブユニットの、１７ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１８ないし１００個のサブユニットの、１８ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１８ないし６０個のサブユニットの、１８ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１８ないし２０個のサブユニットの、１９ないし１００個のサブユニットなどの、１９ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１９ないし６０個のサブユニットの、１９ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１９ないし３０個のサブユニットの、１９ないし２５個のサブユニットなどの、例えば２０ないし１００個のサブユニットの、２０ないし８０個のサブユニットなどの、例えば２０ないし６０個のサブユニットの、２０ないし４０個のサブユニットなどの、例えば２０ないし３０個のサブユニットの、２０ないし２５個のサブユニットなどを含む、または本質的にそれらのサブユニットからなる、請求項１記載の方法。
  40. サブユニットが、各々、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むあるいは本質的に該ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログからなる、請求項３９記載の方法。
  41. サブユニットが、各々、ヌクレオチドを含むまたは本質的に該ヌクレオチドからなる、請求項４０記載の方法。
  42. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸である、請求項４１記載の方法。
  43. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸である、請求項４１記載の方法。
  44. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項４１記載の方法。
  45. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項４１記載の方法。
  46. 共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる群より選択される、請求項４４または４５記載の方法。
  47. 少なくとも数個のヌクレオチドがヌクレオチド誘導体からなる群より選択される、請求項４０記載の方法。
  48. ヌクレオチド誘導体がデオキシリボ核酸誘導体およびリボ核酸誘導体からなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
  49. コード因子サブユニットがヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる群より選択され、そのうちの１個またはそれ以上の塩基部分および／またはリン酸部分および／またはリボース部分および／またはデオキシリボース部分が別の分子部分により置換されている、請求項３９記載の方法。
  50. コード因子サブユニットとの相互作用能を有する相補因子サブユニットが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項４９記載の方法。
  51. ヌクレオチド誘導体が、各々、化学的共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項４７記載の方法。
  52. ヌクレオチド誘導体が、各々、化学的共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項４７記載の方法。
  53. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される、請求項５１または５２記載の方法。
  54. 相補鋳型が、複数の所定の各コード因子をそのコード因子の認識能を有する一の相補因子と接触させることでそのコード因子を相補させることにより、得られる、請求項１記載の方法。
  55. ｎ個の相補因子を含む相補鋳型がコード因子の線状配列である、請求項１記載の方法。
  56. ｎ個の相補因子を含む相補鋳型が分岐している、請求項１記載の方法。
  57. ｎが、好ましくは、２ないし２００の、例えば２ないし１００の、２ないし８０などの、例えば２ないし６０の、２ないし４０などの、例えば２ないし３０の、２ないし２０などの、例えば２ないし１５の、２ないし１０などの、２ないし８などの、例えば２ないし６の、２ないし４などの、２などの、３ないし１００などの、例えば３ないし８０の、３ないし６０などの、３ないし４０などの、例えば３ないし３０の、３ないし２０などの、３ないし１５などの、例えば３ないし１５の、３ないし１０などの、３ないし８などの、例えば３ないし６の、３ないし４などの、例えば３の、４ないし１００などの、例えば４ないし８０の、４ないし６０などの、４ないし４０などの、例えば４ないし３０の、４ないし２０などの、４ないし１５などの、例えば４ないし１０の、４ないし８などの、４ないし６などの、４などの、例えば５ないし１００の、５ないし８０などの、例えば５ないし６０の、５ないし４０などの、例えば５ないし３０の、５ないし２０などの、例えば５ないし１５の、５ないし１０などの、５ないし８などの、例えば５ないし６の、例えば５の、６ないし１００などの、例えば６ないし８０の、６ないし６０などの、６ないし４０などの、例えば６ないし３０の、６ないし２０などの、６ないし１５などの、例えば６ないし１０の、６ないし８などの、６などの、例えば７ないし１００の、７ないし８０などの、例えば７ないし６０の、７ないし４０などの、例えば７ないし３０の、７ないし２０などの、例えば７ないし１５の、７ないし１０などの、７ないし８などの、７などの、例えば８ないし１００の、８ないし８０などの、例えば８ないし６０の、８ないし４０などの、例えば８ないし３０の、８ないし２０などの、例えば８ないし１５の、８ないし１０などの、例えば８の、９などの、例えば１０ないし１００の、１０ないし８０などの、例えば１０ないし６０の、１０ないし４０などの、例えば１０ないし３０の、１０ないし２０などの、例えば１０ないし１５の、１０ないし１２などの、１０などの、例えば１２ないし１００の、１２ないし８０などの、例えば１２ないし６０の、１２ないし４０などの、例えば１２ないし３０の、１２ないし２０などの、例えば１２ないし１５の、１４ないし１００などの、１４ないし８０などの、例えば１４ないし６０の、１４ないし４０などの、例えば１４ないし３０の、１４ないし２０などの、例えば１４ないし１６の、１６ないし１００などの、１６ないし８０などの、例えば１６ないし６０の、１６ないし４０などの、例えば１６ないし３０の、１６ないし２０などの、１８ないし１００などの、１８ないし８０などの、例えば１８ないし６０の、１８ないし４０などの、例えば１８ないし３０の、１８ないし２０などの、例えば２０ないし１００の、２０ないし８０などの、例えば２０ないし６０の、２０ないし４０などの、例えば２０ないし３０の、２０ないし２５などの、例えば２２ないし１００の、２２ないし８０などの、例えば２２ないし６０の、２２ないし４０などの、例えば２２ないし３０の、２２ないし２５などの、例えば２５ないし１００の、２５ないし８０などの、例えば２５ないし６０の、２５ないし４０などの、例えば２５ないし３０の、３０ないし１００などの、例えば３０ないし８０の、３０ないし６０などの、例えば３０ないし４０の、３０ないし３５などの、例えば３５ないし１００の、３５ないし８０などの、例えば３５ないし６０の、３５ないし４０などの、例えば４０ないし１００の、４０ないし８０などの、例えば４０ないし６０の、４０ないし５０などの、例えば４５ないし４５の、４５ないし１００などの、例えば４５ないし８０の、４５ないし６０などの、例えば４５ないし５０の、５０ないし１００などの、例えば５０ないし８０の、５０ないし６０などの、例えば５０ないし５５の、６０ないし１００などの、例えば６０ないし８０の、６０ないし７０などの、例えば７０ないし１００の、７０ないし９０などの、例えば７０ないし８０の、８０ないし１００などの、例えば８０ないし９０の、９０ないし１００などの数値を有する、請求項５５または５６記載の方法。
  58. 相補鋳型が固体または半固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
  59. 相補鋳型が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
  60. 相補鋳型がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなり、その鋳型の対応するコード因子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
  61. 相補鋳型が増幅可能である、請求項１記載の方法。
  62. 相補鋳型が一本鎖の相補因子を含む、請求項１記載の方法。
  63. 一本鎖の相補因子が一本鎖のコード因子を含む鋳型とハイブリッド形成することで二重螺旋を形成することのできる、請求項５５または５６記載の方法。
  64. 相補鋳型がプライミング部位を含む、請求項１ないし５７のいずれかに記載の方法。
  65. 相補因子が、各々、化学的共有結合により隣接する一の相補因子に連結されている、請求項１記載の方法。
  66. 相補因子が、各々、化学的共有結合により隣接する各相補因子に連結されている、請求項１記載の方法。
  67. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる共有結合の群より選択される、請求項５９または６０記載の方法。
  68. リン酸ジエステル結合がＩ型反応基（Ｉ型反応基の一方がヒドロキシル基であり、他方がホスホルイミダゾール基である）の間の反応により形成される、請求項６５ないし６７のいずれかに記載の方法。
  69. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合からなる共有結合の群より選択される、請求項５９または６０記載の方法。
  70. 少なくとも一個の相補因子が固体または半固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
  71. 相補因子がヌクレオチド（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）、アミノ酸、抗体および抗原からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  72. 相補因子がヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる、そのいずれの組み合せをも含む、群より選択される、請求項６４記載の方法。
  73. 多様性を向上させるのに、ヌクレオチド誘導体が天然ならびに天然に存在しない誘導体を含む、請求項７２記載の方法。
  74. 相補因子がヌクレオチドからなる群より選択される、請求項７３記載の方法。
  75. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、７−デアザ−グアニン、７−デアザ−アデニンから選択される塩基を含むデオキシリボ核酸である、請求項７４記載の方法。
  76. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸である、請求項７４記載の方法。
  77. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項７４記載の方法。
  78. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項７４記載の方法。
  79. 共有結合がリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合である、請求項７７または７８記載の方法。
  80. 相補因子がデオキシリボ核酸からなる群より選択される天然または天然に存在しないヌクレオチドである、請求項７２記載の方法。
  81. 相補因子がリボ核酸からなる群より選択される天然または天然に存在しないヌクレオチドである、請求項７２記載の方法。
  82. 相補因子がヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる群より選択され、そのうちの１個またはそれ以上の塩基部分および／またはリン酸部分および／またはリボースまたはデオキシリボース部分が実質的に別の分子部分により置換されている、請求項７２記載の方法。
  83. 相補因子との相互作用能を有するコード因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項８２記載の方法。
  84. ヌクレオチドが、各々、化学的共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項８２ないし８３のいずれかに記載の方法。
  85. ヌクレオチドが、各々、化学的共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項８２ないし８３のいずれかに記載の方法。
  86. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される、請求項８４または８５のいずれかに記載の方法。
  87. コード因子が他のコード因子に共有結合以外の結合で連結されている、請求項１記載の方法。
  88. 共有結合以外の結合が水素結合を包含する、請求項８７記載の方法。
  89. 相補因子が、好ましくは、１ないし１００個のサブユニットの、１ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１ないし６０個のサブユニットの、１ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１ないし２０個のサブユニットの、１ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１ないし１６個のサブユニットの、１ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１ないし１２個のサブユニットの、１ないし１０個のサブユニットなどの、例えば１ないし９個のサブユニットの、１ないし８個のサブユニットなどの、例えば１ないし７個のサブユニットの、１ないし６個のサブユニットなどの、例えば１ないし５個のサブユニットの、１ないし４個のサブユニットなどの、例えば１ないし３個のサブユニットの、１ないし２個のサブユニットなどの、例えば１個のサブユニットの、２ないし１００個のサブユニットの、２ないし８０個のサブユニットなどの、例えば２ないし６０個のサブユニットの、２ないし４０個のサブユニットなどの、例えば２ないし２０個のサブユニットの、２ないし１８個のサブユニットなどの、例えば２ないし１６個のサブユニットの、２ないし１４個のサブユニットなどの、例えば２ないし１２個のサブユニットの、２ないし１０個のサブユニットなどの、例えば２ないし９個のサブユニットの、２ないし８個のサブユニットなどの、例えば２ないし７個のサブユニットの、２ないし６個のサブユニットなどの、例えば２ないし５個のサブユニットの、２ないし４個のサブユニットなどの、例えば２ないし３個のサブユニットの、２個のサブユニットなどの、３ないし１００個のサブユニットの、３ないし８０個のサブユニットなどの、例えば３ないし６０個のサブユニットの、３ないし４０個のサブユニットなどの、例えば３ないし２０個のサブユニットの、３ないし１８個のサブユニットなどの、例えば３ないし１６個のサブユニットの、３ないし１４個のサブユニットなどの、例えば３ないし１２個のサブユニットの、３ないし１０個のサブユニットなどの、例えば３ないし９個のサブユニットの、３ないし８個のサブユニットなどの、例えば３ないし７個のサブユニットの、３ないし６個のサブユニットなどの、例えば３ないし５個のサブユニットの、３ないし４個のサブユニットなどの、例えば３個のサブユニットの、例えば４ないし１００個のサブユニットの、４ないし８０個のサブユニットなどの、例えば４ないし６０個のサブユニットの、４ないし４０個のサブユニットなどの、例えば４ないし２０個のサブユニットの、４ないし１８個のサブユニットなどの、例えば４ないし１６個のサブユニットの、４ないし１４個のサブユニットなどの、例えば４ないし１２個のサブユニットの、４ないし１０個のサブユニットなどの、例えば４ないし９個のサブユニットの、４ないし８個のサブユニットなどの、例えば４ないし７個のサブユニットの、４ないし６個のサブユニットなどの、例えば４ないし５個のサブユニットの、例えば４個のサブユニットの、５ないし１００個のサブユニットの、５ないし８０個のサブユニットなどの、例えば５ないし６０個のサブユニットの、５ないし４０個のサブユニットなどの、例えば５ないし２０個のサブユニットの、５ないし１８個のサブユニットなどの、例えば５ないし１６個のサブユニットの、５ないし１４個のサブユニットなどの、例えば５ないし１２個のサブユニットの、５ないし１０個のサブユニットなどの、例えば５ないし９個のサブユニットの、５ないし８個のサブユニットなどの、例えば５ないし７個のサブユニットの、５ないし６個のサブユニットなどの、例えば５個のサブユニットの、６ないし１００個のサブユニットの、６ないし８０個のサブユニットなどの、例えば６ないし６０個のサブユニットの、６ないし４０個のサブユニットなどの、例えば６ないし２０個のサブユニットの、６ないし１８個のサブユニットなどの、例えば６ないし１６個のサブユニットの、６ないし１４個のサブユニットなどの、例えば６ないし１２個のサブユニットの、６ないし１０個のサブユニットなどの、例えば６ないし７個のサブユニットの、６個のサブユニットなどの、７ないし１００個のサブユニットの、７ないし８０個のサブユニットなどの、例えば７ないし６０個のサブユニットの、７ないし４０個のサブユニットなどの、例えば７ないし２０個のサブユニットの、７ないし１８個のサブユニットなどの、例えば７ないし１６個のサブユニットの、７ないし１４個のサブユニットなどの、例えば７ないし１２個のサブユニットの、７ないし１０個のサブユニットなどの、例えば７ないし９個のサブユニットの、７ないし８個のサブユニットなどの、例えば７個のサブユニットの、８ないし１００個のサブユニットの、８ないし８０個のサブユニットなどの、例えば８ないし６０個のサブユニットの、８ないし４０個のサブユニットなどの、例えば８ないし２０個のサブユニットの、８ないし１８個のサブユニットなどの、例えば８ないし１６個のサブユニットの、８ないし１４個のサブユニットなどの、例えば８ないし１２個のサブユニットの、８ないし１０個のサブユニットなどの、例えば８ないし９個のサブユニットの、例えば８個のサブユニットの、９ないし１００個のサブユニットの、９ないし８０個のサブユニットなどの、例えば９ないし６０個のサブユニットの、９ないし４０個のサブユニットなどの、例えば９ないし２０個のサブユニットの、９ないし１８個のサブユニットなどの、例えば９ないし１６個のサブユニットの、９ないし１４個のサブユニットなどの、例えば９ないし１２個のサブユニットの、９ないし１０個のサブユニットなどの、９個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１００個のサブユニットの、１０ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１０ないし６０個のサブユニットの、１０ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１０ないし２０個のサブユニットの、１０ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１６個のサブユニットの、１０ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１０ないし１２個のサブユニットの、１０個のサブユニットなどの、１１ないし１００個のサブユニットなどの、１１ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１１ないし６０個のサブユニットの、１１ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１１ないし２０個のサブユニットの、１１ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１１ないし１６個のサブユニットの、１１ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１１ないし１２個のサブユニットの、１２ないし１００個のサブユニットなどの、１２ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１２ないし６０個のサブユニットの、１２ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１２ないし２０個のサブユニットの、１２ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１２ないし１６個のサブユニットの、１２ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１３ないし１００個のサブユニットの、１３ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１３ないし６０個のサブユニットの、１３ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１３ないし２０個のサブユニットの、１３ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１３ないし１６個のサブユニットの、１３ないし１４個のサブユニットなどの、例えば１４ないし１００個のサブユニットの、１４ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１４ないし６０個のサブユニットの、１４ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１４ないし２０個のサブユニットの、１４ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１４ないし１６個のサブユニットの、１５ないし１００個のサブユニットなどの、１５ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１５ないし６０個のサブユニットの、１５ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１５ないし２０個のサブユニットの、１５ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１５ないし１６個のサブユニットの、１６ないし１００個のサブユニットなどの、１６ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１６ないし６０個のサブユニットの、１６ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１６ないし２０個のサブユニットの、１６ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１７ないし１００個のサブユニットの、１７ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１７ないし６０個のサブユニットの、１７ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１７ないし２０個のサブユニットの、１７ないし１８個のサブユニットなどの、例えば１８ないし１００個のサブユニットの、１８ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１８ないし６０個のサブユニットの、１８ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１８ないし２０個のサブユニットの、１９ないし１００個のサブユニットなどの、１９ないし８０個のサブユニットなどの、例えば１９ないし６０個のサブユニットの、１９ないし４０個のサブユニットなどの、例えば１９ないし３０個のサブユニットの、１９ないし２５個のサブユニットなどの、例えば２０ないし１００個のサブユニットの、２０ないし８０個のサブユニットなどの、例えば２０ないし６０個のサブユニットの、２０ないし４０個のサブユニットなどの、例えば２０ないし３０個のサブユニットの、２０ないし２５個のサブユニットなどを含む、または本質的にそれらのサブユニットからなる、請求項１記載の方法。
  90. サブユニットが、各々、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むか、または本質的にそのヌクレオチドからなる、請求項８９記載の方法。
  91. サブユニットが、各々、ヌクレオチドを含むか、または本質的にそのヌクレオチドからなる、請求項９０記載の方法。
  92. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むデオキシリボ核酸である、請求項９１記載の方法。
  93. ヌクレオチドが、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から選択される塩基を含むリボ核酸である、請求項９１記載の方法。
  94. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項９１記載の方法。
  95. ヌクレオチドが、各々、共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項９１記載の方法。
  96. 共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる群より選択される、請求項９４記載の方法。
  97. 少なくとも数個のヌクレオチドがヌクレオチド誘導体からなる群より選択される、請求項９０記載の方法。
  98. ヌクレオチド誘導体がデオキシリボ核酸誘導体およびリボ核酸誘導体からなる群より選択される、請求項９７記載の方法。
  99. 相補因子サブユニットがヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログからなる群より選択され、そのうちの１個またはそれ以上の塩基部分および／またはリン酸部分および／またはリボース部分および／またはデオキシリボース部分が別の分子部分により置換されている、請求項９０記載の方法。
  100. 相補因子サブユニットとの相互作用能を有するコード因子サブユニットが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびモルホリノ配列（そのいずれのアナログまたは誘導体をも含む）からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、または本質的にかかるヌクレオチドからなる、請求項９９記載の方法。
  101. ヌクレオチド誘導体が、各々、化学的共有結合により隣接する一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項９３記載の方法。
  102. ヌクレオチド誘導体が、各々、化学的共有結合により隣接する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結されている、請求項９３記載の方法。
  103. 化学的共有結合がリン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合およびペプチド結合からなる共有結合の群から選択される、請求項９７または９８のいずれかに記載の方法。
  104. 相補因子がヌクレオチドから選択され、相補因子が酵素的に連結されている、請求項１記載の方法。
  105. 酵素が、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡ変異体Ｙ６３９Ｆ、シークエナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント）、ＤＮＡ−リガーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、イー・コリＲＮＡポリメラーゼ、ｒＴｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｅＤＮＡポリメラーゼ、修復ポリメラーゼおよびリガーゼまたはレプリカーゼ活性を有するリボザイムを含む、鋳型依存的ＤＮＡ−およびＲＮＡ−ポリメラーゼ（逆転写酵素、ＤＮＡ−リガーゼおよびＲＮＡ−リガーゼ、リボザイムおよびデオキシリボザイムを含む）からなる群より選択される、請求項１００記載の方法。
  106. 酵素が、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡ変異体Ｙ６３９Ｆ、シークエナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント）、ＤＮＡ−リガーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼからなる群より選択される、請求項１０５記載の方法。
  107. 組み込みの際にヌクレオチドが相補鋳型を形成する、請求項１０４ないし１０６のいずれかに記載の方法。
  108. プライマーが鋳型上のプライミング部位にアニールされ、ビルディングブロックの組み込みにより適当なポリメラーゼまたは転写酵素が該プライマーを伸長させ、相補鋳型を得る、請求項１０４ないし１０７のいずれかに記載の方法。
  109. ビルディングブロックがモノ−、ジ−またはオリゴヌクレオチド誘導体である、請求項１０８記載の方法。
  110. ビルディングブロックがモノヌクレオチド誘導体である、請求項１０９記載の方法。
  111. 機能的部分がリンカーを介してヌクレオ塩基部分に結合されている、請求項１０９ないし１１０記載の方法。
  112. リンカーが三重結合を含む、請求項１０７記載の方法。
  113. 相補鋳型に組み込まれると、機能的部分が核酸螺旋の主溝中に突き出るように、ビルディングブロックを設計する、請求項１０８ないし１１２のいずれかに記載の方法。
  114. 相補因子がオリゴヌクレオチドから選択され、相補因子がリガーゼを用いて酵素的に連結されている、請求項１０４ないし１０６のいずれかに記載の方法。
  115. 相補因子のオリゴヌクレオチドが、各々、三個またはそれ以上の核酸モノマーを含む、請求項１１４記載の方法。
  116. 相補因子が４ないし１００個の核酸モノマーを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１１５記載の方法。
  117. 相補因子が、他の相補因子とカップリングすることなく、コード因子にアニールする、請求項１記載の方法。
  118. 相補因子が６ないし１００個のヌクレオチドモノマーのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１７記載の方法。
  119. オリゴヌクレオチドが１０ないし５０個のヌクレオチドモノマーを含む、請求項１１９記載の方法。
  120. その長さが相補因子の長さの少なくとも半分である、請求項１１４ないし１１９のいずれかに記載の方法。
  121. リンカーがオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１４ないし１２０のいずれかに記載の方法。
  122. オリゴヌクレオチド相補因子およびオリゴヌクレオチドリンカーが連続するオリゴヌクレオチドである、請求項１１８ないし１２１のいずれかに記載の方法。
  123. 別個のビルディングブロックの２個のリンカーが、各々、一部の分子対を含み、その対が可逆的相互作用能を有する、請求項１２１ないし１２２記載の方法。
  124. 分子対が、リンカー上に二量化ドメインを形成する、核酸の二本鎖配列を含む、請求項１２３記載の方法。
  125. 一のリンカーの二量化ドメイン部が機能的部分の近くにある、請求項１２３または１２４記載の方法。
  126. 分子対の一部を形成する核酸モノマーの配列が２、１または０個の核酸モノマーで機能的部分から分離されている、請求項１２４または１２５記載の方法。
  127. 機能的部分が二量化ドメインに直接結合されている、請求項１２６記載の方法。
  128. 核酸モノマーの配列が３ないし２０個のモノ核酸を含む、請求項１２３ないし１２７のいずれかに記載の方法。
  129. 配列が３ないし１５個の核酸モノマーを含む、請求項１２８記載の方法。
  130. 配列が４ないし１２個の核酸モノマーを含む、請求項１２９記載の方法。
  131. 機能的部分がオリゴヌクレオチドリンカーのヌクレオ塩基に結合されている、請求項１１４ないし１３０のいずれかに記載の方法。
  132. 機能的部分がリンカーの末端ヌクレオチドに結合されている、請求項１３１記載の方法。
  133. 相補因子がヌクレオチドから選択され、相補因子が化学物質、ｐＨ変化、光、触媒、放射線照射、例えば、電磁気照射を用いることで、あるいは相互に接触させて反応性として自発的にカップリングさせることで連結される、請求項１記載の方法。
  134. 化学物質がホスホイミダゾリド基を含む、請求項１３３記載の方法。
  135. ホスホイミダゾリド基がビルディングブロックの５’末端に結合され、該ビルディングブロックがその３’ヒドロキシル基で発生期にある相補鋳型に連結されている、請求項１３３または１３４記載の方法。
  136. これら複数のビルディングブロックの少なくともサブセットが、好ましくは、一の相補因子および／または一の機能的部分および／または一のリンカーを含む、請求項１記載の方法。
  137. 複数のビルディングブロックのサブセットが機能的部分を相補因子から分離する一の選択的に切断可能なリンカーを含み、その選択的に切断可能なリンカーが、一の選択的に切断可能なリンカーを含むビルディングブロックのサブセットに属しないビルディングブロックの機能的部分を相補因子から分離している複数の切断可能なリンカーの切断をもたらす条件下で切断されない、請求項１記載の方法。
  138. 機能的部分に全くリンカーの痕跡が残らないように、その切断可能なリンカーを切断することにより、機能的部分を切り離す、請求項１０２記載の方法。
  139. 複数の切断可能なリンカーは切断されるが、少なくとも一つの選択的に切断可能なリンカーは切断させておらず、鋳型化された分子が少なくとも一つの選択的に切断可能なリンカーにより鋳型および／または相補因子に連結されている、請求項１３７または１３８記載の方法。
  140. リンカーが酸、塩基、化学物質、光、電磁気照射、酵素または触媒により切断される、請求項１３８または１３９記載の方法。
  141. 光切断されるリンカーがニトロフェニル基を含む、請求項１４０記載の方法。
  142. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約０．８Åないし約７０Åの範囲、０．８Åないし約６０Åの範囲など、例えば０．８Åないし約５０Åの範囲、０．８Åないし約４０Åの範囲など、例えば０．８Åないし約３０Åの範囲、０．８Åないし約２５Åの範囲など、例えば０．８Åないし約２０Åの範囲、０．８Åないし約１８Åの範囲など、例えば０．８Åないし約１６Åの範囲、０．８Åないし約１４Åの範囲など、例えば０．８Åないし約１２Åの範囲、０．８Åないし約１０Åの範囲など、例えば０．８Åないし約８Åの範囲、０．８Åないし約７Åの範囲など、例えば０．８Åないし約６Åの範囲、０．８Åないし約５Åの範囲など、例えば０．８Åないし約４Åの範囲、０．８Åないし約３．５Åの範囲など、例えば０．８Åないし約３．０Åの範囲、０．８Åないし約２．５Åの範囲など、例えば０．８Åないし約２．０Åの範囲、０．８Åないし約１．５Åの範囲など、例えば０．８Åないし約１．０Åの範囲にある、請求項１記載の方法。
  143. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約１Åないし約６０Åの範囲、１Åないし約４０Åの範囲など、例えば１Åないし約３０Åの範囲、１Åないし約２５Åの範囲など、例えば１Åないし約２０Åの範囲、１Åないし約１８Åの範囲など、例えば１Åないし約１６Åの範囲、１Åないし約１４Åの範囲など、例えば１Åないし約１２Åの範囲、１Åないし約１０Åの範囲など、例えば１Åないし約８Åの範囲、１Åないし約７Åの範囲など、例えば１Åないし約６Åの範囲、１Åないし約５Åの範囲など、例えば１Åないし約４Åの範囲、１．０Åないし約３．５Åの範囲など、例えば１．０Åないし約３．０Åの範囲、１．０Åないし約２．５Åの範囲など、例えば１．０Åないし約２．０Åの範囲、１．０Åないし約１．５Åの範囲など、例えば１．０Åないし約１．２Åの範囲にある、請求項１記載の方法。
  144. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約２Åないし約４０Åの範囲、２Åないし約３０Åの範囲など、２Åないし約２５Åの範囲など、例えば２Åないし約２０Åの範囲、２Åないし約１８Åの範囲など、例えば２Åないし約１６Åの範囲、２Åないし約１４Åの範囲など、例えば２Åないし約１２Åの範囲、２Åないし約１０Åの範囲など、例えば２Åないし約８Åの範囲、２Åないし約７Åの範囲など、例えば２Åないし約６Åの範囲、２Åないし約５Åの範囲など、例えば２Åないし約４Åの範囲、２．０Åないし約３．５Åの範囲など、例えば２．０Åないし約３．０Åの範囲、２．０Åないし約２．５Åの範囲など、例えば２．０Åないし約２．２Åの範囲にある、請求項１記載の方法。
  145. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約４Åないし約４０Åの範囲、４Åないし約３０Åの範囲など、４Åないし約２５Åの範囲など、例えば４Åないし約２０Åの範囲、４Åないし約１８Åの範囲など、例えば４Åないし約１６Åの範囲、４Åないし約１４Åの範囲など、例えば４Åないし約１２Åの範囲、４Åないし約１０Åの範囲など、例えば４Åないし約８Åの範囲、４Åないし約７Åの範囲など、例えば４Åないし約６Åの範囲、４Åないし約５Åの範囲などにある、請求項１記載の方法。
  146. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約６Åないし約４０Åの範囲、６Åないし約３０Åの範囲など、６Åないし約２５Åの範囲など、例えば６Åないし約２０Åの範囲、６Åないし約１８Åの範囲など、例えば６Åないし約１６Åの範囲、６Åないし約１４Åの範囲など、例えば６Åないし約１２Åの範囲、６Åないし約１０Åの範囲など、例えば６Åないし約８Åの範囲、６Åないし約７Åの範囲などにある、請求項１記載の方法。
  147. リンカーまたは選択的に切断可能なリンカーの長さが、約８Åないし約４０Åの範囲、８Åないし約３０Åの範囲など、８Åないし約２５Åの範囲など、例えば８Åないし約２０Åの範囲、８Åないし約１８Åの範囲など、例えば８Åないし約１６Åの範囲、８Åないし約１４Åの範囲など、例えば８Åないし約１２Åの範囲、８Åないし約１０Åの範囲などにある、請求項１記載の方法。
  148. 得られた鋳型化された分子が、少なくとも一つの機能的部分の反応基、官能基と、隣接する機能的部分の官能基との反応により、共有結合した一連の官能基を含む、請求項１記載の方法。
  149. 鋳型化された分子が官能基の線状に配列したものである、請求項１ないし１４８のいずれかに記載の方法。
  150. 鋳型化された分子が官能基の分岐状に配列したものである、請求項１ないし１４８のいずれかに記載の方法。
  151. 鋳型化された分子が官能基の環状に配列したものである、請求項１ないし１４８のいずれかに記載の方法。
  152. 鋳型化された分子が官能基の少なくとも一つの繰返し配列を含む、オリゴマーまたはポリマーである、請求項１記載の方法。
  153. 少なくとも三個の官能基の配列が鋳型化された分子中で少なくとも二回繰り返されている、請求項１５２記載の方法。
  154. 鋳型化された分子中に少なくとも三個の官能基の配列が一回だけ発生している、請求項１５２記載の方法。
  155. 鋳型化された分子がα−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ω−アミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  156. 鋳型化された分子が天然アミノ酸残基を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  157. 鋳型化された分子がα−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  158. 鋳型化された分子がモノ置換されたα−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  159. 鋳型化された分子がジ置換されたα−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  160. 鋳型化された分子がモノ置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  161. 鋳型化された分子がジ置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  162. 鋳型化された分子がトリ置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  163. 鋳型化された分子がテトラ置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  164. β−アミノ酸の骨格構造が、シクロヘキサン−骨格および／またはシクロペンタン−骨格を含むか、または本質的にそれら骨格からなる、請求項１記載の方法。
  165. 鋳型化された分子がγ−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  166. 鋳型化された分子がω−アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  167. 鋳型化された分子がビニル性アミノ酸を含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、請求項１記載の方法。
  168. 鋳型化された分子がＮ−置換グリシンを含むか、または本質的にそのアミノ酸からなる、
    請求項１記載の方法。
  169. 鋳型化された分子が、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、モノ−、ジ−およびトリ−置換されたα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形態またはＤ−形態のペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば補欠分子基を含むコンジュゲートペプチド、ポリエステル、多糖類、ポリカルバメート、ポリカルボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリ−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族サイクルを含む多環式化合物（ヘテロ多環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサン、ならびにそれらの組み合わせを含む、からなる群より選択される分子または分子部分を含むか、または本質的にそれらからなる、請求項１記載の方法。
  170. 鋳型化された分子の隣接する残基が、ペプチド結合、スルホンアミド結合、エステル結合、糖鎖結合、カルバメート結合、カルボネート結合、ウレア結合、リン酸結合、ウレタン結合、アザチド結合、ペプトイド結合、エーテル結合、エトキシ結合、チオエーテル結合、炭素単結合、炭素二重結合、炭素三重結合、ジスルフィド結合、スルフィド結合、ホスホジエステル結合、オキシム結合、イミン結合、イミド結合、およびそれらの組み合わせを含む、からなる化学結合の群より選択される化学結合により連結されている、請求項１記載の方法。
  171. 二またはそれ以上のビルディングブロックの機能的部分を連結する化学結合が、第一機能的部分の求核基と、別の機能的部分のエステルまたはチオエステルとの反応によって形成される、請求項１７０記載の方法。
  172. チオエステル基を有するビルディングブロックのリンカーが、官能基を求核性ビルディングブロックに移動させる結合と同時に切断される、請求項１７１記載の方法。
  173. 求核基が−ＮＨ２、Ｈ２ＮＨＮ−、ＨＯＨＮ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択される、請求項１７１または１７２記載の方法。
  174. 鋳型化された分子の骨格構造が、−ＮＨＮ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＢ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＣ（ＲＲ’）ＣＯ−；−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ）ＣＯ−；−ＮＨＣ６Ｈ４ＣＯ−；−ＮＨＣＨ２ＣＨＲＣＯ−；−ＮＨＣＨＲＣＨ２ＣＯ−；−ＣＯＣＨ２−；−ＣＯＳ−；−ＣＯＮＲ−；−ＣＯＯ−；−ＣＳＮＨ−；−ＣＨ２ＮＨ−；−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２Ｓ−；−ＣＨ２ＳＯ−；−ＣＨ２ＳＯ２−；−ＣＨ（ＣＨ３）Ｓ−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＮＨＣＯ−；−ＮＨＣＯＮＨ−；−ＣＯＮＨＯ−；−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−；−ＰＯ２ＮＨ−；ＰＯ２ＣＨ２−；−ＰＯ２ＣＨ２Ｎ＋−；−ＳＯ２ＮＨ−；およびラクタムから選択される分子を含むか、または本質的にそれらからなる、請求項１記載の方法。
  175. 機能的部分が、α−アミノ酸先駆体、β−アミノ酸先駆体、γ−アミノ酸先駆体、およびω−アミノ酸先駆体から選択される先駆体の群より選択される、請求項１記載の方法。
  176. β−アミノ酸先駆体がＮ−カルボキシ無水物の環構造の誘導体である、請求項１７５記載の方法。
  177. β−アミノ酸先駆体チオカルボキシ無水物（ＮＴＡ）環構造の誘導体である、請求項１７１記載の方法。
  178. 少なくとも一つの機能的部分の官能基が架橋分子により別の機能的部分に連結されている、請求項１記載の方法。
  179. 機能的部分が隣接している、請求項１７８記載の方法。
  180. 鋳型化された分子が、少なくとも２個の異なる官能基、少なくとも３個の異なる官能基など、例えば少なくとも４個の異なる官能基、少なくとも５個の異なる官能基など、例えば少なくとも６個の異なる官能基、少なくとも７個の異なる官能基など、例えば少なくとも８個の異なる官能基、少なくとも９個の異なる官能基など、例えば少なくとも１０個の異なる官能基、少なくとも１０個の異なる官能基などを含むか、または本質的にそれらからなる、請求項１記載の方法。
  181. 官能基が同じである、請求項１８０記載の方法。
  182. ビルディングブロックが、各々、少なくとも一つのＩ型反応基を含む、請求項１記載の方法。
  183. ビルディングブロックが、各々、少なくとも一つのＩＩ型反応基を含む、請求項１記載の方法。
  184. ビルディングブロックが、各々、少なくとも二つのＩ型反応基を含む、請求項１８２記載の方法。
  185. ビルディングブロックが、各々、少なくとも二つのＩＩ型反応基を含む、請求項１８３記載の方法。
  186. 少なくとも一つのビルディングブロックが、３個またはそれ以上の、例えば４個またはそれ以上のＩＩ型反応基を含む、請求項１８５記載の方法。
  187. ＩＩ型反応基が類似している、請求項１８５または１８６記載の方法。
  188. ＩＩ型反応基が反応パートナである、請求項１８５または１８６記載の方法。
  189. ＩＩ型反応基が架橋分子を介して官能基の間を連結する形成能を有する、請求項１８７または１８８記載の方法。
  190. 架橋分子が機能的部分のＩＩ型反応基に対する反応パートナである反応基を有する二官能性化合物である、請求項１８９記載の方法。
  191. ＩＩ型反応基が非類似である、請求項１８５記載の方法。
  192. 非類似のＩＩ型反応基が反応パートナである、請求項１９１記載の方法。
  193. ＩＩ型反応基が架橋分子を介して官能基の間を連結する形成能を有する、請求項１９１または１９２記載の方法。
  194. 架橋分子が機能的部分のＩＩ型反応基に対する反応パートナである反応基を有する二官能性化合物である、請求項１９１記載の方法。
  195. 機能的部分の少なくとも一つのＩＩ型反応基が、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、Ｎ−チオカルボキシ無水物（ＮＴＡ）、クマリン、アミン、カルボン酸、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、エステル、チオエステル、アルケニル、二重結合のコンジュゲートシステム、ヒドラジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびエポキシドからなる群より選択される、請求項１８２ないし１９４のいずれかに記載の方法。
  196. ＩＩ型反応基が求電子物質である、請求項１７８ないし１９０のいずれかに記載の方法。
  197. ＩＩ型反応基が、−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ＝ＣＨ−Ｒおよび−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ−ＮＨＲ（ここでＸはＳまたはＯであり、Ｒは独立して官能基である）からなる群より選択される求電子物質である、請求項１９１記載の方法。
  198. ＩＩ型反応基が求核物質である、請求項１８３ないし１９５のいずれかに記載の方法。
  199. ＩＩ型反応基が、−ＮＨ２、Ｈ２ＮＨＮ−、ＨＯＨＮ−およびＨ２Ｎ−Ｃ（Ｏ，Ｓ）−ＮＨ−からなる群より選択される求核物質である、請求項１９８記載の方法。
  200. ＩＩ型反応基がラジカルである、請求項１８３ないし１９５のいずれかに記載の方法。
  201. 機能的部分がリンカーに連結されるＩＩ型反応基を含む、上記した請求項いずれかに記載の方法。
  202. 機能的部分がさらに少なくとも一つのさらなるＩＩ型反応基を含む、請求項２０１記載の方法。
  203. 少なくとも一つのさらなるＩＩ型反応基を含む機能的部分が、第２の機能的部分にあるＩＩ型反応基との反応によって、その別の機能的部分とリンカーの間にあるＩＩ型反応基を有する機能的部分との連結の形成能を有する、請求項２０２記載の方法。
  204. 第２の機能的部分とリンカーの間にある連結が切断され、その第２の機能的部分の官能基が第１の機能的部分に転位される、請求項２０３記載の方法。
  205. 第１と第２の機能的部分の間の連結がそのＩＩ型反応基の各々が直接反応することで形成される、請求項２０１ないし２０４のいずれかに記載の方法。
  206. 第１と第２の機能的部分の間の連結が架橋分子を介して形成される、請求項２０１ないし２０４のいずれかに記載の方法。
  207. 複数の官能基が複数のビルディングブロックの関与する反応カスケードによって連結される、上記した請求項のいずれかに記載の方法。
  208. 複数の官能基が複数のビルディングブロックの関与する反応カスケードによって連結され、そのビルディングブロックが、各々、リンカーに連結される第１のＩＩ型反応基を含む機能的部分を含み、その機能的部分が少なくとも一つのさらなるＩＩ型反応基を含む、請求項２０１ないし２０７のいずれかに記載の方法。
  209. 機能的部分が、他の機能的部分への連結を形成する間の好ましい配向を得るために回転が制限されている、上記した請求項のいずれかに記載の方法。
  210. 機能的部分を相補因子に連結する一またはそれ以上の結合が回転について固定されている、請求項２０９記載の方法。
  211. 好ましい配向が機能的部分をヌクレオチドビルディングブロックの塩基ならびに（デオキシ）リボース部分にカップリングさせることで得られる、請求項２０９または２１０記載の方法。
  212. 機能的部分がジヌクレオチドの二つの塩基にカップリングされている、請求項２０９ないし２１１のいずれかに記載の方法。
  213. 鋳型化された分子の形成に、アニオン、カチオンまたはラジカル重合を介してポリマーを形成する能力を有するＩＩ型反応基が関与している、上記した請求項いずれかに記載の方法。
  214. 一またはそれ以上のＩＩ型反応基を含む足場機能的部分を含み、その足場機能的部分が複数のビルディングブロックから由来の官能基を付加することによって鋳型化された分子を形成するための化学構造基体である、上記した請求項いずれかに記載の方法。
  215. 足場機能的部分が二またはそれ以上のＩＩ型反応基を含む、請求項２１４記載の方法。
  216. 足場機能的部分が鋳型に共有結合されている、請求項２１４または２１５記載の方法。
  217. 足場機能的部分が鋳型のコード因子の認識能を有する相補因子に連結されている、請求項２１４または２１５記載の方法。
  218. 鋳型に結合されたビルディングブロックが足場機能的部分との連結を形成する能力を有するＩＩ型反応基を有する機能的部分を含む、請求項２１４ないし２１７のいずれかに記載の方法。
  219. 官能基の足場機能的部分へのスクランブル化した連結が、足場機能的部分にあるＩＩ型反応基の数を、複数のビルディングブロックの機能的部分にあるＩＩ型反応基の数と比べて異なるようにすることでなされる、請求項２１４ないし２１８のいずれかに記載の方法。
  220. 足場にあるＩＩ型反応基とビルディングブロックにある対応するＩＩ型反応基とを反応させることで、官能基の足場機能的部分への連結と、機能的部分を相補因子と連結しているリンカーの切断が同時になされる、請求項２１４ないし２１９のいずれかに記載の方法。
  221. 異なるコード因子および／または異なる次数のコード因子を有する複数の鋳型を用いる、上記した請求項のいずれかに記載の方法。
  222. 二またはそれ以上の異なる鋳型を用いる、請求項２２１記載の方法。
  223. 四またはそれ以上の異なる鋳型、例えば１０３、１０５、１０７、１０９、１０１１、１０１３、１０１５、１０１７種より多くの異なる鋳型を用いる、請求項２２１または２２２記載の方法。
  224. 複数の異なる鋳型が異なる鋳型化された分子のライブラリを形成し、その鋳型化された分子が、各々、その分子をテンプレートした特定の鋳型または相補鋳型に連結される、請求項２２１記載の方法。
  225. 鋳型または相補鋳型を鋳型化された分子から切り離し、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されない鋳型化された分子を得る、さらなる工程を含む、上記した請求項のいずれかに記載の方法。
  226. 複数の共有結合した官能基が、各々、一の残基を含み、ここでその共有結合した残基が、単独で、または付加部分との組み合わせにおいて、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、モノ−、ジ−およびトリ−置換されたα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形態またはＤ−形態のペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば補欠分子基を含むコンジュゲートペプチド、ポリエステル、多糖類、ポリカルバメート、ポリカルボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリ−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族サイクルを含む多環式化合物（ヘテロ多環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサンからなるポリマー部分の群から選択される少なくとも一つの部分を含むポリマーを形成する能力を有し、その複数の残基が、好ましくは、２ないし２００の、例えば２ないし１００の、２ないし８０などの、例えば２ないし６０の、２ないし４０などの、例えば２ないし３０の、２ないし２０などの、例えば２ないし１５の、２ないし１０などの、２ないし８などの、例えば２ないし６の、２ないし４などの、例えば２の、３ないし１００などの、例えば３ないし８０の、３ないし６０などの、３ないし４０などの、例えば３ないし３０の、３ないし２０などの、３ないし１５などの、例えば３ないし１５の、３ないし１０などの、３ないし８などの、例えば３ないし６の、３ないし４などの、例えば３の、４ないし１００などの、例えば４ないし８０の、４ないし６０などの、４ないし４０などの、例えば４ないし３０の、４ないし２０などの、４ないし１５などの、例えば４ないし１０の、４ないし８などの、４ないし６などの、例えば４の、例えば５ないし１００の、５ないし８０などの、例えば５ないし６０の、５ないし４０などの、例えば５ないし３０の、５ないし２０などの、例えば５ないし１５の、５ないし１０などの、５ないし８などの、例えば５ないし６の、例えば５の、６ないし１００などの、例えば６ないし８０の、６ないし６０などの、６ないし４０などの、例えば６ないし３０の、６ないし２０などの、６ないし１５などの、例えば６ないし１０の、６ないし８などの、６などの、例えば７ないし１００の、７ないし８０などの、例えば７ないし６０の、７ないし４０などの、例えば７ないし３０の、７ないし２０などの、例えば７ないし１５の、７ないし１０などの、７ないし８などの、例えば７の、例えば８ないし１００の、８ないし８０などの、例えば８ないし６０の、８ないし４０などの、例えば８ないし３０の、８ないし２０などの、例えば８ないし１５の、８ないし１０などの、８などの、例えば９の、例えば１０ないし１００の、１０ないし８０などの、例えば１０ないし６０の、１０ないし４０などの、例えば１０ないし３０の、１０ないし２０などの、例えば１０ないし１５の、１０ないし１２などの、１０などの、例えば１２ないし１００の、１２ないし８０などの、例えば１２ないし６０の、１２ないし４０などの、例えば１２ないし３０の、１２ないし２０などの、例えば１２ないし１５の、１４ないし１００などの、１４ないし８０などの、例えば１４ないし６０の、１４ないし４０などの、例えば１４ないし３０の、１４ないし２０などの、例えば１４ないし１６の、１６ないし１００などの、１６ないし８０などの、例えば１６ないし６０の、１６ないし４０などの、例えば１６ないし３０の、１６ないし２０などの、１８ないし１００などの、１８ないし８０などの、例えば１８ないし６０の、１８ないし４０などの、例えば１８ないし３０の、１８ないし２０などの、例えば２０ないし１００の、２０ないし８０などの、例えば２０ないし６０の、２０ないし４０などの、例えば２０ないし３０の、２０ないし２５などの、例えば２２ないし１００の、２２ないし８０などの、例えば２２ないし６０の、２２ないし４０などの、例えば２２ないし３０の、２２ないし２５などの、例えば２５ないし１００の、２５ないし８０などの、例えば２５ないし６０の、２５ないし４０などの、例えば２５ないし３０の、３０ないし１００などの、例えば３０ないし８０の、３０ないし６０などの、例えば３０ないし４０の、３０ないし３５などの、例えば３５ないし１００の、３５ないし８０などの、例えば３５ないし６０の、３５ないし４０などの、例えば４０ないし１００の、４０ないし８０などの、例えば４０ないし６０の、４０ないし５０などの、例えば４５ないし４５の、４５ないし１００などの、例えば４５ないし８０の、４５ないし６０などの、例えば４５ないし５０の、５０ないし１００などの、例えば５０ないし８０の、５０ないし６０などの、例えば５０ないし５５の、６０ないし１００などの、例えば６０ないし８０の、６０ないし７０などの、例えば７０ないし１００の、７０ないし９０などの、例えば７０ないし８０の、８０ないし１００などの、例えば８０ないし９０の、９０ないし１００などの数で存在する、請求項１ないし２２５のいずれかに記載の方法で得られる、鋳型化された分子。
  227. 鋳型化された分子がポリマーである、請求項２２６記載の鋳型化された分子。
  228. ポリマーが線状である、請求項２２７記載の鋳型化された分子。
  229. ポリマーが分岐状である、請求項２２７記載の鋳型化された分子。
  230. 共有結合した残基が、単独で、または以下の郡から選択される付加部分との組み合わせにおいて、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、モノ−、ジ−およびトリ−置換されたα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形態またはＤ−形態のペプチド、ビニル性ポリペプチドからなるポリマー部分の群から選択される少なくとも一つの部分を含むポリマーを形成する能力を有する、請求項２２６ないし２２９のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  231. 共有結合した残基が多糖類を形成する能力を有する、請求項２２６ないし２３０のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  232. 一連の官能基を含む鋳型化された分子であって、隣接する官能基がその官能基と本来結合していない分子部分により連結されている、請求項２２６ないし２３１のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  233. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、α−ペプチドまたはヌクレオチドを含まない、またはそれらで構成されない、鋳型化された分子。
  234. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、モノ置換されたα−ペプチドまたはヌクレオチドを含まない、またはそれらで構成されない、鋳型化された分子。
  235. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、ペプチドまたはヌクレオチドを含まない、またはそれらで構成されない、鋳型化された分子。
  236. 請求項２２１ないし２２４のいずれかに記載の方法に従って調製される鋳型化された分子の組成物であって、複数の約１０３種以上の鋳型化された分子、約１０４種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０５種以上の鋳型化された分子、約１０６種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０７種以上の鋳型化された分子、約１０８種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０９種以上の鋳型化された分子、約１０１０種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０１１種以上の鋳型化された分子、約１０１２種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０１３種以上の鋳型化された分子、約１０１４種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０１５種以上の鋳型化された分子、約１０１６種以上の鋳型化された分子など、例えば約１０１７種以上の鋳型化された分子、約１０１８種以上の鋳型化された分子などを含む、組成物。
  237. 複数の鋳型化された分子が請求項２２６ないし２３５のいずれかに記載の鋳型化された分子の群より選択される、請求項２３６記載の組成物。
  238. さらに、各鋳型化された分子またはその一部をテンプレートする能力を有する鋳型を含む、請求項２３６または２３７記載の組成物。
  239. 鋳型化された分子がその鋳型化された分子をテンプレートする能力を有する鋳型に連結されている、請求項２３８記載の組成物。
  240. 鋳型化された分子が鋳型に共有結合で連結されている、請求項２３９記載の組成物。
  241. 鋳型化された分子が鋳型に共有結合以外の結合で連結されている、請求項２３９記載の組成物。
  242. 共有結合以外の結合が、水素結合、ファンデアワールス結合およびイオン結合からなる群より選択される一またはそれ以上の結合を含む、請求項２４１記載の組成物。
  243. 鋳型化された分子と、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型とを含む、複合体。
  244. 鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、その鋳型が天然に存在しないヌクレオチドである、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  245. 鋳型化された分子が天然に存在するα−ペプチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  246. 鋳型化された分子がα−ペプチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  247. 鋳型化された分子が独占的に一置換されたα−アミノ酸からなるペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドのみからなるものではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  248. 鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  249. 鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  250. 鋳型化された分子が一置換されたα−ペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  251. 鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  252. 鋳型化された分子がペプチドである場合、鋳型は天然のヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  253. 鋳型化された分子がペプチドである場合、鋳型はヌクレオチドではない、請求項２３６ないし２４２のいずれかに記載の組成物。
  254. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がα−ペプチドを含まず、または該ペプチドで構成されない、鋳型化された分子。
  255. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子が一置換されたα−ペプチドを含まない、鋳型化された分子。
  256. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がα−ペプチドまたはヌクレオチドを含まず、またはそれらで構成されない、鋳型化された分子。
  257. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、その鋳型は天然のヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  258. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子が一置換されたα−アミノ酸のみからなるペプチドである場合、その鋳型は天然のヌクレオチドのみからなるものではない、鋳型化された分子。
  259. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合、その鋳型は天然のヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  260. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子が天然のα−ペプチドである場合、その鋳型はヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
    請求項１記載の方法。
  261. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子が一置換されたα−ペプチドである場合、その鋳型はヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  262. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がα−ペプチドである場合、その鋳型はヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  263. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がペプチドである場合、その鋳型は天然のヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  264. 一連の共有結合した官能基を含む鋳型化された分子であって、その鋳型化された分子がリンカーにより、その鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されており、その鋳型化された分子がペプチドである場合、その鋳型はヌクレオチドではない、鋳型化された分子。
  265. 鋳型化された分子が、少なくとも一つの官能基の反復配列を含むオリゴマーまたはポリマーである、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  266. 少なくとも三個の官能基の配列が鋳型化された分子中で少なくとも２回反復されている、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  267. 鋳型化された分子中に少なくとも三個の官能基の配列が一回だけ生じる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  268. 鋳型化された分子が、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ω−アミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  269. 鋳型化された分子が天然のアミノ酸残基を含むか、または本質的にかかるアミノ酸残基からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  270. 鋳型化された分子がα−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  271. 鋳型化された分子が一置換されたα−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  272. 鋳型化された分子が二置換されたα−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  273. 鋳型化された分子が一置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  274. 鋳型化された分子が二置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  275. 鋳型化された分子が三置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  276. 鋳型化された分子が四置換されたβ−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  277. β−アミノ酸の骨格構造がシクロヘキサン骨格および／またはシクロペンタン骨格を含むか、または本質的にかかる骨格からなる、請求項２７３ないし２７６のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  278. 鋳型化された分子がγ−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  279. 鋳型化された分子がω−アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  280. 鋳型化された分子がビニル性アミノ酸を含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  281. 鋳型化された分子がＮ−置換グリシンを含むか、または本質的にかかるアミノ酸からなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  282. 鋳型化された分子が、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、モノ−、ジ−およびトリ−置換されたα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形態またはＤ−形態のペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば補欠分子基を含むコンジュゲートペプチド、ポリエステル、多糖類、ポリカルバメート、ポリカルボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリ−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族サイクルを含む多環式化合物（ヘテロ多環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサン、ならびにそれらの組み合わせを含む、からなる群より選択される分子または分子部分を含むか、または本質的にそれらで構成される、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  283. 鋳型化された分子の隣接する残基が、ペプチド結合、スルホンアミド結合、エステル結合、糖鎖結合、カルバメート結合、カルボネート結合、ウレア結合、リン酸結合、ウレタン結合、アザチド結合、ペプトイド結合、エーテル結合、エトキシ結合、チオエーテル結合、炭素単結合、炭素二重結合、炭素三重結合、ジスルフィド結合、スルフィド結合、ホスホジエステル結合、オキシム結合、イミン結合、イミド結合、アミン結合、アミド結合およびそれらの組み合わせを含む、からなる化学結合の群より選択される化学結合により連結されている、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  284. α−ペプチドではない請求項２８３記載の鋳型化された分子。
  285. 鋳型化された分子の骨格構造が、−ＮＨＮ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＢ（Ｒ）ＣＯ−；−ＮＨＣ（ＲＲ’）ＣＯ−；−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ）ＣＯ−；−ＮＨＣ６Ｈ４ＣＯ−；−ＮＨＣＨ２ＣＨＲＣＯ−；−ＮＨＣＨＲＣＨ２ＣＯ−；−ＣＯＣＨ２−；−ＣＯＳ−；−ＣＯＮＲ−；−ＣＯＯ−；−ＣＳＮＨ−；−ＣＨ２ＮＨ−；−ＣＨ２ＣＨ２−；−ＣＨ２Ｓ−；−ＣＨ２ＳＯ−；−ＣＨ２ＳＯ２−；−ＣＨ（ＣＨ３）Ｓ−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＮＨＣＯ−；−ＮＨＣＯＮＨ−；−ＣＯＮＨＯ−；−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−；−ＰＯ２ＮＨ−；ＰＯ２ＣＨ２−；−ＰＯ２ＣＨ２Ｎ＋−；−ＳＯ２ＮＨ−；およびラクタムから選択される分子（その組み合わせを含む）を含むか、または本質的にそれらからなる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  286. 先駆体がα−アミノ酸先駆体、β−アミノ酸先駆体、γ−アミノ酸先駆体、およびω−アミノ酸先駆体から選択される先駆体の群より選択される、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  287. 鋳型化された分子が、少なくとも２個の異なる官能基、少なくとも３個の異なる官能基など、例えば少なくとも４個の異なる官能基、少なくとも５個の異なる官能基など、例えば少なくとも６個の異なる官能基、少なくとも７個の異なる官能基など、例えば少なくとも８個の異なる官能基、少なくとも９個の異なる官能基など、例えば少なくとも１０個の異なる官能基、少なくとも１０個の異なる官能基などを含むか、または本質的にそれらからなる、請求項２１９ないし２２６または２４０ないし２５０のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  288. 官能基が同じである、請求項２８７記載の鋳型化された分子。
  289. 請求項１ないし２１８のいずれかに記載の方法により得ることができる、請求項２２６ないし２３５または２５４ないし２６４のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  290. 共有結合で連結されているビルディングブロックの配列を含む分子であって、共有結合で連結されているビルディングブロックの配列が、鋳型化された分子の合成をテンプレートした鋳型を補足することのできる相補鋳型を形成する相補因子の配列を含み、その鋳型化された分子がその合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型に連結されているところの、分子。
  291. 鋳型化された分子が、少なくとも一つの官能基を含む機能的部分の配列を含み、少なくとも一つのＩＩ型反応基を含んでいてもよく、機能的部分が鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補因子または鋳型に連結されている、上記した請求項のいずれかに記載の鋳型化された分子。
  292. 鋳型化された分子が請求項１ないし２２５に記載の方法により調製され、ここでこの鋳型化された分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、ペプチドまたは蛋白あるいはその誘導体からなる群より選択される別の分子に結合されている、請求項２２６ないし２９１のいずれかに記載の組成物。
  293. 所定の活性を有する可能性のある鋳型化された分子をスクリーニングする方法であって、標的分子または標的部分（表面を含む）を準備する工程、および標的分子または標的部分について親和性を有する、または標的分子または標的部分に対して効果を有する鋳型化された分子を得る工程を含む、方法。
  294. 鋳型化された分子と結合する可能性のある活性を検定する方法であって、標的分子または標的部分（表面を含む）を準備する工程、および標的分子または標的部分について親和性を有する、または標的分子または標的部分に対して効果を有する鋳型化された分子を得る工程、およびその鋳型化された分子の活性を測定する工程を含む、方法。
  295. 所定の活性を有する複合体または鋳型化された分子を選択する方法であって、選択操作を行う工程、および所定の選択基準に基づいて鋳型化された分子を選択する工程を含む、方法。
  296. 所定の活性を有する分子の組成物をスクリーニングする方法であって、
    ｉ）鋳型化された分子の第１の組成物を確立し、ここで該分子は請求項２２６ないし２３５または請求項２５４ないし２９０のいずれか請求項にて特定されているか、または請求項１ないし２２５のいずれかの請求項に定義されるように産生され、
    ｉｉ）その第１の組成物を該第１の組成物が所定の活性を有する鋳型化された分子に富む条件に曝し、
    ｉｉｉ）第２の組成物を含有して富む組成物の鋳型化された分子を増幅してもよく、
    ｉｖ）さらに、工程ｉｉ）ないしｉｉｉ）を繰り返してもよく、
    ｖ）特異的に所定の活性を有する鋳型化された分子を高い割合で有するさらなる組成物を得る、
    ことを含む、方法。
  297. さらに、鋳型化された分子を変異させる工程を含み、ここでこの変異誘発が工程ｉｉｉ）を行う前、工程ｉｉｉ）を行うと同時に、あるいは工程ｉｉｉ）を行った後に起こり得る、請求項２９６記載の方法。
  298. 変異誘発がランダム変異誘発または部位特異的変異誘発として行われる、請求項２９７記載の方法。
  299. 工程ｉｉｉ）が１０１ないし１０１５倍に増幅することを含む、請求項２９６記載の方法。
  300. 工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を少なくとも２回、３回または５回、少なくとも１０回など、少なくとも１５回など繰り返す、請求項２９６記載の方法。
  301. さらに、所定の活性を有する鋳型化された分子を同定する工程を含む、請求項２９６記載の方法。
  302. 同定が、鋳型および／または相補鋳型を物理的に解析することにより、またはその分子と関連する別の手段により行われる、請求項２９６記載の方法。
  303. 組成物を富ませる条件が所定の活性を有する鋳型化された分子の結合パートナを準備し、その結合パートナが支持体に直接的または間接的に固定されることを含む、請求項２９６記載の方法。
  304. 組成物を富ませる条件が、一またはそれ以上の電気泳動的な分離、ゲル濾過、免疫沈降、等電点電気泳動、遠心分離および固定化を含む、請求項２９６記載の方法。
  305. 所定の活性が酵素活性または触媒活性である、請求項２９６記載の方法。
  306. 組成物を富ませる条件が鋳型化された分子を取り込むことのできる細胞を準備し、所定の活性を有する鋳型化された分子と相互作用させることを含む、請求項２９６記載の方法。
  307. 所定の活性を有する、または有する可能性のある鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅する方法であって、その鋳型を増幅手段と接触させ、その鋳型を増幅させる工程を含む、方法。
  308. 所定の活性を有する、または有する可能性のある鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅する方法であって、ｉ）その鋳型を増幅手段と接触させ、その鋳型を増幅させる工程、およびｉｉ）少なくとも２倍増加した量の鋳型化された分子を得る工程を含む、方法。
  309. 官能基の新規なまたは改変された配列を含む鋳型化された分子の生成を含む、鋳型化された分子の配列を変更する方法であって、好ましくは、
    ｉ）第１の鋳型化された分子をテンプレートすることのできる第１の相補鋳型または第１の鋳型を準備し、あるいは複数の第１の鋳型化された分子をテンプレートすることのできる第１の相補鋳型または第１の鋳型を準備し、
    ｉｉ）その第１の相補鋳型または第１の鋳型の配列を、または複数の第１の相補鋳型または第１の鋳型の配列を変異または修飾させ、第２の鋳型または第２の相補鋳型を、または複数の第２の鋳型または第２の相補鋳型を生成し、
    ここで、第２の鋳型（複数でも可）または相補鋳型（複数でも可）は第２の鋳型化された分子または複数の第２の鋳型化された分子の合成をテンプレートする能力を有し、
    ここで、その第２の鋳型化された分子（複数でも可）は、第１の鋳型化された分子（複数でも可）の官能基の配列と同一ではない、共有結合で連結されている官能基の配列を含み、
    ｉｉｉ）その第２の鋳型（複数でも可）または相補鋳型（複数でも可）により、第２の鋳型化された分子または複数のかかる第２の鋳型化された分子をテンプレートしてもよい、ことを含む、方法。
  310. 官能基の新規なまたは改変された配列を含む鋳型化された分子の生成を含む、鋳型化された分子の配列を変更する方法であって、好ましくは、
    ｉ）複数の第１の鋳型化された分子をテンプレートすることのできる複数の第１の相補鋳型または第１の鋳型を準備し、
    ｉｉ）その複数の第１の相補鋳型または第１の鋳型の配列を組み換え、第２の鋳型または第２の相補鋳型を、または複数の第２の鋳型または第２の相補鋳型を生成し、
    ここで、第２の鋳型（複数でも可）または相補鋳型（複数でも可）は第２の鋳型化された分子または複数の第２の鋳型化された分子の合成をテンプレートする能力を有し、
    ここで、その第２の鋳型化された分子（複数でも可）は、第１の鋳型化された分子（複数でも可）の官能基の配列と同一ではない、共有結合で連結されている官能基の配列を含み、
    ｉｉｉ）その第２の鋳型（複数でも可）または相補鋳型（複数でも可）により、第２の鋳型化された分子または複数のかかる第２の鋳型化された分子をテンプレートしてもよい、ことを含む、方法。
  311. さらに、鋳型化された分子の合成をテンプレートした相補鋳型または鋳型を増幅する工程を含み、その増幅工程が、変異誘発工程または組換え工程の前、同時または後に起こる、請求項３０９または３１０記載の方法。
  312. 変異誘発が部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、化学的変異誘発、独特部位削除（ＵＳＥ）、誤りがちなＰＣＲ、誤りがちなＤＮＡシャフリングとして行われる、請求項３０９または３１０記載の方法。
  313. 変異誘発がＤＮＡシャフリングまたはインビボまたはインビトロでの相同的組換えを含む組換え技法の形態として行われる、請求項３０９または３１０記載の方法。
  314. ｉ）認識基を有するコード因子を特異的に認識することができ、ヌクレオチド、アミノ酸、抗体、抗原、蛋白、ペプチド、およびヌクロチドの認識能を有する分子から選択される、相補因子と、
    ｉｉ）α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、モノ−、ジ−およびトリ−置換されたα−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、ω−ペプチド、アミノ酸残基がＬ−形態またはＤ−形態のペプチド、ビニル性ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリアミド、ビニル性スルホンアミドペプチド、ポリスルホンアミド、例えば補欠分子基を含むコンジュゲートペプチド、ポリエステル、多糖類、ポリカルバメート、ポリカルボネート、ポリウレア、ポリペプチジルホスホネート、ポリウレタン、アザチド、オリゴＮ−置換グリシン、ポリエーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、ポリ−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン、ポリジスルフィド、ポリアリレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ、オリゴピロリノン、ポリオキシム、ポリイミン、ポリエチレンイミン、ポリイミド、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリスチレン、ポリビニル、脂質、リン脂質、糖脂質、例えば脂肪族または芳香族サイクルを含む多環式化合物（ヘテロ多環式化合物を含む）、プロテオグリカン、およびポリシロキサンの先駆体から選択される、少なくとも一つの機能的部分と、
    ｉｉｉ）機能的部分を相補因子から分離するリンカーと、
    を含む、ビルディングブロック。
  315. 相補因子が、１−４個のヌクレオチドの配列など、１−３個のヌクレオチドなど、２個のヌクレオチドなど、または３個のヌクレオチドなどのヌクレオチド配列から選択される、請求項３１４記載のビルディングブロック。
  316. 機能的部分が、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、ジ置換アミノ酸、ポリ置換アミノ酸、ビニル化アミノ酸、Ｎ−置換グリシン誘導体および他の修飾アミノ酸から選択されるアミノ酸の先駆体から選択される、請求項３１４記載のビルディングブロック。
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