JP4738741B2 - テンプレートされた分子を合成するための改良法 - Google Patents
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Description
本発明は、テンプレートされた分子を合成するための方法に関する。該方法は、結合の形成に関与することを意図される反応性基の高い局所濃度を含み、かくして結合形成の可能性を増大させる。本発明はさらに、複数のテンプレートされた分子であるライブラリーにも関し、ここにおいて、テンプレートされた分子のそれぞれはその合成を行うテンプレートに結合している。
新規特性を有する分子の生成は困難な課題である。最近、さらに効率の良い生成およびさらに多数の分子のスクリーニングを可能にする多くの方法が提案されている。行われる方法は、ペプチド、RNAおよびDNAなどの天然のバイオポリマー以外の分子のエンコーディングおよび/またはテンプレーティングを含む。これらの方法は、研究者らが短時間に膨大な数の分子を生成し、スクリーンすることを可能にする。この結果、所望の特性を有するさらに良好な分子が得られる。
本発明は、反応の可能性を促進するために反応物質の局所濃度を増大させるための溶液を提案することを目的とする。
本発明はテンプレートされた分子を合成する方法を提供し、前記方法は:
a)1以上のコドンを含む少なくとも一つのテンプレートを提供する工程、
b)分子対の第二の部分と可逆的に相互作用できる分子対の第一の部分を含むジッピングドメインに結合した第一の機能的エンティティーを提供する工程、
c)それぞれ、アンチコドン、さらなる機能的エンティティーおよびアンチコドンと機能的エンティティーを結合させるリンカーを含む1以上のビルディングブロックを提供する工程(ここにおいて、アンチコドンはテンプレートのコドンを補足し、機能的エンティティーは前記分子対の第二の部分を含むジッピングドメインと結合し、第一の機能的エンティティーと化学的に結合できる)、
d)工程a)、b)、およびc)の成分を、アンチコドンのテンプレートのコドンとの特異的ハイブリダイゼーションおよび分子対の2つの部分の二量化を許容する条件下で互いに接触させる工程、
e)ビルディングブロックが第一の機能的エンティティーとの化学的結合を形成するのを許容する工程、
f)任意に、1以上のリンカーを開裂させる工程(ただし、少なくとも1つのリンカーはテンプレートと機能的エンティティーを結合させたままであるとする)、
g)合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子を得る工程
を含む。
多段合成を行う場合、工程d)からg)の繰り返しは、工程d)に従った接触工程においてジッピングドメインと結合した第一の機能的エンティティーとして工程g)に従った合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子を用いて行われる。
コドン:アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度と二量化ジッピングドメイン間の差は、適当には10℃以上である。さらに好ましくは、アニーリング温度間の差は25℃またはそれ以上である。
アンチコドンのコドンに対する特異的ハイブリダイゼーション中の条件は、適当には、コドンおよび/またはアンチコドンの濃度を包含し、これは分子対の2対の二量化中に使用されるコドンおよび/またはアンチコドンの濃度よりも高い。濃度における差は、コドン:アンチコドンハイブリッドが機能的エンティティーの反応前に形成される可能性を高め、これにより遺伝子情報の伝達を確実にする。好適には、コドンおよびアンチコドンのハイブリダイゼーション中の濃度は、ジッピングドメインの2対の二量化に用いられる濃度と比較して少なくとも10倍高い。媒体中で一般に反応性基の濃度に対してエンコードされた反応性基の局所濃度が増大するので、ジッピングドメイン二量化中の希釈条件も、媒体中に現れるランダムな反応性基間で架橋反応よりもテンプレート指向性反応に有利である。
ライブラリーは好ましくは異なる独自のコドンおよび/または独自のコドンの種類を有する複数のテンプレートを含む。テンプレートの独自のコドンに対応するアンチコドンを有する複数のビルディングブロックが通常提供される。本発明の一態様において、独自のコドンのそれぞれについて特定のビルディングブロックが提供される。もう一つの態様において、コドンのいくつかはビルディングブロックにより合致しないか、あるいは機能的エンティティーなしのオリゴヌクレオチド配列によりブロックされる。
ジッパーボックスは、ある環境条件下で互いに対する親和力を有する2つの部分からなる分子親和性対である。分子親和性対の本質的性質は、分子親和対を組み立てるために2つの部分が相互作用できることである。バイオテクノロジー分野において、分子親和性対として使用できる様々な相互作用分子対が公知である。例としては、これらに限定されるわけではないが、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ポリサッカライド相互作用、RNA−タンパク質相互作用、DNA−DNA相互作用、DNA−RNA相互作用、RNA−RNA相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、酵素−リガンド相互作用、抗体−リガンド相互作用、タンパク質−リガンド相互作用などが挙げられる。
テンプレートのコドンはもう一つ別のエンティティーにより特異的に認識され得る能力を有する任意の生化学的エンティティーであり得る。しかしながら、コドンはヌクレオチドの配列であるのが好ましい。ヌクレオチドの配列は主鎖上に一連の核酸塩基を有する。コドンの核酸塩基は相補エンティティーにより特異的に認識される能力を有する任意の化学的エンティティーであり得る。核酸塩基は通常天然の核酸塩基(アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン)から選択されるが、ワトソン−クリック水素結合則に従う他の核酸塩基、例えば米国特許第6037120号に開示されている合成核酸塩基などを用いることできる。
当業者らは所望のデザインのヌクレオチドを構築することができる。特定のアニーリング温度が望ましい場合、適当な組成の核酸モノマーおよびその長さを示すのが標準的方法である。適当なデザインの構築は、Vector NTI Suiteまたはインターネットアドレスhttp://www.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html.の公共データベースなどのソフトウェアを利用することができる。
ビルディングブロックの機能的エンティティーは、テンプレート分子中に最終的に組み入れられる構造的エンティティーの前駆体の働きをする。従って、本出願と請求の範囲において、機能的エンティティーが初期テンプレート指向性分子に移されるという場合は、本来の機能的エンティティーの全ての原子が最終的に形成されるテンプレート指向性分子において見いだされる必要はないと理解される。また、結合に関与する反応の結果として、機能的エンティティーの構造は、初期テンプレート分子上に出現する場合に変化し得る。特に、結果として機能的エンティティーを放出することになる開裂は、その後の工程において初期テンプレート分子と機能的エンティティー間の結合の形成に関与し得る反応性基を生成することができる。
本発明の方法において用いられるビルディングブロックは、ビルディングブロックに含まれる特定のエンティティーにしたがって設計することができる。一例として、アンチコドンをポリエチレングリコール(PEG)リンカーで分子親和性対の第二の部分に結合させることができ、機能的エンティティーを分子親和性対の第二の部分に直接結合させることができる。もう一つ別の好ましい例において、アンチコドン、リンカーおよび分子親和性対の第二の部分は連続した直線状オリゴヌクレオチドである。
アンチコドンを含むビルディングブロックの設計は、機能的エンティティーが化学反応により互いに結合する前に、アンチコドンがテンプレートにアニールされていることを確実にするために、全てまたは一部のビルディングブロック:テンプレートハイブリッドについての特定の範囲のアニーリング温度を得ることを目的とする。ビルディングブロックが本質的に同じ親和性を有するテンプレートとアニールされる場合、各サイクルにおいてビルディングブロックを付加することが必要である。すなわち、ビルディングブロックをテンプレートと接触させることは、個々のビルディングブロックを別々に付加することを含む。
生じたテンプレート分子が相補エレメント(アンチコドンを含むかどうかに関わらない)によりテンプレートに結合する方法を行う場合、水素結合および疎水性相互作用のみが部分を結合させるので、親和力は比較的弱い。従って、本発明の一態様において、最終的にテンプレート分子を有する相補エレメントを、テンプレートの他のコドン:アンチコドンハイブリッドよりも高いアニーリング温度を有する相補エレメント:テンプレートハイブリッドを介してテンプレートと結合させることができる。別法として、好ましくはいくつかの適用例において、テンプレート分子は、共有結合によりその合成を行うテンプレートと結合される。共有結合は水素結合以外であってもよいし、あるいは共有結合は代替であってもよい。共有結合の存在により、複合体のさらに過酷な化学処理が可能になる。本発明の一態様において、共有結合は選択的に開裂可能であり、相補テンプレートからテンプレート分子が分離される。
本発明はさらに、二機能性複合体のライブラリーにも関する。ライブラリーは複数の異なる複合体、たとえば、103、106、109、1012、または1015の異なる複合体からなる。複数の異なる複合体は、まず複数の異なるテンプレートならびに複数のビルディングブロックを提供することにより製造される。ビルディングブロックのアンチコドンのそれぞれは、少なくとも1つのテンプレートの少なくとも1つのコドンと相互作用できるようにされる。複数の異なるテンプレートは、本明細書に記載された方法に同時に付される。該方法の増殖部分を、テンプレートされた分子を発生させるために望ましい回数繰り返すことができる。増殖の繰り返しのそれぞれは、さらに別のビルディングブロックの新規サブセットとテンプレートを接触させることにより開始される。
治療または診断法において使用される化合物および植物保護化合物、例えば殺虫剤、殺菌剤などの探索を包含する様々な用途にライブラリーを用いることができる。ライブラリーは、任意の数の本発明の複合体を含むことができる。
i)テンプレートされた分子を含む複合体の第一のライブラリーを確立する工程(前記ライブラリーは本発明の方法のいずれかに従って得ることができる)、
ii)ライブラリーをあらかじめ決められた活性を有する複合体に関して濃縮する条件に該ライブラリーを付す工程、
iii)濃縮されたライブラリーの複合体を増幅する工程、
iv)所望により、工程ii)からiii)を繰り返す工程、および
v)さらに高い割合の、あらかじめ決められた活性を有するテンプレートされた分子を含む複合体を有する濃縮されたライブラリーを得る工程。
複合体のライブラリーが濃縮されて、あらかじめ決められた活性を示す複合体を含む小さなプールになる場合、複合体のそれぞれを別々に得ることが望ましい。1以上のビルディングブロックのリンカーを開裂させて、テンプレートからテンプレートされた分子を放出させることにより、テンプレートされた分子を複合体から得ることができる。
本発明において用いられるヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中で一緒に結合させることができる。各ヌクレオチドモノマーは通常2つの部分、すなわち、核酸塩基部分、および主鎖からなる。主鎖は、いくつかの場合においては、糖部分とヌクレオシド間リンカーに再分割することができる。
核酸塩基部分は、天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しない核酸塩基間で選択することができる。以前は「天然に存在しない」と考えられていた様々な核酸塩基が自然界でその後見いだされていることは当業者には明らかである。従って、「核酸塩基」は、公知プリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体を包含する。核酸塩基の例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミンプリン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、7−デアザキサンチン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノ−2,6−ジアミノ−プリン、5−メチルシトシン、5−(C3−C6)−アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびBannerら、米国特許第5432272号に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基である。「核酸塩基」なる用語は、これらの例のそれぞれおよびすべてならびにその類似体および互変異性体を網羅することを意図される。特に、興味深い核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、およびウラシルであり、これらはヒトにおける治療および診断用途に関して天然に存在する核酸塩基と見なされる。
ヌクレオシド間リンカーは、主鎖の糖部分が2’−デオキシリボースのリボースなどのペントースである場合、後続のモノマーの5’末端に先行するモノマーの3’末端を結合させる。ヌクレオシド間結合は天然に存在するホスホジエステル結合またはその誘導体であっても良い。かかる誘導体の例としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、およびホスホジチオエートが挙げられる。さらに、ヌクレオシド間リンカーは、当該分野において公知の多くの非リン含有リンカーのいずれかであり得る。
各コドンはアンチコドンにより補足される。アンチコドンはこれが補足するコドンと特異的に協働する能力を有する。コドンと相補アンチコドン間の親和性は、周知のワトソン−クリック塩基対システムにしたがって水素結合により影響を受ける。従って、アンチコドンはコドンそれ自体と同じ種類の核酸モノマーからなる。
機能的エンティティーは1以上の官能基、すなわちテンプレートされた分子を最終的に形成する基を含むことができる。テンプレートされた分子は1以上の以下の官能基を単独または組み合わせにおいて含むことができる:
1. ヒドロキシル
2. 第一、第二、第三アミン
3.カルボン酸
4.ホスフェート、ホスホネート
5.スルホネート、スルホンアミド
6.アミド
7.カーバメート
8.カーボネート
9.尿素
10.アルカン、アルケン、アルキン
11.アンヒドリド
12.ケトン
13.アルデヒド
14.ナイトレート、ナイトライト
15.イミン
16.フェニルおよび他の芳香族基
17.ピリジン、ピリミジン、プリン、インドール、イミダゾール、および複素環式塩基
18.複素環
19.多環
20.フラビン
21.ハライド
22.金属
23.キレート
24.メカニズムベースの阻害剤
25.小分子触媒
26.デキストリン、サッカライド
27.フルオロセイン、ローダミンおよび他のフルオロフォア
28.ポリケチド、ペプチド、様々なポリマー
29.酵素およびリボザイムおよび他の生物学的触媒
30.官能基の重合後/活性化後カップリングのための官能基
31.薬剤、例えばタキソール部分、アシクロビル部分、「天然の生成物」
32.超分子構造、例えばナノクラスター
33.脂質
34.オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体(例えば、PNA、LNA、モルホリノ)
35.水素
反応性基は特に、機能的エンティティーの一部を形成し、直接または適当な橋かけ分子エンティティーを介して結合を形成する反応に関与することができる基に関する。反応性基の例を以下に列挙する:
1.N−カルボキシアンヒドリド(NCA)
2.N−チオカルボキシアンヒドリド(NTA)
3.アミン
4.カルボン酸
5.ケトン
6.アルデヒド
7.ヒドロキシル
8.チオール
9.エステル
10.チオエステル
11.二重結合の共役系
12.アルキルハライド
13.ヒドラジン
14.N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
15.エポキシド
16.ハロアセチル
17.UDP−活性化サッカライド
18.スルフィド
19.シアネート
20.カルボニルイミダゾール
21.チアジアノン
22.ホスフィン
23.ヒドロキシルアミン
24.スルホネート
25.活性化ヌクレオチド
26.塩化ビニル
27.アルケン、キニン
本発明に従って、本明細書に開示された一般法を用いて実質的に任意の分子をテンプレートすることができる。合成できる化合物の例としては、これらに限定されないが、以下に列挙する化合物が挙げられる:
アルファ−、ベータ−、ガンマ−、およびオメガ−ペプチド;モノ−、ジ−、およびトリ−置換ペプチド;L−およびD−形ペプチド;シクロヘキサン−およびシクロペンタン主鎖修飾ベータ−ペプチド;ビニル系ポリペプチド;グリコポリペプチド;ポリアミド;ビニル系スルホンアミドペプチド;ポリスルホンアミド;共役ペプチド(すなわち、補欠分子団を有する);ポリエステル;ポリサッカライド;ポリカーバメート;ポリカーボネート;ポリウレア;ポリ−ペプチジルホスホネート;アザチド;ペプトイド(オリゴN−置換グリシン);ポリエーテル;エトキシホルムアセタールオリゴマー;ポリ−チオエーテル;ポリエチレングリコール(PEG);ポリエチレン;ポリジスルフィド;ポリアリーレンスルフィド;ポリヌクレオチド;PNA;LNA;モルホリノ;オリゴピロリノン;ポリオキシム;ポリイミン;ポリエチレンイミン;ポリアセテート;ポリスチレン;ポリアセチレン;ポリビニル;脂質;リン脂質;糖脂質;多環(脂肪族);多環(芳香族);ポリ複素環;プロテオグリカン;ポリシロキサン;ポイリソシアニド;ポリイソシアネート;ポリメタクリレート;一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的開鎖炭化水素;一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的非芳香族炭素環;単環、二環、三環、および多環複素環、橋かけ多環複素環;一機能的、二機能的、三機能的、およびオリゴ機能的芳香族炭素環;単環、二環、三環、および多環芳香族炭素環;一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的芳香族複素環;単環、二環、三環および多環複素環;キレート、フラーレン;ステロイド;シクロスポリン類似体;ならびに前記分子部分の任意の組み合わせ。
所望の活性(例えば、特定の標的に対する結合、触媒活性、または活性分析における特定の効果)に関してのテンプレートされた分子を含む複合体のライブラリーの選択またはスクリーニング(通常、濃縮と称する)は、任意の標準的プロトコルに従って行うことができる。例えば、親和性選択は、ファージ提示、ポリソーム提示またはmRNA−タンパク質融合提示ペプチドについて用いられる原理に従って行うことができる。触媒活性についての選択は、遷移状態類似アフィニティーカラム上での親和性選択(Bacaら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、1997;94(19):10063−8)、または機能に基づいた選択スキーム(Pedersenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95(18):10523−8)により行うことができる。所望の特徴についてのスクリーニングは、標準的マクロタイタープレートベースのアッセイ、またはFACS−ソーティングアッセイにしたがって行うことができる。
ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドに関して、存在する増幅法はさらに少ない。非酵素増幅スキーム(Schmidtら、NAR25:4797−4802(1997))を用いることができる。主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体、例えばPNAおよびLNAに関して、この増幅法を用いることができる。次回の選択またはスクリーニングのためにさらに多様性を高めるために、増幅前または増幅中に、テンプレートまたは相補テンプレートを突然変異誘発または組み換えることができる。
ライブラリーをさらに濃縮することが必要と考えられるならば、選択および増幅工程を繰り返すことができる。選択および増幅工程が繰り返される場合、標的および複合体を必要とする結合工程は、好ましくはさらに厳しい条件下で行われ、複合体の一部のみが標的に結合することを確実にする。
濃縮サイクルは、2ないし15回、またはそれ以上行うことができ、各サイクルにおいて濃縮は10ないし1000倍である。一方法において、出発ライブラリーは1014の複合体になる。7サイクルの濃縮後(各サイクルにおいて100倍濃縮)、標的に対して最高の親和性を有する複合体が理論的に得られる。しかしながら、最終サイクルは興味のある複合体の小さなプールを供給する可能性が高く、これは他の手段により調査しなければならない。
ランダムであるが、あらかじめ決められた配列を有するオリゴヌクレオチドのDNAアレイの使用により、単離物を配列化することも可能である。
本発明はさらに、異なる標的と結合することができる小分子の選択を可能にする方法にも関する。テンプレート提示分子技術は、直接選択および増幅のためのビルトイン機能を含む。選択された分子の結合は、これらが特定の標的に対して配位結合し、これにより特定の生物学的効果を防止または誘発するだけである点で選択的である。最終的に、これらの結合分子は、例えば治療薬として、または診断薬として用いることが可能である。
選択法は、ほとんどの標的に対する選択を可能にするように行うことができる。重要なことには、この選択法における工程はどれもライブラリー中の標的または分子の詳細な構造情報を必要としない。全プロセスは、所定の標的に対するライブラリー中の分子の特異的認識/配位結合に関与する結合親和性により支配される。しかしながら、いくつかの用途においては、必要ならば、ファージ提示を用いて触媒活性についての選択に類似した機能を含めることもできる(Soumillionら、(1994)J.Mol.Biol.237:415−22;Pedersenら、(1998)PNAS、18:10523−10528)。様々な選択法の例を以下に記載する。
当業者らは、テンプレート提示分子が配位結合できるバイト(bait)として標的が使用される任意の状況において選択プロセス行うことができることを認識するであろう。
変更された表現型は広範囲に及ぶさまざまな方法で検出することができる。一般に、変更された表現型を、例えば:細胞形態の顕微鏡分析;標準的細胞生存性分析(増大した細胞死および増大した細胞生存性の両方を包含する);標準的標識分析、例えば特定の細胞または分子のレベルの存在についての蛍光計インジケーター分析(FACSまたは他の色素染色技術を包含する);細胞を殺した後の標的化合物の発現の生化学的検出などを用いて検出される。いくつかの場合において、特定のシグナリング経路は、様々なレポーター遺伝子構築物を用いてプローブすることができる。
本発明の結合分子は、結合以外の他の性質について選択することができる。例えば、選択中に;最終生成物の所望の作業環境のある種の条件に対する安定性を選択基準として含めることができる。ある種のプロテアーゼの存在下で安定な結合分子が望ましい場合、該プロテアーゼは選択中に用いられる緩衝媒体の一部であり得る。同様に、選択は血清または細胞抽出物または任意の種類の媒体中で行うこともできる。理解されるように、このテンプレート提示法を用いる場合、テンプレートを破壊または分解する条件は、増幅を許容するために回避しなければならない。当業者らには理解されるように、他の望ましい性質を提示分子中に直接取り入れることができる。例えば、高い疎水性を有するビルディングブロックを用いることにより、特性として膜親和性を含めることができる。
好ましい具体例において、選択された結合分子が合成され、生物学的効果および効力について選択された候補を検証するための種々の適当なインビトロおよびインビボ試験において試験される。当業者らには理解されるように、これは様々な方法で行うことができ、生物活性な分子の組成によって変わる。
もう一つ別の態様において、本発明は病理プロセスまたは他の生物学的事象に含まれる標的を識別または単離するための方法を提供する。この態様において、標的分子はここでも好ましくはタンパク質または核酸であるが、特に、炭水化物および特異的分子リガンド結合が達成できる様々な分子も含むことができる。原則として、テンプレート提示分子技術は、細胞上、組織またはインビボで見いだされる抗原上の特異性エピトープに関して選択するために用いることができる。これらのエピトープは、重要な生物学的事象に関与する標的に属する。加えて、これらのエピトープは標的の生物学的機能にも関与する。
本発明のテンプレート提示分子技術は、様々な標的をブロックするか、または刺激するために用いることができる。治療的に関連する標的は、多機能性であり、従って疾患状態に至る調節プロセスに関与することが知られているか、または予想される物質である。かかるプロセスの例は、レセプター−リガンド相互作用、転写−DNA相互作用、およびに接着分子を含む細胞−細胞相互作用、コファクター−酵素相互作用、および細胞内シグナル伝達におけるタンパク質−タンパク質相互作用である。標的分子とは、分子リガンドが望ましい興味のある任意の化合物を意味する。従って、標的は、例えば、化合物、化合物の混合物、空間的に局在化した化合物のアレイ、生物学的高分子、例えば、DNAまたはmRNA、バクテリオファージペプチド提示ライブラリー、リボソームペプチド提示ライブラリー、細菌、植物、真菌、または動物(例えば、哺乳動物)細胞または組織などの生物学的物質から調製される抽出物、タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、酵素、レセプター、レセプターリガンド、ホルモン、抗原、抗体、薬剤、色素、成長因子、脂質、基質、毒素、ウイルスなどを制限なく包含する。標的の他の例は、例えば、全細胞、全組織、関連するタンパク質または関連しないタンパク質の混合物、ウイルスまたは細菌株の混合物などを制限なく包含する。
図1は、共通のテンプレートにアニールされた2つのオリゴヌクレオチドのアミノ官能基の架橋を示すPAGEゲルの複写を示す。
図2は、共通のテンプレートにアニールされ、0、1、2、および30塩基対間隔をおいて架橋された、2つのオリゴヌクレオチドを示すPAGEゲルの複写を示す。
図3は、それぞれアミンおよびカルボン酸が末端にある2つのオリゴヌクレオチドの架橋を示すPAGEゲルの複写を示す。
図4は、架橋効率に対する異なるpH特性の影響を示すPAGEゲルの複写を示す。
図5は、架橋効率に対する異なるpH特性の影響を示すPAGEゲルの複写を示す。
図6は、pH9での架橋効率を示すPAGEゲルの複写を示す。
図7は、pH10での架橋効率を示すPAGEゲルの複写を示す。
図8は、10merジッパーボックスが用いられる場合、テンプレートが存在しない影響を分析するPAGEゲルの複写である。
図9は、高いインキュベーション温度の架橋効率に対する影響を分析するPAGEゲルの複写を示す。
図10は、架橋効率に対する5merジッパーボックスの影響を示すPAGEゲルの画像を示す。
図11は、10merジッパーボックスが用いられる場合、架橋効率に対する異なる温度の影響を示すPAGEゲルの画像を示す。
図12は、実験において用いられる一般的原則の概略図を示す。
図13は、(A)スカフォード分子および(B)ポリマー分子の合成における二量化ドメインの使用の概略図を示す。
図14は、一般的原則の好ましい具体例を示す。
図15は、2つの異なる機能的エンティティーのスカフォード分子への移動のLC−クロマトグラムを示す。
図16は、実施例において用いられる2つのオリゴセットアップを開示する。
図17は、実施例15における実験AおよびBの結果を示す。
図18は、実施例16において報告されている実験D、E、およびFの結果を示す。
図19は、実施例17において報告されている実験AおよびBの結果を示す。
図20は、実施例17の結果を示す。
図21は、実施例18において行われた実験の結果を示す。
図22は、実施例19において開示された実験の結果を示す。
図23は、実施例20において報告される実験AからBの結果を示す。
図24は、実施例21において報告される実験EからHの結果を開示する。
図25は、実施例21の結果を示す。
(実施例)
実施例1ないし11の一般法および材料
2つのオリゴが同じテンプレート上で隣接する部位にアニールされる場合に、それぞれがオリゴヌクレオチドにカップリングした2つの反応性基間の反応効率を調べるために、
下記に示す一般的セットアップを使用した。2つのオリゴは、下記の図に示されるように、カルボン酸またはアミンで誘導化される末端ヌクレオチド(X、YおよびZ)を含有する。2つのオリゴの末端上の反応性基の反応(架橋)後、2つのオリゴがこの架橋の結果としてカップリングするようになり、従ってカラムを通してさらにゆっくりと移動するので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により架橋効率を分析した。
ビルディングブロック
・Ah1:5’−GCTACTCGTACGAGX
・Ah3:5’−GCTACTCGTACGAGY
・Ah5:5’−GCTACTCGTACGAGZ
・Ah2:5’−XCACTTGCAGACAGC
・Ah4:5’−YCACTTGCAGACAGC
・Ah6:5’−ZCACTTGCAGACAGC
・Ah14:5’−GCTACTCGTACGAG
・Ah23:5’−GCTACTGGCATCGGX
・Ah24:5’−GCTACTGGCATCGGY
・Ah27:5’−YCACTTGCAGACAGC
・AH36:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAA−TGTGTCCAGTTACX
・AH37:5’−ZGTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT−GTCGAGCATCCAGCT
・AH51:5’−ZGTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT−GTCGAGCATCCAGCT
・AH67:5’−ZCATTGACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTG−ACCTGTCGAGCATCCAGCT
・AH69:5’−AGZAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTG−ACCTGTCGAGCATCCAGCT
・AH66:5’−ZTTGTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACC−TGTCGAGCATCCAGCT
・AH65:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCG−AATGTGTCCAGTTACTTX
ジッパーボックスドメインに下線を施す。
・X=X=カルボキシ−dT
・Y=アミノフェノール−修飾因子C2 dT
・Z=アミノフェノール−修飾因子C6 dT
Ah28:5’−GCTGTCTGCAAGTGAACCGATGCCAGTAGC
Ah38:5’−AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGG TCG
Ah7:5’−GCTGTCTGCAAGTGAACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG−ビオチン−3’
Ah8:5’−GCTGTCTGCAAGTGACACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG−ビオチン−3’
Ah9:5’−GCTGTCTGCAAGTGACGACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG−ビオチン−3’
Ah11:5’−GCTGTCTGCAAGTGACGACTGATCCAGTGACATGCGTACCATCGAACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG−ビオチン−3’
テンプレートを通常のホスホルアミダイト合成法により調製した。
緩衝液A(100mM Hepes pH=7.5、1M NaCl)
緩衝液B:(100mM NaPO4 pH=6、1M NaCl)
緩衝液C:(100mM ホウ酸ナトリウム pH=9、1M NaCl)
緩衝液D:(100mM ホウ酸ナトリウム pH=10、1M NaCl)
緩衝液E:(500mM NaPO4 pH=7、1M NaCl)
緩衝液F:(500mM NaPO4 pH=8、1M NaCl)
関連する緩衝液中でオリゴを混合し、80℃に加熱し、次いで28℃に冷却する(−2℃/30秒)。
32Pでの5’−標識
200ピコモルのオリゴヌクレオチド、2μlの10×ホスホリル化緩衝液(Promegaカタログ番号4103)、1μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promegaカタログ番号4103)、1μlのγ−32P ATP、H2O(20μlになるように)を混合する。37℃で10〜30分間インキュベートする。
サンプルをホルムアミド色素1:1(98%ホルムアルデヒド、10mM EDTA、pH8、0.025%キシレンシアノール、0.025%ブロモフェノールブルー)と混合し、80℃で2分間インキュベートし、変性10%ポリアクリルアミドゲルにかける。オートラジオグラフィー(Kodak、BioMax film)を用いてゲルを展開する。
結果を図3に示す。
結果を図6に示す。
ミックス8−2:2μlの緩衝液B、5μlのAh36(0.4ピコモル/ul)、1μlのAh37(2ピコモル/ul)、2μlのH2Oを混合する。80℃に加熱することによりアニールし、次いで44℃に冷却する(−2℃/30秒)。1μlの100mM NHSおよび1μlの1M EDCを添加する。表示された温度(下記参照)で45分間インキュベートし、次いで2μlの緩衝液Dを添加する。約2時間インキュベートし、次いで10%尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度:
45℃、48.2℃、53.0℃、58.5℃、63.1℃、65.6℃
結果を図8に示す。
ミックス9−2:2μlの緩衝液B、1μlのAh36(2ピコモル/ul)、1μlのAh51(2ピコモル/ul)、6μlのH2Oを混合する。80℃に加熱することによりアニールし、次いで35℃に冷却するか(−2℃/30秒)(温度1〜6)、または80℃に加熱し、次いで15℃に冷却する(−2℃/30秒)(温度7〜12)。1μlの100mM NHSおよび1μlの1M EDCを添加する。表示された温度(下記参照)で1時間インキュベートし、次いで2μlの緩衝液Dを添加する。前記のように、1時間インキュベートし、次いで10%尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度:
1)34.9℃、2)36.3℃、3)40.3℃、4)45.7℃、5)51.0℃、6)55.77℃、7)14.9℃、8)17.8℃、9)22.7℃、10)28.3℃、11)31.0℃、12)36℃
ミックス9−3:2μlの緩衝液B、0.5μlのAh36(2ピコモル/ul)、1μlのAh51(2ピコモル/ul)、1μlのAh38(2ピコモル/ul)、5.5
μlのH2Oを混合する。
ミックス9−4:2μlの緩衝液B、0.5μlのAh36(2ピコモル/ul)、1μlのAh51(2ピコモル/ul)、6.5μlのH2Oを混合する。80℃で加熱することによりアニールし、次いで5℃に冷却する(−2℃/30秒)。
1μlの100mM NHSおよび1μlの1M EDCを添加する。異なる温度(下記参照)で1時間インキュベートし、次いで2μlの緩衝液Dを添加する。1時間インキュベートし、次いで10%尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度:
1)5.9℃、2)9.9℃、3)12.6℃、4)18.3℃、5)23.3℃、6)27.9℃、7)35.6℃、8)45.9℃
結果を図9に示す。
架橋効率に対するリンカーの長さおよび反応性基間の間隔の影響
本発明者らはまず、アミンとヌクレオチドを結合させるリンカーの長さを変えることの影響を調べた。オリゴAh3およびAh5は、それぞれ7および11の結合(それぞれアミノ修飾因子C2 dTおよびアミノ修飾因子C6 dTと呼ばれる。前記式参照)によりヌクレオチドの塩基から離れたアミンを含有する。これらのオリゴを、オリゴAh4またはAh6(それぞれアミノ修飾剤C2 dTおよびアミノ修飾因子C6 dTを有する)のすぐ隣に、すなわち、2つのオリゴ間の間隔が0塩基対でアニールした。
図1、レーンAおよびBにおいて見られるように、架橋の効率はどちらのアミノ修飾因子についてもほぼ同じである。
次の実験全てにおいて、オリゴAh5(アミノ酸修飾因子C6 dTを含有)を反応性基アミンとして使用した。
第二に、アミンおよびカルボン酸の架橋を調べた。この実験において、2つの反応性基を架橋するために、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)を添加した。オリゴAh1およびAh6を使用した場合、架橋の効率はここでも0塩基対の間隔で最高であり(図3、パネルM)、1塩基対の間隔で比較的高く(図3、パネルN)、2および30塩基対の間隔でそれぞれ少しおよびわずかであった(図3、パネルOおよびP)。
オリゴAh5およびAH6を使用することによりTSAT濃度の重要性を試験した。1または10mM TSATの濃度により、0.1mMおよび100mM TSAT(図1および2)の両方よりも有効な架橋が得られる。最高のTSAT濃度(100mM)を用いた場合に得られるさらに低い架橋効率は、隣接するアミンのそれぞれと反応する2つのTSAT分子により説明することができる。次に、EDC濃度の重要性を、アミンを有するオリゴ(Ah6)およびカルボン酸を有するオリゴ(Ah1)について調べた。あらかじめ、約10mMのNHS濃度はEDCと共に使用した場合に最高の架橋効率を提供することが判明している。図3に示すように、100mM EDCの結果、0.1mM、1mMおよび10mM EDCと比較した場合に最高の架橋効率が得られる。
次に、本発明者らは、EDC/NHSまたはTSAT試薬のいずれかを使用して架橋効率についての異なるpH特性の影響を試験した。
10のpHで2つのアミンの最も有効なTSAT架橋が得られる(図4、パネルR;図5、パネルS)。オリゴAh5およびAh6をこの研究において使用した。実験6(図6)において、pH10、およびアミンを有するオリゴAh24とAh27の間の0塩基対の間隔を用いて80%の架橋効率が得られる。相補エレメント(テンプレートにアニールするオリゴの領域)と反応性基(アミンまたはカルボン酸)を分離するリンカーがもっと大きい(例えば、図11および12)他の実験において、架橋効率はもっと低い。
本発明者らは次に、反応性基(アミンまたはカルボン酸)を有するオリゴを用いて架橋効率を調査し、ここにおいて、反応性基とアニーリング領域を結合するリンカーはほぼ25ヌクレオチドであった。
第一の実験において、オリゴAh36(カルボン酸を有する)およびAh67(アミンを有する)を使用した。使用したテンプレート(Ah38)はすぐ隣にある、すなわち間隔が0塩基対である2つのオリゴをアニールする。
実験の条件下で、5%未満の架橋効率が、試験した最高の温度でのみ観察される(図10、AおよびB、レーン5)。架橋効率を向上させるために、本発明者らはいわゆるジッパーボックス配列をそれぞれオリゴAh67およびAh36の5’−および3’−末端、(反応性基を有する同じ末端)で導入した。ジッパーボックスは相補配列であり、従って2つのオリゴの反応性基を非常に近接させる。2つの異なる長さのジッパーボックス、すなわち、10’merジッパーボックス(Ah37/Ah66、Ah37は10塩基対のDNA二本鎖を形成する)および5’merジッパーボックス(5塩基対のDNA二本鎖を形成する)を試験した。図12参照。さらに、異なるデザインのジッパーボックス、例えば反応性基がジッパーボックスのすぐ隣に結合しているオリゴ(Ah36、Ah37、Ah51)、またはジッパーボックスから2ヌクレオチド上流にあるオリゴ(Ah65、Ah66)、またはジッパーボックスの中央にあるオリゴ(Ah67)を試験した。
本発明者らは次に、10’merジッパーボックス様式における架橋効率を試験した。オリゴAh36およびAh37をテンプレートAh38にアニールし、架橋効率を様々な温度で調べた。テンプレートの不在下で、驚くほど高い架橋効率が観察された(図8、45℃および48.2℃)。しかしながら、58.5℃より高い温度では、テンプレートの不在下で架橋は観察されない。
ジッパーボックスに対する反応性基の位置も10’merジッパーボックスに関して試験した。これに関連して、両反応性基がジッパーボックスから2ヌクレオチド離れている場合(Ah65、Ah66)、架橋効率は若干減少する(図11、レーン1と3を比較)。Ah65、Ah66、Ah36およびAh37の異なる組み合わせを試験する場合(すなわち、反応性基がジッパーボックスのすぐ隣、または2ヌクレオチド上流にある場合)、架橋効率は著しく変化しない。10’merジッパーボックスに関連してあらゆる温度でテンプレートは絶対に必要というわけではないことに注意。このテンプレート非依存性は、低い温度で特に顕著である(例えば、図11、30℃)。
カルボン酸部分を有する修飾された核酸塩基を含有するオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した:
(配列番号)5’−GAC CTG TCG AGC ATC CAG CTT CAT GGG AAT TCC TCG TCC ACA ATG X
商業的に入手可能なカルボキシ−dTホスホルアミダイト(Glen researchから得られる10−1035−90)を用いてXを組み入れた。下線を施した核酸塩基は、ジッパー領域を表す。
S−トリフェニルメチル保護チオ部分を有する修飾された核酸塩基を含有する次のオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した:
(配列番号):5’−WCA TTG ACC TGT CTG CCB TGT CAG TCG GTA CTG TGG TAA CGC GGA TCG ACC T
(配列番号):5’−WCA TTG ACC TGT ACC ATG BTA AGC TGC CTG TCA GTC GGT ACT ACG ACT ACG TTC AGG CAA GA
商業的に入手可能なチオ修飾因子ホスホルアミダイト(Glen Researchから得られる10−1926−90)を用いてWを組み入れた。Bは、商業的に入手可能なホスホルアミダイト(Glen Researchから得られる10−1953−95)を用いて組み入れられた内部ビオチンである。下線の核酸塩基は、ジッパー領域を表す。
S−トリフェニルメチル保護チオオリゴ(10ナノモル)を真空中で蒸発させて、TEAA緩衝液(0.1M溶液を200uL、pH=6.4)中に再懸濁させた。AgNO3(1M溶液を30uL)を添加し、混合物を室温で1〜2時間放置した。DTT(1M溶液を46uL)を添加し、5〜10分間放置した。反応混合物をスピンダウンし(20.000Gで20分間)、上清を集めた。固体を追加のTEAA緩衝液(0.1M溶液を100ul、pH=6.4)で抽出した。慣例のEtOH沈殿により純粋なチオオリゴを得た。
機能的エンティティーの親油性により、HPLCクロマトグラムにおいて、1つの機能的エンティティーと比較して2つの機能的エンティティーを有するスカフォード分子のより長い保持時間が観察された。2つの同一の機能的エンティティーを有するスカフォード分子のテンプレート合成の効率は、約25%であった(図15において10.76分でのピーク)。
それぞれがオリゴヌクレオチドとカップリングした2つの反応性基間の反応効率を調べるために、2つのオリゴが同じテンプレートにアニールされている場合、図16に示す2のセットアップを使用した(セットアップAおよびセットアップB)。2つのオリゴはカルボン酸またはアミンで誘導化される末端ヌクレオチドを含有する。2つのオリゴの末端上の反応性基の反応(架橋)後、2つのオリゴがこの架橋の結果カップリングするようになり、従ってカラムを通ってよりゆっくりと移動するので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により架橋効率を分析することができる。
X=カルボキシ−dT
Z=アミノ修飾因子C6
6=アミノ−修飾因子5 カタログ番号10−1905
ジッパーボックス配列に下線を引いた。ビルディングブロックジッパーボックスがテンプレートにおいてジッパーボックスと相互作用する場合、ジッパーボックス二本鎖の長さは下線を引いたものより1ヌクレオチド長い。
AH36:5’−
CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAATGTGTCCAGTTACX
AH51:5’−
ZGTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH82:5’−ZGTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH201:5’−TCTGGATTGCATCGGGAGTTACX
AH133:5’−ZGTAACTCCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH134:5’−ZGTAACTGCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH135:5’−ZGTAACTGGTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH142:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGACTGTCCGTCGAATGTGTCCAGTTACX
AH156:5’−ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH202:5’−TCTGGATTGCATCGGGTTACX
AH203:5’−TCTGGATTGCATCGGTTTTTX
AH236:5’−6GTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH240:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGGCACGGTTACX
AH249:5’−ZCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT
AH251:5’−ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH252:5’−XGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH255:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGTGTTACZ
AH258:5’−ACGACTACGTTCAGGCAAGAGTTACZ
AH260:5’−XCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT
AH261:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGZ
AH262:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGTTACZ
AH270:5’−6GTAACGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH271:5’−6GTAACTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
AH272:5’−ACGACTACGTTCAGGCAAGAGTTACX
AH273:5’−ACGACTACGTTCAGGCAAGAGCGTTACX
AH274:5’−ACGACTACGTTCAGGCAAGAGCACGGTTACX
AH275:5’−CGACCTCTGGATTGCATCGGGCGTTACX
AH276:5’−CTGGTAACGCGGATCGACCTGCACGGTTACX
AH277:5’−CTGGTAACGCGGATCGACCTGCGTTACX
慣例のホスホルアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチドを調製した。Xは商業的に入手可能なカルボキシ−dTホスホルアミダイト(Glen researchから得られる10−1035−90)を表す。Zはアミノ修飾因子C6 dT(Glen researchから得られる10−1039)を表す。6はアミノ修飾因子5(Glen researchから得られる10−1905)を表す。
ジッパーボックス配列に下線を引く。
AH38:5’−AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG
AH140:5’−
AGCTGGATGCTCGACAGGTCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
AH154:5’−
AGCTGGATGCTCGACAGGTCAAGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
AH250:5’−
CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACAGGTCGATCC
AH256:5’−
AGCTGGATGCTCGACAGGTCAAGTAACACCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
AH263:5’−
CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCTGGTCACGTGGATCCTTGA
AH278:5’−
AGCTGGATGCTCGACAGGTCGAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTATCGTCCGATGAATCCAGAGGTCG
AH279:5’−
CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGTCACGTGGATCCTTGA
慣例のホスホルアミダイト合成法によりテンプレートを調製した。
緩衝液A(100mM Hepes pH=7.5;1M NaCl)
緩衝液B(20mM Hepes pH=7.5;200M NaCl)
32Pでの5’−標識
5ピコモルのオリゴヌクレオチド、2μlの10×ホスホリル化緩衝液(Promegaカタログ番号4103)、1μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promegaカタログ番号4103)、1μl γ−32P ATPを混合し、H2Oを20μlになるように添加する。37℃で10〜30分間インキュベートする。
PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)
サンプルをホルムアミド色素1:1(98%ホルムアミド、10mM EDTA、pH8、0.025%キシレンシシアノール、0.025%ブロモフェノールブルー)と混合し、80℃で2分間インキュベートし、変性10%ポリアクリルアミドゲル上にかける。オートラジオグラフィー(Kodak,BioMax film)を用いてゲルを展開する。
実験
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表X参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図17(実験AおよびB)および図18(実験C、D、EおよびF)に示す。
結論:
テンプレート非依存性反応が20℃でしばしば観察される。この生成物は、競争テンプレート(ジッパーボックスを有する)がインキュベーション混合物中に含まれない場合でも観察されるので(例えば、図17、実験B、レーン1参照)、おそらくはテンプレート中のジッパーボックスにより支配されない。高濃度でアニーリングし、続いて希釈し、結果として得られる低濃度で反応させることにより、テンプレート非依存性反応が排除されるが、反応工程前のテンプレートでビルディングブロックオリゴの有効なアニーリングは保持される(実験EおよびFの有効な架橋およびテンプレート非依存性反応の不在をあまり興味深くない実験A、B、CおよびDと比較)。
実験
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XI参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図19に示す。
結論:
実験Aは6merジッパーボックスを有するビルディングブロックを用い、約30%の架橋効率が観察される(実験A、レーン2〜4)。ジッパーボックスを有さないビルディングブロックを用いる場合(実験B)、架橋は観察されない(レーン3〜4におけるスポットがフィルム上の生成物であり、架橋を示さない)、架橋は観察されず、20℃でも反応は観察されない(おそらくは、ビルディングブロックがジッパーボックスを有さないため)。
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XII参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図20に示す。
結論:
5、6または7ヌクレオチドの長さのジッパーボックスは24〜28℃の範囲の温度における有効な架橋を支配する(図20、パネルA、C、E)。これらの条件下で(アニーリングが高濃度で、架橋が低濃度である場合)、競争複合体に対する架橋は観察されない(図20、パネルB、DおよびF)。
実験
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XIII参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図21に示す。
結論:
2つの点を調べる:i)リンカーの長さの架橋効率に対する影響(0、2、および5ヌクレオチドのリンカー長さを調べる)、ii)2つの反応するビルディングブロック間の間隔の重要性。図21、レーン1〜6は、3位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み:レーン7は同じビルディングブロックを含むが、レーン7にはテンプレートは存在しない。レーン8〜13は2位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み:レーン14は同じビルディングブロックを含むが、レーン7にはテンプレートは存在しない。レーン15〜20は1位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み:レーン21は同じオリゴを含み、テンプレートが存在しない。レーン1、3、5、8、10、12、15、17、19は、ビルディングブロックオリゴ間の間隔が、レーン2、4、6、9、11、13、16、18、および20の実験において使用したテンプレートよりも1ヌクレオチド大きいテンプレートを使用する。
架橋効率に関して言えば、最適のリンカー長さはあらゆる位置において0ヌクレオチドである(図21、3位についてはレーン1、2;2位についてはレーン8、9;1位についてはレーン15、16)。1位および0位に結合したビルディングブロック間の0または1ヌクレオチドの間隔は、2つのビルディングブロック間の架橋の効率に影響を及ぼさない(図21、例えばレーン1と2を比較)。非常に高い架橋効率が全ての3つの位置から観察される。5ヌクレオチドのジッパーボックスを用いると、ビルディングブロックオリゴがそれぞれ位置3、2および1にアニールされ、リンカー長さが0ヌクレオチドである場合に、反応効率は約50%、95%および95%およびである(図21、レーン1、2、および8、9および15、16)。
実験
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XIV参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図22に示す。
結論:
この実験は、オリゴセットアップBにおいて3位で結合したビルディングブロックオリゴ間の反応効率を測定する。0、5、30および50ヌクレオチドのリンカー長さは、それぞれ約90%(レーン8)、50%(レーン5)、20〜40%(レーン14)および20〜40%(レーン17)の反応効率を仲介する。言い換えれば、セットアップAについても観察されたように、0ヌクレオチドのリンカー長さがセットアップBについて最適である。セットアップBにおいて、約75%および90%の2位および1位からの反応効率が達成された(データは省略)。
実験
2μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XV参照)を混合し、H2Oを10μlになるように添加する。
結果を図23および24に示す。
結論:
5−merジッパーボックス(実験AおよびB)を用いて、テンプレート非依存性反応は9.9℃から50.8℃の間の温度で観察されない(図23、レーン1〜12)。6、7、または8ヌクレオチドの長さのジッパーボックスを用いて、テンプレート非依存性反応がそれぞれ5〜28℃、5〜32℃、および5〜35℃の温度範囲において観察される。実験者により(例えば、試薬の添加により)開始できないテンプレートされた反応を行う場合、テンプレート非依存性反応に至らない温度(例えば、5−、6−、7−、および8−ヌクレオチドのジッパーボックス長さについて、それぞれ25℃、30℃、34℃、および37℃)でアニーリングおよび反応を行うことが推奨される。
実験者により(例えば、試薬の添加またはUV−暴露による)開始できない反応を行う場合、高度のジッパーボックス−ジッパーボックス複合体形成を確実にするために、さらに低い温度で複合体を形成することができ、ここにおいて、過剰のビルディングブロック−オリゴを洗浄により除去した後、反応を開始することができる。洗浄後の低濃度のビルディングブロックのために、テンプレート非依存性反応はずっと顕著ではない。
ここでは、本発明者らは、セットアップAおよびBの両方において、2位と0位で結合したビルディングブロックオリゴ間の架橋の効率が、3位で結合したビルディングブロックオリゴにより影響を受けるかどうかを調べる。
実験
10μl緩衝液A、様々な濃度の関連するオリゴ(下記表XVI参照)を混合し、H2Oを50μlになるように添加する。
結果を図25に示す。
結論:
占有された3位は、2位および0位で結合したビルディングブロックの架橋を妨害しない(図25、レーンAとレーンB、レーンCとレーンD、レーンEとレーンFを比較)。
Claims (49)
- a)1以上のコドンを含む少なくとも一つのテンプレートを提供する工程、
b)第二のジッピングオリゴヌクレオチドと可逆的に相互作用できる第一のジッピングオリゴヌクレオチドに結合した第一の機能的エンティティーを提供する工程、
c)それぞれ、リンカーによりアンチコドンに結合したさらなる機能的エンティティーを含む1以上のビルディングブロックを提供する工程(ここにおいて、該アンチコドンは該テンプレートのコドンを補足し、該さらなる機能的エンティティーは工程bにて提供された第一の機能的エンティティーに結合した第一のジッピングオリゴヌクレオチドと可逆的に相互作用しうる第二のジッピングオリゴヌクレオチドと結合し、該さらなる機能的エンティティーは工程bにて提供された第一の機能的エンティティーと化学的に結合できる)、
d)工程a)、b)、およびc)にて提供された成分を、i)ビルディングブロックのアンチコドンの該テンプレートのコドンとの特異的ハイブリダイゼーションと、ii)異なる機能的エンティティーに結合した2つのジッピングオリゴヌクレオチドの二量化とを許容する条件下で互いに接触させる工程、
e)工程c)にて提供された1以上のビルディングブロックのさらなる機能的エンティティーに工程b)にて提供された第一の機能的エンティティーとの化学結合を形成させる工程、および
f)その合成を行ったテンプレートに結合したテンプレートされた分子を得る工程
を含む、テンプレートされた分子を合成する方法。 - 工程f)にてその合成を行った前記テンプレートに結合した前記テンプレートされた分子を得る前に、工程d)およびe)が1回以上繰り返される請求項1記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが前記テンプレートに共有結合している請求項1および2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが前記テンプレートにハイブリダイズしている請求項1ないし2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが、テンプレートコドンを補足するアンチコドンと、該アンチコドンおよび該第一の機能的エンティティーを結合するリンカーと、該第一の機能的エンティティーに結合した第一のジッピングオリゴヌクレオチドとをさらに含む、ビルディングブロックの一部を形成する請求項1ないし4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一のジッピングオリゴヌクレオチドが前記テンプレート中に存在する請求項1、2、3および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジッピングオリゴヌクレオチドが核酸または核酸類似体の相補配列を含む請求項1ないし6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが、前記テンプレートにより保有される核酸の配列を補足する核酸の配列にさらに結合している請求項1ないし7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジッピングオリゴヌクレオチドが前記ビルディングブロックのリンカーの一部を形成する請求項1ないし8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジッピングオリゴヌクレオチドが3ないし20のヌクレオチドを含む請求項1ないし9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記テンプレートコドンが3ないし30のヌクレオチドを有する請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートの少なくとも2つのコドンが、互いに隣り合って一列に配列され、スペーサー基で隔てられており、該テンプレートがさらにコドンを含む、請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートのコドンの数が2ないし100である、請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートのコドンの数が3ないし15である、請求項12記載の方法。
- 前記1以上のビルディングブロックの機能的エンティティーが1ないし10の反応性基を有する、請求項1記載の方法。
- 2つの反応性基を有するビルディングブロックが、さらなる機能的エンティティーと反応しうるスカフォールドを形成するのに使用される、請求項15記載の方法。
- 2以上の反応性基を有する機能的エンティティーが、コア構造の形態の、数個の反応性基を含むスカフォールドとの反応に使用され、ここで該反応が異なるテンプレートされた分子の形成をもたらすところの、請求項15記載の方法。
- 前記アンチコドン、前記リンカーおよび前記1以上のビルディングブロックの第二のジッピングオリゴヌクレオチドが連続した直線状オリゴヌクレオチドを形成する、請求項1記載の方法。
- ビルディングブロックのアンチコドンが、前記機能的エンティティーが化学反応により互いに結合する前に、前記テンプレートにアニールされている、請求項1記載の方法。
- 個々のビルディングブロックを別々に付加し、前記テンプレートと接触させる、請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートされた分子を前記テンプレート上の固定点に、または該テンプレートを補足するヌクレオチド配列に移し、該テンプレートと該テンプレートされた分子の間に化学結合を確立する工程を含み、該テンプレートされた分子の濃縮の変性またはテンプレート後修飾の変性を実施することを可能とするさらなる工程さえ含む、請求項1記載の方法。
- 前記化学結合が共有化学結合である、請求項21記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが2以上の機能的エンティティーと反応するスカフォールドである、請求項1記載の方法。
- 前記スカフォールドが2以上の反応性基を含む、請求項23記載の方法。
- 前記スカフォールドが前記テンプレートされた分子の合成中ずっと前記テンプレートに結合したままである、請求項23記載の方法。
- 前記スカフォールドがビルディングブロックの一部を形成し、そのアンチコドンが前記テンプレートのフランキング位置にアニールされており、そのフランキング位置が該テンプレートのコドンの間に位置しない、請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートが2以上のコドンを含み、そのアンチコドンを介して該2以上のコドンに結合した前記ビルディングブロックが、指令される方法にて二量化される能力を有する、同一または相補的なジッピングオリゴヌクレオチドを有する、請求項1記載の方法。
- 前記テンプレートが固体担体上に固定されている、請求項1記載の方法。
- ビオチン基が前記テンプレートに組み込まれており、前記固体担体がストレプトアビジンでコーティングされているマトリックス材料である、請求項28記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーが選択的に開裂可能なリンカーを介して前記テンプレートと結合しており、これにより、所定の時間で該テンプレートから合成されたテンプレート指向性分子を分離することが可能になる、請求項1記載の方法。
- 前記第一の機能的エンティティーがスカフォールドである、請求項30記載の方法。
- 異なる二機能性複合体のライブラリーを生成する方法であって、複数のテンプレートを請求項1ないし31のいずれかに記載の方法に供し、それにより各々がテンプレートされた分子の合成を行ったテンプレートまたは相補テンプレートに結合したテンプレートされた分子を含む、異なる二機能性複合体のライブラリーを生成する方法。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも103である、請求項32記載の方法。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも106である、請求項32記載の方法。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも109である、請求項32記載の方法。
- 複数の異なるテンプレートが請求項1の工程a)にて提供され、複数の異なるビルディングブロックが請求項1の工程c)にて提供される、請求項32ないし35のいずれか一項記載の方法。
- 二機能性複合体のライブラリーを、
i)該ライブラリーを所定の活性を有する複合体に関して濃縮する条件に該ライブラリーを曝露し、
ii)該濃縮されたライブラリーの複合体を増幅し、
iii)該所定の活性を有するテンプレートされた分子を含む複合体をさらに高い割合で有する濃縮されたライブラリーを得る
工程を含む、濃縮に供するさらなる工程を含む、請求項32記載の方法。 - 前記濃縮されたライブラリーの複合体の増幅が、該複合体のライブラリーを増幅手段と接触させる工程、テンプレートまたは相補テンプレートを増幅する工程、およびテンプレートとして増幅産物を用いて請求項1ないし31のいずれか一項に記載の方法を行う工程を含む、請求項37記載の方法。
- 工程i)およびii)を2ないし5回繰り返し、各サイクルの反復が完了した後に、得られた複合体を同定する、請求項37および38のいずれか一項に記載の方法。
- 工程i)およびii)を2ないし5回繰り返し、最後の反復サイクルの後に、複合体を同定する、請求項37および38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮後の同定が、前記テンプレートの配列の決定および/または前記テンプレートされた分子および/または前記所定の活性を有する全複合体の構造決定を含む、請求項39および40のいずれか一項に記載の方法。
- ライブラリーの複合体の濃縮が、標的分子に対して親和性を有するか、または該分子に対して影響を及ぼす複合体についてスクリーニングすることにより行われる、請求項37ないし41のいずれか一項に記載の方法。
- その合成を行ったテンプレートに結合したテンプレートされた分子を含む二機能性複合体であって、該テンプレートが指令される方法にて可逆的に二量化される能力を有する少なくとも2個のジッピングオリゴヌクレオチドにさらに結合し、該二機能性複合体が請求項1ないし31のいずれか一項に記載の方法により得られ、ここで該テンプレートされた分子がポリヌクレオチドではないところの、二機能性複合体。
- その合成を行ったテンプレートに結合したテンプレートされた分子を含む二機能性複合体であって、該テンプレートが指令される方法にて可逆的に二量化される能力を有する少なくとも2個のジッピングオリゴヌクレオチドにさらに結合し、該二機能性複合体が請求項1ないし31のいずれか一項に記載の方法により得られ、ここで該テンプレートされた分子が
アルファーペプチド、ベータペプチド、ガンマペプチド、オメガペプチド;モノ置換ペプチド、ジ置換ペプチド、トリ置換ペプチド;L−形ペプチド、D−形ペプチド;シクロヘキサンバックボーン修飾ベータペプチド、シクロペンタンバックボーン修飾ベータペプチド;ビニル性ポリペプチド;グリコポリペプチド;ポリアミド;ビニル性スルホンアミドペプチド;ポリスルホンアミド;補欠分子族を有するコンジュゲートペプチド;ポリエステル;多糖類;ポリカルバメート;ポリカルボネート;ポリウレア;ポリペプチジルホスホネート;アザチド;オリゴN−置換グリシンの形態のペプチド;ポリエーテル;エトキシホルムアセタールオリゴマー;ポリチオエーテル;ポリエチレングリコール(PEG);ポリエチレン;ポリジスルフィド;ポリアリーレンスルフィド;PNA;LNA;モルホリノ;オリゴピロリノン;ポリオキシム;ポリイミン;ポリエチレンイミン;ポリアセテート;ポリスチレン;ポリアセチレン;ポリビニル;脂質;リン脂質;糖脂質;脂肪族ポリサイクル;芳香族ポリサイクル;ポリヘテロサイクル;プロテオグリカン;ポリシロキサン;ポリイソシアニド;ポリイソシアネート;ポリメタクリレート;一機能性開鎖炭化水素、二機能性開鎖炭化水素、三機能性開鎖炭化水素、オリゴ機能性開鎖炭化水素;一機能性非芳香族炭素環、二機能性非芳香族炭素環、三機能性非芳香族炭素環、オリゴ機能性非芳香族炭素環;単環式炭化水素、二環式炭化水素、三環式炭化水素、多環式炭化水素;架橋多環式炭化水素;一機能性非芳香族複素環、二機能性非芳香族複素環、三機能性非芳香族複素環、オリゴ機能性非芳香族複素環;単環式複素環、二環式複素環、三環式複素環、多環式複素環;架橋多環式複素環;一機能性芳香族炭素環、二機能性芳香族炭素環、三機能性芳香族炭素環、オリゴ機能性芳香族炭素環;単環式芳香族炭素環、二環式芳香族炭素環、三環式芳香族炭素環、多環式芳香族炭素環;一機能性芳香族複素環、二機能性芳香族複素環、三機能性芳香族複素環、オリゴ機能性芳香族複素環;単環式複素環、二環式複素環、三環式複素環、多環式複素環;キレート;フラーレン;ステロイドおよびシクロスポリンアナログからなる群より選択されるところの、二機能性複合体。 - 請求項43または44のいずれか一項に記載の異なる二機能性複合体のライブラリー。
- 二機能性複合体の各々が異なるテンプレートされた分子を含む、請求項45記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも103である、請求項45記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも106である、請求項45記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中の異なる二機能性複合体の数が少なくとも109である、請求項45記載のライブラリー。
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