JP2002526511A - 平行セレックス - Google Patents

平行セレックス

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JP2002526511A
JP2002526511A JP2000574297A JP2000574297A JP2002526511A JP 2002526511 A JP2002526511 A JP 2002526511A JP 2000574297 A JP2000574297 A JP 2000574297A JP 2000574297 A JP2000574297 A JP 2000574297A JP 2002526511 A JP2002526511 A JP 2002526511A
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イートン、ブルース
タラソウ、セオドア、エム
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インベナックス、インコーポレイテッド
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

(57)【要約】 本発明は生成物を作るための反応を促進することができる核酸とともに二つ以上の反応物から生成物を共進化させるための方法を開示する。本発明は更に該方法により製造された生成物と促進性核酸を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） この発明は、反応体間の反応、好ましくは結合形成が促進性質を有する核酸に
より媒介される２種またはそれ以上の反応体から生成物を、製造するための方法
に関する。また、本発明において該方法により造られた生成物が包含される。さ
らに特定的には、本発明は、促進性核酸そして該促進性核酸の媒介により構築さ
れる生成物を共同発生（coevolving）ための方法に関する。本発明はさらに、促
進性質を有する核酸を確認（同定）するための方法および前記核酸に関する。
【０００２】 （背景技術） ターゲット分子への高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ発生の
ための方法が開発されて来た。ＳＥＬＥＸと呼ばれるこの方法、指数富化による
配位子の系統的発生（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enric
hment）は、“指数富化による配位子の系統的発生”と題する米国特許出願シリ
アル第０７／５３６，４２８号（現在、放棄）、“核酸配位子”と題する１９９
１年６月１０日に出願された米国特許出願シリアル第０７／７１４，１３１号（
現在、米国特許第５，４７５，０９６号）、および“核酸配位子を確認（同定）
する方法”と題する１９９２年８月１７日に出願された米国特許出願シリアル第
０７／９３１，４７３号（現在、米国特許第５，２７０，１６３号、またＷＯ９
５／１９８１３参照）において記載されている（これらの特許出願の各々を参照
することにより特に本明細書に組み入れる）。集約的にＳＥＬＥＸ特許出願とし
て本明細書において称される、これらの出願の各々は、任意の所望のターゲット
分子に核酸配位子を造るための基本的な新規の方法を記載している。
【０００３】 結合親和性および選択性の実質的に任意の所望の規準を達成させるために、同
じ一般的選択計画を用いて、ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物
からの選択、そして結合、分配および増幅の段階的反復を包含する。好ましくは
ランダム化配列のセグメントを含む、核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法
は、結合のために好ましい条件下に該混合物をターゲットと接触させ、ターゲッ
ト分子に特異的に結合された核酸から結合されていない核酸を分割し、核酸−標
的複合体を解離し、核酸−ターゲット複合体から解離された核酸を増幅して核酸
の配位子富化混合物を生成し、次にターゲット分子への高度に特異性の高い親和
性の核酸配位子を生ずることの所望に応じて、多くのサイクルを通じて結合、分
割、解離および増幅の工程を反復する、工程を包含する。
【０００４】 ＳＥＬＥＸ法は、化学化合物としての核酸が、形、大きさおよび形態の広い配
置を形成することが出来そして結合のはるかに広い種類が可能でありそして生物
系において示される機能以外の機能が可能であることを示すことを本発明者によ
り認識された。
【０００５】 多年にわたっての教理は、核酸が情報的役割を主として有したことであった。
ＳＥＬＥＸの適用により、核酸が、たんぱく質と異なって、３つの三次元的構造
相違点を有することが本発明者に明らかになった。それとして、ＳＥＬＥＸまた
はＳＥＬＥＸ様方法は、核酸配位子が任意の一定のターゲットについて確認（同
定）されることが出来る任意の選ばれた反応を促進することが出来る核酸を確認
（同定）するために使用されることが出来ることを本発明者は認識した。理論に
おいて、本発明者は、約１０13〜１０18の核酸の候補混合物内において、広い種
々の物理的且つ化学的相互作用を促進させるために適当な形を有する少なくとも
１種の核酸が存在すると仮定する。
【０００６】 今日までの研究は、ほんの狭い下位のセットの促進能力を有するほんの２、３
の核酸が確認されただけだった。２、３のＲＮＡ触媒が知られている（Cechによ
るScience 236:第1532頁〜第1539頁（1987）およびMcCorkleおよびAltmanによる
J. Chem. Education 64:第221頁〜第226頁（1987））。これらの天然に存在する
ＲＮＡ酵素（リボザイム類）だけが今日までオリゴヌクチオチド基質上に働らく
ことが知られていた。さらに、これらの分子は狭い範囲の化学的実現性にわたっ
て性能を果し、それはかくして、たんぱく質生合成におけるＲＮＡの可能な影響
以外は、りん酸ジエステル結合縮合／加水分解に非常に大きく関連する。ＲＮＡ
またはＤＮＡ触媒を確認するための熱心な最近の研究にもかかわらず、ほとんど
首尾よく確認されなかった。りん酸ジエスラル開裂、アミノアシルエステル類の
加水分解（Piccirilli等によるScience 256:第1420頁〜第1424頁（1992））、３
′ＯＨを用いての触媒５′トリホエフェート端へのオリゴヌクレオチドの結さく
（BartelおよびSzostakによるScience 261:第1411頁〜第1418頁（1993））、ア
ミド結合開裂（Dai等によるScience 267:第237頁〜第240頁（1995））、ビフェ
ニルイソメラーゼ活性（Prudent等によるScience 264:第1924頁〜第1927頁（199
4））およびポリヌクレオチドキナージ活性（LorschおよびSzostakによるNature
371:第31頁〜第36頁（1994））が観察された。Illangasekare等（Science 267:
第643頁〜第647頁（1995））は炭素−酸素結合形成を触媒作用する第１ＲＮＡ分
子を記載している。今日まで知られている核酸触媒は結合形成／分解反応におけ
るそれらの有効性に伴なっての、或る種の欠点を有している。それらの欠点の中
には、それらがたんぱく質酵素に比較的にゆっくりと働らくことそして上記した
とおりにそれらがやや狭い範囲の化学的実現性にわたって機能を果すことの欠点
がある。
【０００７】 基本的なＳＥＬＥＸ法は多くの特定の目的を達成させるために修正された。例
えば、“構造のベースについての核酸を選択する方法”と題する１９９２年１０
月１４日に出願された米国特許出願シリアル第０７／９６０，０９３号（現在、
放棄；または米国特許第５，７０７，７９６号参照）は、ベントＤＮＡのような
、特異的構造特性を有する核酸分子を選ぶためにゲル電気泳動と組み合わせて、
ＳＥＬＥＸの使用を記載している。“核酸配位子の光選択”と題する１９９３年
９月１７日に出願された米国特許出願シリアル第０８／１２３，９３５号（現在
、放棄；また米国特許第５，７６５，１７７号参照）は、ターゲット分子に結合
しそして（または）それに光架橋しそして（または）ターゲット分子を光不活性
化することが出来る光反応性基を含有する核酸配位子を選択するためのＳＥＬＥ
Ｘをベースとする方法を記載している。米国特許出願シリアル第０８／１２３，
９３５号（特に参照することにより本明細書に組み入れる）のＣＩＰである、１
９９４年９月１９日に出願された共係続中のＰＣＴ出願公開第ＷＯ９５／０８０
０３号はＨＩＶ−１ Ｒｅｖたんぱく質に共有的に結合している５−ヨードウラ
シル残基を含有している或る種の核酸配列が確認されたことを開示している。“
テオフィリンとカフェインとの間を弁別する高い親和性の核酸配位子”と題する
、１９９３年１０月７日に出願された米国特許出願シリアル第０８／１３４，０
２８号（現在放棄：また米国特許第５，５８０，７３７号参照）は、カウンター
−ＳＥＬＥＸと称される、近接的に関連した分子間を弁別することが出来る高度
に特異な核酸配位子を確認するための方法を記載している。“指数富化による配
位子の系統的発生：ソルーションＳＥＬＥＸ”と題する１９９３年１０月２５日
に出願された米国特許出願シリアル第０８／１４３，５６４号（現在放棄：また
米国特許第５，５６７，５８８号参照）は、ターゲット分子について高いそして
低い親和性を有するオリゴヌクレオチド間を高度に有効に分割させることを達成
するＳＥＬＥＸをベースとする方法を記載している。“指数富化による配位子の
系統的発生：ケミ−ＳＥＬＥＸ”と題する１９９５年３月８日に出願された米国
特許出願シリアル第０８／４００，４４０号（現在米国特許第５，７０５，３３
７号はそのターゲットに核酸配位子を共有的に結合するための方法を記載してい
る。
【０００８】 ＳＥＬＥＸ法は、改良されたインビボ安定性または改良された送り出し特性の
ような改良された特性を配位子に与える修飾されたヌクレオチドを含有する高度
に親和性の核酸配位子の確認を包含する。そのような修飾の例は、リボースおよ
び（または）ホスフェートおよび（または）塩基位置での化学的置換を包含する
。修飾されたヌクレオチド類を含有するＳＥＬＥＸ確認核酸配位子は、ピリミジ
ン類の５−および２′−位置で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有す
るオリゴヌクレオチド類を記載している、“修飾されたヌクレオチド類を含有す
る高親和性核酸配位子”と題する１９９３年９月８日に出願された米国特許出願
シリアル第０８／１１７，９９１号（現在放棄：また米国特許第５，６６０，９
８５号参照）において記載されている。上記米国特許出願シリアル第０８／１３
４，０２８号は２′−アミノ（２′−ＮＨｚ）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）お
よび（または）２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）で修飾された１種またはそれ
以上のヌクレオチドを含有する高度に特異性の核酸配位子を記載している。“分
子間親核性置き換えにより既知のおよび新規の２′修飾されたヌクレオチド類の
新規な製造方法”と題する１９９４年６月２２日に出願された米国特許出願シリ
アル第０８／２６４，０２９号（現在米国特許第５，７５６，７０３号）は、種
々の２′−修飾ピリミジン類を含有するオリゴヌクレオチド類を記載している。
【０００９】 ＳＥＬＥＸ法は、“指数富化による配位子の系統的発生：キメラ性ＳＥＬＥＸ
”と題する１９９４年８月２日に出願された米国特許出願シリアル第０８／２８
４，０６３号（現在、米国特許第５，６３７，４５９号）および“指数富化によ
る配位子の系統的発生：ブレンド化ＳＥＬＥＸ”と題する１９９４年４月２８日
に出願された米国特許出願シリアル第０８／２３４，９９７号（現在、米国特許
第５，６８３，８６７号）のそれぞれに記載されているような、選択されたオリ
ゴヌクレオチド類を、他の選ばれたオリゴヌクレオチド類および非オリゴヌクレ
オチド官能単位と組み合わせることを包含する。これらの適用は、オリゴヌクレ
オチド類の、形の広い配置および他の性質そして有効な増幅および複製性質を、
他の分子の所望の性質と組み合わせることを可能にする。基本的なＳＥＬＥＸ法
の修飾を記載する上記特許出願の各々は特にそれらの全体において参照すること
により本発明に組み入れられる。
【００１０】 新しい医薬を発見するための方法として組み合わせ化学を使用するために最近
幾つかの試みが行なわれた。異なる構造の配置を有する組み合わせのライブラリ
を造るために２、３の念の入った計画が考案された。既知の組み合わせのライブ
ラリと一緒にされた構造は、ＳＥＬＥＸ法のために前記されたような核酸類、ペ
プチド類（Brenner等によるPNAS 89:第5381頁〜第5383頁（1992）; Needels等に
よるPNAS 90第10700頁〜第10704頁（1993）: AlperによるScience 264第1399頁
〜第1401頁（1994）; LongmanによるIn Vivo第23頁〜第31頁（1994）; Fodor等
によるScience 251第767頁〜第773頁（1991）;および小さい有機分子に向けられ
たずっと小さい数（Ohlmeyer等によるPNAS 90第10922頁〜第10926頁（1993）を
包含する。既知の組み合わせのライブラリー方法の各々に伴なう或る欠点がある
。
【００１１】 第１に、ペプチドまたは小さい分子組み合わせのライブラリーを造るために用
いられる計画の或るものは、配置／マトリックスにおける任意の点で生じた化学
の軌道を保つために厳格な記録保持システムを必要とする。さらに、ペプチド類
および小さい有機分子は増幅可能性がなくそしてそれ故に、それぞれ各々の生成
物の比較的に大きな量は、所望の生成物の試験および確認を可能にするためにラ
イブラリ中に存在しなければならない。特定の生成物の大きな十分な量を得るた
めに、配置を造り上げる反応は、高度に有効でなければならない。さらに重要な
ことには、これらの方法を実施させるために、配置における同じ部位で生成物と
副生成物との混合物を有することが可能でない。各々が予期出来る結果を有する
単一反応からなる多重工程の異量体（polymeric）組み合わせにより多様性がも
たらされる。しかしながら、異量体組み合わせの範囲は収量および記録保持拘束
により制限される。
【００１２】 小さな分子組み合わせ方法の他の制限は、不斉反応による新しい立体中心を生
ずる結合形成反応を排除することである。不斉反応を排除することにより、これ
らの方法は、単一工程で生成されることが出来る化学的多様性を提供しない。多
くの場合、不斉反応は制御することが異なり、そこでもし新しいキラル中心を形
成する反応が、組み合わせの計画に包含される場合、ラセミ体生成物混合物が生
ずることが恐らくは起るであろう。１つより多くのキラル中心が存在する場合、
ジアステレオ異性体生成物混合物が背景問題を生ずる可能性がある。例えば、そ
れは構築のために理想的な原子および基が導入されることが可能であるがしかし
キラリティが所望の性質のためにきわめて重大でありそして正しい鏡像異性体が
合計の小さなパーセンテージとしてのみしか存在しない可能性がある。この例に
おいて、正しい鏡像異性体が確認されるのに十分な量で造られないことが生ずる
まったくの恐れがある。さらに、大きな配置の反応体が不斉トランスフォーメー
ションにおいて包含される場合、各々それぞれの反応のキラリティを正確に予測
することは不可能である。それ故にラセミ体混合物に伴なう困難性が従来の手段
によって克服されることが出来ることは恐らくは不可能であろう。従来の組み合
わせライブラリー方法において不斉触媒作用を包含させるために必要とする労力
および時間は一般に実用的でない。それ故に、不斉反応は記載の問題を回避する
ために一般に排除される。
【００１３】 それにもかかわらず、非対称性の反応は、全ての結合形成反応タイプのうち最
も強力なものを含む。コンビナトリアルライブラリー（combinatorial library
）アプローチ法における非対称性の反応の欠失は、作製される生産物のタイプ及
びライブラリーの大きさを著しく制限する。後述の例は、非対称性の反応によっ
てもたらされる、限りない多様性を例示するものである。一般的に、反応物の掛
け合わせ（matrix）から生じるであろう生産物の数は、Ｍ＝反応物の数、ｎ＝キ
ラル中心の数として、Ｍ×２nである。１つの非対称性の結合が形成される結合
形成反応の、構成される掛け合わせを考慮されたい。潜在的な生産物の数は、そ
の掛け合わせによる生産物の２倍として増加する。形成される各結合に対して、
２つのキラル中心が発生する可能性があり、よって、単一のトランスフォーメー
ション（transformation）に対して、可能な組合せの数は、４つまり２2である
ことに留意されたい。非対称性の反応の特定の例として、２つの炭素−炭素結合
が形成され、４つのキラル中心が存在する可能性があるDiels-Alder反応を考慮
されたい。 Diels-Alder反応について、ジエン親和性（dienophile）反応物の両端は、関連
の立体化学に従い、ジエン反応物の両端であるように結びつき、可能性としての
数を各ジエン/ジエン親和性物質の対に対して２3に減少させる。これは、10のジ
エンとの組合せでの単一のジエン親和性物質に対して、形成され得る生産物分子
の数が１×10×２3＝80であることを意味する。同レベルの多様性を、単一結合
形成工程のみを用いる従来のコンビナトリアルアプローチ法から獲得するために
は、81の化合物の直接的な合成が必要となる。10×10の反応物の配列（array）
に対して、標準的なコンビナトリアルアプローチ法は、100の化合物を産出する
。10×10の反応物に対する、非対称性Diels-Alder反応の配列は、オリジナルの2
0から800の新化合物を産出する可能性を有する。現在のコンビナトリアル戦略は
、非対称性トランスフォーメーションの全ての可能な生産物を選別する（screen
）ことはできない。なぜなら、所望の生産物を各々得ることは一般的にはできな
いからである。上記したように、非対称性反応の排除は、慣用のコンビナトリア
ルライブラリーアプローチ法の重大な制限となる。
【００１４】 理想的なコンビナトリアルライブラリーアプローチ法は、ＳＥＬＥＸ法を補完
するものであり、収量は重要ではなく、オリゴヌクレオチド生産物を増幅する能
力によって、さらに、一般的に経口投与で活性であり、比較的安価で生産できる
小さい有機分子を産出する。本願発明は、ＳＥＬＥＸの能力と、生産物の広範な
、構造的に多様なライブラリーを生むための新規アプローチ法とを組合せるもの
である。本願発明で採用されるアプローチ法は、他のコンビナトリアルライブラ
リーアプローチ法に関連する多くの不備を克服し、将来の薬物発見において革新
的な概念を表すものである。
【００１５】 発明の簡単な概要 本発明は一以上の化学反応物からのライブラリーの各メンバーを製造するため
に必要な対応する核酸促進剤と同時に進展する生成物ライブラリーを提供する。
より重要なことは、生成物はあらかじめ決定された望ましい特性を持つ生成物ラ
イブラリーから同定することができる。平行セレックス（ＳＥＬＥＸ）（Ｐａｒ
ａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ）と本明細書中で呼ばれるこの方法は、このような生成
物ライブラリーを生じ、次いで望ましい特性を有する生成物を同定するために用
いられるＳＥＬＥＸ様プロセスである。ＳＥＬＥＸプロセスにおけると同様、極
めて大きく多様な核酸試験混合物が提供される。各核酸は化学反応物にカップリ
ングしている。本発明は十分大きな核酸ライブラリーにおいて、核酸に結合した
化学反応物と遊離の化学反応物との間の化学反応を仲介することができる核酸試
験混合物において核酸を同定することができるという仮定を前提としている。さ
らに、化学反応を仲介することができる核酸のサブセットの間で、いくつかはす
べての可能な生成物の各々又は実質的部分を発生させるのに高度に特異的である
。それゆえ、生成物ライブラリーはある一定の反応のすべての可能な生成物のう
ちの少なくともいくつかを含む。核酸は生成物に対する促進性の特異性を発揮し
、その生成物はターゲット上でのあらかじめ決定された望ましい作用に対する特
異性を発揮する。
【００１６】 パラレルセレックス（Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ）法は従来技術の組合せ
ライブラリーアプローチ法の欠点の多くを解消する。その最も基本的な形として
、パラレルセレックス法は、二つ以上の反応体を接触させ、ここで、反応体の一
つは結合形成を仲介しうる核酸に結合し、あらかじめ決めた所望の特性を有する
生成物を選び、反復増幅のためにセレックス法のパワーを用いて生成物を同定す
ることにより生成物ライブラリーを形成することからなる。パラレルセレックス
法の概要図を図１に示す。
【００１７】 本発明は所望の生成物を生成物ライブラリーから同定する方法を提供し、ここ
で、同所望の生成物は、ターゲットにあらかじめ選択した機能を果すその能力に
対して選択され、同方法は、各々がランダマイズド配列の領域を有し、また各々
が最初の反応体と結合する核酸からなる核酸−反応体テスト混合物を調製し；同
核酸−反応体テスト混合物をフリーの反応体と反応させ、同最初の反応対とフリ
ーの反応体との反応により形成される生成物と結合した核酸からなる生成物ライ
ブラリーを形成し；そして前記あらかじめ選択した機能を果すそれらの相対的能
力に基づいて前記生成物ライブラリーの構成員間を仕切ることからなり、よって
前記所望の生成物を同定することができる。
【００１８】 本発明は、少なくとも結合した反応体およびフリーの反応体の間の反応の結果
である生成物の混合物からなる生成物ライブラリーを提供し、ここで、同結合し
た反応体は、前記反応体の反応を促進した核酸に結合している。
【００１９】 パラレルセレックス法は、生成物のマトリックスのトラックとそれらのそれぞ
れの性質を保つ必要もなく、また高度に効率のよい、あるいは迅速な反応も必要
もない。この利点は、生成物形成が特定の核酸によって管理されているというこ
との結果である。この管理されたアプローチは他の組合せライブラリーアプロー
チによって行われるコードされたアプローチと対照をなす。
【００２０】 所望の生成物形成を特異的に促進する核酸は容易に増幅可能で、生成物は続く
生産ラウンドで確かに再生産される。この方法は、最初に起る多くの反応を可能
にし、あらかじめ決めた所望の性質を示す生成物が形成されたことを一度測定し
たら、後でえり分けることができる。この方法により、生成物は詳細な構造情報
がなくても選択されうる。
【００２１】 パラレルセレックス法は、不斉反応を用いる生成物ライブラリーの形成を包含
する。慣用の組合せライブラリーアプローチと違い、たとえ反応開始時に立体化
学的結果を予測することができないとしても、不斉反応は包含されうる。パラレ
ルセレックス法が効果的であるのに特別の性質を追跡する必要はない。唯一の要
件は核酸が可能な反応の総数の少なくとも限りのあるサブセットを仲介するとい
うことである。
【００２２】 もう一つの態様として、促進的な核酸が提供される。促進的な性質を有する核
酸は結合形成もしくは結合解裂のような化学反応を仲介することが可能である。
核酸を種々のやり方で修飾して、追加の電荷、極性、水素結合、静電反応および
化学反応仲介に役立つフラッキシオナリティ（fluxionality）を提供する他の化
学基を含ませることができる。他の化学基としては、とりわけ、アルキル基、ア
ミノ酸側鎖、種々のコフアクターおよびオルガノメタル部分があげられる。本発
明では促進的核酸があらかじめ決めた所望の性質を有する生成物の合成を指示す
るということが必要である。
【００２３】 本発明には本発明の生成物を含有する医薬組成物および同組成物の投与方法が
含まれる。
【００２４】 発明の詳細な記述 パラレルセレックス法は、核酸に結合した第一の化学反応体のプールとフリー
の化学反応体のプールとを合併することにより形成される生成物ライブラリーを
提供する。結合した核酸は生成物ライブラリーに導く化学反応を仲介することが
でき、さらに核酸を増幅させ、あらかじめ決めた所望の性質を有する生成物を豊
富にして、生成物ライブラリーからの同定を可能にする。
【００２５】 その最も一般的な形として、パラレルセレックス法は図１におけるごとく記載
することができる。核酸−反応体テスト混合物は、第１の反応体（Ｒ）を試験混
合物（１０2〜１０18核酸とランダマイズド配列とを含む）中で核酸の各々に結
合することにより形成される。核酸−反応体テスト混合物を、他のフリーの反応
体（三角形、五角形および六角形で示す）で処理する。これは第１の反応体（Ｒ
）と合併し、別の生成物を形成する。核酸テスト混合物（ＮＡ）から、別々の核
酸配列が図１において配列−Ａ、配列−Ｂおよび配列−Ｃで示されるように異る
形の生成物の形成の促進と関連することを注目することは重要である。
【００２６】 生成物は形態、反応性、あるいは形態と反応性の相方で異る。所望の生成物の
形態または反応性の仕切りはターゲットとの結合あるいはターゲットとの反応に
より達成される。蛋白質、小さな分子、脂質、糖類等はすべてターゲット（Ｔ）
の例である。ターゲットに結合または反応後、非反応生成物は、図１に示すよう
に、配列−Ｂおよび配列−Ｃに結合し、配列−Ａから分離され、捨てられる。
【００２７】 次いで、核酸配列−Ａは種々の当業者周知の方法で増幅される。次いで、配列
−Ａは、出発反応体の混合物で処理して選択生成物を形成させるのに特別の反応
を促進させることにより所望の生成物の組立てを促進するのに用いられる。
【００２８】 代表的な反応として、配列−Ａを第１の反応体に再結合させることができるが
、この再結合は必ずしも必要ではない。これは理想的な場合で、多くの場合、核
酸促進物質は出発混合物から１つ以上の生成物を組立てることができるが、選択
された生成物のすべてはターゲットと結合するか、または化学反応する所望の性
質を有する。
【００２９】 Ｉ．定義 本明細書で本発明の記載に使用される一部の用語を以下に定義する。 「核酸」は、一本鎖または二本鎖のDNA、RNAのいずれか、およびそれらの任意
の化学的に修飾された鎖を意味する。修飾にはそれらに限定されるものではない
が、個々の核酸塩基または核酸全体に付加的な電荷、極性、水素結合、静電相互
作用および移動性を導入する他の化学基を提供する修飾が包含される。このよう
な修飾には、それらに限定されるものではないが、2’-位における塩基の修飾、
5-位におけるピリミジン塩基の修飾、8-位におけるプリンの修飾、7-位における
プリンの修飾、シトシンの環外アミンにおける修飾、5-ブロモウラシルの置換；
骨格の修飾、メチル化、異常な塩基ペアの配合たとえばイソシチジンおよびイソ
グアニジンのイソ塩基の配合等が包含される。修飾はまた、核酸の促進性を増強
する修飾も包含される。修飾には、キャッピングのような3’および5’修飾も包
含することができる。増幅の各ラウンド後に起こる修飾も本発明に適合する。増
幅後修飾を増幅の各ラウンド後に可逆性または不可逆的に付加することができる
。本発明では、事実上、核酸の任意の修飾が意図される。核酸のランダム化され
たセクションの長さは一般的に8〜800ヌクレオチド、好ましくは40〜400ヌクレ
オチドである。
【００３０】 「核酸テスト混合物」とは、一部、それらに化学結合の形成および／または切
断を誘発させることができる形状を有する、異なる、ランダム化された配列の核
酸の混合物である。核酸テスト混合物のソースは、天然に存在する核酸もしくは
それらのフラグメント、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸また
は上記技術の組み合わせによって製造された核酸から得られる。好ましい実施態
様においては、それぞれの核酸は増幅過程を促進するランダム化領域を囲む固定
された配列を有する。
【００３１】 「促進性を有する核酸」または「促進核酸」または「促進性核酸」または「核
酸ファシリテーター」とは、化学反応を誘発または促進できる任意の核酸を意味
する。化学反応は結合形成反応でもまた結合切断反応でもよい。本発明の好まし
い実施態様では結合の形成反応が意図される。核酸が促成製を有するためには、
必ずしも触媒的な転換性は必要ではない。生成物の形成の反応速度は核酸の存在
によって増大させることができるが、反応速度増大は促進性に要求されるもので
はない。促進性核酸のフォールディング、たとえばその三次元構造は特定の化学
反応を促進する。核酸は、単独で、その核酸に直接カップリングする他の触媒性
残基との組み合わせで、または溶液中に存在する他の触媒性残基との組み合わせ
で化学反応を誘発することができる。他の触媒性残基には、有機金属残基、金属
イオン等が包含される。核酸は異なる立体異性体の形成を引き起こすことができ
る。核酸は、たとえばそれらに限定されるものではないが、縮合／加水分解反応
、環状付加反応（たとえば、ジールス-アルダー反応、エン反応、および1,3双極
子付加反応）、α,β-不飽和化合物への接合付加、アルドール縮合、クライゼン
反応、ならびにペプチド、糖および脂質のグリコシル化を包含する様々な結合タ
イプの形成または切断を誘発することができる。さらに、核酸修飾が有機金属残
基を包含する場合には、それらに限定されるものではないが、シクロプロパン化
、エポキシ化、アジリジン化、水素化、アルキンの環状トリマー化、不飽和分子
の［３＋２］および［４＋１］環状付加、ならびにオレフィンメタセシスを包含
する反応が起こり、対称または不整生成物を形成することができる。
【００３２】 「反応物」とは、核酸の熱的および化学的安定性に適合し、上述の修飾に包含
される結合形成反応または結合切断反応に関与する任意の化学的実体を意味する
。反応物の語は単一の化学的実体または一クラスの化学的化合物を意味し、数種
の一般化学構造を有する数種の反応物または異なる一般化学構造を有する数種の
反応物を包含する。反応物には、通常、2〜1000、好ましくは約26〜500の範囲の
分子量を有する。とくに好ましくは、反応物は小さい有機分子、たとえばアルケ
ン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、芳香
族炭素、異項環、ジエン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、エポキシド、
エーテル、アミン、イミン、リン酸塩、アミド、チオエーテル、スルホネートお
よびハロゲン化化合物が包含される。しかしながら、本発明の一部の実施態様に
おいては、さらに大きな反応物たとえばポリマーおよびタンパク質が包含される
。使用される化学的反応物は、無作為にまたは、所望の生成物の性質、その生成
物が有すると思われる活性、または生成物が作用すると思われる標的の性質に基
づく情報を含む多くの基準により選択することができる。
【００３３】 「カップリング反応物」または「第一の反応物」または「第一の化学的反応物」は
、核酸にカップリングして核酸-反応物テスト混合物を形成する上述の反応物を
意味する。第一の反応物の核酸へのカップリングは共有結合でも非共有結合でも
よい。第一の化学的反応物は単一の化学的実体、または一クラスの化学的化合物
であってもよく、数種の一般化学構造を有する数種の反応物または異なる一般化
学構造を有する数種の反応物を包含する。たとえば、第一の反応物は、１種のア
ルケン（たとえば、1-プロペン）、または10種の異なるアルケン、または10種の
異なるアルケンおよび10種の異なるアルキンとすることができる。
【００３４】 「遊離反応物」または「第二の反応物」または「遊離の化学的反応物」は、核
酸にカップリングしていない反応物を意味する。反応には、環状トリマー化反応
の場合のように、２種以上の遊離反応物を包含させることができる。遊離反応物
は互いにまたはカップリング反応物と同種でも異種でもよい。たとえば、遊離反
応物は、１種のアルケン（たとえば、1-プロペン）、または10種の異なるアルケ
ン、または10種の異なるアルケンおよび10種の異なるアルキンとすることができ
る。
【００３５】 「核酸-反応物テスト混合物」とは、それぞれが第一の化学的反応物とカップ
リングした核酸の混合物を意味する。カップリングは共有結合でも非共有結合で
もよく、直接または核酸と反応物の間にリンカーを用いて行われる。核酸-反応
物テスト混合物は、遊離の化学的反応物のプールと接触させて生成物ライブラリ
ーを形成させる。
【００３６】 「生成物」とは、１種または２種以上の反応物の間に核酸によって誘発された
結合形成または結合切断反応から生じる生成物を意味する。好ましい実施態様に
おいては、生成物は通常、カップリング反応物と遊離反応物の間で形成される。
反応して生成物を作成する２種の反応物は必ずしも化学構造の異なる反応物であ
る必要はない。本発明の生成物は、好ましくは、医薬的に活性で治療効果を示す
か、または診断剤もしくは農業用剤として有用な小さい有機分子である。生成物
の通常の分子量は、約40〜2000、好ましくは約100〜1000の範囲内である。しか
しながら、本発明の好ましさは劣る実施態様においては、生成物はさらに大きな
分子たとえばペプチド、タンパク質、ポリマー等でもよい。一部の好ましさが劣
る実施態様においては、反応は結合切断反応であり、カップリング反応物のみで
、または２種もしくはそれ以上の反応物の間で行うことができる。
【００３７】 「生成物ライブラリー」とは、促進性核酸にカップリングされた反応物と好ま
しくは少なくとも１種の遊離反応物との間の化学反応によって形成される生成物
の収集を意味する。本発明の本質により、生成物ライブラリーは様々な化学構造
の多くの異なる生成物を含有することができる。
【００３８】 「標的に対して予め選択された機能を行う能力を有する生成物」とは、予め定
められた所望の様式で標的に対して作用する生成物を意味する。標的に対する予
め定められた所望の作用の例には、それらに限定されるものではないが、標的の
結合、標的を触媒的に変化させること、標的もしくは標的の機能活性を修飾／変
化させる方式での標的との反応、自殺阻害剤の場合のような標的への共有結合、
標的と他分子の間の反応が包含される。１例として、生成物ライブラリー中、予
め定められた特性を有する生成物は、集団のバルクにおけるよりも大きな親和性
で標的に結合する生成物である。与えられた生成物ライブラリー中に、与えられ
た標的に対する予め定められた特性を有する２種以上の生成物が存在できる。予
め定められた特性を有する生成物は、標的に対するそれらの結合親和性または標
的に対するそれらの他の活性において互いに相違する。
【００３９】 「標的」は、平行SELEX法によって同定される生成物が予め定められた所望の
様式で作用できる任意の化合物を意味する。標的分子は、タンパク質、ペプチド
、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、
基質、代謝物、遷移状態同族体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養物、成長因
子、細胞、組織等であり、とくに制限はない。 とくに好ましい標的には、それらに限定されるものではないが、アンギオテン
シン変換酵素、レニン、シクロオキシゲナーゼ、5-リポキシゲナーゼ、IL-1β変
換酵素、サイトカイン受容体、PDGF受容体、ＩＩ型イノシンモノリン酸デヒドロ
ゲナーゼ、β-ラクタマーゼ、およびかびシトクロームP-450が包含される。標的
には、それらに限定されるものではないが、ブラジキニン、好中球エラスターゼ
、tat, rev, gag, int, RT, ヌクレオカプシド等を含むHIVタンパク質、VEGF, b
FGF, TGFβ, KGF, PDGF, トロンビン、テオフィリン、カフェイン、サブスタン
スP, セレクチン、サイトカイン、ICP4, 補体タンパク質等を包含することがで
きる。 「分配」とは、核酸テスト混合物または核酸-反応物テスト混合物のメンバー
をその関連反応物が関与する反応を促進する核酸の能力に基づいてテスト混合物
のバルクから分割できる任意の操作を意味する。分配は本技術分野においてよく
知られた様々な方法によって達成することができる。フィルター結合、親和性ク
ロマトグラフィー、液-液分配、ゲルシフト、密度勾配遠心分離、分子量フィル
ター分配、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除膜分離および等電点電気
泳動はすべて適当な分配方法の例である。分配方法の選択は標的および生成物の
性質に依存し、本技術分野の通常の熟練者には周知の原理および性質によって行
うことができる。 したがって、生成物と会合している核酸（すなわち、促進性核酸）と第一の反
応物のみと会合している核酸（非促進性核酸）の間を分配することは初期の分配
工程として望ましい。この分配工程は、本技術分野の通常の熟練者には周知の多
くの方法、たとえばサイジングカラム、親和性クロマトグラフィー等によって達
成することができる。このような分配工程後、核酸テスト混合物中に促進性核酸
が濃縮される。
【００４０】 「増幅」とは、分子または分子クラスの量またはコピー数を増大させる方法ま
たは方法工程の組み合わせを意味する。好ましい実施態様においては、増幅はテ
スト混合物のメンバーの分配後に行われ、増幅されるのは所望の生成物に会合す
る促進性核酸である。たとえば、RNA分子の増幅は、３つの一連の反応すなわち
、選択されたRNAのcDNAコピーの作成、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる各cDNAの
コピー数の増大およびcDNAコピーの転写により選択されたRNA分子と同じ配列を
有するRNA分子の獲得によって行うことができる。本技術分野において周知の任
意の反応および反応の組み合わせ、たとえば本技術分野の熟練者には周知の直接
DNA複製、直接RNA増幅等を適宜使用することができる。増幅法では、増幅前の混
合物中の異なる配列の比率を本質的に表す増幅混合物の比率を生じることになる
。核酸に対する多くの修飾が酵素的増幅に適合することは周知である。増幅に適
合しない修飾は、必要に応じて、増幅の各ラウンド後に実施することができる。 「ランダム化」の語は、与えられた長さにわたって、原理的に任意可能な配列
を有する核酸のセグメントを記載するために用いられる。ランダム化された配列
は、所望により様々な長さ、約8から100以上までの範囲のヌクレオチドを有する
。ランダム化配列セグメントを作成する化学的または酵素的反応は、未知のバイ
アスまたは存在する可能性があるヌクレオチドの優先性により、数学的にランダ
ムな配列を生じないことがある。「ランダム」に代えて「ランダム化」の語が用
いられるのは、非理想性からのこのような偏差の可能性を反映するものである。
現在知られている技術、たとえば逐次化学合成では、大きな偏差が起こることは
知られていない。20ヌクレオチドまたはそれ以下の短いセグメントでは、起こる
可能性のあるわずかなバイアスによる結果は無視できる。 バイアスはランダム化された配列に、たとえば合成反応中の前駆体ヌクレオシ
ド（またはデオキシヌクレオシド）トリホスフェートのモル比を変化させること
によって故意に導入することができる。故意のバイアスは、たとえば二次構造へ
の影響、促進活性を有することが知られている分子に対するバイアスの導入、あ
る種の構造特性の導入、または予備的結果に基づいて所望される場合がある。
【００４１】 「SELEX」法には、標的と所望の様式で相互作用する核酸リガンドの選択の組
み合わせ、たとえば選択された核酸の増幅とともにタンパク質への結合を包含す
る。選択／増幅工程の反復サイクリングは、きわめて大量の核酸を含有するプー
ルから標的と最も強力に沿うが作用する１個または少数の核酸の選択を可能にす
る。選択／増幅操作のサイクリングは選択のゴールが達成されるまで続ける。本
発明においては、所望の生成物と会合した核酸の増幅のためにSELEX法が採用さ
れる。 「平行SELEX」は、核酸テスト混合物中の核酸が化学的反応物にカップリング
され、これをついで、他の遊離の化学的反応物プールと促進される結合形成に好
ましい条件下に接触させて生成物ライブラリーを産生させる方法である。生成物
ライブラリーは予め定められた特性を有する生成物を同定するためにスクリーニ
ングされる。生成物は、与えられた標的に予め定められた様式で作用するその能
力（たとえば、標的への結合、ある方法での標的の修飾等）について試験するこ
とができる。ついで、所望の生成物は望ましくない生成物から分配により分割す
ることができる。所望の生成物は、その合成を指図した促進性核酸にカップリン
グしたままである。促進性核酸をプールの残部から分配し、SELEX方法において
記載したように増幅する。促進性核酸は単独でまたはその会合した所望の生成物
とともに分配することができる。増幅された核酸は、所望の生成物をアッセンブ
ルできる核酸について濃縮される。増幅された核酸をついで第一の反応物に再カ
ップリングし、遊離の反応物と再接触させ、SELEX法の選択／増幅工程の反復サ
イクリングが所望の生成物の合成、選択および同定のための導入される。選択さ
れた核酸は、最終的に、構造を決定できるのに十分な所望の生成物を産生する。
【００４２】 II．反応 Ａ．核酸 平行SELEX方法は、核酸が生成物の形成を誘発する能力に依存する。この方法は
、核酸テスト混合物の最初の調製を要求する。一般に、核酸テスト混合物の調製
の根拠および方法は、前に記載したSELEX特許出願（引用により、本明細書に導
入する）に略述したとおりである。簡単に述べれば、異なる配列の核酸テスト混
合物を調製する。テスト混合物中の各核酸は一般に、固定された配列（すなわち
、テスト混合物のメンバーのそれぞれは同じ位置に同じ配列を含有する）の領域
およびランダム化された配列の領域を包含する。固定された配列の領域は、（a
）SELEX特許に詳細に記載された増幅工程を支援するように、（b）反応を誘発す
ることが知られている配列を模倣するように、（c）テスト混合物中における与
えられた構造アレンッジメントの核酸の濃度を増大させるように、または（d）
第一の反応物のライゲーションを促進するように選択される。ランダム化された
配列は全体的にランダム化されている（すなわち、任意の位置にある塩基が見出
される確率は４中１である）か部分的にランダム化されているのみである（たと
えば、任意の位置にある塩基が見出される確率は0〜100％から選択できる）。核
酸テスト混合物中に見出される核酸は、様々な化学反応を特異的に誘発するため
に、適切にフォールディングできる核酸が包含される。 核酸テスト混合物は促進性を有する核酸の確率を増大させる様々な方法で修飾
することができる。本発明によって意図される修飾は、正しい電荷、極性、水素
結合、静電相互作用または移動性を有し、全体的にその反応を実施するのに必要
な形状を採用できる他の化学基を導入する任意の修飾である。何らかの理論に固
執するものではないが、反応を実施するための機構には、それらに限定されるも
のではないが、反応遷移状態の安定化、特定の化学反応およびカップリングした
反応物に対して近位に運ぶ様式での遊離反応物への結合の促進を、限定なく包含
する。核酸の活性部位を増強させる修飾には、親水性残基、疎水性残基、様々な
酸化状態の金属原子、剛性構造、タンパク質酵素活性部位に見出される機能性基
たよえばイミダゾール、一級アルコール、カルボン酸エステル基、グアニジノ基
、アミノ基、チオール等が包含される。さらに、有機金属および無機金属触媒を
、レドックス反応物の場合のように、核酸の他の化学基として導入するこができ
る。 核酸テスト混合物の個々の化合物は様々な方法で修飾することができる。適当
な修飾には、それらに限定されるものではないが、核酸のすべての残基、ランダ
ム化残基、すべてのピリミジンもしくはプリンまたはすべての特定宇野塩基（す
なわち、G, C, A, TまたはU）における修飾、あるいは核酸あたり１個の修飾が
包含される。ある種の分子（たとえば、金属触媒等）は溶液中において、核酸に
結合せず、核酸の誘発反応に関する反応を誘発するのに有用である。核酸が第一
の反応物にカップリングしている限り、方法および生成物は本発明の範囲に包含
される化学反応の誘発にある種の方法で関連すると考えられる。修飾は本発明の
核酸の活性を促進するための必須要件ではないことも認められている。 ある条件下には、標的に結合する核酸は、予め選択されることが望ましい。この
実施態様においては、ランダム核酸プールは、反応物が核酸プールにカップリン
グする前に標的分子に対してSELEXの数（1〜10）ラウンドに付される。 ｉ．他の化学基による核酸の修飾 核酸は、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置の修飾
を包含する任意の数の方法で修飾できる。一部の修飾は ”High Affinity Nucle
ic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides” と題する、現在は放棄さ
れた米国特許出願08/117,991号（米国特許第5,660,985号も参照）、および “Me
thod for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products” と題
する米国特許出願08/076,735、現在は米国特許第5,428,149号に記載されている
（これらは引用により本明細書に導入される）。一実施態様においては、修飾は
他の化学基がピリミジンの5-位、プリンの7- もしくは8-位、または糖の2’ 位
に結合する修飾である。個々の分子に導入できる他の化学基の種類については制
限はない。好ましい実施態様においては、生じた修飾核酸は増幅可能であるか、
または増幅工程についで修飾することができる。
【００４３】 いかなる意味でも本発明の限定を意味するものではない一例として、生物模倣
性の促進性核酸を考えることができる。核酸修飾のための一選択には、ある種の
塩基がそれらの化学的および物理的性質においてタンパク質をよりふさわしくす
る修飾を包含する。ピリミジンおよびプリンヌクレオチド塩基のある種の修飾は
、核酸をタンパク質のアミノ酸側鎖に類似する「側鎖」をもつようにすることが
できる。ピリミジンの5-位、またはプリンの 7-位もしくは8-位へのアミノ酸誘
導体の場合、数種の合成法が他の化学基を結合させるために利用できる。ピリミ
ジンを5-位で修飾する方法は、米国特許出願08/076,735、現在は米国特許第5,42
8,149号、米国特許出願08/347,600（現在は米国特許第5,580,972号）、および米
国特許出願08/458,421（現在は米国特許第5,719,149号）、ならびに他の観光物
に記載されている。核酸の修飾については多数の刊行物が知られていて、それら
に限定されるものではないが、Limbach, PAら, 1994, Nucleic Acids Res. 22:
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れる。 上述のアミノ酸修飾ヌクレオチドは、ネイティブなヌクレオチドに置換するこ
とが可能で、核酸テスト混合物の配列中に導入することができる。上述のアミノ
酸に代えて他の化学基で修飾されたヌクレオチドも本発明に意図される。多くの
場合、核酸テスト混合物に付加するのにどの修飾核酸が最も望ましいかについて
の作業仮説を作成することができる。たとえば、意図される反応がクラスIアル
ドラーゼの構造によって導かれるアルドール縮合の誘発を意図する場合、必要な
他の化学基は、カルボニル基質とイミンを形成するためアミノ基を含むアミノ酸
誘導体および反応に求核試薬として作用するエナミンの形成を促進する他の塩基
性基である。
【００４４】 他のヌクレオチド修飾には、核酸の促進性を増大させる官能基の拡散への結合
が包含される。このようなｓ官能基は、促進性核酸の活性部位の創製に参加する
。創製された活性部位は多重基質を結合し、高度な正確度で鍵となる促進機能を
アラインすることができる。これらの官能基は反応物の反応ダイナミックスに配
位するのに十分なコンフォーメーションの自由度を持たなければならない。官能
基には、極性および非極性基の、一般に酸、塩基、求核試薬、求電子試薬および
金属リガンドとして作用する両者が包含される。この様式でヌクレオチドを修飾
することによって、たとえばそれらに限定されるものではないが、溶媒和、pKa
、分極能、ダイナミクッス等、核酸を、実際に任意のタイプの反応物間で相互作
用の促進を可能にする適当な性質を有するすべての種類の核酸を製造することが
できる。ヌクレオチドは、糖および／または塩基および／またはホスフェート位
置を、それらに限定されるものではないが、たとえば以下の1種または2種以上の
官能基によって置換することができる。 式中、星印は核酸への官能基の結合点を指示し、nは任意の整数であり、好まし
くは0〜20である。このような化学基はまた、脂肪族または芳香族位置における
置換も包含する。好ましくは、官能基は塩基置換である。
【００４５】 ii. 有機金属基による核酸の改質 本発明によって考えられる核酸試験混合物のもう一つの改質は、核酸試験混合
物を構成する配列に有機金属試薬を配合することである。複雑な有機構造の合成
に有機金属触媒を用いることによって、有機合成が根本的に変化した。有機金属
触媒は、反応を媒介することができる任意の金属および有機リガンド球である。
配位球を構成することができるリガンドは当業者に知られており、ピリジンリガ
ンド、ホスフィンリガンド、オキシムリガンド、ポルフィン、イソシアネート、
シアネート、カルボキシレート、チオール、一酸化炭素、アルケン、エーテルな
どが挙げられる。有用な金属としては、ニッケル、ロジウム、コバルト、パラジ
ウム、ジルコニウム、アルミニウム、鉄、マンガン、チタン、ルテニウム、モリ
ブデン、およびホウ素が挙げられる。例えば、ピリジニウムニッケル錯体は、尿
素を加水分解することが知られており、ロジウムアセテート触媒はシクロプロパ
ン化を促進し、コバルト錯体はシクロトリマー化および［３＋２］付加環化を触
媒し、パラジウムは水素化および［３＋２］付加環化を触媒し、ルテニウムおよ
びモリブデン錯体はオレフィンメタセシスを触媒する。これらの反応を一緒にす
ることによって、３、４、５、６および７員環を調製することができ、これらは
総て多くの医用化合物の構造に用いられることが知られている。より大きな環は
、π‐アリルパラジウム触媒によって調製することができる。キラル中心の形成
が多くの生物活性化合物の合成にとって重要であり、多くの場合に、誤った鏡像
異性体は有害な薬理作用を有する可能性がある。単一鏡像異性体を形成するため
の非対称水素化は、パラジウムおよびジルコニウム錯体によって行われている。 この態様では、有機金属錯体をオリゴヌクレオチドに結合するには、幾つかの
選択を取ることができる。有機金属錯体は、ピリミジンの５位などのようにヌク
レオチド塩基に直接結合させることができる。改質されたオリゴヌクレオチドは
、良好な一体性で増幅されるものである。 幾つかの場合には、核酸と有機金属錯体との結合は開裂して、オリゴヌクレオ
チドをそっくりそのまま残すものである。開裂可能な結合の例としては、光化学
的に不安定なリンカー、ジスルフィド、およびカーボネートが挙げられるが、こ
れらに限定されない。これらの結合の化学は当業者には周知であり、有機金属錯
体を核酸の５′または３′末端または核酸のピリミジン残基の５位に結合させる
のに用いることができる。 もう一つの選択肢は、有機金属錯体を包含するために合成することができるカ
セットオリゴヌクレオチドを用いることである。カセットオリゴヌクレオチドの
態様としては、有機金属錯体を結合させた固定核酸配列であって、各回の選択の
開始時に核酸に連結することができるものが挙げられる。核酸試験混合物の各要
素は、カセットの固定配列に相補的な同一の固定領域を有する。このカセットオ
リゴヌクレオチドでは、他の接合法の必要をなくすることができる。 オリゴヌクレオチド中に有機金属触媒を埋設するのが望ましいこともある。こ
れらの態様の幾つかについては、各回の増幅の後に改質を行うことができる。有
機金属錯体をオリゴヌクレオチド中に埋設する場合には、１を上回る開裂可能な
結合が望ましいことがあり、かつ各開裂可能な結合の化学は特有のものであるこ
とが必要となる。ビピリジンリガンドを、一例として下記の略図で用いる。 ＡおよびＢで表したオリゴヌクレオチド成分は、支持体から化学選択的に開裂
することができるので、それらの配列は独立して決定することができる。更に、
ＡおよびＢは、化学的方法によって容易に合成することができる比較的短い配列
を含んでなることがある。幾つかの有機金属錯体については、合成または転写の
後に金属を組込むことが必要とする。これらの場合には、金属と結合するキレー
トリガンドを上記のオリゴヌクレオチドに結合させ、リガンド交換反応による核
酸合成または増幅の後に金属を導入する。 核酸への有機金属触媒の埋設は、官能基を触媒に加えて、有機金属錯体を核酸
と会合させることによって行うことができる。典型的には、アセチルアセテート
、アミン、カルボキシレート、ピラゾールボレート、ポルフィリン、カルボラン
、チオール、スルフィド、ホスフィン、ホスファイト、ビナフトール、サレン、
オキサゾリン、およびオキシム金属配位リガンドのようなリガンドは、核酸につ
いて、これらのリガンドの親和性を増強する官能基および任意の結合した金属を
用いて改質することができる。金属配位リガンドは、アミン、アミド、スルホキ
シド、スルホネート、ヒドロキシル、グアニジニウム、ポリアミン、プトレッセ
ン(putrescene)、またはスペルミジンのような核酸結合基を包含するように買位
質することが出基るが、これらに限定されない。有機金属触媒の核酸への非共有
的結合は、静電引力によって行うことができ、この場合には触媒上の官能基が真
の正電荷を含む。更に、核酸の有機金属触媒錯体への会合は、核酸構造中に挿入
されるが、静電引力によって結合されない基を導入することによって行うことが
できた。更に、核酸の大小の溝に良好な親和性で結合する基は周知であり、有機
金属錯体のリガンドに結合させることもできる。アルキンおよびアルケンのシク
ロトリマー化の触媒として用いることができる有機金属補助因子の例は、下図に
示される。
【００４６】 １９９６年３月２０日出願の米国特許出願連続番号第０８／６１９，２２８号
明細書であって、現在は「水溶液におけるアルキンのシクロトリマー化の方法」
という標題の米国特許第５，６５９，０６９号明細書の主題（この主題は、参考
として本明細書に引用される）であるコバルト錯体は、一つの可能な例では、Ｂ
におけるような置換のためヒドロキシルを活性化することによって核酸補助因子
となる。Ｂをアグマチンで置換してＣを生成し、またはグアニジンで置換してＤ
を生成することにより、核酸に静電結合することができる種類の基を有するコバ
ルト錯体を生じる。リン酸塩に対する正のグアニジル基の引力は周知であり、約
３ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーを供給する。シクロペンタジエニルまたはシ
クロオクタジエニルリガンドの核酸との追加の疎水性接触または挿入により、コ
バルト金属補助因子の結合の親和性および特異性が増強する。 上記の例から分かるように、結合形成および結合開裂のような化学反応を媒介
することができる核酸を改質するには、多数の方法がある。核酸の総ての改質は
、本発明によって考慮される。
【００４７】 Ｂ． 反応体 最も広義には、反応体という用語は、結合形成または結合開裂反応に関与する
ことができる核酸の熱的および化学的安定性と適合する任意の化学的存在物を表
す。本発明は、反応体の種類によって制限されるものではない。下記のクラスの
小さな有機分子は、潜在的反応体の非制限的例としようとするものである。アル
ケン、アルキン、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、芳
香族炭素環、複素環、ジエン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、エポキシ
ド、エーテル、およびハロゲン化化合物。反応体は、好ましくは分子量が２‐１
０００の範囲であり、最も好ましくは２６‐５００の範囲である。所望な生成物
が大きめの分子である場合には、反応体もペプチド、タンパク質およびポリマー
などのように大きくなる。反応体は１個を上回る官能基を含むことができ、キラ
ル中心を有することができる。一般に、反応体という用語は、化学的に反応性の
単位によって画定される化学的反応体のクラスを表す（例えば、ジエン、エステ
ルなど）。例えば、化学的反応体は、クラスの１‐１０n個の異なる成員を含む
ことができる反応体のクラスであることができる。任意の所定の反応に対して選
択される反応体としては、数種類の反応体を挙げることもできる。 Parallel SELEX工程に適当な反応体を決定する工程におけるあるレベルでは、
標的を同定しなければならず、所望な生成物をこの標的に作用させる作用様式を
決定しなければならない。決定したならば、所望な特性を有すると思われる生成
物のクラスを選択することができる。次に、所望なクラスの生成物を生成すると
思われる適当な反応体を選択し、Parallel SELEX工程に組込むことができる。 反応体の選択は、無作為に決定することができる。しかしながら、好ましくは
反応体は、所望なクラスの生成物に基づく反応体であって、所望な特徴を有する
既知の化合物への類似性に基づく初期の構造の仮定によって決定することができ
るもの、他の既知のリガンド、コンピューターモデルシミュレーション、ＮＭＲ
およびＸ線データ／構造、酵素および化学的足跡実験(footprinting experiment
s)などの多数の基準によって選択することができるが、これらに限定されない。
生成物のクラスを同定してしまえば、反応体は、得ることができる変動性を細大
にするように選択される。レトロ合成法を用いて、可能な反応体を選択すること
が多い。多数の種類の反応体を同時に用いることができる。 本発明の目的に対して、核酸と結合する反応体を第一の反応体またはカップリ
ング反応体と呼ぶ。典型的には、第一の反応体を、結合形成を促進するのに好都
合な条件下で少なくとも１種類の遊離の反応体と接触させ、得られる生成物を分
析して、これが所定の所望な特徴を有するかどうかを決定する。第一の反応体は
１種類を上回る他の反応体（すなわち、第二、第三、第四の反応体など）と化学
的に反応して生成物を形成することができると考えられる。１種類を上回る化学
反応を同時に行うこともできると考えられる。場合によっては様々な比率の生成
物形成を促進するため複数の核酸を用いて、複数の反応を同時にまたは段階的に
行うことができるとも考えられる。理想的には、生成物を特異的に生成する核酸
配列を促進する能力によって、生成物ライブラリーが作成されるように反応体を
選択する。
【００４８】 Ｃ． 反応体の核酸へのカップリング Parallel SELEX工程では、第一の反応体を、核酸試験混合物に含まれる促進特
性を有する核酸にカップリングする必要がある。第一の反応体は、核酸に共有的
にまたは非共有的にカップリングされる。カップリングは理論的には、核酸のど
こで行うこともできる。しかしながら、実際的には、カップリングは通常は核酸
の５′または３′末端で行う。典型的には、カップリングは連結反応によるもの
であるが、任意の既知のカップリング反応を受入れることもできる。カップリン
グは、５′ＧＭＰＳ、末端トランスフェラーゼを有する３′ジデオキシなどで行
うことができるように、直接的であることができる。 核酸と反応体とのカップリングとしては、リンカー基を挙げることもできる。
このようなリンカー基は、核酸を更に好ましい配座に折りたたみ、反応体と一層
相互反応して反応を媒介することができるようにすることができる。リンカー基
により、第一の反応体を、折り畳んだ核酸の全表面および触媒ポケットを調査す
ることができる。 リンカー基は、任位の照基と生なスペーサー残基であることができる。リンカ
ー基は十分な長さのものであり、好ましくはポリマー単位からなり、折り畳んだ
核酸の全表面および結合ポケットに様々な反応体が接近できるようにする柔軟な
鎖の余裕をとるべきである。リンカーの最適な大きさは、核酸の大きさによって
変化する。一般に、リンカー基の多基左派１０−１０００Åであり、好ましくは
２０‐３００Åである。リンカー基は、核酸−反応体試験混合物で変化させて、
所望な反応の最適な長さを選択することができる。リンカー基は、反応条件下で
容易に溶媒和するものとする。適当なリンカー基としては、ＰＥＧ、ポリビニル
アルコール、ポリアクリレートおよびポリペプチドが挙げられる。 リンカー基と核酸の結合は、好ましくは開裂可能であり、核酸がそのまま残る
。適当な開裂可能な結合の例としては、光化学的に不安定なリンカー、ジスルフ
ィド、シスジオールおよびカーボネートが挙げられるが、これらに限定されない
。結合は、ＤＮＡアーゼおよびプロテイナーゼ酵素でも開裂することができる。 更に、結合は、対数増殖によるリガンドの全身的発生：混合SELEXという標題
の１９９４年４月２８日出願の米国特許出願連続番号第０８／２３４，９９７号
明細書であって、現在は米国特許第５，６８３，８６７号明細書に記載のSplint
Blended SELEX法によることができ、上記特許明細書の内容は、参考として本明
細書に引用される。
【００４９】 Ｄ． 生成物形成 化学反応は、第一の反応体と少なくとも１種類の第二の反応体が相互作用し、
生成物を形成するとき、または第一の反応体ある方法で開裂し、会合した核酸に
よって促進されるときに起こる。任意の数の化学反応は、Parallel SELEX法と適
合する。唯一の要件は、反応が第一の反応体にカップリングした核酸によって媒
介されることである。好ましくは、核酸による媒介は反応体および所望な生成物
に特異的であるが、いつもその通りとは限らない。化学反応としては、結合形成
および結合開裂反応が挙げられる。様々な結合形成反応が本発明により考えられ
、例えば縮合／加水分解反応、付加環化反応、例えばディールス‐アルダーおよ
びエンク反応、α,β‐不飽和化合物への共役付加、アルドール縮合、および小
さな有機分子、ペプチド、糖および脂質のグリコシル化が挙げられる。更に、試
験混合物中の核酸を改質して有機金属触媒を核酸に包含させるときには、アルキ
ンおよびアルケンのシクロプロパン化、水素化、シクロトリマー化、不飽和分子
の［３＋２］および［４＋１］付加環化が起きることがあり、これらの総ては非
対称分子を形成することができる。本発明では、これらの反応の単独での、また
は任意の組合せでの一緒の使用が考えられる。本発明では、第一の生成物を２個
以上の反応体で作成した後、この生成物を他の遊離反応体を有する「反応体」と
し、第二の生成物などを形成することができる連続反応も考えられる。 結合開裂反応も、本発明に包含される。結合開裂反応は数個の態様を有し、第
一の反応体を開裂して標的と相互作用する生成物を形成すること、第一の反応体
を開裂して、これを第二の反応体と一層良好に反応して新規生成物などを形成で
きるようにするものなどが挙げられるが、これらに限定されない。 本発明としては、本発明の方法によって形成した生成物がラベル、抗体、他の
小分子など、これらに限定されない他の分子に結合している態様も挙げられる。 （複数の）反応を、当業者に知られている各種条件であって核酸の安定性要件
に合致する条件下で行うことができる。反応は、水、トリス、ＨＥＰＥＳなど任
意の緩衝または非緩衝水性溶媒中、または適当なアルキルアンモニウムを含む有
機溶媒系、またはトリエチルアンモニウム塩を含むアルコール／水、ＤＭＳＯ、
ジオキサ／水、アセトニトリル／水、ＤＭＦ／水中で行うことができる。あるい
は、水性有機二相溶媒系が、用途によって適当であることがある。温度範囲は、
一般に‐１０℃‐１００℃であり、好ましくは１０℃‐５０℃である。無作為化
核酸‐反応体試験混合物の濃度は、１pM‐１０mMの範囲であり、好ましくは１‐
１００μMであり、第二の反応体の濃度は一般に1μM‐１０Mの範囲であり、好ま
しくは１０μM−１０mMの範囲である。
【００５０】 Ｅ． 所定の望ましい特徴を有する分配生成物 化学反応を行ったならば、所定の望ましい特徴を有する生成物について生成物
ライブラリーをスクリーニングしなければならない。上記のように、所定の所望
な特徴としては、標的に対する結合、標的の触媒変化、標的または標的の機能活
性を変化させ／改質する方法で標的との化学的反応、および自殺インヒビター中
でのような標的との共有結合が挙げられる。 標的は、目的とする任意の化合物であることができる。標的は、タンパク質、
ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、抗原、抗
体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似物、補助因子、インヒビター、薬剤
、染料、栄養、成長因子、細胞、組織などであることができるが、これらに限定
されない。特に好ましい標的としては、アンギオテンシン転換酵素、レニン、シ
クロオキシゲナーゼ、５‐リポキシゲナーゼ、ＩＬ−１β、転換酵素、サイトカ
インレセプター、PDGFレセプター、II型イノシンモノホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、β‐ラクタマーゼ、および真菌性シトクロムP４５０が挙げられるが、こ
れらに限定されない。標的としては、ブラジキニン、ニューロフィルエラストマ
ー、ＨＩＶタンパク質、例えばtat、rev、gag、int、RT、ヌクレオキャプシドな
ど、VEGF、bFGF、TGFβ、KGF、PDGF、トロンビン、テオフィリン、カフェイン、
サブスタンスP、IgE、5PLA2、赤血球、神経膠芽細胞腫、フィブリン凝塊、PBMC
、hCG、レクチン、セレクチン、サイトカイン、ICP４、補体タンパク質などが挙
げられるが、これらに限定されない。 生成物をスクリーニングする条件は、上記のD節で記載した生成物形成の条件
に限定されない。スクリーニング条件は、当業者に知られている。 所定の所望な特徴を有する生成物は、当業者に知られている各種方法によって
形成を促進する核酸に結合したままで生成物ライブラリーの残りから分割するこ
とができる。キーとなるのは、核酸が増幅可能となるように結合した核酸を化学
的分解せずに全生成物ライブラリーから所望な生成物を分割することである。次
に、核酸を、基本的SELEX法で教示されるように、所望な生成物に結合したまま
でまたは所望な生成物から分離した後に、増幅することができる。 最も好ましい態様では、所望な生成物は、所望な生成物に結合した核酸と標的
との間に相互作用なしに標的に作用する。核酸は、結合した反応体と遊離の反応
体との間の反応を促進し、所望な生成物を生成し、かつ増幅して所望な生成物を
次に再生して、最終的に広汎な生成物ライブラリーから同定することもできる。
しかしながら、この好ましい態様では、核酸が標的と直接相互作用することは考
えられない。 核酸を改質した後に、標的と接触させて、標的と相互作用しないことを確認す
ることができる。改質は、核酸を二本鎖として、これが標的とあまり相互作用で
きないようにするなどの幾つかの方法で行うことができる。幾分好ましくない態
様では、核酸は、独立してまたは合成が促進される所望な生成物と協奏的に、標
的に作用することができる。この態様では、最終生成物は、会合した核酸との生
成物の組合せであることができる。 一態様では、生成物は標的に結合し、結合した生成物‐標的複合体を多数の方
法によって未結合生成物から分割することができる。これらの方法としては、ニ
トロセルロースフィルター結合、カラムクロマトグラフィ、濾過、アフィニティ
ークロマトグラフィ、遠心分離、および他の周知の方法が挙げられる。簡単に説
明すれば、生成物ライブラリーに、標的を結合するカラムのような分割法を施す
。生成物を形成しなかった総ての核酸、または望ましくない生成物と会合したも
のは、カラムを通過する。更に、望ましくない生成物（例えば、他の標的と交差
反応する生成物）は、Counter-SELEXによって除くことができる。所望な生成物
はカラムに結合し、カラムの条件（例えば、塩など）を変化させることによって
溶出することができ、または所望な生成物と会合した核酸は生成物から開裂させ
、直接溶出することができる。 更に、標的と反応する生成物は、標的と反応しない生成物と分離することがで
きる。一例では、標的（例えば、自殺インヒビター）に共有結合している生成物
は、極めてストリンジェントな条件下で洗浄することができる。次に、得られる
生成物‐標的複合体を、プロテイナーゼ、ＤＮＡアーゼ、または他の適当な試薬
で処理して、リンカーを開裂し、所望な生成物と会合する核酸を遊離することが
できる。遊離した核酸を増幅することができる。 もう一つの例では、所望な生成物の所定の所望な特徴は、化学基を標的に転移
させることにより、標的を不活性化することができることである。生成物ライブ
ラリーであって、生成物の総てがチオエステル化学基を有するものを有すること
ができる。標的と接触させると、所望な生成物は化学基を標的に転移させ、同時
に所望な生成物をチオエステルからチオールに変化させる。従って、（チオエス
テルよりは）現在はチオールである生成物を同定する分割法により、所望な生成
物を選択することができ、これと会合した核酸を増幅することができる。 本発明と適合する他の分割およびスクリーニング法であって、当業者に知られ
ているものがある。一態様では、生成物を多数のよく用いられる方法によって分
画した後、それぞれの画分を活性について分析することができる。分画法として
は、サイズ、ｐＨ、疎水性などが挙げられる。 上記のように、ＳＥＬＥＸ法としては、所望な生成物を良好に分割する目的で
組込むことができる他の態様を包含することができ、Photo-SELEX、Counter-SEL
EXなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Parallel SELEX法に固有なものは、所望な機能に基づく小分子の選択であり、
これは所望な機能および特異性を有する小分子の選択に敷衍することができる。
望ましくない「標的」と相互作用することができる生成物に結合したＲＮＡを抽
出した後（負の選択、またはカウンター選択）、所望な標的を用いて正の選択の
際に、特異性を求めることができる。例えば、真菌性シトクロムＰ‐４５０のイ
ンヒビターは、哺乳類のシトクロムＰ‐４５０とある程度まで交差反応（重大な
副作用を生じる）することが知られている。真菌性シトクロムの極めて特異的な
インヒビターは、最初に哺乳類シトクロムと相互作用することができる生成物を
除去した後、真菌性シトクロムと相互作用することができる残存生成物を保持す
ることによってParallel-SELEX法によって生成した生成物ライブラリーから選択
することができた。 一態様では、分割段階の前に、核酸を、標的とあまり相互作用しないような方
法で処理する。一例としては、核酸を二本鎖にし、またはｐＨ可逆的グリオキサ
ール変性の後に分割することができる。もう一つの態様では、反応体を核酸にカ
ップリングする前に、核酸試験混合物をCounter SELEXによって分割し、標的に
直接作用する核酸を除去することができる。
【００５１】 Ｆ．増幅 望ましい特徴を有する生成物の合成を操作する核酸の増幅は、当業者に知られ
た方法を用いて、基本的ＳＥＬＥＸ方法に記載されたように行われる。必要な若
しくは望ましい場合には、増幅前に任意の修飾又は他の付加特徴（例えば、リン
カー基）を除去することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸を増
幅するための例示的方法である。ＰＣＲ方法の説明は例えばＳａｉｋｉ等、１９
８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４；Ｓａｉｋｉ等、１９８６
、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６；Ｓａｉｋｉ等、１９８６、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３３：１０７６−１０７８；Ｉｎｎｉｓ等、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：９４３６−９４４０；並びに米国特許第４，
６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ等）及び米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍ
ｕｌｌｉｓ等）に見出される。ＰＣＲ増幅は、その基本形で、ｓｓＤＮＡの３’
及び５’末端に相補的な特異的オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラ
ーゼによるプライマー伸長、及びＤＮＡ変性を用いた、所望の一本鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡのｃＤＮＡコピーの反復複製サイクルを必要とする。１つのプライマーか
らの伸長によって得られる生成物は他のプライマーからの伸長のための鋳型とし
て役立つ。他の既知増幅方法を本発明によって考慮する。
【００５２】 鎖排除増幅(strand displacement amplification)（ＳＤＡ）は代替え分配方
法(partitioning method)の１例である（Ｗａｌｋｅｒ等、１９９２、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３９２−３９６；Ｗａｌｋｅｒ等、１９
９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０：１６９１−１６９
６）。ＳＤＡはｓｓＤＮＡからｓｓＤＮＡを増幅する方法であり、ＰＣＲと幾つ
かの類似点を有する。ＰＣＲと同様に、ＳＤＡはプライマー間に存在するＤＮＡ
を増幅するために２つの収束プライマー(convergent primer)のセットを用いて
、これを達成するためにＤＮＡポリメラーゼの活性を必要とする。さらに、ＳＤ
Ａは、新たに合成されたＤＮＡがさらなるＤＮＡ合成の鋳型として役立つ指数関
数的増幅スキームを用いる。ＰＣＲとは異なって、ＳＤＡは一定の温度（〜４０
℃）で行われ、鋳型が新しい鎖を合成すると鋳型から既に合成された鎖を排除す
る、ある一定のクラスのポリメラーゼの能力に依存する。これはＰＣＲに用いら
れる熱変性工程に取って代わる。ＳＤＡは、ｄｓＤＮＡ鋳型にニック(nick)を形
成するために、付加的な酵素、制限エンドヌクレアーゼの作用を必要とする。ニ
ックの３’側のＤＮＡは新たなＤＮＡ合成のためのプライマーとして役立ち、ニ
ックの５’側のＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼによって溶液中に排除され、そこで
ＳＤＡプライマーの１つとアニールして、さらなるＤＮＡ合成のための鋳型とし
て役立つことができる。ＤＮＡリガンドが望ましい場合には、ＳＤＡはＰａｒａ
ｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスとして多くの利点を有する。ＳＤＡ方法はＤＮＡ
合成のためにＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ（−）を用いる、これは
ある一定の修飾ｄＮＴＰｓを容易に加えることが知られる非常に充分に特徴付け
られたポリメラーゼである。 充分に特徴付けられているので、どの修飾ｄＮＴＰｓを作製すべきかについての
合理的な決定は容易になされるはずである。プライマー伸長がＤＮＡリガンドを
テザード(tethered)反応基に結合させるためのライゲーションに取って代わる、
単純なスキームを考案することができる。ＳＤＡはＰＣＲと同様な増幅特性を有
するが（ＤＮＡ＜２００ｎｔ長さに関して）、あまり特殊でない装置を用いてよ
り短時間で達成されることができる。
【００５３】 増幅された核酸に次に任意の必要な後−増幅(post-amplification)を受けさせ
て、これを第１反応物に再結合させて、プロセスを上述したように続ける。プロ
セスは、適当な促進活性(facilitating activity)を有する核酸を富化させるた
めに必要なかぎり及び／又は最大に望ましい特徴を有する望ましい生成物が得ら
れるまで、多数回繰り返される。Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスの１ラ
ウンドが望ましい特徴を有する生成物を得るために必要な総てであることが、完
全に可能である。終点は、結合曲線、ＩＣ50値によって判定される阻害、不活化
速度、毒性プロフィル、バイオアベイラビリティ、薬物動態等を含めた、当業者
によって理解される多くの方法によって決定されることができる。
【００５４】 Ｇ．目的生成物の分析 核酸促進体(facilitator)を増幅させ、充分な量の目的生成物を製造した後に、
１種類の又はシリーズの目的生成物の構造を当業者に知られた慣用的な分光方法
によって解明することができる。これをするためには、初期反応条件を適当に複
製しなければならない。第１反応物を核酸促進体に再結合させるべきであり、得
られた核酸−反応物を第２反応物のプールと混合して、結果としての目的生成物
を形成し、単離すべきである。このプロセスを最大に効果的にさせる前提は、核
酸が個々の反応を又は、所望の反応を含めて、少なくともかなり少数の反応を特
異的に促進することである。慣用的な特徴付け方法は、非限定的に、ＮＭＲ分光
法、質量分析法、ＨＰＬＣ結合分光法、赤外分光法、ＵＶ／可視分光法、円二色
法(circular dichroism)、旋光分析、及びＸ線結晶組織学を包含する。目的生成
物の構造が同定されたならば、目的性生物を標準化学合成方法によって又は側真
性核酸を用いる製造に関して本明細書に略述する方法によって大量に製造するこ
とができる。
【００５５】 ＩＩＩ．一般的実施例 Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ方法をさらに説明するために、以下の一般的実
施例を含める。Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ方法の最も基本的スキームを図１
に略述する。次の実施例は、本発明によって考慮される反応の小サンプリングを
さらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのみに提供されるのであり
、本発明を如何なる意味でも限定するとは解釈されないことが意図される。
【００５６】 Ａ．Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応 下記考察は、ＲＮＡ促進体と一般的ターゲットに結合するシクロヘキセン小分
子生成物とを、図２Ａ−２Ｄに示すＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を用いて同時発
生させる方法を説明する。このＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ実施例の他のバー
ジョンはＤＮＡを用いることができ、場合によっては、ＤＮＡがＲＮＡよりも好
ましいと考えられる。
【００５７】 出発ＲＮＡ（図２ＡのＡ）は転写を可能にする３’及び５’固定領域とＰＥＧ
スペーサーへのコンジュゲーションのためのライゲーション部位とを含有し、こ
の部位が次に第１反応物ジエノフィル(dienophile)に結合する。出発ＲＮＡ（Ａ
）は約４Nの異なる配列（ＮはＲＮＡ配列中のヌクレオチド数である）から成る
ランダム化領域を有する、この場合、ＮはＲＮＡ配列中のヌクレオチド数であり
；正確な数はランダム領域の長さと、ＲＮＡ配列を作製するために用いられたＲ
ＮＡ合成の規模とに依存する。ＰＥＧスペーサーは、折り畳みＲＮＡの全表面と
結合ポケット（図２ＡのＣとＤ）へ第１反応物ジエノフィルをアクセスさせるフ
レキシブルテザーを可能にする充分な数のポリマー単位を含有する。第１反応物
に結合する出発ＲＮＡ（Ａ）は、簡明さのために線状構造として示す。実際のＲ
ＮＡ構造はＣとＤによって代表されるような種々な折り畳みモチーフから成る。
【００５８】 この実施例では、工程１はＢ1-10と標識された１０第２反応物ジエン基質のプ
ールを包含し、この場合、基Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は水素ではない。このプールが、
基Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の１つ又は総てが水素である第２反応物ジエンを包含するよ
うに拡大されることができないという理由はない。これは少数の立体中心（ster
eocenter)の形成を生じるにすぎない。構造ＣとＤは第１反応物ジエノフィルが
アプローチする２つの可能性を表す。各レジオアイソマー(regioisomer)は形成
されうる可能な４立体異性体を有し、総てが形成された場合には、１１化合物が
８０にトランスフォームされる（図２Ｂ）。概略構造要素(diagrammatic struct
ural elements)αとβはＲＮＡ中の理論的バルジ(bulge)を表し、これらは第２
反応物ジエン又は第１反応物ジエノフィルと相互反応して、第２反応物ジエンの
配向と、トランジション状態にある第２反応物ジエンのアプローチとを決定する
ことができる。例えば、Ｅ1-10に関して、Ｒ3がＲ2よりも小さいならば、ジエン
の好ましい配向は、Ｇ／Ｇ*及びＨ／Ｈ*に比べて、ＲＮＡ特徴βとジエノフィル
基Ｒ２との間の立体障害のために、Ｅ／Ｅ*及びＦ／Ｆ*の形成を容易にする。ア
プローチＣに関しては、エナンチオマーＥ／Ｅ*及びＦ／Ｆ*が形成される。例え
ば、ジエノフィルカルボキシレートの酸素とα標識ＲＮＡ領域との間のＨ結合の
ような、アトラクティブ相互作用はエンド(endo)生成物の形成を促進する。Ｒ1
と、β標識ＲＮＡ表面との間の引力(attractive force)もエンドアタックを容易
にすることができる。これとは対照的に、ＲＮＡ構造特徴αとβはカルボキシレ
ート及びジエノフィルのＲ1に対しては反発的相互作用を有して、エキソ(exo)生
成物の形成を生じる可能性がある。対Ｅ／Ｅ*及びＦ／Ｆ*の間の関係がジアステ
レオマー的であるので、これらが同じサブユニットＲ1、Ｒ2及びＲ3に対してさ
え異なる物理的性質を有することに注目のこと。アプローチＤに関しては、エナ
ンチオマーＧ／Ｇ*及びＨ／Ｈ*が形成され、対Ｇ／Ｇ*及びＨ／Ｈ*の間の関係は
ジアステレオマー的である。しかし、オリゴヌクレオチドは固有のキラリティを
有するので、ＲＮＡ促進部位はエナンチオマー対のトランジション状態とのエネ
ルギー的に異なるジアステレオマー的相互作用を有し、これはエネルギー差が小
さい（ΔΔＧ‡３−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）としても高度なエナンチオ選択性を可
能にすることができる。
【００５９】 シクロヘキセン目的生成物の選択は工程２（図２Ｃ）に示す。ターゲットがタ
ンパク質であり、目的生成物がターゲットへの結合に関して選択される場合には
、開始ラウンド中に過剰なターゲットタンパク質中で工程２を行うことができ、
次に、シクロヘキセン目的生成物の富化が上昇するにつれて、タンパク質濃度を
減ずることができる。ターゲットタンパク質の例は、酵素、ホルモン、細胞受容
体、細胞接着分子等を包含する。競合アッセイでは、最高アフィニティの目的生
成物が結合される。このことは最初に、例えばＥ／Ｅ*及びＦ／Ｆ*のような全体
グループ(entire groups)の選択を生じうる。この実施例では、１つのエナンチ
オマーセット、例えばＥが、それがターゲットタンパク質により緊密に結合する
という理由で選択され、例として、可能な１０構造のうちの５構造体のみが同様
なアフィニティを有することがることが想定される。Ｅ１−５は、タンパク質に
結合する５“ウィンナー(winners)”を示す。（ジアステレオマーの各々に由来
する目的生成物を得ることができないと考える推測的な理由が存在しないことが
注目される）。
【００６０】 選択された目的生成物と、それらが付着した同時発生ＲＮＡ促進体とを好まし
くない生成物から分離し、ＲＮＡ促進体を工程３〜５（図２Ｃと２Ｄ）の標準Ｓ
ＥＬＥＸ方法によって増幅する。工程５後に、化合物のＥグループを特異的に形
成する促進活性のためにＲＮＡｓが富化されている。工程５後に得られたＲＮＡ
構造は、折り畳まれたfolded up)ときに、図２ＣのＥによって示されるシクロヘ
キセン生成物の形成のための活性な触媒である。この時点において多くの５を超
えるＲＮＡ(more than 5RNA)配列が存在しうる。ＳＥＬＥＸのその後のラウンド
を行うためには、第１反応物ジエノフィルを含む初期ＰＥＧスペーサーをＲＮＡ
ｓの新たな富化プールにライゲートさせる工程６が必要である。工程１〜６の反
復は工程５後に得られたＲＮＡの促進活性をさらに富化させることができる。さ
らに、シクロヘキセン目的生成物の結合アフィニティは最大に達することができ
る。種々なＲＮＡｓをクローニングし、配列決定することによって、ＲＮＡプー
ルが今や非ランダムであると想定すると、個々のＲＮＡ分子をそれらの促進活性
に関して試験することができる。これらのＲＮＡ分子を同じ第１及び第２反応物
ジエノフィルとジエンによって処理すると、必然的に、同時発生シクロヘキセン
目的生成物の形成が生ずる。充分な量のＲＮＡ促進体を製造した後に、１種類の
又はシリーズのシクロヘキセン目的生成物の構造を慣用的な分光法によって解明
する。
【００６１】 上記実施例は単一の第１反応物ジエノフィルの１０第２反応物ジエンのプール
による処理に関するものであった。多くの異なる第１反応物ジエノフィルをライ
ゲーション配列に単に付着させることによって、この同時発生プロセスに含まれ
る第１反応物ジエノフィルの数を拡大することができる。同時発生、クローニン
グ及び配列決定後に、次に、この促進性ＲＮＡによって形成される個々の目的生
成物が分光的構造同定を可能にするほど充分な量で製造されうるように、個々の
ＲＮＡ促進体を第１及び第２反応物ジエノフィルとジエンの混合物によって処理
する。上記に示したＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ例では、第１反応物ジエノフ
ィルをＲＮＡに付着させるので、促進性ＲＮＡ(facilitating RNA)が付着した第
１反応物ジエノフィルの反応に対して、他のＲＮＡに付着した第１反応物に比べ
て、特異的であることが想定される。単一の促進性ＲＮＡの第１及び第２反応物
ジエノフィルとジエンのプールによる処理は、第２反応物ジエンに関しては、こ
れが選択されたものであるので、非常に特異的な反応を生じるが、第１反応物ジ
エノフィルに対しては、これは選択中に付着するので、あまり選択性でないこと
が判明しうる。
【００６２】 他方では、第１及び第２反応物の両方が変化する場合には、両方の反応物に対
する特異性を得ることができる。改良実施態様は、図３に示すように特定の核酸
に付着する、したがってマトリックスの拡大を可能にする、第１反応物ジエノフ
ィルをコードするライゲーション配列を用いることであると考えられる。このア
プローチを用いると、個々の促進性ＲＮＡｓのクローニング及び配列決定時に、
ライゲーション部位の配列は、ＰＥＧリンカーを介してそれに付着した第１反応
物ジエノフィルを示すと考えられる。この方法では、特定の促進性ＲＮＡに対応
する第１反応物ジエノフィルのみが、発生する目的生成物の最終的製造に用いら
れると考えられる。単一の第１反応物ジエンをＲＮＡライゲーション配列に付着
させ、第２反応物ジエノフィルのプールを工程１に導入する、図２に提案した実
験に対する補足実験を用いることができないという理由が存在しないことを注目
すべきである。多重の第１反応物と１つの第２反応物とを用いることも可能であ
る。 Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒは、多くの非常に強力な非対称的(asymmetric)結合形
成反応の１つに過ぎない。
【００６３】 Ｂ．アルドール反応 合成および生合成化学において有用な別の反応型は、アルドール縮合である。
ディールス・アルダー反応について考察した基本概念が、一つまたはそれ以上の
アルデヒドが一反応体であり、一つまたはそれ以上のケトンが別の反応体である
ようなアルドール反応に応用される。アルドール縮合にＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥ
ＬＥＸプロセスをどのようにして仕立てるかの論理的変形が、以下の実施例およ
び図４Ａ−４Ｃに記載されている。ＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、転写のための３
’または５’固定領域から成り立っている。ＲＮＡへの結合は、最初の反応体ア
ルデヒドを有するＰＥＧリンカー（２０−５０エチレン・ユニット長）である。
最初の反応体アルデヒドは、第二の反応体ケトンに比べてその大きな反応性によ
って、アルドール反応において求電子剤として作用する。Ａで標識されたＲＮＡ
のプールは、異なった構造モチーフにたたみ込まれる。異なった化学基Ｒ1およ
びＲ2とＢ1-10で標識された第二の反応体ケトンは、図４Ａのステップ１でＡと
処理される。この例において、ＲＮＡは、ケトンのカルボニルに付加することが
でき、Ｃ1-10、Ｄ1-10、Ｅ1-10、およびＦ1-10で示されるエナミンを形成するア
ミンを含んでいる。ＲＮＡの形は、Ｅ−またはＺ−エナミンが形成されるかどう
かによって決定される。エナミンは、アルドール反応において、付属するアルデ
ヒドと共に求核剤として作用する。エナミンの周囲のＲＮＡの立体的および電子
的環境が、与えられたＲＮＡ配列に観察されるエナンチオ選択性の程度を決める
。 この実施例の目的のために、アルドール縮合産物Ｇ1-10、Ｈ1-10、Ｇ* 1-10お
よびＨ* 1-10が、同じ面から第一の反応体アルデヒドの攻撃により誘導された。
もし、第一の反応体アルデヒドの異なったエナミンおよび相対的配向が起こると
、そしてこれは起こりそうであるが、反対の面からのアプローチによって同じ産
物が形成される可能性がある。二つの新しいキラル中心が、全ての４０の産物が
Ｇ1-10、Ｈ1-10、Ｇ* 1-10およびＨ* 1-10で代表されるように形成されることが重
要である。アルドール産物Ｇ1-10／Ｇ*は、Ｈ1-10／Ｈ* 1-10のようにエナンチオ
マーである。 水中では、Ｇ1-10、Ｈ1-10、Ｇ* 1-10およびＨ* 1-10のイミン結合は可逆的であ
り、加水分解されて相当するβ−ケトアルコール産物を与える。最高の親和性を
選択することによって、所望の産物であるβ−ケトアルコールは、ビオチンまた
はカラム支持体に結合したタンパク質標的で得られた産物のライブラリーを分配
することによって達成される。平衡の後、選択されたＲＮＡは、図４Ｃのステッ
プ３−５により示された標準ＳＥＬＥＸ技術によって増幅される。折りたたまれ
たときステップ５の後で得られるＲＮＡは、Ｇ1-9により示されたアルドールβ
−ケトアルコール産物を形成する活性な触媒である。 最高レベルの促進が達成されると、あるいは標識に対する結合の親和性が一様
になると、所望の産物に関連した促進されるＲＮＡをクローン化し、配列が決定
される。促進されるＲＮＡは別に調製することができ、所望の産物であるそれら
の相当するβ−ケトアルコールの合成が、単離するに充分なスケールで完成され
、分光学的方法により構造特性が決定される。 ディールス・アルダーの例では、Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスで採
用される第一の反応体アルデヒドのアレーは、ＰＥＧリンカーへの別の第一反応
体に接着し、第一の反応体アルデヒドがその核酸に結合する連結配列をコードす
ることによって拡張することができる。 上記に考察したディールス・アルダーの例から、４の因子が二つの立体中心を
造るために得られる。しかし、アルドール縮合は、これよりもより多くの可能性
を形成する潜在能力を有している。二つのケトンが、カルボニル炭素に比較し得
る求電子性とα炭素に類似した求核性を有する第一および第二の反応体として使
用される混合アルドール反応を考えてみる（図５）。有機合成に典型的な、この
型の反応は非常に複雑な産物の混合物が生じるので避けるべきである。Ｐａｒａ
ｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ戦略では、この多様性の増加は、更なる有利な点と成り得
る。構造Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪは、全て異なったジアステレオマ
ーである。これらのそれぞれの産物は、相当するエナンチオマーを有し、それは
図４の混合アルドール縮合反応に対して、異なった構造の１６００の産物が元の
２０（Ａ1-10およびＢ1-10）から生成することを意味している。
【００６４】 Ｃ．［２+２+２］シクロ三量体化反応 促進ＲＮＡおよび所望の産物の両者の平行選択（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｌｅ
ｃｔｉｏｎ）および共進化は、キラル中心を創造する構造を有する産物の形成に
限定されない。多くの重要な医薬化合物が、付随するキラル置換体を有するアキ
ラル（ａｃｈｉｒａｌ）芳香基を含んでいる。芳香環系（ベンゼン、ナフタレン
、ピリジンなど）を含む産物を構築する強力な方法の一つは、第一、第二、第三
の反応体アルキンのシクロ三量体媒介シクロペンタジエニルコバルト（ＣｐＣｏ
）である。［２+２+２］シクロ三量体化反応は、アルキン反応体に限定されるも
のではなく、非芳香属６員環産物も、アルキンおよびアルケン反応体を結合する
ことによって組みたてることができることに注意すべきである。 ここに考察する実施例は、本発明の実施態様を含み、そこでは有機金属触媒が
ＲＮＡ（またはＤＮＡ）に取り込まれ、そのＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロ
セスにおける使用である。上記および図２および４に示したステップ１−６は、
Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスに一般的なものであり、それで生成する
可能性のある数の産物の構造におけるシクロ三量体化反応の影響のみをここでは
考察する。ベンゼン環を含む産物を形成する三つのアルキン反応体のシクロ三量
体化反応のために、最大数の可能性が、各反応体の各末端に結合した異なった置
換体を有する三つの異なったアルキン反応体を使用して得られる（図６に描写）
。 図６に示すアルキン反応体のシクロ三量体化のために、可能性のある位置異性
体は４ＭＮ2種類ある。ここでＭ＝ＲＮＡに結合した非対称的アルキン第一反応
体の数、およびＮ＝ＲＮＡ第一反応体混合物に接触する遊離非対称的アルキン第
二、第三の反応体の数である。図６は、３種類のアルキン反応体のみの可能性の
マトリックスを示した。ここで、第一の反応体は、ＲＮＡに結合しており、第二
、第三の反応体は遊離である。もし、Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスを
、ＲＮＡ分子に結合した１０種類のアルキン第一反応体および１０種類の第二、
第三の反応体に拡張したならば、４０００種類のベンゼン産物ができる。 アルキン反応体のＣｐＣｏ触媒シクロ三量体化の機構は、図６の最下パネルに
示される。ＣｐＣｏ（またはアルキンを環化し得るその他の金属複合体）を上記
したようにオリゴヌクレオチドに結合することによって、シクロ三量体化促進Ｒ
ＮＡを形成することが可能である。有機金属中心の周囲に折れ曲がったＲＮＡ構
造は、図６Ｃ、Ｂ→ＣまたはＣ→Ｄに描写した結合形成ステップのいずれかに選
択性を与えるポケットを供給する。Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスの分
配を採用することによって、所望するベンゼン産物の合成の特異性を提供する。
促進するＲＮＡの充分量のクローニングおよび調製において、共進化芳香属産物
が、選択に使用したアルキン反応体の混合物とＲＮＡを処理することによって調
製され得る。得られた芳香属産物は、通常の方法により構造的に特徴づけられる
。
【００６５】 Ｄ．逆合成戦略 一般的に、全てのＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸスキームは、上記したように
および図２、４に示したように、共通してステップ１−６を有していることが予
見される。異なった化学では、生成する産物の型および数が変わるだけである。
Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスに包含されるには、どの化学が最良かを
考慮するとき、関連する構造産物のクラスの逆合成解析を行うことは価値あるこ
とである。図７を考慮して、産物の可能性のある結合切断を示した。切断Ａは、
ディールス・アルダー転移を、Ｂはアルドール縮合を含む。これら結合形成反応
の両者は、上記に考察した。この産物を製造するに多くの他の切断がある。一般
的に、環形成産物転移を含む逆合成戦略は、多くの数の結合あるいは立体中心が
生じるので、望ましい。Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸプロセスのどの型の反応
が最も強力かを考慮するとき、別の因子も考慮する必要がある。例えば、試薬の
入手可能性および反応条件下でのオリゴヌクレオチドの反応性および安定性であ
る。著しく重要なことは、生じる可能性のある立体および位置異性体産物の数で
ある。ディールスアルダーおよびアルドール縮合は、新規立体中心の形成の結果
として多くの産物を創製する可能性を有しているので、逆合成経路Ｃは、多くの
位置異性体を提供することができる。本発明は、一つないしそれ以上の促進する
核酸および二つないしそれ以上の異なった反応体を、本発明の産物をつくるため
に、同時にまたは連続して、包含することができる。 Ｅ．反ＳＥＬＥＸ戦略 Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ方法論に固有のものとして、所望の機能に基づ
いた小分子の選択がある。これは、所望の機能と特異性を有する小分子の選択に
拡張することができる。特異性は、非所望の「標的」（反ＳＥＬＥＸ、負の選択
、あるいは反対の選択）と相互作用することができる産物に結合したＲＮＡを先
ず抽出し、次いで所望の標的について正の選択をすることにより、選択プロセス
の間必要とされ得る。この技術の応用は、限定的ではないが、多アイソフォーム
酵素の単一アイソフォームとのみ反応する小分子の選択、レセプターファミリー
に結合することのできる小分子の選択、近接して関連するレセプター間を区別す
ることのできる小分子の選択、哺乳類の対応部分を阻害しない真核病原体の重要
な酵素／レセプターの小分子阻害剤の選択などを包含する。 この技術に応用し得る標的の例としては、限定ではないが、シクロオキシゲナ
ーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ、および真菌チトクロームＰ−４５０
を包含する。シクロオキシゲナーゼ、抗炎症剤の標的、は古典的プロスタグラン
ジン（ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、
およびトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）の形成を終局的に誘導するアラキドン酸
の過酸化を触媒する。現在得られる阻害剤は、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡ
ＩＤＳ）を含み、プロスタグランジン阻害に由来する消化管潰瘍形成は、これら
の薬物の完全に普通な副作用である。標的酵素の２つのアイソマー、Ｃｏｘ１と
Ｃｏｘ２、がある。Ｃｏｘ１イソ酵素は、ほとんどの細胞型で構成的に発現して
いるが、Ｃｏｘ２は単球でＬＰＳによりおよび繊維芽細胞（炎症組織はＣｏｘ２
を発現する）におけるＩＬ−１により急速に誘導される。Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓ
ＥＬＥＸ法／反ＳＥＬＥＸ法の応用により、Ｃｏｘ１と交差反応しないＣｏｘ２
の小分子阻害剤を選択することが可能となった。Ｃｏｘ２の選択的阻害は、消化
管糜爛がない抗炎症活性をもたらすことが期待される。 ＩＩ型イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＩ型ＩＭＰデヒドロゲナーゼ）
は、重要な免疫抑制剤の標的である。ＩＭＰデヒドロゲナーゼを必要とするグア
ノシンヌクレオチドのｄｅ ｎｏｖｏ合成は、抗原性および変異原性促進にヒト
ＴおよびＢリンパ球の増殖応答を必要とするように見える。Ｉ型ＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼは、リンパ球を含む静止細胞で発現されるが、ＩＩ型ＩＭＰデヒドロゲ
ナーゼは、ＴおよびＢリンパ球が増殖シグナルに応答するときに急速に誘導され
る。Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法／反ＳＥＬＥＸ法は、Ｉ型酵素に交差反応
が少なくあるいはしないでＩＩ型酵素の小分子阻害剤（免疫抑制剤リード）を選
択するのに使用することができる。 真菌チトクロームＰ−４５０は、重要な抗真菌剤標的であり、どのようしして
Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法／反ＳＥＬＥＸ実験が実行されるか、の例とし
て使用される。Ｐ−４５０の機能は、エルゴステロール（真菌細胞膜成分）合成
のステップである、ラノステロールのＣ１４脱メチル化である。現在、アゾール
抗真菌剤（イミダゾールおよびトリアゾール）は、このチトクロームを標的とし
ている。 真菌チトクロームＰ−４５０の特異的阻害剤を同定する可能性のある方法はこ
こに概要を記する。第一に、生産物ライブラリーが、第１反応体に関連したＲＮ
Ａｓと遊離反応体と反応することによって生産される。次ぎに、生産物ライブラ
リーは、多くの可能性のある分配プロトコール（別に記載する）の一つを使用し
て、最も好ましくは固形支持体上に固定化した哺乳類チトクロームＰ−４５０と
接触させることにより、哺乳類チトクロームＰ−４５０と接触させる。哺乳類チ
トクロームに対する親和性のプロトコールは、次いで、生産物ライブラリーの残
りと分配される。哺乳類チトクロームによって保持されない生産物は、回収され
、真菌チトクロームＰ−４５０と、多くの既述の分配方法の一つによって、接触
させられ、それによって真菌チトクロームに特異性を有する生産物が、生産物ラ
イブラリーの残りから分配され得る。真菌チトクロームに対して増加した親和性
を有する生産物は、回収され、それらに関連する核酸が増幅される。選択と増幅
プロセスが、核酸のプールがそれらに関連した産物の同定ができるように促進さ
れた核酸が充分に豊富になるまで、繰り返される。 公知のＰ−４５０阻害ファルマコフォーのＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ逆合
成分析は、以下の図式に示され、どのようにして反応体が選択されるかの、非限
定的例示とされる。
【００６６】 大多数の逆合成戦略をもくろむことができる。二つの自明な、しかし非制限的
な戦略は上記スキームのＡとＢにより示されている。２，４−二置換芳香族カル
ボニル化合物から出発して、Ｒ1での縮合により対応するベンジルアルコールが
得られる。戦略Ａに用いることができるタイプの反応の例は、Ｒ1がアルデヒド
、ケトン、及びエステル、カルボン酸、ニトリル、又はアミドであるアルドール
及びクライゼン縮合を包含するが、これらに制限されるものではない。さらに、
戦略Ａはイミダゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、キノリン、イン
ドール、オキサゾール、ピリミジン及びプリンを包含するヘテロ環化合物のアル
キル化を伴うことができる。あるいは、戦略ＢはＸ及び又はＸ’がカルボン酸と
ＢｒとI以外のすべての官能基から選ばれ得る環状三量化反応において三つとい
う多くの異なるアルキンを反応させるものである。Ｒ及び／又はＲ’は同じであ
っても異なってもよく、カルボン酸とＢｒとI以外のすべての官能基の群から選
ばれる。
【００６７】 Ｆ．セレクチン平行ＳＥＬＥＸ法 セレクチンの天然の細胞表面ターゲット、例えばシアリルルイスＸへの結合は
炎症の原因となる症状のカスケードにおける重要な工程として関連付けられてい
る。この工程を阻害する分子は他のセレクチン仲介症状を防止することに加えて
抗炎症剤として役立つ可能性を持っている。以下に小分子セレクチンリガンドを
引き出すための二つの平行ＳＥＬＥＸ戦略を概説する。
【００６８】 二つの平行ＳＥＬＥＸ実験の一般的スキームを以下に示す。両者とも化合物の
ライブラリーと組合せる誘導された糖が関与している。一つのケースでは、糖は
ミカエル付加様式でα，β不飽和カルボニル化合物と反応し得る求核官能性を持
っている。もう一つの戦略は、同じセットのα，β不飽和カルボニル化合物又は
ジエノフィルの全く異なるライブラリーのいずれかとディールス−アルダー環状
付加を起こすジエン官能化糖が関与している。示された例は天然のリガンドのＬ
−フコースへの類似性の故に、誘導体化された糖としてＤ−マンノシドを利用し
ているが、主として適当に官能化された分子であればいずれも関与し得る。同様
にミカエルアクセプター／ジエノフィルライブラリーにも制限がないが、α，β
不飽和カルボニル化合物の広範なプールを発生させるための一つの好都合な戦略
の概略を以下に述べる。ライブラリーにおける一定の官能性のためのバイアスは
シアリルルイスＸ類似体として知られる結合要求に基づいて慎重であるべきであ
ろう。例えば、シアリル酸の負の電荷の保存は結合にとって重要であることが示
されている。その結果、ミカエルアクセプター／ジエノフィルライブラリーは分
子上のどこかに負の電荷を有する大きな分子集団を含むべきである。最終的には
、分離はいくつかの方法で行うことができるが、シアリルルイスＸ結合部位に発
生した小分子が結合することを保証する方法が好ましい。これらは遊離のシアリ
ルルイスＸ又は公知の競合剤で抽出すること、又は要求されるカルシウムイオン
をＥＤＴＡのようなキレーターでタンパクから除去することを包含するが、それ
らに限定されるものではない。
【００６９】 Ｇ． Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法を用いたピリジン化合物の合成 数多くの天然の酵素コファクター及び薬品は誘導体化されたピリジン類であり
、その若干を以下に示す。例えば、ニトロピリジン類はよく知られた抗ガン剤で
ある。ニトリル−環三量体化反応であるＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法を用い
れば、機能化されたピリジンファーマコフォアに一歩近づくことが可能のようで
ある。例えば、ピリドキサル（ビタミンＢ6）依存酵素を阻害するピリジン誘導
体類は、鍵となる反応中間体を模倣することによって生成させることができる。
ニコチン酸及びニコチン受容体をターゲットとして同様の実験を行うことができ
る。上記方法により合成できる、代表的な化合物を以下に示す。 ＩＶ． 投与及び用法 本発明の望ましい生成物の適用には、治療、予防、診断、美容など種々の用途
が含まれる。化学品が望ましいとされる用途はすべて本発明の範囲内である。具
体的な健康状態の種類には、炎症、心臓血管障害、腫瘍、代謝障害、寄生虫病及
び伝染病が含まれるが、これらに限定されるわけではない。より具体的には、本
発明の生成物は、ガン、アンギナ、関節炎、喘息、アレルギー、鼻炎、ショック
、炎症性腸疾患、低血圧の治療又は予防、及び痛みや炎症、傷、火傷、発疹など
の局部的外傷の組織治療のために有用である。 本発明の生成物の好ましい適用には、高血圧及び慢性炎症の治療（アンジオテ
ンシン転化酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍ
ｅ，ＡＣＥ）阻害剤を含む）及び免疫抑制剤、抗菌剤及び抗真菌剤としての使用
が含まれるが、これらに限定されるわけではない。 特に好ましいターゲットには、アンジオテンシン転化酵素、レニン、シクロオ
キシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、ＩＬ−１β転化酵素、サイトカイン受容
体、ＰＤＧＦ受容体、タイプＩＩイノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ、
β−ラクタマーゼ、及び真菌チトクロームＰ−４５０が含まれるが、これらに限
定されるわけではない。ターゲットには、ブラジキニン、ニュートロフィルエラ
スターゼ、ＨＩＶタンパク（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇ、ｉｎｔ、ＲＴ、ヌクレオ
カプシドなどを含む）、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ト
ロンビン、テオフィリン、カフェイン、サブスタンスＰ、ＩｇＥ、ｓＰＬＡ2、
赤血球、グリオブラストーマ、フィブリン凝固塊、ＰＢＭＣ類、ｈＣＧ、レクチ
ン類、セレクチン類、サイトカイン類、ＩＣＰ４、補タンパク、などが含まれる
が、これらに限定されるわけではない。 抗炎症剤は、急性及び慢性の炎症の治療用に使用することができ、シクロオキ
シゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、ＩＬ−１β転化酵素（ＩＬ−１β Ｃｏｎ
ｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ，ＩＣＥ）、及びサイトカイン受容体（例、ＩＬ
−１及びＴＮＦ受容体その他プロ炎症性サイトカインに対する受容体）の阻害剤
を含むことができる。 ターゲット酵素には、Ｃｏｘ１とＣｏｘ２の２種のイソ型がある。Ｃｏｘ１イ
ソ酵素は過半の細胞型において構造的に表現されるのに対して、Ｃｏｘ２はモノ
サイト類中のＬＰＳによって及びフィブロブラスト中のＩＬ−１によって迅速に
誘導することができる（炎症性組織はＣｏｘ２を表現する）。Ｃｏｘ２を選択的
に阻害すると、胃腸を荒らすことなく抗炎症活性をもたらすことができる。 ５−リポキシゲナーゼ（これもまたアラキドン酸代謝に含まれる）はロイコト
リエンホルモンの合成のために必要である。この酵素の阻害剤の発生は、それが
いくつかのコファクター（Ｃａ＋＋、ＡＴＰ、リン脂質、など）によって制御さ
れているという事実によって妨げられていた。それゆえ、純粋な形で研究するこ
とは困難である。現今の薬剤先導スクリーニング法は、細胞全体を使用すること
を必要とする。単離酵素を利用するＰａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法は、不可逆
阻害剤の選択（付随的酵素活性分析の必要性を伴う）に適用することができる。 免疫抑制剤は、タイプＩＩイノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（タイ
プＩＩ ＩＭＰデヒドロゲナーゼ）の阻害剤を含むことができる。グアノシンヌ
クレオチドのｄｅ ｎｏｖｏ合成は、抗原性及び突然変異原性刺激に対するヒト
Ｔ及びＢリンパ球の増殖性応答のために必要とされるように見える（Ａｌｉｓｏ
ｎ，Ａ．Ｃ．１９９３．Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。タイプＩ ＩＭＰデヒドロゲナーゼは休眠細胞（リンパ細
胞を含む）において表現され、一方、タイプＩＩ酵素はＴ及びＢリンパ球が増殖
信号に応答すると迅速に誘導される。上記Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法は、
タイプＩＩ酵素に対して高度に特異的な（タイプＩ酵素との交叉反応性が無いか
、低い）薬剤の設計に適用することができた。 抗真菌性製品は、真菌チトクロームＰ−４５０阻害剤を含む。Ｐ−４５０の機
能は、エルゴステロール（真菌細胞膜成分）の合成の一段階である、ラノステロ
ールのＣ１４脱メチル化である。現今のアゾール抗真菌剤（イミダゾール類及び
トリアゾール類）はこのチトクロームをターゲットとしている。上記Ｐａｒａｌ
ｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法は、真菌チトクロームＰ−４５０に対する選択性の改善さ
れた（哺乳類チトクロームＰ−４５０に対する交叉反応性がより低くされた）薬
剤を提供することができた。 ステロイドホルモン作用薬及び拮抗剤として有用な生成物も、本発明に含まれ
る。これらの生成物は、乳ガン、前立腺ガン、及び子宮ガンを治療するのに有用
であろうと考えられる。これらの生成物は、産児制限剤及び関節炎治療薬として
も有用である。 本発明の望ましい生成物は、いったん上記Ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＥＬＥＸ法に
よって同定してしまえば、慣用の化学的合成経路により、もしくは反応体の間の
反応を仲介する、促進性核酸を使用することにより、工業的に製造することがで
きる。本発明の生成物は、非対称原子を単数又は複数含むことができる。この非
対称原子（単数又は複数）は、若干の例を挙げれば、炭素、リン、ケイ素、イオ
ウなどの中から選択することができる。このように、本発明は、個々の立体異性
体、及びそれらの混合物を含む。個々の異性体は、当業界において公知の方法に
より調製し、単離することができる。 上記望ましい生成物は、当業者に知られている、任意の方法により投与するこ
とができる。投与の態様には、経口投与、非経口（静脈、皮下、及び筋肉内）投
与、局所投与、及び粘膜（鼻、呼吸器、など）塗布が含まれるが、これらに限定
されるわけではない。 本発明による治療方法は、治療を必要とする患者に、有効量の上記望ましい生
成物を内的又は局所的に投与することを含む。本発明の方法及び医薬組成物に含
まれる望ましい生成物の用量は、望ましい生成物を一般的には０．０１〜５００
ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される、
効き目があるが、毒にはならない量である。ルーチン臨床試験を用いる当業者は
、治療すべき具体的な疾患に対して最適の用量を決めることができる。その望ま
しい用量は、一般に患者に毎日１〜６回又はそれ以上、静脈、経口、直腸、非経
口、局所的に、又は吸入により投与される。本発明の望ましい生成物の効き目は
、当業者に知られている標準的な方法により求めることができる。 医薬製剤に入れた、投与用の生成物の調製は、当業者によく知られている、種
々の方法により行うことができる。本発明の範囲内において、好適な、医薬品と
して許容可能な塩は、無機酸（例、塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、及
び硫酸）から誘導されるもの及び有機酸（酒石酸、フマル酸、乳酸、シュウ酸、
エチルスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、など）であって、それぞれ、塩酸
塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩、ベンゼンスル
ホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩その他の塩を与えるものから誘導されるも
のである。 本発明の望ましい生成物は、非経口投与用に水性注射溶液に製剤化することが
でき、そこには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、可溶化剤、化学防護剤、などを
含めることができる。即席注射溶液は、希釈剤、分散及び界面活性剤、バインダ
ー及び潤滑剤（これらの材料はすべて当業者によく知られているものである）を
含有してもよい避妊ピル、顆粒剤、又は錠剤から調製することができる。 経口投与の場合、上記望ましい生成物の微粉末又は顆粒は、希釈剤及び分散及
び界面活性剤を用いて（水中又はシロップ中において調製してもよい）、乾燥状
態又は非水サスペンション（懸濁剤を含めてもよい）中においてカプセル又はカ
シェーに製剤化することができる。上記望ましい生成物は、任意のバインダー及
び潤滑剤を含んだ錠剤型で、又は水中又はシロップ中サスペンションで、又は油
剤、又は油中水エマルションで、又は生分解性又は生腐食性ポリマーを原料とす
る徐放型で投与することもでき、香料、防腐剤、懸垂剤、増粘剤、及び乳化剤を
含むことができる。経口投与用顆粒又は錠剤はコーティングすることもでき、そ
の他の医薬品として許容できる薬剤や製剤を利用することもでき、これらはすべ
て医薬品関係の当業者に知られているものである。 固体又は液体担体もまた使用できる。固体担体には、デンプン、ラクトース、
硫酸カルシウム２水和物、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、カンテン、ペクチ
ン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸が含まれる。液体
担体には、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、食塩水、及び水が含
まれる。軟膏やクリームは、種々の、よく知られた親水性及び疎水性基剤を用い
て調製される。局所的貯蔵容器は、公知のポリマー材料（例、所望の放出特性が
得られるように選択された種々のアクリル系ポリマー）を用いて好適に調製され
る。座薬は、標準的な基剤（例、ポリエチレングリコール及びカカオバター）を
原料として調製される。リポソームも本発明の生成物の担体として使用すること
ができる。 更に、本発明の望ましい生成物には農薬としての用途もある。具体的には、上
記望ましい生成物は、除草剤、殺虫剤、成長調節剤などとすることができる。本
発明の生成物の農業目的での使用及び投与は、当業者には知られている。本発明
の生成物は、化学的製造プロセスにおいて使用することもできる。
【００７０】例 以下の例は、本発明の調製方法及び生成物の好ましい実施の態様を説明するた
めのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。例１ 修飾されたヌクレオシドを含む核酸試験混合物の合成及び特性表示 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、天然及び修飾されたヌクレオシドを含む
核酸試験混合物を生成させ、その修飾されたＲＮＡを、例えば、４０ｎｔ５’−
固定領域とそれに続く４０又は１００ヌクレオチドランダム化領域及び２４ヌク
レオチド３’−固定領域からなるｄｓＤＮＡテンプレートから転写した。１のラ
ンダム化領域を有するテンプレートを、（１）ＲＮＡの合成ランダムプールの相
対的効率を試験し、（２）逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ，ＲＴ）実験用ランダムＲＮＡテンプレートを生成させ、（３）ＲＮＡを生成
させて、その塩基構成で特徴づけるために使用した。典型的な転写の例は、下記
例３に挙げる。転写条件は、５’−モノホスフェートＲＮＡを生成するためのＧ
ＭＰを含み、典型的なＳＥＬＥＸ実験におけるＲＮＡの生成中に採用されるのと
同様の条件である。単修飾ＲＮＡライブラリーの合成後、そのＲＮＡを塩基性条
件にて消化し、得られたヌクレオチドを細菌アルカリ性ホスファターゼを用いて
脱リン酸した。次いで、得られた混合物のヌクレオシド構成を、Ｃ１８逆相ＨＰ
ＬＣを用いて分析した。 種々の修飾されたウリジン及びシチジンの合成は、「パラジウム触媒炭素−炭
素カップリング法及び生成物」と題された米国特許第５，４２８，１４９号、１
９９４年６月２２日出願の、「分子間求核置換による既知及び新規な２’−修飾
ヌクレオシドの新規な調製方法」と題された米国特許出願第０８／２６４，０２
９号（現在では米国特許第５，７５６，７０３号、１９９４年１２月１日出願の
、「パラジウム触媒法によるプリンヌクレオシド修飾」と題された米国特許出願
第０８／３４７，６００号（現在では米国特許第５，５８０，９７２号、及び１
９９５年６月２日出願の、「求核試薬及び一酸化炭素を用いたパラジウム触媒ヌ
クレオシド修飾法」と題された米国特許出願第０８／４５８，４２１号（現在で
は米国特許第５，７１９，２７３号に記載されている（これらすべての内容全体
は本願明細書の記載の一部とする）。そのトリホスフェートの合成は、修正され
た文献実施要領（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９８９）５４，６３１−６３５）により、５’−ヒドロキシルヌクレ
オシド類をそれらのトリホスフェートに転化し、続いて、酸性Ｄｏｗｅｘ脱保護
することによって、或いは、ヌクレオシド ５’−モノホスフェート類を、文献
実施要領（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）５５，１８３４）を経由して転
化することによって達成した。それらのトリホスフェートを、イオン交換クロマ
トグラフィ及び／又は水性相として０．０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩
衝液を用いた逆相ＨＰＬＣを通して精製し、それらの1Ｈ及び31Ｐ−ＮＭＲスペ
クトル及び質量分析スペクトルによって特徴付けた。それらトリホスフェート類
の溶液は、遊離のヌクレオシドやヌクレオシド ５’−モノホスフェートについ
て求めたようにして、各λmaxにおけるＵＶ吸収に基づいて定量した。 製造され、トリホスフェートに転化された、修飾ピリミジンの若干の例を下記
に示す。ここには、５−ベンゾイルウリジン（ＢｅｎｚＵ）、５−ピリジルメチ
ルウリジン（ＰｙｍｅＵ）、５−エチレンジアミンウリジンカルボキシアミド（
Ｎ−ＴＦＡ−ｅｎＵ）、５−イミダゾールウリジンカルボキシアミド（ｉｍｉｄ
Ｕ）、５−ピリジルメチルシチジンモノホスフェートカルボキシアミド（ｐｙｍ
ｅＣＭＰ）、及び５−イミダゾールシチジンモノホスフェートカルボキシアミド
（ｉｍｉｄＣＭＰ）が含まれている。
【００７１】例２ 反応物質−リンカー化合物の合成 平行（Parallel）SELEX法の一の態様において、化学反応物質はリンカー基を
通じて核酸試験混合物に結合される。この例は化学反応物質をPEG分子にカップ
リングすることにより、幾つかの反応物質−リンカー化合物を作製する方法を例
証する。幾つかの化学反応物質が、モノ−アミノPEG2000（「アミノPEG」）へと
変換されたPEG2000を用いる幾つかの技法により、2000MW PEGへとつなげられた
。以下は、ジエン（環状及び非環状）、脂肪族ケトン、芳香族ケトン、β−ケト
アミド、アルキン（末端及び内部）、並びにビオチン部分と結合したPEG化合物
の例である。これらのPEG化合物は続いて、標準的な方法により対応するホスホ
ールアミダイト（phosphoramidites）へと変換された。保護されたPEGリンカー
へとカップリングされた反応物質を次に、DNAの10−merの5’末端に結合させた
（ランダム核酸試験混合物とのリゲートを容易にするため）。このリストは、PE
G化合物への結合に近付くことができる化学基を含むことを意図されている訳で
はない。反応物質−PEG−DNA部分は、次に、例えば、例１またはSELEX特許出願
に記載されたような、核酸試験混合物へとカップリングされた。このカップリン
グ反応は、例３に記載されている。
【００７２】PEG−非環状ジエン合成 以下の工程を、下記スキームに示す通り、PEG−非環状ジエン、特に2,3−ヘキ
サジエニルPEG2000カルバメートを調製するために行った。 2,4−ヘキサジエニル−p−ニトロフェニルカルボナートを以下の通りに調製し
た。アルゴン雰囲気下で、1.0mL（8.87ミリモル）の2,4−ヘキサジエン−1−オ
ール及び2.0mL（11.5ミリモル）の無水ジイソプロピルエチルアミンを100mLのCH
Cl3中に溶解し、氷浴により5℃まで冷却した。この混合物に、10mLのCHCl3中に
溶解した1.97g（9.76ナノモル）のp−ニトロフェニルクロロホルマートを、攪拌
しながら30分かけて滴下により加えた。反応混合物を、ゆっくりと室温まで戻し
ながら、さらに5時間攪拌した。混合物を次に50mLの食塩水により洗浄した。水
層をCHCl3で逆抽出し（50ml×2回）、有機部分を合わせて、MgSO4上で乾燥し、
溶媒を減圧下で取り除いた。
【００７３】 生成物を残留する黄色の固体から、エタノールからの再結晶により精製し、1.
94g（83％）のカルボナートを白色の針状物として得た。TLC：Rf＝0.39（へキサ
ン）。化合物をその1H及び13C NMRスペクトルに基づき特徴付けした。
【００７４】 2,4−ヘキサジエニルPEG−2000カルバメートを以下のように調製した。30mLの
CHCl3中の500mg（0.25ミリモル）のPEG−2000と42mg（0.275ミリモル）のDBUの
攪拌している溶液中に、室温で、72mg（0.275ミリモル）の2,4−ヘキサジエニル
−p−ニトロフェニルカルボナートを加えた。反応を室温で攪拌しながら、一晩
進行させた。当該溶液を次に飽和NaHCO3（50mL×6回）及び食塩水（50mL×1回）
で洗浄した。クロロホルム相をMgSO4上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、僅
かに黄色の、ワックス状のオイルを得た。生成物を、フラッシュシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（7％MeOH／CH2Cl2）によりさらに精製し、184mgの無色固
体を得た。所望の生成物の同定は、1H NMRにより確認された。
【００７５】PEG−環状ジエン合成 以下の工程を、下記スキームに示す通り、PEG−環状ジエン、特にPEG−N−ア
セチルシクロヘキサジエン、を調製するために行った。
【００７６】 PEG−シクロヘキサジエン鉄トリカルボニル錯体を以下のように調製した。３m
Lの無水DMF中の250mg（0.8ミリモル）のシクロヘキサジエニリウム鉄（0）トリ
カルボニルテトラフルオロボラートの攪拌した溶液に、0℃で4mLの無水DMF中の1
.6g（0.8ミリモル）のアミノPEGの溶液を加えた。溶液を室温までゆっくりと暖
めた後、真空下で濃縮した。残留物を10mLのTHF中に懸濁し、生成物を沈殿させ
るために200mLのジエチルエーテルを加えた。青白い黄色の固体が得られ、それ
らを真空濾過により集めて1.46g（粗収率81％）の、1H NMRスペクトルにより確
認された生成物を得た。
【００７７】 PEG−シクロヘキサジエンを以下のように調製した。4mLのメタノール中のPEG-
シクロヘキサジエン鉄錯体500mg（0.22ミリモル）の溶液に、42mg（0.22ミリモ
ル）のp−トルエンスルホン酸を加えた。当該溶液を−15℃まで冷却し、1mLのCH 2 Cl2を加えて反応物質を溶解した。次にセリン硝酸アンモニウム（263mg、0.48
ミリモル）を固体として加え、溶液を−15℃で40分間攪拌した。次に溶液を周囲
の温度まで暖め、真空下で濃縮した。残留物を150mLの2：1の食塩水：酢酸エチ
ル中に溶かし、100mLの濃NaHCO3水溶液で塩基性として、20％のCH2Cl2／酢酸エ
チル50mLで4回抽出し、有機抽出物を真空下で濃縮し、369mg（粗収率79％）の1H
NMRスペクトルにより確認された生成物を得た。
【００７８】 PEG−ジアセチルシクロヘキサジエンを以下の通りに調製した。5mLの無水ピリ
ジン中369mg（0.17ミリモル）の上記PEG−シクロヘキサジエンの溶液中に、35.3
μL（0.37ミリモル）の無水酢酸を加えた。溶液を周囲の温度で一晩攪拌し、さ
らに16μLの無水酢酸を加えた。1時間後、混合物を真空下で濃縮した。残留物を
120ｍLの2：1の食塩水：酢酸エチルに溶かし、50mLの酢酸エチルで4回、つぎに2
0％のCH2Cl2／酢酸エチルで2回抽出し、抽出物を合わせて真空下で濃縮して、26
0mg（粗収率61％）の1H NMRスペクトルにより確認された生成物を得た。
【００７９】 PEG−N−アセチルシクロヘキサジエンを以下の通りに調製した。3mLのメタノ
ール中の260mg（0.12ミリモル）のジアセチル化PEG−シクロヘキサジエンの攪拌
されている溶液に、１mLのH2O中の163mg（1.2ミリモル）のK2CO3の溶液を加えた
。溶液を周囲の温度で一晩攪拌し、真空下で濃縮した。残留物を60mLの2：1食塩
水：酢酸エチル中に溶かし、40mLの20％のCH2Cl2／酢酸エチルで2回抽出した。
抽出物を合わせて、真空下で濃縮し、残留物を2mLのTHFに溶かし、ガラスウール
の栓を通して濾過して、100mLのジエチルエーテルを加えた。得られた白色の固
体を真空濾過により回収し、高真空下で乾燥して、119mg（収率46％）の1H NMR
スペクトル及び質量分析により確認された生成物を得た。
【００８０】PEG−ケトン合成 PEG−アセトフェノン合成 以下の通りにPEG−アセトフェノンを調製した。アルゴン雰囲気下で、2.0ｇ（
1.0ミリモル）のPEG−2000を乾燥THF中に溶かし、287mg（1.1ミリモル）のｐ−
（N-ヒドロキシスクシンイミジル）−カルボニルアセトフェノンで処理した。混
合物を室温で2時間攪拌し、その後、PEGをエーテルの添加により沈殿させて濾過
により単離した。残留の白色固体をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（
７％MeOH／CH2Cl2）により精製し、450mgの所望の生成物をワックス様の固体と
して得た。生成物の同定を1H NMRにより確認した。
【００８１】PEG−アセチルアセトアミドの合成 PEG−アセチルアセトアミドを以下のように調製した。2mLの無水DMF中の300mg
（0.18ミリモル）のアミノPEGの溶液に、36mg（0.15ミリモル）のN-ヒドロキシ
スクシンイミジルアセトアセタートを加えた。溶液を周囲の温度で2日間攪拌し
、真空下で濃縮した。残留物を5mLのTHF中に懸濁し、100mLのジエチルエーテル
を加えて生成物を沈殿させた。白色固体を真空濾過により回収し、262mg（収率7
0％）の1H NMRスペクトルにより確認された生成物を得た。PEG−4−アセチルブチルアミド合成 PEG−4−アセチルブチルアミドを以下の通りに調製した。25mLの無水CH2Cl2中
の0.5mL（4.2ミリモル）の4−アセチル酪酸の攪拌している溶液に、1.6g（6.3ミ
リモル）のジスクシンイミジルカルボナート及び644μL（4.6ミリモル）のトリ
エチルアミンを加えた。当該溶液を周囲の温度で一晩攪拌し、真空下で濃縮した
。残留物を30％の酢酸エチル／へキサンを用いたシリカ上のフラッシュカラムク
ロマトグラフィーにより精製し、668mg（収率70％）の、1H NMRスペクトルによ
り確認されたNHSエステルを得た。
【００８２】 3.0mLの無水DMF中の55mg（0.24ミリモル）の4−アセチル酪酸NHSエステルの溶
液に、400mg（0.2ミリモル）のアミノPEGを加えた。溶液を周囲温度下で一晩攪
拌し、真空下で濃縮した。残留物を10mLのTHFに溶かし、ジエチルエーテル200mL
を加えて生成物を沈殿させた。形成した白色固体を真空濾過により回収し、高真
空下で乾燥して、334mg（収率66％）の1H NMRスペクトルにより確認された生成
物を得た。
【００８３】PEG−アルキン合成 PEG−2−ブチンアミドの合成 以下の通りにPEG−2−ブチンアミドを合成した。20mLの無水CH2Cl2中の250mg
（3.0ミリモル）の2−ブチン酸の攪拌している溶液に、619mg（3.0ミリモル）の
1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドと、345mg（3.0ミリモル）のN-ヒドロキ
シスクシンイミドを加えた。当該溶液を1.5時間攪拌し、固体を濾過により除去
し、真空下で濃縮した。残留物を40％の酢酸エチル／へキサンを用いたシリカ上
のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、448mg（収率83％）の、1 H NMRスペクトルにより確認されたNHSエステルを得た。
【００８４】 2mLの無水DMF中の300mg（0.15ミリモル）のアミノPEGの攪拌されている溶液に
、33mg（0.18ミリモル）の2−ブチン酸NHSエステルを加えた。溶液を周囲温度下
で一晩攪拌し、真空下で濃縮した。残留物を15mLのTHF中に懸濁し、ジエチルエ
ーテル200mLを加えて生成物を沈殿させた。形成された白色固体を真空濾過によ
り回収し、高真空下で乾燥して、280mg（収率75％）の1H NMRスペクトルにより
確認された生成物を得た。
【００８５】PEG−4−ペンチンアミド合成 PEG−4−ペンチンアミドを以下の通りに調製した。20mLの無水CH2Cl2中の250m
g（2.5ミリモル）の4−ペンチン酸の攪拌している溶液に、515mg（2.5ミリモル
）の1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドと、288mg（2.5ミリモル）のN-ヒド
ロキシスクシンイミドを加えた。当該溶液を周囲温度下で一晩攪拌し、固体を濾
過により除去し、溶液を真空下で濃縮した。残留物を40％の酢酸エチル／へキサ
ンを用いたシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、
367mg（収率75％）の、1H NMRスペクトルにより確認されたNHSエステルを得た
。
【００８６】 2mLの無水DMF中の300mg（0.15ミリモル）のアミノPEGの攪拌されている溶液に
、35mg（0.18ミリモル）の4−ペンチン酸NHSエステルを加えた。溶液を周囲温度
下で一晩攪拌し、真空下で濃縮した。残留物を15mLのTHF中に懸濁し、ジエチル
エーテル200mLを加えて生成物を沈殿させた。形成された白色固体を真空濾過に
より回収し、高真空下で乾燥して、214mg（収率57％）の1H NMRスペクトルによ
り確認された生成物を得た。
【００８７】PEG−ビオチンアミド合成 PEG−ビオチンアミドを以下の通りに調製した。2mLの無水DMF中の400mg（0.2
ミリモル）のアミノPEGの攪拌している溶液に、82mg（0.24ミリモル）のビオチ
ンNHSエステルを加えた。当該溶液を周囲温度下で4日間攪拌し、真空下で濃縮し
た。残留物を6mLのTHF中に懸濁し、ジエチルエーテル150mLを加えて生成物を沈
殿させた。形成された白色固体を真空濾過により回収し、高真空下で乾燥し、41
1mg（収率92％）の1H NMRスペクトルにより確認された生成物を得た。
【００８８】例３ 核酸−反応物質試験混合物の調製 核酸試験混合物を例１及びSELEX特許出願中に記載されたように調製した。反
応物質を、直接又は、例えば例２に記載されているようなリンカー部分を通して
、のいずれかにより核酸試験混合物にカップリングした。核酸−反応物質試験混
合物の調製を以下の通りに達成した。核酸試験混合物は典型的に特定の5’及び3
’末端によりフランクされている（flanked）隣接ランダム配列の、プライマー
ハイブリダイゼーションを可能とする100またはそれ以上のヌクレオチドを含有
する。Taqポリメラーゼにより合成される二本鎖DNA（dsDNA）分子は、5’末端に
T7 RNAポリメラーゼプロモーターを有し、転写を容易にする。
【００８９】 典型的な転写反応は、最終容量400μLまでで、200pmolのdsDNA、80μLの５X
T7 RNAポリメラーゼバッファー（200mM Tris-pH8.0、60mMのMgCl2、5mMのスペ
ルミジン、25mMのDTT、20％のグリセロール及び0.01％のトリトン（triton）X−
100）、40μLの10mMのATP、40μLの10mMのGTP、40μLの10mMのCTP、40μLの10mM
のUTP（または修飾UTP）、4μLのα［32P］ATP（必要により、10μCi／μL）、3
2μLの250mMのGMP、5μLのRNasin（プロメガ（Promega）、40,000単位（Units）
／mL）、16μLのT7 RNAポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（New E
ngland Biolabs、50,000単位（Units）／mL）及びｄH2Oを含む。37℃で一晩イ
ンキュベーションした後、RNAを6％の変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した
。以下に説明する通り、5’モノホスファートがRNAのリンカー配列のDNA部分へ
のリゲートのために必要である。
【００９０】核酸試験混合物のDNA−PEG−反応物質へのリゲート リゲート反応は、最終容量100μLまでで、500pmolesの核酸試験混合物、１nmo
leの例2に記載されたDNA−PEG−反応物質、1.5nmolesのブリッジオリゴ（5’−C
TTGTCTCCCGCGTGCCTGG）（配列番号3）、10μLの10X T4 DNAリガーゼバッファ
ー（べーリンガー マンハイム（Boehringer Mannheim）、660mM のTris−HCl
pH7.5、50mMMgCl2、10mMのジチオエリトリトール、10mMのATP）、8μLのT4 DNA
リガーゼ保存バッファー（べーリンガー マンハイム、20mM のTris−HCl pH7
.5、1mMのEDTA、5 mMのDTT、60 mM KCl、50％のグリセロール）、2μLのRNas
in（プロメガ、40,000単位／mL）、8μLのT4 DNAリガーゼ（べーリンガー マ
ンハイム、5単位／μL）及びdH2Oを含有する。RNasin及びリガーゼを除くリゲー
ト反応の全ての成分を混合し、72℃で3分間加熱した。次に溶液をゆっくりと室
温まで（〜10分間）冷まし、RNasin及びリガーゼを加えた。37℃で一晩インキュ
ベーションした後、リゲート生成物を6％の変性ポリアクリルアミドゲル上で精
製した。得られたRNA−DNA−PEG−反応物質が核酸−反応物質試験混合物である
。
【００９１】 例４ディールスアルダー反応を容易にするために未修飾RNAの使用 PEGリンカーの合成 ポリエチレングリコール（PEG）リンカーを合成して、核酸(この場合40N8 RNA
)（配列ID NO:2）と第１反応体（この場合マレイミド）との間のスペーサーと
して作用させる。このリンカーの合成経路は以下に示す。 トシル化PEG（Ts-PEG）（２）の合成−ポリエチレングリコール１、１．０g（
０．６７０ミリモル、平均分子量１５００）を無水THF１５mLに溶解し、溶媒を
真空下除去した。無水THF１５mLに溶解した残りの残査に、DBU５２mg(０．３３
５ミリモル)を加え、ついでp-トルエンスルフォニルクロリド６４mg（０．３３
５ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で１０日間アルゴン下で攪拌し、
白色の沈殿物を生成した。１０日後に、反応混合物を濾過し、溶媒を真空下除去
した。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（７%MeOH/CH2Cl2 )によりモノトシル化生成物を精製し、わずかに黄色の固体（Rf=０．３１）３２
０mg（５８%）を得た。生成物は1HNMRスペクトルにより同定した。 アミノ−PEG（３）の合成−無水DMF２mLにTs-PEG（２）４００mg（０．２４３
ミリモル）を溶解し、ついでアジドリチウム１１９mg（２．４３ミリモル）を溶
解した。アルゴンの雰囲気下攪拌しながら、反応混合物を８０℃で５時間加熱し
た。室温に達してから、混合物をシリカパッドで濾過し、生成物が溶離剤中に検
出されなくなるまで、このパッドを１０%MeOH/CH2Cl2で洗った。合わせた濾液を
減圧下蒸発乾固した。のこりの残査を４mLのMeOHに溶解し、それに３０mgの５%P
d/Cを加え、ついで溶液を水素雰囲気下１６時間で攪拌した。この混合物をセラ
イトで濾過した。セライトパッドはMeOHで洗い、濾液を合わせ、溶媒を減圧下蒸
発させ、灰白色の固形を得た。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（１２%M
eOH・NH3/CH2Cl2）で精製して、白色固体として、２７９mg（７７%）の目的のア
ミノ−PEG生成物（Rf＝０．３８，１５% MeOH・NH3/CH2Cl2）を得た。 FMOC-PEG（４）の合成−アミノ−PEG(3)を75mLの無水THFに８４０mg（０．５
６３ミリモル）を溶解して乾燥しつづいて回転蒸発により溶媒を除去した。アル
ゴン雰囲気下、アミノ−PEGを５０mLの無水THFに溶解し、９−フルオレニルメチ
ル サクシンイミジルカーボネート１９０mg(0.563ミリモル)で処理し、溶液を
室温で２時間攪拌した。ついで溶媒を回転蒸発により除去し、生成物をフラッシ
ュシリカゲルクロマトグラフィ（８%MeOH/CH2Cl2）により精製し、白色固体（Rf
=0.28,10%MeOH/CH2Cl2）８６３mg（９２%）を得た。 FMOC-PEGホスホルアミダイト（５）の合成−FMOC-PEG（４）は無水THF２５mL
に１７３mg（０．１０４ミリモル）溶解して乾燥し、ついで回転蒸発により溶媒
を除去した。アルゴン雰囲気下、FMOC-PEGを無水CH2Cl2２５mLに溶解し、３４．
８mL（０．２０８ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンで処理し、つづいて
２−シアノN,N−ジイソプロピルクロロホスホアミダイト３６．２mL（０．１５
６ミリモル）で処理した．混合物を室温で１時間攪拌した。溶媒と過剰の塩基を
減圧下除去した。目的のホスホルアミダイトをフラッシュシリカゲルクロマトグ
ラフィ（８% MeOH/CH2Cl2）により精製し、白色固体（Rf=０．３０，１０% MeOH
/CH2Cl2）１９０mg（９７%）を得た。 DNA-PEG接合および第１反応体の付加 上記のように合成した保護PEGリンカーをDNA10-merの5’末端に接合し（ラン
ダムRNAとの連結を容易にする）つづいて下記の反応式に示すように第１反応体(
この場合マレイミド)をカップリングさせる。 応用DNAシンセサイザーを使って、DNA10-mer（5’-CCAGGCACGC)(配列ID NO.1)
を合成し、上記の標準ホスホルアミダイト化学物質を使って１段階で合成したFM
OC-PEGホスホルアミダイトを接合した。DNA-PEG接合体をCPG（調整ポアグラス）
固体相支持体から分離し、濃水酸化アルミニウムにて一晩標準インキュベーショ
ン法を使って十分に脱保護し、DNA-PEG遊離アミン種６を得た。各種反応を使っ
てPEG鎖の末端に任意の基質を加えることができる。例えば、アミノDNA-PEGとマ
レイミド−活性化エステル７を反応させて、ディールス−アルダーのためにマレ
イミドジエノフィルを追加して、アミド８を得た。 5’モノ燐酸を有するランダムRNAプールの製造 オペロン（カリフォルニア州アラメダ）から入手した合成、ランダム配列短鎖
DNA(ssDNA)テンプレートから標準SELEXストラテジ技術を使ってランダム配列４
０N８ RNAプール（配列ID,NO.２）を調製した。ランダム領域は、オリゴヌクレ
オチド合成中４つのヌクレオチド混合物（モル比を調整して付加ヌクレオチドの
１:1:1:1比を得る）を使ってランダム領域を生成した。ssDNAは、プライマーハ
イブリッドを行う画定した5’および３’末端の側面にある連続ランダム配列の
４０ヌクレオチドを含んだ。Taqポリメラーゼにより合成した二重鎖DNA(dsDNA)
分子は転写を容易にするために5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有す
る。 各転写反応は、８０μlの５XT7RNAポリメラーゼバッファー（２００mM トリス
−pH8.0,,60mM MgCl2, 5mM スパーマジン、２５mM DTT, 20%グリセロール、０
．０１%のトリトン−X−１００）、４０μlの１０mM GTP,40μlの１０mM CTP,40
μlの１０mM ATP, 40μlの１０mM UTP, ４０μlの５００mM GMP, ８μlのRnasi
n（Promega, ４０，０００単位/ｍＬ），２４μl T7 RNA ポリメラーゼ（ニュー
イングランド・バイオラブ、５０，０００単位/mL）、およびdH2Ｏと一緒にして
１００pモルの４０N8 dsDNAからなり、最終容量４００μlになる。３７℃で一晩
インキュベーション後、5’モノ燐酸RNAは８%変性ポリアクリルアミドゲルを使
って精製した。この5’モノ燐酸はRNAを下記したリンカー配列のDNA部分に連結
するために必要である。 ランダムRNAをDNA-PEG−マレイミドに連結 ランダム配列RNAプールは上記したように生成した。連結反応に使用するDNA10
-mer(配列 ID No.1)とDNAブリッジオリゴ（5’-CTTGTCTCCCGCGTGCCTGG）(配列 I
D No.3)はオペロン（カリフォルニア州アラメダ）から得、使用前にゲル精製し
た。１００pモルのランダム40N8 RNA（配列 ID No.2）は細菌アルカリフォスフ
ァターゼ（Gibco BRL）で脱フォスフォリル化し、ついでT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ニューイングランド・バイオラブ）とγ−[32P]ATPでフォスフォリル化
して末端ラベル化した。 連結反応には５０ピコモルのランダム40N8 RNA、大体６０，０００CPMのラン
ダム、5’-末端ラベル化40N8 RNA, １００ピコモルDNA-PEG-マレイミド、１５０
ピコモルDNAブリッジオリゴ、２．５μL１０XT4 DNAリガーゼバッファー（５０m
M Tris-pH7.8, 10ｍＭ MgCl2, 1 mM ATP, 25mg/mL ウシ血清アルブミン）、０．
５μl RNAasin(Promega, 40,000単位/mL), T4 DNA リカ゛ーセ゛を最終濃度１．２ワ イス単位mL（ニューイングランド・バイオラブ）、およびdH2Oを最終容量２５μ
lを含む。１．２ワイス単位/mLはニューイングランド・バイオラブ単位定義を任
意のカタログに見られる変換因子を使ってワイス単位に変換して得られる（１NE
B=0.015ワイス単位）。 RnasinとT4DNAリガーゼを除く全ての成分を混合し、７０℃で３分間インキュ
ベーションし、そして３７℃未満にゆっくり冷却する。RnaseとT4DNAをついで添
加し、混合物を３７℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーション
後、RNAローディングバッファーを加え、混合物を７０℃で３０分間加熱しつい
で予備加熱８%変性ポリアクリルアミドゲルに担持させた。連結イールドはオー
トジオグラフィにより得た。生成したRNA-DNA-PEG-マレイミドは核酸−反応体試
験混合物である。 ビオチニル化ジエン接合体の調製 NHS-ビオチン（Pierce, 99.3mg, 0.291ミリモル）と２，４−ヘキサジエン−
１−オール（66.2mg, 2.3eq）をアルコ゛ン下０℃で無水ピリジン１０mLに一緒にし、 室温で加温しながら、一晩暗所で攪拌した。TLC（５０%EtOAc/ヘキサン）により
反応混合物を監視し、遅延反応を示し、ついで溶液を一晩アルゴン下で還流させ
た。溶媒を真空除去しついで５%ＭｅＯＨ/EtOAcついで6%MeOH/CH2Cl2によりフラ
ッシュシリカゲルでクロマトグラフィにかけ、精製物９を得、これは1Hおよび1H
COSY NMR スペクトルで同定した。 化学反応 上記で調製した核酸−反応体試験混合物（RNA-DNA-PEG-マレイミド）を次ぎの
条件下で第２反応体（ビオチニル化ジエン）と反応させる。１/２ナノモル（〜
５０，０００cpm）の核酸−反応体試験混合物を５０μLの反応バッファー（１０
mM MES, 200mM NaCl, pH 6.5）に溶解するか、別法として反応バッファーは10mM
Tris, 300mM NaCl, pH 7.0)でよい。この混合物を７０℃で５分間加熱する。つ
いでMgCl2をそれぞれ100μMと１０μMの最終濃度に添加し、溶液をゆっくり室温
に下げた(大体１０分)。ついでビオチニル化ジエンを最終濃度１mMに加え、混合
物を室温で12時間インキュベーションした。ついで溶液を固定化ストレプタビジ
ンカラムにはこび、カラムは１０μM MgCl2を含む反応バッファーで丁寧に洗っ
た。結合RNAはプロティナーゼKで処理しついでカラムを反応バッファーで洗い、
カラムマトリックスから遊離する。別法として、RNAは樹脂に結合したまま逆転
写することができ、あるいはジスルフィド結合ビオチン−ジエン基質を使用する
ことが出来、その場合RNAは５０mM DTTを使ってカラムから溶離させる。プール
の豊富化につづいてcpmの数は標準プロティナーゼK処理にしたがって溶離した。
溶離したRNAはついで逆転写し、生成したcDNA をPCR増幅しそしてdsDNAは代表的
SELEX実験のように転写した。DNA-PEG-マレイミド接合体は上記のようにRNAに連
結し、生成物の量がその構造を決定するのに十分になるまで方法を繰り返した。
【００９２】例５ ジールスアルダー反応を促進するための溶液中における非修正RNA及び金属 の使用 例４の方法を、反応液に金属イオンアルミニウム（III）とコバルト（II）を
含ませて、正確に繰り返した。例６ ジールスアルダー反応を促進するための修正RNA（ピリジン修正UTPに組み込 んだ）の使用 本発明の核酸を、前記した各種方法により修正することができる。修正核酸の
一つ例として、ピリジン型残基を５位に組み込んだ修正UTPを調製した。このピ
リジン修正UTPは、前記したようにランダムRNAに組み込むことができる。修正RN
AはPEGリンカーを通して反応試薬に結合させてジールスアルダー反応の促進に用
いられる。 以下の方法により、ピリジン残基が塩基の５位に結合したウリジントリホスフ
ェート（UTP）誘導体を合成できる。
【００９３】 カルボキシアミデーション ５−ヨードウリジン−２’，３’−イソプロピリデン（０．２２５ｇ,０．５
４５ｍｍoｌ）、Pd（PPｈ3）4（０．１eｑ.,５６ｍｇ）、トリエチルアミン（１
０eｑ.,０．７６ｍL）及び４−（アミノメチル）−ピリジン（４eq.,０．２３ｍ
L）のドライTHFの１０ｍL溶液を、テフロンストップコック付きのフレーム乾燥
ガラス容器中でアルゴン気流下に調製した。続いて容器に５０psiCOを充填し、
３回減圧し、５０psiCOとした後シールした。７０℃に加熱しながら、フラスコ
を激しく攪拌した。２時間後、パラジウムプレートの視覚化が始まった。フラス
コを更に１８時間攪拌し、冷却し、通気して、溶液を蒸発させて、黄色のオイル
を得た。シリカゲルクロマトグラフィーに付して８−１０％MeOH/CH2Cl2グラジ
エントで溶出して、白色固形物として化合物１０を０．１７７ｇ（７８％）得た
。1H,13C NMRスペクトルで特徴化した。分析用サンプルはメタノールによる再
結晶により得た。
【００９４】 トリホスフェートの調製 上記で調製した５’―ヒドロキシ修正ウリジンを用いて、LudwigとEckstein の方法（J.Org. Chem., 1989,54, 631-635）により、トリフォスフェートを調製
した。反応混合物の蒸留水溶液を、０．０５−１．００M TBK（トリエチルアン
モニウムビカーボネート）緩衝液でアニオン交換カラムに通して、トリホスフェ
‐トを精製した。トリホスフェートを含むフラクションを凍結乾燥して、イソプ
ロピリデン保護トリホスフェートを得、31P NMRにより特徴化した。イソプロリ
デン保護基は、Dowex 50WX8 樹脂（H+フォーム）１００ｍｇと共に蒸留水５ｍL
中で７０℃で１５分間加熱し、次いで２M TBK バッファー（ｐH８ヘ）で中和し
て脱離した。この溶液を、逆相調製クロマトグラフィーＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム
）に付して、０．００５Ｍ TBK バッファー溶液中ＣＨ3ＣＮの３−５％グラジィ
エントで最後の精製を行った。かくして得られたトリフォスフェート（１１）を
、そのトリス（トリエチルアンモニウム）塩の形態の13Ｐ NMR スペクトルの1Ｈ
を基に特徴化し、ＵＶ吸収（２７７nｍ,ε＝１４，６００Ｍ-1ｃｍ-1）で定量し
た。 反応を、例４の方法により続ける。
【００９５】例７ ジールスアルダー反応を促進するための修正RNA（ピリジン修正UTPに組み込 んだ）の使用 本発明の核酸を、前記した各種方法により修正することができる。修正核酸の
一つ例として、ヒスチジン型残基を５位に組み込んで修正UTPを調製した。この
ヒスチジン修正UTPは、前記したようにランダムRNA（SEQ ID NO:2）に組み込む
ことができる。修正RNAはPEGリンカーを通して反応試薬に結合させて、ガストリ
ン放出ペプチド（ＧＲＰ）の解裂促進に用いられる。 ヒスチジン修正ＵＴＰの合成 以下の方法により、ヒスチジン型残基が５位に結合したウリジントリホスフ
ェート（UTP）分子を合成できる。
【００９６】 圧力同等化追加フネエルを備えた自己含有カップリング装置に、不活性雰囲気
グローブボックス中で、化合物１２を７０２．３ｍｇ（２．０ｍｍoｌ）、パラ
ジウムアセテート４４．９ｍｇ（０．２０ｍol）、沃化銅（Ｉ）１１４．３ｍｇ
（０．６０ｍｍol）及びトリフェニルホスフィン１５７．４ｍｇ（０．６０ｍｍ
oｌ）を秤リ取った。装置をシールし、ボックスから離し、カニューレにより、
装置の丸底部分に無水ＴＨＦ３０ｍＬを加えた。ビニルトリブチルチン０．６４
３ｍＬ（２．２ｍｍol）の４０ｍＬ無水ＴＨＦ溶液のアルゴン置換したものを、
カニューレを通して、追加フネエル部分に加えた。フラスコを減圧し次いでＣＯ
で３回充填し、黄色い溶液が少しオレンジ色になるまで１．０時間７０℃で加熱
した。次いで、ビニルトリブチルチン溶液を、１０秒間で１滴の割合で追加した
。５−１０％試薬を追加した後で、溶液が黒赤色になった。溶液を７０℃で５時
間加熱し、次いで冷却し、減圧した。残査をＣＨ2Ｃｌ2に溶解しシリカパッドに
付し、２００ｍＬヘキサン及び２００ｍＬＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、５％ＣＨ3ＯＨ/
CH2Cl2で生成物を溶出した。溶出液を濃縮し、５％ＣＨ3ＯＨ/CH2Cl2でシリカゲ
ルによるフラッシュクロマトグラフィーに付して、白色固形物として化合物１３
を０．２９４ｇ得た。
【００９７】 ヒスチジノールミカエル付加生成物 ＴＢＤＭＳ保護ヒスチジノール化合物１４ ヘキサンで３回洗浄したＮａＨ２０５ｍｇ（５．１ｍｍoｌ）の３．０ｍＬＤ
ＭＦ溶液に、攪拌しながらアルゴン下で、Ｎ−メチルヒスチジノール２塩酸塩の
１部５００ｍｇ（２．３ｍｍoｌ）を加え、中程度のガスが発生した。溶液を１
．５時間攪拌し、次いで無水ピリジン１．８ｍＬ（２３ｍｍoｌ）及びＴＢＤＭ
ＳＣｌ ６９３．０ｍｇ（４．６ｍｍoｌ）を加えた。溶液を１．５時間攪拌し
、減圧下に濃縮し、５％ＣＨ3ＯＨ/CH2Cl2でシリカゲルによるフラッシュクロマ
トグラフィーに付して、１４を得た。
【００９８】 ミカエル生成物１５ 化合物１３の１６７．９ｍｇ（０．６ｍｍoｌ）の１０ｍＬＤＭＦ溶液に、
ジイソプロピルエチルアミン０．１０５ｍＬ（０．６ｍｍoｌ）を加え、次いで
化合物１４の１８５ｍｇ（０．７２ｍｍoｌ）の無水ＤＭＦ１．８５ｍＬ（２３
ｍｍoｌ）溶液を滴下した。溶液を１時間攪拌し、減圧下に濃縮し、１５％ＣＨ3 ＯＨ・ＮＨ3/エチルアセテートでシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィ
ーに付して、化合物１５を白色固形物として得、1Ｈ ＮＭＲスペクトルで特徴
化した。
【００９９】 トリフォスフェートの調製 化合物１５のジオキサン/ピリジン溶液に、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−
ベンゼ−ヂオキサホスフォリン−４−オンのＴＨＦ溶液を滴下し、２０分間攪拌
し、次いでビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ Ｄ
ＭＦ溶液とトリブチルアミンを同時に加えた。溶液を更に２０分間攪拌し、Ｉ2
のピリジン/水の溶液を加え、２０分間攪拌した。過剰のヨウ素を、５％ビスル
フアイトナトリウムで破壊し、１５分間攪拌し、溶液を濃縮し、濃水酸化アンモ
ニウムで加水分解した。アンモニアを減圧下に除去し、残った溶液をＣＨ2Ｃｌ2 で２回、エチルアセテートで１回洗浄し、減圧下に濃縮した。残査を水に溶解し
、Ｄｏｗeｘと共に７０℃で１５分間攪拌した。溶液を濾過し、２Ｍ ＴＢＫバ
ッファーで中和し、ＤＥＡＥセファデックスに直接付し、０．００５Ｍトリエチ
ルアンモニウムビカーボネートバッファー（ＴＢＫバッファー）〜１.０Ｍ Ｔ
ＢＫバッファーのグラジエントで溶出して、シアリレート種及び少量のＴＢＤＭ
Ｓとイソプロピリデン保護を含むものを僅かに含む生成物を得た。これをＤｏe
ｘ樹脂で再び処理し、逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラムに付して、０−５％アセトニ
トリルの０．００５Ｍ ＴＢＫバッファー溶液のグラジエントで１５分間溶出し
て、化合物１６を得、1Ｈ、13Ｈ及び31Ｐ ＮＭＲで確認した。 上記例４と同様にして、実験を続けた。しかしながら、シクロヘキサン生成物
が形成されるより、むしろ核酸がＧＰＲ蛋白を加水分解した。
【０１００】例８ Ｎ−ブロモアセチルブラジキンに結合した５’−ホスホロチオエート修正Ｒ ＮＡ 本例は、結合反応試薬が、ランダム核酸テスト混合物に直接結合した５’−グ
アノシンモノホスホロチオエート（ＧＭＰＳ）であるパラレルＳＥＬＥＸ方法に
ついて記載するものである。フリーの反応試薬は、ブラジキニンターゲット（Ｂ
ｒＢＫ）に結合したブロモアセチル基である。本例は、Ｎ−ブロモアセチル化ブ
ラジキニン（ＢｒＢＫ）と特異的に反応しＲＮＡとＢｒＢＫとのチオエーテル結
合の形成を促進する５’−グアノシンモノホスホロチオエート置換ＲＮＡ（ＧＭ
ＰＳ−ＲＮＡ）の選択及び分析について記載するものである。この分野の以前の
研究により、フリー溶液中及び支持マトリックスに結合したブラジキニンに対す
るリガンドを得るのは難しいことが分かっている。以下に記載するように、ｋｃ
at/Kmが６７００倍にそしてＮ−ブロモアセチルブラジキニンについての結合ア
フィニティーが出発プールに対し１００倍上昇するＲＮＡを同定した。このＲＮ
Ａはその基質に特異的に結合し、最適活性のためにペプチドのアミノ及びカルボ
キシ末端の両者を必要とした。
【０１０１】 Ａ．パラレルＳＥＬＥＸ ＲＮＡテスト混合物に結合した結合反応試薬として５’−グアノシンモノホス
ホロチオエート（ＧＭＰＳ）を、フリー反応試薬及びターゲットとしてブロモア
セチル化ブラジキニンを用いて、パラレルＳＥＬＥＸを実施した。ＧＭＰＳ−Ｒ
ＮＡは、ＢｒＢＫのブロミド基をＲＮＡのチオエート基に迅速に置換できるもの
として選択された。次いで、ＢＫ−Ｓ−ＲＮＡの生成物を、残った未反応ＧＭＰ
Ｓ−ＲＮＡから分画し、他のセレクションサイクルに付す前に再度増幅した。
【０１０２】 １．ＧＭＰＳ−ＲＮＡ Schneider et.al.,(ＦＡＳＥＢ)に詳細に記載された３０ランダム化ヌクレオ
シド（３０Ｎ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の中心領域を有する７６ヌクレオ
シドの長さの約５×１０13ＧＭＰＳ−ＲＮＡ分子のイニシャルレパートリーを、
増幅用のテンプレートとしての非ランダム領域と共に用いて、パラレルＳＥＬＥ
Ｘを実施した。核酸反応試薬テスト混合物は、ＧＭＰＳにより約８０％の全長生
成物が生成するようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写のプライムにおける同
モルのＧＴＰに対して優先的に利用されるように、最初の及びそれに続く全ての
転写反応にＧＭＰＳを取り込ませて形成した。ＧＭＰＳ−ＲＮＡを転写し、アミ
コンー５０スピン分離機で精製し、過剰のＧＭＰＳを除いた。ＧＭＰＳ−ＲＮＡ
を、チオプロピルセファロース６Ｂで非ＧＭＰＳ ＲＮＡから分離し、ヂチオス
レイトール（ＤＴＴ）のマトリックスから溶出し、他のミクロン５０スピン分離
機でＲＴＴから精製した。チオプロピルセファロース ６Ｂ（ファルマシア）は
、カラムバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．
０）であらかじめ洗浄し、使用前に１２，０００ｇで乾燥した。ＧＭＰＳ−ＲＮ
Ａ精製ミクロン５０カラム精製ＲＮＡは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ及び２０ｍＭ ＨＥＳＰＥＳ ｐＨ７．０の終濃度にし、６０μＬボイド
量に対して２５μＬのメジャーでマトリックスに加えた。マトリックスを７０℃
で５分間反応させ、１２，０００ｇでスパンし、９０％フォルムアミド、５０ｍ
Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．０の４つのカラム量で７０℃でスピン洗浄し、ｐＨ５．０
で５０ｍＭ中の５００ｍＭ ＮａＣｌの４カラム量でスピン洗浄し、ｐＨ５．０
で５０ｍＭ ＭＥＳ中の１００ｍＭ ＤＴＴの４カラム量でスピン溶出した。こ
れらの条件は、ＧＭＰＳ−ＲＮＡのみのリテンション及びそれに続く溶出のため
に最適化した。
【０１０３】 ２．ブロモアセチル化ブラジキニン この例では、ブロモアセチルブラジキニン（ＢｒＢＫ）は、フリーの反応試薬
とターゲットの両者として用いた。ブロモアセチル基はフリー反応試薬である。
ＢｒＢＫは、５ｍＭブラジキンの５０μＬと、４２ｍＭブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルの３ツの２５０μＬ部分とを、室温で１２分間のイン
ターバルで反応させて合成した。過剰のブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルは、アミノエチルアクリルアミド５ｍＭで濾過して除き（室温で５分
間反応）、ＢｒＢＫをＧＳ−１０セファロースで分離した。ＢｒＢＫ濃度は、１
２，０００ｃｍ-1Ｍ-1の吸収係数で２２０ｎｍで決定した。
【０１０４】 ３． 選択反応 ＢｒＢＫとの反応をほとんど実施できるこれらの種のＧＭＰＳ−ＲＮＡは、Ｓ
ＥＬＥＸの複数のラウンド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｕｎｄｓ）を通して相互に
選択される。選択されたラウンドは、以下の表１に示される所定の時間及び温度
で、反応緩衝（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）中、１．１mMのＢｒＢＫ及び
ＧＭＰＳ−ＲＮＡの濃度で実施された。 選択の間、ＢｒＢＫペプチドの濃度は、ＢｒＢＫを有するラウンド０プールの
Ｋｍよりも１２倍も低い濃度である１．１ｍＭに保持された。選択の進行にあた
り、全ＧＭＰＳ−ＲＮＡの５％以下に反応を制限するために、反応時間は制限さ
れ、反応温度は下げられた。目的は、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）と化学（ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）の両方の改善を選択するために二次反応条件を維持することにある
。ＢｒＢＫの活性は、２５μＭ ＧＭＰＳ−ＲＮＡ、１２．５μＭ ＢｒＢＫで
評価された。反応を完全に実施すると、ＲＮＡの５０％がＢｒＢＫと共有結合し
、ペプチドのブロモアセチル化が本質的に完全であることを示していた。 反応は、チオリン酸ナトリウム（ラウンド１〜８）又はチオ硫酸ナトリウム（
ラウンド９〜１２）の最終濃度を２３５ｍＭにして抑制され、そして変性７Ｍ尿
素８％ポリアクリルアミドＡＰＭゲル（ラウンド１〜６）又はアフィニティーク
ロマトグラフィーによって分配された。反応したＲＮＡ％（％ＲＮＡ Ｒｅａｃ
ｔｅｄ）とは、アクリルアミドゲル分配から又はアフィニティーカラム分配での
ＢＫ−Ｓ−ＲＮＡの自由溶出からのＢＫ−Ｓ−ＲＮＡとして存在する全ＧＭＰＳ
−ＲＮＡの％のことを指している。バックグラウンドは、両方のケースにおいて
、回収されたＲＮＡから差し引かれた。バックグラウンドは、ＢｒＢＫを添加す
る前に反応が抑制されたときの調節処理からＲＮＡが回収された量を指している
。バックグラウンド比は、［反応したＲＮＡ］対［バックグラウンドとして存在
するもの］の比である。反応時間を調節することによって、ＳＥＬＥＸのラウン
ド中、この比は２〜１０の間に保つ試みがなされた。 サブトラクティブ・分配は、チオプロピル セファローズ６Ｂによるサブトラ
クションによるか、又はＡＰＭポリアクリルアミドゲル上で二つの種を分離する
ことによって完成される。Ｇ．Ｌ．イグロイ（Ｉｇｌｏｉ）によってバイオケミ
ストリー２７巻、３８４２（１９８８）に報告されているように、塩化［（β−
アクリロイルアミノ）フェニル］水銀（ＡＰＭ）を合成し、チオール含有ＲＮＡ
を遅延させるために濃度２５μＭで変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で使用
した。１００ｍＭのＤＴＴの存在下に、ＡＰＭ−ポリアクリルアミドから溶出し
て、ＧＭＰＳ−ＲＮＡを精製した。新たに精製された、ＡＰＭ−遅延ＧＭＰＳ−
ＲＮＡをＡＰＭゲル上で再精製し、適用された全ＧＭＰＳ−ＲＮＡの約３％から
なる、未遅延ＲＮＡの自由バンドが得られることが、前記引用文献から分かった
。自由−ランニング（ｆｒｅｅ−ｒｕｎｎｉｎｇ；空走）ＲＮＡは、それが（ゲ
ル中で使用されたアクリルアミドの％に関係なく）ＢＫ−ＲＮＡに非常に近接し
て溶出し、分配の間にバックグラウンドを増加させることが問題であった。この
自由−ランニングＲＮＡをゲルから精製し、ＡＰＭゲルに戻すとき、約５０％の
このＲＮＡが自由ラニングのまま残っており、残りのＲＮＡはＧＭＰＳ−ＲＮＡ
としてランニングされた。自由−ランニングＲＮＡの量は、分配に要した時間の
量に比例したが、ｐＨの影響、ＤＴＴ、マグネシウム、アセテート、ホルムアミ
ド、尿素、又は熱の存在又は不存在には依存しなかった。 逆転写及びポリメラーゼ鎖反応を、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら（
ＦＡＳＥＢ，７，２０１，１９９３）が報告したように、実施した。ＧＭＰＳ−
ＲＮＡプールのｋobs値はラウンド４〜６の間に１００倍に増加し、その後のラ
ウンドではわずか２倍増加しただけであった。ｋobs値を決定するための反応は
０℃で反応緩衝（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2
、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、２μＭのＧＭＰＳ−ＲＮＡ及び１３０μMのＢ
ｒＢＫで、０、１、３、１０、３０及び９０分で監視しつつ行なった。ＧＭＰＳ
−ＲＮＡは、７０℃で、３分間変性され、最終反応緩衝状態まで希釈される前に
室温で徐冷するようにされ、氷に移され、ＢｒＢＫを添加した。反応は氷上、２
３５ｍＭのチオ硫酸ナトリウムで停止され、変性７Ｍ尿素８％ポリアクリルアミ
ドＡＰＭゲル上で溶出され、ｋobs値は、［未反応ＧＭＰＳ−ＲＮＡの濃度］対
［時間のプロット］からのデータ点の直線範囲のマイナスの傾斜として測定され
た。ラウンド１０及び１２は、クローニング及び配列化を決定するのに使用され
た。 Ｂ． クローン ５６の独立したクローンが、配列決定された。１６の反応物がＢｒＢＫとの反
応性の３０Ｎｌバルク プールと比較された。試験された反応物の全ては、最初
のプールと比較してｋobs値で１０倍から１００倍の増加を示した。反応物12.1
（配列 ＩＤ ＮＯ：５）は、３つの基準：（ｉ）競合（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）
ブラドキニンによる反応抑制の予備的検討において、ブラジキニンとして最も低
いＫi（データは示されていない）を有すること、（ｉｉ）ラウンド１２ポピュ
レーション（ｐｏｌｐｕｌａｔｉｏｎ）において最も屡々表れる分子であること
、（ｉｉｉ）試験された反応物の中で、第二に速いｋobs値を有すること、に基
づき、更なる機構分析のために選ばれた。 反応物のｋobs値１２．１の選択された増加は、反応性及び結合の両方の増加
に帰することができる。ＢｒＢＫとの反応において、反応物１２．１はｋcat値
でバルク３０Ｎ１ ＧＭＰＳ−ＲＮＡの６７倍の増加を示し、Ｋm値で１００倍
の減少を示し、ｋcat/Ｋmが全体として６７００倍増加した（表１参照）。 Ｃ． 特異性 反応物１２．１による最適結合（ｏｐｔｉｍａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）に要求さ
れるＢｒＢＫの構造要素（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を、ブラ
ジキノン類似物による反応抑制によって検討した。ＢＫによる抑制は、バルク３
０ＮＩのＧＭＰＳ−ＲＮＡとＢｒＢＫとの反応では測定できない（データは示さ
れていない）が、ネイティブのブラジキノン（ＢＫ）は反応物１２．１とＢｒＢ
Ｋとの反応のＫi １４０±６０μＭを有する。この値は、未抑制の反応のＫmと
ほぼ同じである。Ｄｅｓ−Ａｒｇ9−ＢＫ（カルボキシル末端アルギニンを欠く
ＢＫ類似物）はＫi ２．６±０．５ｍＭを有する。このように、カルボキシ末
端アルギニンを欠くことは、ＢＫと反応物１２．１との結合を約１８倍減少させ
る。さらに、ｄｅｓ−Ａｒｇ1−ＢＫ（アミノ末端アルギニンを欠くＢＫ類似物
）は、アミノ末端アルギニンが反応物１２．１とＢｒＢＫとの間に観察される結
合反応には絶対的に必要であることを示す、反応物１２．１とＢＫとの反応のい
かなる測定できるほどの抑制も示さない。アルギニンは、ペプチドとの関連にお
いて認識されなければならないが、遊離のＬ−アルギニン単独は反応を測定可能
なほどは抑制しない。したがって、反応物１２．１のアフィニティーがＢｒＢＫ
のバルク ３０Ｎ１ ＧＭＰＳ−ＲＮＡのアフィニティーよりも増加することは
、部分的には、ＢｒＢＫのアミノ末端アルギニンの反応物認識に帰せられ、カル
ボキシ末端アルギニンには帰せられる程度はそれより少ない。 反応物１２．１の本質的な反応活性は、微量のブロモアセチル構造としてＮ−
ブロモアセチルアミド（ＢｒＡｃＮＨ2）を使用して検討した。反応物１２．１
と３０ＮＩ ＲＮＡプール及びＢｒＡｃＮＨ2との反応のＫmとｋcatの値は、ほ
ぼ同じであった。したがって、反応物１２．１とＢｒＢＫの反応の加速された反
応速度は、みかけ上、チオネート基の求核性の増加に帰すべきではなく、むしろ
、二つの基質の位置における立体要因及び／又はエントロピー要因の結果に帰す
べきである。このように、パラレルＳＥＬＥＸプロセスに求められたのと全く同
様に、化学反応は容易化された。
【０１０５】実施例９ クライゼン縮合を促進するための改変していないＲＮＡ及びイミダゾール−Ｕ ＭＰで改変したＲＮＡの使用 この実施例では、結合した反応物質が、ＰＥＧ結合を経由してランダムな核酸
試験混合物に取り付けられたアセトフェノンである、平行ＳＥＬＥＸ法について
記述する。核酸試験混合物は、改変していないか又はイミダゾール−ＵＴＰを含
有する、１００のヌクレオチドのランダムな配列を含んでいた。アセトフェノン
反応物質−核酸試験混合物の用意は、実施例１−３において述べている。フリー
の反応物質は、ビオチン−４−ニトロフェノール分子である。ＲＮＡによって促
進される反応は、以下のスキームに示される通り、アセトフェノンとニトロフェ
ノール部分とのクライゼン反応である。 ＰＣＲとＲＮＡの転写のための一本鎖ＤＮＡテンプレート 隣接するランダムな配列である１００−ヌクレオチド領域と、５’及び３’固
定領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を有する、１４７‐ヌクレオチド １００Ｎ
８ 一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを標準的な方法で合成した
。３’固定領域中のランダムな領域に並んでいる８のヌクレオチドが、５’固定
領域中のランダムな領域に並んでいる８のヌクレオチドに対して相補的である点
以外は、この１００Ｎ８Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）ｓｓＤＮＡテンプレート
は、１００Ｎ８テンプレートと同一であった。１００Ｎ８Ｃの相補的な８のヌク
レオチドは、可変領域中の１００ＮループをもつＲＮＡの幹の構造を形成するた
めに準備される。それゆえ、１００Ｎ８Ｃは、最初の構造を有している。 シングル−コピー二本鎖ＰＣＲ生成物の生成 １００Ｎ８と１００Ｎ８Ｃ両者のための、２ｎｍｏｌのシングル−コピーｓｓ
ＤＮＡテンプレートを、２ｎｍｏｌの転写生成物を作るために、２サイクルの増
幅のためのＰＣＲ反応に用いた。シングル−コピー２本鎖ＰＣＲ生成物は、転写
のためのキアゲンカラム（Ｑｉａｇｅｎ ｃｏｌｕｍｎ）で精製した。１００Ｎ
８及び１００Ｎ８Ｃテンプレートそれぞれの１ｎｍｏｌを改変していないＲＮＡ
との転写のために用い、それぞれの１ｎｍｏｌを５−イミダゾール−ＵＴＰとの
転写のために用いた。以下に述べるように、ＲＮＡ転写物は精製され、くくられ
、ゲル精製された。 ５’モノホスフェートを有するランダムなＲＮＡプールの生成 ＲＮＡ転写物は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ
スペルミジン、ＡＴＰ，ＣＴＰ、ＵＴＰ又は５−イミダゾール−ＵＴＰそれぞれ
１ｍＭ、２０ｍＭ ＧＭＰ、０．２６μＭ α−32Ｐ−ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ
、４％ＰＥＧ、０．００２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、を含み、ｐＨ８．０であ
る５００μｌの反応混合物中の、２本鎖ＰＣＲ生成物の転写によって準備された
。ＲＮＡの濃度は、１２５ｎＭから１μＭまで、つまり、より高い増幅を与える
低濃度で変化させた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを１．５μＭ加え、転写物は３７
℃で２時間インキュベートした。反応混合物は、等量のフェノール、フェノール
：クロロホルム（５０：５０）およびクロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽出した
。抽出に引き続き、ＲＮＡは、Ｃｅｎｔｒｅｘ ＵＦ−０．５ ３０,０００Ｍ
Ｗフィルターにかけた。ＲＮＡは、５００μｌのＨ2Ｏで３回洗浄した。ＲＮＡ
は、２００μｌのＨ2Ｏでそれぞれのフィルターから溶出した。ＲＮＡを定量し
た。 ランダムなＲＮＡのＤＮＡ−ＰＥＧ−アセトフェノンへのくくりつけ ＲＮＡは、５μＭのＲＮＡ濃度で５００μｌのａｌｉｑｕｏｔｓ中のアセトフ
ェノン−ＰＥＧ−１０−ヌクレオチドＤＮＡにくくりつけた。このくくりつけの
反応は、２つのステップで行われた。第１のステップは、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＥ、１ｍＭ ＡＴＰを含み、ｐＨ７．
５である３３０μｌ混合物（ベーリンガーマンハイム リガーゼバッファー）中
の、２重に過剰なアセトフェノン−ＰＥＧ−１０−ヌクレオチドＤＮＡ及び３重
に過剰な２０−ヌクレオチド架橋ＤＮＡで、７２℃、３分間、ＲＮＡをインキュ
ベートした。 第２のステップは、反応混合物が室温に達した後、４０μｌのベーリンガーマ
ンハイムエンザイムストレージバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、６０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＥ，５０％グリセロール、ｐＨ７
．５）、５３μｌ Ｈ2Ｏ、１７μｌ ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，４０ユ
ニット／μｌ）、１７μｌ １０ｘリガーゼバッファー（上記に同じ）及び４０
μｌ リガーゼ（ベーリンガーマンハイム、５ユニット／μｌ）を最終的な容積
が５００μｌになるように加えた。くくりつけの反応は、３７℃のインキュベー
ターの中に２−３時間置いて行った。くくりつけられたＲＮＡは、ゲルから切り
離され、０．２μＭのフィルターを通じて凍結圧搾し、ＮＡＰ−５脱塩カラムに
通して、急速真空乾燥した。乾燥させたくくりつけられたＲＮＡは、５０μｌの
水の中に懸濁させて定量した。
【０１０６】化学反応 核酸−反応体試験混合物（アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＲＮＡ）と第２
反応体（ビオチン−４−ニトロフェノール）との反応は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ
ＣａＣｌ2、１０μＭ ＺｎＣｌ2、２０％アセトニトリルを含む、ｐＨ７．０の
、５００μｌアリコット中においてであった。反応中における連結反応したＲＮ
Ａの濃度は２．５μＭであり、ビオチン−４−ニトロフェノール化合物の濃度は
０．５ｍＭであった。核酸−反応体及び第２反応体の濃度は、厳密度を上げるた
めに必要に応じて調節した。これらの反応混合物を１７時間２５℃においてイン
キュベートした。インキュベーション後、反応混合物は、まずＮＡＰ−５カラム
を通し、次いでＮＡＰ−１０カラムを通して、遊離のビオチン−４−ニトロフェ
ノール化合物を除去した。これらの試料は高速真空にて乾燥し、次いで１００μ
ｌの水に懸濁した。これらの試料の特異的活性を求めた。反応した生成物は、下
記のように分画し、逆転写し、ＰＣＲ増幅し、転写した。アセトフェノン−ＰＥ
Ｇ−ＤＮＡ10mer接合体を、上記したように、ＲＮＡに連結反応し、それらの結
合した反応生成物の構造を求めるために、試験混合物プールが促進ＲＮＡで十分
に豊富になるまで選択／増幅を繰り返した。ゲル−シフト分画 ラウンド１−３ ストレプタビジン（１０ナノモル）及び１０ｘ緩衝液（１０ｍＭトリス、１５
０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．５の溶液を与えるための）を添加し、各試料
を３７℃にて１５分間インキュベートし、次いで７０℃にて３分間インキュベー
トした。ビオチニル化ＲＮＡのストレプタビジン誘導ゲルシフトに対するポジテ
ィブコントロールとして、上記アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ10−ＲＮＡ100N と同様にして調製したビオチン−ＰＥＧ−ＤＮＡ10−ＲＮＡ100N（約７ピコモル
）を、上記したように、１０ナノモルのストレプタビジンと共にインキュベート
した。このストレプタビジンシフトさせた試料を、１．５ｍｍ６％変性ゲル上を
、絶縁ゲル装置中５０ワットにて、キシレンシアノール指示薬染料が底から約１
インチとなるまで動かした。 そのシフトした領域におけるゲルバンドを、上記ポジティブコントロールによ
って予想されたとおりに削った。そのゲルからＲＮＡを凍結絞出し、ＮＡＰ−５
カラムを通し、高速真空にて乾燥した。このＲＮＡを５０μｌの水中に再懸濁さ
せた。この回収したＲＮＡの量を、回収カウントを求め、ゲルに適用されたこの
ＲＮＡの特異的活性を用いることによって求めた。このＲＮＡを逆転写し、得ら
れるＤＮＡをＰＣＲ−増幅する。次いでこのＰＣＲ生成物を転写し、ＲＮＡの複
写を、上記したように、上記アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ10MERに連結反応
させる。
【０１０７】ストレプタビジン−被覆磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ）での分離 ラウンド４−６ １．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の５０μlの常磁性ビーズスラリー（１
００ピコモルのビオチン化オリゴヌクレオチドにまで結合すべき）をＭＰＣ装置
（磁気ホルダー）に入れ、上清を取り除いた。ビーズはチューブを各洗浄の間Ｍ
ＰＣ中に入れることにより、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍM ＥＤＴＡ
、２．０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＰＥＧ２０００を含む結合及び洗浄（Ｂ＆Ｗ
）バッファーで３回洗浄した。Ｂ＆ＷバッファーはＤＥＰＣ−処理水で調製する
。結合反応については、ビーズは１００μlＢ＆Ｗバッファーに再懸濁する。Ｒ
ＮＡは２００μlの全体積に対して一容の１００μl ＤＥＰＣ−処理水中に添加
する。ＲＮＡは時折混合しながら３０分間ビーズと共にインキュベートする。チ
ューブはMPCホルダーに入れ、バッファーは取り除きＮｏ．１として保存する。
ビーズは２００μlＢ＆Ｗで２回洗浄し、洗浄の間MPCホルダー中に入れる。洗浄
バッファーはＮｏ．２及び３として保存する。次いでビーズは２００μlの水で
、その後１００μlの水で洗浄する。洗浄水はＮｏ．４として保存し、プールす
る。ビーズは５０μlの水に再懸濁し、Ｎｏ．５として保存する。ラウンド６の
後、追加の２００μlの水での洗浄を行った。洗浄バッファーは各々４ｍｌシン
チレーション液体のバイアルに添加する。磁気ビーズのアリコットもカウントす
る。これらの数は結合％を決定するために使用される。この実験でのバックグラ
ウンドは第二の反応物（ビオチン−４−ニトロフェノール）なしで反応中に核酸
反応物試験混合物（アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＲＮＡ）をインキュベー
トすることにより決定され、０．０２％より小さい。ビーズに結合したＲＮＡは
逆転写される。ｃＤＮＡは熱変性条件とＭＰＣホルダーを用いてビーズから取り
除き、ＰＣＲ増幅される。
【０１０８】カウンターＳＥＬＥＸ法 第二反応物（ビオチン−４−ニトロフェノール）と、核酸の通常の官能基又は
ＲＮＡを修飾するための共配列として導入される基（イミダゾール）との反応か
ら生じる可能性のある望ましくない生成物を排除するために、いくつかのカウン
ターＳＥＬＥＸ法がある。
【０１０９】 ＤＮＡ−ＰＥＧリンカーのＤＮアーゼＩ消化は，第一反応物が関与しない核酸
−反応物試験混合物（アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＲＮＡ）の間の生成物
を除くための最も効率的な方法である。すべてのビオチン化した生成物は磁気ビ
ーズ上のストレプタビジンに結合するであろう。未結合核酸−反応物を除くため
の多重洗浄工程の後、磁気ビーズ（結合ビオチン化ＲＮＡと共に）を２００μｌ
のDNアーゼＩバッファーに再懸濁する。DNアーゼＩ（４単位；ＲＮアーゼフリー
）を添加し、ＤＮＡを３７℃で３０分間消化する。ビーズをＭＰＣに入れ、遊離
するＲＮＡを上清中に集める。ビーズは未結合ＲＮＡを除くために数回洗浄する
。上清と洗浄液はアセトフェノンとビオチン−４−ニトロフェノールの反応によ
り形成された生成物によりストレプタビジンに結合したＲＮＡのみを含む。RNA
溶液はDAアーゼを取り除くためにフェノール／クロロホルム抽出され、乾燥させ
るためにスピード真空に置く。ｃＤＮＡはＰＣＲ増幅され、次のラウンドの転写
のために二本鎖ＤＮＡ生成物を作る。
【０１１０】 あるいは、カウンターＳＥＬＥＸ法は、ＲＮＡが別の反応物−ＰＥＧ−ＤＮＡ
１０マー、すなわちクライゼン縮合の場合のジエンに連結するサブトラクション
工程を含む。このＲＮＡはアセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＲＮＡと同じ条件
下で第二の反応物（ビオチン−４−ニトロフェノール）と反応させられる。スト
レプタビジン−被覆磁気ビーズに結合しないＲＮＡはＮＡＰ−１０カラムを通過
して塩を取り除き、スピード真空中で乾燥され、水中に再懸濁され、逆転写され
る。ｃＤＮＡはＰＣＲ増幅され、ポジティブ選択のためにアセトフェノン−ＰＥ
Ｇ−ＤＮＡ１０マーに連結するために転写される。
【０１１１】 もし、連結されないＲＮＡの第二反応物とのインキュベーションの結果、ター
ゲットに結合した同様の量のＲＮＡになるのであれば、それらの望ましくないＲ
ＮＡはこの混合物を磁気ビーズの上を通過させることにより取り除くことができ
る。未結合ＲＮＡは次いでＮＡＰ−１０脱塩カラムを通過し、スピード真空下で
乾燥される。ＲＮＡは次いで水中に再懸濁され、アセトフェノン−ＰＥＧ−ＤＮ
Ａ１０マーとの連結反応に直接使用することができる。アセトフェノン−ＰＥＧ
−ＤＮＡ−ＲＮＡは次いで上述のようにビオチン−４−ニトロフェノールとイン
キュベートされる。
【０１１２】実施例１０ ＲＮＡ促進クライゼン反応 この例は、パラレルＳＥＬＥＸ処理を記載するものであり、ここでは、結合反
応物質は、ＰＥＧリンカーを介して、先の実施例１−３に記載したランダム核酸
試験混合物に結合したアセトフェノンである。この核酸試験混合物は、ベンゾイ
ル−ＵＴＰまたはイミダゾール−ＵＴＰのいずれかを含むランダムなシークエン
スの１００ヌクレオチドを含んでいた。フリーの反応物質は、ＡＭＰ−ビオチン
分子である。このＲＮＡによって促進される反応は、下記のスキームで示すアセ
トフェノンとＡＭＰ分子との間のクライゼン反応である。
【０１１３】アセトフェノン−核酸試験混合物の合成 出発材料のランダム核酸試験混合物は１００Ｎ８の2ナノモルであり、実施例
１に記載したベンゾイル−ＵＴＰまたはイミダゾール−ＵＴＰのいずれかを含ん
でいる。実施例２−３に記載のとおり、アセトフェノン求核原子をＤＮＡ−ＰＥ
Ｇリンカーを介してＲＮＡ分子に連結した。ＨＣｌ／ピリジン混合物中に過剰の
ＤＣＣを存在させて、ＡＭＰとビオチンの等モルインキュベーションにより、Ａ
ＭＰ−ビオチンを合成した。ＡＭＰ−ビオチンは、逆相ＨＰＬＣで精製し、31Ｐ
−ＮＭＲでキャラクタライズした。
【０１１４】反応 ＳＥＬＥＸ反応緩衝液は、２００ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２００ミ
リモルのＮａＣｌ、２００ミリモルのＫＣｌ、２ミリモルのＭｇＣｌ2、２ミリ
モルのＣａＣｌ2、それぞれ１０マイクロモルのＣｏＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＦｅＣ
ｌ2、ＭｎＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＺｎＣｌ2を含んでおり、反応を２５℃でインキュ
ベートして行った。ＳＥＬＥＸ実験の間、ＲＮＡ濃度を１０マイクロモルから１
マイクロモルに下げ，ＡＭＰ−ビオチン濃度を１０ミリモルから０．２−１ミリ
モルにさげ、インキュベートの時間を１６時間から１時間に減らすことによって
、反応の切迫度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）をじょじょに高めた。促進されたＲＮ
Ａ分子の分割は、反応した分子にビオチンによるタグが存在するか否かによった
。ラウンド１−７およびラウンド１１においてゲル−シフト分割を使用し、ラウ
ンド８−１０およびラウンド１２−１４では、分割に常磁性ストレップタビディ
ンダイナビーズＭ−２８０（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄ
ｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０）を使用した。ラウンド１２−１４の間
、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）プールとスターティングプールのＳＥＬＥＸ反応を
並行して行った。対応するバックグラウンドは、ＡＭＰ−ビオチンの不存在下で
それぞれのＲＮＡプールの半分をインキュベートすることによって決定した。
【０１１５】 ビオチン化が末端の求核分子で起こっているのか、内部の反応中心で起こって
いるのかを決定するために、訂正（ｃｏｒｒｅｃｔ）末端求核分子またはＲＮＡ
分子に連結した非反応性のジエンを用いてラウンド１４を行った。比較により、
末端求核分子としてアセトフェノンを有しているＲＮＡ分子は、だいたい、内部
がビオチン化されていることがわかる。実施例９に記載したカウンターＳＥＬＥ
Ｘ法によって、内部のビオチン化が促進されたＲＮＡ分子をプールから除く。Ｓ
ＥＬＥＸプールは、反応の緊迫度が増加するようにランドを続けることによって
、末端求核分子のビオチン化が促進されたＲＮＡ分子によりさらに富化される。
【０１１６】実施例１１ ＲＮＡ−促進アミド化反応 この例は、パラレルＳＥＬＥＸ処理を記載するものであり、ここでは、結合反
応物質は、ＰＥＧリンカーを介して、先の実施例１−３に記載したランダム核酸
試験混合物に結合したアミンである。この核酸試験混合物は、ベンゾイル−ＵＴ
Ｐまたはイミダゾール−ＵＴＰのいずれかを含むランダムなシークエンスの１０
０ヌクレオチドを含んでいた。フリーの反応物質は、ＡＭＰ−ビオチン分子であ
る。このＲＮＡによって促進される反応は、下記のスキームで示すアミンとＡＭ
Ｐ分子との間の反応である。
【０１１７】
【０１１８】アミン−ＲＮＡライブラリーの合成 出発材料のランダム核酸試験混合物は１００Ｎ８の2ナノモルであり、実施例
１に記載したベンゾイル−ＵＴＰまたはイミダゾール−ＵＴＰのいずれかを含ん
でいる。実施例１−３の記載と同様にして、ＤＮＡ−ＰＥＧリンカーを介してア
ミン求核分子をＲＮＡ分子に連結した。 ＨＣｌ／ピリジン混合物中に過剰のＤＣＣを存在させて、ＡＭＰとビオチンの
等モルインキュベーションにより、ＡＭＰ−ビオチンを合成した。ＡＭＰ−ビオ
チンは、逆相ＨＰＬＣで精製し、31Ｐ−ＮＭＲでキャラクタライズした。
【０１１９】反応 ＳＥＬＥＸ反応緩衝液は、２００ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２００ミ
リモルのＮａＣｌ、２００ミリモルのＫＣｌ、２ミリモルのＭｇＣｌ2、２ミリ
モルのＣａＣｌ2、それぞれ１０マイクロモル／ｌのＣｏＣｌ2、ＣｕＣｌ2、Ｆ
ｅＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＺｎＣｌ2を含んでおり、反応を２５℃でイン
キュベートして行った。ＳＥＬＥＸ実験の間、ＲＮＡ濃度を１０マイクロモルか
ら１マイクロモルに下げ，ＡＭＰ−ビオチン濃度を１０ミリモルから０．２−１
ミリモルにさげ、インキュベートの時間を１６時間から１時間に減らすことによ
って、反応の切迫度をじょじょに高めた。促進されたＲＮＡ分子の分割は、反応
した分子にビオチンによるタグが存在するかいなかによった。ラウンド１−７お
よびラウンド１１においてゲル−シフト分割を使用し、ラウンド８−１０および
ラウンド１２−１４では、分割に常磁性ストレップタビディンダイナビーズＭ−
２８０を使用した。ラウンド１２−１４の間、富化プールとスターティングプー
ルのＳＥＬＥＸ反応を並行して行った。対応するバックグラウンドは、ＡＭＰ−
ビオチンの不存在下でそれぞれのＲＮＡプールの半分をインキュベートすること
によって決定した。
【０１２０】 ビオチン化が末端アミン求核分子で起こっているのか、内部の反応中心で起こ
っているのかを決定するために、訂正末端求核分子またはＲＮＡ分子に連結した
非反応性のジエンを用いてラウンド１４を行った。比較により、イミダゾール−
ＵＴＰ ＲＮＡ分子のビオチン化は、末端アミンにおいて優先して起こっている
ことがわかる。実施例９に記載したカウンターＳＥＬＥＸ法によって、内部のビ
オチン化が促進されたＲＮＡ分子をプールから除く。ＳＥＬＥＸプールは、反応
の緊迫度が増加するようにランドを続けることによって、末端求核分子のビオチ
ン化が促進されたＲＮＡ分子によりさらに富化される。
【０１２１】実施例１２ アシル化反応を促進するための改変していないＲＮＡ及び５−イミダゾール− ＵＭＰで改変したＲＮＡの使用：ＮＨＳ−カルバメートで官能基化したペプチド ライブラリーからのヒト好中球エラスターゼ抑制剤の選択 平行ＳＥＬＥＸ法の、追加の適用は、改変していないＲＮＡ又は第一アミンと
接合した５−イミダゾール−ＵＭＰで改変したＲＮＡを使用した、ＮＨＳ−カル
バメートで官能基化した大きなペプチドライブラリーからの、セリンプロテアー
ゼ ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）の抑制剤を選択することを含んでいる。
この応用は、あらかじめ合成された組み合わせ（コンビナトリアル）ライブラリ
ーのデコンヴォリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を取り扱う。ＲＮ
Ａに取り付けた求核的な第一アミンと、ＮＨＳ−カルバメートの求電子的なカル
ボニル基の炭素との間の反応（アシル化）を促進することができるＲＮＡは、結
果として得られる、ＨＮＥと相互に作用するＲＮＡ−接合ペプチドの能力に基づ
き選択される。現在進行中である、この平行ＳＥＬＥＸ実験のより詳細な記述を
以下に記す。
【０１２２】 ＮＨＳ−カルバメートで官能基化したペプチド−ホスホン酸ジフェニルライブ ラリーの合成 （α−アミノアルキル）ホスホン酸ジフェニルのある一定のペプチド誘導体は
、ＨＮＥの効果的な非可逆的（共有的）抑制剤であることが知られている（Ｊ．
Ｏｌｅｋｓｙｓｚｙｎ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｐｏｗｅｒｓ、１９９１、（α−アミ
ノアルキル）ホスホン酸ジフェニルエステルのペプチド誘導体によるセリンプロ
テアーゼの非可逆的抑制、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：４８５−４９３）
。出発点として既知の弱い抑制剤ＶａｌP（ＯＰｈ）2を使用すると、コンビナト
リアルスプリット合成の標準溶液層によって、約２５０，０００の異なるテトラ
ペプチドホスホン酸ジフェニルのライブラリーが合成された。Ｂｏｃ基で保護し
た、５０の異なるアミノ酸の対称な無水物を合成し、赤外線分光法で特定し、そ
して、以下のスキームに示すアミノホスホネート６と反応させた。この反応は、
Ｂｏｃ−ジペプチド混合物と一致した1Ｈ及び31Ｐ共鳴を有する、約１００の化
合物の混合物７を与えるように組み合わせた。混合物７はフリーのアミン８に変
換し、５０の等しい部分に分割して、５０の無水物のそれぞれで処理して５Ｋラ
イブラリー９を生成した。この方法はペプチドライブラリーを完成させるために
一度繰り返した。結果として生じた脱保護されたペプチドは、ＮＨＳカルバメー
トとして誘導された。
【０１２３】
【０１２４】 ＲＮＡプール ランダムな配列のＲＮＡプール（１００Ｎ；隣接するランダムな配列の１００
のヌクレオチド；改変していないもの又は５−イミダゾール−Ｕで改変したもの
）は、上記実施例１−３で述べた様に、ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＮＨ2でくくられてい
た。
【０１２５】 ＮＨＳ−カルバメートで官能基化したペプチドライブラリーとＲＮＡ−ＮＨ2
プールとの反応 ＲＮＡプールのそれぞれにおいて、初期の反応（この初期反応は典型的な反応
例として与えられる）は、反応緩衝液（２０％ｖ／ｖメタノール、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１００
μＭ ＭｎＣｌ2、１０μＭ ＣｕＳＯ4、１０μＭ ＺｎＣｌ2、１０μＭ Ｃ
ｏＣｌ2、１０μＭ ＮｉＣｌ2、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）の２００
μｌ中に、約２ｎｍｏｌのＲＮＡ−ＮＨ2と約１００ｎｍｏｌのＮＨＳ−カルバ
メートで官能基化されたペプチドから構成されていた。次いで、２２℃で１６時
間インキュベーションし、フリーのペプチドは、大きさで振り分ける、サイズエ
クスクルージョンクロマトグラフィーによって、ＲＮＡ溶液から除去された。Ｒ
ＮＡは、分子量３０，０００でカットオフ（ＭＷＣＯ）するマイクロ遠心スピン
フィルター上の保持に引き続いて、残っているフリーのペプチドを除去するため
の広範囲にわたる洗浄により、さらに精製した。
【０１２６】 ＨＮＥとの親和性に基づくＲＮＡ配列の選択を防止するために、回収されたＲ
ＮＡは、二重らせんのＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを作成するため、負の逆転
写酵素ＲＮａｓｅＨ（上付き記号；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて逆転写された。
【０１２７】 ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤の選択 ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤の効果的な選択のための方法は、充分特定されてい
る。これらの方法は、フリーのＲＮＡと変性したポリアクリルアミドゲル上のＨ
ＮＥ−接合ＲＮＡの特異な移動性、または、ビーズで連結したＨＮＥ上における
ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤の特定の保持を利用している。第一の選択サイクルに
でＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤を選択するため、アガロースビーズ（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ６Ｂ）で接合したＨＮＥが用いられるが、ＮＨＳ−カルバメートで官能
基化されたＨＮＥ抑制剤とのアシル化反応を促進するＲＮＡのみを豊富にするよ
うにＲＮＡの数を調節することを保証するために、以下に述べるそれぞれの方法
を、選択のプロセスを通してずっと用いることができる（すなわち、異なる分割
法を交互に行うことによって、ＲＮＡの数は、取り付けたＨＮＥ抑制剤を有して
いるということ以外の理由のため、保持された核酸とともに増加することはない
）。
【０１２８】 ゲル移動シフト分割のために、回収されたＲＮＡは、ＨＮＥ反応緩衝液（１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７
．５）中の過剰なＨＮＥと結合し、室温で３０分間インキュベートされる。２容
積のゲル装填緩衝液（７Ｍ 尿素、５０％ｖ／ｖホルムアミド、０．０５％ＳＤ
Ｓ、２０ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、キシレンシアノール及びブ
ロモフェノールブルーおのおの０．１％ｗ／ｖ）を反応混合物に加え、次いで、
２０ｍＭ リン酸カリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡを泳動緩衝液として用いて、変性
ポリアクリルアミドゲル[５％アクリルアミド（１９：１ アクリルアミド：ビ
ス−アクリルアミド）、７Ｍ 尿素、５０％ｖ／ｖホルムアミド、０．０５％Ｓ
ＤＳ、２０ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ]上で電気泳動させた。電
気泳動に続いて、ＲＮＡ−ＨＮＥ接合体は、オートラジオグラフィー（ａｕｔｏ
ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）で特定し、標準的な方法で回収した。
【０１２９】 ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤をビーズで連結したＨＮＥと分割するための２つの
方法が開発されている。第１の方法では、ＨＮＥを、分割可能な結合を通じてＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂと接合させた。より詳しくは、ＤＴＴで結合手を還元す
ることによって、チオプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（シグマ社、ピリジ
ルジチオール結合手）をチオール−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂに変換した。ＤＴ
Ｔの除去後、チオールで官能基化したビーズを３−（２−ピリジルジチオール）
プロピオニル ヒドラジド（ＰＤＰＨ；Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させ、これにより
、ヒドラジドで官能基化されたビーズとジスルフィドを含む結合手とを還元剤に
よって開裂させやすくした。その後、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したＨＮ
Ｅは、ヒドラジド基を通じてビーズと結合させた。この方法で、Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅビーズと結合したＨＮＥは、十分な活性を有しており、ＲＮＡ接合−ＨＮＥ
抑制剤としての活性を保持していた。得られたＲＮＡ−ＨＮＥ接合体は、ＤＴＴ
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、≧１００ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．５）による結合手の開裂によって、ビーズから遊離しうる。ＨＮＥの特異な
遊離は、ＨＮＥ以外の母体の成分と相互作用する拡散の保持を防止する。
【０１３０】 ＨＮＥは、また、ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で被覆した
超常磁性ビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ））は、磁場
内に置かれたときのみ磁気的性質を発現する）と結合されている。この特別の適
用において重要なことは、これらの均一な大きさのポリスチレン（Ｆｅ2Ｏ3を一
様に分散したもの）のビーズが、核酸との非常に低い非特異性結合を有すること
である。ＨＮＥの結合は、まず、ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド（Ｐｉｅｒｃｅ）
で、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したＨＮＥをビオチン化し、次いで、スト
レプタビジンで被覆したビーズにビオチン−ＨＮＥを添加することにより完成さ
れた。この方法で結合させたＨＮＥもまた、ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤として十
分に効果的である。これらの非常に低い非特異性結合の性質ゆえに、ＨＮＥ−接
合ＲＮＡは、ビーズの存在下、直接拡充することができる。
【０１３１】 これまで述べた分割法のそれそれについて、最も良いＨＮＥ抑制剤は、結合反
応の説得力が大きいことから、優先的にＳＥＬＥＸ法から選ばれ得る。このこと
は、例えば、反応液の濃度を減少させることによって、インキュベーションする
時間を減らすことによって、又は、ＲＮＡ−接合ＨＮＥ抑制剤を、ＨＮＥとの結
合のための可逆的なＨＮＥ抑制剤と競争させるようにすることによって、成し遂
げられる。選択／拡充のプロセスは、ＲＮＡに特別に取り付けられたＨＮＥ抑制
剤の同一性を許容することを、ＲＮＡが促進するに充分なまでに、ＲＮＡプール
を豊富にするまで繰り返されるであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 パラレルセレックス法の最も基本的な形としてその代表的概要を示す。
【図２】 Ａ−Ｄ： パラレルセレックス法の概要を示す。ここで、促進性核酸はジエン
とジエノフィルとの間の一般的Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を仲介する。
【図３】 Ａ−Ｅ： パラレルセレックス法において、第二の反応体分子の配列を広げる
ために結合配列をいかに用いるかを示す。図２と一致する１６，３８４の可能性
のうちの５つが示される。
【図４】 Ａ−Ｃ： パラレルセレックス法の概要を示す。ここでは、促進性核酸はケト
ンとアルデヒドとの間の一般的結合形成Ａｌｄｏｌ縮合反応を仲介する。
【図５】 Ａ−Ｃ： 生成物の構造的多様性に関し図４に記載の混合Ａｌｄｏｌ反応のイ
ンパクトを示す。Ａ1-10およびＢ1-10は反応体を示す。Ｃ1-10、Ｄ1-10、Ｇ1-10 およびＨ1-10は、Ａが求核性剤でかつＢが求電子性剤である場合、形成されるジ
アステレオマーを示す。Ｅ1-10、Ｆ1-10、Ｉ1-10およびＪ1-10はＢが求核性剤で
、かつＡが求電子性剤である場合、形成されるジアステレオマーを示す。唯一の
ジアステレオマーが示され、各構造は相当するエナンチオマーを有する。
【図６Ａ】 ３つのアルキンのシクロトリマー化による置換ベンゼン環の形成を示す。
【図６Ｂ】 図６Ａに示された３つのアルキンのシクロトリマー化によるベンゼン化合物の
集合の可能性のマトリックスを示す。
【図６Ｃ】 アルキンのシクロトリマー化の機構を示す。可能な生成物の唯一が示される。
【図７】 本発明の代表的生成物をレトロ合成する可能な手法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 ＺＣＣ Ａ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA77 FB01 FB02 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA14 4C057 AA18 BB01 MM05 4C084 AA17 MA01 NA14 4H006 AA02 AB20 AC90

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂行する能力を
    有する生成物を製造する方法において、 （ａ）核酸試験混合物を調製すること、ここで該核酸試験混合物は以下からな
    る群から選ばれる一又は二以上の官能基を有する核酸を含み、アステリスクは核
    酸への官能基の結合点を示し、ｎは整数であり、該官能基は脂肪族又は芳香族位
    置で置換されていてもよい； （ｂ）該核酸試験混合物の各メンバーを第一反応物とカップリングさせて核酸
    −第一反応物試験混合物を形成すること； （ｃ）該核酸−第一反応物試験混合物を、２〜１０００の範囲の分子量の小有
    機分子からなる遊離の反応物の混合物と接触させることにより生成物ライブラリ
    ーを形成すること、ここで該生成物ライブラリーは該第一反応物と少なくとも一
    つの該遊離の反応物との間の結合形成反応の結果として形成されるものであり、
    該結合形成反応は該第一反応物にカップリングした核酸により促進されるもので
    あり； （ｄ）工程（ｃ）の生成物ライブラリーをターゲットと接触させること、ここ
    で生成物ライブラリーに対して該ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂
    行する能力を有する生成物を生成物ライブラリーの残りから分離することができ
    るものであり； （ｅ）該ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂行する能力を有する生
    成物を生成物ライブラリーの残りから分離すること、ここで該生成物を同定する
    ことができる、 からなる上記方法。
  2. 【請求項２】 該核酸試験混合物が保存された配列の領域とランダムの配列
    の領域を有する核酸を含むものである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 該第一反応物にカップリングした該核酸が、一本鎖ＲＮＡ、
    一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該核酸試験混合物が２’−又は５−位で修飾されたピリミジ
    ンを含む請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 該官能基が該核酸のリボース位置にある請求項１記載の方法
    。
  6. 【請求項６】 該官能基が該核酸の塩基位置にある請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 該官能基が該核酸のリン酸エステル位置にある請求項１記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 該第一反応物と該核酸との間でカップリングしたリンカー基
    を更に含む請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 該リンカー基が１０〜１０００Ｄの範囲の大きさを有する請
    求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該リンカー基がＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリアク
    リレート及びポリペプチドからなる群から選ばれる請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 結合形成を促進する核酸とターゲット上であらかじめ選択
    された機能を遂行する生成物を共に製造する方法において、 （ａ）核酸試験混合物を調製すること、ここで該核酸試験混合物は以下からな
    る群から選ばれる一又は二以上の官能基を有する核酸を含み、アステリスクは核
    酸への官能基の結合点を示し、ｎは整数であり、該官能基は脂肪族又は芳香族位
    置で置換されていてもよい； （ｂ）該核酸試験混合物の各メンバーに第一反応物をカップリングさせて核酸
    −第一反応物試験混合物を形成すること； （ｃ）該核酸−第一反応物試験混合物を、２〜１０００の範囲の分子量の小有
    機分子からなる遊離の反応物の混合物と接触させることにより生成物ライブラリ
    ーを形成すること、ここで該生成物ライブラリーは該第一反応物と少なくとも一
    つの該遊離の反応物との間の結合形成の結果として形成されるものであり、該結
    合形成は該第一反応物にカップリングした核酸により促進され、各生成物は核酸
    にカップリングしている； （ｄ）該生成物ライブラリーをターゲットと接触させること、ここで生成物ラ
    イブラリーに対して該ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂行する生成
    物を生成物ライブラリーの残りから分離することができるものであり； （ｅ）該ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂行する生成物と会合し
    た核酸を増幅して、該第一反応物と該遊離の反応物との間の結合形成を促進する
    核酸が豊富化された核酸の混合物を生成すること、それにより結合形成を促進す
    る該核酸と該生成物が製造される、 からなる上記方法。
  12. 【請求項１２】 更に （ｆ）増幅された核酸を該第一反応物とカップリングすること； （ｇ）該ターゲット上であらかじめ選択された機能を遂行する生成物が構造決
    定に十分な量で製造することができるまで工程（ｃ）〜（ｆ）を繰り返すことを
    含む請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該核酸試験混合物が保存された配列の領域とランダムの配
    列の領域を有する核酸を含むものである請求項１１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該第一反応物にカップリングした該核酸が、一本鎖ＲＮＡ
    、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡからなる群から選ばれる請求項１１記載の方法
    。
  15. 【請求項１５】 該官能基が該核酸のリボース位置にある請求項１１記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 該官能基が該核酸の塩基位置にある請求項１１記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 該官能基が該核酸のリン酸エステル位置にある請求項１１
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該第一反応物と該核酸との間でカップリングしたリンカー
    基を更に含む請求項１１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該リンカー基が１０〜１０００Ｄの範囲の大きさを有する
    請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該リンカー基がＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリアク
    リレート及びポリペプチドからなる群から選ばれる請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 各々が核酸試験混合物のメンバーにカップリングした第一
    反応物の混合物を遊離の反応物の混合物と接触させることからなる生成物ライブ
    ラリーを製造する方法において、該核酸試験混合物は以下からなる群から選ばれ
    る一又は二以上の官能基を有する核酸を含み、 アステリスクは核酸への化学基の結合点を示し、ｎは整数であり、該化学基は脂
    肪族又は芳香族位置で置換されていてもよく、第一の及び遊離の反応物の各々は
    ２〜１０００の範囲の分子量の小有機分子からなり、ここで該生成物ライブラリ
    ーは該第一反応物と少なくとも一つの該遊離の反応物との間の結合形成反応の結
    果として形成されるものであり、該結合形成反応は該第一反応物にカップリング
    した核酸によって促進されるものである上記方法。
  22. 【請求項２２】 該官能基が該核酸のリボース位置にある請求項２１記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 該官能基が該核酸の塩基位置にある請求項２１記載の方法
    。
  24. 【請求項２４】 該官能基が該核酸のリン酸エステル位置にある請求項２１
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該第一反応物と該核酸との間でカップリングしたリンカー
    基を更に含む請求項２１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該リンカー基が１０〜１０００Ｄの範囲の大きさを有する
    請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該リンカー基がＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリアク
    リレート及びポリペプチドからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。
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