JP2001508657A

JP2001508657A - オリゴヌクレオチドのバイオコンジュゲーション

Info

Publication number: JP2001508657A
Application number: JP53123098A
Authority: JP
Inventors: ウィリス，シー・マイケル; スティーヴンズ，アンドリュー・ダブリュー
Original assignee: プロリゴ・エルエルシー
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2001-07-03
Also published as: AU6022798A; CA2277545A1; EP1015629A1; WO1998030720A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドの５’−位のみにおいてＲＮＡオリゴヌクレオチドを他の分子体（molecular entities）とコンジュゲートする新規な方法に関する。特に、本発明の方法は５’−修飾グアノシンの存在下に転写によってＲＮＡオリゴヌクレオチドをコンジュゲート又は誘導体化する方法を開示する。また本発明は、本発明の方法によって調製される新規なバイオコンジュゲートも含む。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドのバイオコンジュゲーション発明の分野本発明は、オリゴヌクレオチドの５’−位のみにおいてオリゴヌクレオチドを他の分子体（molecular entities）とコンジュゲートする新規な方法に関する。本発明の方法はＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを合成する酵素的方法を利用する。発明の背景高い特異性でターゲット分子に結合する核酸分子をインビトロ進化させる方法が開発されてきた。この方法,、Systematic Evolution of Ligands by Exponent ial Enrichment（指数的濃縮による系統的リガンド進化）はＳＥＬＥＸと呼ばれ、下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガンドの同定法” 、現在は米国特許第５，２７０，１６３号(国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照)；これらをそれぞれ本明細書に援用する。これらの各特許出願( 本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ)には、目的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製するための、基本的には新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法によれば、核酸リガンドと呼ばれる（当業界では”アプタマー(aptamer)”とも呼ばれる）一群の生成物が得られる。これらのリガンドはそれぞれユニークな配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和性核酸リガンドを得る。多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”（これは放棄して、米国特許出願第０８／１９８，６７０号の方を選ぶ）には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択することが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（これは放棄して、米国特許出願第０８／４４３，９５７号の方を選ぶ：現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子（非ペプチド系であってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（これは放棄して、米国特許出願第第０８／４６１，０６９号を選ぶ：現在は米国特許第５，５６７，５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記載されている。米国特許出願第０８／４３４，４２５号、１９９５年５月３日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：組織ＳＥＬＥＸ”、及び米国特許出願第０８／４３３，１２４号、１９９５年５月３日出願、表題“組織ターゲットの核酸リガンド”には、組織ターゲットに対する核酸リガンドを同定、調製するためにＳＥＬＥＸを使用することが記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（これは放棄して、米国特許出願第０８／４３０，７０９号の方を選ぶ：現在は米国特許第５，６６０，９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０９／１３４，０２８号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ₂）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’ −ＯＭｅ）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２’−修飾ヌクレオチドを製造するための新規方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，６８３，８６７号）に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。ＳＥＬＥＸ法はさらに、オリゴヌクレオチド複合体を包含する。米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、標題”核酸リガンド複合体”は、核酸リガンドと親油性化合物もしくは非免疫原性高分子化合物を含む診断用または療法用複合体の製造法を記載する。ＳＥＬＥＸ法に由来する核酸リガンドは診断用途で使用されてきた（例えば、米国特許出願第０８／４８７，３２５号、１９９５年６月７日出願、標題”酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡＳ）”、米国特許出願第０８／４７９，７２９号、１９９５年６月７日出願、標題”フローサイトメトリにおける核酸リガンドの使用”及び米国特許出願第０８／６２８，３５６号、１９９６年４月５日出願、標題"核酸リガンドを用いる物質中のターゲット化合物の検出法" を参照のこと）。上記特許出願の全文、全ての定義及びＳＥＬＥＸ法の記載（但しこれに限定されない）の全てをここに援用する。オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を診断用及び研究用試薬として、また有用な治療薬として応用することに関して多くの研究が行われている。オリゴヌクレオチドを医薬化合物として使用することについては現在少なくとも３つの研究分野がある、最も進んだ分野では、タンパク質の発現を防ぎ、あるいは種々の細胞機能を阻止するために、生物体中の特定コーディング領域と結合するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられている。さらに、触媒機能をもつＲＮＡ種であるリボザイムの発見は、所望の効果を達成するであろう細胞内反応を行うために作用するＲＮＡ種の研究につながった。そして最後に、ＳＥＬＥＸ法（指数的濃縮による系統的リガンド進化）（Tuerk and Gold(1990)Sc ience 249:505）の発見は、ほとんど全ての生物学的に興味のあるターゲットと結合するようなオリゴヌクレオチドを同定できることを示した。遺伝子発現の制御手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、及び有用な医薬としてのオリゴヌクレオチドの使用の可能性は、オリゴヌクレオチドに多数の化学修飾を導入して治療活性や安定性を増加する研究を促進してきた。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞浸透性を増加すること、体内でのオリゴヌクレオチド類似体の構造又は活性を分解又は妨げるヌクレアーゼやその他の酵素からオリゴヌクレオチドを安定化すること、ターゲットＲＮＡとの結合を強化すること、ターゲットＲＮＡとの配列特異的結合をした後の分解モード( 停止事象)を提供すること及び／又はオリゴヌクレオチドの薬物動態挙動を改良することを目的として設計される。最近の研究は、ＲＮＡの二次及び三次構造が重要な生物学的機能をもちうることを示している(Tinoco et al.(1987)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52:13 5;Laeson et al.,(1987)Mol.Cell.Biochem.74:5;Tuerk et al.,(1988)Proc.Natl .Acad.Sci.USA 85:1364;Resnekov et al.,(1989)J.Biol.Chem.264:9953)。ＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ９１／１４４３６号、標題”ＲＮＡ模倣性による遺伝子発現を調節する試薬及び方法”は、１以上のタンパク質と相互作用しうるＲＮＡの一部を模倣するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を記載する。これらのオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性を与える修飾ヌクレオチド間結合を含み、細胞への浸透力が増強されており、標的オリゴヌクレオチド配列と結合しうる。治療薬及び診断薬としてのオリゴヌクレオチドの使用は急速に大きくなっており、多数の化合物が前臨床試験及びヒト臨床試験に入っている。これらの応用の多くにおいて、オリゴヌクレオチドは誘導体とされるか、あるいは別の分子体とコンジュゲートを形成する。これらのコンジュゲートは典型的には蛍光染料やその他の診断レポーター基を付着する目的で、あるいはオリゴヌクレオチドの活性又は薬物動態挙動を調節する化合物を付着する目的で行われる。例えば、Smith らは蛍光ベースのＤＮＡ配列分析に使用するために蛍光染料とコンジュゲートしたプライマーの合成を記載する（Smith et al.,(1987)Method Enzymol.155:260- 301）。Pitnerらによる米国特許第５，６５０，２７５号は分光光学的に検出可能なように標識された核酸リガンドを用いてサンプル中のターゲット化合物の存否を決定することを記載する（また、同時継続中の米国特許出願第０８／４８７，４２５号、１９９５年６月７日出願、標題”酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡＳ）”、米国特許出願第０８／４７９，７２９号、１９９５年６月７日出願、標題”フローサイトメトリにおける核酸リガンドの使用”及び米国特許出願第０８／６２８，３５６号、１９９６年４月５日出願、標題” 核酸リガンドを用いる物質中のターゲット化合物の検出法”も参照のこと）。米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、標題”核酸リガンド複合体”は、親油性化合物又は非免疫原性高分子量化合物と結合したオリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドの活性又は薬物動態挙動を調節することを記載する。ホスホエステル結合を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドと共有結合した親油性化合物がBischofbergerのＥＰ４６２１４５Ｂ１に記載されている。オリゴヌクレオチドを二量体にして、オリゴヌクレオチドを多量体プラットホームに付着するのにコンジュゲートも用いられている（Jones et al.(1 995)J.Med.Chem.38:2138）。このようなコンジュゲートを達成するいくつかの化学的方法が存在する(総説としては、Goodchild(1990)Bioconjugate Chemistry 1:165-187を参照されたい) 。オリゴヌクレオチドの５’−末端にアミンやチオールなどの化学反応官能基が存在することにより、レポーター基（Smith et al.(1987)Methods Enzymol.155: 260-301;Sproat et al.(1987)NucleicAcidsRes.15:6181-6196）及びペプチドエピトープ（Tung et al.(1991)Bioconjugate Chem.2:464-465;Bruick et al.(199 7)Chem.Biol.3:39-56）を含む様々なコンジュゲートを選択的に付着することが可能になる。末端アミノ官能基を含むオリゴヌクレオチドを用いて新規な性質をもつバイオコンジュゲートの構築が行われてきた。これらのバイオコンジュゲートを合成するより一般的ないくつかの方法においては、合成オリゴヌクレオチドの組立の最終段階でオリゴヌクレオチドの５’−末端に一級脂肪族アミン基を導入する（Tung et al.(1991)Bioconjugate Chem.2:464-465;Smith et al.(1987)M ethods Enzymol.155:260-301）。オリゴヌクレオチドの５’−末端に結合する市販の試薬（実際は様々な長さのポリメチレンコネクターをもつ一連のリンカー）は５’−アミノ−モディファイアＣ６である。これらの試薬はGlen Research Co rp(Sterling VA)から入手可能である。これらの化合物はオリゴヌクレオチドの５’−末端にフルオレセインを結合するためにKrieg(Krieg et al.(1971)Antise nse Res.and Dev.1:161)によって用いられた。興味のある巨大分子(macromolecu le)の多くは親水性であるので、これらの反応は一般的に水中で行われ、競合する加水分解を克服するために大過剰の試薬を必要とする。普通はオリゴヌクレオチド上のアミンが分子の末端に付加され、この修飾を合成後に行う場合には、完全に脱保護されているオリゴヌクレオチド上の遊離アミン及びアルコールと競合しなければならない。他の分子体にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするもう１つのよく用いられている方法では、分子体をホスホルアミダイトに変換し、これを固相支持体に固定した全長オリゴヌクレオチドの遊離アルコールに付加する。この方法はホスホルアミダイトが空気と水に感受性であり、また分子がオリゴヌクレオチドの末端にしか付加できないという事実のために理想的なものではない。さらに、充分な脱保護と支持体からのオリゴヌクレオチドの放出のために通常必要とされる激しい条件のために、多くの検出分子がこの方法には使えない。他の分子にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートする第三の方法は、アルキルチオ誘導体としたオリゴヌクレオチドをα−ハロアセチル又はマレイミド含有化合物とカップリングすることである（Jones et al.(1995)J.Med.Chem.38:2138）。５’−アミノ−５’−デオキシチミジンで終わるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する別の方法が文献に記載されている(Bruick et al.(1997)Nucleic Acid s Res.25:1309-1310)。この方法は、オリゴヌクレオチドにペプチドのライゲーションを指示するＤＮＡテンプレートを用いるものであり、ここではペプチドが反応性のチオエステル結合した中間体の形で第二オリゴヌクレオチドによって提示される。オリゴデオキシヌクレオチドは２つの方法で標識されて有力なin vivo診断画像に使用されてきた。Hnatowichは５’−末端に一級アミンをもつオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、次にこれをＮＨＳケミストリを介してペプチジルＴｃキレートにカップリングした(Hnatowich(1995)J.Nucl.Med.36:2306)。Hayesらは 5'-[フルオレニルメトキシカルボニル]-5-(E)-[2-トリ-n-ブチルスタニルビニル ]-2'-デオキシウリジン-3'-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトを合成した（Hayes et al.(1997)Nucleic Acid Res.25:2897-2901）。この試薬は自動固相合成に適しており、トロンビンアプタマーに導入された。修飾デオキシヌクレオチドは¹²³Ｉで容易にヨード化されて有力な血栓造影剤となる。これらの技術はいずれも合成デオキシオリゴヌクレオチドに適用されるものであり、合成で製造されたリボオリゴヌクレオチドには転用できない。特定の機能を持つペプチドとオリゴヌクレオチドのコンジュゲートは様々な用途に有用である。これらの例には、細胞内トラフィッキングを指示する核内輸送シグナルペプチド（Eritja et al.(1991)Tetrahedron 47:4113-4120）；細胞浸透性を増加する疎水性ペプチド(Juby et al.(1991)Tetrahedron Lett.32:879-82 2)又はポリリシン（Leonetti et al.(1991)Bioconjugate Chem.1:149-153）、及び非放射性リポーティングプローブに対する複数の結合部位を提供するポリリシン（Haralambidis et al．(1987)Tetrahedron Lett.28:5199-5202;Haralambidis et al.(1990)Nucleic Acids Res.18:493-499）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる合成ＤＮＡテンプレートからの転写はＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成に便利な方法である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ転写は、プロモーターＤＮＡ配列に関して特異的に定められる塩基から開始する（Chamberlin and Ring(1973)J.Biol.Chem.248:2235-2244）。転写される最初のヌクレオチドは通常プリンである。ＤＮＡテンプレートからＲＮＡへの転写は、その５'末端に三リン酸をもつ新しいＲＮＡを作ることで区別される。ＲＮＡ合成における開始ヌクレオチドの５’−位の修飾の効果はMartinとColeman によって研究された(Martin and Coleman(1989)Biochemistry 28:2760-2762)。M artinとColemanはＲＮＡ転写物に導入される最初のヌクレオチドは、５’−トリホスフェートが結合形成段階に用いられないという点でユニークであることを見いだした。すなわち、ワトソン／クリックの塩基対が関与するが、最初のヌクレオチドの５’領域がタンパク質への結合及び／又はＤＮＡテンプレートへの結合に関与しないことを意味する。従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ転写の開始は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン−リン酸（ＧＭＰ）又はグアノシンのいずれで開始しても有効に進行する。酵素的ＲＮＡ合成における開始剤として修飾グアノシンである５’−アミノ− ５’−デオキシグアノシンを使用することはLohseとSzostak(Lohse and Szostak (1996)Nature 381:442-444)によって記載されている。この分子の合成は難しい。今日までのところ、グアノシンが三リン酸よりも大きい５’−位の置換基を有する場合の、酵素的ＲＮＡ合成における開始剤としての修飾グアノシンの使用は示されていない。発明の概要本発明は、オリゴヌクレオチドを誘導体とするか、又は他の分子体(molecular entities)とコンジュゲートする新規で極めて効率の良い方法を記載する。特に、本発明は、ＲＮＡの酵素的合成における開始剤として５’−置換されたグアノシンを用いて、オリゴヌクレオチドの５’−位だけで誘導体としたオリゴヌクレオチドを酵素的に作製する方法を記載する。ここに記載する方法によって、反応性分子、レポーター分子、レポーター酵素、親油性分子、ペプチド及びタンパク質を含む（ただしこれに限定されない）様々な分子体を、新生の（nascent）ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−末端に付加することが可能になる。本発明の方法の最も基本的な形は以下の工程によって示される：ａ）ＤＮＡテンプレートを提供し；そしてｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせる。好ましい態様では、ＲＮＡ上の開始塩基はグアノシンであり、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。使用するヌクレオチド三リン酸のタイプはテンプレートと所望のＲＮＡ生成物の組成に依存するであろう。本発明の方法は、ＲＮＡポリメラーゼで触媒されるテンプレート依存型転写における開始剤として５’−修飾したグアノシンーリン酸（ＧＡＰ）を使用する。グアノシン開始剤は、その化学的性質がＲＮＡ転写と適合性である分子体によって５’−位で修飾される。これらのグアノシンは、グアノシン三リン酸の三リン酸基とはサイズが大きく異なる分子体によって５’−位で置換されうる。オリゴヌクレオチドとカップリングする分子体の例には、他の巨大分子、例えばオリゴヌクレオチド、親油性化合物、例えばコレステロール、リン脂質、ジアセチルクリセロール及びジアルキルグリセロール、タンパク質、ペプチド又は炭水化物、ポリスチレンなどのポリマー又は樹脂、診断検出分子、例えばビオチン又はフルオレセイン、レポーター酵素、光親和性標識、ステロイド、ＰＥＧなどの薬物動態調節因子、脂質又はリポソーム、ヘキシルアミンもしくはジエンもしくはジエノフィルなどの転写後コンジュゲーションのための反応性部分、及び結合性金属のためのキレートを含むがこれに限定されない。分子体は種々の機能を果たすために設計することができる。例えば、ビオチン又は蛍光分子などのレポーター基をバイオコンジュゲートに導入して診断試薬として使用するレポーターバイオコンジュゲートを提供することができる。ポリエチレングリコールなどの巨大分子をバイオコンジュゲートに導入して改良された薬物動態をもつバイオコンジュゲートを提供することができる。金属、特に⁹⁹ｍＴｃなどの放射性金属を結合するためのキレート剤をオリゴヌクレオチドに結合して診断画像用に用いることができる。他の放射性金属、例えばレニウム−１８８をコンジュゲートして指向性のある放射線治療用途にすることができる。バイオコンジュゲートはタンパク質の活性部位と反応性であるペプチドを含むこともできる。Bolton-Hunter試薬のようなその他の標識性ハプテンを導入して放射性ヨウ素化を可能にすることもできる。蛍光消光剤もしくはスピンラベルなどの構造プローブを導入してタンパク質−核酸の相互作用を研究することができる。共有原子価（covalent）ＳＥＬＥＸを可能にするには、プソラレン、アクリジンもしくは同様の分子などの光親和性標識をコンジュゲートすることができる。ジエンもしくはシッフ塩基などの化学体（chemical entity）を化学的共有原子価ＳＥＬＥＸのために導入することができる。パラレルＳＥＬＥＸの態様では、コンビナトリアル小分子ライブラリーを転写物にコンジュゲートできる。分子体は光親和性標識として作用するように設計することもできる。可視化もしくは抗体染色のために、組織学的プローブをバイオコンジュゲートに導入することができる。本出願はさらに、核酸リガンドの５’−位のみにおいて分子体で誘導体化される核酸リガンドを含むバイオコンジュゲートを作製する方法を開示する。この特定の態様は、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数的濃縮による系統的リガンド進化）の略称であるＳＥＬＥＸと呼ばれる核酸リガンドを同定する方法を利用する。簡単に述べると、ターゲットに対するバイオコンジュゲートは以下の工程を含むＳＥＬＥＸ法によって同定できる：１）（ａ）転写すべき配列をもつＤＮＡテンプレートを提供し、そして（ｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせる、ことを含む工程によって、候補となるバイオコンジュゲートの混合物を調製し；２）バイオコンジュゲート候補混合物をターゲットと接触させ、ここでバイオコンジュゲート候補混合物と比較してターゲットに対して高い親和性をもつバイオコンジュゲートは残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配されうるものであり；３）高い親和性のバイオコンジュゲートを残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配し；そして４）高い親和性のバイオコンジュゲートを増幅して、リガンド−濃縮されたバイオコンジュゲート混合物を得て、これによってターゲットのバイオコンジュゲートを同定する。５’−置換ＧＡＰは、（１）ＳＥＬＥＸ分配工程で、例えばＢＩＡ−ＳＥＬＥＸ（米国特許出願第08/792,075号、１９９７年１月３１日出願、表題”フローセルＳＥＬＥＸ”を参照、これを本明細書に参照として援用する）、プレートＳＥＬＥＸ（Conrad et al.(1996)Methods of Enzymol.267:336）、及びストレプトアビジンカラム分配で、（２）レポーター置換を用いるＳＥＬＥＸの進行をモニターするのに、及び／又は（３）ターゲットタンパク質と直接参加するのに、例えばブレンド（blended）ＳＥＬＥＸ（米国特許第5,683,867号、１９９７年１１月４日発行、表題”指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ” ）で、役に立つ。本発明の一つの態様は、ブレンドＳＥＬＥＸ法（米国特許第5,683,867号、１９９７年１１月４日発行、表題”指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ”：この全てを参照としてここに援用する）の延長であり、特異的に選択された性質をもつオリゴヌクレオチドを同定し、かつ作製する新規な方法を提供する。本発明のこの態様は、分子体で誘導体としたオリゴヌクレオチドを同定し合成する方法を提供する。この分子体は上で例示したような所望のオリゴヌクレオチドの性質に基づいて選択される。本発明の別の態様では、５’−誘導体化グアノシンは、転写物の転写後コンジュゲートに使用できる反応性部分を含む。本発明のこの態様は以下の工程によって記載される：ａ）ＤＮＡテンプレートを提供し、ｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン（該５’−置換基は反応性部分を含む）及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせ；そしてｃ）工程ｂ）の生成物を、該５’−置換基上の反応性部分と反応しうる部分を含む分子体と反応させる。転写と適合性でない分子体で誘導体にしたオリゴヌクレオチドを得るには転写後のコンジュゲートが必要である。反応性部分（reactive moiet ies）の例には、アミン、ジエン、ジエノフィル、チオール、ビニルスルホン、光親和性標識及びインターキレーターを含むが、これに限定されない。本発明の方法で作製される新規なコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドも本発明に含まれる。図面の簡単な説明図１は、０から１０ｍＭの範囲のＧＡＰ濃度におけるＧＡＰの導入率及びＧＡＰ転写物の収量をグラフで示す。図２は、実施例２に記載するＧＡＰ−ＴＥＧ−ビオチン／γ−³²Ｐ−ＧＴＰ開始競合アッセイの結果を示す。転写反応の生成物を変性ゲル電気泳動で分析した。全てのレーンはＧＴＰに対するＧＡＰ−ビオチンの率で表してあり、レーンＣだけは対照として６ｍＭのＧＴＰを含む。ＧＡＰ−ビオチンの濃度が増加するにつれて、γ−³²Ｐ−ＧＴＰは減少した。図３は、実施例２に記載するストレプトアビジンシフトアッセイの結果を示す。反応生成物をストレプトアビジンと組み合わせて変性ゲル電気泳動で分析した。全てのレーンはＧＴＰに対するＧＡＰ−ビオチンの率で表してある。図４Ａは、ＧＡＰ類似体１１−１６で行った転写反応の結果を示す。レーン１及び２はＧＡＰなしの転写物を含み、レーン３はＧＡＰ−ＴＥＧ転写物であり、レーン４はＧＡＰ−ビオチン転写物であり、レーン５はＧＡＰ−ＴＥＧ−ビオチン転写物であり、レーン６はＧＡＰ−Ｔｃキレート転写物であり、レーン７はＧＡＰ−ＴＥＧ−Ｔｃキレート転写物であり、レーン８はＧＡＰ−フルオレセイン転写物であり、そしてレーン９はＧＡＰ−ＴＥＧ−フルオレセイン転写物である。分析は７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル上で実施した。図４Ｂは、レーン８及び９のフルオレセイン−ＧＡＰで開始した転写物の透視を示す。図５は、ＧＡＰ−Ｔｃキレートで開始した転写物の⁹⁹ｍＴｃ標識の結果を示す。⁹⁹ｍＴｃ標識した転写物はＥＤＴＡの不在下に８％ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で分析した。レーン１は³²Ｐ全長転写物対照を、レーン２は⁹⁹ｍＴｃ標識したＧＡＰ−Ｔｃキレートを含む。発明の詳細な記述本発明は、酵素的にオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートを作製する新規な方法を含む。特に、本発明は、５’−位で特異的に分子体（molecular entiti es）で誘導体にしたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むバイオコンジュゲートを酵素的に作製する新規な方法を記載する。この方法は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するテンプレートによる（template-directed）バイオコンジュゲート合成の開始剤として５’−置換されたグアノシン類を利用する。本発明の方法は、転写前にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするのに、あるいは転写物中に反応体を導入して次にこれを転写後にオリゴヌクレオチドをバイオコンジュゲートするのに使用できる。この方法は核酸リガンド、リボザイム及びアンチセンスＲＮＡを含む様々なコンジュゲートされたリボヌクレオチドの合成に応用できる。分子体はどのような分子であってもよく、転写に適合する別の巨大分子を含む。オリゴヌクレオチドとカップリングすることのできる分子体の例には別の巨大分子、例えばオリゴヌクレオチド、親油性化合物、タンパク質、ペプチド又は炭水化物、ポリマー又は樹脂、例えばポリスチレン、診断検出分子、例えばビオチン又はフルオレセイン、レポーター酵素、光親和性標識、ステロイド、ＰＥＧなどの薬物動態調節因子、脂質又はリポソーム、ヘキシルアミンやジエンやジエノフィルなどの後転写コンジュゲートのための反応体、及び結合性金属のためのキレート剤を含むがこれに限定されない。分子体は広範な様々な機能を果たすように設計できる。例えば、ビオチンやフルオレセイン分子などのレポーター基をバイオコンジュゲートに導入して診断試薬として使用するためのレポーターバイオコンジュゲートを提供する。ポリエチレングリコールなどの巨大分子をバイオコンジュゲートに導入して改良された薬物動態をもつバイオコンジュゲートを提供する。結合性金属、特に⁹⁹ｍＴｃのような放射性金属のためのキレート剤を診断用画像目的のためにオリゴヌクレオチドに付けることができる。別の放射性金属、例えばレニウム−１８８をコンジュゲートして指向性放射線治療に応用できる。バイオコンジュゲートにはタンパク質の活性部位に反応性であるペプチドを含むこともできる。バイオコンジュゲートはオリゴヌクレオチドをカラム、固体支持体マトリックス、もしくはミクロタイタープレートの表面に付着させるのに使用できる。本発明を記載するのに使用するいくつかの用語を以下に定義する： ”ヌクレオシド”は、デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドもしくはその化学修飾体を意味する。ヌクレオシドの修飾には、２’−位の糖修飾、５−位のピリミジン修飾、８−位のプリン修飾、シトシンの環外アミンにおける修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換などを含むがこれに限定されない。 ”ヌクレオチド”は、修飾もしくは天然のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドと定義される。ヌクレオチドは典型的にはプリンとピリミジンを含み、これにはチミジン、シチジン、グアノシン、アデニン及びウリジンを含む。 ”オリゴヌクレオチド”は、先に定義したヌクレオチド単位が複数結合して形成されるポリヌクレオチドをいう。各ヌクレオチド単位は、典型的にはリン酸結合基を介して結合したヌクレオシド単位を含む。オリゴヌクレオチドの用語は、リン酸結合以外の結合を介して結合された複数のヌクレオチドも指す。オリゴヌクレオチドは天然もしくは非天然のものであってよい。好ましい態様では本発明のオリゴヌクレオチドは１−１，０００個のヌクレオチドをもつ。 ”核酸リガンド”は、ターゲットに対して望ましい作用をもつ核酸をいう。望ましい作用には、ターゲットへの結合、ターゲットの触媒的変更、ターゲットもしくはターゲットの機能的活性を修飾／改変するような方法でのターゲットとの反応、自殺阻害剤（suicide inhibitor）としてのターゲットへの共有結合、ターゲットと別の分子との反応を可能にすること、を含むがこれに限定されない。好ましい態様では、作用はターゲット分子に対する特異的結合親和性であり、このようなターゲット分子は、ワトソン／クリックの塩基対形成もしくは三重らせん結合に主として依存するメカニズムで核酸リガンドと結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここで該核酸リガンドはターゲット分子によって結合される既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。ある態様では、核酸リガンドは非天然の核酸である。本発明の好ましい態様では、核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法で同定される。核酸リガンド（該核酸リガンドはあるターゲットのリガンドである）は、ａ）候補混合物をターゲットと接触させ、ここで候補混合物と比較してターゲットに対して高い親和性をもつ核酸は残りの候補混合物から分配されうるものであり；ｂ）高い親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）高い親和性の核酸を増幅して、リガンド−濃縮された核酸混合物を得る、ことを含む方法によって、核酸の候補混合物から同定される核酸を含む。 ”核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（fluxionality）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。 ”ＤＮＡテンプレード”は、”転写”と呼ばれるプロセスで相補的リボヌクレオチドコピーを作るようにＲＮＡポリメラーゼに指示を与えるデオキシリボヌクレオチドをいう。コピーされるＤＮＡの鎖を”センス鎖”という。ＤＮＡテンプレート鎖はまた、センス鎖のスタートの前の特定の位置において酵素によるコピー合成を開始させ、またセンス鎖のエンドのやや後ろの特定の位置においてコピー合成を停止させるシグナルを与える。ＤＮＡテンプレートは一本鎖もしくは二本鎖であってよい。好ましい態様では、ＤＮＡテンプレートは二本鎖である。 “非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない、約１０００Ｄａもしくはそれ以上の化合物である。免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；多糖、例えばデキストラン；ポリペプチドペプチド、例えばアルブミン；及び磁性構造をもつもの、例えばマグネタイトである。 ”巨大分子（macromolecule）”は、大きな有機分子を言う。巨大分子の例には、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、親油性化合物、例えばコレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロール、ホルモン、医薬、非免疫原性高分子化合物、蛍光性、化学発光性及び生物発光性のマーカー化合物、抗体及びビオチンなどを含むがこれに限定されない。 ”バイオコンジュゲート”は、ここでは別の分子体で誘導体とされているいかなるオリゴヌクレオチドをもさす。好ましい態様ではオリゴヌクレオチドは巨大分子で誘導体とされる。 ”バイオコンジュゲーション”または”コンジュゲーション”は、別の分子体によるオリゴヌクレオチドの誘導体化をいう。”分子体（molecular entity）” は、いかなる分子であってもよく、小分子もしくは別の巨大分子を含む。分子体の例には、別の巨大分子、ポリマーもしくは樹脂、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリスチレン、診断用検出分子、例えばビオチン、フルオレセインもしくはクマリン、レポーター酵素、光親和性標識、ステロイド、ＰＥＧなどの薬物動態的分子、脂質又はリポソーム、ヘキシルアミンもしくはジエンもしくはジエノフィルなどの転写後コンジュゲーションのための反応性部分、及び結合性金属のためのキレートを含むがこれに限定されない。バイオコンジュゲーション及びコンジュゲーションの用語は本明細書では相互変換的に使用する。 ”治療剤”は、疾患及び傷害の治療もしくは予防に使用する化合物をいう。 ”診断剤”は、サンプル中のターゲットの存否を検出及び／又はその量を測定するために使用するバイオコンジュゲートをいう。ターゲット分子の検出は、そのターゲット分子に特異的なバイオコンジュゲートの核酸成分との結合によって行われる。バイオコンジュゲートは放射性標識などで標識して定性もしくは定量検出を行うことができる。 “改良された薬物動態特性”とは、バイオコンジュゲートが、バイオコンジュゲートの一部ではない核酸と対比して、より長い循環半減期をインビボで示すこと、あるいは非ターゲットに対する改良されたターゲット比率などのその他の薬物動態上の利益を意味する。 “ターゲット”は、核酸が予め定められた望ましい方法で作用するいかなる化合物であってもよい。ＳＥＬＥＸターゲット分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態の類似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織など、制限がない。実際、あらゆる化学的もしくは生物的要因が適切なＳＥＬＥＸターゲットたりうる。あらゆるサイズの分子がＳＥＬＥＸターゲットとして作用しうる。ターゲットは一定の方法で修飾してターゲットと核酸との相互作用を増強することもできる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＧＡＰ分子を用いる合成ＤＮＡテンプレートからの転写は、５’−位のみで誘導体化されたＲＮＡの合成に都合良くまた効率よく利用できる方法である。ＲＮＡポリメラーゼで触媒されるＤＮＡテンプレート依存性の転写においては、酵素は相補的ＲＮＡコピーを作るためのテンプレートとしてＤＮＡの一本の鎖を用いる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの転写は、プロモーターＤＮＡ配列に関連して特定して（uniquely）定められる塩基から開始する。コピー合成の開始にはＲＮＡのプライマー片は必要ではない。ヌクレオチド三リン酸が順次縮合されてＲＮＡコピーが５’−末端から３’−末端へと成長する。酵素は最初のヌクレオチド（通常はＧＴＰかＡＴＰ）に位置し、次にこのヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基が次に入ってくるヌクレオシドの５’−三リン酸と反応する。次いで、ジヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基が正しい位置に入ってくる次のヌクレオチドと縮合し、そしてこれが続く。合成はピロリン酸の加水分解によって進行する。最後に、そして本発明の中心となることであるが、新生の（nascent）ＲＮＡ中の最初のヌクレオチドの５’−三リン酸は転写に関与しない。本発明者はこの発見を利用してオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートを迅速且つ便宜的に合成する新規な方法を開発した。本発明は、５’−位のみにおいて分子体で誘導体にしたＲＮＡを含むバイオコンジュゲートを酵素的に合成する新規な方法を記載する。最も基本的な形では、本発明は以下の工程で説明される：ａ）ＤＮＡテンプレートを提供し、そしてｂ）該ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下に組み合わせる。使用するヌクレオチド三リン酸のタイプはテンプレートの組成と所望するＲＮＡ産物に依存する。本発明の方法を用いて、５’−修飾グアノシンを転写の開始フェーズ中に転写物の開始５’−末端のみに付加することができる。上述したように、転写物の伸長はピロホスフェートの加水分解によって進行するので、残ったヌクレオチドがヌクレオシド三リン酸である必要がある。５’−置換グアノシンは５’−三リン酸基をもたないので、開始には参加できるが、伸長には参加できない。従って、置換ヌクレオチド三リン酸がＲＮＡ転写物の全体にわたって導入される、ＲＮＡ合成中に置換ヌクレオチド三リン酸を酵素的に導入するその他の方法とは対照的に、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドの５’−位のみに結合した分子体を含むバイオコンジュゲートを合成するユニークな方法を提供する。転写されるべきＤＮＡテンプレート中の最初のヌクレオチドはシトシンであるので、５’−誘導体化グアノシン（ここではＧＡＰと呼ぶ）は新生のＲＮＡ転写物の最初の成分としてＧＴＰと競合する。従って、５’−置換ＲＮＡオリゴヌクレオチドと５’−非置換ＲＮＡオリゴヌクレオチドからなるバイオコンジュゲートを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドの混合物が得られるであろう。しかしながら、転写反応中の５’−誘導体化グアノシンの濃度がＧＴＰ濃度と比較して増加することにより、これに比例してより多くの誘導体化グアノシンが転写物中に導入されることになる。図１に示すように、ＧＡＰ：ＧＴＰの比率が１０：１であると、転写物の９２％がＧＡＰで開始することになる。理論的には、ＧＡＰとＧＴＰが等しい効率で開始ヌクレオチドとして使用されるとすると、ＧＡＰはその時点の９０．９１％存在するはずである。５’−置換された転写物の必要とする純度レベルに応じて、ＧＡＰ−コンジュゲート：ＧＴＰの比率を変えうる。オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートの酵素合成に基質として５’−誘導体化グアノシンを使用できることは、現在可能な方法やこれらの化合物の合成に有意な利点を与える。第一に、この方法は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの酵素合成中にＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−位に巨大分子を特異的に導入することができる。これは、合成の最終工程で修飾ヌクレオチドを導入するような方法でまずオリゴヌクレオチドを化学合成し、次に修飾オリゴヌクレオチドを分子体とコンジュゲートしなければならない伝統的で時間のかかるバイオコンジュゲートの合成法とは対照的である。第二に、５’−誘導体化グアノシンを用いることにより、長すぎて化学合成できない転写物の修飾が可能となり、応用範囲を大いに広くする。第三に、新生オリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチド三リン酸を酵素的に導入するために当業界で現在知られている方法を用いると、オリゴヌクレオチド中にいくつかの置換されたヌクレオチドをもつ修飾ヌクレオチドを合成することになる。これとは対照的に、本発明の方法ではオリゴヌクレオチドの５’ −末端のみで置換されたバイオコンジュゲートの制御された酵素合成が可能になる。本発明の一態様は、特定のターゲット分子に対する高親和性バイオコンジュゲートを作製する方法を含む。好ましい方法では、核酸リガンドをＳＥＬＥＸ法で同定する。ＳＥＬＥＸ法は米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガンドの同定法” 、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）に記載されている。これらの出願をそれぞれ本明細書に援用し、これを本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では下記の一連の工程により定義される：１）候補となる、種々の配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列の領域（すなわち候補混合物の各員子が同じ位置に同じ配列を含む）およびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は以下のように選択される：（ａ）後記の増幅工程を補助する、（ｂ）ターゲットに結合することが分かっている配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の特定の構造様式の核酸の濃度を高める。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率は１／４である）、または部分的にランダムであってもよい（たとえばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０〜１００％のいずれの水準でも選択できる）。２）ターゲットと候補混合物の員子の結合に好ましい条件下で、候補混合物を選択されたターゲットと接触させる。これらの状況は、ターゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットに対し最も強い親和性をもつ核酸の間に核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる。３）ターゲットに対し最も高い親和性をもつ核酸を、ターゲットに対しより低い親和性をもつ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当する配列はきわめて少数存在するにすぎない（おそらくわずか１分子の核酸）ので、一般に分配に際し有意量の核酸（約５〜５０％）が保持されるように分配基準を設定することが望ましい。４）分配に際し、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつとして選択された核酸を、次いで増幅させて、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつ核酸が濃縮された新たな候補混合物を形成する。５）上記の分配工程および増幅工程を反復することにより、新た形成された候補混合物が含有するユニーク配列はいっそう少なくなり、ターゲットに対する核酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にはＳＥＬＥＸ法は、最初の候補混合物からターゲット分子に対し最も高い親和性をもつ核酸に相当する１または少数の核酸を含有する候補混合物を与えるであろう。ＳＥＬＥＸ特許出願はこの方法を詳しく記載し説明してある。これには以下のものが含まれる：この方法に使用できるターゲット；候補混合物中に核酸を分配する方法；及び分配した核酸を増幅して濃縮された候補混合物を作製する。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質であるタンパク質ターゲットとそうでないタンパク質ターゲットの両方のタンパク質ターゲットを含む多数のターゲット種に対して得られたリガンド溶液についても記載する。ＳＥＬＥＸ特許出願は多数の治療及び診断用途を含む核酸リガンドの多数の使用につい記載する。この態様では、ＳＥＬＥＸ特許出願に記載されたＳＥＬＥＸ法によってバイオコンジュゲートを調製できる。簡単に述べると、ターゲットに対するバイオコンジュゲートは以下の工程を含むＳＥＬＥＸ法によって同定できる：１）（ａ）転写すべき配列をもつＤＮＡテンプレートを提供し、そして（ｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、置換グアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせる、ことを含む工程によって、候補となるバイオコンジュゲートの混合物を調製し；２）バイオコンジュゲート候補混合物をターゲットと接触させ、ここでバイオコンジュゲート候補混合物と比較してターゲットに対して高い親和性をもつバイオコンジュゲートは残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配されうるものであり；３）高い親和性のバイオコンジュゲートを残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配し；そして４）高い親和性のバイオコンジュゲートを増幅して、リガンド−濃縮されたバイオコンジュゲート混合物を得て、これによってターゲットのバイオコンジュゲートを同定する。５’−置換ＧＡＰは、（１）ＳＥＬＥＸ分配工程で、例えばＢＩＡ−ＳＥＬＥＸ（米国特許出願第08/792,075号、１９９７年１月３１日出願、表題”フローセルＳＥＬＥＸ”を参照、これを本明細書に参照として援用する）、プレートＳＥＬＥＸ（Conrad et al.(1996)Methods of Enzymol.267:336）、及びストレプトアビジンカラム分配で、（２）レポーター置換を用いるＳＥＬＥＸの進行をモニターするのに、及び／又は（３）ターゲットタンパク質と直接参加するのに、例えばブレンド（blended）ＳＥＬＥＸ（米国特許第5,683,867号、１９９７年１１月４日発行、表題”指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ” ）で、役に立つ。この方法を用いて、転写に適合性である実質的にあらゆる分子体で核酸リガンドの５’−位のみで誘導体化した核酸リガンドを調製し、同定することができる。核酸リガンドにカップリングすることのできる分子体は親油性分子、タンパク質、ペプチド、レポーター分子、レポーター酵素及びステロイドを含むが、これに限定されない。本発明の別の態様では、５’−誘導体化グアノシンは、転写物の転写後コンジュゲートに使用できる反応性部分を含む。本発明のこの態様は以下の工程によって記載される：ａ）ＤＮＡを提供し、ｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン（該５’−置換基は反応性部分を含む）及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせ；そしてｃ）工程ｂ）の生成物を、該５’−置換基上の反応性部分と反応しうる部分を含む分子体と反応させる。転写と適合性でない分子体で誘導体にしたオリゴヌクレオチドを得るには転写後のコンジュゲートが必要である。反応性部分（reactive moieties）の例には、アミン、ジエン、ジエノフィル、チオール、ビニルスルホン、光親和性標識及びインターキレーターを含むが、これに限定されない。いくつかの態様では、分子体は核酸リガンドにいくつかの望ましい性質、例えばＲＮＡの疎水性を増加して結合、膜分配及び／又は透過性を増強するなどの性質を提供する。さらに、ビオチン、フルオレセインもしくは診断用放射性核種を導入するためのペプチジル金属キレートなどのレポーター分子を付けて診断剤として使用できるバイオコンジュゲートを提供することができる。実施例１は様々な５’−修飾グアノシン一リン酸の合成を記載する。よく用いられる官能基については、転写前に関心のある部分をＧＡＰ分子にコンジュゲートする方が効率的である。これによって開始剤の大規模な合成、開始剤の転写前精製が可能となり、また転写後コンジュゲーションを行う必要がなくなる。合成された修飾グアノシンはスキーム１，２，４及び５に記載されており、これにはＧＡＰ（５）、ＧＡＰ−フルオレセイン（１１）、ＧＡＰ−ビオチン（１２）、ＧＡＰ−Ｔｃキレート（１３）、ＧＡＰ−ＴＥＧ（１０）、ＧＡＰ−ＴＥＧ−フルオレセイン（１４）、ＧＡＰ−ＴＥＧ−ビオチン（１５）及びＧＡＰ−ＴＥＧ −Ｔｃキレート（１６）を含む。ビオチン及びフルオレセインはＲＮＡに極めて有用な性質を与える非常に普遍的なコンジュゲートである。ＧＡＰ−ＴＥＧ類似体は、これがＧＡＰ類似体よりも費用がかからず、親水性でなく、また多分免疫原性が低いために合成した。ＧＡＰをビオチンなどのより疎水性である付加物とコンジュゲートするときは、水性緩衝液中での溶解度を深刻に考慮する。実施例２は、５’−位のみで修飾されたオリゴヌクレオチドを合成するために、５’−修飾グアノシンによる転写を用いることの実行可能性を説明する。この実施例はＧＡＰもＧＡＰコンジュゲートもＲＮＡ合成の開始についてＧＴＰと競合できることを示している。図１に示すように、ＧＡＰ：ＧＴＰの比率を１０：１にすると、転写物の９２％がＧＡＰで開始する結果となった。実施例２は全長生成物の収量は、ＧＡＰ−ビオチンが転写反応を阻害する結果として減少しないことも示している。実施例３は、ＧＡＰで開始した転写物の転写後コンジュゲーションを説明する。転写後コンジュゲーションは、転写に適合性でない分子体で誘導体化したオリゴヌクレオチドを得るために必要である。第一級アミン開始剤による転写により、容易に利用可能なＮＨＳケミストリを用いて広範な様々な官能基でＲＮＡの転写後コンジュゲーションを行うことが可能になる。この実施例ではＧＡＰで開始したＲＮＡをビオチンＮＨＳエステルと反応させた。実施例４は、ＧＡＰ（５）とＧＡＰ−ＴＥＧ（１０）が同程度に取り込み、同量の全長５’−修飾オリゴヌクレオチド産物が得られたことを示す。実施例５（図４Ａ）は、ＧＡＰコンジュゲート化合物１１−１６が同程度に取り込み、ＧＴＰと同量の全長産物が得られたことを示す（以下の表を参照）。この実施例は、ＧＡＰ類似体１１−１６の転写反応物の泳動とＧＡＰなしのコントロール泳動とを比較したものである。結果を以下の表に示す。図４ＢはＧＡＰ− フルオレセイン（１１）及びＧＡＰ−ＴＥＧ−フルオレセイン（１４）で開始した全長転写物がＵＶ光を照射したときに蛍光シグナルをもたらすことを示す。この実施例は、グアノシンに結合した実質的にあらゆるリンカーもしくはコンジュゲートが、究極的に転写酵素と適合性である限り、ＲＮＡ分子の５’−末端を酵素的に誘導体化するのに使用できることを明瞭に示す。実施例６は、ＧＡＰ−Ｔｃキレート（１３）で開始した転写物の⁹⁹ｍＴｃによる標識を記載する。以下の実施例は本発明を説明し、具体的に示すために記載したものであり、本発明を限定するものとみなすべきではない。実施例一般的方法全ての試薬と溶媒は製造者から受け取った状態で使用した。5'-ジメトキシトリチル-²N-イソブチリルグアノシン（１）はChem Genes Corp.から購入した。5' -アミノ-モディファイア（Modifier）Ｃ６−ＴＦＡはGlen Researchから購入した。全ての反応はオーブンで乾燥したガラス容器中、不活性雰囲気で無水条件で実施した。ＴＬＣはBaker Si250F TLCプレート-シリカゲルで行い、スポットはＵＶ光で可視化した。フラッシュクロマトグラフィーはKiloprep Column(KP-Sil ,60A)を用いてBiotage Flash 40の装置で行った。RP-HPLCはWater's Delta Pak 5μ C18 300A,3.9x150mmカラムで行った。バッファーＡ：100mM TEAA,pH7.0；バッファーＢ：ACN。温度は３０℃で流速は0.50mL／分であった。NMRスペクトルは、CDCl₃及び(CD₃)₂SOを溶媒として用い、TMSを内部標準としてBruker ARX 300分光計で記録した。電子スプレイマススペクトルは陰イオンモードを用いてFissio ns Quattro II(Beverly MA)で実施した。試料は0.1％TEAを含む1:1 MeOH/Ｈ₂O(v /v)中で10μL／分でマススペクトルメータに導入した。一般的in vitro転写Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはEnzyco,Denver,Coloradoから購入した。2'-F-CTP 及び-UTPはUSB Biochemicalsから購入した。転写のテンプレートは以下の配列を有する線状pUCプラスミドからPCRで増幅した104-bpのDNAであった：ここで太字の塩基はＴ７プロモーター配列を表し、下線の塩基はPCRプライマー領域を表す。標準の条件でin vitro転写を行い（Krupp and Soll(1987)FEBS 212 :271-275;Milligan and Uhlenbeck(1989)Methods of Enzymology 180:51-62）、転写物に2'-F ピリミジントリホスフェートを導入してこの方法に修飾を加えた（Lin et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:5229-34）。簡単に述べると、0.5から1.0μMのテンプレート濃度、0.4μMのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ濃度で、40mM Tris-HCL,pH8,4％PEG8000,12mMMgCl₂,5mM DTT,1mMスペルマジン,0.002％Triton X-100中で転写を行い、2'-F-CTP及び2'-F--UTPは3mMまで加え、ATPとGTPは最終濃度1mMまで加えた。反応は３７℃で１６−２０時間インキュベートした。実施例１．５’置換グアノシンモノホスフェートの合成 5'-(O'- ヘキシルアミノ）グアノシンモノホスフェート（GAP）の小規模固相合成最初に、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて市販の試薬からGAP（５）を合成した。酢酸保護されたグアノシンCPG（Glen Research）を出発物質として、１回のカップリング工程を用いて5'-アミノ-モディファイア（modifier）Ｃ６−ＴＦＡホスホルアミダイト（Glen Research）を付加した。生成物を固体支持体から知りだして、NaOHで脱保護し、逆相クロマトグラフィーで精製してGAP（５）を得た。この実験の成功により、以下に議論するGAP分子の大規模製造が刺激された。5'-(O' ヘキシルアミノ）グアノシンモノホスフェート（５）の大規模液相合成スキーム１はGAP（５）の大規模液相合成を示す。スキーム１ 2',3'- ジアセチル-5'-ジメトキシトリチル-²Ｎ-イソブチリルグアノシン（２） 5'-ジメトキシトリチル-²N-イソブチリルグアノシン（１）（5g,7.63mmol）をピリジン30mLとジクロロメタン（DCM）15mLに２３℃で溶解し、無水酢酸3.6mL(3 8mmol)を加えた。反応はＴＬＣ（9.5:9.5:1 ヘキサン／EtOAc／MeOH）で確認して５時間で完了した。次に溶液をEtOAc(500mL)中にとり、飽和NaHCO₃(3x30mL)で洗浄した。NaHCO₃分画をEtOAcで逆抽出した。EtOAc分画を集めてMgSO₄で乾燥し、減圧で乾燥沈殿物となるまで濃縮した。これによって¹H NMR(300MHz,(CD₃)₂SO )で測定して純粋な生成物２を5.5g(97.6％)得た。2',3'- ジアセチル-²N-イソブチリルグアノシン（３） 2',3'-ジアセチル-5'-ジメトキシトリチル-²N-イソブチリルグアノシン(２)(5 .5g,7.44mmol)をDCM 10mL中にとり、Biotage Flash 40シリカゲルカラムに充填した。トリクロロ酢酸（TCA）の３％溶液とDCM中の0.5％MeOHを用いてカラム上でジメトキシトリチルを除去した。ＴＬＣ（19:1 DCM/MeOH）で目視により確認してジメトキシトリチルがカラムから溶出した後、カラムをDCM中の0.5 ％MeOH 10容量で洗浄した。次に生成物をDCM中の1％-10％ MeOHのグラジエントで溶出した。適当な分画を集めて減圧で固体になるまで濃縮した。これにより¹H NMR(300MHz,(CD₃)₂SO)で測定して純粋な生成物３を2.96g(91％)得た。5'-(O'- ヘキシルアミノ)グアノシンモノホスフェート（GAP）（５）乾燥ACN（20mL）中の３（2.96g,6.76mmol）の攪拌溶液に、5'-アミノ-モディファイア（Modifier）Ｃ６−ＴＦＡ（3.64g,1.3当量；Glen Research）と無水AC N（374mL,26当量；Glen Research）中の0.47Mテトラゾールを加えた。反応はＴＬＣで確認して４時間で終了した。褐色が持続するようになるまで、0.1M酸化溶液（I₂/THF/ピリジン）（100mL;Glen Research）で滴定した。溶液を約１／５の容積になるまで減圧で濃縮し、EtOAc（500mL）中にとり、5％NaHSO₃（2x300mL）と飽和NaHCO₃（2x300mL）で洗浄した。水性洗浄物をEtOAc（500mL）に逆抽出し、EtOAc分画を集めてMgSO₄で乾燥し、減圧で濃縮乾燥した。これによって粗製の４を5.57g(109.8％)得た。この粗製物質を1:1 NH₄OH/CH₃NH₂(125当量：125当量) で３０分、６５℃で処理した。減圧でNH₄OHとCH₃NH₂を除去して残った物質をRP- HPLCで精製することによって固体として５を2.5g(80％)得た。生成物を¹H NMR(3 00MHz,(CD₃)₂SO)と、C₁₆H₂₆N₆O₈P(M+1):462.3としたときのＭＳ計算値で確認した。5'-(O'- テトラエチレングリコール)グアノシンモノホスフェート(GAP-TEG)（１０）の合成スキーム２に示すようにして、化合物３とTEG-フタルイミドホスホルアミダイト（８）とを反応させて5'-(O'_-テトラエチレングリコール)グアノシンモノホスフェート（GAP-TEG）（１０）を合成した。TEG-フタルイミドホスホルアミダイトの合成は以下のスキーム３に示してある。スキーム２ 5'-(O'- テトラエチレングリコール)グアノシンモノホスフェート(GAP-TEG)（１０）乾燥ACN(20mL)中の３(0.941g,2.15mmol)の攪拌溶液に、無水ACN(120mL,56.4mm ol；Glen Research)中の0.47Mテトラゾールと粗製８（1.89g）を加えた。反応はＴＬＣで確認して４時間で終了した。褐色が持続するようになるまで、0.1M酸化溶液（32mL;Glen Research）で滴定した。溶液を約１／５の容積になるまで減圧で濃縮し、EtOAc（500mL）中にとり、5％NaHSO₃（2x300mL）と飽和NaHCO₃（2x30 0mL）で洗浄した。水性洗浄物をEtOAc（500mL）に逆抽出した。有機分画を集めてMgSO₄で乾燥し、減圧で濃縮乾燥した。これによって粗製の化合物９を2.2g(11 8.8％)得た。この粗製物質を1:1 NH₄OH/CH₃NH₂(125当量：125当量)で３０分、６５℃で処理した。減圧でNH₄OHとCH₃NH₂を除去して残った物質をRP-HPLCで精製することによって、¹ H NMR(300MHz,(CD₃)₂SO)と、C₁₈H₂₉N₆O₁₁P(M+1):537.1としたときのＭＳ計算値で確認して、純粋生成物の化合物１０を0.900g(77.95％)得た。テトラエチレングリコールフタルイミドホスホルアミダイト（８）はスキーム３に示すようにして合成した。スキーム３テトラエチレングリコールモノトシレート（６）テトラエチレングリコール（100mL,575mmol）をピリジン250mLに溶解し、０℃ に冷却して、p-トルエンスルホニルクロリド（11.0g，0.1当量，575.mmol）で処理した。溶液ができたら、反応物を一晩冷蔵庫に保存した。ＴＬＣ（19:1 EtOAc /MeOH）で確認したところ反応は完了していた。反応混合物を減圧濃縮した。残渣をEtOAc 600mLに溶解してH₂O(3x2O0mL)で抽出した。H₂O分画をEtOAc 400mLで逆抽出して集めたEtOAc分画を飽和Na₂HPO₄水溶液で抽出した。有機相をMgSO₄で乾燥して減圧濃縮することにより、テトラエチレングリコールモノトシレート（６）を無色オイルとして18.0g(90.2％)得た。テトラエチレングリコールモノフタルイミド（７）無水DMF(225mL)中の粗製６（18.0g，51.7mmol）の攪拌溶液に、フタルイミド8 .0g（1.05当量，54.3mmol）と1,8-ジアザビシクロ[5.5.0]ウンデク-7-エン8.12m L(1.05当量,54.3mmol)を加えた。溶液を７０℃で１８時間加熱して減圧濃縮した。ＴＬＣ（19:1 EtOAc/MeOH）で確認したところ反応は完了していた。粗製黄色オイルをBiotage Flash 40シリカゲルカラムを用いるフラッシュクロマトグラフィーで、25％ EtOAc/ヘキサン、50％ EtOAc/ヘキサン、75％ EtOAc/ヘキサン、EtOAc、及び10％MeOHで溶出して精製し、化合物７をオイルとして13.7g (82％)得た。放置すると７はワックス状の白色固体となった。 1- フタルイミド-テトラエチレングリコール(ジイソプロピルアミノ)-β-シアノエトキシホスフィン（８）７のアリコート1g(3.1mmol)をTHF(20mL)にとり、減圧乾燥してオイル状とし、次にこれをアルゴン下にTHF（20mL）に再溶解した。この攪拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（702μL，4.0mmol）と2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（762μL,3.41mmol;Aldrich）を加えた。ＴＬＣで確認したところ反応は３０分で完了した。溶液を減圧乾燥してオイル状にし、これをEtOAc(300mL)にとり、Ｈ₂O(2x100mL)で洗浄し、有機相をMgSO₄で乾燥した。これによって粗製化合物８を1.89g(116.5％)得て、さらにこれを精製することなく使用した。NHS エステル活性化分子を化合物５（スキーム４）及び１０（スキーム５）の5'- アミノ末端とコンジュゲートするための一般的方法 DMSO(219.5μL,20mg/mL)とTEA(11.5μL,5％)中の５又は８（10mmol）の溶液に、所望のNHSエステル分子（20mmol）を加えた。RP-HPLCで確認したところ反応は１時間で完了した。５’修飾したグアノシンモノホスフェートの精製は逆相クロマトグラフィーで行った。粗製反応混合物1gをWaters Delta Pak C-18カラム(50 x300mm)に充填して100mM炭酸トリエチルアミン(pH8)中のアセトニトリルの2％から50％グラジエント（１０８分）で12mL／分の速度で流して分離を行った。分析用の分離はWaters Delta Pak C-18カラム(4.9x150mm)で、100mM酢酸トリエチルアミン（pH7）中のアセトニトリルの２％から50％グラジエント(５４分)で1mL／分の速度で流して行った。RP-HPLC により精製して化合物１１−１６を得た（18mmol,90％）（スキーム３及び４）。スキーム４スキーム５ビオチンアミドカプロエート5'-(O'-ヘキシルアミノ)−グアノシンモノホスフェート（１４） DMSO(21.85mL,20mg/mL)及びTEA(1.15mL,5％)中の５（1mmol）の溶液に、ビオチンアミドカプロエート N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（909mg,2当量）を加えた。RP-HPLCで確認したところ反応は１時間で完了した。RP-HPLCで精製して純粋生成物化合物１４を719.8mg(90％)得た。実施例２．開始競合アッセイ GAP/ γ-³²P-GTP開始競合アッセイ転写反応の開始についてGTPと競合するGAP（５）の程度を測定するために γ-³²P-GTPを用いて一連の転写反応を実施した。上述した標準条件下で反応を行った。反応は、０から10mMの最終濃度でGAP分子を加え、一方GTP(1mM)とγ標識した³²P-GTPは固定濃度にした。³²Pはγ位にあるので、転写を開始するGTP分子のみが転写物中に放射性標識を取り込むことになる。反応生成物を変性ゲル電気泳動で分析した。全長転写物のバンドをゲルから切り出し、ゲルスライスからＲＮＡを溶出して260nmにおけるＵＶ吸収により定量した。以下の式を用いて取り込み率を計算した：（１−CPM_[GAP」／CPM_[init.]）ｘ100 式中、CPM_[GAP]は、あるGAP濃度における全長バンドのCPMを表し、CPM_[init.]は、0mMのGAP濃度における全長バンドのCPMを表す。結果を図１に示すが、これによるとGAPの濃度が増加するとこれに対応してγ-³²P-GTPの取り込みが減少することを示す（図１）。各反応は同じ収率の全長転写物をもたらした。量からすると、ＧＡＰはＧＴＰと同程度に開始ヌクレオシドとして用いられたことを示す。GAP-TEG- ビオチン/γ-³²P-GTP競合アッセイ固定量のGTP(1mM)とγ-³²P-GTPを用い、１GTPに対して0,0.1,0.5,1,2,4及び10 の比率を与えるようにGAP-TEG-ビオチン（１５）の濃度を増加させて第二の一連の反応を行った。反応生成物を変性ゲル電気泳動で分析したところ、GAP-TEG-ビオチン濃度の増加と対応してγ-³²P-GTPの取り込みが減少した（図２）。GAP-TE G-ビオチンによる競合は、GTPに対するGAP-TEG-ビオチンの比率と一致している。GAP- ビオチン阻害アッセイ上述した標準条件下で転写反応を実施した。ただし、α-³²P-ATPを転写産物を内部標識するために加えた。GAP-ビオチン（１２）に対するGTPの比率を再度０から１０倍過剰にして用いて同じ一連の転写反応を行った。各反応におけるGAP の量が増加しても全長生成物の量は同じであり、これはGAP-ビオチンがＲＮＡ転写を阻害しないことを示している。ストレプトアビジンシフトアッセイ０から１０倍比率のGAP-ビオチンについての転写反応生成物を37.5mM Tris, pH7.5中の10μMストレプトアビジンと合わせた。反応生成物を変性ゲルで分析し、ホスホイメジャー（phosphoimager）で定量した。ストレプトアビジンシフトの量は取り込まれたに違いないGAP-ビオチンの理論量と相関していた(図３)。GAP- ビオチン取り込み５’第一級アミンの存在を、NHS-ビオチンがGAP転写物とコンジュゲートする能力によって評価した。漸次増加する濃度のGAPの存在下に転写物を合成した。得られる転写物を１００倍過剰のＮＨＳ−ビオチンとコンジュゲートした。コンジュゲーション転写物を５倍過剰のストレプトアビジンと混合した後、８％尿素ポリアクリルアミドゲルに適用した。これらのデータはGAPが存在しないときにはビオチンの取り込みはなく、転写反応に加えたGAPの増加と共にゲルシフトした転写物の率が増加することを示す。ゲルシフトアッセイは約７０％で最大に達し、これはコンジュゲートした転写物のγ-³²P-ATP-GTPアッセイ又はHPLCと比較して、最高のGAP:GTP比率におけるGAP取り込みを低く評価した。 GAPに代えてGAP-TEGで同じ実験を繰り返すと、同じ結果になるであろう。実施例３．GAPRNA転写物の転写後ビオチン化 GAPで開始したＲＮＡを１５：１のGAP対GTP濃度で転写した。精製していない全長GAP RNA(TEA塩)の末端にある５'アミンを無水DMSO/10％TEA中の長鎖ビオチンNHSエステルとコンジュゲートした。ビオチンNHSエステルをビオチン５当量で１時間にわたって加え、次いでさらに５当量を１時間にわたって加えた。ビオチン化した転写物をエタノール沈殿により精製して遊離ビオチンを除去した。転写後コンジュゲーションを確認するために転写反応生成物を大過剰のストレプトアビジン（37.5mM Tris,pH7.5中の10μMストレプトアビジン）と合わせた。生成物を変性ゲルで分析するとストレプトアビジンシフトを示した。ビオチンの５０％のストレプトアビジンの存在下では、コンジュゲートしたＲＮＡ物質はゆっくりと移動するストレプトアビジン複合体にシフトした。実施例４．GAP（５）及びGAP-TEG（１０）による転写上述した標準条件下で、GTP濃度に対して１０から１の比率で加えたGAP（５）又はGAP-TEG（１０）による転写反応を行った。反応生成物を変性ゲルで分析したところ、GAP及びGAP-TEGによる転写は同じ収量の全長転写物をもたらすことを示した。実施例５．GAP及びGAP-TEGコンジュゲートによる転写本実施例はGAPコンジュゲート（１１−１３）及びGAP-TEGコンジュゲート（１４−１６）の取り込みを記載する。転写反応は、104-bpの転写テンプレートにα -³²P-ATPを追加して、上述した標準条件下で転写反応を平行して行った。GTP濃度に対して１０から１倍の比率でGAPコンジュゲートを加えた。標準ＲＮＡ転写反応に修飾グアノシンを加えない対照反応を行った。反応生成物を７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ゲルをオートラジオグラフィで可視化した（図４Ａ）。全長転写物に対応するバンドをゲルから切り出し、溶出してＵＶ分光計で定量した。分析結果は、全ての修飾グアノシン化合物が対照と同じ収量の全長転写物を生じたことを示した。全長GAP-フルオレセイン及びGAP-TEG- フルオレセイン転写物中のフルオレセインの存在を検出するためにレーン８及び９を透視した。全ての場合において、GTP濃度に対して１０倍過剰の修飾グアノシンは転写収率の減少を示さなかった。実施例６．GAP-Tcキレート（１３）転写物の標識 GAP-Tcキレート（１３）で開始した転写物1nmoleに、100mM NaPO₄バッファー, pH8.5を200μL，シュウ酸ナトリウム23mg/mL及び、１２時間以内使用の99-Moカラムから溶出した⁹⁹mTcパーテクネテート50μL(5.0mCi)を加えた。5mg/mL SnCl₂ を10μＬ加えて標識反応を開始した。反応混合物を９０℃で１５分インキュベートした。30,000ＭＷのカットオフメンブラン（Centrex,Schleicher & Scheull）を通すスピン透析によって未反応⁹⁹m Tcから反応混合物を分離した。この標識プロトコルによって添加した⁹⁹m Tcの３０−５０％が2-4mCi/nmoleRNAの特異活性で取り込まれた。⁹⁹m Tcで標識した転写物をEDTAの不在下に８％ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で分析した。定量の結果は、スピン透析後に９7％以上の99m Tcが全長転写物と関連していたことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．バイオコンジュゲートを合成する方法であって、以下の工程：ａ）転写のためのＤＮＡテンプレートを提供し、ここで転写されるべき最初のヌクレオチドはシトシンであり；そしてｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、リボース環の５’−位において分子体で誘導体化されたグアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせる、を含む上記方法。２．５’−標識グアノシンからなる群より選択される分子体が巨大分子、ポリマー、樹脂、診断用検出分子、レポーター酵素、光親和性標識、ステロイド、薬物動態調節因子、転写後コンジュゲーションのための反応性部分、及び結合性金属のためのキレートからなる群より選択される請求項１記載の方法。３．ポリマーがＰＥＧ及びポリスチレンからなる群より選択される請求項２記載の方法。４．診断用検出分子がビオチン、フルオレセイン及びクマリンからなる群より選択される請求項２記載の方法。５．薬物動態調節因子がリポソームである請求項２記載の方法。６．反応性部分がヘキシルアミン、ジエン又はジエノフィルからなる群より選択される請求項２記載の方法。７．リボース環の５’−位において誘導体化されたグアノシンがＧＡＰ、ＧＡＰ−フルオレセイン、ＧＡＰ−ビオチン、ＧＡＰ−Ｔｃキレート、ＧＡＰ−ＴＥＧ、ＧＡＰ−ＴＥＧ−フルオレセイン、ＧＡＰ−ＴＥＧ−ビオチン及びＧＡＰ− ＴＥＧ−Ｔｃキレートからなる群より選択される請求項１記載の方法。８．ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項１記載の方法。９．ヌクレオチド三リン酸がリボース環の２’−位で修飾されている請求項１記載の方法。１０．ヌクレオチド三リン酸が塩基の５−位で修飾されている請求項１記載の方法。１１．分子体が治療剤、診断剤としての用途、又は放射性治療用の用途から選択される請求項１記載の方法。１２．分子体が薬物動態挙動の改良、疎水性の増加、結合の増強、膜分配の増強及び透過性の増強を行うために選択される請求項１記載の方法。１３．請求項１記載の方法によって形成される生成物。１４．ターゲットに対するバイオコンジュゲートを同定する方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）ＤＮＡテンプレートを提供し、そして（ｉｉ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、リボース環の５ ’−位において分子体で誘導体化されたグアノシン及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせる、ことを含む工程によって、候補となるバイオコンジュゲートの混合物を調製し；（ｂ）バイオコンジュゲート候補混合物をターゲットと接触させ、ここでターゲットに対して高い親和性をもつバイオコンジュゲートは残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配されうるものであり；（ｃ）高い親和性のバイオコンジュゲートを残りのバイオコンジュゲート候補混合物から分配し；そして（ｄ）高い親和性のバイオコンジュゲートを増幅して、リガンド−濃縮されたバイオコンジュゲート混合物を得て、これによってターゲットに対するバイオコンジュゲートを同定する、を含む上記方法。１５．さらに（ｅ）工程（ｂ）から（ｄ）を繰り返す、ことを含む請求項１４記載の方法。１６．バイオコンジュゲートが核酸リガンドの５’−末端で分子体により誘導体化された核酸リガンドを含む請求項１４記載の方法。１７．分子体が巨大分子、ポリマー、樹脂、診断用検出分子、レポーター酵素、光親和性標識、ステロイド、薬物動態調節因子、転写後コンジュゲーションのための反応性部分、及び結合性金属のためのキレートからなる群より選択される請求項１４記載の方法。１８．ポリマーがＰＥＧ及びポリスチレンからなる群より選択される請求項１７記載の方法。１９．診断用検出分子がビオチン、フルオレセイン及びクマリンからなる群より選択される請求項１７記載の方法。２０．薬物動態調節因子がリポソームである請求項１７記載の方法。２１．反応性部分がヘキシルアミン、ジエン又はジエノフィルからなる群より選択される請求項１７記載の方法。２２．リボース環の５’−位において誘導体化されたグアノシンがＧＡＰ、ＧＡＰ−フルオレセイン、ＧＡＰ−ビオチン、ＧＡＰ−Ｔｃキレート、ＧＡＰ−ＴＥＧ、ＧＡＰ−ＴＥＧ−フルオレセイン、ＧＡＰ−ＴＥＧ−ビオチン及びＧＡＰ− ＴＥＧ−Ｔｃキレートからなる群より選択される請求項１４記載の方法。２３．ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項１４記載の方法。２４．ヌクレオチド三リン酸がリボース環の２’−位で修飾されている請求項１４記載の方法。２５．ヌクレオチド三リン酸が塩基の５−位で修飾されている請求項１４記載の方法。２６．ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項１４記載の方法。２７．ＤＮＡテンプレートがランダム領域及び固定領域を含む請求項１４記載の方法。２８．ターゲットが、タンパク質、ペプチド、組織、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素及び増殖因子からなる群より選択される請求項１４記載の方法。２９．組織が結合組織、上皮、筋肉組織、神経組織、器官、腫瘍、リンパ節、動脈及び細胞からなる群より選択される請求項２８記載の方法。３０．分子体が治療剤、診断剤としての用途、又は放射性治療用の用途から選択される請求項１４記載の方法。３１．分子体が薬物動態挙動の改良、疎水性の増加、結合の増強、膜分配の増強及び透過性の増強を行うために選択される請求項１４記載の方法。３２．請求項１４記載の方法によって形成される生成物。３３．バイオコンジュゲートを合成する方法であって、以下の工程：（ａ）ＤＮＡテンプレートを提供し；（ｂ）ＤＮＡテンプレートをヌクレオチド三リン酸、５’−置換グアノシン（該５’−置換基は反応性部分を含む）及びＲＮＡポリメラーゼと転写に適した条件下で組み合わせ；そして（ｃ）工程（ｂ）の生成物を、該５’−置換基上の反応性部分と反応しうる部分を含む分子体と反応させる、を含む上記方法。３４．反応性部分がアミン、ジエン、ジエノフィル、チオール、ビニルスルホン、光親和性標識及びインターキレーターからなる群より選択される請求項３３記載の方法。３５．ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項３３記載の方法。３６．分子体が治療剤、診断剤としての用途、又は放射性治療用の用途から選択される請求項３３記載の方法。３７．分子体が薬物動態挙動の改良、疎水性の増加、結合の増強、膜分配の増強及び透過性の増強を行うために選択される請求項３３記載の方法。３８．請求項３３記載の方法によって形成される生成物。