JP2003506025A

JP2003506025A - Ｃｄ４０リガンドに対する核酸リガンド

Info

Publication number: JP2003506025A
Application number: JP2001513967A
Authority: JP
Inventors: コルマン，アラン・ジェイ; ゴールド，ラリー
Original assignee: ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2003-02-18
Also published as: AU6612500A; WO2001009160A1; CA2380545A1; AU777043B2; EP1203008A1; EP1203008A4; US6171795B1

Abstract

(57)【要約】ＣＤ４０リガンドの核酸リガンドを生成するための方法を提供する。発明の方法は核酸リガンドの単離に関しＳＥＬＥＸ法を使用する。発明は更に、ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンド及び核酸リガンドを用いた疾患の治療及び診断に適した方法及び組成体も含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は対数濃縮によるリガンドの系統的発展（Systematic Evolution of Li
gands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）として知られる方法を利用
した、標的分子に対する特異的機能を有する核酸リガンドを生成する方法を目的
とする。発明はＣＤ４０リガンドの核酸リガンドを目的とする。

【０００２】発明の背景ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４としても知られる）はＴＮＦファミリー分子の
一員である。それは活性化Ｔ細胞上に発現されたＩＩ型膜蛋白質（Ｎ−末端が細
胞質にあり、Ｃ−末端が細胞外にある）である。ヒト蛋白質は２６１残基長を持
ち、単一のＮ−結合型炭水化物部分を有する。ＣＤ１５４に対する抗体は複数の
実験系にてＴ細胞と抗体を介した免疫反応を抑制することが示されている。これ
には移植片拒絶の阻害や自己免疫疾患の阻止が含まれる（Ｄｕｒｉｅら、（１９
９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３２８）。抗−ＣＤ４０リガンド抗体とＣＤ
２８遮断剤（即ちＣＴＬＡ−４１ｇ）の併用は、マウス及びアカゲザルモデルの
両方に於いて移植片拒絶の阻止に有効であることが示されている（Ｌａｒｓｅｎ
ら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８１：４３４；Ｋｒｉｋ（１９９７）Ｐｒｏ
ｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：８７８９）。ごく最近、アカゲザル腎
臓同種移植に於ける単一作用物質としての抗−ＣＤ４０リガンド抗体の使用が極
めて効果的であることが示された（Ｋｉｒｋら、（１９９９）ＮａｔｕｒｅＭ
ｅｄｉｃｉｎｅ５：６８６）。

【０００３】ＣＤ４０リガンドは活性化血小板でも発現されており、この観察は血管生物学
に於けるＣＤ４０リガンド−ＣＤ４０相互作用の役割に関し大変興味深い（Ｈｅ
ｎｎら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：５９１）。血管内皮細胞及び平滑
筋細胞でのＣＤ４０及びＣＤ４０リガンドの発現も報告されている（Ｍａｒｃｈ
ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．９４：１９３１）。ある報告は
ＣＤ４０リガンド：ＣＤ４０相互作用がアテローム性動脈効果障害の発生を軽減
することを示唆している（Ｍａｃｈら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９４：２
００）。アテローム性動脈硬化症は免疫システムの炎症プロセスが役割を果たす
と考えられている疾患状態と考えられている。ＣＤ４０リガンドの活性を阻害す
ることの潜在的治療結果を考えるとき、この分子に高い親和性と高い特異性を持
つ阻害剤が望まれる。

【０００４】核酸は主に情報的な役割を持つものであるという考えが長い間定説であった。
対数濃縮によるリガンドの系統的発展として知られるＳＥＬＥＸ法と命名された
方法により、核酸が蛋白質とは異ならない三次元構造上の多様性を有することが
明らかになりつつある。ＳＥＬＥＸ方は標的分子に高い特性で結合する核酸分子
のインビトロ発展に関する方法であり、１９９０年、６月１１日提出の“対数濃
縮リガンドの系統的発展（Systematic Evolution of Ligands by EXponential e
nrichment）”と題された米国特許出願第０７／５３６、４２８号、現在放棄さ
れた“核酸リガンド”と題された米国特許第５、４７５、０９６号及び“核酸リ
ガンドを特定する方法”と題された米国特許第５、２７０、１６３号（ＷＯ９１
・１９８１３も参照）に記載されており、いずれもその全てが参照されここに具
体的に援用する。ここで集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称されるこれら各出願は
、所望標的分子に対する核酸リガンドを作製する新規の方法を原理的に記載する
。

【０００５】ＳＥＬＥＸ法はそれぞれ特有の配列を有する核酸リガンド又はアプタマーと呼
ばれ、そして望まれる標的化合物又は分子に特異的に結合する性質を持つ部類の
産物を提供する。ＳＥＬＥＸにより特定された各核酸リガンドは、それぞれ特定
の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が各種の
２次元及び３次元構造を形成する十分な能力を有し、そしてそれらモノマーが十
分な化学的融通性を有しており単量体又は多量体にかかわらず実質的にいずれか
の化合物に対し実際的にリガンドとして機能する（特異的結合対を形成する）と
いう洞察に基づくものである。高親和性結合の応用に適用されるＳＥＬＥＸ法に
は、候補オリゴヌクレオチド混合体からの選別すること、同一の包括的な選別計
画を用いて段階的に結合、分配及び増幅を相互に実施することが含まれ、実際的
に望まれる結合親和性及び選択性の基準を達成する。核酸混合体、好ましくは無
作為化された配列の断片を含む混合体より開始し、ＳＥＬＥＸ法は結合に関し好
ましい条件の下に混合体を標的と接触させる段階、標的分子に特異的に結合した
核酸から非結合型の核酸を分配する段階、核酸−標的複合体を解離させる段階、
核酸−標的複合体より解離した核酸を増幅し核酸混合体に富んだリガンドを得る
段階、そして更に標的分子に対する高い特異性と高い親和性を有する核酸リガン
ドを得るまで望まれる回数結合、分配、解離及び増幅の段階を繰り返することを
含む。

【０００６】本発明者は、ＳＥＬＥＸ法が化合物としての核酸が様々な配列の形、大きさ及
び配置を形成でき、そして生物学的システムに於いて核酸が示す範囲を遙かに超
える広い範囲の結合及びその他機能を持つことができることを例示していること
を認識した。

【０００７】基本のＳＥＬＥＸ法は複数の特定の目的を達成するために変更されている。例
えば共に”構造を基に核酸を選択する方法”と題される、現在放棄されている１
９９２年１０月１４日提出の米国特許出願第０７／９６０、０９３号、及び米国
特許第５、７０７、７９６号は、例えば屈曲したＤＮＡの様な特定の構造特性を
持った核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と結びつけたＳＥＬＥＸ法を記
載している。現在放棄されている”核酸リガンドの光選択”と題された１９９３
年９月１７日提出の米国特許出願第０８／１２３、９３５号、共に”対数濃縮に
よるリガンドの系統的発展：核酸リガンドの光選択及びＳＥＬＥＸ法”と題され
た米国特許第５、７６３、１７７号及び米国特許第６、０１１，５７７号は、標
的分子に結合でき、そして／又は光架橋でき、そして／又は光不活性化できるし
光反応性官能基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸをベースとした
方法を記述している。”テオフィリンとカフェリンを識別する高親和性核酸リガ
ンド”と題された米国特許第５、５８０、７３７号は、密接に関係する分子を区
別できる極めて特異的な核酸リガンドを同定する、カウンターＳＥＬＥＸと呼ば
れる方法を記述している。”対数濃縮によるリガンドの体系的発生：ＳＥＬＥＸ
法”と題された米国特許第５、５６７、５８８号は、標的分子に対し高い親和性
と低い親和性を持つオリゴヌクレオチドを高い効率で分配することができるＳＥ
ＬＥＸをベースとした方法を記載している。

【０００８】ＳＥＬＥＸ法はリガンドに、改良されたインビボでの安定性又は改良された運
搬特性といった改良特性を付与する修飾ヌクレオチドを含んでいる高親和性核酸
リガンドを特定することも包含する。この様な修飾の例には、リボース及び／又
はリン酸塩及び／又は塩基位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法で同定
された修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドは、”修飾ヌクレオチドを含む高親
和性核酸リガンド”と題された、５−及び２’位置のピリミジンが化学修飾され
ているヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５、
６６０、９８５号に記載されている。上記米国特許第５、５８０、７３７号は、
２’−アミノ（２’−）ＮＨ₂、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−
Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１又はそれ以上のヌクレオチドを含む
高特異的核酸リガンドを記載する。 ”分子内求核転位による既知及び新規２’
修飾ヌクレオチドの新規調製方法”と題された米国特許出願第０８／２６４、０
２９号は各種２’−修飾型ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記述している
。

【０００９】ＳＥＬＥＸ法は、”対数濃縮によるリガンドの系統的発展：キメラＳＥＬＥＸ
法”と題された米国特許第５、６３７、４５９号及び”対数濃縮によるリガンド
の系統的発展：混合型ＳＥＬＥＸ法”と題された米国特許第５、６８３、８６７
号にそれぞれ記述されている様に、選択されたオリゴヌクレオチドを別の選択オ
リゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能性単位と組み合わせることを包
含する。この様な応用により広範囲の形状及びその他特性の組合せが可能となり
、その他分子の望ましい特性を持つオリゴヌクレオチドの効果的な増幅及び特性
の複製が可能になる。

【００１０】ＳＥＬＥＸ法は更に”核酸リガンド複合体”と題された米国特許第６、０１１
、０２０号に記載の如く、選択された核酸リガンドを於いて親油性化合物又は非
免疫原性の高分子化合物と混合することも包含する。基本のＳＥＬＥＸ法の改良
を記載する上記各特許出願は、その全てがここに参照され特異的に援用する。

【００１１】ＣＤ４０リガンドに高い特性と親和性で結合する核酸リガンドを特定するのに
使用できる方法を提供することが本発明の目的の一つである。更に、結合した時にＣＤ４０リガンドの活性を阻害するＣＤ４０リガンドに対
する核酸リガンドを得ることが本発明の別の目的である。

【００１２】発明の概要本発明はヒトＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを特定し、製造する方法
及びそれにより特定され、製造された核酸リガンドを含む。方法は対数濃縮によ
る体系的反転に関するＳＥＬＥＸ法を用いる。具体的にはヒトＣＤ４０に特異的
に結合することができるＲＮＡ配列が提供される。またピリミジンの２’位置が
修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドも含まれる。具体的には発明
には表２及び３（配列番号１−３１）に示すＲＮＡリガンド配列が含まれる。発
明の核酸リガンドはＣＤ４０とその受容体ＣＤ４０との相互作用を阻害すること
ができる。ＣＤ４０リガンドに対する高親和性核酸リガンドは免疫系の病気の治
療や診断に多くの利用が考えられる。

【００１３】発明の詳細な説明ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを特定するためにここで使用されてい
る中心的方法は、対数濃縮によるリガンドの体系的発生の頭文字を取りＳＥＬＥ
Ｘ法と呼ばれており、そして（ａ）ＣＤ４０リガンド、又はＣＤ４０リガンドに
対応する発現ドメイン又はペプチドと核酸混合物とを接触させること；（ｂ）Ｃ
Ｄ４０リガンドに対する親和性に基づき前記候補体混合物のメンバーを分配する
こと；及び（ｃ）選択された分子を増幅してＣＤ４０リガンドへの結合に関し比
較的高い親和性を持つ核酸配列に富む核酸混合物を得ることを含む。

【００１４】

【定義】

ここでは本発明の側面を表すために様々な用語が用いられている。本発明の構
成要素の記載を明確化することを支援する目的で、以下の定義が提供される。

【００１５】ここで用いる場合、”核酸リガンド”とは標的上に望ましい作用を有している
非天然に生ずる核酸である。核酸リガンドは”アプトマー”と称されることが多
い。所望作用には、標的への結合、標的を触媒的に変更すること、標的そのもの
又は標的の機能活性を修飾／変更する様式で標的に作用すること、自殺的阻害剤
として標的に共有的に結合すること、標的と多分子との相互作用を促進すること
が含まれるが、これらに限定されるものではない。好適実施態様では、作用は標
的分子に関する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は主にワトソン／
クリックの塩基対合又は３重鎖結合に依存したメカニズムで核酸リガンドに結合
するポリヌクレオチドとは異なる３次元的化学構造体であり、前記核酸リガンド
は標的分子との結合に関し既知である生理学的機能を有していない。本発明では
、標的はＣＤ４０リガンド又はその一部領域である。核酸リガンドはある標的の
リガンドにあって、次を含む方法により核酸候補体混合物より特定された核酸を
含む：ａ）それにより候補体混合物に比べ標的に対し高い親和性を有する核酸が
残りの候補体混合物より分離するために、候補体混合物と標的とを接触させるこ
と；ｂ）高い親和性を持つ核酸を残りの候補体混合物より分離すること；及びｃ
）高親和性核酸を増幅して核酸の富リガンド混合体を得ること。

【００１６】ここで用いる”候補体混合物”とは、そこから所望のリガンドが選択される各
種配列の核酸の混合体である。候補体混合物の供給源は天然に生ずる核酸又はそ
の断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸又は前記技術の組合
せにより作製された核酸である。好適実施態様では、各核酸は増幅工程を促進す
るために、無作為領域周辺に一定の配列を有している。

【００１７】ここで用いる場合、”核酸”はＤＮＡ、ＲＮＡ、単鎖又は２本鎖型、およびそ
の化学的修飾体の何れかである。修飾には、追加の電荷、極性、水素結合、静電
的相互作用、及び流動性を核酸リガンド塩基あるいは核酸リガンド全体に組み込
むための修飾が含まれるが、これらに限定されない。この様な修飾には２’−位
置の糖の修飾、５−位置のピリミジンの修飾、８−位置のプリンの修飾、環外ア
ミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの
置換；主鎖の修飾、メチル化、イソベースイソシチジンやイソグアニジンの様な
異常な塩基対合等が含まれるが、これらに限定されるものではない。修飾には更
にキャッピングの様な３’及び５’の修飾も含むことができる。

【００１８】 ”ＳＥＬＥＸ”法は、例えば蛋白質への結合の様な所望様式にて標的と相互作
用する核酸リガンドの選択と、これら選択された核酸の増幅とを組み合わせるこ
とを含む。選択／増幅段階の最適な反復により、非常に多数の核酸を含むプール
より標的と最も強く相互作用する１又は少数の核酸の選択が可能となる。選択／
増幅手順の循環は選択の最終目標が達成されるまで続けられる。本発明では、Ｓ
ＥＬＥＸ法はＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを得るために実施される。

【００１９】ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許明細書に記載されている。 ”ＳＥＬＥＸ標的”又は”標的”は、リガンドが望まれる関心の化合物又は分
子を意味する。標的は限定されることなく、蛋白質、ペプチド、炭水化物、多糖
類、糖蛋白質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移
状態類似体、補助因子、阻害剤、薬物、色素、栄養物、成長因子等である。本明
細書では、ＳＥＬＥＸ標的はＣＤ４０リガンドである。具体的には、本明細書の
ＳＥＬＥＸ標的は精製ＣＤ４０リガンド及びその断片、ならびにＣＤ４０リガン
ドを含む短いペプチド又は発現蛋白質ドメインである。またＣＤ４０リガンドの
一部及び例えばマウスＣＤ８の様なその他蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。

【００２０】ここで用いられる”個体支持体”は、分子が共有結合又は非共有結合により取
りつけられる表面として定義される。それには、膜、マイクロタイタープレート
、磁性ビーズ、荷電紙、ナイロン、ラングミュア−ボジェット（Ｌａｎｇｍｕｉ
ｒ−Ｂｏｄｇｅｔｔ）フィルム、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴ
ＦＥ、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金及び銀が含まれるが、これらに限定され
ない。その表面上に取り込まれたアミノ、カルボキシル、チオール又はヒドロキ
シルの様な官能基を持つことができる当分野既知のその他物質も想定される。こ
れには球面及び溝付き表面を含む、何れかのトポロジーの表面が含まれるが、こ
れらに限定されない。

【００２１】ここで用いられる”ＣＤ４０リガンド”とは、ＣＤ４０に関するリガンドを意
味する。”ＣＤ４０リガンド”はＣＤ１５４も指す。これには精製リガンド、リ
ガンドの断片、リガンドの化学的合成された断片、リガンドの誘導体又は変異型
、及びリガンドとその他蛋白質の融合蛋白質。ここで用いられる”ＣＤ４０”は
また、ヒト以外の種より単離されたＣＤ４０受容体のリガンドも含む。

【００２２】本明細書と通し、様々な引用が行われることに注意せよ。それぞれの引用は参
照され、その全てがここに特異的に援用する。ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドの調製好適実施態様では、本発明の核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により誘導される。
ＳＥＬＥＸの工程は“対数濃縮リガンドの系統的発展（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）”と題された米国特許出願第０７／５３６、４２８号、
現在放棄された“核酸リガンド”と題された米国特許第５、４７５、０９６号及
び“核酸リガンドを特定する方法”と題された米国特許第５、２７０、１６３号
（ＷＯ９１・１９８１３も参照）に記載されている。それぞれが参照され特異的
にここに援用するこれら出願は、集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と呼ばれる。

【００２３】ＳＥＬＥＸ法はそれぞれが特有の配列を有し、そして望まれる標的化合物又は
分子に特異的に結合する特性を持つ核酸分子である産物類を提供する。標的分子
は好ましくは蛋白質であるが、とりわけその他炭水化物、ペプチドグリカン及び
各種小分子も含むことができる。ＳＥＬＥＸ法はその生物学的構造体の不可欠部
分である分子との特異的相互作用を通して、細胞表面又はウイルスといった生物
構造を標的にすることにも利用できる。

【００２４】その最も基本的形態では、ＳＥＬＥＸ法は以下の一連の段階により規定できる
だろう。１）各種配列の核酸の候補体混合物を調製する。候補体混合物は固定された配
列領域（即ち候補体混合物の各メンバーは同一位置に同一配列を含む）と無作為
化された配列領域とを含んでいる。固定配列領域は（ａ）下記増幅段階を助ける
ため；（ｂ）標的への結合が既知である配列を模擬するため；又は（ｃ）候補体
混合物中の核酸の特定構造配置の濃度を高めるために選択される。無作為化配列
は全体的に無作為化されているか（即ち、ある位置に於いてある塩基が見いださ
れる確率が４分の１である）又は部分的に無作為化されている（例えばある位置
でのあるベースの存在確率が０ないし１００％のいずれかのレベルで選択できる
）。

【００２５】２）候補体混合物を、標的と候補体混合物の核酸との間の結合に好ましい条件
の下に選択された標的と接触させる。この様な状況下では、標的と候補体混合物
の核酸との間の相互作用により、標的と標的に関し最も強い親和性を持つ核酸と
の間に核酸−標的対合が形成されと考えられる。

【００２６】３）標的に対し最も高い親和性を持った核酸は、標的に対しより低い親和性を
持つ核酸から分離される。候補体混合物中に存在する、最高親和性を持つ核酸に
該当する配列は極めて少数である（そして恐らく１分子の核酸のみである）こと
から、候補体混合物中の核酸の有意量（約５−５０％）が分離中に保持される様
な分離基準を設定することが一般的に望まれる。

【００２７】４）次に、分離中に比較的高い標的に対する親和性を持つものとして選択され
たこれら核酸を増幅し、標的に対し比較的高い親和性を持つ核酸が豊富になった
新たな候補体混合物が作られる。

【００２８】５）上記の分離と増幅の段階を繰り返すことで、新たに形成された候補体親和
性が含む特有配列は次第に少なくなり、標的に対する核酸の平均親和性は次第に
増加する。これを押し進めることで、ＳＥＬＥＸ法は標的分子に対し最高の親和
性を持つ核酸を代表する１種類、又は少数の特異的核酸を含む候補体混合物を、
元の候補体混合物から生ずるだろう。

【００２９】基本のＳＥＬＥＸ法は複数の特定の目的を達成するために変更されている。例
えば共に”構造を基に核酸を選択する方法”と題される、現在放棄されている１
９９２年１０月１４日提出の米国特許出願第０７／９６０、０９３号、及び米国
特許第５、７０７、７９６号は、例えば屈曲したＤＮＡの様な特定の構造特性を
持った核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と結びつけたＳＥＬＥＸ法を記
載している。現在放棄されている”核酸リガンドの光選択”と題された１９９３
年９月１７日提出の米国特許出願第０８／１２３、９３５号、共に”対数濃縮に
よるリガンドの系統的発展：核酸リガンドの光選択及びＳＥＬＥＸ法”と題され
た米国特許第５、７６３、１７７号及び米国特許第６、０１１，５７７号は、標
的分子に結合でき、そして／又は光架橋でき、そして／又は光不活性化できるし
光反応性官能基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸをベースとした
方法を記述している。”テオフィリンとカフェリンを識別する高親和性核酸リガ
ンド”と題された米国特許第５、５８０、７３７号は、密接に関係する分子を区
別できる極めて特異的な核酸リガンドを同定する、カウンターＳＥＬＥＸと呼ば
れる方法を記述している。”対数濃縮によるリガンドの体系的発生：ＳＥＬＥＸ
法”と題された米国特許第５、５６７、５８８号は、標的分子に対し高い親和性
と低い親和性を持つオリゴヌクレオチドを高い効率で分配することができるＳＥ
ＬＥＸをベースとした方法を記載している。”ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１Ｒ
ｅｖに対する核酸リガンド”と題する米国特許第５、４９６、９３８号は、ＳＥ
ＬＥＸを実施した後に改良型核酸リガンドを獲得するための方法を記述している
。”対数濃縮によるリガンドの体系的発生：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ”と題する
米国特許第５、７０５、３３７号は、その標的に対しリガンドを共有結合させる
方法を記述している。

【００３０】ＳＥＬＥＸ法はインビボでの改良された安定性又は改良された運搬特性といっ
た改良された性質をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リ
ガンドを同定することを包含する。この様な修飾の例には、リボース及び／又は
リン酸及び／又は塩基位置での化学的置換が含まれる。修飾型ヌクレオチドを含
むＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドは”修飾型ヌクレオチドを含む高親和性
核酸リガンド（ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉ
ｇａｎｄｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ、”と題される、５−及び２’−位置のピリミジンが化学的に修飾されたヌク
レオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記述する米国特許第５、６６０、９
８５号に記載されている。上記米国特許第５、６３７、４５９号は、２’−アミ
ノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（
２’）−ＯＭｅ）にて修飾された１以上のヌクレオチドを含む高い特性を持つ核
酸リガンドを記述している。１９９４年６月２２日に提出された、”分子内求核
置換による既知及び新規２’修飾型ヌクレオシドの新規調製方法（Ｎｏｖｅｌ
ＭｅｔｈｏｄｏｆＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＫｎｏｗｎａｎｄＮ
ｏｖｅｌ２’ ＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓｂｙＩｎｔｒ
ａｍｏｌｅｃｕｌａｒＮｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
）”と題される米国特許出願第０８／２６４、０２９号は各種２’−修飾型ピリ
ミジンを含むオリゴヌクレオチドを記述する。

【００３１】ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドと、”対数濃縮によるリガンド
の体系的発生：キメラＳＥＬＥＸ（ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｌｏｕｔｉｏｎ
ｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎ
ｔ：ＣｈｉｍｅｒｉｃＳＥＬＥＸ）”と題された米国特許第５、６３７、４５
９号及び”対数濃縮によるリガンドの体系的発生：混合型ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃＥｖｌｏｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎ
ｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＢｌｅｎｄｅｄＳＥＬＥＸ）”と題さ
れた米国特許第５、６８３、８６７号にそれぞれ記述されているその他の選択さ
れたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能単位とを組み合わせるこ
とを包含する。これら応用により多様な形状とその他特性の組合せ、及びその他
分子の望ましい特性を持つオリゴヌクレオチドの効率的増幅及び複製特性が可能
になる。

【００３２】米国特許第５、４９６、９３８号はＳＥＬＥＸ法を実施した後に改良された核
酸リガンドを得ることに関し記述されている。”ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１
Ｒｅｖに対する核酸リガンド（ＮｕｃｌｅｉｃＡｉｃｄＬｉｇａｎｄｔｏ
ＨＩＶ−ＲＴａｎｄＨＩＶ−１Ｒｅｖ）”と題された本特許は、参照さ
れここに具体的に取り込まれる。

【００３３】核酸を診断利用する際に起こりえる１つの問題は、ホスホジエステル型をした
オリゴヌクレオチドがその効果を顕す前に、エンドヌクレアーゼやエクソヌクレ
アーゼといった細胞内及び細胞外酵素によって体液中に於いて迅速に分解される
可能性があることである。核酸リガンドのインビボでの安定性を増すため、又は
核酸リガンドの運搬を促進するか仲介することを目的に、核酸リガンドにある種
の化学修飾を施すことができる。例えば、それぞれその全体が参照されここに具
体的に援用する、共に”修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇ
ｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＣｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）”と題された、現
在は放棄されている１９９３年９月８日提出の米国特許出願第０８／１１７、９
９１号、及び米国特許５、５６６０、９８５、ならびに”無転写型ＳＥＬＥＸ（
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆｒｅｅＳＥＬＥＸ）と題された１９９９年７
月２８日提出の米国特許出願第０９／３６２、５７８号を参照。本発明で考えら
れる核酸リガンドの修飾には、追加の荷電、極性、疎水性、水素結合、静電的相
互作用及び流動性を核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体に組み込む様な修
飾が含まれるが、これらに限定されない。この様な修飾には２’−位置の糖修飾
、５−位置のピリミジン修飾、８−位置のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−
チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖の修飾
、ホスホルオチオエート又はアルキルホスフェート修飾、メチル化、イソ円形、
イソシチジン及びイソグアニジン等の異常塩基対合が含まれるが、これらに限定
されない。修飾にはキャッピングの様な３’及び５’の修飾も含むことができる
。本発明の好適実施態様では、核酸リガンドはピリミジン残基の糖成分が２’−
フルオロ（２’−Ｆ）修飾されているＲＮＡ分子である。

【００３４】修飾は前−又は後−ＳＥＬＥＸ工程修飾であろう。前−ＳＥＬＥＸ工程修飾は
、それらＳＥＬＥＸの標的に対し特異的であり且つインビボでの安定性が改良さ
れている核酸リガンドを生ずる。後−ＳＥＬＥＸ工程修飾は２’−ＯＨ核酸リガ
ンドを生じ、その結果核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなくインビ
ボの安定性を改良できる。

【００３５】その他修飾は当業者に既知である。この様な修飾は後−ＳＥＬＥＸ工程（前も
って特定された非修飾リガンドの修飾）によるか、又はＳＥＬＥＸ工程に取り込
まれ実施されるだろう。

【００３６】発明の核酸リガンドは上記概要を示したＳＥＬＥＸ法を通じ調製される、そし
てその全てが参照されここに援用するＳＥＬＥＸアプリケーション内にて完全に
実施できる。ＳＥＬＥＸ法は精製ＣＤ４０リガンド又はその断片を標的に用い実
施できる。あるいは完全長のＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０リガンドの分離ドメ
インを好適発現系にて作製することができる。あるいはＳＥＬＥＸ法は標的とし
てＣＤ４０リガンド内に存在する配列を含む合成ペプチドを用い実施できる。最
適核酸リガンドに求められるアミノ酸の正確な数を決定することは、当業者の通
常の作業である。

【００３７】幾つかの実施態様では、核酸リガンドは選択された波長を持つ光による核酸リ
ガンド照射により、それらの標的に共有的に結合される。この様な核酸リガンド
を得る方法は、いずれもがその全体を参照されここに具体的に援用する”核酸リ
ガンドの光選択（ＰｈｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄＬｉｇａｎｄｓ）”と題された、現在放棄されている１９９３年９月１７日
提出の米国特許出願第０８／１２３，９３５号、及び共に”対数濃縮によるリガ
ンドの体系的発生：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉ
ａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓａｎｄＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ）
ど題された米国特許第５、７６３、１７７号及び米国特許第６、００１、５７７
号に詳述されている。

【００３８】好適実施態様では、ＳＥＬＥＸ法は疎水性相互作用により磁性ビーズに結合さ
せられたＣＤ４０リガンドの断片を用い実施される。次にマイクロタイタープレ
ートのウエル内にて、一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合体は磁性ビーズと接触させら
れる。所定温度で所定時間インキュベーションされた後、ビーズは磁場によりプ
レートのウエルの側部に保持され、プレートのウエルは洗浄され未結合の候補核
酸リガンドが取り除かれる。次にＣＤ４０リガンドに結合した核酸リガンドはウ
エル中の溶液内に放出され、続いて逆転写酵素により逆転写され、ポリメラーゼ
チェインリアクション（ＰＣＲ）を利用し増幅される。次に増幅候補体混合物を
用いて次の回のＳＥＬＥＸ工程が実施される。

【００３９】次に本発明の方法により単離された核酸リガンドは、ＣＤ４０リガンド蛋白質
に対する結合、及びＣＤ４０リガンドとＣＤ４０間の相互作用の阻害について試
験することができる。この試験は、例えば正常にはＣＤ４０リガンドとＩＬ−４
により誘導されるＢ細胞の増殖の阻害に関し核酸リガンドをアッセイすることで
実施できる。あるいは、核酸リガンド及びＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０リガン
ド−融合蛋白質はＣＤ４０蛋白質陽性の細胞に加えることができ、相互作用の阻
害はマウスＣＤ８−ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質中のマウスＣＤ８の様な蛋
白質の非関連部分に対する抗体を用いた免疫蛍光により見ることができる。可溶
性ＣＤ４０リガンドと細胞表面に発現されたＣＤ４０間の相互作用の阻害は、細
胞表面の蛍光染色を減少させるか、又は全く無くす。

【００４０】ＣＤ４０リガンド核酸リガンドの診断及び治療応用本発明より提供される核酸リガンドは多くの医療応用に有用である。例えばそ
れらはＴ細胞活性、抗体介在免疫反応又は活性化血小板が病因に役割を果たす病
気の治療又は診断に使用できる。幾つかの実施態様では、それらは臓器移植又は
移植片を受けた患者に関し、臓器又は移植片拒絶を遮断するために利用できる。
別の実施態様では、核酸リガンドはアテローム性動脈硬化障害の発生といった血
管病の発生を減じるために利用される。さらに別の実施態様では、核酸リガンド
は自己免疫疾患の治療に用いられる。治療剤として核酸リガンドを使用するため
には、生体液中の核酸リガンドの安定性を増すために修飾ヌクレオチド及びリボ
ヌクレオチドを使用する必要があるだろう。この様な修飾は上記のＳＥＬＥＸ特
許出願に記載されている。

【００４１】本発明の核酸リガンドは血小板凝集により形成される血栓を造影することにも
利用できる。血栓症に感受性である患者−大きな外傷又は手術による−にはＣＤ
４０リガンドに対する放射線標識核酸リガンドを注射することができ、次に放射
線造影が大きな血小板の凝集塊、即ち血栓が存在している体内部位を描写できる
。血栓が体内の重要部位に検出された場合には、抗凝固剤及び血栓溶解治療薬を
経口的に投与できる。この様な核酸リガンド造影剤を使用する利点は、抗凝固剤
や血栓溶解治療薬−これらは予防的に投与された場合に効果的凝固なしに内部出
血を持続するために危険であることから−を危険な状態の血栓を明らかに持つ患
者のみに投与できることである。さらにこれら治療薬は、活性作用物質が血栓が
予想される全部位に達するために高濃度に血流中に注射される代わりに、本発明
の核酸リガンドにより見いだされた血栓部位に特異的に注射することができる。

【００４２】核酸リガンドの治療組成体は注射により非腸管的に投与されるが、間接注射、
吸入噴霧、経口活性剤、経皮的イオントロフェレーシス又は座薬の様なその他有
効な投与形状も想定される。好適キャリアーの一つは生理的食塩水であるが、そ
の他医薬品として受け入れ可能なキャリアーも使用されることも想定される。好
適実施態様の一つでは、キャリアー及びリガンドは生理学的に適合した徐放製剤
である。この様なキャリアー中の主要溶媒は水性又は非水性のいずれでもよい。
更に、キャリアーは、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、滅菌性、安定性
、溶解速度又は臭いを変更し、又は維持するためにその他医薬品として受け入れ
可能な賦形剤を含んでもよい。同様に、リガンドの安定性、溶解速度、放出又は
吸収を変更し、又は維持するためにキャリアーは更に別の医薬品として受け入れ
可能な賦形剤を含んでもよい。この様な賦形剤は単回投与又は複数回投与の形状
の非腸管投与用の製剤に一般的及び慣例的に用いられているものである。

【００４３】治療組成体ば形成された後は、それは溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体又は乾
燥あるいは凍結乾燥粉末として保存されるだろう。この様な製剤は使用可能な形
状又は投与直前調製を必要とする形状のいずれかで保存される。全身投与を目的
とした、核酸リガンドを含む製剤の投与方法は、皮下、筋肉内、静脈内、経鼻又
は膣を介するもの、あるいは直腸用座薬であろう。

【００４４】本発明を説明し例示するために以下の実施例を提供するが、これは本発明を限
定することを意図するものではない。

【００４５】

【実施例】

【００４６】

【実施例１】ＳＥＬＥＸ法に於いて標的としての使用に適したＣＤ４０リガンドの生成ＣＤ４０リガンドは融合蛋白質として大腸菌にて発現された。融合蛋白質はヒ
トＣＤ４０リガンドのアミノ酸１０８ないしアミノ酸２６１（カルボキシ末端）
がトロンビン切断部位が続く６−ｈｉｓ配列にＮＨ２−末端で融合した融合もの
を含む。得られた融合蛋白質であるｐ２０はＮｉ−ＮＴＡカラムへの結合により
精製された。次にｐ２０をビオチニル化トロンビンで処理した後、ビオチニル化
トロンビンをストレプトアビジンアガロースとその後の透析により取り除きｐ１
８が生成された。

【００４７】ＣＤ４０リガンドはまた真核細胞中−ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞の両方−にマウス
ＣＤ８−ヒト（又はマウス）ＣＤ４０リガンド融合蛋白質としても発現される。
得られた蛋白質、ｐ４０／ｐ５０は抗ＣＤ８−セファロースクロマトグラフィー
により精製された。この構築体（ｐ４０）の変種はＣＤ４０リガンド蛋白質の残
に５０−１０８を除いた内部欠失を含む：これにより２個の遊離型システイン残
基が除かれ、その結果分子内架橋が減数した蛋白質が生まれる。

【００４８】更に上記の蛋白質に加え、ヒトＣＤ４０リガンドは成熟ＣＤ４０リガンド蛋白
質をコードする完全長ｃＤＮＡを用いたトランスフェクトＬ細胞中に発現される
。各種発現ＣＤ４０リガンド蛋白質の構造を図１に示す。

【００４９】ｐ１８及びｐ４０／ｐ５０蛋白質は生物学的活性を持つことが示されている。
ｐ１８はＩＬ−４存在下にＢ細胞の増殖を誘導できる。抗ＣＤ４０リガンド抗体
はこの増殖を阻害する。このことは、Ｂ細胞増殖活性が細菌のリポポリサッカラ
イドに拠るものではないことを示している；更に、同様の方法で精製された制御
蛋白質（６−ｈｉｓ−ベータ−ガラクトシダーゼ）はＢ細胞増殖活性を持ってい
ない。ｐ４０／ｐ５０もまたＩＬ−４存在下にＢ細胞の増殖を刺激することが示
されている。更に、分子のＣＤ８０部分に対する二次試薬を使用することで、ｐ
４０／ｐ５０はＣＤ４０陽性Ｒａｊｉ細胞と正常Ｂ細胞に結合することも示され
ている。図２はヒトＣＤ４０Ｌ融合蛋白質に関するデータを示している。マウス
ＣＤ４０Ｌ融合蛋白質に関するデータは示されていない。

【００５０】

【実施例２】ｐ１８及びｐ４０に対する核酸リガンドの生成ＳＥＬＥＸ法は、ヒトＣＤ４０Ｌに関してはｐ１８とｐ４０の両方を、そして
マウスＣＤ４０Ｌについてはｐ４０蛋白質を用い行われた。蛋白質は疎水吸着に
より磁性ビーズに結合された。ビーズは一本鎖２’−フルオロ−ピリミジン（２
’−Ｆ）ＲＮＡの候補体混合物に接触させられ、そしてインキュベーションして
候補核酸リガンドをビーズ上に固定されたｐ１８又はｐ４０蛋白質に結合させた
。次にビーズを洗浄して未結合の核酸リガンドを除き、さらに磁場にかけてビー
ズを未結合の核酸リガンドから分離した。次にｐ１８又はｐ４０に結合した核酸
リガンドをビーズから溶出した。溶出された核酸リガンドを逆転写にかけ、得ら
れたＤＮＡの鋳型を次に転写してｐ１８又はｐ４０に結合する核酸リガンドに富
んだ核酸リガンドの候補体混合物を得た。この工程を合計６回繰り返した。

【００５１】ＳＥＬＥＸ回数毎の変化を表１に示した。６回を繰り返した後、核酸リガンド
のプールを幾つかのアッセイにかけ試験した。ヒトｐ４０ＳＥＬＥＸ実験の６回
目のＲＮＡを用いてｍｕＣＤ８−ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質を結合した；
結合データは、６回目のプールの親和性が０回目の未選別プールに比べ〜２対数
改善されていることを示した。無関係のＣＤ８融合蛋白質への結合はごくわずか
であった（データ未提示）。

【００５２】

【実施例３】ｐ４０及びｐ１８を標的に用いたＳＥＬＥＸ法より得たクローンの配列ｐ４０選別とｐ１８選別より得たクローンの配列を図２−４（配列番号３−７
０）に示す。第１欄内の命名では、起源種（ｈ＝ヒト、ｍ＝マウス）、蛋白質構
築体（ｐ１８又はｐ４０）、核酸リガンドを得たＳＥＬＥＸ回数、そして小数点
を付けクローン認識番号がしめされている。即ちｈＰ４０Ｒ６．３は、ヒトｐ４
０を標的に用いて行ったＳＥＬＥＸ実験６回目から得たクローン番号３を表す。
表２−４に示される各アプタマーは５’末端にｇｇｇａｇｇａｃｇａｕｇｃｇｇ
（配列番号１）の４０Ｎ７固定配列を、そして３’末端には４０Ｎ７固定配列で
あるｃａｇａｃｇａｃｕｃｇｃｃｃｇ（配列番号２）を有していることに注意せ
よ。配列中の”Ｕ”又は”Ｃ”はそれぞれ２’−Ｆ−Ｕ又は２’−Ｆ−Ｃに対応
しており、”Ａ”又は”Ｇ”はそれぞれ２’−ＯＨ−Ａ又は２’−ＯＨ−Ｇに対
応している。”Ｎ”はその位置が不明確なヌクレオチド（即ち２’−ＯＨ−Ａ又
は−Ｇ、あるいは２’−Ｆ−Ｃ又は−Ｕのいずれかである）であることを示して
いる。表４では、”Ｙ”が２’−Ｆ−Ｕ又は２’−Ｆ−Ｃに、そして”Ｒ”が２
’−ＯＨ−Ａ又は２’−ＯＨ−Ｇに、”Ｍ”が２’−ＯＨ−Ａ又は２’−Ｆ−Ｃ
に、そして”Ｓ”が２’−ＯＨ−Ｇ又は２’−Ｆ−Ｃのいずれかに対応している
。

【００５３】

【実施例４】ＣＤ４０陽性細胞へのマウスＣＤ８−ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質の結合の阻害ｐ１８に対する６回の実験より得たＲＮＡ（ｐ１８Ｒ８ｐｏｏｌ）とヒトｐ４
０ＳＥＬＥＸ実験から得たＲＮＡを調整し、ＣＤ４０陽性細胞へのマウスＣＤ８
−ヒトＣＤ４０リガンド融合体の結合（細胞に対する蛍光抗ＣＤ８−ＰＥ抗体結
合として表される）阻害能力について試験した。０．２５μｇ／ｍＬの濃度のマ
ウスＣＤ８−ヒトＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ８−ｈＣＤ４０リガンド）を１×１
０ｅ−５Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ４０陽性）とインキュベーションし、１時間室温に
てインキュベーションした後、３回洗浄、続いて抗−ｍＣＤ８−ＰＥ抗体（Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ社より得た）とインキュベーションした。この濃度のｍＣＤ８
−ｈｕＣＤ４０リガンドでは、平均チャンネル蛍光（ＭＣＦ）値は〜８であった
（図２参照）。この相互作用を次のようにして阻害した：指定濃度の核酸リガン
ド、抗体、及びＩｇ融合体（ヒトＣＤ４０−ヒトＩｇ及びヒトＣＤ５−ヒトＩｇ
）を、５０μＬの反応溶液中にて０．２５μｇ／ｍＬの濃度のｍＣＤ８−ｈｕＣ
Ｄ４０リガンドと３７度、１／２時間インキュベーションし、続いてＲａｊｉ細
胞（１×１０⁵）を加えた。インキュベーションを１時間続けた後、ＰＦＡ（Ｐ
ＢＳ；１０％ウシ胎児血清；アジ化ナトリウム０．０１％）で３回洗浄した。次
に細胞を蛍光標識した抗マウスＣＤ８抗体（ＰＥ抗ｍＣＤ８）を含むＰＦＡ中で
１時間インキュベーションし、３回洗浄した後ＣｏｕｌｔｅｒＦａｃｓｔａｒ
を用い蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）し、分析した。

【００５４】ヒトＣＤ４０ＬＳＥＬＥＸプールの各クローンについても分析した。２つの
６回目クローン、ｈＰ４０Ｒ６．８（配列番号２０）及びｈＰ１８Ｒ６．７（配
列番号２２）がＣＤ４０リガンドの相互作用に関する強力な阻害体であることが
分かった（図２参照）。これら核酸リガンドはマウスｐ４０の結合を阻害できな
かった（マウスＣＤ８−マウスＣＤ４０リガンド）ことから、核酸リガンドがＣ
Ｄ８配列には結合せず、そしてマウスＣＤ４０リガンドと交叉反応しないことが
示された。また図２には、ｈＰ１８Ｒ６．５（配列番号２８）、ｐ１８ＳＥＬＥ
Ｘ実験の６回目の全プール、ヒトＣＤ４０−ヒトＩｇ融合蛋白質（ｈＣＤ４０−
ｈＩｇ）、ヒトＣＤ５−ヒトＩｇ融合蛋白質（ｈＣＤ５−ｈＩｇ）、抗ヒトＣＤ
４０抗体（抗ｈＣＤ４０Ｌ）及び抗マウスＣＤ８抗体（ＰＥ抗ｍＣＤ８）に関す
る結合曲線も示されている。

【００５５】阻害アプタマー（ｈＰ４０Ｒ６．８及びｈＰ１８Ｒ６．７）は得られた配列の
〜１０−１５％であった。ｈＰ４０Ｒ６．８アプタマーを用いた結合分析はヒト
ｐ４０蛋白質についてアプタマーの親和性が〜２００ｐＭであるとした；しかし
、結合曲線は２相性であり、プラトーのＲＮＡ結合は不良であった（〜１５％）
。

【００５６】

【実施例５】ビオチニル化核酸リガンドによるＬｔｋ細胞の染色Ｌｔｋ細胞はヒトＣＤ４０リガンド遺伝子の発現を目的にトランスフェクショ
ンされた：高レベルの構成的発現を行っている１クローンが選別された。これら
細胞を図３に示す濃度のビオチニル化核酸リガンドとインキュベーションした。
用いたビオチニル化ヒトｐ４０核酸リガンドは；５回目核酸リガンド（ｈＰ４０
Ｒ５ＲＮＡプール−ビオチン．ｈＰ４０Ｒ６．１（配列番号５）、ｈＰ４０Ｒ６
．４（配列番号１５）、ｈＰ４０Ｒ６．８（配列番号２０）、ｈＰ４０Ｒ６．４
０（配列番号２１）及びｈＰ４０Ｒ６．４８（配列番号１１）である。初回の候
補体混合物（ランダム４０Ｎ７ＲＮＡ）もビオチニル化され、アッセイにかけら
れた。抗ヒトＣＤ４０リガンド抗体（抗ｈＣＤ４０Ｌ−ビオチン）（Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ社より入手）をコントロールに用いた。４℃にて３０分間インキュベ
ーションした後、細胞を１回洗浄し、蛍光標識ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ
）と４℃にて１時間インキュベーションした。細胞はＰＦＡ中に３回洗浄してか
ら分析した。結果（図３）は、ビオチニル化アプタマーがヒトＣＤ４０リガンド
トランスフェクタントに結合できることを示している。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【表２】

【００５９】

【表３】

【００６０】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明にＳＬＥＬＸ標的として用いられている組換え体型ヒト及びマ
ウスＣＤ４０リガンド蛋白質の構造。

【図２】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンド（ｐ４０）による、Ｒａｊｉ
細胞（ＣＤ４０陽性）表面へのマウスＣＤ８−ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質
の結合の阻害。

【図３】ｈＣＤ４０Ｌ−発現Ｌｋｔ細胞に対するビオチニル化ＲＮＡプール及
びアプタマーの結合。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 41/00 37/06 43/00 １０７ 41/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 43/00 １０７Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 HA03 HA17 4B063 QA20 QQ42 QQ52 QS25 QS34 QX07 4C057 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04 MM05 MM09 4C085 HH03 JJ01 KA29 KB92 LL07 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZA45 ZB07 ZB08 ZB22 ZC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドにあって、以下の段
階を含む方法により特定される核酸リガンド：ａ）核酸の候補体混合物を調製する段階；ｂ）候補体混合物に比べＣＤ４０リガンドに対し高い親和性を有する核酸を候
補体混合物のその他核酸より分配される様に核酸の候補体混合物をＣＤ４０リガ
ンドと接触させる段階；ｃ）候補体混合物の残りから高親和性核酸を分離する段階；及びｄ）高親和性核酸を増幅し、ＣＤ４０リガンドへの結合に関し相対的により高
い親和性及び特異性を持った核酸に富む核酸の混合物を得て、それによりＣＤ４
０リガンドの核酸リガンドを同定する段階。
【請求項２】ＣＤ４０リガンドに対する精製及び非天然生成ＲＮＡリガン
ドにあって、前記リガンドが配列番号３−７０よりなるグループから選択される
ＲＮＡリガンド。
【請求項３】ＣＤ４０リガンドに対する精製・分離された非天然型核酸リ
ガンド。
【請求項４】前記ＣＤ４０リガンドが疎水的相互作用を介して固体支持体
に結合し、前記段階ｂ）−ｃ）が前記固体支持体の表面にて行われる、請求項１
記載の核酸リガンド。
【請求項５】前記固体支持体がビーズである、請求項４記載の核酸リガン
ド。
【請求項６】前記核酸の候補体混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１記載
の核酸リガンド。
【請求項７】前記一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項６記載の核酸リガ
ンド。
【請求項８】前記一本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項６記載の
核酸リガンド。
【請求項９】核酸の前記候補体混合物が２’−Ｆ（２’−フルオロ）修飾
型リボ核酸である、請求項７記載の核酸リガンド。
【請求項１０】前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項３記載の精製・
単離された非天然生成核酸リガンド。
【請求項１１】前記核酸リガンドがＲＮＡである、請求項１０記載の精製
・単離された非天然生成核酸リガンド。
【請求項１２】前記リガンドが２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾型ヌクレ
オチドである、請求項１１記載の精製・単離された非天然生成ＲＮＡリガンド。
【請求項１３】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを分離する方法で
あって、以下の段階を含む方法：ａ）核酸の候補体混合物を調製する段階；ｂ）候補体混合物に比べＣＤ４０リガンドに対し高い親和性を有する核酸を候
補体混合物のその他核酸より分配される様に核酸の候補体混合物をＣＤ４０リガ
ンドと接触させる段階；ｃ）候補体混合物の残りから高親和性核酸を分離する段階；及びｄ）高親和性核酸を増幅し、ＣＤ４０リガンドへの結合に関し相対的により高
い親和性及び特異性を持った核酸に富む核酸の混合物を得て、それによりＣＤ４
０リガンドの核酸リガンドを同定する段階。
【請求項１４】前記候補体混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１３記載の
方法。
【請求項１５】前記一本鎖核酸がリボ核酸を含む、請求項１４記載の方法
。
【請求項１６】Ｔ細胞の活性化により生ずる疾患を治療する方法であって
、ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを投与することを含む、該方法。
【請求項１７】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを投与することを
含む、アテローム性動脈硬化症の治療方法。
【請求項１８】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを投与することを
含む、臓器、組織又は移植片の拒絶を予防する方法。
【請求項１９】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンド、及び医薬品とし
て許容可能な賦形剤を含む、アテローム性動脈硬化の治療のための医薬組成物。
【請求項２０】ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンド、及び医薬品とし
て許容可能な賦形剤を含む、臓器、組織、又は移植片の拒絶の予防に適した医薬
組成物。
【請求項２１】個体内の血液凝固塊を検出する方法にあって、該方法が次
の段階を含むもの。（ａ）ヒトＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンドを提供する段階にあって、
前記核酸リガンドが放射活性標識体に結合している段階；（ｂ）前記個体に前記核酸リガンドを投与する段階；及び（ｃ）放射線イメージング技術を利用して前記核酸リガンドの局在を分析する
ことで、前記血液凝固塊を検出する段階。