CN110564730B - 一种cd40l核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种CD40L核酸适配体，所述核酸适配体具有(a)或(b)所示的核苷酸序列；(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或(b)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端和3’端各截去20个核苷酸的核苷酸序列。本发明还提供了上述CD40L核酸适配体在检测CD40L中的应用以及在制备抑制免疫反应药物中的应用，本发明同时提供了一种用于抑制免疫反应的药物，包括上述CD40L核酸适配体以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的CD40L核酸适配体能与CD40L特异性结合，特异性高，且与CD40L有较高的亲和力。

Description

一种CD40L核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种CD40L核酸适配体及其应用。
背景技术
异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治愈白血病等恶性血液病、重症再生障碍性贫血和遗传性血液病的最有效方法。当前制约allo-HSCT治疗的最主要因素是移植物抗宿主病(GVHD)，GVHD不仅影响移植后生存，而且慢性GVHD(cGVHD)还影响患者的生活质量，依据HLA相合程度和供者来源等不同，移植后大约有30％-80％的受者出现急性GVHD(aGVHD)；30％-70％存活100天以上的受者可出现cGVHD，其中近半数患者直接或间接因GVHD而致死。现广泛接受的aGVHD发病机理是同种异体抗原激活供体T细胞发生的异常免疫反应。cGVHD的发病机理目前仍不清楚，可能与免疫耐受异常有关，临床常用的免疫抑制剂是非特异性的免疫功能抑制药物，尽管可以降低a/cGVHD的发生率，但同时也抑制了对其它抗原的免疫应答，包括对移植物抗肿瘤效应(GVL)的抑制，增加了肿瘤复发、感染以及第二肿瘤发生的风险。GVL是供体T细胞识别肿瘤细胞特异性抗原发生的免疫应答反应，可以不依赖GVHD的发生。诱导免疫耐受可能是解决所有这些问题的最好途径，免疫耐受的作用不同于免疫抑制剂的普遍抑制，它只对特定抗原表现为无应答状态，仍保留对其它抗原的正常免疫应答，不影响抗肿瘤和抗感染免疫，可以实现GVHD及GVL的分离。
诱导免疫耐受的最关键环节是清除供体反应性T细胞，没有同种异体反应T细胞，就无法介导排斥反应，供体T细胞的激活需要两种信号共同参与，第一信号是T细胞受体(TCR)与人类主要组织相容抗原(MHC)多肽复合物交联和识别，具有抗原特异性和MHC限制性，第二信号是共刺激信号，不受MHC限制，为非抗原特异性，是T细胞特异性激活所必需的，它决定了经抗原刺激的T细胞是增殖、分化为效应细胞还是转变为无能细胞或凋亡。共刺激通路在启动同种异体免疫反应中起关键作用，因此，阻断共刺激通路对于诱导免疫耐受具有重要作用。在诸多共刺激分子中，CD28-B7和CD40-CD40L是参与T细胞活化最重要的共刺激通路，所以最常用阻断剂是抗CD40L抗体(阻断CD40-CD40L通路)和CTLA4-Ig(阻断CD28-B7途径)。Kiyoshi Saito等用封闭B7的方法阻断CD28-B7途径，发现allo-HSCT小鼠仍可通过CD40-CD40L通路激活T细胞，导致aGVHD发生，CD40-CD40L通路因此被视为引发aGVHD的启动环节，同时还能协同其它共刺激通路传递信号。此外，CD40与CD40L交联后通过诱导激活磷脂酰肌醇第二信号系统、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶和分裂素活性蛋白激酶，进一步增强抗原提呈细胞(APC)的功能，由此可见，阻断CD40-CD40L通路可以阻止抗原的有效提呈并能导致供体T细胞无能。因此过去认为阻断CD40-CD40L通路只能获得外周免疫耐受，即供体反应性T细胞接触抗原时不应答所形成的耐受，这意味着一旦该通路阻滞剂去除后，免疫活性可以恢复，这种免疫无能状态难以维继。但是，大动物移植模型研究发现应用CD40L单抗的移植物在药物撤除后仍可存活数月到数年。最近资料表明，即使是在MHC完全不匹配的大鼠间进行骨髓移植，如果应用CD40L单抗则无需照射也可以诱导稳定的同种异基因嵌合体和免疫耐受，而且还保留对非特异性抗原的正常免疫反应。其原因是供体T细胞经CD40L单抗作用后处于无反应状态，因而有机会迁移至胸腺，并在此发育成熟，通过阴性选择灭活对表达受体及供体抗原发生反应的T细胞克隆，形成混合嵌合状态下的中枢耐受，中枢耐受时供、受体淋巴细胞互将对方组织抗原视为自身成分，从而既可使受体再接受供体的组织器官移植不发生排斥，也可减轻或避免GVHD，还保留自身免疫功能。阻断CD40-CD40L通路后早阶段主要表现为外周耐受，之后中枢耐受和外周耐受共同发挥作用，最后中枢耐受起主导作用。由此可见，持久稳定的中枢耐受有利于免疫耐受的长期维持，如何获得持久稳定的中枢耐受是当前移植免疫耐受研究的重点和难点，阻断CD40-CD40L通路有望实现这个目标。因为嵌合状态下存在的无能T细胞进入胸腺再选择，使新产生的供体反应性细胞对受体抗原无应答，并再进入胸腺选择，如此循环反复形成持久稳定的中枢耐受，诱导和维持供体T细胞的特异性耐受、分离GVHD和GVL。而且，与其它途径如清髓性预处理相比，应用阻滞剂阻断CD40-CD40L通路诱导嵌合体的不良反应较小，嵌合率较高，临床应用前景更好。这些研究阐明阻断CD40-CD40L通路可以发挥外周和中枢耐受诱导机制，建立稳定嵌合体诱导持久免疫耐受，保留对其他抗原的正常免疫应答，不影响抗肿瘤和抗感染免疫，为诱导和维持供体T细胞的特异性免疫耐受、分离GVHD和GVL提供了理论和实验依据。
但是，CD40L单抗的Ⅰ期临床试验因为严重的血栓并发症的发生而中止，因此，迫切需要研发新的CD40L阻滞剂，比如核酸药物，核酸适配体和核酸疫苗等。核酸适配体是指利用指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选出的寡聚核苷酸序列，其作用原理和抗体类似，通过核酸自身形成的三维空间结构可以和不同靶标如有机小分子、RNA、DNA或蛋白质等特异性地识别和结合。核酸适配体相比于抗体具有免疫原性低、靶分子广、易于体外合成和修饰、价格低廉等优点，已经在临床疾病的诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。2004年第一个核酸适配体药物Macugen被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市用于治疗年龄相关性黄斑变性，并在临床上获得肯定的疗效，显示了核酸适配体在靶向治疗方面的优越性和实用性，另有多种核酸适配体药物已经通过Ⅰ期临床评价，因此，制备CD40L核酸适配体是替代CD40L单抗的最佳选择。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种CD40L核酸适配体及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种CD40L核酸适配体，所述核酸适配体具有(a)或(b)所示的核苷酸序列；
(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(b)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端和3’端各截去20个核苷酸的核苷酸序列。。
进一步，所述核酸适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇修饰。可以只对其一端进行修饰，也可以对两端均进行修饰，两端进行修饰时，其基团可以相同也可以不同。本发明的一个实施例中，提供了在CD40L核酸适配体的两端分别进行生物素和荧光素异硫氰酸盐修饰，经修饰后得到的CD40L核酸适配体具有与CD40L特异性结合的能力。
进一步，所述核酸适配体的碱基任选地经硫代、氨基、氟基或甲基修饰。
本发明还提供了上述CD40L核酸适配体在检测CD40L中的应用。
进一步，所述检测CD40L的方法为生物传感器检测、酶联免疫吸附检测或流式细胞技术。
本发明的有益效果是：本发明的CD40L核酸适配体能与CD40L特异性结合，特异性高，且与CD40L有较高的亲和力，两条核酸适配体的解离常数分别为4nM和18nM，可以应用于生物传感器、酶联免疫吸附检测和流式细胞技术检测CD40L。
本发明还提供了上述CD40L核酸适配体在制备抑制免疫反应药物中的应用。
进一步，所述免疫反应为急性移植物抗宿主病。
本发明还提供了一种CD40L靶向分子，包括上述CD40L核酸适配体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种用于抑制免疫反应的药物，包括上述CD40L核酸适配体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步，所述免疫反应为急性移植物抗宿主病。
本发明的有益效果是：本发明的CD40L核酸适配体在血清中有一定的稳定性，可以与T细胞表面的CD40L特异性结合，抑制淋巴细胞的免疫反应，用于制备抑制急性移植物抗宿主病的药物。
附图说明
图1为本发明实施例1不同循环的筛选出的适配体与不同浓度CD40L靶蛋白的亲和力，其中Rnd 0为初始核酸文库，Rnd 6为第6循环核酸产物，Rnd 11为第11循环核酸产物，Rnd 12为第12循环核酸产物；
图2为本发明实施例1硝酸纤维素滤膜结合法比较第11轮核酸适配体文库与不同蛋白的亲和力，其中w/o protein为空白对照，CD40L为靶蛋白，Cyt-1、ERK-2和Sec7为无关蛋白；
图3为本发明实施例1的不同核酸序列对不同浓度CD40L蛋白和无关蛋白(ERK-2和Lysozym)的亲和力；
图4为本发明实施例1中CD40L核酸适配体C7、C10和C15的解离曲线及其具体常数(左上为C10，右上为C7，右下为C15)；
图5为CD40L核酸适配体及随机序列的二级结构图，其中图5A为C10的二级结构图，图5B为C15的二级结构图，图5C为随机序列C16的二级结构图；
图6为在血清中孵育时间不同的C10的琼脂糖凝胶电泳照片；
图7为荧光显微镜下观测与Cy5标记的D40或C10(10nM)在含血清的培养基中孵育4小时后T细胞表面的荧光信号，其中图7A为未活化的(unstimulated)T细胞表面的荧光信号，图7B为活化的(stimulated)T细胞表面的荧光信号，荧光显微照片用40×物镜曝光10秒；
图8为荧光显微镜下观测与Cy5标记的D40或C10(10nM)在含血清的培养基中孵育24h、48h和72小时后活化T细胞的荧光信号，荧光显微照片用40×物镜曝光10秒，其中图8A、图8B和图8C的孵育时间分别为24h、48h和72h；
图9为应用CD40L核酸适配体通过流式细胞技术检测Epoxy Beads表面包被的CD40L，其中图9A为对照(从左到右分别为空白对照、同种型对照、CD40L单抗对照)，图9B使用D40和R1、R11检测，图9C为分别使用CD40L核酸适配体以及筛选过程中其他序列进行检测；
图10为应用CD40L核酸适配体检测EpoxyBeads表面包被的Lysozym，其中图10A为对照(从左到右分别为空白对照、同种型对照、CD40L单抗阳性对照)，图10B为使用D40和R1、R11检测，图10C为分别使用C3、C10、C15和C16进行检测；
图11为应用CD40L核酸适配体通过流式细胞技术检测活化和未活化T细胞表达的CD40L，用PMA(50ng/ml)和离子霉素(200ng/ml)刺激T细胞4小时活化T细胞，其中“control”为同种型对照(isotype control)抗体和CD40L单抗分别对T细胞表面的CD40L进行检测，“Aptamer”为应用D40、C3、C10、C15和C16分别对T细胞表面的CD40L进行检测；
图12为不同结合缓冲液中，CD40L核酸适配体检测活化T细胞表达的CD40L，用PMA(50ng/ml)和离子霉素(200ng/ml)刺激T细胞4小时活化T细胞，以D40、C3、C16为阴性对照，结合缓冲液从上到下分别是PBS，PBS和1mM MgCl2，PBS和3mM MgCl2，PBS、3mM MgCl2和1μg/ml BSA，PBS、3mM MgCl2和10％FCS；
图13为非荧光标记的IgG1及适配体对荧光标记的CD40L核酸适配体检测功能的特异性竞争干预；
图14为CD40L核酸适配体应用于临床GVHD病例标本的流式细胞检测；
图15为A法ELISA使用三种单抗(2B7.1，24-31，TRAP1)检测分别由CD40L核酸适配体C10和C15捕获的纯化CD40L蛋白的标准曲线；
图16为B法ELISA用适配体检测纯化CD40L蛋白的特异性和敏感性；
图17为B法ELISA分别用CD40L核酸适配体C10和C15及单抗M91检测由单抗2B7.1捕获的纯化CD40L蛋白的标准曲线；
图18为B法ELISA检测培养上清液中的可溶性CD40L蛋白，图18A为流式细胞术检测成纤维细胞是否成功转染及表达CD40L，图18B和图18C为在抗CD40L抗体上捕获CD40L蛋白，并通过适配体或抗体检测，其中图18B为使用单体蛋白，图18C为使用同源三聚体蛋白，其中96孔板的A-E行为标准纯化CD40L蛋白，F-H为待测细胞上清液，转染CD32基因的成纤维细胞作为对照。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
由于目前缺乏能高效特异性结合CD40L的核酸适配体，本发明通过筛选获得了两个特异性针对CD40L的核酸适配体，这些核酸适配体能与CD40L高亲和力、高特异性的结合，具有很好的应用前景。为了筛选这些核酸适配体，本发明首先合成一个两端序列已知，中间含有40个随机碱基的DNA文库，将CD40L作为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力、高特异性的核酸适配体，通过结构预测软件mfold分析预测核酸适配体的二级结构，通过硝酸纤维素滤膜结合法鉴定核酸适配体对靶蛋白的亲和力和特异性，得到了两个与CD40L蛋白高亲和力、高特异性的核酸适配体序列，这些适配体都能形成各自特异的颈环结构。
实施例1 CD40L核酸适配体的筛选
预先设计并合成单链寡核苷酸(ssDNA)文库(D40)，文库约有1015个独立序列，由中间40个核苷酸的随机序列和5’、3’端20nt的引物杂交位点构成(MWG-BiotechAG,Ebersberg,Germany)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：
agcatagagacatctgctatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntagactccagacttcaggta
合成5’端标记了荧光素异硫氰酸盐(FITC)的引物Fp和3’端标记生物素(TRB)的引物Rp用于PCR反应合成双标记的双链DNA分子。
引物Fp的结构为：5’-FITC-18C-agcatagagacatctgctat-3’(核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，其中FITC为荧光素异硫氰酸盐，18C表示18个碳乙二醇间隔物)；
引物Rp的结构为：5’-TRB-tacctgaagtctggagtcta-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，TRB为生物素)；
通过链霉亲和素包被的磁珠将生物素化的ssDNA与FITC标记的ssDNA分离。
适配体的筛选采用SELEX技术，筛选流程为将合成的D40文库与人重组CD40L蛋白共孵育，将结合复合物与未结合的序列分开，获得的序列再作为模板进行PCR扩增产生次级文库，用于下一轮筛选。每轮筛选具体包括5个主要步骤：结合、分离、洗脱、扩增和调节。将初步筛选出的ssDNA进行变复性处理，即80℃变性10min，冰浴猝冷10min，后将人重组CD40L蛋白计入上述ssDNA文库中，室温孵育30min，孵育结束后，离心分离结合和未结合的ssDNA。三轮筛选后，改用聚乙烯管防止适配体与聚丙烯管反应，并用筛选缓冲液反复洗涤数次，去除非特异性吸附的ssDNA，以特异性结合的ssDNA为PCR模板，用FITC和生物素标记的引物对其进行扩增，PCR反应条件为94℃，1min，46℃，1min，72℃，1min，72℃，10min，共28个循环。
利用SELEX技术反复筛选的过程中，应用硝酸纤维素滤膜结合法测定产物特异性和亲和力，用32P标记不同循环产物的不同核酸序列，与不同浓度的靶蛋白(CD40L)共孵育，加入50μL结合缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2)，室温孵育30min。将混合物在真空下通过硝酸纤维素滤过膜，分离结合和未结合的ssDNA，立即用500ul结合缓冲液冲洗。与靶蛋白结合的DNA分子保留在滤膜上，而游离的DNA滤过滤膜，从而通过测量滤膜的放射性来测定与靶蛋白结合的适配体量。使用Phosphor成像仪(Sunnyvale，CA)对滤膜成像，ImageQuant(Sunnyvale,CA)分析结合部分。测量3次计算标准差。以结合前靶蛋白浓度为横坐标，结合量为纵坐标作图，曲线拟合至标准Langmuir结合等温线方程：
Figure BDA0002134688280000091
其中M0为最大结合分数，M1是CD40L蛋白和核酸适配体的结合分数，M2为CD40L蛋白和核酸适配体的解离常数，以无关蛋白如Cyt-1、ERK-2、Sec-7为阴性对照。
不同循环的核酸适配体文库与不同浓度的CD40L蛋白的亲和力比较，结果如图1所示，随着循环次数的增加，核酸适配体文库与CD40L蛋白的亲和力不断提高，其中第11循环产生的核酸适配体文库亲和力最佳，经过12个循环后，核酸适配体文库与CD40L蛋白的亲和力不再提高。
由第11循环产生的核酸适配体特异性识别结合人重组CD40L蛋白，而不识别结合无关蛋白如Cyt-1、ERK-2和Sec-7，特异性高，如图2所示。
由第11轮产生的核酸适配体文库筛选分离后与TOPO克隆载体混合，按TOPOTA克隆试剂盒说明书操作转入大肠杆菌并筛选阳性克隆，克隆产物应用ABI PRISM 377DNA测序仪(Applied Biosystems，Darmstadt，Germany)测序，硝酸纤维素滤膜结合法分析，同时测定不同核酸序列对不同浓度CD40L蛋白和无关蛋白(ERK-2和Lysozym)的亲和力，结果如图3所示，所有的核酸序列均不识别无关蛋白ERK-2和Lysozym，对CD40L的亲和力不同，筛选出了亲和力较好的序列C7、C10和C15，采用固定浓度的核酸适配体与CD40L蛋白共孵育，拟合Langmuir等温线方程计算解离常数(M2，KD)，结果如图4所示，解离常数最小的是C10和C15，分别为4nM和18nM，得到亲和力高的CD40L的两条核酸适配体C10和C15，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1
agcatagagacatctgctatccttggctcaggtccctctctccggtatgcggctccatcctagactccagacttcaggta
SEQ ID NO:2
agcatagagacatctgctatccggaccttagcatccttggctcgcctatgtactggtaactagactccagacttcaggta
根据本领域技术人员公知，核酸适配体也可以去除两端的引物杂交位点序列，只具备中间的40个核苷酸的随机序列，并不影响其与CD40L的识别和结合，因此CD40L核酸适配体的序列可以为在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端和3’端各截去20个核苷酸的核苷酸序列，也可以在其两端任选的进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰，不影响其与CD40L的识别和结合。
以下实施例中均以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为例进行CD40L核酸适配体功能的验证。
在核酸适配体的应用过程中，可以根据需要对核酸适配体的两端进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰，也可以根据需要对碱基进行硫代、氨基、氟基或甲氧基修饰。
另外取起始文库、一个不相关序列C3和由C10的碱基随机组合而成的序列C16作为阴性对照，其中C16的核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示：
SEQ ID NO:6
agcatagagacatctgctattatcgttccgatcgtgagcctgttcgccccctggccctcctagactccagacttcaggta
用UNAFold server(V3.2)软件分析核酸序列C10、C15和C16的二级结构，结果如图5所示。
实施例2 CD40L核酸适配体的稳定性
应用2.5％琼脂糖凝胶电泳测定CD40L核酸适配体C10的核酶抗性和生物稳定性。将浓度500nM的CD40L核酸适配体加入含10％胎牛血清(10％FBS，Gibco)细胞培养液中，37℃孵育；分别于孵育0，1，4，8，12，24，32，48，60和72小时后取样，加入等体积5mM EDTA终止反应，静止储藏于-20℃。将不同时间点孵育的核酸适配体加入2.5％琼脂糖凝胶(Sigma-Aldrich)，行电泳测定，并曝光拍照(图6)。琼脂糖凝胶电泳显示，随着孵育时间延长，培养液中CD40L适配体含量逐渐下降，24小时后条带出现降解趋势，72小时后核酸适配体降解完全，说明CD40L核酸适配体在血清中具有生物稳定性，半衰期约12小时。
实施例3 CD40L核酸适配体的细胞摄取试验
在获得知情同意和伦理委员会批准的情况下，采集健康献血者血样或福建医科大学附属协和医院收治的急性移植物抗宿主病(aGVHD)患者血样，经Ficoll-Hypaque(Histopaque 1077，中国)密度梯度离心分离法分离单个核细胞(MNC)。阳性磁珠分选法富集CD3+T淋巴细胞，经流式细胞术(FACS)分析鉴定，台盼蓝染色法检验细胞活性高于95％。细胞培养于含10％FBS(Gibco)的RPMI-1640(Cell concepts GMBH)培养基内。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基中含2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
体外刺激T淋巴细胞(健康血样)的过程是，在CD3+T淋巴细胞中加入50ng/ml含佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA，Sigma-Aldrich)和200ng/ml离子霉素(ionomycin，Sigma-Aldrich)，放置于10％FBS的PRPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2培养箱，避光孵育4小时。
Cy5标记的CD40L核酸适配体C1010nM与PMA/ionomycin刺激的CD3+T细胞共孵育于96孔板(TPP)，2.5×105cells/孔，37℃共孵育72小时。分别于4，24，48，和72小时后取样，经含100u/ml肝素的缓冲液洗涤两遍，于荧光显微镜下(inverses microscopy Axiovert 25,Carl Zeiss)观察细胞摄取核酸适配体的过程，采用LSM(版本4.0，Carl Zeiss)和AxioVision(版本3.0，Carl Zeiss)软件分析图像。
C10分别与活化的和未活化的CD3+T细胞共孵育，以D40为阴性对照，4小时后荧光显微镜下观察，结果如图7所示，可以观测到活化T细胞表面的荧光信号，并分别于24小时、48小时和72小时观察活化细胞的荧光信号，结果如图8所示，24小时后活化T细胞表面的荧光聚集增强，72小时后荧光信号渗入到细胞核内。根据CD40L核酸适配体的血清稳定性推测荧光信号的入胞过程可能是由标记荧光的CD40L核酸适配体直接引发，或由CD40L核酸适配体降解后游离的荧光片段引发。
实施例4 CD40L核酸适配体应用于流式细胞检测
本实施例中CD40L单抗购自Becton Dickinson,Heidelberg,Germany。
T细胞获取和激活方式同实例3。
应用流式细胞仪检测CD40L核酸适配体识别包被在环氧微珠(Epoxy Beads)表面的人重组CD40L蛋白，以及T淋巴细胞或外周血单个核细胞(PBMC)激活后的CD40L表达的能力，同时设立未激活细胞组，以空白对照和CD40L单抗为对照，以核酸文库D40，以及筛选过程中的R1、R11产物，以及筛选后不同序列为对照。
荧光素Cy5标记CD40L核酸适配体的5'端用于检测环氧微珠(Epoxy Beads，DynalBiotech)包被的靶蛋白(人重组CD40L蛋白)。具体实验步骤如下：在0.1M Na-Phosphat缓冲液(pH 7.4)中，加入5mg环氧微珠和30μg人重组CD40L蛋白，4℃，孵育过夜后洗涤，加入Cy5标记CD40L核酸适配体，37℃避光孵育15min，洗涤，上机检测。以包被溶菌酶蛋白(Lysozym)的环氧微珠为阴性对照，流式细胞术的检测结果如图9和图10所示，Cy5标记CD40L核酸适配体(C10和C15)可特异性检出包被在Epoxy Beads表面的靶蛋白(CD40L)，结果与APC标记的CD40L单抗相似，无法检测出无关蛋白Lysozym。
经链霉抗生物素蛋白-荧光素Cy5标记的生物素组合修饰后的CD40L核酸适配体用于检测体外激活T细胞表达的CD40L。具体实验步骤如下：30pmol CD40L核酸适配体与1×106/L经体外刺激的CD3+T淋巴细胞共孵育15min，37℃避光，洗涤，上机检测。以未经体外刺激的CD3+T淋巴细胞为阴性对照。流式细胞术的检测结果如图11所示，Cy5标记CD40L-aptamer可特异性检出PMA/Ionomycin体外刺激的CD3+T细胞表达的靶蛋白(CD40L)，结果与APC标记的CD40L单抗相似，其中ISO是指isotypecontrol,即同型对照，用与CD40L单抗相同的荧光素标记相同来源的非特异性抗体进行染色，用来排除非特异性结合的可能，即图9和图10中的antibodyisotype-APC。
因CD40L核酸适配体筛选制备的结合缓冲液中含Mg2+，在流式检测应用中分别加入不同浓度Mg2+的结合缓冲液(PBS，PBS+1mM MgCl2，PBS+3mM MgCl2，PBS+3mM MgCl2+1mg/mlBSA，PBS+3mM MgCl2+10％FBS)，以测试CD40L核酸适配体检测对缓冲条件的依赖性。流式细胞术的检测结果如图12所示，Cy标记CD40L核酸适配体(C10和C15)的检测功能不依赖于结合缓冲液的组成成分和双价离子Mg2+的含量。
特异性竞争结合试验中，以体外刺激的CD3+T淋巴细胞为检测对象，先与非荧光标记CD40L核酸适配体于37℃避光孵育15min，洗涤后再与荧光标记CD40L核酸适配体于37℃避光孵育15min，洗涤，上机检测。检测CD40L核酸适配体之间的特异性竞争干预。流式细胞术的检测结果如图13所示，特异性竞争结合试验显示非荧光标记对荧光标记的CD40L核酸适配体检测功能的特异性竞争干预。C10和C15之间有交叉性的竞争作用(约90％的抑制率)，而序列C16由序列C10的碱基随机组合产生，虽与C10有相同的碱基组成，并不能完全抑制C10或C15的结合活性，显示CD40L-aptamer的结合活性是由它们折叠形成的二级结构所决定，不依赖于碱基含量。
临床病例检测应用中，以aGVHD病例的CD3+T淋巴细胞为检测对象，与荧光标记CD40L核酸适配体于37℃避光孵育15min，洗涤，上机检测。流式细胞术的检测结果如图14所示，CD40L核酸适配体检出aGVHD病例CD3+T细胞表达的CD40L为45.22％，CD40L单抗结果为27.85％，均高于未发生aGVHD的阴性对照标本。Cy标记的CD40L-aptamer检出急性移植物抗宿主病(aGVHD)病例标本中CD3+T细胞早期表达的CD40L，结果与CD40L单抗相似。
实施例5 CD40L核酸适配体应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)
A法：使用PBS(50mM PBS，pH 7.4)在37℃下将生物素化的适配体固定在链霉生物素蛋白包被的板(Nunc，Wiesbaden，Germany)上30分钟。然后用含100U/ml肝素的选择缓冲液洗涤，并加入CD40L蛋白(50μl/孔，Peprotech，Frankfurt，Germany)。室温震荡孵育1小时并用PBS洗涤，分别加入大鼠抗人CD40L单抗(克隆：2B7.1由德国慕尼黑Nastional健康与环境研究所的ElisabethKremmer博士提供)或小鼠抗人CD40L单抗(克隆：TRAP1，BDPharmingen，Heidelberg,Germany或克隆：24-31，Ancell Immunology Research，Bayport，MN，USA)4℃,1小时。洗涤后，用山羊抗大鼠或山羊抗小鼠过氧化物酶(Pierce)，在室温下孵育1小时，检测结合抗体。
B法：大鼠抗人CD40L单抗(2B7.1)首先使用50mM碳酸盐缓冲液pH9.6在Maxisorp板(Nunc，Wiesbaden，Germany)上4℃过夜固定。然后在室温下用牛奶缓冲液(200μl/孔)封闭1小时以减少非特异性结合。用PBS手动洗涤板三次。加入纯化的CD40L蛋白(peprotech或sigma)和培养CD40L或CD32转染的成纤维细胞(300μl/孔)4天的上清液，最后加入生物素化的适配体(每孔30pmol)。生物素化的抗CD154单克隆抗体(M91，Becton Dickson，Heiderberg，Germany)作为阳性对照。使用链霉抗生物素蛋白结合的过氧化物酶(Pierce)检测结合的适配体。
最后二法都使用TMB和H2O2作为底物检测过氧化物酶标记物，在650nm下进行显色监测，20分钟后用0.1M H2SO4终止反应，并使用TECAN酶标仪、EasyWin软件(TECAN，Crailsheim,Germany)在450nm下测量吸光度。
在A法中，首先把适配体固定于链霉亲和素包被的板上，将CD40L蛋白作为标准样品，2倍稀释数次(从1.85ng/ml到500ng/ml)。然后用抗CD40L单克隆抗体(2B7.1、24-31或trap1)和过氧化物酶结合的二抗检测CD40L。如图15所示，通过不同浓度待测物的检测产物在450nm上的吸光度最终获得15.6-500ng/ml范围内的线性标准曲线。该法的灵敏度为15.6ng/ml，比平均背景信号值高出三个标准差。单克隆抗体(2B7.1)与适体之间的相关系数从0.9554到0.9666不等，表明它们可能针对两个或更多不同的结合位点，基本符合ELISA试验的要求。
在B法中，用抗CD40L单克隆抗体(2B7.1)捕获纯化的CD40L蛋白，然后加入生物素化适配体，用链霉亲和素连接的过氧化物酶检测。以生物素化抗CD40L(M91)单抗作为检测抗体作为对照。结果表明，生物素化的C10和C15可以特异性地检测纯化单体CD40L蛋白(peprotech)，并且与生物素化的D40的背景相比，具有浓度依赖性(图16、图17)。适配体的结果比使用检测抗体的测量值略高。适配体的诊断性能似乎优于其抗体对应物：适配体的检测下限为15.6ng/ml(吸光度＝0.117)，抗体为31.25ng/ml(吸光度＝0.114)。其中图16为不同浓度待测物用不同适配体或单克隆抗体检测的产物在450nm上的吸光度，测定B法ELISA用适配体检测纯化CD40L的特异性和敏感性。图17通过在抗CD40L抗体(2B7.1)上捕获CD40L蛋白，并通过适配体(C10或C15)或抗CD40L抗体(M91)检测的产物在450nm上的吸光度，测定B法ELISA检测纯化CD40L蛋白的标准曲线。
为了评估该方法的适用性，在培养基中培养4天后采集人CD40L和CD32转染的小鼠L929成纤维细胞，并测定上清液中可溶性CD40L蛋白的分泌(图18)。从上述标准曲线中插入培养上清液中可溶性CD40L蛋白的浓度，用C10、C15和mAb(M91)测定的人CD40L转染成纤维细胞的可溶性CD40L含量，分别为35.32ng/ml(平均吸光度＝0.538)、24.29ng/ml(平均吸光度＝0.439)和30.73ng/ml(平均吸光度＝0.124)(P＝0.142和0.112)。CD32转染的成纤维细胞作为阴性对照(平均吸光度分别为0.214、0.21和0.06)。结果表明，采用适配体ELISA试验检测样本与阴性对照的差异显著。图18为B法ELISA检测培养上清液中的可溶性CD40L蛋白，其中图18A为流式细胞术检测待测细胞是否成功转染表达CD40L，及阴性对照细胞是否不表达CD40L。图18B和18C为在抗CD40L抗体(2B7.1)上捕获CD40L蛋白，并通过适配体或抗CD40L抗体(M91)检测，A-E行为标准纯化CD40L蛋白(图18B：单体蛋白，图18C：同源三聚体蛋白)，F-H行为待测细胞上清液。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CD40L核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体具有(a)或(b)所示的核苷酸序列；
(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(b)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端和3’端各截去20个核苷酸的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种CD40L核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。
3.根据权利要求1所述的一种CD40L核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的碱基任选地经硫代、氨基、氟基或甲氧基修饰。
4.权利要求1-3任一项所述的CD40L核酸适配体在检测CD40L中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测CD40L的方法为生物传感器检测、酶联免疫吸附检测或流式细胞技术。
6.权利要求1-3任一项所述的CD40L核酸适配体在制备抑制免疫反应药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫反应为急性移植物抗宿主病。
8.一种CD40L靶向分子，所述靶向分子包括权利要求1-3任一项所述的CD40L核酸适配体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
9.一种用于抑制免疫反应的药物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的CD40L核酸适配体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述免疫反应为急性移植物抗宿主病。
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