CN113699156A - Pd-1核酸适配体、其筛选方法及应用 - Google Patents
Pd-1核酸适配体、其筛选方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种PD‑1核酸适配体、其筛选方法及应用。所述PD‑1核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的序列或SEQ ID No.2所示的序列。所述筛选方法包括:利用慢病毒体系对CHO‑K1细胞进行细胞转染,获得PD‑1稳定高表达的细胞系,用于靶细胞的正筛选;选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞,用于靶细胞的负筛选;利用Cell‑SELEX技术进行PD‑1核酸适配体的筛选。本发明的PD‑1核酸适配体能够特异性结合PD‑1蛋白,从而阻断PD‑1/PD‑L1的相互作用,拮抗由PD‑1/PD‑L1信号通路所介导的免疫抑制作用,激活并增强肿瘤浸润效应T细胞活性,抑制肿瘤的生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体,尤其涉及一种用于拮抗PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤浸润T细胞的抑制的PD-1高表达细胞系的PD-1核酸适配体及其筛选方法与应用,属于分子生物学技术领域。
背景技术
核酸适配体,也被称为核酸适体、适配子等,是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和力和高特异性与靶标结合的单链寡核苷酸,最早是由Szostak和Gold两个小组提出。适配体(aptamer)是指利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术,从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的具有亲和力高、特异性强的能够与靶分子特异性结合的短的单链DNA和RNA分子。
程序性死亡受体(PD-1)和程序性死亡配体(PD-L1)是重要的负性调控因子。T细胞介导的细胞免疫反应发挥着重要的调控作用,形成一个由多步级联反应构成的抗肿瘤免疫循环。首先,肿瘤细胞释放的肿瘤抗原经抗原提呈细胞识别处理后提呈给T淋巴细胞,激活T淋巴细胞,活化的T淋巴细胞经由血液循环系统转运并浸润到肿瘤部位,识别并清除肿瘤细胞。在抗肿瘤免疫循环中存在多个因素可增强或抑制对肿瘤细胞的免疫清除,其中包括程序性死亡受体1(PD-1)与其配体组成一个重要的免疫抑制性检查点,即PD-1/PD-L1免疫检查点。
PD-1及其配体PD-L1是一对免疫共刺激因子,属于免疫球蛋白超家族B7-CD28协同刺激分子的关键成员,参与自身免疫、肿瘤免疫的调节过程。近年来,PD-1/PD-L1免疫检查点因参与肿瘤免疫逃逸机制而备受瞩目。肿瘤浸润性T淋巴细胞表达的PD-1与肿瘤细胞表达的PD-L1相互作用而激活PD-1/PD-L1信号通路,可抑制效应T细胞的抗肿瘤活性,导致免疫抑制性肿瘤微环境形成,最终使肿瘤细胞逃避免疫清除。几乎所有类型的人类肿瘤都有表达PD-L1,如黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、膀胱癌、卵巢癌和血液系统恶性肿瘤等。而阻断PD-1/PD-L1这一免疫检查点可有效改善肿瘤免疫微环境,提高效应T细胞对肿瘤细胞的免疫监视和清除能力。以阻断此免疫检查点的抗体药物为基础的免疫疗法已成为肿瘤治疗的新策略。
因此,如何对PD-1核酸适配体的筛选方法进行优化,寻求一种用于拮抗PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤浸润T细胞的抑制的PD-1高表达细胞系的核酸适配体,已然成为业界研究人员长期以来一直努力的方向。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种高亲和力PD-1核酸适配体,以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种基于工程化细胞系的PD-1核酸适配体的筛选方法及应用。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
本发明实施例提供了一种PD-1核酸适配体,其具有SEQ ID No.1所示的序列或SEQID No.2所示的序列。
本发明实施例还提供了一种基于工程化细胞的PD-1核酸适配体的筛选方法,其包括:
利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染,获得PD-1稳定高表达的细胞系,用于靶细胞的正筛选;
选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞,用于靶细胞的负筛选;
利用Cell-SELEX技术进行PD-1核酸适配体的筛选。
本发明实施例还提供了前述的PD-1核酸适配体在制备能够抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。
进一步地,所述产品至少具有能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用的功能。
进一步地,所述产品至少具有能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用的功能。
本发明实施例还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的产品,其包含前述的PD-1核酸适配体。
与现有技术相比,本发明的有益效果至少包括:
1)本发明提供了一种靶向PD-1蛋白的适配体序列,基于所述PD-1核酸适配体能够与PD-1高表达细胞系特异性结合,以及与鼠重组PD-1的蛋白的结合,阻断PD-1与PD-L1的结合作用,拮抗由PD-1/PD-L1信号通路所介导的免疫抑制作用,激活并增强肿瘤浸润效应T细胞活性,抑制肿瘤的生长;
2)由于膜蛋白质在提取纯化过程中分子构象和形态会发生变化,故以膜蛋白为靶标进行筛选的适配体很难进行整体细胞的识别,直接用高表达膜蛋白的工程化细胞系进行筛选,在筛选的过程中可以保持蛋白的天然构象,进而可以借助与膜蛋白的相互作用,对全细胞进行识别;
3)与现有抗体技术相比,本发明的PD-1核酸适配体本身具有分子量小、免疫原性低、成本低、能够精准修饰等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a和图1b是本发明一典型实施方案之中利用流式技术验证所构建的细胞系是否稳定高表达PD-1蛋白的流式分析结果示意图,其中图1a是转染后的流式分析结果图,图1b是未进行转染的细胞流式分析结果图;
图2是本发明一典型实施方案之中利用Cell-SELEX方法进行适配体筛选的流程图;
图3a和3b是本发明实施例3中所筛选到的第十轮富集库以及筛选起始文库m-lib与对照细胞CHO-K1和靶细胞PD-1细胞相互作用的共聚焦成像图;
图4a与4b是本发明实施例4中所筛选到的优化适配体PD4S以及筛选起始文库m-Lib与对照细胞CHO-K1和靶细胞PD-1细胞相互作用的共聚焦成像图;
图5是本发明实施例6中所筛选到的优化适配体PD4S与鼠重组PD-1蛋白的结合作用图;
图6是本发明实施例7中所筛选到的优化适配体PD4S竞争PD-1与PD-L1的相互作用图;
图7是本发明实施例8中所优化适配体PD4S拮抗PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞抑制作用图;
图8是本发明实施例9中所优化适配体PD4S抑制CT26肿瘤模型中肿瘤生长的统计数据图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本发明的技术方案,其主要提供了基于工程化细胞系的DNA核酸适配体的筛选方法,其包括:构建PD-1表达质粒和高表达稳定细胞系,以及利用Cell-SELEX技术进行DNA核酸适配体的筛选。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种PD-1核酸适配体,其具有SEQ ID No.1所示的序列或SEQ ID No.2所示的序列。
进一步地,所述SEQ ID No.1所示的序列具体为:5’-ATACCAGCTTATTCAATTGAGT AAGAGTGCACTATGTTTTACGAGCCGTTTCCTCGGCTCGTAGTAAGTGCAATCT-3’。
在一些优选实施例中,所述PD-1核酸适配体具有SEQ ID No.2所示的序列,即具体序列为:5’-CGCACTATGTTTTACGAGCCGTTTCCTCGGCTCGTAGTAAGTGCG-3’。
进一步地,所述PD-1核酸适配体能够与PD-1蛋白特异性结合。
进一步地,所述PD-1核酸适配体能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用。
进一步地,所述PD-1核酸适配体能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制。
进一步地,所述PD-1核酸适配体具有对CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长的抑制性作用。
本发明的一种基于阻断PD-1/PC-L1信号通路进行拮抗免役抑制的核酸适配体,从而能够激活受抑制的肿瘤浸润效应T细胞的活性,增强免疫功能,在一定程度上抑制肿瘤的生长。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于工程化细胞系的PD-1核酸适配体的筛选方法,其包括:
利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染,获得PD-1稳定高表达的细胞系,用于靶细胞的正筛选;
选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞,用于靶细胞的负筛选;
利用Cell-SELEX技术进行PD-1核酸适配体的筛选。
在一些优选实施例中,所述的筛选方法包括:利用载有PD-1表达基因的三质粒系统的慢病毒体系对CHO-K1细胞进行转染。
在一些更为优选实施例之中,一种基于工程化细胞的膜蛋白靶标PD-1适配体的筛选与应用,所述靶标的核酸适配体的筛选包括:
(1)利用载有PD-1表达基因的三质粒系统的慢病毒体系对CHO-K1细胞进行转染,并获得PD-1稳定高表达的细胞系,用作靶细胞进行正筛选;
(2)利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选,同时选取未转染的CHO-K1细胞作对照细胞进行负筛选;
(3)利用流式细胞术和共聚焦显微镜技术对适配体候选序列进行亲和作用表征。
更进一步地,所述的筛选方法包括:设计并合成包含40个随机碱基序列的单链DNA核酸文库作为起始筛选库,然后与靶细胞进行孵育后分离与靶细胞结合的序列,经PCR扩增后,制备单链DNA序列用作下一轮的筛选库;通过反复多轮的筛选,选择富集效果较好次级筛选库进行测序分析,并对测序的序列进行二级结构模拟,选择可能的适配体候选序列,然后进行进一步的亲和力和特异性的表征。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的PD-1核酸适配体在制备能够抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。
进一步地,所述产品至少具有能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用的功能。
进一步地,所述产品至少具有能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用的功能。
进一步地,所述产品至少具有能够激活并增强受抑制的肿瘤浸润效应T细胞的活性,增强免疫功能,从而抑制肿瘤的生长的功能。
进一步地,所述肿瘤包括黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、膀胱癌、卵巢癌或血液系统恶性肿瘤等,但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的产品,其包含前述的PD-1核酸适配体。
藉由上述技术方案,本发明提供的一种靶向PD-1蛋白的适配体序列,基于所述PD-1核酸适配体能够与PD-1高表达细胞系特异性结合,以及与鼠重组PD-1的蛋白的结合,阻断PD-1与PD-L1的结合作用,拮抗由PD-1/PD-L1信号通路所介导的免疫抑制作用,激活并增强肿瘤浸润效应T细胞活性,抑制肿瘤的生长。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下列实施例中所用试剂和原料均市售可得,而其中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。又及,除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NewYork,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,AcademicPress,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1
该基于工程化细胞系进行PD-1适配体的筛选方法具体如下:
a)将含有人PD-1全长基因序列的载体进行PCR扩增,纯化后酶切,同时将pLVX-IRES-Pruo载体进行酶切,然后将酶切后的片段与载体进行连接,然后测序验证所连接的含有目的序列的质粒是否正确,是否将目的序列正确连接到目的载体的相应位点。
b)将步骤a所获得的含有目的序列的重组载体命名为PD-1-pLVX-IRES-Pruo,将PD-1-pLVX-IRES-Pruo、pSPAX2和Pmd2.G三质粒系统进行慢病毒体系的包装。具体方法如下:分别将三质粒系统和OPTI-MEM培养基混合静置;然后将5-10uL Lipo 2000和150uLOPTI-MEM培养基混合静置,然后将上述两体系进行混合静置后加入到293T细胞中,3-4h后更换成完全培养基,48h后收集病毒颗粒。
c)包括:将步骤b中收集的病毒颗粒加入到融合度为70-90%的CHO-K1细胞中进行转染,同时加入浓度为4-6μg/mL的转染增强试剂polybrene,转染12h后,更换培养基;24h后,加入浓度为1-3μg/mL的嘌呤霉素进行为期一周的筛选,成功转入重组载体的细胞可获得嘌呤霉素抗性而存活,并进行蛋白的表达,从而获得稳定表达PD-1细胞系。
d)利用流式细胞术检测所存活的细胞是否能够表达PD-1蛋白,利用抗人PD-1蛋白抗体进行检测,分别用未转染的CHO-K1细胞和转染后的细胞在4℃条件下与绿色荧光基团修饰的anti-PD-1抗体进行孵育30min,然后进行流式分析,相对于对照细胞,转染PD-1表达基因的细胞具有较强的PD-1表达,并将该细胞命名为PD-1细胞。其中,流式分析结果如图1a和图1b所示,其是利用流式技术验证所构建的细胞系是否稳定高表达PD-1蛋白的流式分析结果示意图,其中图1a是转染后的流式分析结果图,图1b是未进行转染的细胞流式分析结果图。
实施例2
以PD-1细胞为靶细胞进行正筛选,未转染的CHO-K1细胞作对照细胞进行负筛选。具体的筛选方法如下:首先将合成的全长76个碱基(含有40个随机序列)的单链DNA文库m-Lib置于95℃水浴中变性5min,然后立即置于冰上10min。用洗涤缓冲液对融合度在90%的PD-1细胞进行清洗,然后与筛选起始文库在4℃条件下孵育60min,洗涤缓冲液清洗后加入适量灭菌水,用灭菌水细胞刮刀将细胞刮下并转移至离心管中,经过95℃处理10min后离心,收集上清即为本轮筛选所得到的富集文库。利用PCR扩增技术,对所得的本轮的筛选库进行扩增,然后利用碱变性的方法制备单链DNA文库用于下一轮的筛选,如此反复,直至得到富集的次级文库。图2为具体的筛选方法示意图。
实施例3
以PD-1细胞为阳性细胞,CHO-K1细胞为对照细胞,利用共聚焦显微镜成像技术对筛选进程进行监测。分别考察了所得到的第十轮的筛选库和起始文库m-Lib对细胞的亲和作用。将状态良好的PD-1和CHO-K1细胞消化后接种到共聚焦皿中,培养24h,PBS清洗后,分别将500nM m-Lib和荧光修饰的第十轮的筛选库和阳性PD-1细胞和对照CHO-K1细胞在4℃条件下进行孵育,洗涤缓冲液清洗然后进行共聚焦显微镜成像。图3a和图3b的共聚焦成像结果表明在筛选至10轮时,该筛选库与靶细胞具有较强的结合,并且与对照细胞无明显的相互作用。
实施例4
选择第十轮的筛选库进行测序并对序列进行二级结构模拟,然后根据所筛选到的序列的二级结构选择可能的适配体候选序列。然后以PD-1细胞为阳性细胞,CHO-K1细胞为对照细胞,利用流式技术考察考察候选序列与细胞的亲和作用。将生长状态良好的PD-1和CHO-K1用胰酶细胞消化处理后,进行细胞计数。将2×105个细胞与绿色荧光基团修饰的候选适配体序列(终浓度为0.25μM)在4℃条件下孵育,洗涤缓冲液离心清洗后进行流式分析,图4a和图4b的流式结果表明所筛选到的适配体序列与构建的PD-1细胞具有较强的结合作用,并且与对照细胞无明显的相互作用。
实施例5
以PD-1细胞为靶细胞,利用流式细胞术技术考察所筛选到的适配体序列与靶细胞间相互作用的的亲和力。将2×105个细胞与不同浓度梯度的绿色荧光基团修饰的候选适配体序列在4℃条件下孵育,洗涤缓冲液离心清洗后进行流式分析其细胞的平均荧光强度,并重复2-4次。利用其细胞平均荧光强度对其适配体浓度进行非线性拟合,其拟合模型为:其中F代表细胞平均荧光强度,F0代表空白细胞平均荧光强度,X代表适配体浓度。其适配体序列及其平衡解离常数如表1所示。
实施例6
考察绿色荧光修饰的候选适配体与鼠源PD-1蛋白的结合作用,其具体方法如下:首先将100uL鼠重组PD-1蛋白(2μg/mL)接种于96孔吸附酶标板,并置于4℃过夜,用洗涤缓冲液清洗3次后,分别加入100μL结合缓冲液、候选适配体、随机序列,其中各序列工作浓度为250nM。4℃孵育后,用洗涤缓冲液清洗,然后利用酶标仪进行检测每个样品孔中的荧光强度(488nm波长激发)。其中每个样品孔重复3次。结果如图5所示,结果表明相对于随机序列,所筛选到的候选适配体能够与鼠源的PD-1蛋白结合,这也为后续的动物实验提供了一定的可行性根据。
实施例7
利用ELISA技术考察候选优化适配体与抗体对PD-1蛋白的竞争作用,其具体方法如下:首先将100uL人重组PD-1蛋白(2μg/mL)接种于96孔吸附酶标板,并置于4℃过夜,用洗涤缓冲液清洗3次,然后分别加入PBS、抗PD-1抗体(2μg/mL)和候选适配体序列(2.5,5,10uM),4℃进行孵育,清洗后利用酶标仪进行测定每个样品孔中的荧光强度,并且每个样品孔重复三次。图6结果表明,随着适配体浓度的提高,该适配体拮抗抗体对PD-1蛋白结合作用越强。
实施例8
利用Jurkat和Hep G2共培养体系考察候选优化适配体对PD-1/PC-L1介导的T细胞抑制的拮抗作用,其具体方法如下:首先利用抗CD3和CD28抗体(2μg/mL)对Jurkat细胞进行激活36-72h,同时利用IFNγ进行Hep G2诱导48h,然后将激活后的Jurkat加入到Hep G2细胞孔中进行共培养,其中Jurkat和Hep G2的比例为10∶1。然后分别设置不同的处理组,包括优化适配体组、随机序列组,以及PBS组。共培养48h后,利用人IFNγ检测试剂盒检测样品孔中细胞培养液中IFNγ的浓度。结果如图7所示,在共培养体系中,随着适配体的加入,细胞因子IFNγ的分泌增加,进而说明候选适配体能够在一定程度上拮抗PD-1/PD-L1信号通路所介导的肿瘤浸润效应T细胞的抑制作用,增强T细胞活性。
实施例9
选择4-6周、雌性Balb/c鼠,在每只小鼠皮下接种CT26细胞,待小鼠皮下肿瘤成型并长径达到5mm时,随机将小鼠分成5组,每组分别给予PBS、PD-1抑制剂、同型对照、优化适配体和随机序列处理,同时记录每只小鼠的体重和肿瘤的长径与短径,并计算肿瘤体积。其中,给药间隔为48h,连续给药两周后,停止给药,并观察小鼠的生长状况。图8示出了所优化适配体PD4S抑制CT26肿瘤模型中肿瘤生长的统计数据图。
综上所述,本发明提供了一种靶向PD-1蛋白的适配体序列,基于所述PD-1核酸适配体能够与PD-1高表达细胞系特异性结合,以及与鼠重组PD-1的蛋白的结合,阻断PD-1与PD-L1的结合作用,拮抗由PD-1/PD-L1信号通路所介导的免疫抑制作用,激活并增强肿瘤浸润效应T细胞活性,抑制肿瘤的生长。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明,本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下,所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明;每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中,在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处,预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成,且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解,各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要,只要本发明教示保持可操作即可。此外,可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外,本案发明人还参照前述实施例,以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验,并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明,但所属领域的技术人员将理解,在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外,可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此,本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例,而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> PD-1核酸适配体、其筛选方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ataccagctt attcaattga gtaagagtgc actatgtttt acgagccgtt tcctcggctc 60
gtagtaagtg caatct 76
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cgcactatgt tttacgagcc gtttcctcgg ctcgtagtaa gtgcg 45
Claims (11)
1.一种PD-1核酸适配体,其特征在于具有SEQ ID No.1所示的序列或SEQ ID No.2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的PD-1核酸适配体,其特征在于:所述优选PD-1核酸适配体具有SEQ ID No.2所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的PD-1核酸适配体,其特征在于:所述PD-1核酸适配体能够与PD-1蛋白特异性结合。
4.一种基于工程化细胞的PD-1核酸适配体的筛选方法,其特征在于包括:
利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染,获得PD-1稳定高表达的细胞系,用于靶细胞的正筛选;
选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞,用于靶细胞的负筛选;
利用Cell-SELEX技术进行PD-1核酸适配体的筛选。
5.根据权利要求4所述的筛选方法,其特征在于包括:利用载有PD-1表达基因的三质粒系统的慢病毒体系对CHO-K1细胞进行转染。
6.权利要求1-3中任一项所述的PD-1核酸适配体在制备能够抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述产品至少具有能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用的功能。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述产品至少具有能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用的功能。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述产品至少具有能够激活并增强受抑制的肿瘤浸润效应T细胞的活性,增强免疫功能,从而抑制肿瘤的生长的功能。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述肿瘤包括黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、膀胱癌、卵巢癌或血液系统恶性肿瘤。
11.一种抑制肿瘤细胞生长的产品,其特征在于包含权利要求1-3中任一项所述的PD-1核酸适配体。
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CN113699156B (zh) | 2023-12-01 |
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