JP6815400B2 - 腫瘍特異的t細胞を提供するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、腫瘍特異的、特に腫瘍反応性のT細胞調製物を提供する方法及びその使用、特に養子移入及び癌治療のための方法に関する。
本明細書の文脈における「核酸」という用語は、ヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを指す。このオリゴマー又はポリマーは、天然ヌクレオシド(すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例えば2−アミノプリン、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、及び2−チオシチジン)、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例えばメチル化された塩基)、挿入塩基、無塩基部位、リボース糖(RNA)、2’−デオキシリボース糖(DNA)、末端3’−デオキシリボース又は2’、3’−ジデオキシリボース糖、修飾糖(例えば、2’−フルオロリボース、アラビノース及びヘキソース)、又は修飾リン酸基(例えば、ホスホロチオエート結合及び5’−N−ホスホロアミダイト結合)を含み得る。さらに、骨格は、修飾されたロックド(LNA)アンロックド(UNA)糖、鏡形態の糖(spiegelmer)又はペプチド骨格(PNA)又はそれらの混合物を含み得る。
本発明の第一の態様によれば、腫瘍特異的T細胞調製物を提供するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む:
a 腫瘍特異的T細胞クローンを以下により選択する工程:
− 患者から得られた腫瘍試料を提供する工程であって、腫瘍試料は腫瘍に浸潤したT細胞を含む工程;
− 核酸単離工程において腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物から複数のT細胞受容体核酸配列を得る工程又は該複数のT細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得る工程;
− 配列選択工程において、複数のT細胞受容体核酸配列から腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を選択する工程、又は複数のT細胞受容体アミノ酸配列から腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を選択する工程;
b 腫瘍特異的T細胞クローンを以下により選別する工程:
− 患者から得られたリンパ球調製物を提供する工程;
− 選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は選択された腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を含む細胞を、単離工程においてリンパ球調製物から単離する工程。
− リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列に対応するT細胞受容体のVセグメント内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドと接触させる工程であって、リガンドが検出可能な標識に結合している工程、及び
− リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程。
− リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、核酸プローブが検出可能な標識に結合している工程と、
− リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程。
− 選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列に対応するT細胞受容体のV領域内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドとリンパ球調製物を接触させる工程であって、リガンドが検出可能な標識に結合している工程、
− リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程、
− 単離された細胞を、選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、前記核酸プローブが別の検出可能な標識に結合している工程と、
− 以前に単離された細胞から他の検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程。
− リンパ球調製物を複数の画分に分離する、分離工程、
− 前記複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、増殖工程、及び
− 選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を含む前記複数の画分の少なくとも1つの画分が選択される、選択工程。
− リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列、又は選択された腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列に対応する、T細胞受容体のVセグメント内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドと接触させる工程、この接触工程ではリガンドが検出可能な標識に結合している工程、及び
− リンパ球調製物から検出可能な標識を担持するT細胞を単離する工程を含み、その後、単離されたT細胞は、上記の分離工程に付される。
− 選択された画分を第2の複数の画分に分離する、第2の分離工程、
− 前記第2の複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、第2の増殖工程、及び
− 選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を含む前記第2の複数の画分の少なくとも1つの画分が選択される、第2の選択工程。
− 腫瘍試料から得られた複数のT細胞受容体核酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体核酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、
− a)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列は、TCRの可変領域に対して実質的に同一の核酸配列を表し、及び/又は
− b)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域に関して同一のアミノ酸配列を示す工程;
− 各クローン型に関連する複数のT細胞受容体核酸配列内のT細胞受容体核酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型の各々についてクローン型頻度を取得する工程、
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である工程、及び
− 選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列を、腫瘍特異的受容体核酸配列として選択する工程。
− 腫瘍試料から得られた複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体アミノ酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域と、実質的に同一又は同一のアミノ酸配列を示す工程;
− 各クローン型に関連する複数のT細胞受容体アミノ酸配列内の、T細胞受容体アミノ酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型のそれぞれのクローン型頻度を取得する工程;
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの100の最も頻度の高いクローン型の1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型であって、この別のクローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうち100個の最も頻度の高いクローン型の中の1つの腫瘍特異的クローン型内に含まれる、複数のT細胞受容体アミノ酸配列の中のT細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一のT細胞受容体アミノ酸配列を含む工程;
− 選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列を、腫瘍特異的受容体アミノ酸配列として選択する工程。
− 患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において非腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物から複数のT細胞受容体核酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を取得する工程;
− 非腫瘍試料から得られた複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を整列させる工程;
− 複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、
a)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に対して実質的に同一の核酸配列を表し、及び/又は
b)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に関して同一のアミノ酸配列を示す工程;
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は腫瘍特異的クローン型の頻度の20%、15%、10%、又は5%以下の頻度(非腫瘍試料中)を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる工程。
a) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列のいずれか1つは、非腫瘍クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列と実質同一である、及び/又は
b) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、非腫瘍試料クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
− 患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において非腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物由来の複数のT細胞受容体核酸配列及び複数のT細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を取得する工程;
− 非腫瘍試料から得られた複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に対して実質的に同一又は同一の配列を表す工程、
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は腫瘍特異的クローン型の頻度の20%、15%、10%、又は5%以下の頻度(非腫瘍試料中)を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる工程。
− 患者から得られた血液試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において血液試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物から複数のT細胞受容体核酸配列を得る工程;
− 複数のT細胞受容体核酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで
a)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に対して実質的に同一の配列を表し、及び/又は
b)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に関して同一の配列を表す工程;
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、前記1つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる工程。
a) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列のいずれか1つは、血液試料クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列と実質同一配列を表す、及び/又は
b) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、血液試料クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
− 患者から得られた血液試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において血液試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物由来の複数のT細胞受容体核酸配列及び複数のT細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のT細胞アミノ酸配列を得る工程;
− 複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体配列に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域に対して実質的に同一の配列を表す工程、
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、前記1つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる工程。
− 患者から得られた無細胞試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において無細胞試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物から複数のT細胞受容体核酸配列を得る工程;
− 複数のT細胞受容体核酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで
a)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に対して実質的に同一の配列を表し、及び/又は
b)特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に関して同一の配列を表す工程;
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、0.001%より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる工程。
a) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列のいずれか1つは、無細胞試料クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列と実質同一配列を表す、及び/又は
b) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列は、無細胞試料クローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
− 患者から得られた無細胞試料を提供する工程;
− 核酸単離工程において無細胞試料から核酸調製物を単離する工程;
− 核酸調製物から複数のT細胞受容体核酸配列及び複数のT細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得る工程;
− 複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 複数のT細胞受容体配列に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列は、TCRの可変領域、特にCDR3領域に対して実質的に同一又は同一の配列を表す工程;
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、0.001%より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる工程。
a) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのどのT細胞受容体核酸配列も、既知のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列と実質同一ではない、
b) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちのT細胞受容体核酸配列によってコードされるどのT細胞受容体アミノ酸配列も、既知のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一ではない、又は
c) 上記のこのクローン型内に含まれる複数のT細胞アミノ酸配列のうちのどのT細胞受容体アミノ酸配列も、既知のクローン型内に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一ではない。
− 複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、前記100個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型のうちの1つに含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうち1つのT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるT細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である。
最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるT細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる。
− 腫瘍試料から5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの5、10、15又は20個であるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の100個の最大頻度のクローン型のうちの5、10又は20個の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び任意に
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は複数の腫瘍試料クローン型の最も高い頻度のクローン型100個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、20%、15%、10%、又は5%以下の頻度(非腫瘍試料中)を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、前記腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、0.001%より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうち1つのT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるT細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる工程。
− 複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1、5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のT細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1、5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれるT細胞アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型100個のうちの1、5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、1つ又は複数の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞アミノ酸配列のうちのT細胞アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である。
− 腫瘍試料から5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの、5個の最大頻度のクローン型、10個の最大頻度のクローン型、15個の最大頻度のクローン型又は20個の最大頻度のクローン型であるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうち前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び任意に
・ 前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中で前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、20%、15%、10%、又は5%以下の頻度(非腫瘍試料中)を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、0.001%より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうちの100個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうち1つのT細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一であるT細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる工程。
− 複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のT細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体アミノ酸配列のT細胞アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された5、10、15又は20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちのT細胞アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である。
a. 腫瘍試料からT細胞を単離し、T細胞から核酸を単離する工程、及び/又は
b. T細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
CD4+CCR7+CD62L+CD45RO+T細胞、より具体的にはCD4+CCR7+CD62L+CD45RO+CD45RA−T細胞を、本発明の腫瘍特異的T細胞調製物、増殖T細胞調製物、又は活性化腫瘍特異的T細胞調製物から単離され、腫瘍特異的セントラルメモリーCD4+T細胞調製物を産生する。
CD4+CCR7−CD62L−CD45RO+T細胞、より具体的には、CD4+CCR7−CD62L−CD45RP+CD45RA−T細胞は、本発明の腫瘍特異的T細胞調製物、増殖T細胞調製物又は活性化腫瘍特異的T細胞調製物から単離され、腫瘍特異的エフェクターメモリーCD4+T細胞調製物を産生する。
− 少なくとも本発明の腫瘍特異的T細胞調製物のいずれか1つのアリコート、特に、単離工程でリンパ球調製物から単離された腫瘍特異的T細胞の1つのアリコートを、患者の自己腫瘍の細胞懸濁液と、又は患者の自己抗原提示細胞を併せた自己腫瘍の溶解物と共培養すること、及び
− 細胞懸濁液の存在下で、T細胞調製物によって産生されたインターフェロンガンマ又はTNFアルファの量を決定すること、及び/又は細胞懸濁液の存在下で、T細胞調製物中のT細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特にOX40、CD107a、CD137、CD154、LAG3、PD−1、B7−H4、PD−1、ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び/又はCD69の量を決定すること。
− 本発明の方法による腫瘍特異的T細胞調製物を提供する工程;
− 腫瘍特異的T細胞調製物を抗癌剤と接触させる工程;及び
− 接触後の腫瘍特異的T細胞調製物の機能性及び/又は生存能力を決定する工程。
− 腫瘍特異的T細胞調製物を、患者の自己腫瘍の細胞懸濁液と、又は患者の自己抗原提示細胞を併せた自己腫瘍の溶解物と共培養する工程、及び
− 細胞懸濁液の存在下で、T細胞調製物によって産生されたインターフェロンガンマ又はTNFアルファの量を決定すること、及び/又は細胞懸濁液の存在下で、T細胞調製物中のT細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特にOX40、CD107a、CD137、CD154、LAG3、PD−1、B7−H4、PD−1、ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び/又はCD69の量を決定する工程。
− 本発明の方法による本発明の腫瘍特異的T細胞調製物のいずれか1つを提供する工程、特に活性化腫瘍特異的T細胞調製物を提供する工程、
− 個々の腫瘍特異的T細胞を腫瘍特異的T細胞調製物から単離する工程;
− 単離された個々の腫瘍特異的T細胞の中のT細胞受容体の両方のサブユニットのCDR3領域を決定する工程;
− 両方のサブユニットの決定されたCDR3領域を含む人工T細胞受容体を調製する工程。
− 本発明の方法による腫瘍特異的T細胞調製物を提供する工程、
− 個々の腫瘍特異的T細胞を腫瘍特異的T細胞調製物から単離する工程;
− 単離された個々の腫瘍特異的T細胞のT細胞受容体の両サブユニットのCDR3領域を決定する工程;
− 両サブユニットの決定されたCDR3領域を含む人工T細胞受容体を調製する工程であって、人工T細胞受容体は部分を含み、この部分により人工T細胞受容体が選択的に単離可能となる、
− 人工T細胞受容体を、抗原を有する細胞と接触させる工程、
− 人工受容体に結合する細胞を単離する工程。
− 目的のT細胞クローン型を含むリンパ球調製物を提供する工程、
− 分離工程において前記リンパ球調製物を複数の画分に分離する工程、
− 前記複数の画分に含まれる細胞を、増殖工程における細胞培養の条件下で増殖させる増殖工程、及び
− 選択工程において前記特異的T細胞受容体核酸配列又はアミノ酸配列を含む前記複数の画分のうちの少なくとも1つの画分を選択する工程。
− 選択された画分が第2の複数の画分に分離される、第2の分離工程、
− 第2の複数の画分に含まれる細胞が、細胞培養条件下で増殖される、第2の増殖工程、及び
− 選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を含む、第2の複数の画分の少なくとも1つの画分が選択される、第2の選択工程。
− 患者から得られた試料を提供する工程であって、前記試料はT細胞を含み、
− 特に本発明のリガンドと試料を接触させることによって、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含むT細胞の存在を検出する工程。
− 患者から得られた試料を提供する工程であって、試料はT細胞を含む工程、
− 試料から核酸調製物を得る工程、
− 本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列の存在を検出する工程。
− 本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含む人工T細胞受容体を特に両方のサブユニットにおいて調製する工程。
i.)異なる生検又は1つの生検の中の異なる領域の選択。これは免疫組織化学的染色によって補助され、ここでは、特に、腫瘍反応性T細胞(TRTC)を、好ましくはT細胞活性化マーカー、例えばLAG3、OX40、CD107a又はCD137で免疫組織学的により染色し、染色された領域をDNA抽出のために選択する;
ii.)腫瘍組織の溶解。TCR分析の出発点としての単一細胞懸濁液の調製のためであり、ビーズベースの技術による。単一細胞懸濁液は、異なるT細胞サブセット、例えば、CD4+及びCD8+サブセットに分けることができる。
さらに、腫瘍試料は、細胞材料のための資源として細胞保存条件下で保存することができる。
i 1bp以下のミスマッチ及び
ii 一方のクラスター(クラスターA)が、他方のクラスター(クラスターB)より少なくとも20倍多くの読み取り断片を有する場合、
そのクラスターはマージされてクラスターAと同一であるとみなされる。ヌクレオチド配列クラスターは、クローン型と等価であるとみなされる。
a.蛍光タグの合成のためのテンプレート
b.遺伝子導入による新規の腫瘍特異的T細胞の合成のためのテンプレート。
− マイクロタイターウェル(少なくとも2ウェル、好ましくは6ウェルより多く、より好ましくは128ウェルから384ウェルの間である)。
− 埋め込みアレイ。細胞は、好ましくは、細胞の自由な拡散を妨げるマトリックスによって埋め込まれ、したがって、最初に沈着されたクローンの座標を保存する。 マトリックスは、好ましくは、アガロース、ゼラチン又はポリアクリルアミドなどのポリマーを含む。
− ランダムアレイ。ランダムアレイは、試料を含むのに、事前に形成されたグリッドに依存しない。
− マイクロフルイディック。 マイクロ流体アレイは、細胞及び/又は核酸の初期細胞分布、洗浄、希釈、増殖及び回収を含む取り扱い段階を可能にするチャネル及び他の構造によって特異的に形成することができる。 そのようなマイクロ流体アレイの非限定的な例は、http://www.biomemsrc.org/research/cell−tissue−microengineering/living−cell−arryに示されている。
− 1bp以下のミスマッチ及び
− 1つのクラスタ(クラスタA)が他のクラスター(クラスターB)よりも少なくとも20倍の読み取り断片を有する
場合には、合併されてクラスターAと同一であるとみなされる。ヌクレオチド配列クラスターは、クローン型と等価であるとみなされる。
Claims (14)
- 腫瘍特異的T細胞調製物を提供するための方法であって、以下の工程:
a 腫瘍特異的T細胞受容体の核酸配列又はアミノ酸配列を以下により選択する工程:
− 患者から得られた腫瘍試料を提供する工程;
− 該腫瘍試料から核酸を抽出して核酸抽出物を得る核酸抽出工程;
− 該核酸抽出物から複数のT細胞受容体核酸配列を得る工程又は該複数のT細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得る工程;
− 前記複数のT細胞受容体核酸配列から腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を選択する工程、又は前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列から腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を選択する配列選択工程;
b 腫瘍特異的T細胞クローンを以下により選別する工程:
− 前記患者から得られたリンパ球調製物を提供する工程;
− 前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を含む細胞を前記リンパ球調製物から単離する単離工程
を含む、腫瘍特異的T細胞調製物を提供するための方法。 - 前記単離工程は、以下の工程:
− 前記リンパ球調製物を、前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は前記選択されたT細胞受容体アミノ酸配列に対応するT細胞受容体のVセグメント内に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することができる反応性リガンドと、接触させる工程であって、前記リガンドが検出可能な標識に結合し、及び前記リガンドは、10 −7 mol/l以下の解離定数で前記アミノ酸配列に結合する工程、及び
− 前記リンパ球調製物から、前記検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記単離工程は、以下の工程:
− 前記リンパ球調製物を、前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、前記核酸プローブが検出可能な標識に結合する工程、
− 前記リンパ球調製物から、前記検出可能な標識を有するT細胞を単離する工程
を含み、又は
前記単離工程は、以下の工程:
− 前記リンパ球調製物を複数の画分に分離する、分離工程、
− 前記複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、増殖工程、及び
− 前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は選択された腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を含む前記複数の画分の少なくとも1つの画分が選択される、画分選択工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 前記画分選択工程は、以下の工程:
− 前記複数の画分を、前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させ、ここで前記核酸プローブが検出可能な標識に結合しており、かつ前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を含む画分を同定する工程、又は
− 前記複数の画分からT細胞受容体核酸配列を得て、及び前記選択された腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列を含む画分を同定する工程
を含む、請求項3記載の方法。 - 前記配列選択工程は、以下の工程:
− 前記複数のT細胞受容体核酸配列又は前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 前記複数のT細胞受容体核酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列、前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列又はT細胞受容体アミノ酸配列は、同一の配列、又は1つの位置の塩基が異なる核酸配列又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を表す工程;
− 各クローン型に関連するT細胞受容体核酸配列の数を決定し、又は各クローン型に関連するT細胞受容体アミノ酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型の各々についてクローン型頻度を取得する工程;
− 前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで前記腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つである、及び/又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である工程、及び
− 前記選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列を、前記腫瘍特異的受容体核酸配列として選択する工程、又は前記選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列を、前記腫瘍特異的アミノ酸配列として選択する工程
を含む、請求項1〜4のいずれか一項を含む方法。 - 更に以下の工程:
− 前記患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程;
− 前記非腫瘍試料から核酸を抽出して核酸抽出物を得る核酸抽出工程;
− 前記核酸抽出物から複数のT細胞受容体核酸配列を得て、又は該T細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を取得する工程;
− 前記複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は前記複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 前記複数の非腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列又は前記複数の非腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列又はT細胞受容体アミノ酸配列は、同一の配列、又は1つの位置の塩基が異なる核酸配列又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を表す工程、
− 前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、前記非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記腫瘍特異的クローン型の頻度の20%以下の頻度を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項5記載の方法。 - 更に以下の工程:
− 前記患者から得られた血液試料を提供する工程;
− 該血液試料から核酸を抽出して核酸抽出物を得る核酸抽出工程;
− 該核酸抽出物から複数のT細胞受容体核酸配列、又は該複数のT細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得る工程;
− 該複数のT細胞受容体核酸配列又は該複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 該複数のT細胞受容体核酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列又はT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列又はT細胞受容体アミノ酸配列は同一の配列、又は1つの位置の塩基が異なる核酸配列又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を表す工程;
− 前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 前記複数の腫瘍試料のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、前記1つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項5又は6記載の方法。 - 更に以下の工程:
− 前記患者から得られた無細胞試料を提供する工程;
− 該無細胞試料から核酸を抽出して核酸抽出物を得る核酸抽出工程;
− 該核酸抽出物から複数のT細胞受容体核酸配列、又は該複数のT細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のT細胞受容体アミノ酸配列を得る工程;
− 該複数のT細胞受容体核酸配列又は該複数のT細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程;
− 該複数のT細胞受容体核酸配列に含まれるT細胞受容体核酸配列又は該複数のT細胞受容体アミノ酸配列に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで特定のクローン型内に含まれるT細胞受容体核酸配列又はT細胞受容体アミノ酸配列は同一の配列、又は1つの位置の塩基が異なる核酸配列又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を表す工程;
− 前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・ 前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記100個の腫瘍特異的クローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列、又は前記100個の腫瘍特異的クローン型のうちの前記1つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列
を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型
に割り当てることができる、
請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記腫瘍試料クローン型の最大頻度のクローン型、又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型が、選択され、ここで前記最大頻度のクローン型が、前記非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記腫瘍特異的クローン型の頻度の、20%以下の頻度を示す非腫瘍クローン型に割り当てることができ、及び/又は前記各腫瘍試料クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができ、及び/又は無細胞クローン型に割り当てることができ、及び/又は前記最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる、
請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 更に以下の工程:
− 前記腫瘍試料から5〜20個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・ 前記選択された腫瘍特異的クローン型は、頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの5〜20個であって、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの頻度が最高のものから上位5〜20個のクローン型であるか、及び/又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型のいずれか1つに含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの1つのT細胞受容体核酸配列によってコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び/又は
・ 前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、20%以下の頻度を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び/又は
・ 前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列のうちの前記T細胞受容体核酸配列のいずれか一つにコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一又は1つ若しくは2つの位置のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であるT細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる、
請求項5〜10のいずれか一項に記載の方法。 - − 前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの、前記頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つ、前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちの1つのT細胞受容体アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のT細胞受容体アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの、前記頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つ、前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれるT細胞受容体配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び/又は
− 前記複数の腫瘍試料クローン型のうち前記頻度が最高のものから上位100個のクローン型のうちの1つ、前記選択された5〜20個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか1つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体核酸配列の中のT細胞受容体核酸配列にコードされるT細胞受容体アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体核酸配列によりコードされるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のT細胞受容体アミノ酸配列のうちのT細胞受容体アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるT細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、
請求項5〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記核酸抽出工程は、以下の工程:
a. 前記腫瘍試料からT細胞を単離し、前記単離されたT細胞から核酸を抽出する工程、及び/又は
b. T細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程
を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記腫瘍特異的T細胞受容体核酸配列は、ヒトT細胞受容体の鎖のCDR3領域をコードし、又は前記腫瘍特異的T細胞受容体アミノ酸配列は、ヒトT細胞受容体の鎖のCDR3領域に含まれるか、又はそのものである、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
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