CN110087731A

CN110087731A - Pd-1特异性适体

Info

Publication number: CN110087731A
Application number: CN201780062311.2A
Authority: CN
Inventors: 桑塔那·高里·坦戛弗吕·戴瓦拉吉; 斯瓦米纳坦·P·耶尔
Original assignee: Methodist Hospital System
Current assignee: Methodist Hospital System
Priority date: 2016-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2019-08-02
Also published as: MX2019002618A; EP3509700A1; JP2019534708A; WO2018048888A1; AU2017324860A1; GB2569488A; BR112019004481A2; US20190233824A1; IL265169A; GB201904737D0

Abstract

本公开涉及PD1特异性适体和治疗癌症的方法。

Description

PD-1特异性适体

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年9月6日提交的美国临时专利申请序列号62/383,952的权益，所述专利的公开内容明确地以引用的方式并入本文。

技术领域

本公开涉及PD1特异性适体和治疗癌症的方法。

背景技术

大多数人肿瘤具有导致肿瘤相关抗原表达的显著遗传和表观遗传变化，所述肿瘤相关抗原触发作为用于清除肿瘤细胞的有利步骤的细胞毒性T细胞应答。然而，许多检查点机制已经就位以防止自身免疫，其证明对癌细胞增殖是有益的。已显示癌细胞分泌PD-L1和PD-L2并利用PD-1介导的T细胞功能的抑制用于逃避免疫监视，从而导致癌症进展(Pardoll，DM(2012)Nature Reviews 12：252-264)。最近，已经开发了若干治疗性抗体，所述治疗性抗体靶向PD-1/PD-L1轴以活化针对小鼠和人中的肿瘤的T细胞应答，并且已经FDA批准。然而，由于其他免疫学副作用，治疗性抗体并非适合所有患者。

发明内容

本文公开了DNA适体，所述DNA适体模拟靶向PD-1/PD-L1轴的治疗性抗体。选择性地结合至参与癌症进展的重要蛋白质的高亲和力DNA适体正在成为一类新的药物和诊断剂。DNA适体是基于小分子和抗体的药物的替代物，这是由于它们对治疗性蛋白质靶标的高特异性以及它们易于修饰以携带毒性物质来杀死体内的癌细胞的顺从性。

在一些方面，本文公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-L-n-Z-n-R-n，

其中“L”包含核酸序列TACCTGATAGCGTATGCGA(SEQ ID NO：2)，或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的核酸序列，或其长度为至少15个核苷酸的片段，

其中“Z”包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：1)，其中“x”是A、T或C，

其中“R”包含核酸序列CTCTCAGTAGGTGCATAAGCG(SEQ ID NO：3)，或与SEQ ID NO：3具有至少80％序列同一性的核酸序列，或其长度为至少15个核苷酸的片段，并且

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

其中所述DNA适体在生理条件下特异性地结合至PD-1并破坏程序性死亡-1(PD-1)与程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用。

在一些实施方案中，所述DNA适体包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

在一些实施方案中，所述DNA适体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

还公开了一种治疗性组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本文公开的DNA适体。在一些实施方案中，所述DNA适体被包封在纳米颗粒中。例如，所述DNA适体可以是聚乙二醇化的。

在一些实施方案中，本文所述的DNA适体充当化合物的模块部分，可以向所述模块部分添加另外的模块单元。在一些实施方案中，所述适体与另外的适体缀合。在一些实施方案中，所述适体与抗体或抗体片段缀合。在一些实施方案中，所述与另外的适体缀合的DNA适体充当双特异性适体。在一些实施方案中，所述与抗体缀合的DNA适体充当双特异性适体/抗体分子。在一些实施方案中，本文所述的DNA适体与至少一种(例如，至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种)另外的适体缀合。在一些实施方案中，本文所述的DNA适体与至少一种(例如，至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种)抗体或抗体片段缀合。

在一些实施方案中，所述适体与治疗剂，如抗肿瘤剂和/或放射增敏剂缀合。在一些实施方案中，所述适体与治疗剂，如抗肿瘤剂和/或放射增敏剂组合施用。

抗肿瘤剂(抗肿瘤药物)包括但不限于阿巴瑞克、阿比特龙、阿多-曲妥珠单抗恩他新、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、艾乐替尼(alectinib)、阿仑单抗、阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、抗胸腺细胞球蛋白、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿特珠单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、BCG、贝利司他、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博来霉素、博纳吐单抗、硼替佐米、博舒替尼、贝伦妥单抗-维多汀、本妥昔单抗维多汀、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫氟、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮芥、色瑞替尼、西妥昔单抗、西达本胺、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、考比替尼、克唑替尼、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达拉菲尼、达卡巴嗪、更生霉素、达雷木单抗、柔红霉素、达沙替尼、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物、达妥昔单抗、多西他赛、阿霉素、埃罗妥珠单抗、恩杂鲁胺、表柔比星、依托泊苷、艾日布林、埃罗替尼、雌莫司汀、依维莫司、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟甲睾酮、氟他胺、福莫司汀、氟维司群、吉非替尼、吉妥珠单抗奥佐米星、戈舍瑞林、组氨瑞林、羟基尿素、羟基脲、替伊莫单抗、依鲁替尼、替伊莫单抗、伊达比星、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、干扰素、碘苄胍、伊匹单抗、伊立替康、异维甲酸、亮丙瑞林、洛莫司汀、美法仑、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、米非司酮、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳米白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、耐昔妥珠单抗、奈达铂、奈拉滨、尼罗替尼、尼鲁米特、纳武单抗、奥比妥珠单抗、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕尼、奥马他辛(Omacetaxine)、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼、紫杉醇、帕尼单抗、帕比司他、帕唑帕尼、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、喷司他丁、普卡霉素、泊马度胺、普纳替尼、普拉曲沙、丙卡巴肼、二氯化镭Ra223、雷替曲塞、雷莫芦单抗、瑞戈非尼、利妥昔单抗、罗米地辛、鲁索替尼、来昔决南钐(153Sm)、司妥昔单抗、西普鲁塞-T、索尼德吉、索拉非尼、锶-89、舒尼替尼、拉他莫金冻干混悬剂(talimogene laherparepvec)、他米巴罗汀(tamibarotene)、他莫昔芬、替加氟、替加氟/尿嘧啶、替莫唑胺、替西罗莫司、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、托泊替康、托瑞米芬、托珠单抗、托西莫单抗、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦新、维甲酸、三氟尿苷/替吡嘧啶组合、曲普瑞林、丙戊酸盐、戊柔比星、凡德他尼、威罗菲尼、维特克拉、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、维莫德吉、伏立诺他、阿柏西普。在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂包含括羟基脲。在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂包括干扰素。在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂包括维奈托克(venetoclax)。

已知的放射增敏剂的实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、己酮可可碱和长春瑞滨。

在一些实施方案中，所述适体是键结DNA“货车车厢(boxcar)”以形成用于分子药物的靶向转运的“DNA纳米列车(nanotrain)”。DNA“货车车厢”是串联dsDNA序列，其是化学治疗药物插入的靶标。众所周知，若干广泛使用的蒽环类抗癌药物，包括阿霉素(Dox)、柔红霉素(DNR)和表柔比星(EPR)，可优先插入双链5’-GC-3’或5’-CG-3’。因此，所述货车车厢可含有药物插入位点，如ACG/CGT。

还公开了包含两种或更多种公开的适体的多价适体，所述公开的适体模拟靶向PD-1/PD-L1轴的治疗性抗体。

在一些实施方案中，所述DNA适体以10nM至200μM的浓度存在。

在一些实施方案中，本文公开的方法用于治疗受试者的癌症，例如血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓病症、淋巴病症、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、肥大细胞病症和骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)等。在一些实施方案中，所述癌症是白血病。在一些实施方案中，所述癌症是急性骨髓性白血病。在一些实施方案中，所述癌症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。

还公开了一种用于治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的含有PD-1特异性适体的组合物。例如，所述感染性疾病可选自由以下组成的组：结核病、人免疫缺陷病毒(HIV)和急性丙型肝炎病毒(HCV)。

附图和下文的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其他特征、目的和优点将是从说明书和附图以及权利要求清楚的。

附图说明

图1示出使用抗PD1抗体从人白血病细胞系的裂解物中免疫沉淀PD-1后的免疫印迹分析。将细胞用50IU干扰素处理24小时。

图2示出来自代表性迭代轮次选择的PCR扩增的PCR的PAGE分析。

图3示出来自第6轮和第7轮的会聚序列的Clustal X多序列分析。在所有会聚序列中存在高重复元件TTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：64)。

图4示出表示在第7轮选择之后会聚序列之间的邻近关系的系统发育树。

图5示出各自五百皮摩尔的六种选择的适体分别与链霉亲和素磁珠混合并孵育一小时。通过洗涤除去未结合的适体，并将此类珠粒与上述HEL细胞裂解物一起进一步孵育，并充分洗涤未结合的蛋白质，并使珠粒上的结合的蛋白质进行SDS-PAGE，然后使用PD-1特异性抗体进行蛋白质印迹分析。

图6A示出通过流式细胞术PD-1荧光素适体与HEL细胞结合。图6B示出HEL细胞中PD-1适体的荧光显微术。

图7是保守的富含G的重复序列中PD-1特异性适体和G-四链体的预测的二级结构的示意图。

图8示出在第7天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的同种异体MLR的活化。

图9A示出适体fpf2(10-150-373)与PD1的结合。图9B示出适体fpf2与PD1(裂解物)的结合。

图10是用于筛选PD-1特异性适体的SELEX方法的示意性图示。

图11示出用于SELEX的PD-1蛋白的分离和制备。

图12示出在存在和不存在PD-1抗体的情况下所选择的DNA适体与PD-1之间的竞争性结合测定。

图13A-13D示出所选择的DNA适体与PD-1蛋白的结合特异性的验证。

图14A-14B示出用于验证PD-1适体与PD-1蛋白的结合的过滤结合测定。

图15A-15C示出通过蛋白质印迹分析和免疫沉淀分析验证白血病患者样品中所选择的DNA适体与PD-1蛋白的结合特异性。

图16示出在抗PD-1 DNA适体的背景下使用基于细胞的测定来筛选和表征PD-1的生物活性及其配体相互作用。

图17示出在不同时间点在96％的人AB血清中测试的适体稳定性。

图18示出在不同时间点在80％的人AB血清中测试的适体稳定性。

图19示出在第1天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的同种异体MLR的活化。

图20示出在第3天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的同种异体MLR的活化。

图21A-21C示出通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性。

图22A-22C示出通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性。

图23示出在第1天、第3天、第5天和第7天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的与CD4的混合淋巴细胞反应(MLR)的活化。

图24示出PD1和PD-L1表达对照、PD-1和PD-L1抗体的CD4+T细胞(MLR测定)的共聚焦显微术分析。

图25示出PD1和PD-L1表达对照、PD-1适体和PD-L1抗体的CD4+T细胞(MLR测定)的共聚焦显微术分析。

图26示出在第1天、第3天和第5天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的与CD4的混合淋巴细胞反应(MLR)的活化。

图27示出在第1天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图28示出在第3天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图29示出在第5天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图30示出在第1天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图31示出在第3天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图32示出在第5天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD4的MLR)。

图33示出在第1天、第3天和第5天由PD-1抗体和PD-1适体刺激的与CD8的混合淋巴细胞反应(MLR)的活化。

图34示出在第1天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图35示出在第3天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图36示出在第5天通过用于IFNγ细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图37示出在第1天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图38示出在第3天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图39示出在第5天通过用于IL-2细胞因子分析的ELISA与PD-1抗体相比较来表征PD-1适体的功能活性(与CD8的MLR)。

图40示出具有TCR/PD-L1 HEK的Jurkat中的PD1 NFATc荧光素酶报告子。

图41示出Incucyte靶细胞裂解活性。

图42示出用于改进具有聚乙二醇化的适体的稳定性的示意图。

图43示出与对照相比，Cy3聚乙二醇化适体的平均血浆浓度。

图44示出使用HNSG-SGM3小鼠的体内实验的示意性图示。

图45示出H-NSG HEL92.1.7异种移植模型中的平均肿瘤体积。

图46示出H-NSG HEL92.1.7异种移植模型中的中值肿瘤体积。

图47示出至13天的H-NSG HEL92.1.7异种移植模型中的平均肿瘤体积。

具体实施方式

急性骨髓性白血病的特征在于异常高数量的骨髓来源的未成熟白细胞。它每年影响20,000人，并且造成10,000例死亡，大多数是成年人。它通常是在老年群体(65+)中观察到的疾病，但是在急性成淋巴细胞性白血病后儿童中第二最常见形式的癌症。通过免疫系统识别癌细胞上的肿瘤抗原是清除肿瘤细胞中最重要的步骤之一。然而，癌细胞可通过表达一些活化免疫检查点的蛋白质来发展逃避免疫应答的非凡能力。此类分子包括PD-1、CTLA-4及其同源配体，所述同源配体有效抑制T细胞活化并随后逃避免疫监视。免疫检查点是用于预防自身免疫的内在机制。此外，在巨噬细胞和树突细胞呈递抗原期间的蛋白水解加工在免疫应答的调控以及自身免疫中具有重要意义。这种高度协调的生物现象对于建立适应性免疫至关重要。在抗原加工的任何步骤中的失调可导致自身反应性T细胞的发育或肿瘤的免疫逃避。最近，已经开发了若干治疗性抗体，所述治疗性抗体靶向PD-1/PD-L1轴以活化针对人中的肿瘤的T细胞应答，并且已经FDA批准。

本文公开了PD-1特异性DNA适体(抗PD1-Apt)，所述适体模拟靶向PD-1/PD-L1轴的治疗性抗体，其可通过恢复癌症患者中的T细胞活化而引发活性宿主免疫应答。适体是由长度在30至60个碱基范围内的短的单链寡核苷酸组成的小分子配体。与蛋白质抗体类似，寡核苷酸适体基于其独特的三维结构以高亲和力特异性地识别并结合至其靶标。本文公开了特异性地阻断人PD1与其配体PDL1的相互作用的DNA适体。本发明人已经证明了混合淋巴细胞反应(MLR)中的稳健抗PD1阻断以及CD8+T细胞中Th1细胞因子干扰素-γ和IL-2的诱导。

现将详细参考本发明的代表性实施方案。虽然将结合列举的实施方案来描述本发明，但是应理解，本发明并不意图限于那些实施方案。相反，本发明意图涵盖可包括在如权利要求所限定的本发明范围内的所有替代方案、修改以及等效物。

本领域技术人员将认识到与本文所描述的方法和材料类似或等效的许多方法和材料，所述方法和材料可用于实践本发明并且在本发明的范围内。本发明绝不限于所描述的方法和材料。

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然可在本发明的实践或测试中使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。

本公开中引用的所有出版物、公布的专利文件以及专利申请指示了本公开所涉及的一个或多个领域中的技术水平。本文所引用的所有出版物、公布的专利文献以及专利申请特此以引用的方式并入，其引用程度就如同具体地并且个别地指示每一单个出版物、公布的专利文献或专利申请是以引用的方式并入。

如本公开(包括所附权利要求书)中所使用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物，并且可与“至少一个”和“一个或多个”互换使用。因此，提及“适体”包括适体的混合物等。

如本文所用，术语“约”表示数值的非显著的修改或变化，以使得所述数值所涉及的项目的基本功能不变。在一些实施方案中，术语“约”可包括数值的20％(例如，20％、10％、5％、1％)内的值。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”以及其任何变化形式意图涵盖非排他性包括，以使得包含、包括或含有要素或要素列表的过程、方法、产品方法或物质的组合物不仅包括那些要素，而且可包括未明确列出或此类过程、方法、产品丰富或物质的组合物所固有的要素。

术语“适体”是指与特定靶分子结合的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列汇集物。所选择的适体能够适应独特的三级结构并以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适体”是DNA或RNA寡核酸，所述寡核酸经由其构象与靶分子结合且由此抑制或遏制这种分子的功能。核酸适体可由DNA、RNA或其组合构成。“肽适体”是具有插入恒定支架蛋白内的可变肽序列的组合蛋白质分子。肽适体的鉴别通常在严格的酵母双杂交条件下进行，其增强所选择的肽适体在细胞内环境中稳定表达和正确折叠的可能性。

核酸适体通常是长度在10-150个碱基(或例如15-50个碱基)范围内的寡核苷酸，所述寡核苷酸折叠成确定的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。核酸适体优选地以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的K_d结合靶分子。核酸适体也可以非常高度的特异性结合靶分子。优选所述核酸适体与靶分子的K_d比其他非靶向分子的K_d低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。

通常通过吸附、回收和再扩增的迭代过程从合成寡核苷酸的复杂文库中分离核酸适体。例如，可使用SELEX(指数富集的配体系统进化)方法来制备核酸适体。SELEX方法涉及从由各自具有随机序列区和在其两端的引物结合区的RNA分子组成的RNA汇集物中选择与靶分子结合的RNA分子，经由RT-PCR扩增所回收的RNA分子，使用所获得的cDNA分子作为模板进行转录，以及使用所得物作为后续程序的RNA汇集物。将这种程序重复数次至数十次，以选择具有更强的结合至靶分子的能力的RNA。对随机序列区和引物结合区的碱基序列长度没有特别限制。通常，随机序列区含有约20至80个碱基，并且引物结合区含有约15至40个碱基。通过将类似于靶分子的分子与RNA汇集物前瞻性混合并使用含有不与目标分子结合的RNA分子的汇集物，可增强对靶分子的特异性。通过这种技术作为最终产物获得的RNA分子用作RNA适体。如何制备适体和使用适体来结合多种不同靶分子的代表性实例可见于美国专利号5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776以及6,051,698中。含有关于已经通过体外选择方法产生的适体和非天然核酶的综合序列信息的适体数据库可在aptamer.icmb.utexas.edu获得。

核酸适体通常对靶分子具有比抗体更高的特异性和亲和力。因此，核酸适体可特异性地、直接地且牢固地结合至靶分子。由于结合所需的靶氨基酸残基的数量可小于抗体的数量，例如，当意图选择性遏制高度同源蛋白质中给定蛋白质的功能时，核酸适体优于抗体。

未经修饰的核酸适体从血流中快速清除，半衰期为数分钟至数小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除，这是适体固有的低分子量的结果。这种快速清除在诸如体内诊断成像的应用中可以是有利的。然而，若干修饰，如2′-氟取代的嘧啶、聚乙二醇(PEG)键联等，可用于使适体的血清半衰期增加至天或甚至周时间尺度。

增加适体的核酸酶抗性的另一种方法是使用镜像异构体(Spiegelmer)。镜像异构体是由非天然L-核糖核苷酸构建的核糖核酸(RNA)样分子。因此，镜像异构体是天然寡核苷酸的立体化学镜像(对映异构体)。与其他适体一样，镜像异构体能够结合诸如蛋白质的靶分子。镜像异构体对其靶分子的亲和力通常在皮摩尔至纳摩尔范围内，并且因此与抗体相当。与其他适体相比，镜像异构体在血清中具有高稳定性，因为它们不易被酶水解裂解。尽管如此，由于它们的低摩尔质量，它们在短时间内由肾脏排泄。与其他适体不同，镜像异构体可能不是通过SELEX方法直接产生的。这是因为L-核酸不适合于酶方法，如聚合酶链式反应。相反，确定通过SELEX方法鉴别的天然适体的序列且然后将其用于天然适体的镜像的人工合成中。

“PD-1适体”是在生理条件下特异性地结合至PD-1并破坏程序性死亡-1(PD-1)与程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用的适体。

如本文所用，“SOMAmer”或缓慢解离速率修饰的适体是指解离速率(t1/2)＞30分钟、＞60分钟、＞90分钟、＞120分钟、＞150分钟、＞180分钟、＞210分钟或＞240分钟的适体(包括含有至少一个具有疏水性修饰的核苷酸的适体)。在一些实施方案中，使用名称为“Methodfor Generating Aptarners with Improved Off-Rates”的美国专利号7,947,447中描述的改进的SELEX方法产生SOMAmer。

如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式以及其类似物。核苷酸包括物质，所述物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。

如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用来指核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括各种实体或部分与任何位置的核苷酸单元的连接。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更广义的术语，且因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括为适体的核苷酸的聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适体。

如本文所用，当用于提及寡核苷酸时，术语“修饰(modify)”、“修饰的(modified)”、“修饰(modification)”及其任何变化形式意指寡核苷酸的四种组成性核苷酸碱基(即A、G、T/U和C)中的至少一种是天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。在一些实施方案中，修饰的核苷酸导致适体与蛋白质靶标的主要疏水相互作用，从而产生高结合效率和稳定的共晶体复合物。在C-5位置具有取代的嘧啶是修饰的核苷酸的实例。修饰可包括主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异胍等。修饰还可包括3′和5′修饰，如加帽。其他修饰可包括，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如像，具有不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)等)和具有带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷化剂(alkylator)的那些以及具有修饰的键联(例如，α端基异构核酸等)的那些。此外，任何通常存在于核苷酸的糖上的任何羟基均可被膦酸酯基团、磷酸酯基团置换；被标准的保护基团保护；或被活化以制备与另外核苷酸或与固体载体的另外键联。5′和3′末端OH基团可被磷酸化或被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一些实施方案中约10至约80kDa范围内的聚乙二醇(PEG)聚合物、在一些实施方案中约20至约60kDa范围内的PEG聚合物或其他亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一些实施方案中，修饰是嘧啶的C-5位置。这些修饰可通过直接在C-5位置的酰胺键联或通过其它类型的键联产生。多核苷酸还可包含本领域众所周知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括2′-0-甲基-、2′-0-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、a-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。如上所述，一个或多个磷酸二酯键联可被替代连接基团置换。这些替代连接基团包括其中磷酸酯被P(0)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(0)NR2(“酰胺化物”)、P(0)R、P(0)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各个R或R′独立地是H、或任选地含有醚(-0-)键联的取代的或未取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键联都需要相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代在设计最终产物中可能是有利的，例如，替代主链结构如聚酰胺主链也可在设计最终产物中是有利的。

核苷酸可在寡核苷酸合成之前或之后进行修饰。寡核苷酸中的核苷酸的序列可被一种或多种非核苷酸组分中断。修饰的寡核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如像通过与任何合适的标记组分缀合。

如本文所用，当提及核酸的修饰时，术语“至少一个嘧啶”是指核酸中的一个、几个或所有嘧啶，从而表明核酸中的C、T或U的任何一者或所有的任何或所有出现都可被修饰或不被修饰。

如本文所用，除非另有说明，否则A、C、G、U和T分别表示dA、dC、dG、dU和dT。

如本文所用，“蛋白质”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化的”多肽、蛋白质、肽或肽片段基本上不含来自从其获得氨基酸序列的细胞、组织或无细胞来源的细胞物质或其他污染蛋白质，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。

如本文所用，“癌症”是指涉及不受调控的和异常的细胞生长的疾病或疾患。常见癌症的一些实例是膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌和直肠癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL))和甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤，所述血液恶性肿瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓病症、淋巴病症、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、肥大细胞病症和骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)等。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。

如本文所用，“接头”是通过共价键或非共价相互作用连接两个或更多个分子实体并且可允许以保持一个或多个分子实体的功能性质的方式空间分离分子实体的分子实体。接头也可称为间隔区。基于本公开，本领域技术人员将容易确定适当的接头序列。

如本文所用，接头可包含选自包括但不限于以下组的一种或多种分子或亚组分：多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体(affybody)、抗体模拟物、脂肪族、芳香族或杂芳香族碳分子、聚乙二醇(PEG)分子、细胞受体、配体、脂质、这些结构的任何片段或衍生物、前述的任何组合或任何其他化学结构或组分。

在一些此类实施方案中，所公开的适体包含至少一种包含疏水性核碱基修饰的修饰的核苷。此外，在一些此类实施方案中，所述疏水性核碱基修饰是修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每种修饰的嘧啶可独立地选自5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲酰胺)-2′-0-甲基尿苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-苯硫基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-0-甲基尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-0-甲基尿苷、5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-0-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-氟尿苷以及5-(N-[1-(2，3-二羟基丙基)]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷)。

在一些实施方案中，所公开的适体可包含C2-C50接头或间隔区，其可以是包含以下的主链：2至50个碳原子(C2-C50)的(饱和、不饱和、直链、支链或环状)链、0至10个芳基、0至10个杂芳基和0至10个杂环基，任选地包含醚(-0-)键联(例如，一个或多个亚烷基二醇单元，包括但不限于一个或多个乙二醇单元-0-(CH2CH20)-；一个或多个1，3-丙二醇单元-O-(α3/4α3/4α3/40)-等)；胺(-NH--)键联；酰胺(-NC(O)-)键联；以及硫醚(-S-)键联等；其中每个主链碳原子可独立地是未取代的(即，包含-H取代基)或可被一个或多个选自以下的基团取代：d至C3烷基、-OH、-NH2、-SH、-0-(Ci至C6烷基)、-S-(Ci至C6烷基)、卤素、-OC(0)(Ci至C6烷基)、-NH-(Ci至C6烷基)等。在一些实施方案中，C2-C50接头是C2-C20接头、C2-C10接头、C2-C8接头、C2-C6接头、C2-C5接头、C2-C4接头或C3接头，其中每个碳可如上所述独立地被取代。

在一些实施方案中，所公开的适体的一个或多个核苷包含选自2′-位糖修饰(如2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟代(2′-F)或2′-0-甲基(2′-OMe))、胞嘧啶环外胺处的修饰、核苷间键联修饰以及5-甲基-胞嘧啶的修饰。在一些实施方案中，PDGF适体在3′末端包含3′帽、5′帽和/或反转脱氧胸苷。

在一些实施方案中，所公开的适体包含至少一个修饰的核苷间键联。在一些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。

在一些实施方案中，所公开的适体具有选自表2中所示序列(SEQ ID NO：6至63)的序列。在一些实施方案中，所公开的适体具有与表2中所示的序列(SEQ ID NO：6至63)至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。

当在两个核酸序列的背景下使用时，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”、“同一性百分比”、“同一％”、“同一性％”及其变化形式可互换使用来指当与参考核酸进行比较并比对最大对应时，查询核酸或查询核酸的一部分中相同的核苷酸碱基的数目除以(1)核苷酸碱基的数量。所述查询序列中最5′对应(即，比对)的核苷酸碱基与最3′对应(即，比对的)核苷酸碱基之间(且包括最5′对应(即，比对)的核苷酸碱基与最3′对应(即，比对的)核苷酸碱基)的核碱基的数目，或(2)参考序列的总长度，以较大者为准。可例如通过以下方法来进行序列的示例性比对以供比较：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索法；这些算法的计算机实施(威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)；或目视检查(一般参见，Ausubel，F.M.等人(1987)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Inter science)。[00135]适于确定序列同一性百分比的算法的一个实例是用于基本局部比对搜寻工具(下文称为“BLAST”)中的算法，参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.15：3389。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(下文称为“NCBI”)公开获得。用于使用可自NCBI获得的软件(例如，BLASTN(用于核苷酸序列))确定序列同一性的缺省参数描述于McGinnis等人(2004)Nucleic Acids Res.32：W20中。

如本文所用，当描述核酸(如适体)的同一性百分比时，所述核酸的序列与参考核苷酸序列至少例如约95％相同时，旨在除所述核酸序列可在每100个参考核酸序列的核苷酸中包括至多五个点突变外，所述核酸序列与参考序列相同。换句话说，为获得所需的核酸序列，即与参考核酸序列至少约95％相同的核酸序列，参考序列中的至多5％核苷酸可缺失或被另一核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸数目的至多5％的一定数目的核苷酸可插入参考序列中(在本文称为插入)。参考序列的用于产生所需序列的这些突变可出现在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或介于那些末端位置之间的任何处，并且是单独地散置在参考序列中的核苷酸间或在参考序列内的一个或多个连续群组中。此外，当核苷酸碱基(1)与参考序列中的核苷酸碱基相同时，或(2)源自参考序列中的核苷酸碱基，或(3)源自参考序列中的核苷酸碱基所来源的相同核苷酸碱基时，意图出于确定同一性百分比的目的将核苷酸碱基视为“相同的”。例如，为了计算同一性百分比，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶“相同”。

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-L-n-Z-n-R-n，

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

在一些实施方案中，所述DNA适体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。在一些实施方案中，所述DNA适体包含SEQ ID NO：12。在一些实施方案中，所述DNA适体包含SEQ ID NO：18。

在一些实施方案中，所公开的适体包含选自由以下组成的组的核酸序列的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

在一些实施方案中，所公开的适体包含选自由以下组成的组的核酸序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

在一些实施方案中，所述DNA包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63，其中所述序列包含位于SEQ ID NO：6至63中的每个中的SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3之间的核酸序列片段。

除PD-1结合区外，所公开的适体可含有任何数量的核苷酸。在各种实施方案中，所公开的适体可包含至多约100个核苷酸、至多约95个核苷酸、至多约90个核苷酸、至多约85个核苷酸、至多约80个核苷酸、至多约75个核苷酸、至多约70个核苷酸、至多约65个核苷酸、至多约60个核苷酸、至多约55个核苷酸、至多约50个核苷酸、至多约45个核苷酸、至多约40个核苷酸、至多约35个核苷酸、至多约30个核苷酸、至多约25个核苷酸或至多约20个核苷酸。

可选择所公开的适体以对PD-1具有任何合适的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，PD-1适体对PD-1具有小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM的解离常数(Kd)。解离常数可用结合测定来确定，所述结合测定使用多点滴定并且拟合方程式y＝(max-min)(蛋白质)/(Kd+蛋白质)+min。在一些实施方案中，所述PD-1适体是Kd小于或等于表2中所示的适体的Kd的适体。

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-L-n-Z-n-R-n，

其中“Z”包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：1)，或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的核酸序列，或其长度为至少15个核苷酸的片段；其中“x”是A、T或C；

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ IDNO：1)，其中“x”是A、T或C。在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：1)，或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的核酸序列；其中“x”是A、T或C。在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：1)，或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的核酸序列；或其长度为至少15个核苷酸的片段；其中“x”是A、T或C。

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-Z-n，

其中“Z”包含核酸序列GGGxTTGGTGTGGTGGG(SEQ ID NO：1)，其中“x”是A、T或C，并且

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-Z-n，

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

在一些实施方案中，n独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，n是0个核苷酸。在一些实施方案中，n是1个核苷酸。在一些实施方案中，n是2个核苷酸。在一些实施方案中，n是3个核苷酸。在一些实施方案中，n是4个核苷酸。在一些实施方案中，n是5个核苷酸。在一些实施方案中，n是6个核苷酸。在一些实施方案中，n是7个核苷酸。在一些实施方案中，n是8个核苷酸。在一些实施方案中，n是9个核苷酸。在一些实施方案中，n是10个核苷酸。在一些实施方案中，n独立地选自0至50个核苷酸。

在一些方面，公开了一种单链DNA适体，其包含下式：

n-L-n-Z-m-R-n，

其中“R”包含核酸序列CTCTCAGTAGGTGCATAAGCG(SEQ ID NO：3)，或与SEQ ID NO：3具有至少80％序列同一性的核酸序列，或其长度为至少15个核苷酸的片段，

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

其中“m”是任何0至50个核苷酸，

包含适体和适体构建体的药物组合物

在一些实施方案中，提供了包含至少一种本文所述的适体或适体构建体和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。合适的载体描述于Lippincott Williams&Wilkins出版的“Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Twenty-first Edition”中，所述文献以引用的方式并入本文。

本文所述的适体可以任何药学上可接受的剂型使用，所述剂型包括但不限于可注射剂型、液体分散剂、凝胶、气雾剂、软膏、乳膏、冻干制剂、干粉、片剂、胶囊、控制释放制剂、快速熔化制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、混合立即释放和控制释放制剂等。具体地，本文所述的适体可被配制：(a)用于选白以下中的任一种的施用：口服、肺部、静脉内、动脉内、鞘内、关节内、直肠、眼、结肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部、经颊、鼻腔和局部施用；(b)成选自以下中的任一种的剂型：液体分散剂、凝胶、气雾剂、软膏、乳膏、片剂、囊剂以及胶囊；(c)成选自以下中的任一种的剂型：冻干制剂、干粉、快速熔化制剂、控制释放制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂和混合立即释放和控制释放制剂；或(d)其任何组合。

用于胃肠外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可包含一种或多种以下组分：(1)无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；(2)抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；(3)抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；(4)螯合剂，如乙二胺四乙酸；(5)缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及(5)用于调节张力的剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可被封闭在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多次剂量小瓶中。

适合用于注射使用的药物组合物可包含无菌水溶液(可溶于水时)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。所述药物组合物应该在制造和储存条件下稳定且必须被保藏以防诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。如本文所用，术语“稳定”是指保持在适于施用至受试者的状态或条件下。

载体可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂(例如，糖)、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)以及无机盐(如氯化钠)。可通过在组合物中包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可通过将活性试剂(例如，适体和/或适体构建体)以适当量与以上列举的成分之一或其组合一起掺入适当溶剂中，根据需要随后过滤灭菌来制备。通常，通过将至少一种适体和/或适体构建体掺入含有基础分散介质和任何其他所需成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，两者都将产生适体和/或适体构建体的粉末以及来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

在一些实施方案中，适体和/或适体构建体被配制用于玻璃体内注射。用于玻璃体内施用的合适制剂描述于例如在Rawas-Qalaji等人(2012)Curr.Eye Res.37：345；Bochot等人(2012)J.Control Release 161：628；Yasukawa等人(2011)Recent Pat.DrugDeliv.Formul.5∶1；以及Doshi等人(2011)Semin.Ophthalmol.26：104中论述的例如眼部药物递送中。在一些实施方案中，包含适体和/或适体构建体的药物组合物通过玻璃体内注射每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次或频率少于每12周一次施用。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可被例如封装在明胶胶囊中或被压缩成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可将适体和/或适体构建体与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。也可使用流体载体制备用作漱口剂的经口组合物，其中于流体载体中的化合物经口施用且漱口并吐出或吞咽。可包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。

对于通过吸入施用，化合物以来自含有合适推进剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或分配器的气雾剂喷雾、雾化液体或来自合适装置的干粉的形式递送。对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且例如对于经粘膜施用，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性试剂配制成本领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。所述试剂也可被制备成栓剂(例如，利用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式以用于直肠递送。

在一些实施方案中，用载体制备适体和/或适体构建体，所述载体将防止从身体中快速消除。例如，可使用控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域的技术人员将是清楚的。所述材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc商购。

脂质体悬浮液(包括带有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些都可根据本领域技术人员已知的方法，例如像美国专利号4,522,811中所述的方法来制备。

此外，适体和/或适体构建体的悬浮液可被制备为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酸酯)或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可用于递送。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂，或增加化合物的溶解度并允许制备高度浓缩溶液的剂。

在一些情况下，尤其有利的是将口服或胃肠外组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量均匀性。

如本文使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；各单位含有经计算在与所需药物载体缔合的情况下可产生所需治疗作用的预定量的适体和/或适体构建体。本文所述的适体和/或构建体的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：特定适体和/或适体构建体的特征和待实现的特定治疗作用，和本领域中配制用于治疗个体的这种活性剂的固有局限性。

包含至少一种适体和/或适体构建体的药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。此类赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂以及其他赋形剂。此类赋形剂是本领域中已知的。示例性赋形剂包括：(1)粘合剂，其包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素(如AvicelPH101和Avicel PHI 02)、硅化微晶纤维素(ProSolv SMCC^TM)、黄芪胶和明胶；(2)填充剂，如各种淀粉、乳糖、乳糖一水合物和无水乳糖；(3)崩解剂，如海藻酸、Primogel、玉米淀粉、轻度交联的聚乙烯吡咯烷酮、马铃薯淀粉、玉米淀粉和改性淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羟基乙酸淀粉钠以及其混合物；(4)润滑剂，包括作用于待压缩粉末的流动性的剂，并且包括硬脂酸镁、胶体二氧化硅，如Aerosil 200、滑石、硬脂酸、硬脂酸钙和硅胶；(5)助流剂，如胶体二氧化硅；(6)防腐剂，如山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其、对羟基苯甲酸的其他酯如对羟基苯甲酸丁酯、醇类如乙醇或苄醇、酚类化合物如苯酚或季铵化合物如苯扎氯铵；(7)稀释剂，如药学上可接受的惰性填充剂，如微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙、糖类和/或任何前述物质的混合物；稀释剂的实例包括微晶纤维素，如Avicel PH101和Avicel PHI 02；乳糖，如乳糖一水合物、无水乳糖和Pharmatose DCL21；磷酸氢钙如Emcompress；甘露醇；淀粉；山梨糖醇；蔗糖；以及葡萄糖；(8)甜味剂，包括任何天然或人造甜味剂，如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜和安赛蜜；(9)调味剂，如薄、水杨酸甲酯、橙子调味剂、麦力甜(Magnasweet)(MAFCO的商标)、泡泡糖调味剂、水果调味剂等；以及(10)泡腾剂，包括泡腾剂对，如有机酸和碳酸盐或碳酸氢盐。合适的有机酸包括，例如，柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、己二酸、琥珀酸和海藻酸以及酸酐和酸式盐。合适的碳酸盐和碳酸氢盐包括，例如，碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、碳酸甘氨酸钠、L-赖氨酸碳酸盐和精氨酸碳酸盐。或者，可仅存在泡腾剂对的碳酸氢钠组分。

在一些实施方案中，本文描述的制剂是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”是指活性成分(例如，适体和/或适体构建体)是存在的主要物质(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其他个体物质更丰富)。在一些实施方案中，基本上纯化的部分是其中所述活性成分占存在的所有大分子物质的至少约50％(在摩尔基础上)的组合物。通常，基本上纯的组合物将占所述组合物中存在的所有大分子物质的大于约80％。在各种实施方案中，基本上纯的组合物将占所述组合物中存在的所有大分子物质的至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在各种实施方案中，所述活性成分被纯化至均质性(通过常规的检测方法不能在所述组合物中检测到污染物质)，其中所述组合物基本上由单一大分子物质组成。

包含适体和适体构建体的药盒

本公开提供了包含本文所述的任何适体和/或适体构建体的药盒。此类药盒可包括，例如，(1)至少一种适体和/或适体构建体；和(2)至少一种药学上可接受的载体，如溶剂或溶液。另外的药盒部件可任选地包括，例如：(1)本文鉴别的任何药学上可接受的赋形剂，如稳定剂、缓冲液等；(2)用于容纳和/或混合药盒组分的至少一个容器、小瓶或类似装置；以及(3)递送装置。

治疗方法

本公开提供了通过使用PD-1适体或适体构建体来预防或治疗医学病状(例如，缓解医学病状的一种或多种症状)的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的这种适体和/或适体构建体。所描述的适体也可用于预防性疗法。在一些实施方案中，所述适体和/或适体构建体口服或静脉内施用。

在一些方面，本文公开了一种用于抑制受试者中PD-1与PD-L1之间的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的DNA适体(或包含所述DNA适体的组合物)，其中所述DNA适体在生理条件下特异性地结合至PD-1并破坏程序性死亡-1(PD-1)与程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用。

在一些实施方案中，所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和膀胱癌的癌症。在一些实施方案中，所述受试者患有急性骨髓性白血病。在一些实施方案中，所述受试者是人。

术语“治疗”是指医学管理患者旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病状或病症。此术语包括积极治疗，即治疗直接具体针对疾病、病理病状或病症的改善；以及包括病因治疗，即治疗针对于去除相关疾病、病理病状或病症的病因。另外，此术语包括舒减治疗，即治疗设计用来减轻症状，而不是治愈疾病、病理病状或病症；预防性治疗，即治疗针对于使相关疾病、病理病状或病症的发展减到最小或部分或完全抑制相关疾病、病理病状或病症的发展；和支持治疗，即治疗用以补充针对改善相关疾病、病理病状或病症的另一特定疗法。术语治疗包括施用本文公开的任何组合物。

术语“受试者”或“宿主”是指为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽类患者。术语“患者”是指在临床医师(例如，医生)的治疗下的受试者。

术语“治疗有效的”是指所用组合物的量具有足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的量。这种改善仅需要减轻或改变，不一定消除。

在一些实施方案中，所公开的化合物或其药学上可接受的盐或前药可与改善或根除如上所述的疾病病状的其他治疗组合施用。包括所公开的适体和/或适体构建体的组合物可含有例如多于一种适体。在一些实例中，含有一种或多种适体的组合物与另一种有用的心血管剂或抗癌剂或抗纤维化剂等组合施用。一般来说，已知治疗剂的当前可用剂型用于在此类组合中使用将是适合的。

“组合疗法”(或“共同疗法”)包括施用适体和/或适体构建体和至少一种第二剂作为意图因这些治疗剂的共同作用而提供有益作用的特定治疗方案的一部分。组合的有益作用包括但不限于由治疗剂的组合所产生的药代动力学或药效动力学共同作用。这些治疗剂的组合施用通常在限定时间段(取决于所选择的组合通常数分钟、数小时、数天或数周)内进行。

根据多种因素来选择利用所述适体和/或适体构建体的给药方案，所述因素包括例如受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学病状；待治疗的病状的严重性；施用途径；受试者的肾功能和肝功能；以及所采用的特定适体和/或适体构建体或其盐。具有普通技能的医师或兽医可以容易地确定和开具预防、对抗或阻止病状进展的所需的组合物的有效量。

在一些实施方案中，本文公开的方法用于治疗受试者的癌症，例如血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓病症、淋巴病症、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、肥大细胞病症和骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)等。在一些实施方案中，所述癌症是白血病。在一些实施方案中，所述癌症是急性骨髓性白血病。在一些实施方案中，所述癌症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。

如本文所考虑的，所治疗的癌症可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。在一个方面，本文描述的方法用于治疗实体瘤，例如，黑素瘤、肺癌(包括肺腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)；乳腺癌(包括导管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌、浆膜腔乳腺癌)；结肠直肠癌(结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；肛门癌；胰腺癌(包括胰腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)；前列腺癌；前列腺腺癌；卵巢癌(卵巢上皮癌或表面上皮-间质瘤，包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索间质肿瘤)；肝和胆管癌(包括肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)；食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌)；口腔和口咽鳞状细胞癌；唾液腺腺样囊性癌；膀胱癌(bladder cancer)；膀胱癌(bladder carcinoma)；子宫癌(包括子宫内膜腺癌、眼部、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、苗勒型混合瘤)；神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤和其他脑肿瘤；肾癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、维尔姆斯肿瘤)；头颈癌(包括鳞状细胞癌)；胃癌(胃癌；胃腺癌；胃肠道间质肿瘤)；睾丸癌；生殖细胞肿瘤；神经内分泌肿瘤；宫颈癌；胃肠道、乳房和其他器官的类癌；印戒细胞癌；间充质肿瘤，包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假血管瘤样基质增生、成肌纤维细胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、皮肤癌(包括黑素瘤)、宫颈癌、成视网膜细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、脑癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、软组织癌、腺体腺癌、尿道癌、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、胆管癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性神经胶质瘤；多形性成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌、恶性副神经节瘤、黑素瘤、梅克尔细胞肿瘤、叶状囊肉瘤、唾液癌、胸腺癌以及阴道癌等。

在一些方面，本文公开了一种用于抑制细胞中的PD-1与PD-L1之间的相互作用的方法，所述方法包括向所述细胞施用如本文所述的DNA适体(或包含所述DNA适体的组合物)，其中所述DNA适体在生理条件下特异性地结合至PD-1并破坏程序性死亡-1(PD-1)与程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用。

在一些实施方案中，所述DNA适体是分离的或纯化的DNA适体。在一些实施方案中，所述DNA适体是非天然存在的序列。在一些实施方案中，所述DNA适体是合成DNA。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解的是，可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其他实施方案也处于以下权利要求的范围内。

实施例

实施例1：程序性细胞死亡-1(PD-1)特异性DNA适体序列的鉴别及其作为免疫治疗剂在癌症诊断和治疗中的效用。

公开了使用几乎未加修改的SELEX程序针对天然人PD1蛋白选择的高亲和力DNA适体的序列。

文库设计：在任一端上的19个碱基的引物侧翼具有25个碱基随机区域的组合DNA文库购自Integrated DNA technologies。表1给出用于所选择的适体汇集物的PCR扩增的正向和反向引物。另外，在多轮迭代筛选期间，将带有5′生物素的反向引物用于使用链霉亲和素磁珠进行的单链DNA制备。正向引物上的5′FAM有助于在选择和ssDNA制备过程中追踪所选择的链。

表2中的序列通常可使用上文第1列中的前三个数字来指代。对于一些序列名称，前三个数字可以是相同的，并且因此也使用另外四个数字来鉴别。

用于SELEX的PD1的分离和制备。在6和24小时的干扰素处理后，通过免疫印迹分析对四种不同的人细胞系中的内源性PD1表达水平进行比较。基于24小时后PD-1的表达水平，选择两种单独细胞系即HEL 92.1.7(ATCC)和KG-1(DSMZ)用于单独地通过免疫沉淀进一步分离PD1。

为了制备用于SELEX筛选的PD-1，将100μl蛋白A与蛋白G磁珠的1∶1混合物用PBS-T洗涤三次，并用于预清除细胞裂解物且然后丢弃。将相同量的类似制备的珠粒与10ug抗PD-1抗体在4℃下孵育2小时。在PBS-T洗涤3次后，将来自每种HEL(ATCC)和KG-1(DSMZ)细胞系的对应于500μg总蛋白质的预澄清裂解物在4℃下与抗体包被的珠粒一起孵育过夜，以将PD-1捕获到表面上。将此类具有捕获的PD-1的珠粒与上清液分离并用PBS-T洗涤3次。对此类珠粒的小等分试样进行免疫印迹分析，以确认捕获的PD-1的存在，并将它们的剩余部分用于如下所述的SELEX轮次。

SELEX程序、下一代测序和数据分析。将一纳摩尔的购买的文库悬浮于50ml含有2mMMgCl2的PBS pH 7.4中，并在水浴中加热至95℃保持10分钟，且然后在室温下缓慢冷却。在冷却至室温后，将用抗PD1抗体包被的磁珠添加至文库混合物中并在室温下孵育30分钟以除去对磁珠以及抗PD1抗体具有高亲和力的那些适体。通过磁性分离除去珠粒，并在此时将含有减小的文库的上清液与具有捕获的PD-1的磁珠一起孵育，并在室温下孵育1小时。在孵育后，分离珠粒并用含有2mM MgCl₂的PBS pH 7.4充分洗涤三次(每次10ml)。将洗涤的珠粒用作用引物AMLIB3和AMLIB4进行的PCR扩增中的模板(参见文库设计)。PCR条件为95℃持续3分钟，初始变性；[95℃持续45秒，54℃持续45秒以及72℃持续45秒]x 20个循环；然后72℃持续5分钟，最终延伸，图2。通过捕获链霉亲和素磁珠上的生物素化链(由生物素化引物产生)、然后在0.1M NaOH存在下进行链分离来制备用于下一轮迭代选择的单链DNA。通过10Kcentricon旋转过滤从单链DNA制备物中除去NaOH。每次用新制备的PD-1磁珠以与上述类似的方式进行七轮迭代选择。在每一轮中，储存所选择PCR产物汇集物的等分试样用于使用具有额外“标签”序列的引物的PCR扩增，以允许随后在下一代测序后鉴别其来源。这种分析对于在多轮迭代选择的情况下追踪结合序列的会聚是非常有用的。在将来自所有七轮和两种不同品系的各自在5′和3′位置具有追踪标签(独特条形码)的PCR产物以相等比例汇集在一起后，在单个Ion-torrent 314芯片(SeqWright)上进行下一代测序。

使用Galaxy项目序列分析工具和FastAptamer软件套件进行NGS数据的分析[Alam KK等人(2015)Molecular Therapy-Nucleic acids 4∶e230：1-10.]。所述软件具有手动工具，用于将测序数据分类并对齐成群集并根据DNA标签记录每条序列，从而允许鉴别PD-1的最佳结合序列(图3)。使用clustal X进一步产生多序列比较和系统树图[Thompson JD等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882](图4)。

所选择的DNA适体与PD-1的结合特异性的验证。为了确定所选择的适体识别内源性PD-1的能力，使用六种最佳代表的生物素化适体从HEL 92.1.7(ATCC)的总细胞裂解物进行PD-1下拉测定。来自下拉测定的PD-1蛋白水平与使用PD1特异性抗体的免疫沉淀蛋白相当(图5)。

通过流式细胞术和显微术进一步验证两种选择的15-120-298和10-150-373适体的PD-1结合。简言之，将荧光标记的适体与表达PD-1的HEL细胞一起孵育，并充分洗涤以除去未结合的适体。然后通过流式细胞术分析细胞的平均荧光强度(图6A)。此外，通过荧光显微术检查细胞(图6B)。

PD-1特异性适体的二级结构。mfold算法用于预测所选择的适体的二级结构。对于所有适体，最优和次优结构具有在-1.5至-4.0千卡/摩尔范围内的最小自由能，揭示这些结构具有低稳定性(图7)。

使用平均荧光强度通过流式细胞术测定适体的亲和力。虽然存在观察到的在具有HEL细胞裂解物的聚丙烯酰胺凝胶中适体的迁移率变动，但是在商购获得的纯化的PD-1蛋白的情况下未观察到相同现象，这是由于这些适体是针对可能处于复合物或呈交替构象的免疫沉淀的内源性PD-1蛋白进行选择的。因此，为了测定结合亲和力，在将荧光标记的适体滴定至固定数量的表达PD-1的细胞中后，使用流式细胞仪测量平均荧光强度。将缺乏PD1表达的细胞用作阴性对照。为了测定所选择的PD-1适体对HEL 92.1.7和KG-1细胞系的结合亲和力，将范围在500nM至0.1nM内的各种浓度的羧基荧光素(FAM)标记的PD-1特异性适体和非特异性(阴性对照)适体分别与HEL 92.1.7或KG-1细胞(对于每种为1x10⁵个细胞)一起在50μl结合缓冲液中孵育15分钟。然后将细胞用100μl洗涤缓冲液洗涤5-6次，且然后重新悬浮于50μl结合缓冲液中以用于经由流式细胞术分析，并且对计数出1x10⁴个细胞用于分析。无适体处理的细胞充当本底对照。通过从本底强度中减去平均荧光强度来计算特异性结合强度。所得到的特异性PD-1适体的平均荧光强度进一步用于计算平衡解离常数(Kd)。使用prism软件(GraphPad Software，Inc.USA)对荧光PD-1适体的Kd作图，其可拟合为特异性结合强度(Y)对比适体浓度(X)的平均荧光强度曲线，Y＝BmaxX/(Kd+X)，假定仅一个结合位点(Hung，L.-Y.等人(2015)Sci.Rep.5，10326；Sefah，K等人(2010)Nat.Protoc.5，1169-1185；Weng，C.H.等人(2013)Microfluid Nanofluid 14，753-765)。

通过读板仪从荧光强度值确定PD-1适体的结合亲和力。为了测定所选择的PD-1适体对HEL 92.1.7和KG-1细胞系的结合亲和力，将范围在500nM至0.1nM内的各种浓度的羧基荧光素(FAM)标记的PD-1特异性适体和非特异性适体(阴性对照)分别与HEL 92.1.7或KG-1细胞(对于每种为1x10⁵个细胞)一起在50μl结合缓冲液中孵育15分钟。然后将1x10⁴个细胞用100μl洗涤缓冲液洗涤5-6次，且然后重新悬浮于50μl结合缓冲液中，并经由读板仪(BioTEK)测量荧光强度。以下实验将重复3次以获得再现性。未进行适体处理的细胞充当本底对照。通过从本底强度中减去荧光强度值来计算特定荧光强度。所得到的特异性PD-1适体的荧光强度进一步用于计算平衡解离常数(Kd)。通过使用prism软件(GraphPad Software，Inc.USA)获得荧光PD-1适体的Kd，其可拟合为特异性结合强度(Y)对比适体浓度(X)的平均荧光强度的曲线，Y＝B_maxX/(K_d+X)，假定仅一个结合位点。

通过共聚焦显微术成像，PD-1特异性适体和抗体与HEL 92.1.7和KG-1细胞的结合。为了通过共聚焦显微术可视化所选择的PD-1适体在HEL 92.1.7或KG-1细胞中的结合位置，将1x10⁵个细胞涂铺。然后将细胞用1x PBS温和洗涤，并且重新悬浮于200μl结合缓冲液中，随后用50μl的250nM和25nM FAM标记的PD-1适体和非特异性适体(作为阴性对照)处理30分钟。在孵育后，将标记的细胞用1 x PBS洗涤三次，并用冰冷的4％多聚甲醛固定5分钟，且然后通过细胞离心涂片器(Cytospin)在600k下附着至显微镜载玻片6分钟。在PD-1抗体标记的情况下，将细胞与PD-1一级抗体一起孵育，然后与二级抗体一起孵育。然后将载玻片空气干燥5分钟，然后用具有DAPI的封固介质固定以进行核染色(抗褪色试剂Invitrogen)。然后通过使用Axio共聚焦显微术对载玻片进行光学分析。

特异性PD-1 DNA适体与不同类型的癌细胞的结合选择性测试。结合选择性测试提供了表达PD-1和选择的PD-1 DNA适体的不同癌细胞模型中捕获速率的间接测量。将不同的癌细胞系模型(1 x 10⁵)与10μl用特异性PD-1适体包被的MyOne珠粒在结合缓冲液中孵育30分钟，最终体积200μl。在孵育后，然后将癌细胞用200μl洗涤缓冲液洗涤5次，且然后重新悬浮于200μl结合缓冲液中。在明视野显微术下使用血细胞计数器对捕获的癌细胞的数量进行计数，而排除MyOne珠粒将充当对照。捕获率计算如下：

反相蛋白质阵列(RPPA)在不同癌症模型中使用PD-1 DNA适体检测PD-1表达水平。使用特异性PD-1 DNA适体替代RPPA中的PD-1抗体将是用于评估不同癌症模型中PD-1蛋白质表达和翻译后修饰的理想选择。PD-1 DNA适体将充当理想的PD-1生物标志物检测剂。

PD-L1抑制剂筛选ELISA测定用于测试特异性抗PD-1适体或抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。使用PD-L1抑制剂筛选ELISA测定评价PD-1特异性适体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。将96孔板用人PD-L1蛋白包被，并与特异性PD-1适体或标准抗体(用于阳性对照)和作为阴性对照的非特异性适体一起孵育。然后将生物素化的人PD-1添加至结合的hPD-L1，然后添加链霉亲和素-HRP。使用TMB或其他比色HRP底物观察显色。最后，将通过OD测量确定PD-1适体抑制PD-1：PD-L1结合的能力。

体外功能测定

混合淋巴细胞反应。使用同种异体混合淋巴细胞反应来评价PD-1特异性适体促进T细胞活化的能力。同种异体MLR是一种功能测定，其测量来自一个供体(应答者)的淋巴细胞对来自另一个供体(刺激者)的淋巴细胞的增殖应答。使用Ficoll-Paque密度梯度离心从血液中分离来自应答者和刺激者供体的PBMC。将刺激者PBMC与500U/ml白细胞介素-4(IL-4)和250U/ml GM-CSF(Biolegend)一起在体外孵育7天。在孵育7天后，用50μg/ml与DNA结合的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理刺激者细胞，从而使细胞有非增殖性。用T细胞增殖应答所需的2μg/ml PHA-M(植物凝集素)处理一组刺激者细胞作为阳性对照(Sigma Aldrich)。应答者细胞未经处理并且在刺激时能够增殖。用50μg/ml丝裂霉素C处理一组应答者细胞用于阴性BrdU对照。将应答者细胞与20ng/ml和10ng/ml PD-1特异性适体或非特异性适体一起孵育24小时。然后根据不同的测试条件将存活刺激者细胞(150,000个)与应答者细胞(100,000个)共培养并孵育5天。在第6天，将溴脱氧尿苷(BrdU)添加至孔来代替胸苷掺入增殖细胞的DNA中(BrdU细胞增殖化学发光测定，Cellsignal)。在24小时后，通过基于板的发光计分析细胞的BrdU掺入，以测量相对光单位(RLU)。刺激的测试细胞与对照、未刺激的应答者细胞的比较产生刺激指数，所述刺激指数可用于比较各种细胞处理组合中的增殖。通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)通过定量存在的ATP(代谢活性细胞的指示物)来分析具有相同组条件而没有BrdU的单独一组板的活细胞。根据数据，在50和100ng抗体处理情况下观察到稳健的MLR应答，并且在PD-1特异性适体情况下也观察到相当的应答(图8)。

用调控性T细胞进行遏制测定。从PBMC纯化CD4⁺CD25⁺调控性T细胞(Treg)和CD4⁺CD25^-应答者T细胞(EasySep^TM人CD4+CD127低CD25+调控性T细胞分离试剂盒(StemcellTechnologies)。通过共培养Treg(5 x 10⁴个)与应答者T细胞1 x 10⁵个以及2 x 10⁴个刺激的树突细胞(DC)与20ng/ml或10ng/ml的PD-1特异性适体或对照非特异性适体来进行同种异体混合淋巴细胞反应测定。在上清液中评估IFN-γ产生，并用(BrdU)标记细胞以便代替胸苷再掺入18小时用于增殖分析。

离体细胞因子释放测定。将来自健康供体的肝素化血液(500μl)与PD-1特异性适体或对照非特异性DNA适体一起在48孔板中在37℃和5％CO₂下孵育24小时。细胞因子应答(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α)使用细胞计数珠粒阵列(Cytometric Bead Array)(Biolegend)在血浆中测量，并通过FACSArray Bioanalyzer(BD Biosciences)进行分析。

聚乙二醇化的特异性PD-1适体不具有细胞毒性，并且不会触发TLR9-先天免疫信号传导

DNA适体的聚乙二醇化。将具有3′己胺修饰剂的特异性和非特异性PD-1 DNA适体与10倍过量的40kDa mPEG-琥珀酰亚胺基戊二酸酯一起孵育(所有测定的P值在适当的情况下使用学生t检验或方差分析来计算)。使用GraphPad PRISM软件来对所有数据作图，执行统计分析，并使用单点结合模型拟合结合曲线。

适体诱导的TLR9免疫应答。将聚乙二醇化的PD-1特异性和非特异性对照适体(40μg，1.3nmol)或TLR9 CpG ODN(ODN 1826，Invivogen，CA)腹膜内施用到初始接触实验的C57BL/6小鼠(n＝3)中。在3小时后处死小鼠，并使用商业ELISA试剂盒(BD Biosciences)定量TNF-α和IL-6的血清水平。对于体外研究，用3μmol/l CpG ODN 1585或PD-1特异性适体或对照非特异性适体处理人巨噬细胞细胞系U-937(ATCC)和小鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7(ATCC)3小时。从通过RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Vaencia，CA)从上述处理分离的RNA通过一步实时PCR反应观察到TLR9诱导。

统计数据。在适当的情况下，使用学生t检验或方差分析来计算所有测定的P值。使用Graph Pad PRISM软件来对所有数据作图，执行统计分析，并使用单点结合模型拟合结合曲线。

使用此类高度特异性的PD-1 DNA适体，现在有可能将其用于生物标志物筛选过程，以用于检测临床患者样品中的PD-1蛋白，以及治疗患有多种类型的癌症(包括白血病和许多其他PD-1免疫应答相关的慢性疾病)的患者。

实施例2：PD1适体和蛋白质结合亲和力

下文的图9A和9B以及表3A和3B示出适体fpf2(10-150-373)与PD1(图9A)和PD1裂解物(图9B)的结合。

实施例3：PD1特异性DNA适体的开发和表征

通过调节调控免疫检查点的受体-配体相互作用，肿瘤具有逃避免疫应答的非凡能力。程序性细胞死亡蛋白(PD-1)(一种在T细胞上表达的细胞表面蛋白)是当与其配体-PDL1或PDL2结合时传递抑制信号的这样一种免疫检查点受体。这种调节通常导致T细胞活化的抑制和肿瘤随后逃避免疫监视。最近，几种FDA批准的治疗性抗体靶向PD-1/PD-L1轴以增强针对癌症的免疫应答。适体是由长度范围为大约15至100个碱基的短的单链寡核苷酸组成的具有确定的三维构象的合成配体，并且类似于能够以高亲和力识别并结合其靶标的抗体。此外，核酸组分具有优于蛋白质对应物的若干优点-如在不太严格的条件下易于生产、长保质期和低成本。在该实施例中，使用白血病细胞裂解物(细胞系和原发性患者样品)评估由高度重复的保守区域组成的PD-1特异性适体(抗-PD1-Apt)的靶标验证，并且发现PD-1特异性适体以其天然状态与PD-1结合。所选择的抗PD1-适体能够特异性地从模拟抗PD-1抗体的裂解物中下拉PD-1蛋白。通过流式细胞术和荧光显微术也证实了抗PD1-Apt的特异性相互作用。如通过生物层干涉术(Bio-Layer Interferometry)所评估，抗-PD1-Apt能够以约500皮摩尔亲和力的Kd结合至PD-1。此外，使用PD-1/NFAT报告子Jurkat细胞，使用基于PD-1/PD-L1细胞的测定确认并表征抗PD1-Apt生物活性。与对照相比，对于在抗-PD1-Apt存在下与过表达PD-L1和TCR活化子的HEK293细胞共培养的PD-1/NFAT报告子-Jurkat细胞中的NFAT荧光素酶报告子活性(相对荧光素酶单位)观察到几倍诱导。这些数据证明了混合淋巴细胞反应(MLR)中的稳健抗PD1阻断以及来自不同供体组PBMC的Th1细胞因子干扰素-γ和IL-2的诱导。

材料和方法

细胞培养：HEL 92.1.7、THP-1、Jurkat-克隆E6-1和HEK293细胞系获自ATCC.HEL92.1.7 THP-1，并且将Jurkat克隆E6-1细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS)和100IU/mL青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养(根据ATCC说明书)。将HEK293细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS)和100IU/mL青霉素-链霉素的DMEM高葡萄糖中培养(根据ATCC说明书)。KG-1细胞系获自DSMZ(Braunschweig，Germany)。将KG-1细胞系在补充有20％胎牛血清(FBS)和100IU/mL青霉素-链霉素的IMDM中培养(根据DSMZ说明书)。所有细胞系的实验均在从ATCC和DSMZ解冻或获得后6个月内进行。细胞系认证由ATCC和DSMZ进行。DSMZ利用短串联重复序列(STR)谱分析来表征和认证细胞系。表达PD-1/NFAT-报告子的JURKAT重组细胞系获自BPSBioscience。将PD-1/NFAT报告子/Jurkat T细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素-链霉素、1mg/ml遗传霉素和200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培养基中以在细胞上保持选择压力。将所有细胞系用5％CO₂和95％空气维持在37℃，并如制造商所描述使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza Rockland，Rockland，ME)测试支原体。当细胞达到70％-80％汇合时，进行所有上述细胞系的实验。

PBMC和原发性AML母细胞：根据赫尔辛基宣言，在知情同意下获得外周血单核细胞(PBMC)和原发性AML样品。收集外周血或骨髓抽吸物样品，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离单核细胞。在细胞活力测定和免疫印迹分析(Devaraj SG 2016)中使用之前纯化了获得但未用于植入接受者中的储备、分离且去识别(de-identified)的供体外周血单核细胞。

抗体和纯化的PD-1、PD-L1蛋白：抗-PD-1和抗肌动蛋白抗体获自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。抗PD-L1抗体获自ThermoFisher Scientific。从ACROBiosystems获得在人293细胞(HEK293)中产生的重组人全长PDCD1蛋白和在人293细胞(HEK293)中产生的PD-L1蛋白。

蛋白质的定量，蛋白质印迹分析：用冰冷的裂解缓冲液使细胞进行裂解，并通过使用BCA测定试剂盒(Thermo Scientific，Waltham，MA)测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE使用等量的细胞裂解物用于蛋白质分析或用于免疫沉淀。将蛋白质样品在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离，且然后电转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(EMD Millipore，Billerica，MA)上。将PVDF膜用封闭缓冲液(LI-COR)封闭，冲洗并与针对PD-1的一级抗体和PD-L1一起孵育。在4℃下孵育过夜后，将膜洗涤并与其相应的近红外荧光二级抗体(LI-COR)一起孵育。通过ODYSSEYCLx(LI-COR)扫描免疫印迹以定量蛋白质表达。蛋白质β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)用作负载对照。

免疫沉淀分析：将100μl的蛋白A与蛋白G磁珠的1∶1混合物用PBS-T洗涤三次，并用于预澄清来自每种HEL(ATCC)和KG-1(DSMZ)细胞系的500μg总细胞裂解物蛋白且然后丢弃。将相同量的类似制备的珠粒与10μg抗PD-1抗体在4℃下孵育2小时。在用3倍PBS-T缓冲液洗涤珠粒后，将来自每种HEL(ATCC)和KG-1(DSMZ)细胞系的对应于500μg总蛋白质的预澄清裂解物在4℃下与抗体包被的珠粒一起孵育过夜以将PD-1捕获到表面上。将具有捕获的PD-1的此类珠粒与上清液分离并用PBS-T缓冲液洗涤3次。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将此类珠粒的小等分试样进行免疫印迹分析，以确认捕获的PD-1的存在，并将它们的剩余部分用于如下所述的SELEX轮次(Tuerk C 1990)。

用于SELEX的PD-1蛋白的分离和制备：在6和24小时的干扰素处理后，通过免疫印迹分析在四种不同的人细胞系(HEL 92.1.7、THP-1、Jurkat-克隆E6-1和KG-1)中比较内源性PD1和PD-L1蛋白表达水平。基于24小时后PD-1和PD-L1的表达水平，选择表达PD-1细胞表面受体及其配体PD-L1的两种细胞系HEL 92.1.7(ATCC)和KG-1(DSMZ)用于单独地通过免疫沉淀进一步分离PD1。

将100μl的蛋白A与蛋白G磁珠的1∶1混合物用PBS-T洗涤三次，并用于预澄清来自每种HEL(ATCC)和KG-1(DSMZ)细胞系的500μg总细胞裂解物蛋白且然后丢弃。将相同量的类似制备的珠粒与10μg抗PD-1抗体在4℃下孵育2小时。在用3倍PBS-T缓冲液洗涤珠粒后，将来自每种HEL(ATCC)和KG-1(DSMZ)细胞系的对应于500μg总蛋白质的预澄清裂解物在4℃下与抗体包被的珠粒一起孵育过夜以将PD-1捕获到表面上。将具有捕获的PD-1的此类珠粒与上清液分离并用PBS-T缓冲液洗涤3次。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将此类珠粒的小等分试样进行免疫印迹分析，以确认捕获的PD-1的存在，并将它们的剩余部分用于如下所述的SELEX轮次(Tuerk C 1990)。

SELEX程序、下一代测序和数据分析：将一纳摩尔的购买的文库悬浮于50ml含有2mMMgCl2的PBS pH 7.4中，并在水浴中加热至95℃持续10分钟，且然后在室温下缓慢冷却。在冷却至室温后，将用抗PD1抗体包被的磁珠添加至文库混合物中并在室温下孵育30分钟以除去对磁珠以及抗PD1抗体具有高亲和力的那些适体。通过磁性分离除去珠粒，且然后将含有减小的文库的上清液现在与具有捕获的PD-1的磁珠一起孵育，并在室温下孵育1小时。在孵育后，将珠粒分离并用含有2mM MgCl₂的PBS pH 7.4充分洗涤三次(每次10ml)。将洗涤的珠粒用作用引物AMLIB3和AMLIB4进行的PCR扩增中的模板(参见文库设计)。PCR条件为95℃持续3分钟，初始变性；[95℃持续45秒，54℃持续45秒以及72℃持续45秒]x 20个循环；然后72℃持续5分钟，最终延伸，图2。通过捕获链霉亲和素磁珠上的生物素化链(由生物素化引物产生)、然后在0.1M NaOH存在下进行链分离来制备用于下一轮迭代选择的单链DNA。通过10K centricon旋转过滤从单链DNA制备物中除去NaOH。每次用新鲜制备的PD-1磁珠以与上述类似的方式进行七轮迭代选择。在每一轮中，储存所选择PCR产物汇集物的等分试样用于使用具有额外“标签”序列的引物的PCR扩增，以允许随后在下一代测序后鉴别其来源。这种分析对于在多轮迭代选择的情况下追踪结合序列的会聚非常有用。在将来自所有七轮和两种不同品系的各自在5′和3′位置具有追踪标签(独特条形码)的PCR产物以相等比例汇集在一起后，在单个Ion-torrent 314芯片(SeqWright)上进行下一代测序。

使用Galaxy项目序列分析工具和FastAptamer软件套件进行NGS数据的分析(Khalid KAlam 2015)。所述软件具有手动工具以将测序数据分类并对齐成群集，并根据DNA标签记录每条序列，从而允许鉴别PD-1的最佳结合序列。使用clustal X进一步产生多序列比较和系统树图(Thompson JD 1997)。

适体合成：使用标准亚磷酰胺化学在Expedite 8909 Oligo合成仪(Midland Oligos，Midland，TX)上合成适体(Caruthers MH 1987)。将适体在室温下在浓氢氧化铵中脱保护过夜，将它们真空干燥过夜，并通过在AKTA 10纯化器(General Electric)上通过使用100mM三乙胺乙酸盐缓冲液(pH 8.4)负载并用递增的乙腈浓度洗脱的Hamilton PRP-1柱上的反相色谱法纯化。使用通过OligoCalc估计的消光系数确定适体浓度(WA 2007)。

所选择的DNA适体与PD-1的结合特异性的验证：为了确定所选择的适体识别内源性PD-1的能力，使用六种最佳代表的生物素化适体从HEL 92.1.7(ATCC)的总细胞裂解物进行PD-1下拉测定。来自下拉测定的PD-1蛋白水平与使用PD1特异性抗体的免疫沉淀蛋白相当。

通过流式细胞术和显微术进一步验证两种选择的15-120-298和10-150-373适体的PD-1结合。简言之，将荧光标记的适体与表达PD-1的HEL细胞一起孵育，并充分洗涤以除去未结合的适体。然后通过流式细胞术分析细胞的平均荧光强度。此外，通过荧光显微术检查细胞。

PD-1特异性适体的二级结构：mfold算法用于预测所选择的PD-1 DNA适体的二级结构。对于所有适体，最优和次优结构具有在-1.5至-4.0千卡/摩尔范围内的最小自由能，从而表明结构具有低稳定性。这些适体可适应G-四链体结构，所述G-四链体结构可有助于识别PD-1的特异性/亲和力(Bochman ML 2012)。

过滤结合测定：通过双膜过滤结合测定来测定PD-1-DNA适体与PD-1蛋白的结合亲和力。如上所述合成并纯化用于链霉亲和素-HRP化学发光检测的在5′端具有生物素-TEG修饰的PD-1-DNA适体。将1μl的50nM PD-1 DNA适体与在3.5μl的10mM Tris-HCl pH 7.4(TE缓冲液)中的不同浓度的PD-1蛋白(1000-0nM，连续半稀释液)在室温下孵育30分钟。在孵育后，将每个反应的体积用TE缓冲液补足至30μl，并通过具有在尼龙膜的顶部上层叠的硝酸纤维素的96孔斑点印迹装置(Bio-Rad)过滤。顶部硝酸纤维素保留蛋白质-DNA复合物，并且底部尼龙膜可捕获游离DNA。将膜用100μL的TE洗涤三次，以从硝酸纤维素膜洗去任何未结合的DNA直至尼龙。在洗涤后，将两种膜进行UV交联以固定保留的DNA，并使用Pierce生物素化的核酸检测试剂盒根据制造商的说明书进行化学发光检测。检测化学发光信号并将其在Fluorochem成像仪(Alpha Innotech)上成像。使用ImageJ软件进行斑点强度的图像分析和定量。来自尼龙膜的数据用于计算使用graph pad prism软件产生的结合分数和结合曲线，假定单一位点结合(Oehler S 1999)。

生物层干涉测量结合研究：纯化的PD-1蛋白和含有PD-1蛋白复合物的总细胞裂解物与PD-1 DNA适体的结合动力学在测定缓冲液(10mM磷酸盐pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％Tween-20)中在25℃下使用Octet RED96(ForteBio)生物层干涉测量法进行表征。以(10nM和100nM)的浓度范围制备特异性PD-15`生物素化的DNA适体(Midland Oligos)。将生物素化的适体固定在链霉亲和素生物传感器尖端上，然后在不同浓度的纯化的PD-1蛋白和来自总细胞裂解物的PD-1蛋白(1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.063μM、0.0312μM、0.0156μM和0μM)缔合和随后PD-1蛋白解离到空白测定缓冲液中后测量BLI信号。每种DNA的解离常数(KD)是通过将PD-1结合数据的完整滴定范围与1∶1缔合和解离函数模型ForteBio和(Kelly Hew和2016)拟合而得到的。Octet Red分析软件(ForteBio)用于分析传感图数据。

用于测定作为抗体的PD-1 DNA适体功能的过滤结合测定：通过PVDF膜过滤结合测定来测定模拟PD-1抗体作用的PD-1 DNA适体的功能。如上所述合成并纯化用于近红外荧光链霉亲和素二级Ab(LI-COR)检测的在5′端具有生物素-TEG修饰的PD-1-DNA适体。将来自含有PD-1蛋白(100μg-0.78μg，连续半稀释液)和纯化的PD-1蛋白(10μg-0.078μg，连续半稀释液)的HEL和KG-1细胞系的1μl不同浓度的总细胞裂解物通过96孔斑点印迹装置(Bio-Rad)过滤到PVDF膜上。将膜用100μL的TE洗涤三次以从PVDF膜洗去任何未结合的蛋白质。在洗涤后，将膜进行UV交联以固定保留的蛋白质。然后将PD-1蛋白结合的PVDF膜用封闭缓冲液(LI-COR)封闭，冲洗并与初级PD-1 DNA适体和针对PD-1的抗体一起孵育。在室温(RT)下孵育1小时后，将膜洗涤并与其相应的近红外荧光二级抗体(LI-COR)一起孵育。通过ODYSSEYCLx(LI-COR)扫描免疫印迹以定量蛋白质表达(Oehler S 1999)。

通过流式细胞术确定PD-1 DNA适体与抗体之间的亲和力竞争：为了确定PD-1 DNA适体与抗体之间的竞争，将HEL 92.1.7和KG-1细胞系(对于每一种为1x10⁵个细胞)分别与100nM和10nM的羧基荧光素(FAM)标记的PD-1特异性适体以及500nM和50nM的PD-1抗体在50μl结合缓冲液中孵育15分钟。然后将细胞用100μl洗涤缓冲液洗涤5-6次，且然后重新悬浮于50μl结合缓冲液中以用于经由流式细胞术进行分析，并且对1x10⁴个细胞进行计数以用于分析。无适体处理的细胞充当本底对照。

通过荧光显微术确定PD-1 DNA适体与抗体之间的亲和力竞争：为了确定PD-1 DNA适体与抗体之间的竞争，将HEL 92.1.7和KG-1细胞系(对于每一种为1x10⁵个细胞)分别与100nM和10nM的羧基荧光素(FAM)标记的PD-1特异性适体以及500nM和50nM的PD-1抗体在50μl结合缓冲液中孵育15分钟。然后将细胞用100μl洗涤缓冲液洗涤5-6次，且然后重新悬浮于50μl结合缓冲液中以用于经由流式细胞术进行分析，并且对1x10⁴个细胞进行计数以用于分析。无适体处理的细胞充当本底对照。

混合淋巴细胞反应：使用同种异体混合淋巴细胞反应来评价PD-1特异性适体促进T细胞活化的能力。同种异体MLR是一种功能测定，其测量来自一个供体(应答者)的淋巴细胞对来自另一个供体(刺激者)的淋巴细胞的增殖应答。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心从血液中分离来自应答者和刺激者供体的PBMC。将刺激者PBMC与500U/ml白细胞介素-4(IL-4)和250U/ml GM-CSF(Biolegend)一起在体外孵育7天。在孵育7天后，用50μg/ml与DNA结合的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理刺激者细胞，从而使细胞有非增殖性。用T细胞增殖应答所需的2μg/ml PHA-M(植物凝集素)处理一组刺激者细胞作为阳性对照(SigmaAldrich)。应答者细胞未经处理并且在刺激时能够增殖。用50μg/ml丝裂霉素C处理一组应答者细胞用于阴性BrdU对照。将应答者细胞与20nM/ml和10nM/ml PD-1特异性适体或非特异性适体一起孵育，并且还与100nM/ml PD-1抗体一起孵育24小时用于阳性对照。然后根据不同的测试条件将存活刺激者细胞(150,000个)与应答者细胞(100,000个)共培养并孵育5天。在第6天，将溴脱氧尿苷(BrdU)添加至孔中以代替胸苷掺入增殖细胞的DNA中(BrdU细胞增殖化学发光测定，Cellsignal)。在24小时后，通过基于板的发光计分析细胞的BrdU掺入，以测量相对光单位(RLU)。刺激的测试细胞与对照、未刺激的应答者细胞的比较产生刺激指数，所述刺激指数可用于比较各种细胞处理组合中的增殖。通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)通过定量存在的ATP(代谢活性细胞的指示物)来分析具有相同组条件而没有BrdU的单独一组板的活细胞。根据数据，在50和100ng抗体处理情况下观察到稳健的MLR应答，并且在PD-1特异性适体(K.V Bromelow 2001)和Xeno Diagnostics LLC.情况下也观察到相当的应答。

用PD-1 DNA适体和抗体进行的ELISA分析：使用(BD Biochem ELISA试剂盒)，根据制造商的说明书使从MLR测定第1天、第3天和第7天收集的上清液进行针对IL-2、IL-4和IFN-γ表达水平的ELISA分析。

在抗PD-1 DNA适体的背景下使用基于细胞的测定筛选和表征PD-1的生物活性及其配体相互作用：为了测试抗PD-1 DNA适体PD-1 DNA-适体的有效性，将HEK293细胞系用TCR活化子或人PD-L1 TCR活化子转染，并在转染24小时后与抗PD1适体或抗体一起预孵育。然后在不同浓度的抗PD-1 DNA适体或抗体存在下，将PD-1/NFAT报告子-Jurkat细胞添加至TCR和PD-L1 TCR转染的HEK293。使用发光计测量相对荧光素酶或发光单位。PD-1/NFAT荧光素酶报告子表达的诱导倍数通过刺激孔的减去本底的发光/未受刺激的对照孔的减去本底的平均发光来计算(Mei Cong 2015)。

人血清中的适体稳定性：将溶解在1X PBS中的每种PD-1 DNA-适体(2μM)在来自(SigmaAldrich)的96％或80％人血清中在37℃下孵育1小时至7天范围内的时间段。在每个时间点，将孵育的5μL血清(20pmol DNA)的等分试样取出并在37℃下与5μL蛋白酶K溶液(600mAU/mL)一起孵育1小时，以除去干扰电泳迁移的血清蛋白。在蛋白酶K处理后，向每个样品中添加18μL变性凝胶负载缓冲液，且然后将样品储存在-80℃。无DNA适体的血清样品将充当阴性对照。通过在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳来分离来自每个时间点的样品。将凝胶用溴化乙锭染色并通过紫外光暴露可视化(Ken-ichiro Matsunaga 2015)。

使用适体进行免疫组织化学以检测PD-1：由IHC World提供福尔马林固定的石蜡包埋的组织载玻片。将组织切片在旋转切片机上以5um厚度切割并固定在带电载玻片上并在50C烘箱中烘烤过夜。所有染色程序均在室温下进行。

PD-1抗体IHC染色：将载玻片脱蜡并再水合至水。使用蒸汽和蛋白酶K消化方法进行抗原修复。对于蒸汽方法，将载玻片在IHC-Tek表位修复溶液(IW-1100)中蒸汽处理35分钟，且然后冷却20分钟。对于蛋白酶K方法，将载玻片在IHC-Tek蛋白酶K溶液(IW-1101)中在37C烘箱中孵育20分钟，且然后冷却10分钟。在抗原修复后，使载玻片在下一步骤之前在室温下冷却20分钟。然后将载玻片各自在三次更换的PBS中洗涤5分钟，并用3％H2O2封闭。在三次更换PBS中洗涤后，将载玻片在用抗体稀释剂1∶50和1∶100稀释的PD-1抗体(Abcam，Cat#ab52587)中在室温下孵育1小时。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，并与马抗小鼠二级抗体(Vector Lab)一起孵育30分钟。然后将载玻片用PBS洗涤三次，每次5分钟，并与HRP--链霉亲和素(Jackson Immunoresearch，1∶500)一起孵育30分钟。然后与DAB色原体底物溶液(IHC World，Cat#IW-1600，0.05％DAB)一起孵育5-10分钟，且然后用PBS洗涤并用迈耶尔苏木精(Mayer′s hematoxylin)复染色。

PD-1适体IHC染色：将载玻片脱蜡并再水合至水。使用蒸汽和蛋白酶K消化方法进行抗原修复。对于蒸汽方法，将载玻片在IHC-Tek表位修复溶液(IW-1100)中蒸汽处理35分钟，且然后冷却20分钟。对于蛋白酶K方法，将载玻片在IHC-Tek蛋白酶K溶液(IW-1101)中在37C烘箱中孵育20分钟，且然后冷却10分钟。在抗原修复后，使载玻片在下一步骤之前在室温下冷却20分钟。然后将载玻片各自在三次更换的PBS中洗涤5分钟，并用3％H2O2封闭。在三次更换PBS中洗涤后，将载玻片与用适体稀释剂1∶500nM和1∶1000nM稀释的生物素化的PD-1适体一起在室温下孵育1小时。然后将载玻片用PBS洗涤三次，每次5分钟，并与HRP--链霉亲和素(Jackson Immunoresearch，1∶500)一起孵育30分钟。然后与DAB色原体底物溶液(IHCWorld，Cat#IW-1600，0.05％DAB)一起孵育5-10分钟，且然后用PBS洗涤并用迈耶尔苏木精(Mayer′s hematoxylin)复染色。用常规显微镜检查染色的载玻片。拍摄了代表性照片。

用于检测PD-1适体的功能的靶标杀伤测定：通过经由Incucyte测量膜联蛋白V阳性细胞的荧光强度区域而定量HEL-92-1肿瘤细胞的杀伤来评价PD-1特异性适体促进免疫细胞活化(外周血单核细胞(PBMC)的T细胞亚群)的能力。

这种功能测定测量由于膜联蛋白V阳性标记产生的平均荧光强度区域。PBMC(效应子)细胞和HEL.92.1(靶)细胞用于该测定。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心从血液中分离来自供体的PBMC。将刺激者PBMC与500U/ml白细胞介素-4(IL-4)和250U/ml GM-CSF(Biolegend)一起在体外孵育5天。将靶细胞与20nM/ml PD-1特异性适体或非特异性适体一起孵育，或将100nM/ml的PD-1特异性适体在存活效应细胞存在下以20∶1或10∶1的比例共培养。然后将膜联蛋白V溶液(Incucyte)添加至这些共培养细胞中，并使其在水平表面上沉降至少30-60分钟以允许分布均匀。将细胞板置于Incucyte ZOOM仪器中，并在第一次扫描之前使板在37℃下温热10-20分钟。每2-3小时安排扫描持续24小时重复直至5天。

体内实验(动物模型)：所有动物圈养和处理程序均符合CrownBio IACUC方案，并且已根据Crown BioIntemational R&D Center标准操作程序(SOP)进行。将6周龄NOD/SCID小鼠(Crown Bio)(n＝3)指定到两个组。小鼠的总体平均重量是18-22gm。所有动物圈养和实验程序均按照Crown Bio的机构指南进行。通过注射用CY3标记的PD-1 DNA适体和用CY3-P10标记的PD-1 DNA适体，在6周龄NOD/SCID小鼠中进行药代动力学研究。在单剂量急性研究中(100μl生理盐水中45μM)经由尾静脉静脉内注射一次。抽取50μl血液作为阴性对照，然后注射PD-1适体并且(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至1∶10和1∶100)。将(45μM/100μl盐水)的CY3标记的PD-1适体和(45μM/100μl盐水)的CY3-P10标记的PD-1适体注射在小鼠中，并在从5分钟至720分钟的8个时间点收集50μl血液。然后将来自这些时间点的血浆在PBS中稀释至1∶10和1∶100。使用CY3过滤器在550nm的激发峰和570nm的发射峰处测量CY3荧光。通过使用6.3版(Certara USA，Inc.，Princeton，NJ)将血浆浓度-时间数据拟合至两房室模型来获得药代动力学参数(Kang SA 2015)。

抗PD1适体-p10功效与抗PD-1抗体相当接下来，分析抗PD1适体功效以与抗PD-1抗体进行比较。使用HEL92.1.7模型来植入人源化NSG中。研究具有3个组以及来自单个群组的每组3只动物：媒介物组，抗PD-1和抗PD-1适体。将人源化NSG小鼠在右后腹侧皮下接种5,000,000个细胞。当平均肿瘤在60-90mm³之间时实施随机化后每天IV，BIW 3个剂量的抗-PD-1抗体和IV，BIW 5个剂量的抗-PD-1适体(总共8个剂量用于该研究)用于这一体内研究。监测动物的存活持续4-6周。根据IACUC方案规定，如果肿瘤体积超过2000mm³或体重减轻大于20％，则对动物实施安乐死。

统计分析：使用Graph Pad Prism 6.0软件(Graph Pad Software Inc.，San Diego，CA)进行结合曲线计算。

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结果

PD-1和PD-L1过表达与癌症患者的较差存活有相关

首先，对癌症基因组图谱(TCGA)数据库的血液癌症(HC)数据集进行分析以确定免疫检查点PD-1及其配体PD-L1表达与HC患者存活的相关性(图15A)。TCGA数据表明PD-1及其配体PD-L1的过表达与HC患者中的肿瘤进展和较差的存活相关(图15A)。此外，在包括四种白血病细胞系的组中对PD-1及其配体PD-L1蛋白表达水平的蛋白质印迹分析发现PD-1和PD-L1在大多数白血病细胞系中高度表达(图15A)。来自患有高度严重HC的患者的肿瘤样品中PD-1和PD-L1蛋白表达的免疫组织化学分析揭示在这些肿瘤中的高PD-1和PD-L1表达(图15A、图15B和图15C)。这些发现表明PD-1作为HC患者的治疗性靶标的潜在重要性。

人内源性PD-1结合DNA适体的鉴别

进行基于体外的SELEX以使用特异性PD-1抗体通过针对来自白血病细胞系HEL 92.1.7和KG-1的内源性表达的免疫沉淀的PD-1筛选随机DNA文库来鉴别特异性地识别内源性人PD-1(hPD-1)的DNA适体(图1、图2、图10、图11)，并且通过共聚焦显微术确认PD-1和PD-L1的表达水平(图13A、图13B、图13C和图13D)。每次用新鲜制备的免疫沉淀的天然PD-1进行七次迭代富集轮次，并且通过与抗PD-1抗体结合的珠粒进行反选择步骤以从每个迭代轮次中的选定汇集物除去对链霉亲和素珠粒具有特异性的适体序列或抗体。在将来自所有七轮和两种不同品系的各自在5′和3′位置具有追踪标签(独特条形码)的PCR产物以相等比例汇集在一起后，在单个Ion-torrent 314芯片(SeqWright)上进行下一代测序(NGS)。NGS数据揭示了具有与亲本高度富集序列具有高序列同一性的序列的适体家族的显著富集。具体地说，来自第6轮和第7轮的会聚序列的Clustal X多序列分析揭示了在所有现有会聚序列中观察到的具有“T和G”的高度重复元件(图3和图4)。使用固定到磁性链霉亲和素珠粒上的这些适体的六种此类生物素化型式的免疫沉淀分析用于从HEL和KG-1细胞系的总细胞提取物中免疫沉淀hPD-1，从而证实这些序列在选择期间在大量文库中富集，这是由于它们能够呈其内源性天然复合物结合hPD-1(图5)。通过用HEL和KG-1细胞质和细胞核提取物的免疫沉淀证实抗PD-1 DNA适体结合hPD-1的能力。观察到PD-1表达在细胞质提取物中而不是细胞核提取物中与PD-1抗体相当。

抗PD-1 DNA适体是稳定的

选择最高富集的最佳代表的生物素化的抗PD-1 DNA适体序列用于进一步评价。使用Mfold算法对选定的适体序列进行的结构预测揭示了复杂的发夹-凸起折叠状态。观察到具有-1.5至-4.0kcal/mol的最小吉布斯自由能的最优和次优结构的折叠适体序列(图7)。所有富集的DNA序列都含有富含G的重复区域的高普遍性，因此有可能这些适体适应G-四链体结构，所述G-四链体结构可有助于识别PD-1的特异性/亲和力(图7)。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗PD-1 DNA适体在含有96％或80％人血清的培养基中1小时至7天的稳定性。这些数据清楚地表明抗-PD-1 DNA适体在96％和80％血清中稳定长达72小时(图17和图18)。

抗PD-1 DNA适体以纳摩尔亲和力与纯化的过表达的PD-1蛋白结合，并且以皮摩尔亲和力与总细胞提取物中存在的内源性PD-1蛋白结合

生物层干涉测量法用于产生纯化的PD-1蛋白的结合动力学数据，并且总细胞裂解物(HEL和KG-1细胞系)将抗PD1-DNA适体的解离常数定义为5nM和500pM(图9A和图9B)。通过硝酸纤维素过滤结合测定证实解离常数，从而证明抗PD-1 DNA适体优于纯化的过表达的PD-1蛋白，以其天然构象以皮摩尔浓度结合至表达PD-1的细胞系的总细胞裂解物(图14A和图14B)。为了评价这种抗PD-1 DNA适体在细胞中的定位，将HEL和KG-1细胞系与荧光标记的抗PD-1 DNA适体(250nM)一起孵育30分钟。在固定细胞后，使用免疫荧光来可视化定位。抗PD-1 DNA适体定位于细胞表面，而不表达PD-1的阴性对照细胞系未展示信号(图6B)。

抗PD-1 DNA适体结合位点、随后抗PD-1抗体的竞争结合测定。

为了进一步验证通过流式细胞术抗PD-1 DNA适体和抗PD-1抗体是否竞争相同的PD-1结合位点，进行免疫荧光和凝胶移位测定。为了确定PD-1 DNA适体和抗体对PD-1结合位点的竞争，将HEL 92.1.7和KG-1细胞系与100nM和10nM羧基荧光素(FAM)标记的PD-1特异性适体、随后500nM和50nM的PD-1抗体在50μl结合缓冲液中一起孵育15分钟。通过流式细胞术获得的平均荧光强度揭示在抗体存在下适体结合亲和力下调，从而表明抗体和抗体共享至少相似的PD-1结合位点(图6A)。通过荧光显微术确认对PD-1结合位点的竞争(图6B)。凝胶移位测定还揭示了抗体与适体对PD-1结合位点的相似亲和力(图12)。

使用体外基于细胞的测定，PD-1和其配体PD-L1相互作用中抗PD-1 DNA适体的生物活性

使用基于PD-1：PD-L1细胞的测定验证抗PD-1 DNA适体的功能。表达PD-1/NFAT的Jurkat T细胞用作效应细胞，而过表达工程化的T细胞受体(TCR)的HEK293细胞与PD-L1一起用作活化细胞。共培养这两种细胞(效应子+TCR活化子)产生NFAT荧光素酶报告子的表达，而(效应子+TCR活化子+PD-L1)导致TCR活化的阻止，并且因此遏制NFAT应答性荧光素酶活性。当在这种组合(效应子+TCR活化子+PD-L1)中用抗PD-1 DNA适体处理时观察到特异性抑制缓解，并且抗PD-1中和抗体用作阳性对照(图40)。在抗PD-1 DNA适体存在下相对荧光素酶单位的增加表明模拟PD-1中和抗体的抗PD-1 DNA适体在阻断PD-1：PD-L1相互作用和促进T细胞活化、从而导致NFAT应答性荧光素酶报告子的再活化中的作用。还示出EC50值为0.2471μg/ml的阳性对照抗PD-1中和抗体(图16A)和EC50值为0.1849μg/ml的抗PD-1 DNA适体(图16B)的剂量应答曲线。这些结果表明抗PD-1 DNA适体以比抗体更低的浓度促进T细胞活化。

通过MLR测定而确定的抗PD-1 DNA适体的体外生物活性

为了评估在抗PD-1 DNA适体存在下的MLR应答的动力学以促进T细胞活化，进行了增殖测定。在5天刺激后展示BrdU掺入的连续测量。在抗PD-1DNA适体(浓度为20nM/ml和10nM/ml)(图8)和对照PD-1中和抗体(浓度为100nM/ml和50nM/ml))刺激5天后，在第1天左右观察到最大淋巴细胞增殖(图8)。在较低浓度的抗PD-1 DNA适体存在下观察到更好的增殖应答(图19和图20)。培养物上活细胞的数量在活化的前5天保持恒定，并且在抗PD-1 DNA适体或抗体增殖存在下在第6天左右开始达到峰值并在第8天缓慢开始下降。通过使用细胞滴度CellTiter-Glo发光细胞活力测定来定量ATP存在，针对无BrdU掺入的细胞的活力观察到类似的增殖应答模式。在相当的抗体处理中，在抗PD-1 DNA适体存在下观察到稳健的MLR应答。通过ELISA在MLR测定样品的上清液中在与PD-1抗体相当的抗PD-1 DNA适体存在下还观察到IFN-γ应答(图21A-21C)以及IL-2分泌(图22A-22C)的增强。培养基中IFN-γ应答的浓度的连续测量在5天刺激后在第6天达到峰值，并且在第8天左右可观察到IL-2分泌的下降(图21A-21C和图22A-22C)。培养基中IL-2的浓度的连续测量在5天刺激后在第6天达到峰值，并且在第8天左右可观察到IL-2分泌的下降(图22A-22C)。总体而言，添加抗PD-1 DNA适体使IL-2分泌相对于对照增加平均约80倍至380倍，并且IFN-γ应答相对于对照增加平均约200倍至400倍。还通过共聚焦显微术检查CD4+T细胞中的PD-1和PD-L1表达(图24和图25)。在CD4+T细胞(图23和图26)和CD8+T细胞(图33)情况下观察到类似的MLR应答模式。在CD4+T细胞的上清液(图27、图28和图29)以及CD8+T细胞的上清液(图34、图35和图36)中观察到IFN-γ应答的浓度的增加。在CD4+T细胞的上清液(图30、图31和图32)以及CD8+T细胞的上清液(图37、图38和图39)中观察到IL-2应答的浓度的增加。

用免疫组织化学确定生物素化的抗PD-1 DNA适体作为人组织中PD-1的诊断剂

使用IHC-DAB方法在人扁桃体和肺癌组织上检查PD-1适体。这决定了这种PD-1适体的最佳工作条件和稀释度。使用IHC-Tek表位修复蒸汽预处理在1∶1000nM浓度下发现最佳的PD-1适体阳性染色(图15B、15C)。在蛋白酶K预处理和完整载玻片上未观察到阳性染色或观察到较弱阳性染色。

使用基于Incucyte膜联蛋白V的测定确定的抗PD-1 DNA适体的靶细胞裂解活性

还使用Incucyte的靶细胞裂解分析验证了抗PD-1 DNA适体的功能。HEL.92.1.7细胞用作靶细胞，而具有T细胞亚群的PBMC用作效应细胞。在膜联蛋白V存在下共培养这两种细胞(效应细胞+靶细胞)产生平均总绿色目标面积。在存在PD-1适体的情况下，在绿色目标区域中观察到与PD-1抗体的存在相当的增加，并且在对照条件下在绿色目标区域中观察到减少。这些结果表明抗PD-1 DNA适体以比抗体更低的浓度促进T细胞活化(图41)。

聚乙二醇化的抗PD-1 DNA适体(抗-PD-1-p10)表现出改善的药代动力学

聚乙二醇(PEG)与诸如适体(核酸)、蛋白质和疫苗的生物分子的缀合是用于改进这些分子在血液中的半衰期和稳定性以及保护这些分子免于免疫细胞的识别以及肾和肝清除的最常见和最重要的策略之一(Yoshihiro Morita等人Molecular Therapy-Nucleicacids(2016)5，e399)(图42)。在单次静脉内剂量的Cy3标记的PD-1和PD-1-p10后，在NOD/SCID雌性小鼠中测定适体药代动力学。与PD-1相比，10kDa的PEG与抗PD-1 DNA适体的缀合降低了体循环的清除率并延长了消除半衰期(图8A和图8B)。这导致抗PD-1-p10的更高血浆浓度持续延长的时间段(117/360分钟，对比仅cy3 37/360分钟)，以及总体全身暴露的至少3倍增加(图43)。分配体积稳态(Vs)的总体积在抗PD-1-p10与抗PD-1之间是相当的。

抗PD1适体-p10功效与抗PD-1抗体相当

使用HEL92.1.7模型以植入人源化NSG中来检查抗PD1适体功效以与抗PD-1抗体进行比较(图44)。对于对照组观察到肿瘤体积为3002.18mm³，对比PD-1Ab(2224.07mm³)对比PD-1适体(2190.85mm³)(图45-47)。该数据表明抗PD1适体-p10经由PD-1的功能性阻断和对透明肿瘤细胞的免疫应答的增强而在植入血液白血病细胞的小鼠中与抗PD-1抗体相当地降低肿瘤负荷。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义具有相同的含义。本文所引用的出版物和致使它们被引用的材料是以引用的方式特别并入。

本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图由以下权利要求涵盖。

Claims

1.一种单链DNA适体，其包含下式：

n-L-n-Z-n-R-n，

其中“L”包含核酸序列TACCTGATAGCGTATGCGA(SEQ ID NO：2)，或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的核酸序列，或所述核酸序列的长度为至少15个核苷酸的片段，

其中“R”包含核酸序列CTCTCAGTAGGTGCATAAGCG(SEQ ID NO：3)，或与SEQ ID NO：3具有至少80％序列同一性的核酸序列，或所述核酸序列的长度为至少15个核苷酸的片段，并且

其中每个“n”独立地是任何0至10个核苷酸，

2.如权利要求1所述的DNA适体，其中所述DNA适体包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

3.如权利要求1所述的DNA适体，其中所述DNA适体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62以及63。

4.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的如权利要求1至3中任一项所述的DNA适体。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述DNA适体被包封在纳米颗粒中。

6.如权利要求4或5所述的组合物，其中所述DNA适体是聚乙二醇化的。

7.如权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述DNA适体以10nM至10μM的浓度存在。

8.如权利要求4至7中任一项所述的组合物，其还包含另外的DNA适体。

9.如权利要求4至8中任一项所述的组合物，其还包含特异性地结合至CD38的DNA适体。

10.如权利要求4至9中任一项所述的组合物，其还包含特异性地结合至CD117的DNA适体。

11.如权利要求4至10中任一项所述的组合物，其还包含抗体。

12.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求4至11中任一项所述的组合物。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和膀胱癌。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症是白血病。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。

16.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

17.一种用于抑制受试者中PD-1与PD-L1之间的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求4至11中任一项所述的组合物，其中所述DNA适体在生理条件下特异性地结合至PD-1并破坏程序性死亡-1(PD-1)与程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和膀胱癌。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有急性骨髓性白血病。

20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。