CN103007291B - 双靶标/多靶标小核酸治疗眼部疾病的组合物及应用 - Google Patents

Abstract

<b>本发明公开了双靶标</b><b>/</b><b>多靶标小核酸治疗眼部疾病的组合物及应用，该组合物，有包含二种小核酸分子和药物载体的，该二种小核酸分子靶向的基因选自</b><b>VEGF</b><b>基因、</b><b>VEGFR2</b><b>基因、</b><b>TGF-b1</b><b>基因中的二种；也有包含三种小核酸分子和药物载体的，该三种小核酸分子靶向的基因分别为</b><b>VEGF</b><b>基因、</b><b>VEGFR2</b><b>基因、</b><b>TGF-b1</b><b>基因。该组合物，通过用核酸干扰（</b><b>RNAi</b><b>）介导的抑制基因表达和生化途径来获得对眼病有效的治疗，能够制备成治疗眼部疾病的药物。该眼部疾病，包括增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、单纯疱疹病毒性基质角膜炎、老年黄斑变性、葡萄膜炎等。</b>

Description

双靶标/多靶标小核酸治疗眼部疾病的组合物及应用

技术领域

本发明主要涉及一种核苷酸药物，特别涉及一种双靶标/多靶标的小核酸鸡尾酒药物，应用RNA干扰(RNAi)技术来治疗眼部疾病如糖尿病视网膜病变等。

背景技术

糖尿病视网膜病变是全球范围内引发劳动力人口失明最常见的原因。该疾病主要通过损害眼部光敏感的视网膜组织的小血管，引起视网膜中央附近即斑点部位的液体泄漏，引发黄斑水肿。斑点为一些如阅读、驾驶和人脸识别等活动提供中央视觉，黄斑水肿病人视网膜组织膨胀，如不及时治疗将导致失明。

除了糖尿病视网膜病变，其他大量的眼部疾病也是由于过量血管增生(NV)所致，NV是眼内血管异常的增殖和生长。眼部NV本身就有许多副作用，也是许多严重眼病的早期病理学步骤，尽管有新的治疗方法和制剂出现，但对于这些眼部NV病人几乎没有多少可供选择的治疗方法。

美国国立卫生研究院(NIH)下属国立眼科研究所(NEI)估计，有40万美国人患有不同种类的眼部疱疹，每年有5万名新生或者复发病例，其中更严重的基质角膜炎大约占了25％。一项更大规模的研究表明，眼部疱疹的年复发率是10％，两年复发率是23％，20年内的复发率高达63％。虽然抗病毒药物可以在一定程度上控制单纯疱疹病毒(HSV)感染，但在治疗HSV引起的基质角膜炎和保护病人免遭失明方面没有效果。

我国眼部疾病主要以眼部炎症、白内障、青光眼、干眼病视疲劳、近视眼为主，各疾病症状患病率绝对值均不高(在2.5‰左右)。但随着人口的增长和老龄化的发展，我国眼科疾病发病率呈上升态势。据卫生部统计年鉴及对医生的实地调查，患病率最高的眼科疾病依次为：白内障、青光眼、视网膜病、屈光不正、结膜病、眼外伤。而视网膜脱落与断裂为患病率居第三的眼科疾病，该病患者占眼科患者比例接近15％。

眼部血管增生(NV)疾病可分为影响眼睛前部和影响眼睛后部(视网膜)两种，不同部位的NV有不同的原因，但其生物化学和生理学特征几乎是一样的，与眼睛部位无关。因此，能有效干扰眼部NV生化过程的方式将可以有效治疗任何NV为主要病因或潜在病因的眼部疾病，不管疾病损害的是眼睛前部还是眼睛后部。

眼部血管增生的生物化学和生理学

与其他组织类似，眼部组织需要持续的营养供给，因此需要新血管生成，这一过程通过促进因子和抑制因子之间的平衡而保持平衡。然而，许多眼部血管增生疾病不能正确地维持平衡，导致损伤性新生血管过度生长。尽管病理学和失明的诱因差异很大，但这一过度增生过程几乎是一致的，与眼睛或疾病的区域无关。病理学的共同特征给大量眼部疾病的治疗提供了有效的干预方式。

正常眼角膜是无血管的，HSV本身也不表达任何血管新生蛋白，但是感染眼部组织后表达血管生长因子从而诱导角膜血管增生(NV)。血管生长因子最初由病毒感染的角膜表皮、非炎症细胞产生，接着由基质内的炎症细胞(中性粒细胞PMN和巨噬细胞)表达。通过植入纯化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA，富含CpG结构域)或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)，建立HSV诱导的角膜血管增生模型。这一模型已成为角膜血管增生和单纯疱疹病毒性基质角膜炎疾病的临床研究模型，有利于检测抑制眼部血管增生疾病的的治疗效果。

一种较好的干扰治疗方式是抑制这些疾病共同的病理学因素。大量研究表明，VEGF介导的血管新生和血管再生是许多眼部血管增生疾病发生的最主要原因。VEGF介导的血管新生在所有NV相关的眼部疾病的血管增生中起到核心作用。VEGF家族包括五个结构相关的生长因子：VEGF-A、胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。已知的受体包括三种结构同源的酪氨酸激酶受体，VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，这些受体与不同的VEGF有不同的亲和力，具有不同的功能。目前，对四种VEGF的功能和调控机制了解较少，仅知道VEGF-A和VEGFR-2结合诱导血管新生和血管再生，也增加血管通透性。

是正常血管形成和新生血管重塑过程中起重要作用的生长因子，某些疾病条件下，如肿瘤发生时，形成新血管用于传输氧和养分促进非正常组织的快速生长，此时VEGF新生血管途径被激活。眼内表达血管新生蛋白VEGF与人体血管增生紊乱及小鼠中缺血引起的视网膜血管增生密切相关。因此，由VEGF和VEGF受体组成的VEGF信号通路，是抑制视网膜血管新生的合理靶标。

在理解了VEGF血管新生信号通路中关键因子后，目前许多研究采用VEGF-A的抑制剂作为候选治疗制剂，用于治疗眼部血管增生疾病。单独使用这类制剂或者与激光治疗联合，有明显的临床治疗效果，能促进视觉恢复。这些制剂包括Ranibizumab(Lucentis)、Pegaptanib sodium(Macugen)和Bevacizumab(Avastin)，所有这些VEGF抑制剂通过阻断VEGF蛋白功能而起作用。Macugen是一种抑制VFGE与其受体结合的适体寡聚核苷酸。尽管这些眼部血管新生的研究，与其他如肿瘤生长之类的血管新生疾病证明了VEGF通路的临床治疗价值，但目前的实验制剂对许多病人依然无效。很明显，需要开发更好的VEGF通路抑制剂来治疗这些眼部疾病。

在内皮增殖中上调，这可能是对VEGF-A或缺氧的直接反应。一般认为VEGFR-2是血管生长的血管新生信号，在人体中名为激酶插入区受体(KDR)，小鼠中名为胎肝激酶-1(Flk-1)，是受体酪氨酸激酶(RTK)家族III的一员。VEGFR-2包含7个细胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个包含激酶插入序列的细胞内酪氨酸激酶结构域。VEGFR-2的表达基本仅限于内皮细胞，全长的VEGFR-2前体蛋白包含1356个氨基酸，其中有19个氨基酸为信号肽。VEGFR-2与VEGF高亲和力结合，在肿瘤血管新生和其他包含病理性血管新生的疾病中发生重要作用。采用中和抗体或小分子酪氨酸激酶受体(TKR)抑制剂阻断VEGFR-2能破坏血管新生、阻止肿瘤侵袭。

大量研究证实VEGF在新血管形成中起到核心作用，但令人费解的是，VEGF拮抗剂的治疗效果却有限。最近，研究表明转化生长因子(TGF-b1)与新血管形成有关，Smad-4(mothers against decapentaplegic protein homolog 4，一种细胞内信号转导分子)在TGF-b信号转导中起最重要的作用。一项研究显示氧诱导的新生小鼠视网膜病与视网膜中TGF-b和Smad-4的mRNA表达上升有关，也有研究发现TGF-b能诱导细胞凋亡。例如，用TGF-b1刺激人二倍体成纤维细胞将引发出现SIPS的生物标志物，如细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的活性，同时衰老相关基因Apo J、纤粘连蛋白(fibronectin、FN)和平滑肌22(SM22)的mRNA水平稳定上升。不同细胞系的体外研究显示TGF-b1受到氧化应激的诱导，因此，有假设认为氧化应激诱导的早衰是TGF-b1表达上升引起的。之前有研究显示哺乳动物衰老过程中视网膜色素上皮细胞(RPE)发生衰老，而体外细胞实验证实人RPE细胞暴露在高浓度氧中将发生凋亡。老年黄斑变性(AMD)是否发生RPE细胞衰老还不清楚，组织化学检测表明AMD病人RPE细胞中的TGF-b1表达量增加。使用TGF-b1的中和抗体治疗，能够阻止氧化应激诱导的衰老生物标志物的上升。另一方面，TGF-b1也是一种促炎症因子，参与组织疤痕形成，被怀疑为抗血管增生治疗中视网膜疤痕形成的一个原因。因此，敲低VEGF通路的多种因子或在敲低VEGF通路因子的同时抑制(或沉默)TGF-b1将是治疗眼部疾病如糖尿病视网膜病变和AMD的新手段。

发明内容

本发明涉及用核酸干扰(RNAi)介导的抑制基因表达和生化途径来获得对眼病有效的治疗。RNAi制剂包括鸡尾酒小核酸寡聚核苷酸来抑制(1)VEGF和VEGFR-2、(2)促炎症因子TGF-b1。

本发明提供的组合物，有包含二种小核酸分子和药物载体的，该二种小核酸分子靶向的基因选自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因中的二种；也有包含三种小核酸分子和药物载体的，该三种小核酸分子靶向的基因分别为VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因。

干扰(RNA interference，RNAi)，是由双链RNA寡聚核苷酸促进的序列特异性的信使RNA(mRNA)降解的过程，经常被称为“基因沉默”。这一强有力的方法已经被证实是基因功能发现和确证的重要工具，也有巨大的潜力成为新的基因特异性药物。在我们的抑制眼部血管增生的抗血管新生RNAi设计中，选择了VEGF-A、VEGFR-2和TGF-b1。根据Tuchl研究团队提出的通用规则设计小干扰RNA(小核酸)，为21个核苷酸长度的双链RNA，3’末端有2个悬浮的碱基突出，其中的负链与靶向的mRNA序列互补。敲低这些基因中的一个或多个的表达，对阻断血管新生通路抑制NV有重要作用，可减轻基质角膜炎的症状。同样的方法也适用于NV相关的其他眼部疾病。

过量而有害的眼部血管增生是一个复杂的过程，通常涉及多个生化信号通路，因此，干扰一个靶点或一条通路还不足以完全控制疾病的病理学(血管增生)。本发明提供的是联合干扰方式，即同时干扰一条生化信号通路的多个靶标，或者干扰多个信号通路，或者两种方式同时采用(干扰多个信号通路，每个信号通路的多个靶标)。例如，本发明提供了干扰VEGF通路的多个靶标，包括联合VEGF-A和VEGFR-2的小核酸，甚至更进一步提出了干扰包括VEGF信号通路的多个信号通路。本发明也提供了这些联合的组合治疗方式，例如VEGF通路和TGF-b通路的小核酸的联合。这种联合具有抗血管新生和抗疤痕形成的效果，疤痕是糖尿病视网膜病变病人的常见问题，因为抗血管新生治疗引起的伤疤常常导致视觉损害，而外科手术去除这些伤疤非常麻烦还不一定有效。

截至目前，没有报道过用于将RNAi制剂导入眼血管增生部位的合适的技术，包括我们在本发明中采用的HKP也没有报道过。因此，对能够用作RNAi制剂导入眼部血管增生部位的专有核酸导入系统存在巨大需求。对RNAi机制的理解及其快速扩展的应用是过去十年生物医药领域一项最主要的突破。使用小核酸干扰特定基因的表达需要将小核酸送至靶位点，但正是因为缺少有效的将小核酸运输至眼部NV疾病部位的载体系统而限制了小核酸的应用。随着小核酸作为基因功能研究工具的高速发展，越来越多的研究将小核酸作为一种新的治疗方式。时至今日，已经有二十多个小核酸药物正在进行临床评估。但将小核酸作为治疗药物依赖于有效的局部和系统导入方法。小核酸作为治疗药物的优势是具有特异性、稳定性、高效性等特点，作用机理也是天然的，还有因为靶向不同基因的小核酸都是核苷酸序列而具有化学性质的均一性。

我们采用一种基于多肽的组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)作为体内外导入小核酸的载体。这一技术(参见专利WO 0147496，内容以引文的方式并入本发明中)能够大幅降低小鼠中CpG和单纯疱疹病毒感染引起的角膜血管增生及缺氧引起的视网膜血管增生。为评估眼部组织分布情况，采用了大白耳兔模型。我们在小核酸设计及其实验的成功显示了RNAi方法在治疗如糖尿病黄斑水肿、老年黄斑病变、单纯疱疹性基质角膜炎和其他血管新生疾病等糖尿病视网膜病变上具有很好的疗效。

除了采用HKP作为药物载体外，本发明还能采用其他阳离子多肽。一类多肽是第五个氨基酸残基连接有组氨酸或咪唑单体的多聚线性赖氨酸。另一类多肽是分枝状的多聚赖氨酸和第五个氨基酸残基连接有组氨酸或咪唑单体的多聚分枝状赖氨酸。还有一类多肽是含组氨酸-组氨酸-赖氨酸(HHK)三肽或组氨酸-组氨酸-赖氨酸-赖氨酸(HHKK)四肽的聚合物，聚合物可以是线状或分枝状，分枝状聚合物的单体可以与另一个单体的第一个或第五个氨基结合，或者同时与两个氨基结合。优选那些30％-70％赖氨酸单体的伯胺基上结合有组氨酸或咪唑的多聚赖氨酸。多聚赖氨酸聚合物优选分子量在5000-100000，更优选分子量为10000-30000。带2-10倍的过量正电荷的多肽，能与带负电的核苷酸治疗制剂自动形成复合物。

在药物载体中，一类接枝聚合物是连接有亲水性聚合物的多肽，亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚噁唑啉(polyoxazoline)、聚缩醛(polyacetal，某些情形下也称为柔性水泥Fleximer)、甲基丙烯酸羟基丙基酯(HPMA)和聚丙三醇(polyglycerol)。另一类接枝聚合物是连接的亲水性聚合物上还含有配体的接枝聚合物，配体包括多肽、糖类、维生素、营养素和抗体，或者这些物质的组分。带2-10倍的过量正电荷的阳离子接枝聚合物能自动与带负电的核苷酸治疗制剂形成复合物，优选携带2-6倍正电荷的接枝聚合物。[0023]药物载体中的非天然的合成的阳离子聚合物含有乙烯亚氨基(-C-C-N-)，包括聚噁唑啉(polyoxazoline)和聚乙烯亚胺(PEI)。线性或分枝状聚噁唑啉或PEI含衍生的组氨酸或咪唑单体，优选连接的组氨酸或咪唑单体中30％-70％的残基(basic moiety)是咪唑的聚合物，优选分子量在5000-100000的聚合物，更优选分子量为10000-30000的聚合物。带2-10倍的过量正电荷的阳离子非天然合成聚合物和带负电的核苷酸治疗制剂能自动形成复合物，优选携带2-6倍正电荷的非天然合成聚合物。

药物载体中还包括含有聚缩醛骨架结构的阳离子聚合物，线性聚缩醛、分枝状聚缩醛均含衍生残基，残基包括赖氨酸、伯胺基、组氨酸和咪唑单体的混合物。优选连接的赖氨酸、伯胺基、组氨酸和咪唑单体中30％-70％的残基是咪唑的聚合物，优选分子量在5000-100000的聚合物，更优选分子量为10000-30000的聚合物。带2-10倍的过量正电荷的阳离子聚缩醛和带负电的核苷酸治疗制剂能自动形成复合物，优选携带2-6倍正电荷的聚缩醛。

药物载体中的阳离子胶团是嵌段聚合物，一段是亲水聚合物，另一段是疏水聚合物，包括聚环氧丙烯，疏水的聚噁唑啉，疏水聚合物衍生的伯胺基或咪唑或伯胺基和咪唑，疏水聚合物衍生的残基(该残基与治疗制剂形成可被酶切的连接键，如二硫键的巯基)，Schiff碱的醛基，酯中的酸或醇类。优选的，胶团是亲水聚合物上连接有配体的嵌段聚合物，配体包括多肽、糖类、维生素、营养素和抗体，或者这些物质的组分。带2-50倍的过量正电荷的阳离子胶团和带负电的核苷酸治疗制剂能自动形成复合物，优选携带4-20倍正电荷的胶团。

本发明提供的组合物，能够制备成治疗眼部疾病的药物。该眼部疾病，包括增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、单纯疱疹病毒性基质角膜炎、老年黄斑变性、葡萄膜炎、虹膜红变、结膜炎、角膜炎、睑缘炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、黄斑退化和视网膜病。该组合物的给药位点为结膜下、玻璃体内或皮下组织，给药方式为局部给药或注射给药。组合物中小核酸介导的抗血管新生效果作用于眼部组织和血管增生疾病组织，抑制那些诱导有害的眼部血管增生的多个因子和生化途径。

为了评估新型开发的抗血管增生制剂用于治疗眼部血管增生(NV)疾病的效果，可以利用已发表的临床相关的动物模型，如通过氧诱导过量视网膜血管生成的动物模型，或者是利用激光灼伤视网膜诱导血管新生的动物模型。临床常用的角膜NV模型可以采用将前述的CpG植入角膜基质的微袋或者用HSV感染获得，在这些模型中检测新生血管被抑制的效果也非常容易。候选制剂的效果可以先通过体外细胞培养检测，接着用临床相关的疾病动物模型选择。

本发明组合物中的小核酸制剂，包括双链的RNA(dsRNA)寡聚核苷酸(可以有末端突出碱基，也可以无末端突出碱基，可以是粘性末端，也可以是平末端)、小的颈环结构的RNA(shRNA)及DNA来源的RNA(ddRNA)。小核酸是一种可用于敲低基因表达、以序列特异性方式毁坏mRNA的强有力工具，是一种快速持续地研究生物学功能的工具。小核酸制剂设计时，要保证核苷酸序列与靶基因的部分序列匹配(互补结合)，选定的小核酸序列可以与基因表达过程中的mRNA的任何部位匹配。小核酸包含的“反义链”序列能与靶基因的mRNA杂交(互补结合)，同时还包含与反义链结合的“正义链”。选定的针对靶基因的小核酸序列不能与细胞内任何除靶基因外的mRNA序列同源(即不能与任何其他mRNA互补结合)，小核酸所针对的序列也不能是那种无法转录成mRNA的序列。目前有大量的设计原则用于筛选20到27个碱基对的靶向mRNA的小核酸序列，其中包含一些商业化的方法。这些设计方法不断改善，使得最新的方法随时可用。利用这些方法中可以设计出一系列首选的小核酸序列。本发明首先制备至少6种首选的小核酸序列，然后在培养的细胞中检测基因被抑制的程度，一般都可以选出至少两种活性的小核酸序列。如果没有筛选到活性小核酸，则进行第二轮的设计和筛选。

除了鉴别活性的小核酸序列，设计过程中还要确保选定的小核酸只与靶标的mRNA序列同源。与靶基因mRNA序列之外的基因组序列同源性低的小核酸序列能在mRNA水平或基因水平降低脱靶效应，小核酸中“正义链”与其他序列的同源性低也有利于减少脱靶效应。通过Clone Manager Suite软件的DNA比对和在线的BLAST(序列比对)搜索分析，选定基因的靶序列应该与包括人同源基因在内的任何其它基因缺少同源性。例如，与小鼠mVEGF-A的mRNA匹配的序列应该是独特的只针对mVEGF-A的，而不能与其他mVEGF-B、mVEGF-C、mVEGF-D匹配，也不能与人体中同源的hVEGF165-a(AF486837)相匹配。然而，匹配序列可以针对mVEGF-A的多个亚型(isoform)，例如mVEGF(M95200)、mVEGF115(U502791)、mVEGF-2(S38100)和mVEGF-A(NM_192823)，这些同形物分别编码190个氨基酸(aa)、141个aa、146个aa和148个aa的mVEGF-A。所有已发表的mVEGF-A亚型的cDNA序列，除了mVEGF-A(NM_192823，成熟的蛋白形式)外，在N末端均有一个26个氨基酸(aa)的信号肽。因此，靶向mVEGF的mRNA的小核酸序列不能选在信号肽区域，而应该选择所有mVEGF-A亚型共有的编码成熟蛋白的区域。靶向mVEGFR-2的小核酸序列也经过相同的方法确定。本发明包含不同形式的干扰RNA分子，例如，根据抑制的规则设计的针对上述靶基因序列的小核酸序列是25个碱基对的平末端寡聚核苷酸序列，参见表1-3。

制剂针对基因序列的特异性依赖于预期要靶向的机体(动物)种类。多数哺乳动物基因都含有大量的同源序列，使得RNAi制剂可以抑制多个物种的同源基因的表达。我们优先采用同源性的小核酸抑制剂，既可以抑制人基因的mRNA，也可以抑制实验动物的mRNA。用来检测的动物模型是眼部患病动物，并且应该是经常用于药效学和毒理学研究的动物，如小鼠、兔或猴。

序列依赖性的脱靶效应至少需要17个核苷酸(nt)与其它非靶基因序列同源，对于25个碱基对的小核酸来说，分别需要对8种17nt的的核苷酸序列进行比对(Blast)，看是否存在序列依赖性的脱靶效应，并将这一信息作为最终选择小核酸治疗制剂中的小核酸药物中间体(API)的一项重要参数。

我们尽量在小核酸候选药物中排除那些能在体内外通过Toll样受体(TLR)通路激活干扰素反应的免疫刺激结构域(富含GU的结构域，5’-UGUGU-3’或5’-GUCCUUCAA-3’)。最终，我们描绘出每种小核酸针对的mRNA的靶向区域，这对于理解小核酸候选药物是否能准确靶向靶标mRNA及其替代转录本非常重要。

本发明提供的组合物用于治疗眼睛前部或者后部的血管增生疾病，眼部的任何组织都能通过新生血管靶向的导入制剂治疗，本发明中的给药方式包括局部给药、眼睛局部给药和末梢位点的静脉注射给药。本发明中，眼睛前部的治疗，可以采用结膜下注射的局部给药方式治疗，或者眼睛局部给药治疗，或者眼周注射治疗，或者眼内注射治疗，或者末梢位点的静脉注射治疗。本发明的组合物包括1)通过静电相互作用与核酸结合的阳离子制剂，包括非天然的合成的聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、多肽、脂质体和胶团，2)减少组织和细胞非特异性吸附的亲水制剂，包括非天然的合成的聚合物、多肽和糖类，3)组织和细胞渗透剂，包括表面活性剂、多肽、非天然的合成的聚合物和糖类，4)磷硫酰(Phosphorothioate)、硼烷磷酸酯(Boranophosphate)、甲基膦酸酯(Methylphosphonate)和磷酸二酯(Phosphodiester)修饰的小核酸寡聚核苷酸。

本发明提供了成熟的将包括小核酸在内的治疗制剂送至细胞和组织的导入载体，该载体可以保护核酸免遭降解及促进组织和细胞对治疗制剂的吸收。将RNAi或其他带负电荷的制剂与本发明中的导入载体联合，细胞能大量吸收治疗制剂，内源靶基因的表达也被抑制。本发明使用局部给药的方式，将小核酸和其它治疗制剂导入眼部治疗眼部疾病，包括基质感染、角膜血管新生、基质角膜炎和葡萄膜炎等。尽管局部给药比系统给药的扩散性强，也有因感染或刺激导致炎症的风险，局部导入给药依然是临床上优选的方式，例如，在治疗严重血管增生(NV)或快速生长的肿瘤时都是如此。本发明也整合了增加组织吸附和通过角膜内皮的渗透性的制剂，这一组合制剂通过滴眼液的形式局部给药。

本发明的组合物中，小核酸或其他治疗制剂可以通过局部给药、局部注射或静脉注射(I.V.)给药来治疗眼部血管增生疾病。

附图说明

图1A和图1B显示了25个碱基对的平末端小核酸与21个碱基对粘末端小核酸对VEGF基因抑制的效果比较。在图1A中，首先分别从6条小核酸中择最有效的21和25个碱基对的小核酸，然后利用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，CA)体外转染表达人VEGF的两株细胞系(DLD-1结肠癌细胞和MBA-MD-435乳腺癌细胞)，RT-PCR技术检测。0.3μg或2.0μg剂量下，25个碱基对小核酸比21个碱基对小核酸表现出更强的抑制活性，特别是2.0μg剂量差别更明显。在图1B中，在MCF-7/VEGF165细胞中比较25个碱基对的平末端小核酸与21个碱基对粘末端小核酸抑制基因表达的效果。转染后5天检测VEGF的表达水平，25个碱基对的平末端小核酸确实比21个碱基对的粘末端小核酸更有效。

图2为选择靶向VEGF的最有效的小核酸。八条针对VEGF的25碱基对的小核酸及对照小核酸转染人293细胞和小鼠F3细胞，分别用小核酸转染相应的细胞，设置标准基因标靶对照，接着进行Q-RT-PCR分析。体外研究表明选定的最有效的小核酸(hmVEGFc)具有高效敲低人和小鼠细胞中靶基因的巨大活性。

图3A和图3B为鉴别靶向VEGFR-2的最有效的小核酸。用Invitrogen公司的基于网页的小核酸设计工具BLOCK-IT RNAi Designer来设计25个碱基对的平末端小核酸。基于交互式的算法，用户可以选择系统设定参数或用户自定义参数来选择小核酸序列。将靶标mRNA序列或靶标基因在基因库(GenBank)中的编号输入程序中，每个靶基因mRNA能够得到10条以上一星级到五星级的25碱基对的小核酸候选序列。星级越高的候选小核酸，理论上敲低靶基因的效果更好。通过BLOCK-IT RNAi Designer或我们自己的算法，我们选择了八条25个碱基对的平末端小核酸。接着，将这些小核酸转染小鼠SVR细胞后进行Q-RT-PCR分析(图3A)，或者转染人HUVEC细胞后进行ELISA分析(图3B)。通过电转方式将八条VEGFR-2的小核酸及对照的针对绿色荧光蛋白的25碱基对的Luc-小核酸(7μg小核酸/1′10⁶个细胞)转进细胞。转染后48小时，收集HUVEC细胞开展hVEGFR-2的ELISA实验，检测细胞裂解液中VEGFR-2的浓度(每孔加入的裂解蛋白量为3mg)。数据均以“平均值±标准差”(Mean±STD)的方式列出。ELISA方法选定的有效的25个碱基对的小核酸将进一步用于后期的肿瘤动物模型研究。选定的VEGFR-2特异性的最有效的小核酸是VEGFR2-h。

图4A和图4B为设计和选择靶向TGF-β1的最有效的小核酸。选择25个碱基对的平末端小核酸是基于其活性和效力的持久性，每种小核酸序列能靶向人和小鼠的同源基因。在用相应的细胞检测这些小核酸(由Qiagen合成)之前，先简单的用人PC-3细胞测试，因为该细胞能表达(预期要通过小核酸来敲低的)三个靶标基因(图4A)，同时也在小鼠C166细胞中测定TGF-β1的表达(图4B)。为筛选每个靶基因的八条小核酸，首先将小核酸转染细胞，接着提取总RNA进行Q-RT-PCR分析，选择抑制TGF-β1表达的最有效的小核酸。以持家基因核糖体蛋白S15(rig/S15)扩增的361bp的片段来校正样品浓度，选定的hmTF25f序列如表3所示。

图5显示了用于小核酸导入的组氨酸-赖氨酸分枝状聚合物。经过优化的分枝状组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)已经被广泛用于体外和体内导入小核酸，其中的H3K4b具有一个赖氨酸骨架结构，有四个包含重复的组氨酸和赖氨酸的分支结构。以N/P(氮磷比)质量比为4∶1的比例，H3K4b用于小核酸的包裹。用扫描电子显微镜(SEM)观察自动形成的纳米颗粒(平均直径为150nm)。

图6显示HKP-小核酸纳米颗粒的表征。采用90Plus Nanoparticle Size DistributionAnalyser(纳米颗粒粒径分布分析仪，Brookheaven Instruments Limited，NY)检测HKP-小核酸，结果表明制备的HKP-小核酸纳米颗粒平均直径是159.9nm(A)，Zeta电位为38(B)，这些结果与SEM分析的结果一致。

图7显示HKP包裹有利于促进结膜下小核酸的导入。在结膜下注射小鼠眼睛评估小核酸导入效率之前，FITC标记的小核酸与HKP自动形成纳米颗粒。标记的小核酸经眼睛结膜下(SCJ)给药后24小时能在角膜切片中观察到(A)，而同样给要的不含HKP的FITC标记siC1ab信号微弱(B)。箭头所指为FITC标记的小核酸的位置。

图8显示系统和局部导入的抗血管新生活性比较。给药后第4天，比较HKP介导的靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的小核酸鸡尾酒的局部导入和不同的纳米颗粒载体(配体导向聚合物，LDP)介导的系统导入效果。对照组、裸露的小核酸和包裹的小核酸均使用HKP或LDP检测。N＝6，＊表示p＜0.05，＊＊表示p＜0.01。

图9显示玻璃体内注射后小核酸的分布。在兔眼部模型中通过玻璃体内注射H³标记的小核酸来评估小核酸的分布情况。注射后24小时和72小时，处死动物收集组织，解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃体液、视网膜和巩膜(包括脉络膜)。用液体闪烁波谱分析每个样品的放射性活性。注射裸露的小核酸(2mg)和HKP-小核酸(250μg)，72小时后，HKP-小核酸组中水晶体和视网膜中小核酸的浓度明显高于裸露小核酸组。

图10显示玻璃体内注射HKP-小核酸后的控释和视网膜聚集。(A)注射后24小时和72小时，从所有组织样品中回收小核酸，黄色为裸露的小核酸，蓝色代表HKP-小核酸，两个时间点后者的回收率都明显高于前者。(B)视网膜中的小核酸的定量，红色为裸露的小核酸，绿色代表HKP-小核酸，后者明显更多聚集于视网膜内。

图11显示用小鼠ROP模型分析小核酸鸡尾酒治疗后FITC灌注的视网膜。缺氧诱导的眼部血管增生模型第17天后典型的FITC灌注视网膜。第1组为不接受治疗组，第2组为玻璃体内注射的HKP-小核酸_control对照组，第4组为结膜下注射的HKP-小核酸_control对照组，第5组为正常对照组，第6组为玻璃体内注射的HKP-小核酸鸡尾酒治疗组，第8组为结膜下注射的HKP-小核酸鸡尾酒治疗组，其中第6组通过视网膜分离观察可以看到明显的抗新血管生成作用。

图12显示用小鼠ROP模型分析比较小核酸鸡尾酒治疗后的典型的组织切片。缺氧诱导的眼部血管增生模型第17天后典型的组织切片图。第1组为不接受治疗组，第2组为玻璃体内注射的HKP-小核酸_control对照组，第4组为结膜下注射的HKP-小核酸_control对照组，第5组为正常对照组，第6组为玻璃体内注射的HKP-小核酸鸡尾酒治疗组，第8组为结膜下注射的HKP-小核酸鸡尾酒治疗组，其中第6组的切片血管染色更少，表明具有更好的抗新血管生成的治疗效果。

图13显示mRNA水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸鸡尾酒通过玻璃体内注射缺氧诱导的眼部血管增生模型，通过Q-RT-PCR检测每个靶基因的mRNA水平。从结果可以看出，使用相应小核酸处理后的VEGF和VEGFR2的mRNA水平明显低于对照组。

图14显示蛋白水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸鸡尾酒通过玻璃体内注射到缺氧诱导的眼部血管增生模型，通过ELISA检测每个靶基因的蛋白水平。从结果可以看出，使用相应小核酸处理后的VEGF和VEGFR2的蛋白水平明显低于对照组。

图15显示HKP介导的TGF-β1小核酸导入导致快速的伤口愈合。HKP-TGF-β1小核酸治疗组伤口愈合速率明显提高，快速的伤口愈合是靶标基因的沉默所致。

图16显示HKP-TGF-β1小核酸治疗后疤痕形成更少。组织学分析表明，与不治疗的伤口皮肤相比，HKP-TGF-β1小核酸治疗后的伤口表皮结构与正常皮肤结构十分接近。箭头所指为皮肤伤口区域的疤痕大小。

图17显示用于小核酸导入的第一代纳米颗粒。我们已经开发和获得了一系列用于促进小核酸导入的临床可用纳米颗粒材料，并取名为Snano系列载体。Snano-1是基于HKP的系统，Snano-2是树枝状大分子(Dendrimer)系统，Snano-3是基于聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物PLGA的系统，Snano-4是小分子量的聚乙二醇-聚乙酰亚胺(PEG-PEI)共聚物，Snano-5是阳离子脂质体S-DOTAP，Snano-6是基于亚精胺(spermidine)的系统。

图18显示小核酸寡聚体的化学修饰。为了提高小核酸的稳定性，尽量降低其副作用(如脱靶效应)，采用了如图中所示的各种化学修饰：硫磷酰、硼烷、甲基膦酸酯、磷酸二酯。修饰位置可以是2-O-甲基化或2-O-甲氧乙烷基(2-O-MOE)，这些修饰的结构如图所示。

图19为新药临床试验申请(IND)的设计与流程。我们已经针对HKP-小核酸制剂治疗眼部疾病设计了流程图，包括新药临床试验申请所需的主要任务和流程。三个方面的任务包括：(1)HKP-小核酸的剂型工艺确认；(2)药理学和毒理学研究；(3)活性药物中间体(API)和辅料的化学、制备与控制(CMC)。

具体实施方式

具体实施例1：25个碱基对长度的小核酸比21个碱基对的小核酸效果更好

尽管最初的研究主要是利用化学合成的19和21个碱基对的小核酸双链，但有证据表明23、25、27个碱基对的小核酸双链都比19和21个碱基对的寡核苷酸双链表现出了更好的抑制活性。更长的小核酸(23个碱基对或更长)所具有的潜在激活干扰素效应是一种依赖于细胞类型的现象。我们发现，在MBA-MD-435或DLD-1细胞系及携带肿瘤的动物模型中，25个碱基对的带有平末端的小核酸双链具有最好的抑制效果。我们针对人VEGF基因为靶标的25个碱基对的小核酸hVEGF-25c(正义链：5’-CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA-3’；反义链：5’-UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG-3’)进行了检测，并与已被测试过很多次的、被认为最有效的21个碱基对的VEGF序列hVEGF-21a(正义链：5’-UCGAGACCCUGGUGGACAUTT-3’；反义链：5’-AUGUCCACCAGGGUCUCGATT-3’)进行了比较，前者显示比后者更强的抑制效果。在培养细胞模型中，用Q-RT-PCR技术(图1A)检测显示25个碱基对的带有平末端的小核酸双链比21个碱基对粘末端小核酸更有效。而ELISA分析蛋白表达水平(图1B)也表明，两种长度的小核酸对VEGF表达抑制具有显著的差异。

具体实施例2：选择特异性针对人和小鼠VEGF mRNA的小核酸

依据专有的以计算机为基础的算法，我们针对VEGF设计了小核酸(表1)，它们具有如下特征：a.最佳热力学特征；b.增强与RISC的结合能力；c.消除免疫激活结构域；d.具有人鼠同源性；e.通过已有知识产权搜索序列；f.使用blast尽量避免“脱靶效应”；g.能作为小核酸鸡尾酒药物。通过Q-RT-PCR(MyiQ，Bio-Rad)检测选择针对每个基因的最有效的小核酸。用于体外细胞培养研究的25个碱基对小核酸由Qiagen(Germantown，MD)合成，更大量的用于动物疾病模型体内研究的小核酸由Dharmacon(Bolder，CO)合成。用于筛选最有效小核酸的细胞系应该是能够表达靶基因的细胞系，例如，人293细胞和小鼠F3细胞用于选择VEGF特异性的小核酸(图2)。经过试验，选择了靶向VEGF的最有效小核酸，即hmVEGFc(正义链：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’)作为活性药物中间体(API)用于VEGF基因的沉默。

具体实施例3：选择特异性针对人和小鼠VEGFR-2mRNA的小核酸

依据专有的电子计算机为基础的算法，我们针对VEGFR-2设计了小核酸(表2)，它们具有如下特征：a.最佳热力学特征；b.增强与RISC的结合能力；c.消除免疫激活结构域；d.具有人鼠同源性；e.通过已有知识产权搜索序列；f.使用blast尽量避免“脱靶效应”；g.能作为小核酸鸡尾酒药物。通过Q-RT-PCR(MyiQ，Bio-Rad)检测选择针对每个基因的最有效的小核酸。用于体外细胞培养研究的25个碱基对小核酸由Qiagen(Germantown，MD)合成，更大量的用于动物疾病模型体内研究的小核酸由Dharmacon(Bolder，CO)合成。用于筛选最有效小核酸的细胞系应该是能够表达靶基因的细胞系，小鼠SVR细胞转染小核酸后，提取总RNA进行Q-RT-PCR分析(图3A)，人HUVEC细胞转染小核酸后，分离蛋白进行酶联免疫吸附试验(ELISA)(图3B)。经过试验，选择了靶向VEGFR-2的最有效小核酸，即hmVR2h(正义链：5’-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3’)作为活性药物中间体(API)用于VEGFR-2基因的沉默。

具体实施例4：选择特异性针对人和小鼠TGF-β1mRNA的小核酸

依据专有的电子计算机为基础的算法，我们针对TGF-β1设计了小核酸(表3)，它们具有如下特征：a.最佳热力学特征；b.增强与RISC的结合能力；c.消除免疫激活结构域；d.具有人鼠同源性；e.通过已有知识产权搜索序列；f.使用blast尽量避免“脱靶效应”；g.能作为小核酸鸡尾酒药物。通过Q-RT-PCR(MyiQ，Bio-Rad)检测选择针对每个基因的最有效的小核酸。用于体外细胞培养研究的25个碱基对小核酸由Qiagen(Germantown，MD)合成，更大量的用于动物疾病模型体内研究的小核酸由Dharmacon(Bolder，CO)合成。用于筛选最有效小核酸的细胞系应该是能够表达靶基因的细胞系，例如，人PC3细胞(图4A-B)和小鼠C166细胞(图4B)用于选择TGF-β1特异性的小核酸。经过试验，选择了靶向TGF-β1的最有效小核酸，即hmVEGFc(正义链：5’-GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’)作为活性药物中间体(API)用于TGF-β1基因的沉默。

具体实施例5：选择小核酸组合物作为候选药物

为了充分利用本发明中新型的联合两种小核酸或三种小核酸的药物制剂模式，提高小核酸治疗的效果，我们制定了如下的组合药物：

(1)组合1：VEGF-VEGFR-2小核酸：

VEGF特异性的小核酸hmVEGFc：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正义链)与VEGFR-2特异性的小核酸hmVR2h：5’-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3’(正义链)组合的双靶标小核酸作为活性药物中间体(API)。

(2)组合2：VEGF-TGF-β1小核酸：

VEGF特异性的小核酸hmVEGFc：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正义链)与TGF-β1特异性的小核酸hmTF25f：5’-GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正义链)组合的双靶标小核酸作为活性药物中间体(API)。

(3)组合3：VEGF-VEGFR-2-TGF-β1小核酸：

VEGF特异性的小核酸hmVEGFc：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正义链)、VEGFR-2特异性的小核酸hmVR2h：5’-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3’(正义链)与TGF-β1特异性的小核酸hmTF25f：5’-GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正义链)组合的三靶标小核酸作为活性药物中间体(API)。

具体实施例6：HKP-小核酸能自动形成纳米颗粒

经过优化的分枝状组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)已经被广泛用于体外和体内导入小核酸，其中两种HK聚合物，H3K4b和H3K(+H)4b，具有一个赖氨酸骨架结构，有四个包含重复的组氨酸、赖氨酸和天冬酰胺的分支。当这种HKP水溶液与小核酸以N/P(氮磷比)质量比为4∶1混合时，将自动组装形成平均直径为100-200nm的纳米颗粒(图5)。在RaninVoyager合成器上(PTI，Tucson，AZ)合成具有理想分支的组氨酸-赖氨酸聚合物HKP。研究中使用的两类HKP粒子为具有(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)结构的H3K4b和PT73，其中H3K4b粒子中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，而PT73粒子的R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天冬酰胺。HKP水溶液与小核酸水溶液以4∶1质量比进行混合，形成平均直径为150-200nm的粒子。HKP-小核酸水溶液为半透明的，具有明显的沉淀聚集现象，并且可以在4℃的条件下储存至少三个月。测定表征后的HKP-小核酸纳米颗粒的直径和Zeta电位(图6)，我们同时使用H3K4b和H3K(+H)4来对眼部和其它组织实施高效的小核酸导入。

具体实施例7：HKP-小核酸能增强小鼠眼部小核酸的局部导入

角膜血管新生模型：此模型通过纯化的HSV DNA(富含CpG)和/或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)诱导小鼠角膜表达VEGF，此模型具有典型的炎症诱导型血管新生和淋巴管新生症状，这与临床常见的角膜血管新生相似。随时诱导并检测新血管的形成，监测新生血管区域和HSK疾病评分是评估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。本发明用这一方法检测干扰RNA，并收集RNAi治疗CpG诱导的基质角膜炎(SK)的数据，提供定量数据，制造与人体HSV感染引起的SK相似的环境。

将CpG-ODN植入小鼠得到单纯疱疹性基质角膜炎模型，这是与临床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎症诱导的血管新生和淋巴管新生的特征。为了在CpG-ODN诱导的角膜炎症模型中评估HKP纳米颗粒导入小核酸的效果，通过结膜下注射(SCJ)FITC(异硫氰酸荧光素)标记的小核酸，给药24小时后观察角膜切片的血管新生情况。观察处理各组的组织切片，HKP-FITC标记的小核酸主要聚集在角膜组织，而同样给药的不含HKP的处理组信号十分微弱(图7)。这些结果是HKP有利于通过结膜下给药促进小核酸导入角膜的直接证据，大量的HKP-小核酸停留在注射位点，HKP-小核酸导入其它类型的组织也观察到了同样的现象。

具体实施例8：小核酸鸡尾酒显示较强的抗新生血管活性

将CpG-ODN植入小鼠和HSV感染得到单纯疱疹性基质角膜炎的方法如前所述，这是与临床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎症诱导的血管新生和淋巴管新生的特征。测定新生血管区域面积和HSK疾病评分是评估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。我们发现，分别敲低VEGF、VEGFR1和VEGFR2具有类似的抗血管新生作用，而将三种小核酸联合起来同时敲低三个基因具有更强的抗血管新生活性。我们的研究发现，在CpG诱导的血管新生模型中HKP-小核酸鸡尾酒比裸露的小核酸鸡尾酒更有效果(图8)。

具体实施例9：玻璃体内注射HKP-小核酸剂型导入兔子眼部

大耳白兔模型：这一模型用于小核酸玻璃体内注射后的组织分布研究。给药前，肌肉注射氯胺酮(ketamine)和赛拉嗪(xylazine)的混合镇静剂。接着用0.9％的注射用氯化钠(美国药典，Baxter)配制的1∶10000的苯扎氯铵溶液/杀藻胺50％NF(Spectrum LabProducts，Inc.，New Brunswick，NJ)溶液(相当于0.1mg/mL)冲洗结膜。对每只眼睛进行局部麻醉(Alcain，0.5％)，每次注射都用新的胰岛素注射器(含预装好的针头)。两只眼睛每次给药的溶液体积是50μl/眼，用双目间接检眼镜确认针头位置。分离左眼收集房水、虹膜、玻璃体液、视网膜和巩膜(包括脉络膜)。

³标记的小核酸用于兔子(大耳白兔)的给药，0.5mg的H³标记的小核酸以50μl体积注射每只眼睛，双目间接检眼镜确认注射位置。治疗后眼科医师迅速检测眼睛(间接检眼镜和裂隙灯检查)，记录任何可能有剂量流程引起的异常情况。检查后，用硫酸庆大霉素滴眼液处理每只眼睛，如果眼科医师认为需要，则进一步用眼部润滑剂泪然点眼液(TearsAlcon，Fort Worth，TX)处理。在预定的时间节点(注射后24小时和72小时)通过注射(Bimeda-MTC Animal Health Inc.，Cambridge，Ontario，Canada，剂量约为200mg/kg)对动物实施安乐死，每个时间节点处死四只动物，收集组织样品，完整摘除八只眼睛。解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃体液、视网膜和巩膜(包括脉络膜)。所有样品储存于-80℃。

放射性活性检测：记录所有八个组织样品，将样品溶于四乙基氢氧化铵(TEAH)中，溶解的样品，或者取其中一半，与液相闪烁溶液混合后，采用液体闪烁波谱分析检测放射活性。每份样品检测5分钟，任一样品都首先观察到了0.1％的偏差(two-sigmaerror)。通过基于外部标准的自动淬灭校正，将所有计数转化为绝对的放射性活性(dpm)。将放射性活性小于或等于2倍背景值的样品定义为零，所有放射性检测都输入标准的电脑数据库程序(Debra Version 5.2)，计算放射性物质的浓度(dpm/g和质量单位eq/g)和每个样品中放射性活性。放射性样品活性首先表示为dpm/g，接着根据测定的给药溶液中放射标记物的特定活性(dpm/mg或合适的质量单位)将其转化为质量eq/g(假定小核酸保持完整)。根据组织的总重量计算总组织含量。用SAS Version 8.1统计软件估测非房室药代动力学参数等眼部数据，包括浓度时间曲线下面积(AUC)、终末半衰期(tl/2el)、终末速度常数(kel)、血药峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)。其中Cmax根据检验数据获得，用梯形法计算AUC，在浓度时间曲线末期选择时间点进行线性回归分析计算kel。终末半衰期(tl/2el)的计算为：t1/2el＝ln2/kel。对于偏离超过10％的时间偏差，以实际的时间点来计算参数。图9显示了每个样品在小核酸给药后24小时和72小时的放射性活性。很明显，尽管裸露小核酸注射量(2mg/眼)显著高于HKP-小核酸(250μug/眼)，给药后72小时，HKP-小核酸组的小核酸回收量显著高于裸露小核酸组。

具体实施例10：HKP-小核酸纳米颗粒增强小核酸的视网膜导入

从H³标记的小核酸兔眼部样品发现，HKP-小核酸纳米颗粒比裸露的小核酸更稳定，不但HKP-小核酸的总回收率远远高于裸露的小核酸，H³标记的HKP-小核酸在视网膜中的绝对数量也明显高于H³标记的裸露的小核酸。这些结果表明玻璃体内注射HKP-小核酸能够提高小核酸的稳定性，使小核酸停留在视网膜组织中并富集(图10)。注射后的第一天和第三天，小核酸在眼内的组织分布显著不同：注射第1天小核酸主要集中于玻璃体内，第3天转移到水晶体和视网膜内。而用HKP包裹小核酸后，转移到水晶体和视网膜内的小核酸更明显。因此，我们推断HKP-小核酸纳米颗粒通过一种暂时未知的作用机制靶向进入视网膜，非常有利于眼部疾病的治疗。

具体实施例11：在缺氧诱导的视网膜病变模型中观察治疗效果

缺氧诱导的视网膜病变(OIR)模型：这一模型具有典型的病理性缺血和退行性的视网膜NV特性，如增生性糖尿病视网膜病变和老年黄斑变性。通过荧光标记的葡聚糖的心肌血流灌注检测血管新生区域，接着采用视网膜分离，冻干切片，检测mRNA和蛋白表达水平等来评估抗眼睛后部的血管新生活性。

缺氧诱导的视网膜病变(OIR)C57BL/6小鼠模型购白广州中医药大学广州医学院实验动物中心。简单地说，出生后第7天到第12天，高氧环境下(75％+2氧气)饲养新生小动物，然后转入室内空气(正常氧气浓度)，然后用通过不同途径导入的HKP-小核酸纳米颗粒处理。通过荧光素灌注/视网膜分离、组织切片染色评估OIR眼部血管增生模型，通过RT-PCR分析mRNA水平，ELISA检测蛋白含量。所有实验遵循中国的实验动物资源保护委员会、生命科学委员会和国家研究委员会的指导原则。

由于缺氧诱导的血管新生模型代表了一种缺血性和退行性脉络膜血管增生(CNV)症状，我们用这一模型同时检测局部(玻璃体内注射)和系统(腹腔注射)给药HKP-小核酸纳米颗粒剂型的情况，以探索对早产儿视网膜病和老年黄斑变性的治疗效果。结膜下和玻璃体内注射作为HKP-小核酸鸡尾酒剂型的局部给药途径，而因为幼小动物尾静脉注射的剂量受到限制，故系统给药途径则从静脉注射调整为腹腔注射。所有三种给药途径都以两种方案给药：方案A：在出生后第12天和第13天分别给药两次；方案B：在第12天、第14天和第16天分别给药三次。在第17天收集样品，接着用荧光素标记的葡聚糖进行心肌血流灌注。比较分离的视网膜，发现方案A和方案B的玻璃体内注射和腹腔注射给药效果均很好，能减少50％的血管新生(图11)。

具体实施例12：通过HIR模型的超薄组织切片样品观察疗效

上述缺氧诱导的视网膜病变(HIR)C57BL/6小鼠，在第17天摘除眼球并冷冻于合适温度的包埋化合物(Miles Diagnostics，PA，USA)中用于组织切片分析，眼部冰冻切片(10μm)用生物素化的牛血清白蛋白(BSA)进行组织化学染色。将切片放入乙醇/双氧水在4℃放置10分钟，用0.05M、pH为7.6的Tris盐缓冲液(TBS)清洗，接着在10％的正常牛血清中孵育30分钟。切片孵育在生物素标记的BSA中，接着加入亲和素(Avidin)标记的碱性磷酸酶(Vector Laboratories)和3，3′-二氨基联苯胺(DAB)，然后用伊红复染，并用Cytoseal封片。为了进行定量评估，用显微镜观察15份BSA染色组织切片，并用数码相机拍照。用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)描绘视网膜表面的BSA染色的细胞，并测定区域面积。局部导入实验中，每只眼的检测作为单一实验值；系统导入中，两只眼睛检测的平均值作为单一实验值。

经组织切片分析，检测内界膜(ILM)前部的BSA阳性细胞，从组织学上评估视网膜血管增生情况。两种给药方案中，玻璃体内注射和腹腔注射给药的样品都取得了明显的减少血管新生的效果(图12)。这一有趣的现象从另一方面证实了腹腔注射HKP-小核酸鸡尾酒，确实能够通过血液循环到达视网膜，而结膜下注射导入HKP-小核酸鸡尾酒不能有效穿过血视网膜屏障(BRB)而不能有效到达脉络膜血管新生部位。

具体实施例13：在mRNA水平证明RNAi作用机制

有报道称，有些小核酸会通过TLR3途径引起序列和靶标非依赖性的血管新生抑制，然而我们在小鼠血管新生模型中，使用纳米颗粒增强的小核酸导入，用mRNA特异性PCR(RS-PCR)和逆转录PCR(RT-PCR)检测，并未观察到这类现象。用RNAwiz(Ambion，#9736)抽提细胞中的总RNA，在第14天和17天处死的小鼠用TRIzo试剂(Invitrogen，USA)提取总RNA。细胞质RNA样品用前述的mRNA特异性PCR(RS-PCR)检测。每种mRNA的引物包含一个47个核苷酸的用于逆转录反应(RTP)的引物、一个5’端基因特异性引物(GP)和一个3’端通用引物(5’-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3’)。每个基因扩增所用引物如下：mVEGF：(RTP)5’-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg-3’，(GP)5’-GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG-3，mVEGFR2：(RTP)5’-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATaggtcactgacagaggcg-3’，(GP)5’-GGCGCTGCTAGCTGT CGCTCTGTG GTTCTG-3’，字母小写代表的序列为逆转录靶标特异性的序列。同时，通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白(β-actin)来定量mRNA样品的含量，所有PCR产物用凝胶电泳进行定量分析。

小鼠眼部血管增生模型切实地表明，通过局部或系统给药，HKP-小核酸鸡尾酒具有显著的抗血管新生效果，接着我们也探讨这一抗血管新生效果是否为小核酸介导的基因沉默引起。首先是查看是否有mRNA水平的序列和靶标依赖性的基因沉默。用Q-RT-PCR分析HIR模型眼部组织的mRNA样品，发现VEGF和VEGFR2的mRNA表达水平显著降低(图13)，这是序列和靶标依赖性的，与局部或系统给药无关。另一有趣发现时HIR眼睛中VEGF表达量非常高，而VEGFR2表达量正常。而且，内源性的VEGFR2的表达能够通过纳米颗粒-小核酸鸡尾酒的作用在mRNA水平被抑制。

具体实施例14：在蛋白水平证明RNAi作用机制

我们也同时通过ELISA分析VEGF和VEGFR2在蛋白水平被敲低的程度。第14天和第17天处死小鼠收集视网膜，在细胞裂解液(哺乳动物细胞裂解试剂盒，BiotechnologyDepartment Bio Basid Inc.，Canada)中匀浆化，上清经BCA试剂盒(申能博彩生物科技有限公司，中国)定量后进行ELISA分析。分别用针对VEGF和VEGFR2的鼠科Quantikine M免疫试剂盒(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)确定VEGF和VEGFR2的水平，每一组每个时间点分析6-12份样品。

在小鼠眼部血管增生模型中观察到局部或系统给药的纳米颗粒-simVmix(VEGF小核酸和VEGFR2小核酸的混合)剂型的显著的抗血管新生效果，接着我们也探讨这一抗血管新生效果是否为小核酸介导的基因沉默引起。除了评估mRNA，我们也检测蛋白水平的序列和靶标特异性基因沉默情况。通过对HIR小鼠模型的眼部组织蛋白样品进行ELISA分析，发现靶标基因的蛋白表达水平显著降低(图14)，这是序列和靶标依赖性的，与局部给药或系统给药无关。两种给药方案中，在第14天和第17天两个时间点分别检测，表明HKP包裹的小核酸鸡尾酒能有效抑制VEGF和VEGFR2的表达。在CpG诱导和单纯疱疹病毒感染引起的小鼠血管增生模型中也观察到了序列和靶标依赖性的基因沉默。在我们整个研究过程中，无论是靶向单个基因还是多个基因，是局部局部给药还是系统给药，是视网膜血管增生模型还是角膜血管新生模型，都没有观察到其它报道中所说的序列非依赖性的抗血管新生活性。

具体实施例15：小鼠模型中TGF-β1小核酸导致的伤口无疤痕愈合

使用Avastin或Lucentis拮抗剂药物进行抗血管增生治疗的缺点是视网膜组织会形成疤痕，这将严重影响药物治疗的效果，并导致视觉损害。为了在抗血管增生治疗后的愈合过程中尽量减少疤痕形成，我们开发了用TGF-β1小核酸抑制促炎症因子的方法。我们已经证明，将TGF-β1小核酸用于小鼠表皮切割伤口模型治疗时，能有效促进伤口愈合并减少疤痕形成。靶向TGF-β1的HKP-小核酸，以甲基纤维素为辅料用于皮肤切割伤口的治疗，与HKP-对照小核酸治疗组和不含小核酸的HKP对照组相比，能明显快速促进伤口愈合(图15)。取治疗组和非治疗组的皮肤样品进行三色染色(Trichrome staining)和组织学分析，进一步证实了促进伤口愈合的作用(图16)。与非治疗组相比，HKP-TGF-β1小核酸治疗后的组织结构更接近正常皮肤组织。基于大量文献报道和上述的实验证据，我们提出联合靶向血管新生信号途径的VEGF和VEGFR2及TGF-β1信号途径的多个小核酸来治疗，这是一种全新的治疗眼部血管增生疾病的方式。我们期望这样的治疗方式还包括HKP包裹的VEGF-TGF-β1小核酸组合：VEGF特异性小核酸hmVEGFc：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正义链)与hmTF25f：5’-GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正义链)联合的双靶标小核酸作为活性药物中间体(API)，这不但能减少新生血管发生，还能使疤痕最小化，进而保护和促进病人视力。

具体实施例16：用于眼部小核酸治疗的第一代纳米颗粒

在核酸药物开发过程中，有多种不同的多肽、聚合物、脂质体和其它材料可用作小核酸的导入载体。我们将能够与小核酸通过静电相互作用自动形成纳米颗粒的阳离子聚合物或脂质体称为第一代小核酸导入载体(图17)。

即为Snano-1，是典型的第一代小核酸导入载体，带正电荷的分枝状组氨酸-赖氨酸多肽和带负电荷的小核酸能够形成非常均一的纳米颗粒，实现高效的体内导入。

聚乙二胺树枝状聚合物(PAMAM)，Snano-2，是一种定性清楚的高分枝的合成大分子，具有良好的生物相容性和非免疫原性，成为为各种治疗制剂、成像制剂和小核酸这样的寡聚核苷酸的独特导入系统。G5PAMAM树枝状聚合物在我们的小核酸的体内外导入中非常有用。

是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其它们的聚合物(PLGA)，因为其生物相容性和生物可降解性而引起极大关注。这类材料已经成为一些如抗癌制剂、抗高血压药物、免疫调节剂、激素等药物和一些如核酸、蛋白、多肽、抗体等大分子的潜在载体。随着传统方法的进步，选择性也更多，一些新的用于装在药物的纳米颗粒的制备技术也获得开发和完善。我们已经建立了制备直径约200nm的PLGA-小核酸纳米颗粒的方法，实现了高效的小核酸体内导入。

是聚乙二醇-聚乙酰亚胺(PEG-PEI)共聚物纳米颗粒，已经被用于体内运输核苷酸和寡聚多肽。小分子量的PEI带有正电荷，这是能与带负电的小核酸形成纳米颗粒的关键，小核酸中和了纳米颗粒的正电荷，有利于降低毒性，因为体内导入后过量的正电荷会导致凝集和非特异性吸附。聚乙二醇化后能进一步提升PEG-PEI纳米颗粒在血液中的循环时间。

使用DOTAP镜像异构体(enantiomer)来导入包括小核酸在内的核酸具有不同的效果，我们发现用S-DOTAP(两种DOTAP镜像异构体的一种)，更有利于小核酸在体外的转染和在体内(呼吸道追踪)的导入。因此，我们设计用S-DOTAP作为Snano-5来将小核酸导入眼部。

我们在多种细胞和小鼠组织中测试了精胺和亚精胺为基础的材料的体内外导入效果，其中一种基于精胺的系统非常有利于小核酸转染人A549细胞和呼吸道导入小核酸，我们将其命名为Snano-6。

具体实施例17：用于眼部治疗的小核酸的化学修饰

单链的核苷酸在血清或细胞内将被快速降解，双链核苷酸，包括小核酸，比对应的单链核苷酸更稳定，但是依然会被酶解，因此在药物必须接触血液的情况下，需要保护药物免遭核酸酶的酶解作用。这些保护措施可以来自于外部的合适的导入载体(如我们在实施例16中描述的，包含纳米颗粒或脂质体胶囊的复合物)，或者是来自于内部的对核苷酸自身进行抗核酸酶降解的修饰。最简单的方法是直接修饰核苷酸间的磷酸连接增加稳定性，采用硫(PS)、硼(硼烷，boranophosphate)、氮(氨基磷酸酯，phosphoramidate)或甲基(甲基膦酸酯，methylphosphonate)代替非桥键氧已经用于稳定反义的单链寡聚核苷酸。

图18显示了可提高小核酸核酸酶稳定性的各种修饰方法，氨基磷酸酯和甲基膦酸酯的衍生物广泛用于反义核苷酸，可以显著改变核苷酸与细胞内酶如RNase H的相互作用。还没有系统的研究将这些应用拓展到RNAi领域。硼烷修饰的DNA或RNA有利于抵抗核酸酶的降解，硼修饰也不影响小核酸的功能，但是硼烷的化学合成相对困难。PS修饰更容易因此获得广泛应用，可以提升反义单链核苷酸和小核酸的核酸酶稳定性。

硫磷酰(Phosphorothioate)修饰的核酸是具有“粘性”的硫酸聚阴离子，能非特异性地与大量细胞内蛋白结合，可能引起有害的副作用。尽管如此，这一修饰依然可安全用于小核酸的修饰。只在寡聚核苷酸的末端用最小程度的PS修饰，这有利于减少有害的副作用。鉴于反义核苷酸已经有很长的使用PS修饰的历史，对这一修饰的潜在毒性有很好的理解，PS修饰化合物的安全性也在可控范围内。

在核酸2号位上修饰能间接提升核苷酸间的磷酸键对核酸酶的抗性，同时能增加双链的稳定性(Tm)，甚至有利于避免遭受激活的免疫系统的攻击。2-O-甲基化RNA(2-OMe)是在哺乳动物核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)中发现的天然RNA变体，这种结构没有毒性，可用于修饰小核酸中的正义链或反义链。

氟修饰(2-F)不影响小核酸的功能，有利于双链稳定抵抗核酸酶的降解，在嘧啶上连接2-F能维持小核酸在体内外的活性。甚至可以在Ago-2(Argonaute，将长的双链RNA切割成小核酸的蛋白)切割的位点进行2-F修饰。2-F修饰嘧啶和2-OMe修饰嘌呤同时使用将极大提高RNA双链在血清中的稳定性，提高在体内的作用效果。

核酸锁(LNA)包含一个亚甲基桥，将2-O与核糖的4-C连接起来，亚甲基桥“锁住”3’内向构象中的糖，可显著提高Tm和对核酸酶的抗性。大量的LNA修饰会导致小核酸活性下降(甚至比2-OMe修饰下降更多)，然而，少量的LNA修饰能保持小核酸的功能，并且明显增强对核酸酶的稳定性。

是天然发生的RNA变体，用在合成的小核酸中不会有明显毒性，而其他种类的2-修饰是非天然的，它们的毒副作用需要进一步探讨。已有大量研究将2-F修饰作为合成寡聚核苷酸的安全组分。

上述的修饰策略能够保持21个碱基对小核酸双链与RISC(RNA诱导的沉默复合物)结合的能力，维持Ago2引导链的功能。我们用于治疗眼部疾病的小核酸是25个碱基对的平末端小核酸，我们将联合采用纳米颗粒载体和一定程度上的化学修饰这两种策略，以提升治疗效果，尽量降低毒性及后期产品制备阶段的复杂性。

具体实施例18：小核酸治疗与其它治疗方法的联合使用

已经有若干个治疗药物用于临床，包括单克隆抗体药物(Avastin和Lucentis)、可溶性受体制剂(VEGF trap)和其他药物。由于我们的小核酸药物采用不同的作用机理，即是通过抑制VEGF和VEGFR2蛋白的产生而不是等蛋白生成之后再阻断其功能，因此理论上两种不同作用机理的药物联合会有更好的效果。我们尝试在同一给药方案中将小核酸与单克隆抗体联合使用，观察到疗效显著提升。因此，在我们用小核酸治疗眼部血管增生时，将考虑同时用小核酸和其它抑制剂联合治疗。最新研究发现了许多micro RNA(miRNA)参与血管增生疾病的血管新生过程，例如miR-132能作为抗miR或小核酸抑制剂的靶标，使病理学逆转。小核酸与抗miR制剂联合也是治疗眼部适应症的新方法。

具体实施例19：HKP-小核酸药物的开发过程

小核酸治疗药物的开发与小分子和蛋白药物等其他制剂的开发过程有一定差异，我们已经建立了HKP-小核酸制剂的生产制备流程(图19)，进行一系列药理学和毒理学研究，以符合监管机构对药品注册审批的要求。

表1.选择针对VEGF的有效的小核酸：

hmVEGFa	正义链：	5’-r(CCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCA)-3’
				反义链：	5’-r(UGCAGCCUGGGACCACUUGGCAUGG)-3’
			hmVEGFb	正义链：	5’-r(CCAACAUCACCAUGCAGAUUAUGCG)-3’
	反义链：	5’-r(CGCAUAAUCUGCAUGGUGAUGUUGG)-3’
hmVEGFc	正义链：	5’-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA)-3’
				反义链：	5’-r(UGUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACAG)-3’
			hmVEGFd	正义链：	5’-r(CACUUUGGGUCCGGAGGGCGAGACU)-3’
	反义链：	5’-r(AGUCUCGCCCUCCGGACCCAAAGUG)-3’
hmVEGFe：	正义链：	5’-r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)-3’
				反义链：	5’-r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)-3’
			hmVEGFf：	正义链：	5’-r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)-3’
	反义链：	5’-r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC)-3’
hmVEGFg：	正义链：	5’-r(GCAAGGCGAGGCAGCUUGAGUUAAA)-3’
				反义链：	5’-r(UUUAACUCAAGCUGCCUCGCCUUGC)-3’
			hmVEGFh：	正义链：	5’-r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)-3’
	反义链：	5’-r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)-3’

表2.选择针对VEGFR2的有效的小核酸：

hVR2a：	正义链：	5’-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3’
				反义链：	5’-r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)-3’
			hVR2b：	正义链：	5’-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3’
	反义链：	5’-r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG)-3’
hVR2c：	正义链：	5’-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3’
				反义链：	5’-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)-3’
			hmVR2d：	正义链：	5’-r(GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGACUC)-3’
	反义链：	5’-r(GAGUCCAGAAUCCUCUUCCAUGCUC)-3’
hmVR2e：	正义链：	5’-r(CAUGGAAGAGGAUUCUGGACUCUCU)-3’
				反义链：	5’-r(AGAGAGUCCAGAAUCCUCUUCCAUG)-3’
			hmVR2f：	正义链：	5’-r(CCUGACCUUGGAGCAUCUCAUCUGU)-3’
	反义链：	5’-r(ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG)-3’

			hmVR2g：	正义链：	5’-r(GCUAAGGGCAUGGAGUUCUUGGCAU)-3’
	反义链：	5’-r(AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC)-3’
hmVR2h：	正义链：	5’-r(GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA)-3’
				反义链：	5’-r(UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC)-3’

表3.选择针对TGF-β1的有效的小核酸：

hmTFb1a：	正义链：	5’-r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3’
				反义链：	5’-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3’
			hmTFb1b：	正义链：	5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’
	反义链：	5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’
hmTFb1c：	正义链：	5’-r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3’
				反义链：	5’-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3’
			hmTF25d：	正义链：	5’-r(GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU)-3’
	反义链：	5’-r(AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3’
hmTF25e：	正义链：	5’-r(CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA)-3’
				反义链：	5’-r(UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUCGUG)-3’
			hmTF25f：	正义链：	5’-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3’
	反义链：	5’-r(CCACCAUUAGCACGCGGGUGACCUC)-3’
hmTF25g：	正义链：	5’-r(GUACAACAGCACCCGCGACCGGGUG)-3’
				反义链：	5’-r(CACCCGGUCGCGGGUGCUCUUCUAC)-3’
			hmTF25h：	正义链：	5’-r(GUGGAUCCACGAGCCCAAGGGCUAC)-3’
	反义链：	5’-r(GUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCCAG)-3

Claims (11)

1.包含三种小核酸分子和药物载体的组合物，所述三种小核酸分子能与三个靶基因的mRNA分子结合，所述的mRNA至少能编码一部分多肽或蛋白质，或者为5-’或3-’端的非翻译序列，所述三个靶基因分别为VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因，所述的组合物包括小核酸序列的组合：hmVEGFc，正义链：5’-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA)-3’，hmVR2h，正义链：5’-r(GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA)-3’，和hmTF25f，正义链：5’-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3’。

2.如权利要求1所述的组合物，其中小核酸的靶mRNA分子能编码的基因来自VEGF信号通路，TGF-b信号通路，或者同时来自VEGF 和TGF-b两个信号通路。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述mRNA分子编码VEGF、VEGFR2、TGF-b1蛋白。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物载体包括聚阳离子结合剂、阳离子脂质体、阳离子胶团、阳离子多肽、阳离子聚缩醛、接枝状亲水聚合物。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述药物载体为分枝状组氨酸-赖氨酸聚合物HKP。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述小核酸分子，选自小干扰核苷酸（small interfering RNA，siRNA）、微核苷酸（microRNA，miRNA）和双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述小核酸分子，具有粘性末端或平末端，该小核酸分子是未经修饰的小核酸分子或者是经过化学修饰的小核酸分子。

8.权利要求1所述的组合物在制备治疗与血管新生和血管再生相关的眼部血管增生疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，给药位点为结膜下、玻璃体内或皮下组织，给药方式为局部给药或注射给药。

10.如权利要求8所述的应用，其中所述眼部血管增生疾病，包括但不限于葡萄膜炎、虹膜红变、结膜炎、角膜炎、睑缘炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎和视网膜病。

11.如权利要求5所述的组合物，其中所述药物载体和所述小核酸分子的N:P比例在2：1~3：1， 或2：1~4：1，或2：1~5：1， 或2：1~6：1之间。