CN102380098B - 用于治疗眼新血管疾病的组合治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明特征在于用于治疗被诊断患有或有危险发展为新血管疾病的患者的方法,其通过给所述患者施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂来实现。本发明特征也在于用于治疗或预防新血管疾病的含有PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的药用组合物。
Description
本申请是申请日为2004年8月26日,申请号为200480031700.1的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2003年8月27日提交的美国临时申请序号60/498,407,律师档案号EYE-013P,和2004年3月26日提交的美国临时申请序号60/556,837,律师档案号EYE-013P2的优先权,所述文献都被以全文形式收作本文参考。
发明领域
本发明涉及眼科学和医学领域。更具体地讲,本发明涉及采用能抑制血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的试剂的组合治疗眼的新血管疾病。
发明背景
血管发生,又被称作新生血管形成,包括由现存的血管形成新枝(sprout),以及它们侵入周围的组织。一种相关的过程,血管发生(vasculogenesis)包括业已存在于整个组织中的内皮细胞和成血管细胞的分化,以及它们随后连接在一起以便形成血管。
血管发生广泛出现在发育期间,并且还出现在创伤愈合期间的健康身体内,以便在损伤或伤害之后恢复血液流向组织。不过,血管发生也与癌和肿瘤形成相关。实际上,肿瘤组织中血管的量是乳腺癌(Weidner等,(1992)J.Natl.Cancer Inst.84:1875-1887)、前列腺癌(Weidner等,(1993)Am.J.Pathol.143:401-409)、脑肿瘤(Li等,(1994)Lancet 344:82-86)和黑素瘤(Foss等,(1996)Cancer Res.56:2900-2903)的有力的消极预后指标。最近发现,血管发生与许多医学领域的其他疾病状态相关,包括风湿病学、皮肤病学、心脏病学和眼科学。具体地讲,不希望的或病理学组织特异性血管发生与某些特殊疾病状态相关,包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和银屑病(参见例如,Fan等,(1995)Trends Pharmacol.Sci.16:57;和Folkman(1995)Nature Med.1:27)。另外,血管通透性的改变被认为在正常和病理学生理过程中起着作用(Cullinan-Bove等,(1993)Endocrinol.133:829;Senger等,(1993)Cancer andMetastasis Reviews 12:303)。尽管血管生成过程在上述每一种疾病中都可能与发育血管发生和肿瘤血管发生共有很多特征,但是各自可能具有由于周围细胞的影响产生的特殊的特征。
若干眼疾病涉及血管发生的改变。例如,糖尿病性视网膜病,是导致成年人失明的第三大原因(在美国占失明人数的几乎7%),与广泛的血管生成事件相关。非增殖性视网膜病伴随着视网膜内的周细胞的选择性丧失,并且它们的丧失导致了相关毛细血管的扩张,并且导致了血流的增加。在扩张的毛细血管中,内皮细胞增殖,并且形成外翻,它形成微动脉瘤,并且相邻的毛细血管被阻塞,从而微动脉瘤周围的视网膜区域没有被灌注。最终,支路血管出现在相邻的微动脉瘤区域之间,并且可以看到具有微动脉瘤的早期糖尿病性视网膜病和无灌注的视网膜区域的临床图像。微动脉瘤泄漏,并且毛细血管可能出血,导致渗出物和出血。一旦确定了背景糖尿病性视网膜病的起始阶段,所述状况会发展数年时间段,发展成增殖性糖尿病性视网膜病,并且导致大约5%的失明病例。当视网膜的某些区域持续丧失它们的毛细血管并变得不能灌注,从而导致在视网膜盘和其他地方出现新血管时,发生增殖性糖尿病性视网膜病。这些新血管生长成玻璃体,并且容易出血,从而导致视网膜前出血。在晚期增殖性糖尿病性视网膜病中,大量的玻璃体出血可能填充玻璃体腔的大部分。另外,新血管伴随着纤维组织增殖,它可能导致牵引视网膜脱离。
糖尿病性视网膜病主要与糖尿病的持续时间相关;因此,随着人群年龄和糖尿病患者生活的更长,糖尿病性视网膜病的流行率将增加。激光治疗目前被用于非增殖性和增殖性糖尿病性视网膜病。黄斑区周围的泄漏性微动脉瘤的病灶激光治疗使患有临床上显著的黄斑水肿的患者视力的丧失降低了50%。在增殖性糖尿病性视网膜病中,全视网膜光凝固导致了在整个视网膜上散布数千个微小的灼伤(避开黄斑区);这种治疗能降低失明比例60%。黄斑水肿和增殖性糖尿病性视网膜病的早期治疗能预防95%的患者在五年时间内失明,而晚期治疗只能防止50%的患者失明。因此,早期诊断和治疗是重要的。
涉及新生血管形成的另一种眼疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD),这是一种影响65岁以上的大约1/10的美国人的疾病。AMD的特征是黄斑,即视网膜中心区的一系列病理学变化,这种变化伴随着降低的视敏度,特别是影响中心视力。AMD涉及被称为视网膜色素上皮的单层细胞,它紧位于感觉视网膜下面。这些细胞滋养并且支持与它们接触的视网膜部分,即,包含视色素的感光细胞。视网膜色素上皮位于玻璃膜上,它是基底膜复合物,在AMD患者中,它会增厚并且硬化。新血管可能从下脉络膜穿透玻璃膜,它包括丰富的血管床。这些血管可能会泄漏流体或者在视网膜色素上皮下面出血,并且还可能在视网膜色素上皮和感觉视网膜之间出血。随后的纤维状瘢痕形成会破坏感光细胞的营养,并且导致这些细胞死亡,从而导致中央视敏度的丧失。这种类型的年龄相关性黄斑病变被称作“潮湿”类型的,这是因为泄漏的血管和视网膜下水肿或血液。潮湿类型只占年龄相关性黄斑病变病例的10%,但是导致了老年人中90%的病例因为黄斑变性而为法定盲。“干燥”类型的年龄相关性黄斑病变涉及视网膜色素上皮的分解,以及上面感光细胞的丧失。干燥类型的病变会降低视力,但是通常只有20/50-20/100的水平。
AMD伴随着中心视力的失真,使目标变大或变小或直线出现扭曲、弯曲或没有中心段。在潮湿类型的AMD中,在黄斑区可能注意到感觉视网膜的小的脱离,不过,视网膜下新生血管膜的最终诊断需要荧光素血管造影术。在所述干燥类型中,玻璃疣可能干扰黄斑区的色素沉着模式。玻璃疣是视网膜色素上皮的基底膜的赘疣,它能突出进入细胞,从而导致所述细胞前部膨胀;它们作为年龄相关性黄斑病变的危险因素的原因尚不清楚。目前还没有用于治疗干燥类型的年龄相关性黄斑病变的方法。激光治疗被用于潮湿类型的年龄相关性黄斑病变,并且最初消除了新生血管膜,并且在18个月时阻止了大约50%患者的进一步视力丧失。不过,到60个月时,只有20%的患者仍然有显著效果。
业已鉴定了血管发生的多种分子介体,包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF,bFGF)、转化生长因子α和β(TGFα,TGFβ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、白细胞介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)。参与血管发生的其他刺激物包括血管生成素(angiopoietin)-1、Del-1、卵泡抑素(follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、苗条蛋白、midkine、胎盘生长因子、多效蛋白(PTN)、progranulin、增殖蛋白和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。另外,血管发生的控制还可以通过由身体产生的血管发生的多种负调节剂介导,包括angioarrestin、血管抑素(血纤蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、软骨-衍生的抑制剂(CDI)、CD59补体片段、内皮抑制素(endostatin)(胶原XVIII片段)、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱导型蛋白(IP-10)、白细胞介素-12、kringle 5(血纤蛋白溶酶原片段)、金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)、2-甲氧雌甾二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂、血小板因子-4(PF4)、促乳素16kD片段、增殖蛋白-相关蛋白(PRP)、类视黄醇、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、脉管抑素(vasculostatin)和血管抑制因子(vasostatin)(钙网蛋白片段)。
在上述血管生成调节剂中,VEGF似乎作为伴随着肿瘤生长的异常血管发生的正调节剂发挥关键作用(综述参见Brown等,(1996)Control of Angiogenesis(Goldberg and Rosen,eds.)Birkhauser,Basel,和Thomas(1996)J.Biol.Chem.271:603-606)。另外,最近业已研究了信号传导分子的PDGF家族的PDGF-B成员的作用,因为它似乎在血管周围细胞的形成、扩增和正常功能方面发挥作用,所述血管周围细胞有时被称作壁细胞,例如,血管平滑肌、肾小球膜细胞和周细胞。
尽管对与发育、伤口愈合和肿瘤形成伴随的血管发生或新生血管形成的了解较多,但仍然需要确定在血管发生和眼血管发生之间是否存在差异。很显然,尽管伴随着,例如,心脏上的侧支血管形成的血管发生可能对生物有利并且适应生物,但伴随着例如AMD的病理性眼新生血管形成没有已知的好处,并且通常会导致失明(有关综述参见Campochiaro(2000)J.Cell.Physiol.184:301-10)。因此,尽管对伴随新生血管形成的分子事件的理解业已取得了进展,但仍然需要利用这些理解去开发用于治疗新血管疾病的其他方法,所述疾病包括眼新血管疾病和诸如与AMD和糖尿病性视网膜病伴随出现的脉络膜新生血管形成的疾病。
发明概述
业已惊奇地发现,抗-VEGF和抗-PDGF剂的组合,在治疗眼新血管疾病时能提供协同治疗效果。
因此,本发明特征在于用于治疗被诊断患有或有危险发展为新血管疾病的患者的方法。该方法包括给所述患者施用抗-VEGF剂和抗-PDGF剂,作为主要或辅助治疗。
一方面,本发明提供了用于抑制有所述需要的患者的新血管疾病的方法,其通过同时或相互间隔约90天之内给患者施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂来实现,使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。
另一方面,本发明提供了用于治疗有所述需要的患者的方法,所述患者被诊断患有或有危险发展为新血管疾病,其通过同时或相互间隔90天之内给患者施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂来实现,以足以治疗患者的用量施用。
在这些方面的特定实施方案中,本发明的方法包括在相互间隔大约10天内施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂。在本发明方法的另一种实施方案中,所述PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是在相互间隔5天内施用的。在本发明方法的另一种实施方案中,所述PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是在相互间隔约24小时内施用的。在本发明方法的特定实施方案中,所述PDGF拮抗剂和所述VEGF拮抗剂是同时施用的。
在另一种实施方案中,本发明的方法包括施用PDGF拮抗剂,它是PDGF-B拮抗剂。在另一种实施方案中,本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂,它是VEGF-A拮抗剂。
在某些实施方案中,本发明的方法包括施用PDGF拮抗剂,它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在另一种实施方案中,本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂,它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。
在特定实施方案中,本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂,它是适体,如EYE001适体。在另一种实施方案中,本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂,它是抗体或其结合片段。
在特定实施方案中,本发明的方法包括施用PDGF拮抗剂,它是适体、抗体或其结合片段。在另一种具体实施方案中,本发明的方法包括施用PDGF拮抗剂,它是反义寡核苷酸。
在本发明这一方面的另一种实施方案中,所述PDGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。
在一种实施方案中,本发明的方法提供了用于抑制或治疗眼新血管疾病的手段。在某些实施方案中,适合通过本发明的方法治疗或抑制的眼新血管疾病包括缺血性视网膜病、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病性视网膜缺血或增殖性糖尿病性视网膜病。在另一种实施方案中,本发明的方法提供了用于抑制或治疗有所述需要的患者或被诊断患有或有危险发展为这种疾病的患者的银屑病或类风湿性关节炎的手段。
本发明还提供了包括PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的,以及可以药用的载体的药用组合物。在这一方面,PDGF和VEGF拮抗剂的使用量都足以抑制所述患者的新血管疾病。
在这一方面的一种实施方案中,所述药用组合物包括PDGF拮抗剂,它是PDGF-B拮抗剂。在另一种实施方案中,所述药用组合物包括VEGF拮抗剂,它是VEGF-A拮抗剂。
在某些实施方案中,本发明的药用组合物包括PDGF拮抗剂,它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在另一种实施方案中,本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂,它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。
在其他特定实施方案中,本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂,它是适体,如EYE001适体。在一种实施方案中,本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂,它是抗体或其结合片段。
在特定实施方案中,本发明的药用组合物包括PDGF拮抗剂,它是抗体或其结合片段。在另一种具体实施方案中,本发明的药用组合物包括PDGF拮抗剂,它是反义寡核苷酸。
本发明的药用组合物可以包括可以药用的载体,它包括小球体或水凝胶制剂。
在另一种实施方案中,所述PDGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。
在另一种实施方案中,本发明的药用组合物提供了用于抑制或治疗眼新血管疾病的手段。在某些实施方案中,适合通过本发明的药用组合物治疗或抑制的眼新血管疾病包括缺血性视网膜病、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病性视网膜缺血或增殖性糖尿病性视网膜病。在其他实施方案中,本发明的药用组合物提供用于在有所述需要的患者,或被诊断患有或有危险发展为这种疾病的患者中抑制或治疗银屑病或类风湿性关节炎的手段。
本发明还提供了包括PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的药物包(pharmaceutical pack)。在这一方面的一种实施方案中,所述药物包包括PDGF拮抗剂,它是PDGF-B拮抗剂。在这一方面的另一种实施方案中,所述药物包包括VEGF拮抗剂,它是VEGF-A拮抗剂。
在另一种实施方案中,所述药物包的PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是分别且以单独剂量形式制备的。在另一种实施方案中,所述药物包的PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是一起制备的。
在某些特定实施方案中,本发明的药物包包括VEGF拮抗剂,它是适体,如EYE001适体。在其他实施方案中,本发明的药物包包括VEGF拮抗剂,它是抗体或其结合片段。
在某些实施方案中,本发明的药物包包括PDGF拮抗剂,它是抗体或其结合片段。在其他特定实施方案中,本发明的药物包包括PDGF拮抗剂,它是反义寡核苷酸。在这一方面的另一种实施方案中,所述PDGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。
附图简述
图1(A)是人PDGF-B的核酸序列(GenBank编号X02811)(SEQID NO:1)的示意图。
图1(B)是人PDGF-B的氨基酸序列(GenBank编号CAA26579)(SEQ ID NO:2)的示意图。
图1(C)是人PDGF-A的核酸序列(GenBank编号X06374)(SEQ ID NO:11)的示意图。
图1(D)是人PDGF-A的多肽序列(GenBank编号CAA29677)(SEQ ID NO:12)的示意图。
图2(A)是人VEGF的核酸序列(GenBank编号:NM_003376)(SEQ ID NO:3)的示意图。
图2(B)是人VEGF多肽氨基酸序列(GenBank编号NP_003367)(SEQ ID NO:4)的示意图。
图3(A)是人PDGFR-B核酸序列(GenBank编号NM_002609)(SEQ ID NO:5)的示意图。
图3(B)是人PDGFR-B多肽序列(GenBank编号NP_002600)(SEQ ID NO:6)的示意图。
图3(C)是人PDGFR-A核酸序列(GenBank编号NM_006206)(SEQ ID NO:13)的示意图。
图3(D)是人PDGFR-A多肽序列(GenBank编号NP_006197)(SEQ ID NO:14)的示意图。
图4(A)是人VEGFR-1(Flt-1)核酸序列(GenBank编号AF063657)(SEQ ID NO:7)的示意图。
图4(B)是人VEGFR-1(Flt-1)多肽序列(GenBank编号)(SEQID NO:8)的示意图。
图4(C)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)核酸序列(GenBank编号AF035121)(SEQ ID NO:9)的示意图。
图4(D)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)多肽序列(GenBank编号AAB88005)(SEQ ID NO:10)的示意图。
图5是比较对照处理(cont)、Gleevec处理(抗-PDGF剂)和MacugenTM处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)的角膜新生血管形成测定结果,与用MacugenTM和Gleevec的组合处理结果(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的图示。
图6(A)是出现在对照(PEG-处理的)小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图6(B)是出现在Gleevec-处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图6(C)是出现在MacugenTM-处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图6(D)是出现在用MacugenTM和Gleevec两者处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图7(A)是荧光显微镜图像的照片图示,表示正常的角膜脉管系统不会受到施用APB5(PDGFR抗体,抗-PDGF剂)的影响。
图7(B)是荧光显微镜图像的照片图示,表示正常的角膜脉管系统不受施用Gleevec的影响。
图7(C)是荧光显微镜图像的照片图示,表示正常的角膜脉管系统不受同时施用MacugenTM(Mac)和Gleevec的影响。
图7(D)是荧光显微镜图像的照片图示,表示正常的角膜脉管系统不受施用PEG的影响。
图8是激光诱导的脉络膜新生血管形成测定结果的图示,比较了对照处理(cont)、Gleevec处理(抗-PDGF剂)和MacugenTM处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)与用MacugenTM和Gleevec组合处理的结果(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)。
图9是激光诱导的脉络膜新生血管形成测定结果的图示,比较了对照-处理的(cont)、APB5-处理的(抗-PGFR抗体,它起着抗-PDGF剂的作用)和Macugen处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF适体)与用Macugen和APB5(Mac+APB5)组合处理的结果。
图10是视网膜发育模型结果的图示,比较了对照处理(cont)、ARC-127处理(抗-PDGF剂)和Macugen处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)与用Macugen和ARC-127组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。
图11是角膜新生血管形成测定结果的图示,比较了对照处理(cont)、ARC-127处理(抗-PDGF剂)和Macugen处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)与用Macugen和ARC-127组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。
图12(A)是出现在对照小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图12(B)是出现在ARC-127-处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图12(C)是出现在Macugen-处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图12(D)是出现在用Macugen和ARC-127处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图13是角膜新生血管形成测定结果的图示,比较了对照处理(cont)、APB-5处理(抗-PDGF剂)和Macugen处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)与用Macugen和APB-5组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。
图14是角膜新生血管形成测定结果的图示,比较了对照处理(cont)、APB-5处理(抗-PDGF剂)和Macugen-处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)与用Macugen和APB-5组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。
发明详述
在本说明书中所提到的所有文献、专利和专利申请都被收作本文参考。
定义
在本文中,以下术语和短语具有下面所具有的含义。除非另有说明,本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员所普遍了解的相同含义。
“拮抗剂”表示能部分或完全抑制靶分子的活性或产生的试剂。具体地讲,术语“拮抗剂”,在本文中选择性地使用时,表示能够降低PDGF、PDGFR、VEGF或VEGFR基因表达水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的试剂。拮抗剂的示例性形式包括,例如,蛋白、多肽、肽(如环肽)、抗体或抗体片段、肽模拟物、核酸分子、反义分子、核酶、适体、RNAi分子和小有机分子。拮抗剂抑制VEGF/VEGFR和PDGF/PDGFR配体/受体靶的示例性的非限定性机制包括抑制配体合成和/或稳定性(例如,使用靶定配体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断配体与它的同源受体的结合(例如,使用抗-配体适体、抗体或可溶性引诱同源受体)、抑制受体合成和/或稳定性(例如,使用靶定配体受体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断受体与它的同源受体的结合(例如,使用受体抗体)和阻断受体被它的同源配体的激活(例如,使用受体酪氨酸激酶抑制剂)。另外,所述拮抗剂可以直接或间接抑制靶分子。
在本文中,术语“抗体”意在包括完整的抗体,例如,任何同种型的抗体(IgG、IgA、IgM、IgE等),并且包括能够识别并且还能与脊椎动物(例如,哺乳动物)蛋白、糖类等特异性起反应的它们的片段。抗体可以使用常规技术片段化,并且以上述完整抗体相同的方式筛选这些片段的用途。因此,该术语包括抗体分子的蛋白酶剪切的片段或重组制备的部分,它能够与某些蛋白选择性地起反应。所述蛋白酶解和/或重组片段的非限定性例子包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv和单链抗体(scFv),它包括通过肽接头结合的V[L]和/或V[H]结构域。所述scFv′s可以共价或非共价连接,以便形成具有两个或两个以上结合位点的抗体。本发明包括多克隆抗体、单克隆抗体或抗体的其他纯化制剂和重组抗体。
在这里,术语“适体”,可以与术语“核酸配体”互换使用,它表示核酸,所述核酸通过它适应特殊的三维构象的能力,能结合靶分子并且对它具有拮抗作用(即,抑制)。本发明的靶是PDGF或VEGF(或它们的同源受体PDGFR或VEGFR之一),因此,使用了术语PDGF适体或核酸配体或VEGF适体或核酸配体(或PDGFR适体或核酸配体或VEGFR适体或核酸配体)。所述适体对靶的抑制可以通过下述方式进行:靶的结合,催化性改变靶,以修饰/改变靶或靶的功能活性的方式与靶起反应,作为自杀抑制剂与靶共价附着,促进靶和其他分子之间的反应。适体可以包括多个核糖核苷酸单位、脱氧核糖核苷酸单位或这两种类型核苷酸残基的混合物。适体还可以包括一个或多个修饰过的碱基、糖或磷酸酯主链单位,正如在本文中进一步描述的。
“抗体拮抗剂”表示本文所定义的抗体分子,它能阻断或显著减弱靶PDGF或VEGF的一种或多种活性。例如,VEGF抑制抗体可以抑制或减弱VEGF刺激血管发生的能力。
如果两个序列的每一个碱基都匹配,即能够形成沃森-克里克(Watson Crick)碱基对,那么一种核苷酸序列就是与另一种核苷酸序列“互补的”。术语“互补链”在这里可以与术语“互补体”互换使用。核酸链的互补体可以是编码链的互补体或非编码链的互补体。
短语“保守残基”或“保守性氨基酸取代”表示基于某些共同特性的氨基酸分组。确定独立氨基酸之间的共同特性的功能性途径是分析同源生物的相应蛋白之间的氨基酸变化的归一化频率。根据所述分析,可以确定氨基酸的组,其中,一组中的氨基酸优选能够彼此交换,因此,它们在对总的蛋白结构的影响上最彼此类似(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。以这种方式确定的氨基酸组的例子包括:
(i)带电荷的组,由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成,
(ii)带正电荷的组,由Lys、Arg和His组成,
(iii)带负电荷的组,同Glu和Asp组成,
(iv)芳族组,由Phe、Tyr和Trp组成,
(v)氮环组,由His和Trp组成,
(vi)大的脂族非极性组,由Val、Leu和Ile组成,
(vii)略微极性组,由Met和Cys组成,
(viii)小残基组,由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成,
(ix)脂族组,由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成,和
(x)小羟基组,由Ser和Thr组成。
除上面所列举的组之外,每一种氨基酸残基可以形成它自身的组,并且由单独的氨基酸形成的组可以简单地通过本领域常用的氨基酸的单字母和/或三字母的缩写来表示。
在本文中,术语“相互作用”实际上表示包括分子之间的可检测的关系或结合(例如,生物化学相互作用),如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之间的相互作用。
术语“相互作用的蛋白”表示能够与目标蛋白相互作用、结合和/或以其他方式结合的蛋白,例如,PDGF或VEGF蛋白,或它们的相应的同源受体。
在本文中,与核酸,如DNA或RNA相应的术语“分离的”,表示与存在于所述大分子天然来源中的其他DNAs或RNAs分别分离的分子。类似的,在本文中,与多肽相应的术语“分离的”表示与所述多肽的来源中存在的其他蛋白分离的蛋白分子。在本文中,术语分离的还表示在通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽,或者在通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学试剂。
“分离的核酸”表示包括核酸片段,它不是作为片段天然存在的,并且不会以天然状态被发现。术语“分离的”在这里还用于表示多肽,它是从其他细胞蛋白中分离的,并且表示包括纯化的和重组多肽两者。
在本文中,术语“标记”和“可检测标记”表示能够检测的分子,包括,但不局限于,放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(例如,生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”表示能够表现出可检测范围的荧光的物质或它的部分。可以在本发明中使用的标记的具体例子包括荧光素、若丹明、丹酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。
“基因在细胞中的表达水平”表示由所述细胞中的基因编码的mRNA,以及前-mRNA新生转录物,转录物加工中间物,成熟mRNA和降解产物的水平,以及由所述基因翻译的蛋白的水平。
在本文中,术语“核酸”表示多核苷酸,如脱氧核糖核酸(DNA),且如果合适的话,还表示核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解成包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA类似物作为等同物,以及在用于所述实施方案时,单链(有义或反义)和双链多核苷酸、ESTs、染色体、cDNAs、mRNAs和rRNAs是可以被称作核酸的分子的代表性例子。
术语“寡核苷酸”表示核苷酸或核苷单体的寡聚体或多聚体,它是由天然存在的碱基糖类和糖间(主链)键组成的。该术语还包括修饰过的或取代过的寡聚体,包括非天然存在的单体或它的部分,它们起着类似的作用。取代过的寡聚体的整合是基于多种因素的,包括增强了的细胞摄取,或增强了的核酸酶抗性,并且是根据本领域公知方法选择的。完整的寡核苷酸或者仅是它的一部分可以包括取代过的寡聚体。
术语“百分比同一性”表示两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的序列同一性。同一性可以通过比较在每一种序列上的位置确定,它们可以是为了比较而进行比对的。当比较的序列上的相同位置被相同的碱基或氨基酸所占据时,所述分子在该位置上是相同的;当相同的位点被相同或类似的氨基酸残基(例如,在空间和/或电子性质方面类似)所占据时,所述分子可以被称作在该位置上是同源的(类似的)。同源性、相似性或同一性的百分比表示由比较序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序,包括Hidden Markov Model(HMM)、FASTA和BLAST。HNiM、FASTA和BLAST可以从以下机构获得:the National Centerfor Biotechnology Information、National Library of Medicine、National Institutes of Health,Bethesda,Md.和the EuropeanBioinformatic Institute EBI。在一种实施方案中,两种序列的百分比同一性可以通过所述GCG程序确定,其缺口权重为1,例如,对每一个氨基酸缺口进行加权,就如同它是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配。用于比对的其他技术描述于以下文献中:Methods inEnzymology,vol.266:Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(1996),ed.Doolittle,Academic Press,Inc.,adivision of Harcourt Brace & Co.,San Diego,California,美国。如果需要的话,将允许序列中存在缺口的比对程序用于比对所述序列。Smith Waterman是一种类型的允许在序列比对中存在缺口的算法(参见(1997)Meth.Mol.Biol.70:173-187)。同样,采用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。包括使用HMM的更多的技术和算法描述于以下文献中:Sequence,Structure,andDatabanks:A Practical Approach(2000),ed.Oxford UniversityPress,Incorporated and in Bioinformatics:Databases and Systems(1999)ed.Kluwer Academic Publishers。另一种检索策略使用了MPSRCH软件,该软件在MASPAR计算机上运行。MPSRCH使用Smith-Watermnan算法在大量并行计算机上对序列进行评分。这种方法改善了挑选关系较远的匹配的能力,并且特别能耐受小的缺口和核苷酸序列错误。可以将核酸编码的氨基酸序列用于检索蛋白和DNA数据库。具有独立序列的数据库描述于以下文献中:Methods inEnzymology,ed.Doolittle,同上。数据库包括Genbank、EMBL和日本的DNA数据库(DDBJ)。
“完全匹配的”在表示双链体时,表示由形成所述双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此形成了双链结构,以便在每一条链上的每一个核苷酸都与另一条链上的核苷酸发生了沃森-克里克碱基配对。该术语还可以包含可以应用的核苷类似物的配对,如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷等。靶多核苷酸和寡核苷酸或多核苷酸之间的双链体的错配表示所述双链体上的一对核苷酸不能进行沃森-克里克结合。在提到三链体时,该术语表示三链体由完全配对的双链体和第三条链组成,其中,每一个核苷酸都与完全匹配的双链体上的碱基对发生了Hoogsteen或反向Hoogsteen结合。
术语“RNA干扰”、“RNAi”或“siRNA”都表示通过将一个或多个双链RNAs导入靶细胞中来减弱基因或基因产物的表达的任何方法,所述RNA与目标基因同源(特别是与目标基因,例如,PDGF或VEGF的信使RNA同源)。
多态变体还可以包括“单核苷酸多态性”(SNPs),其中,所述多核苷酸序列有一个碱基的改变(例如,在PDGF或VEGF中的一个碱基的改变)。SNPs的存在可以是,例如,某些群体、疾病状态或出现疾病状态的倾向的指标。
异常“特征(profile)”,例如,肿瘤细胞的生物学状态表示因为疾病状态而改变的细胞的各种成分的含量。细胞成分包括RNA水平、蛋白丰度水平或蛋白活性水平。
在这里,术语“蛋白”可以与术语“肽”和“多肽”互换使用。术语“重组蛋白”表示通过重组DNA技术生产的本发明的的蛋白,其中,一般将编码表达的蛋白或RNA的DNA插入合适的表达载体,该表达载体又被用于转化宿主细胞,以便产生异源蛋白或RNA。另外,短语“源于”,在关于编码重组蛋白的重组基因时,是指在“重组蛋白”的含义内,包括具有天然蛋白的氨基酸序列,或与它类似的通过突变产生的氨基酸序列的蛋白,所述突变包括天然存在的蛋白的取代和缺失。
在本文中,术语“转基因”表示核酸序列(编码例如,靶核酸之一,或它的反义转录物),业已将所述核酸序列导入了细胞。对于导入了它的转基因动物或细胞来说,转基因可以是部分或完全异源的,即,外源的,或者与导入了它的转基因动物或细胞的内源基因同源,不过,它们被设计成或已经以这样的方式插入所述动物的基因组,以便改变插入了它的细胞的基因组(例如,它被插入的位置不同于天然基因的位置,或者它的插入导致了敲除)。转基因还能够以附加体的形式存在于细胞中。转基因可以包括一个或多个转录调控序列,以及任何其他核酸,如内含子,它们可能是所选核酸的最佳表达所必需的。
“新血管疾病”表示以改变了的或不受调控的血管发生为特征的疾病,其中伴随着致癌性或致瘤性转化的疾病,即,癌症除外。新血管疾病的例子包括银屑病、类风湿性关节炎和眼新血管疾病,包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性。
在本文中,术语“新生血管形成”和“血管发生”可以互换使用。新生血管形成和血管发生表示产生新血管进入细胞、组织或器官。血管发生的控制通常在某些疾病状态中发生改变,并且,在很多场合下,与所述疾病相关的病理学损伤与改变了的、不受调控的或不受控制的血管发生相关。持久的、不受调控的血管发生出现在多种疾病状态中,包括以内皮细胞异常生长为特征的疾病,并且支持在这些状况中出现的病理学损伤,包括血管的泄漏和通透性。
“眼新血管疾病”是以患者眼中改变了的或不受调控的血管发生为特征的疾病。实例性的眼新血管疾病包括视神经盘新生血管形成、虹膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、绿内障、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管原性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎、视网膜炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变。
术语“治疗”受试者的新血管疾病或“治疗”患有新血管疾病的受试者表示让所述受试者接受药物治疗,例如,施用药物,以便减弱新血管疾病的至少一种症状。因此,在本文中,术语“治疗”意在包括治愈和改善新血管状况或疾病的至少一种症状。因此,在本文中,“治疗”包括施用或开处药用组合物,用于治疗或预防眼新血管疾病。
“患者”表示任何动物。术语“动物”包括哺乳动物,包括,但不局限于人和其他灵长类。该术语还包括家畜,如牛、猪、羊、马、狗和猫。
“PDGF”或“血小板衍生生长因子”表示能影响血管发生或血管生成过程的哺乳动物血小板衍生生长因子。在本文中,术语“PDGF”包括PDGF的各种亚型,包括PDGF-B(参见图1(A)和(B))和PDGF-A(参见图1(C)和(D))。另外,在本文中,术语“PDGF”表示PDGF-相关的血管生成因子,如PDGF-C和PDGF-D,它们通过同源PDGF受体起作用,刺激血管发生或血管生成过程。具体地讲,术语“PDGF”表示生长因子种类的任何成员,它能够(i)与诸如PDGFR-B(参见图3(A)和(B))或PDGFR-A(参见图3(C)和(D))的PDGF受体结合;(ii)激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性;和(iii)从而影响血管发生或血管生成过程。在本文中,术语“PDGF”一般表示生长因子种类的以下成员,它能通过结合并且激活反应性细胞类型上的血小板衍生生长因子细胞表面受体(即,PDGFR)来诱导DNA合成和有丝分裂发生。PDGFs能实现的特殊生物学作用包括,例如:定向细胞迁移(趋化性)和细胞激活;磷脂酶激活;增强了的磷脂酰肌醇周转和前列腺素代谢;刺激反应性细胞的胶原和胶原酶合成;改变细胞代谢活性,包括基质合成,细胞因子产生,和脂蛋白吸收;在缺少PDGF受体的细胞中增殖性反应的间接诱导;和有效的血管收缩活性。术语“PDGF”表示包括“PDGF”多肽及其相应的“PDGF”编码基因或核酸。
“PDGF-A”表示PDGF的A链多肽及其相应的编码基因或核酸。
“PDGF-B”表示PDGF的B链多肽及其相应的编码基因或核酸。
“VEGF”或“血管内皮生长因子”表示能影响血管发生或血管生成过程的哺乳动物血管内皮生长因子。在本文中,术语“VEGF”包括VEGF的各种亚型(又被称作血管通透因子(VPF)和VEGF-A)(参见图2(A)和(B)),它们是通过例如,VEGF-A/VPF基因的可变剪接产生的,包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。另外,在本文中,术语“VEGF”表示VEGF-相关的血管生成因子,如PIGF(胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E,它们通过同源VEFG受体起作用,刺激血管发生或血管生成过程。具体地讲,术语“VEGF”表示生长因子种类的任何成员,它能(i)与诸如VEGFR-1(Flt-1)(参见图4(A)和(B))、VEGFR-2(KDR/Flk-1)(参见图4(C)和(D))或VEGFR-3(FLT-4)的VEGF受体结合;(ii)激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性;和(iii)从而影响血管发生或血管生成过程。术语“VEGF”意在包括“VEGF”多肽及其相应的“VEGF”编码基因或核酸。
“PDGF拮抗剂”表示能够部分或完全减弱,或抑制PDGF活性或产生的试剂。PDGF拮抗剂能够直接或间接减少或抑制特殊的PDGF,如PDGF-B。另外,与上述“拮抗剂”的定义一致的“PDGF拮抗剂”可以包括能够作用于PDGF配体或它的同源受体,从而减弱或抑制PDGF-相关的受体信号的试剂。因此,所述“PDGF拮抗剂”的例子包括,例如:靶定PDGF核酸的反义、核酶或RNAi组合物;抗-PDGF适体、抗-PDGF抗体或可溶性PDGF受体诱饵,其能防止PDGF与它的同源受体结合;靶定同源PDGF受体(PDGFR)核酸的反义、核酶或RNAi组合物;抗-PDGFR适体或抗-PDGFR抗体,其能结合同源PDGFR受体;和PDGFR酪氨酸激酶抑制剂。
“VEGF拮抗剂”表示能部分或完全减弱或抑制VEGF活性或产生的试剂。VEGF拮抗剂能够直接或间接减弱或抑制特殊的VEGF,如VEGF165。另外,与上述“拮抗剂”定义一致的“VEGF拮抗剂”可以包括能够作用于VEGF配体或它的同源受体,从而减弱或抑制VEGF-相关的受体信号的试剂。因此,所述“VEGF拮抗剂”的例子包括,例如:靶定VEGF核酸的反义、核酶或RNAi组合物;抗-VEGF适体、抗-VEGF抗体或可溶性VEGF受体诱饵,其能防止VEGF与它的同源受体结合;靶定同源VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶或RNAi组合物;能结合同源VEGFR受体的抗-VEGFR适体或抗-VEGFR抗体;和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
“足以抑制新血管疾病的量”表示在本发明组合中用于治疗或预防新形成疾病或它的症状所必需的拮抗剂的有效量。用于实施本发明用来治疗性治疗由新血管疾病导致或造成所述新血管疾病的状况的活性拮抗剂的“有效量”根据施用方式、新血管疾病的解剖学部位、患者的年龄、体重和一般健康状况而改变。最后,医生或兽医决定合适的量和剂量方案。所述量被称作足以抑制新血管疾病的量。
通过以下详细说明和权利要求书,可以了解本发明的其他特征和优点。
多肽X的“变体”表示具有肽X的氨基酸序列的多肽,其中,有一个或多个氨基酸残基发生了改变。所述变体可以具有“保守性”改变,其中,取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如,用异亮氨酸取代亮氨酸)。更罕见的是,变体可能具有“非保守性”改变(例如,用色氨酸取代甘氨酸)。类似的微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入,或这两者。决定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而又不消除生物学或免疫学活性的指南可以使用本领域所熟知的计算机程序发现,例如,LASERGENE软件(DNASTAR)。
术语“变体”,在用于表示多核苷酸序列时,可以包括与基因或它的编码序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括,例如,“等位基因的”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可以与参考分子具有显著同一性。不过,由于在mRNA加工期间外显子的可变剪接,一般具有更多或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可以具有额外的功能结构域,或者缺少所述结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。一般,所得到的多肽彼此具有显著的氨基酸同一性。多态变体是特定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。
术语“载体”表示能够转运与它连接的其他核酸的核酸分子。一种类型的有用的载体是附加体,即,能够进行染色体外复制的核酸。有用的载体是能够自主复制和/或表达与它连接的核酸的载体。能够指导可操作地与它连接的基因的表达的载体在本文中被称作“表达载体”。一般,可用于重组DNA技术中的表达载体通常是“质粒”形式的,它一般表示环状双链DNA环,在它们的载体形式中,它们不与染色体结合。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是载体的最常使用的形式。不过,本发明意在包括这样的其他形式的表达载体,它们发挥等同的功能,并且它们随后为本领域所公知。
组合治疗
本发明部分基于VEGF和PDGF活性的特殊抑制作用,其中使用合适的生长因子拮抗剂作为有效的治疗手段,用于治疗患有新血管疾病的患者。PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合施用,提供了治疗眼新血管疾病的比单独施用任意一种拮抗剂更高的治疗益处。鉴于证明这两种因子在刺激视网膜内皮细胞系统的血管发生方面没有表现出显著的协同作用的研究,抗-VEGF和抗-PDGF剂的组合作用是出乎意料的(参见Castellon等,(2001)Exp.Eye Res.74:523-35)。
PDGF和VEGF是新血管在身体,特别是在眼中生长的重要刺激物。为了抑制PDGF和VEGF生物学活性而进行的组合治疗提供了用于治疗或预防新血管疾病的方法。
因此,本发明涉及使用组合治疗抑制新血管疾病的方法和组合物。具体地讲,本发明利用在血管细胞中起作用的两种不同的细胞间通讯信号传导途径,即PDGF和VEGF信号传导,作为新血管疾病,如眼新血管疾病的治疗靶。这种组合方法特别可用于治疗任何数目的以眼新生血管形成的发展为标志的眼科学疾病或病症,包括,但不局限于,视神经盘新生血管形成、虹膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、绿内障、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、血管原性视网膜病、视网膜变性、黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变。所述组合治疗,由抑制PDGF(如PDGF-B)和VEGF(如VEGF-A)信号传导的拮抗剂组成,与单独使用这两种治疗相比,产生了增强了的治疗功效。尽管在下面讨论的例子,描述了单一PDGF拮抗剂和单一VEGF拮抗剂的组合,但可以理解的是,多种拮抗剂的组合可能是所需的。
根据本发明的抗-PDGF和抗-VEGF组合治疗可以单独进行,或者与其他治疗组合进行,并且可以在家庭、医务室、诊所、医院门诊室或医院提供。治疗一般在医院开始,从而医生能够密切观察治疗效果,并且进行任何需要的调整。组合治疗持续时间取决于接受治疗的新血管疾病的类型、患者的年龄和状况、患者疾病的阶段和类型以及患者对治疗的反应。另外,有发展为新血管疾病的较大风险的人(例如,糖尿病患者)可以接受治疗,以抑制或延缓症状的发作。本发明所提供的一个显著优点是,将PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合用于治疗新血管疾病,使得能够施用低剂量的每一种拮抗剂,和较少的总的活性拮抗剂,因此以较低的毒性和副作用以及低成本提供了相似的功效。
所述组合的每一种成分的施用剂量和频率可以独立地控制。例如,一种拮抗剂可以每天施用三次,而第二种拮抗剂可以每天施用一次。组合治疗能够以断断续续的循环形式提供,它包括静止时间段,以便患者身体有机会从任何尚无法预料的副作用中恢复。所述拮抗剂还可以一起制备,以便一次施用能够送递两种拮抗剂。
PDGF和VEGF拮抗剂靶
PDGF最初是从血小板裂解物分离的,并且被确定为存在于血清而不是血浆中的主要生长促进活性。首先显示PDGF的促有丝分裂活性作用在结缔组织细胞上,如成纤维细胞和平滑肌细胞,并且存在于培养物中的神经胶质细胞中。业已鉴定了两种同源PDGF同工型,PDGF A和B,它们是由独立的基因(位于7号和22号染色体上)编码的。来自血小板的最主要的种类是AB异源二聚体,尽管所有三种可能的二聚体(AA、AB和BB)都是天然存在的。在翻译之后,PDGF二聚体被加工成大约30kDa的分泌蛋白。
业已鉴定了以高亲和力结合PDGF的两种细胞表面蛋白,α和β(Heldin等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)78:3664;Williams等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:5867)。这两个种类都包括五个免疫球蛋白-样细胞外结构域、一个跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域,该结构域是由激酶插入结构域隔开的。在过去几年中,业已阐明了三种PDGF同工型对三种受体二聚体(α/α、α/β和β/β)的特异性。α-受体同源二聚体能以高的亲和力结合所有三种PDGF同工型,β-受体同源二聚体只能以高的亲和力结合PDGF BB,而结合PDGF AB的亲和力低大约10倍,并且α/β-受体异源二聚体能够以高亲和力结合PDGF BB和PDGF AB(Westermark & Heldin(1993)Acta Oncologica 32:101)。所述特异性模式似乎是由于A-链只能结合α-受体,而B-链能以高亲和力结合α和β-受体亚基两者的能力造成的。
总的来说,本发明提供了能够抑制一种或多种PDGF活性的试剂。这些PDGF-抑制剂,或PDGF拮抗剂能够作用于一种或多种形式的所述PDGF配体。血小板衍生生长因子包括A-链(PDGF-A)和B-链(PDGF-B)的同源或异源二聚体,它们通过结合两种相关的受体酪氨酸激酶,[α]-受体(PDGFR-[α])和[β]-受体(PDGFR-[β])并且使其二聚化发挥作用。另外,业已鉴定了所述PDGFR复合物的两种新的蛋白酶激活配体,PDGF-C和PDGF-D(参见Li等,(2000)Nat.Cell.Biol.2:302-9;Bergsten等,(2001)Nat.Cell.Biol.3:512-6;和Uutele等,(2001)Circulation 103:2242-47)。由于所述PDGFRs的不同的配体结合特异性,已知PDGFR-[α][α]能结合PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-CC;PDGFR-[β][β]能结合PDGF-BB和PDGF-DD;而PDGFR-[α][β]能结合PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD(参见Betsholtz 等,(2001)BioEssays 23:494-507)。
VEGF是分泌的二硫键连接的同源二聚体,它能选择性地刺激内皮细胞增殖,迁移,并且产生基质降解酶(Conn等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87:1323-1327);Ferrara和Henzel(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.161:851-858);Pepper等,(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:902-906;Unemori等,(1992)J.Cell.Physiol.153:557-562),它们都是形成新血管所需要的过程。VEGF以四种形式(VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189、VEGF-206)存在,这是由于VEGF基因的可变剪接产生的(Houck等,(1991)Mol. Endocrinol. 5:1806-1814;Tischer等,(1991)J.Biol.Chem.266:11947-11954)。两种较小的形式是可扩散的,而较大的两种形式保持主要位于细胞膜上,这是它们对肝素高亲和力的结果。VEGF-165还能与肝素结合,并且是最丰富的形式。VEGF-121,即不能与肝素结合的唯一形式,似乎对VEGF受体具有较低的亲和力(Gitay-Goren等,(1996)J.Biol.Chem.271:5519-5523)以及较低的促有丝分裂效力(Keyt等,(1996)J.Biol. Chem.271:7788-7795)。VEGF的生物学作用是由两种酪氨酸激酶受体(Flt-1和Flk-1/KDR)介导的,它们的表达在很大程度上局限于内皮来源的细胞(de Vries等,(1992)Science 255:989-991;Millauer等,(1993)Cell 72:835-846;Terman等,(1991)Oncogene 6:519-524)。尽管两种功能性受体的表达都是高亲和力结合所必需的,但内皮细胞内的趋化性和促有丝分裂信号传导似乎主要是通过KDR受体进行的(Park等,(1994)J.Biol.Chem.269:25646-25654;Seetharam等,(1995)Oncogene 10:135-147;Waltenberger等,(1994)J.Biol.Chem.26988-26995)。最近业已在缺少VEGF基因的单个等位基因(Carmeliet等,(1996)Nature 380:435-439;Ferrara等,(1996)Nature 380:439-442)或Flt-1的两个等位基因(Fong等,(1995)Nature 376:66-70)或Flk-1基因(Shalaby等,(1995)Nature 376:62-66)的小鼠体内证实了VEGF和VEGF受体对血管发育的重要性。在每一种场合下,都发现血管形成的明显的异常导致了胚胎致死。
现在已知由组织缺氧诱导的补偿性血管生成是通过VEGF介导的(Levy等,(1996)J.Biol.Chem.2746-2753);Shweiki等,(1992)Nature 359:843-845)。在人类中所做的研究业已表明,在血管生成性视网膜疾病的玻璃体中存在高浓度的VEGF,但是在无活性的或非-新生血管形成疾病状态中不存在所述高浓度的VEGF。在实验黄斑下手术之后切断的人类脉络膜组织同样表现出高的VEGF水平。
除了是唯一的已知内皮细胞特异性有丝分裂原之外,VEGF是血管生成生长因子中独特的,表现在它在诱导血管对大分子的通透性瞬时增加的能力方面(因此,它的最初的和替代的名称是血管通透因子,VPF)(参见Dvorak等,(1979)J.Immunol.122:166-174;Senger等,(1983)Science 219:983-985;Senger等,(1986)Cancer Res.46:5629-5632)。增加了的血管通透性和所导致的血浆蛋白在血管外间隙的沉积,有助于通过提供内皮细胞迁移的临时基质形成新血管(Dvorak等,(1995)Am.J.Pathol.146:1029-1039)。通透性过高确实是新血管的特有特征,包括与肿瘤相关的血管。
PDGF和VEGF拮抗剂
概要
本发明提供了一起用于新血管疾病的组合治疗的PDGF和VEGF的拮抗剂(即,抑制剂)。特异性PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂为本领域所公知,并且简单地描述于以下部分。现在或者已经是技术人员能够得到的其他PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂包括抗体、适体、反义寡聚体、核酶和RNAi组合物,它们能够通过本领域的常规实践结合本说明书的教导和指导鉴定和生产,包括在下面进一步提供的部分。
PDGF拮抗剂
一般,PDGF(例如,PDGF-B)的抑制可以通过多种方式实现。例如,可以获得能抑制PDGF的活性或产生的多种PDGF拮抗剂,并且可将其用于本发明的方法。示例性的PDGF拮抗剂包括PDGF的核酸配体或适体,如在下文中所描述的。另外,所述PDGF拮抗剂可以是,例如,抗-PDGF抗体或抗体片段。因此,通过抑制它与受体的结合可以使所述PDGF分子失活。另外,能在核酸水平上抑制PDGF表达的诸如反义RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本发明的拮抗剂。其他PDGF拮抗剂包括肽、蛋白、环肽或小有机化合物。另外,通过破坏它的下游信号传导,能够抑制PDGF的信号传导活性,例如,通过使用多种小分子酪氨酸激酶抑制性拮抗剂,包括下面所描述的拮抗剂。化合物或试剂起着PDGF拮抗剂作用的能力可以按照本领域已知的方法确定,且另外,可以参见以下文献,例如,Dai等,(2001)Genes & Dev.15:1913-25;Zippel,等,(1989)Eur.J.Cell Biol.50(2):428-34;和Zwiller,等,(1991)Oncogene6:219-21。
本发明还包括本领域所公知的PDGF拮抗剂,以及下文所支持的,以及属于普通技术人员知识范围内的任何和所有等同试剂。例如,抗PDGF的抑制性抗体为本领域所公知,例如,描述于美国专利号5,976,534、5,833,986、5,817,310、5,882,644、5,662,904、5,620,687、5,468,468和PCT WO 2003/025019中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。另外,本发明包括N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物,它是PDGF拮抗剂,例如公开于美国专利号5,521,184和WO2003/013541、WO 2003/078404、WO 2003/099771、WO 2003/015282和WO 2004/05282中的那些,所述文献被以全文形式收作本文参考。
能阻断PDGF作用的小分子为本领域所公知,例如,描述于美国专利号6,528,526(PDGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6,524,347(PDGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6,482,834(PDGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6,472,391(PDGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6,696,434、6,331,555、6,251,905、6,245,760、6,207,667、5,990,141、5,700,822、5,618,837和5,731,326中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。
能阻断PDGF作用的蛋白和多肽为本领域所公知,例如,描述于美国专利号6,350,731(PDGF肽类似物)、5,952,304中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。
能抑制EGF和/或PDGF受体酪氨酸激酶的双单-和双环芳基和杂芳基化合物为本领域所公知,例如,描述于例如美国专利号5,476,851、5,480,883、5,656,643、5,795,889和6,057,320中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。
用于抑制PDGF的反义寡核苷酸为本领域所公知,例如,描述于美国专利号5,869,462和5,821,234中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
用于抑制PDGF的适体(又被称作核酸配体)为本领域所公知,例如,描述于例如美国专利号6,582,918、6,229,002、6,207,816、5,668,264、5,674,685和5,723,594中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
本领域所公知的用于抑制PDGF的其他化合物包括,描述于美国专利号5,238,950、5,418,135、5,674,892、5,693,610、5,700,822、5,700,823、5,728,726、5,795,910、5,817,310、5,872,218、5,932,580、5,932,602、5,958,959、5,990,141、6,358,954、6,537,988和6,673,798中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
VEGF拮抗剂
VEGF(例如,VEGF-A)的抑制是通过多种方式实现的。例如,能抑制VEGF活性或产生的多种VEGF拮抗剂,包括核酸分子,如适体、反义RNA、核酶、RNAi分子和VEGF抗体可以获得,并且能够用于本发明的方法中。示例性的VEGF拮抗剂包括VEGF的核酸配体或适体,正如下文所描述的。对VEGF-A的特别有用的拮抗剂是EYE001(以前称为NX1838),它是修饰过的、PEG化的适体,它能以高的和特异性亲和力结合主要的可溶性人VEGF同工型(参见,美国专利号6,011,020;6,051,698;和6,147,204)。所述适体能够以与针对VEGF的高亲和力抗体类似的方式结合并且使VEGF失活。另一种有用的VEGF适体是EYE001,它是非-PEG化的形式的。另外,所述VEGF拮抗剂可以是,例如,抗-VEGF抗体或抗体片段。因此,通过抑制它与受体结合使VEGF分子失活。另外,能在核酸水平上抑制VEGF表达或RNA稳定性的诸如反义RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本发明的方法和组合物中的拮抗剂。其他VEGF拮抗剂包括肽、蛋白、环肽和小有机化合物。例如,能结合VEGF受体而又无伴随的信号传导活性的可溶性截短形式的VEGF也可用作拮抗剂。另外,VEGF的信号传导活性可以通过破坏它的下游信号传导抑制,例如,通过使用多种拮抗剂,包括VEGF受体酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂,正如下文所进一步描述的。
化合物或试剂起着VEGF拮抗剂作用的能力,可以按照本领域所熟知的多种标准方法确定。例如,VEGF的生物学活性之一是通过与血管内皮细胞上的受体结合来增强血管通透性。所述相互作用导致了紧密的内皮连接的松弛,其后果是造成血管流体的泄漏。通过VEGF诱导的血管泄漏可以在体内测量,其通过跟踪由于皮内注射VEGF导致的伊文思蓝染料从豚鼠脉管系统的泄漏来进行(Dvorak等,inVascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor,Microvascular Hyperpermeability,and Angiogenesis,和(1995)Am.J.Pathol.146:1029)。类似地,可以将所述测定方法用于测量拮抗剂阻断VEGF的这种生物学活性的能力。
在血管通透性测定的有用的例子中,VEGF165(20-30nM)与EYE001(30nM-1μM)或候选VEGF拮抗剂离体(ex vivo)预混合,并且随后通过皮内注射施用到豚鼠背部的剔毛的皮肤中。在注射之后30分钟,按照标准方法对注射部位周围的伊文思蓝染料泄漏进行定量,其通过使用计算机化的形态度量分析系统实现。能抑制VEGF-诱导的指示染料从脉管系统中泄漏的化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用拮抗剂。
用于确定化合物是否是VEGF拮抗剂的另一种测定方法是所谓的角膜血管发生测定。在该测定方法中,将含有VEGF165(3pmol)的methacyrate聚合物沉淀植入大鼠的角膜基质中,以诱导血管生长进入正常的无血管角膜。然后将候选VEGF拮抗剂通过静脉内途径施用到大鼠体内,剂量为1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg,每天一次或两次,施用5天时间。在治疗时间段结束时,对所有个体的角膜进行显微照相。新血管在角膜组织中发育的程度,以及候选化合物对它们的抑制作用,随后通过显微照片的标准化形态度量分析进行定量。与用磷酸缓冲盐水(PBS)处理相比,能抑制角膜中VEGF-依赖型血管发生的化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用的拮抗剂。
还使用早熟性视网膜病的小鼠模型鉴定了候选VEGF拮抗剂。在一个有用的例子中,分别将9、8、8、7和7只小鼠同窝崽放置在室内空气中或者增加含氧量,并且通过腹膜内用磷酸缓冲盐水(PBS)或候选VEGF拮抗剂进行处理(例如,以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg/天进行处理)。然后通过在来自所有处理过的和对照小鼠的每只眼的20个组织学切片中进行显微镜鉴定和新血管芽计数来估计测定终点,即新毛细血管通过角膜的内界膜长出到玻璃体液中。相对未处理过的对照而言处理过的小鼠的视网膜新脉管系统的减少被确定为鉴定有用的VEGF拮抗剂。
在另一种示例性的筛选测定方法中,使用体内人类肿瘤异种移植测定鉴定候选VEGF拮抗剂。在这种筛选测定中,在植入裸鼠中的人类肿瘤异种移植物(A673横纹肌肉瘤和Wilms肿瘤)中检测候选VEGF拮抗剂的体内功效。然后用候选VEGF拮抗剂处理小鼠(例如,10mg/kg,每天腹膜内施用一次,然后发展为确定的肿瘤(200mg))。用对照试剂处理对照组。被确定为相对对照而言能抑制A673横纹肌肉瘤生长和Wilms肿瘤的候选化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用的拮抗剂。
测定VEGF拮抗剂活性的其他方法为本领域所公知,并且在下文进一步描述。
本发明还包括本领域所公知的VEGF拮抗剂,以及下面所支持的那些,和普通技术人员知识范围内的任何和所有等同试剂。例如,针对VEGF的抑制抗体为本领域所公知,例如,描述于美国专利号6,524,583、6,451,764(VRP抗体)、6,448,077、6,416,758、6,403,088(针对VEGF-C)、6,383,484(针对VEGF-D)、6,342,221(抗-VEGF抗体)、6,342,219、6,331,301(VEGF-B抗体)和5,730,977,和PCT公开号WO 96/30046、WO 97/44453和WO 98/45331中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。
VEGF受体的抗体同样为本领域所公知,例如,描述于例如美国专利号5,840,301、5,874,542、5,955,311、6,365,157和PCT公开号WO 04/003211中的那些,所述文献内容被以全文形式收作本文参考。
通过例如抑制VEGFR-相关的酪氨酸激酶活性阻断VEGF的作用的小分子为本领域所公知,例如,描述于美国专利号6,514,971、6,448,277、6,414,148、6,362,336、6,291,455、6,284,751、6,177,401、6071,921和6001,885(VEGF表达的类视黄醇抑制剂)中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
能阻断VEGF的作用的蛋白和多肽为本领域所公知,例如,描述于美国专利号6,576,608、6,559,126、6,541,008、6,515,105、6,383,486(VEGF引诱受体)、6,375,929(VEGF引诱受体)、6,361,946(VEFG肽类似物抑制剂)、6,348,333(VEGF引诱受体)、6,559,126(能结合VEGF并且阻断与VEGFR结合的多肽)、6,100,071(VEGF引诱受体)和5,952,199中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
能够介导对VEGF和/或VEGFR基因表达和/或活性的RNA干扰(RNAi)的短的干扰核酸(siNA)、短的干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微型RNA(miRNA)和短的发夹RNA(shRNA)为本领域所公知,例如,描述于PCT公开号WO 03/070910中的那些,所述文献的内容以全文形式收作本文参考。
用于抑制VEGF的反义寡核苷酸为本领域所公知,例如,描述于,例如,美国专利号5,611,135、5,814,620、6,399,586、6,410,322和6,291,667中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
用于抑制VEGF的适体(又被称作核酸配体)为本领域所公知,例如,描述于,例如,美国专利号6,762,290、6,426,335、6,168,778、6,051,698和5,859,228中的那些,每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。
抗体拮抗剂
本发明包括针对PDGF和VEGF以及它们的同源受体PDGFR和VEGFR的拮抗剂抗体。本发明的抗体拮抗剂能够阻断配体与它的同源受体结合。因此,本发明的PDGF拮抗剂抗体包括针对PDGF以及PDGFR靶的抗体。
本发明的拮抗剂抗体包括单克隆抑制抗体。单克隆抗体,或其片段,包括所有免疫球蛋白类型,如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其亚型,如IgG亚型或其混合物。IgG及其亚型是有用的,如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgGM。所述IgG亚型IgG1/kappa和IgG2b/kapp被作为有用的实施方案。可以提到的片段都是截短的或修饰过的抗体片段,具有一个或两个抗原互补结合部位,它表现出针对哺乳动物PDGF或VEGF(或它们的同源受体)的高的结合和中和活性,如部分抗体具有相当于所述抗体的结合部位,并且是由轻链和重链形成的,如Fv、Fab或F(ab′)2片段,或单链片段。截短的双链片段,如Fv、Fab或F(ab′)2是特别有用的。例如,所述片段可以通过酶促方法通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶消除所述抗体的Fc部分,通过化学氧化或通过对抗体基因进行遗传学操作获得。同样可能并且有利的是使用遗传学操作的、非截短的片段。所述抗-PDGF或VEGF抗体或其片段可以单独使用或以混合物使用。
所述新型抗体、抗体片段、它们的混合物或衍生物对PDGF或VEGF(或它们的同源受体)的结合亲和力有利地在1×10-7M-1×10-12M,或1×10-8M-1×10-11M,或1×10-9M-5×10-10M范围内。
例如,用于遗传操作的抗体基因可以以本领域技术人员公知的方式从杂交瘤细胞中分离,为此,培养抗体生产性细胞,并且当细胞的光密度足够时,用已知方式从所述细胞中分离mRNA,其通过用硫氰酸胍裂解细胞,用乙酸钠酸化,用苯酚、氯仿/异戊醇提取,用异丙醇沉淀,并且用乙醇洗涤来实现。然后用mRNA通过使用逆转录酶合成cDNA。合成的cDNA可以直接或者在遗传操作之后插入合适的动物、真菌、细菌或病毒载体中,并且在合适的宿主生物中表达,所述遗传操作为例如,定点诱变,导入插入、倒位、缺失或碱基交换。有用的细菌或酵母载体是pBR322、pUC18/19、pACYC184、λ或酵母μ载体,用于克隆所述基因,并且在诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌或诸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母中表达。
本发明还涉及能合成PDGF或VEGF抗体的细胞。所述细胞包括按上述方法转化过的动物、真菌、细菌细胞或酵母细胞。它们有利地是杂交瘤细胞或三体瘤(trioma)细胞,通常是杂交瘤细胞。例如,所述杂交瘤细胞可以通过已知方式从用PDGF或VEGF(或它们的同源受体)免疫的动物生产,并且分离它们的产生抗体的B细胞,筛选这些细胞的PDGF或VEGF-结合抗体,并且随后使这些细胞与,例如,人或动物,例如,小鼠骨髓瘤细胞、人类淋巴母细胞或异种杂交瘤细胞融合(参见,例如,Koehler等,(1975)Nature 256:496),或通过用合适的病毒感染所述细胞,以便产生无限增殖化细胞系。通过融合产生的杂交瘤细胞系是有用的,并且小鼠杂交瘤细胞系是特别有用的。本发明的杂交瘤细胞系能分泌IgG类型的有用抗体。本发明的mAb抗体能够以高亲和力结合,并且减弱或中和PDGF或VEGF的生物学(例如,血管生成)活性。
本发明还包括所述抗-PDGF或VEGF抗体的衍生物,它们保留了它们的PDGF或VEGF-抑制活性,同时改变了与将它们用作药物试剂相关的一种或多种其他特性,例如,血清稳定性或生产的效力。所述抗-PDGF或VEGF抗体衍生物的例子包括肽,由抗体的抗原结合区衍生的肽模拟物(peptidomimetics),和与固体或液体载体结合的抗体、抗体片段或肽,所述载体如聚乙二醇,玻璃,合成聚合物,如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯或天然聚合物,如纤维素、Sepharose或琼脂糖,或与酶、毒素或放射性或非放射性标记,如3H、123I、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、55Fe、59Fe、90y、99mTc、75Se的缀合物或与荧光/化学发光标记共价结合的抗体、片段或肽,所述标记如若丹明、荧光素、异硫氰酸盐、藻红蛋白、藻蓝蛋白、荧光胺、金属螯合物、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素。
所述新型抗体、抗体片段、其混合物及衍生物可以直接地,在干燥之后,例如冷冻干燥之后,在与上述载体附着之后或在与其他药用活性和辅助物质配制之后用于生产药用制剂。可以提及的活性和辅助物质的例子是其他抗体,具有杀微生物或抑微生物作用的抗微生物活性物质,一般如抗生素或磺胺、抗肿瘤剂、水、缓冲剂、盐水、醇、脂肪、蜡、惰性媒介物或其他常规用于肠胃外产品的其他物质,如氨基酸、增稠剂或糖。所述药用制剂可用于控制疾病,并且可用于控制眼新血管疾病和包括AMD和糖尿病性视网膜病的疾病。
所述新型抗体、抗体片段、其混合物或衍生物可以直接或者在与上述固体或液体载体、酶、毒素、放射性或非放射性标记或与荧光/化学发光标记结合之后用于治疗或诊断。
本发明的人PDGF或VEGF单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法获得。例如,用人PDGF或VEGF(或它们的同源受体)对哺乳动物进行免疫。纯化的人PDGF和VEGF可以通过商业渠道获得(例如,从Cell Sciences,Norwood,MA,以及其他供应商那里购买)。另外,人PDGF或VEGF(或它们的同源受体)可以用人胎盘组织方便地纯化。用于产生抗-人PDGF或VEGF抗体的哺乳动物不受限制,并且可以是灵长类、啮齿类(如小鼠、大鼠或兔子)、牛、绵羊、山羊或狗。
然后,将产生抗体的细胞,如脾细胞从免疫的动物体内取出,并且与骨髓瘤细胞融合。所述骨髓瘤细胞为本领域所熟知(例如,可以使用p3x63-Ag8-653、NS-0、NS-1或P3U1细胞)。细胞融合操作可以通过本领域所公知的任何常规方法完成。
在进行了细胞融合操作之后的细胞随后在HAT选择培养基中培养,以选择杂交瘤。然后筛选能产生抗人单克隆抗体的杂交瘤。例如,这种筛选可以通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)或类似方法进行,其中,让产生的单克隆抗体与固定了人PDGF或VEGF(或它们的同源受体)的孔结合。在这种场合下,可以采用对免疫过的动物的免疫球蛋白特异的抗体作为第二抗体,所述抗体是用酶,如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶等标记过的。可以通过让所述标记酶与它的底物起反应并且测量所产生的颜色来检测所述标记。作为底物,可以生产3,3-二氨基联苯胺、2,2-二氨基双邻联茴香胺、4-氯萘酚,4-氨基安替比林、邻苯二胺等。
通过上述操作,可以筛选能产生抗-人PDGF或VEGF抗体的杂交瘤。然后通过常规有限稀释方法或软琼脂方法克隆所选择的杂交瘤。如果需要的话,可以使用含血清的或不含血清的培养基大规模培养所述克隆的杂交瘤,或者可以接种到小鼠腹腔内,并且从腹水中回收,从而可以获得大量的克隆的杂交瘤。
然后从所述选择的抗-人PDGF或VEGF单克隆抗体中选择具有防止相应的配体/受体对的结合和激活(例如,在基于细胞的PDGF或VEGF测定系统中(参见上文))的能力的单克隆抗体用于进一步分析和操作。如果所述抗体阻断受体/配体结合和/或激活的话,这意味着实验的单克隆抗体具有减弱或中和人PDGF或VEGF的PDGF或VEGF活性的能力。就是说,所述单克隆抗体能特异性地识别和/或干扰人PDGF或VEGF(或它们的同源受体)的关键结合部位。
本发明的单克隆抗体还包括通过如下方法产生的杂交和重组抗体:剪接抗-PDGF或VEGF抗体的可变(包括高变)结构域与恒定结构域(例如,“人源化的”抗体),或轻链与重链,或来自一种物种的链与来自另一种物种的链,或融合体与异源蛋白,而不管来源物种或免疫球蛋白类型或亚型的名称,以及抗体片段[例如,Fab、F(ab)2和Fv],只要它们具有希望的生物学活性就行。[参见例如,美国专利号4,816,567和Mage&Lamoyi,in Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,PP.79-97(Marcel Dekker,Inc.),New York(1987)]。
因此,术语“单克隆的”表示所获得的抗体的性质是来自抗体的基本上均匀的群体,并且不被理解成必须通过任何特定方法生产抗体。例如,要用于本发明中的单克隆抗体可以通过最初由Kohler &Milstein,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备,或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。″单克隆抗体“还可以从利用在以下文献中描述的技术制备的噬菌体文库中分离:例如,McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)。
非人(例如,鼠类)抗体的“人源化的”形式是特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab)2或抗体的其他抗原结合亚序列),它包括来自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体),其中,来自受体抗体的互补决定区(CDRs)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔子的CDRs的残基所取代,它具有所需要的特异性、亲和力和能力。在某些场合下,人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人FR残基所取代。另外,人源化抗体可以包括既不存在于受体抗体中,又不存在于输入的CDR或FR序列中的残基。进行上述修饰是为了进一步改进并且最优化抗体的特性。一般,人源化抗体基本上包括至少一种,通常两种可变结构域的全部,其中,CDR区的全部或基本上全部都相当于非人免疫球蛋白的CDR区,而FR残基的全部或基本上全部都相当于人免疫球蛋白共有序列的FR残基。所述人源化抗体最优地还包括免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区。
人源化非人抗体的方法为本领域所熟知。一般,将来自非人来源的一个或多个氨基酸残基导入人源化抗体。所述非人氨基酸残基通常被称作“输入”残基,它通常来自“输入”可变结构域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法进行(Jones等,(1986)Nature321:522-525;Riechmann等,(1988)Nature 332:323-327;和Verhoeyen等,(1988)Science 239:1534-1536),其中用啮齿类CDRs或CDR序列取代人类抗体的相应序列。因此,所述“人源化的”抗体是嵌合抗体,其中,业已用来自非人物种的相应序列取代了明显小于完整的人类可变结构域的序列。实践中,人源化抗体通常是人类抗体,其中,某些CDR残基,及可能的某些FR残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基所取代。
选择轻链和重链人可变结构域用于制备人源化抗体对于减弱抗原性来说是非常重要的。按照所谓的“最佳配合”方法,用啮齿类抗体的可变结构域序列对已知人类可变-结构域序列的整个文库进行筛选。然后与啮齿类序列最接近的人类序列被用作人源化抗体的人构架(FR)(Sims等,(1993)J.Immunol.,151:2296;和Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196:901)。另一种方法使用来自轻链或重链的特定亚型的所有人类抗体共有序列的特定构架。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:4285;和Presta等,(1993)J.Immnol.,151:2623)。
另外,重要的是将抗体人源化,其中保留对抗原的高亲和力,以及其他有利的生物学特性。为了实现这一目的,根据一种有用的方法,通过利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念的人源化的产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是可以普遍获得的,并且为本领域技术人员所熟悉。可以获得用于说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查所述展示允许分析有关残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的作用,即,分析能影响候选免疫球蛋白与它的抗原结合的能力的残基。这样,可以从共有序列和输入序列中选择并且组合FR残基,从而获得需要的抗体特性,如增强了的对靶抗原的亲和力。一般,CDR残基直接并且最主要地参与影响抗原结合。
本发明还包括针对PDGF或VEGF的人类单克隆抗体。所述抗体可以通过杂交瘤方法制备。业已描述了用于生产人单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系,例如,参见Kozbor(1984)J.Immunol.,133,3001;Brodeur,等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,PP.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);和Boerner等,(1991)J.Immunol.,147:86-95。
现在可能生产转基因动物(例如,小鼠),它在免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白产生的前提下产生所有的人类抗体谱。例如,业已发现,在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失,导致了内源抗体产生的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到种系突变型小鼠体内,会导致在受到抗原攻击后产生人类抗体(参见,例如,Jakobovits等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),90:2551;Jakobovits等,(1993)Nature,362:255-258;和Bruggermann等,(1993)Year in Immuno.,7:33)。
另外,可以将噬菌体展示技术(McCafferty等,(1990)Nature,348:552-553)用于由来自未免疫过的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱体外生产人类抗体和抗体片段(有关综述可以参见例如,Johnson等,(1993)Current Opinion in Structural Biology.3:564-571)。V-基因片段的若干来源可用于噬菌体展示.例如,Clackson等((1991)Nature,352:624-628)从来自免疫过的小鼠脾脏的V基因的小型随机组合文库中分离了多样性的抗-唑酮抗体阵列。可以构建来自未免疫过的人类供体的V基因谱,并且可以基本上按下文所描述的技术分离针对多样性抗原阵列(包括自身抗原)的抗体:Marks等,((1991)J.Mol.Biol.,222:581-597,或Griffith等,(1993)EMBO J.,12:725-734)。
在天然免疫反应中,抗体基因以高比例积累突变(体细胞高变)。所导入的某些变化可能产生较高的亲和力,并且,表现出高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优选在随后的抗原攻击中复制并分化。通过采用被称作“链改组”的技术可以模拟这种自然过程(参见Marks等,(1992)Bio.Technol.,10:779-783)。在该方法中,通过噬菌体展示获得的“第一”人类抗体的亲和力能够通过用从未免疫过的供体内获得的V结构域基因的天然存在的变体谱(所有组成成分)依次取代重链和轻链V区基因进行改良。这种技术能够产生亲和力在nM范围内的抗体和抗体片段。Waterhouse等业已描述了用于制备非常大的噬菌体抗体谱的策略((1993)Nucl.Acids Res.,21:2265-2266)。
还可将基因改组用于从啮齿类抗体生产人类抗体,其中,所述人类抗体对起始啮齿类抗体具有类似亲和力和特异性。根据该方法,它又被称作“表位印记”,通过噬菌体展示技术获得的啮齿类抗体的重链或轻链V结构域基因被人类V结构域基因谱所取代,从而产生了啮齿类-人类嵌合体。选择抗原,导致了能够恢复功能性抗原结合部位的人类可变结构域的分离,即表位控制(印记)配偶体的选择。在重复所述过程,以便取代其余的啮齿类V结构域时,获得了人类抗体(参见PCT WO 93/06213,1993年4月1日公开)。与通过CDR嫁接进行啮齿类抗体的传统人源化不同,这种技术提供了完整的人类抗体,它不具备来自啮齿类的构架或CDR残基。
适体拮抗剂
本发明提供了针对PDGF和/或VEGF(或它们的同源受体)的适体拮抗剂。适体,又被称作核酸配体,是非天然存在的核酸,它能够结合,并且一般拮抗(即,抑制)预先选择的靶。
适体可以通过生产寡聚体或寡核苷酸的任何已知方法制备。很多合成方法为本领域所公知。例如,包括残余的嘌呤核糖核苷酸,并且具有合适的3′-末端,如颠倒的胸苷残基(Ortigao等,AntisenseResearch and Development,2:129-146(1992))或位于3′-末端的两个硫代磷酸酯键以防止最终被3′-外切核酸酶降解的2′-O-烯丙基修饰过的寡聚体,可以通过固相β-氰乙基亚磷酰胺化学方法(Sinha等,Nucleic Acids Res.,12:4539-4557(1984))在任何可以通过商业渠道获得的DNA/RNA合成仪上合成。一种方法是核糖核苷酸的2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护策略(Usman等,J.Am.Chem.Soc.,109:7845-7854(1987)),并且所有需要的3′-O-亚磷酰胺是通过商业渠道获得的。另外,氨基甲基聚苯乙烯可以用作支持材料,这是因为它的有利特性(McCollum和Andrus(1991)TetrahedronLett.,32:4069-4072)。可以在合成期间通过使用由商业渠道获得的荧光素亚磷酰胺,将荧光素添加到底物RNA的5′-末端。一般,可以通过标准的RNA循环合成适体寡聚体。在组装结束时,通过在密封的小瓶中在55℃下用浓氨水-乙醇(3∶1v/v)处理8小时除去所有碱不稳定的保护基团。乙醇能抑制2′-O-TBDMS基团的过早除掉,该基团的过早除掉会在去保护的碱性条件下,在所得到的核糖核苷酸位置上导致明显的链裂解(Usman等,(1987)J.Am.Chem.Soc.,109:7845-7854)。在冷冻干燥之后,用三乙胺三氢氟化物/三乙胺/N-甲基吡咯烷酮的混合物在60℃下处理TBDMS保护的寡聚体2小时,以在中性条件下快速并且有效地除掉甲硅烷基保护基团(参见Wincott等,(1995)Nucleic Acids Res.,23:2677-2684)。然后可以用丁醇沉淀完全去保护的寡聚体,其中按照Cathala和Brunel的方法进行((1990)Nucleic Acids Res.,18:201)。纯化可以通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过离子交换HPLC(Sproat等,(1995)Nucleosides and Nucleotides,14:255-273)和反相HPLC的组合进行。为了在细胞中使用,通过在丙酮中用高氯酸钠沉淀将合成的寡聚体转化成它们的钠盐。然后使用小型的一次性的凝胶过滤柱除掉痕量的残余盐,所述柱可以通过商业渠道获得。作为最后的步骤,可以通过基质辅助的激光解吸质谱分析法(Pieles等,(1993)Nucleic AcidsRes.,21:3191-3196)以及通过核苷碱基组成分析检查所分离的寡聚体的真实性。
当所述核苷酸亚单位可用于酶促操作时,所公开的适体可以通过酶促方法生产。例如,可以通过体外RNA聚合酶T7反应制备RNA分子。所述分子还可以通过能表达T7的细菌菌株或细胞系制备,随后从所述细胞中分离。正如下文所讨论的,所公开的适体还可以使用载体和启动子直接在细胞中表达。
所述适体,与本发明的其他核酸分子类似,还可以包括化学修饰过的核苷酸。在核酸的诊断或治疗用途中要处理的一个问题是,磷酸二酯形式的寡核苷酸在体液中在表现出所需效果之前可能被细胞内和细胞外酶,如内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。可以对核酸配体进行某些化学修饰,以提高核酸配体的体内稳定性,或者增强或者介导核酸配体的送递(参见例如,美国专利申请号5,660,985,标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing ModifiedNucleotides”),所述文献被专门收作本文参考。
本发明所预期的核酸配体的修饰包括,但不局限于提供了其他化学基团的修饰,它向核酸配体碱基或向总体上的核酸配体整合了额外的电荷、可极化性、疏水性、氢键结合、静电相互作用和不确定性(fluxionality)。所述修饰包括,但不局限于,2′号位置的糖修饰,5-号位置的嘧啶修饰,8-号位置的嘌呤修饰,在环外胺上的修饰,4-硫尿苷的取代,5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代;主链修饰,硫代磷酸酯或磷酸烷基酯修饰,甲基化,不常见的碱基对组合,如异碱基(isobase)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。修饰还可以包括3′和5′修饰,如用糖部分加帽或修饰。在本发明的某些实施方案中,所述核酸配体是RNA分子,它是在嘧啶残基的糖部分上2′-氟(2′-F)修饰的。
通过导入这种修饰,以及通过沿RNA的磷酸酯主链修饰和取代,可以大大加强所述适体的稳定性。另外,可以在核碱基(nucleobase)本身上进行多种修饰,这种修饰能抑制降解,并且能够增强需要的核苷酸相互作用或减弱不需要的核苷酸相互作用。因此,一旦知道了适体的序列,就可以通过下文所描述的合成方法或通过本领域技术人员所公知的方法进行修饰或取代。
其他修饰包括整合修饰过的碱基(或修饰过的核苷或修饰过的核苷酸),它们是存在于核糖核酸(即,A、C、G和U)和脱氧核糖核酸(即,A、C、G和T)的标准碱基、糖和/或磷酸酯主链化学结构的变化形式。所述范围内包括,例如:Gm(2′-甲氧基鸟嘌呤核苷酸)、Am(2′-甲氧基腺苷酸)、Cf(2′-氟胞嘧啶核苷酸)、Uf(2′-氟尿苷酸)、Ar(核糖腺嘌呤核苷酸)。所述适体还可以包括胞嘧啶或任何胞嘧啶-相关的碱基,包括5-甲基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶(例如,5-氟代胞嘧啶、5-溴代胞嘧啶、5-氯代胞嘧啶和5-碘代胞嘧啶)、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosine)、吩嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、咔唑胞苷或吡啶并吲哚胞苷。所述适体还可以包括鸟嘌呤或任何鸟嘌呤-相关的碱基,包括6-甲基鸟嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、6-丙基鸟嘌呤、8-卤代鸟嘌呤(例如,8-氟代鸟嘌呤、8-溴代鸟嘌呤、8-氯代鸟嘌呤和8-碘代鸟嘌呤)、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或3-脱氮鸟嘌呤。所述适体还可以包括腺嘌呤或任何腺嘌呤-相关的碱基,包括6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、8-卤代腺嘌呤(例如,8-氟代腺嘌呤、8-溴代腺嘌呤、8-氯代腺嘌呤和8-碘代腺嘌呤)、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-卤代腺嘌呤(例如,2-氟代腺嘌呤、2-溴代腺嘌呤、2-氯代腺嘌呤和2-碘代腺嘌呤)、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或3-脱氮腺嘌呤。还包括尿嘧啶或任何尿嘧啶-相关的碱基,包括5-卤代尿嘧啶(例如,5-氟代尿嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-氯代尿嘧啶、5-碘代尿嘧啶)、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-偶氮尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。
本领域所公知的其他修饰过的碱基变体的例子包括,但不局限于在37C.F.R.§1.822(p)(1)中所列举的,例如,4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2′-甲氧基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-thioridine、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿嘧啶核苷、b-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿嘧啶核苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、b-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代N6-异戊烯腺苷、N-((9-b-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-b-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-羟基乙酸甲酯、尿苷-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶核苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-b-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。
还包括在以下文献中描述的修饰过的核碱基:美国专利号3,687,808、3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941。本领域所公知的修饰过的核苷和核苷酸糖主链变体的例子包括,但不局限于这样的变体,它具有,例如,2′核糖基取代基,如F、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、OCH2OCH2N(CH3)2、O(C1-10烷基)、O(C2-10链烯基)、O(C2-10炔基)、S(C1-10烷基)、S(C2-10链烯基)、S(C2-10炔基)、NH(C1-10烷基)、NH(C2-10链烯基)、NH(C2-10炔基)和O-烷基-O-烷基。所需的2′核糖基取代基包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH=CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH=CH2)、2′-氨基(2′-NH2)和2′-氟(2′-F)。所述2′-取代基可以在阿糖基(上游)位置或核糖基(下游)位置上。
本发明的适体可以由上文所述的核苷酸和/或核苷酸类似物或者这两者的组合组成,或者是寡核苷酸类似物。本发明的适体可以在不影响该寡聚体与PDGF或VEGF(或它们的同源受体)结合的功能的位置上包括核苷酸类似物。
有若干种技术可适用于改善或加强核酸配体对特定靶分子的结合或对其他适体的选择。一种技术,一般称作“体外遗传学”(参见Szostak(1992)TIBS,19:89),涉及通过从随机序列库中选择来分离适体拮抗剂。可以分离所公开的适体的核酸分子库可以包括与大约二十到四十个核苷酸的可变序列侧接的不变序列。该方法业已被称作通过指数富集进行的配体选择进化(Selective Evolution of Ligandsby EXponential Enrichment)(SELEX)。通过SELEX和相关方法制备本发明的适体拮抗剂的组合物和方法为本领域所公知,并且教导于以下文献中,例如,美国专利号5,475,096,标题为“Nucleic AcidLigands”,和美国专利号5,270,163,标题为“Methods for IdentifyingNucleic Acid Ligands”,每一份文献都被专门以全文形式收作本文参考。一般,所述SELEX方法,以及具体地讲,VEGF和PDGF适体和制剂进一步描述于以下文献中,例如,美国专利申请号5,668,264、5,696,249、5,670,637、5,674,685、5,723,594、5,756,291、5,811,533、5,817,785、5,958,691、6,011,020、6,051,698、6,147,204、6,168,778、6,207,816、6,229,002、6,426,335、6,582,918,每一份文献的内容都被专门收作本文参考。
简单地讲,SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物中选择,并且使用相同的通用选择方法逐步重复与所选择的靶的结合、分开和扩增,以便获得实际上任何需要的结合亲和力和选择性标准。从通常包括随机化序列片段的核酸混合物开始,所述SELEX方法包括让所述混合物在有利于结合的条件下与靶接触,从业已特异性地结合到靶分子的核酸中分开未结合的核酸,解离所述核酸-靶复合物,扩增从核酸-靶复合物上解离的核酸,以得到核酸的富含配体的混合物,然后重复结合、分开、解离和扩增步骤多达需要的循环次数,以得到对靶分子具有高度特异性高亲和力的核酸配体。
业已为实现多种特殊目的对基本SELEX方法进行了改进。例如,美国专利号5,707,796,标题为“Method for Selecting Nucleic Acids onthe Basis of Structure”,描述了利用SELEX方法与凝胶电泳组合选择具有特殊结构特征的核酸分子,如弯曲的DNA。美国专利号5,763,177,标题为“Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and SolutionSELEX”描述了用于选择含有光反应性基团的核酸配体的基于SELEX的方法,所述基团能够结合和/或光交联和/或光灭活靶分子。美国专利号5,580,737,标题为“High-Affinity Nucleic Acid LigandsThat Discriminate Between Theophylline and Caffeine”,描述了用于鉴定高特异性核酸配体的方法,所述配体能够区别密切相关的分子,所述方法可能是非肽的,被称作Counter-SELEX。美国专利号5,567,588,标题为“Systematic Evolution of Ligands by EXponentialEnrichment:Solution SELEX”,描述了一种基于SELEX的方法,它能够高效分开对靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸。
SELEX方法包括鉴定包含修饰过的核苷酸的高亲和力核酸配体,所述修饰过的核苷酸能赋予配体改善了的特征,如改善了的体内稳定性或改善了的送递特征。所述修饰的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置上的化学取代。SELEX方法鉴定的包括修饰过的核苷酸的核酸配体描述于美国专利号5,660,985中,标题为“HighAffinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”,该文献描述了含有在嘧啶的5-和2′-位置上进行过化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利号5,580,737,同上,描述了高特异性核酸配体,它包括一个或多个用2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰过的核苷酸。美国专利申请号08/264,029,于1994年6月22日提交,标题为“Novel Method of Preparation ofKnown and Novel 2′Modified Nucleosides by IntramolecularNucleophilic Displacement”,现已放弃,描述了包括各种2′-修饰过的嘧啶的寡核苷酸。
SELEX方法包括将选择的寡核苷酸与其他选择的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单位组合,分别如美国专利号5,637,459,标题为“Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment:Chimeric SELEX”,和美国专利号5,683,867,标题为“SystematicEvolution of Ligands by EXponential Enrichment:Blended SELEX”所述。上述专利允许将寡核苷酸的多种形状和其他特性,以及有效扩增和复制特性与其他分子的所需特性组合在一起。
SELEX方法还包括将选定的核酸配体与亲脂性化合物或非免疫原性、高分子量化合物在诊断性或治疗性复合物中组合,如美国专利号6,011,020,标题为“Nucleic Acid Ligands Complexes”所述,所述文献以全文形式收作本文参考。
所述适体拮抗剂可以通过使用计算机模拟技术改良。分子模拟系统的例子为CHARMm和QUANTA程序,Polygen Corporation(Waltham,Mass.)。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建、图形模拟和分析。QUANTA能够相互构建、修饰、显示并且分析分子相互之间的表现。上述应用可适用于确定并且显示RNA和DNA分子的二级结构。
然后可以检验具有上述各种修饰的适体的功能,其中使用适合目标PDGF或VEGF功能的任何合适的测定方法,如PDGF基于细胞的增殖活性测定。
修饰可以在SELEX方法之前或之后进行。SELEX方法之前的修饰得到了具有对它们的SELEX靶的特异性以及改善的体内稳定性的核酸配体。在SELEX方法之后对2′-OH核酸配体进行修饰,能够导致体内稳定性的改善,而又不会对核酸配体的结合能力产生负面影响。
可用于生产本发明的适体的其他修饰为本领域普通技术人员所公知。所述修饰可以在SELEX方法之后进行(以前鉴定的未修饰过的配体的修饰)或者通过整合到SELEX方法中进行。
业已发现,一般来说适体或核酸配体,和具体地讲VEGF适体是最稳定的,并因此当5′-加帽和3′-加帽时是有效的,能够减弱对外切核酸酶的易感性,并且提高整体稳定性。因此,在一种实施方案中,本发明是基于一般来说对适体的加帽的,以及具体地讲对抗-VEGF适体的加帽的,其中使用位于5’末端的5′-5′反向核苷帽结构和位于3’末端的3′-3′反向核苷帽结构。因此,本发明提供了抗-VEGF和/或抗-PDGF适体,即,核酸配体,它在5’末端带有5′-5′-反向核苷帽,并且在3’末端带有3′-3′反向核苷帽。
某些特别有用的本发明的适体是抗-VEGF适体组合物,包括,但不局限于在它们的末端具有5′-5′和3′-3′反向核苷酸帽结构的组合物。所述抗-VEGF加帽的适体可以是RNA适体、DNA适体或具有混合的(即,RNA和DNA)组合物的适体。本发明的合适的抗-VEGF适体序列包括核苷酸序列GAAGAAUUGG(SEQ ID NO:15);或核苷酸序列UUGGACGC(SEQ ID NO:16);或核苷酸序列GUGAAUGC(SEQ ID NO:17)。特别有用的是本发明的加帽的抗-VEGF的适体,它具有以下序列:
X-5′-5′-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG-3′-3′-X(SEQ ID NO:18)
其中每一个C、G、A和U分别表示天然存在的核苷酸胞苷、胍、腺嘌呤和尿苷,或与它相应的修饰过的核苷酸;X-5′-5′是在所述适体的5′末端加帽的反向核苷酸;3′-3′-X是在所述适体的3′末端加帽的反向核苷酸;而其余的核苷酸或修饰过的核苷酸依次通过5′-3′磷酸二酯键连接。在某些实施方案中,加帽的抗-VEGF适体的每一个核苷酸单独具有2′核糖基取代,如-OH(它是核糖核酸(RNAs)的标准),或-H(它是脱氧核糖核酸(DNAs)的标准)。在其他实施方案中,2′核糖基位置被O(C1-10烷基)、O(C1-10链烯基)、F、N3或NH2取代基所取代。
在更具体的非限定性例子中,5′-5′加帽的抗-VEGF适体可能具有以下结构:
Td-5′-5′-CfGmGmArArUfCfAmGmUfGmAmAmUfGmCfUfUfAmUfAmCfAmUfCfCfGm3′-3′-Td
(SEQ ID NO:19)其中,“Gm”表示2′-甲氧基鸟嘌呤核苷酸,“Am”表示2′-甲氧基腺苷酸,“Cf”表示2′-氟胞嘧啶核苷酸,“Uf”表示2′-氟尿苷酸,“Ar”表示核糖腺嘌呤核苷酸,而“Td”表示脱氧核糖胸苷酸。
反义、核酶和DNA酶拮抗剂
靶定PDGF和VEGF的反义寡核苷酸和核酶,通过抑制从这些信使RNAs的蛋白翻译或通过分别靶定相应的PDGF或VEGF mRNs的降解实现PDGF/VEGF的抑制作用。上述PDGF和VEGF-靶定的核酸提供了用于设计和合成PDGF和VEGF核酶和反义寡核苷酸的有用的序列。设计和合成反义寡核苷酸和核酶的方法为本领域所公知。本发明提供了其他指导。
在设计特异性和有效的mRNA-靶定的寡核苷酸(反义ODNs)和核酶和反义中的一个问题是鉴定靶mRNA内的反义配对的可接近位点(它本身折叠成部分自我配对的二级结构)。计算机辅助的预测RNA配对可接近性的算法和分子筛选的组合,能够制备针对大部分mRNA靶的特异性和有效的核酶和/或反义寡核苷酸。实际上,业已描述了若干种确定靶RNA分子对反义或核酶抑制剂的可接近性的方法。一种方法利用体外筛选测定,其中使用尽可能多的反义寡聚脱氧核苷酸(参见Monia等,(1996)Nature Med.,2:668-675;和Milner等,(1997)Nature Biotechnol.,15:537-541)。另一种方法使用ODNs的随机文库(Ho等,(1996)Nucleic Acids Res.,24:1901-1907;Birikh等,(1997)RNA 3:429-437;和Lima等,(1997)J.Biol.Chem.,272:626-638)。可以通过RNA酶H切割监控可接近的位点(参见Birikh等,同上;和Ho等,(1998)Nature Biotechnol.,16:59-63)。RNA酶H能够催化DNA-RNA双链体的RNA链的磷酸二酯主链的水解切割。
在另一种方法中,涉及使用半随机、嵌合的化学合成的ODNs的库,它被用于鉴定被RNA酶H切割的在体外合成的RNA靶上的可接近的位点。然后利用引物延伸分析鉴定靶分子中的这些位点(参见Lima等,同上)。用于设计RNA中的反义靶的其他方法基于计算机辅助的RNA折叠模型。若干报导业已公开了利用随机核酶文库筛选有效的切割(参见Campbell等,(1995)RNA 1:598-609;Lieber等,(1995)Mol.Cell Biol.,15:540-551;和Vaish等,(1997)Biochem.,36:6459-6501)。
利用ODNs和RNA酶H的随机或半随机文库的其他体外方法可能比计算机模拟更有效(Lima等,同上)。不过,体外合成的RNA的使用不能预测反义ODNs在体内的可接近性,因为最近的观察表明了多核苷酸的退火相互作用受RNA-结合蛋白的影响(参见Tsuchihashi等,(1993)Science,267:99-102;Portman等,(1994)EMBO J.,13:213-221;和Bertrand和Rossi(1994)EMBO J.,13:2904-2912)。内容被收作本文参考的美国专利号6,562,570,提供了用于在存在细胞提取物的条件下确定mRNA内的可接近位点的组合物和方法,所述提取物模拟了体内条件。
简单地讲,该方法涉及在杂交条件下在反应培养基中,该培养基包括含有内源RNA-结合蛋白的细胞提取物,或者由于存在一种或多种RNA-结合蛋白而模仿细胞提取物,使天然的或体外合成的RNAs与特定的反义ODNs、核酶或DNAzymes,或与随机或半随机ODN、核酶或DNAzyme文库一起温育。与靶RNA中的可接近位点互补的任何反义ODN、核酶或DNAzyme,能够与所述位点杂交。在使用特定的ODNs或ODN文库时,RNA酶H是在杂交期间存在的,或者是在杂交之后添加的,以切割业已发生了杂交的RNA。在使用核酶或DNAzymes时,可能存在RNA酶H,但不一是必需的,因为当发生了杂交时所述核酶和DNAzymes能切割RNA。在某些场合下,使用了在细胞提取物中的随机或半随机ODN文库,其含有内源mRNA、RNA-结合蛋白和RNA酶H。
然后,可以用各种方法鉴定靶RNA上的业已结合了反义ODNs、核酶或DNAzymes并且发生了切割的位点。例如,可以将依赖于末端脱氧核苷酸转移酶的聚合酶链反应(TDPCR)用于这一目的(参见Komura和Riggs(1998)Nucleic Acids Res.,26:1807-11)。通过逆转录步骤将RNA模板转化成DNA,然后进行TDPCR。在本发明中,TDPCR方法需要的3′末端是通过使用任何合适的依赖于RNA的DNA聚合酶(例如,逆转录酶)对目标靶RNA进行逆转录产生的。这一目的是通过让第一种ODN引物(P1)与所述RNA的位于接受研究的靶RNA分子部分下游的区域(即,沿RNA分子上的5′→3′方向)杂交。在存在dNTPs的情况下,所述聚合酶从P1的3’末端将RNA拷贝成DNA,并且在通过反义ODN/RNA酶H、核酶或DNAzyme产生的切割位点终止拷贝。新的DNA分子(被称作第一链DNA)起着TDPCR方法的PCR部分的第一模板的作用,它被用于鉴定存在于RNA上的相应的可接近的靶序列。
例如,然后可以使用TDPCR方法,即,具有鸟苷三磷酸(rGTP)的逆转录DNA在存在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的条件下起反应,以在DNA分子的3′末端添加(rG)2-4尾巴。然后连接双链ODN接头,其在一股链上具有3′2-4突出端,它与(rG)2-4尾巴碱基配对。然后添加两个PCR引物。第一个是接头引物(LP),它与TDPCR接头的链互补,该接头连接在(rG)2-4尾巴上(有时称作下部链)。另一个引物(P2)可能与P1相同,不过可以是相对P1嵌套的,即,它与靶RNA在至少部分位于由P1结合的区域上游的区域互补(即,在RNA分子上的3′→5′方向),不过,它位于接受研究的靶RNA分子的部分的下游。就是说,接受研究以确定它是否具有可接近的结合位点的靶RNA分子的部分,是互补于P2的区域上游的部分。然后在存在DNA聚合酶和dNTPs的条件下用已知方式进行PCR,以扩增由引物LP和P2限定的DNA片段。然后可以通过多种已知方法中的任何一种捕获扩增的产物,并且随后用自动化DNA测序仪测序,从而提供对切割位点的精确鉴定。一旦确定了所述性质,就可以合成确定序列的反义DNA或核酶,以在体外和体内使用。
在表达特定基因中的反义干预可以通过使用合成的反义寡核苷酸序列实现(参见,例如,Lefebvre-d′Hellencourt等,(1995)Eur.Cyokine Netw.,6:7;Agrawal(1996)TIBTECH,14:376;和Lev-Lehman等,(1997)Antisense Therap.Cohen and Smicek,eds.(Plenum Press,New York))。简单地讲,反义寡核苷酸序列可以是短的DNA序列,通常为15-30聚体,不过,可以小到7聚体(参见Wagner等,(1994)Nature 372:333),它被设计成与目标靶mRNA互补,并且形成RNA:AS双链体。这种双链体的形成能够防止相关mRNA的加工、剪接、转运或翻译。另外,某些AS核苷酸序列在与它们的靶mRNA杂交时能够引起细胞RNA酶H活性,从而导致mRNA降解(参见Calabretta等,(1996)Semin.Oncol.,23:78)。在这种场合下,RNA酶H会切割所述双链体的RNA成分,并且能够潜在地释放AS,以进一步与靶RNA的其他分子杂交。通过AS与基因组DNA相互作用产生的另一种作用模式,所述相互作用形成了三重螺旋,它能够转录失活。
作为上文所讨论的反义序列的非限定性、补充性或替代性例子,可以将核酶用于抑制基因功能。当反义治疗受到化学计量的因素限制时,这是特别必要的。然后可以使用靶定相同序列的核酶。核酶是具有RNA催化能力的RNA分子,它能够切割靶RNA上的特定位点。由核酶切割的RNA分子的数目大于由1∶1化学计量推测的数目(参见Hampel和Tritz(1989)Biochem.,28:4929-33;和Uhlenbeck(1987)Nature,328:596-600)。因此,本发明还可以利用核酶序列,所述序列靶定PDGF或VEGF mRNA种类的可接近的结构域,并且包括合适的催化中心。按照本领域所公知的以及本文中所进一步讨论的方法制备和送递核酶。核酶可以与反义序列组合使用。
核酶能催化RNA的磷酸二酯键切割。业已鉴定了若干种核酶结构家族,包括I组内含子、RNA酶P、丁型肝炎病毒核酶、锤头核酶和发夹核酶,其最初来自烟草环斑病毒卫星RNA(sTRSV)的负链(参见Sullivan(1994)Investig.Dermatolog(Suppl.)103:95S;和美国专利号5,225,347)。后两个家族来自类病毒和拟病毒,其中,核酶被认为能够分离单体和在滚环复制期间产生的寡聚体(参见Symons(1989)TIBS,14:445-50;Symons(1992)Ann.Rev.Biochem.,61:641-71)。锤头和发夹核酶基序通常最适合用于基因治疗的mRNAs的反式切割。用于本发明的核酶类型是按照本领域已知方法选择的。发夹核酶现在用于临床实验,并且是特别有用的类型。一般,核酶的长度为30-100核苷酸。
被设计用于催化切割靶mRNA转录物的核酶分子为本领域所公知(例如,PDGF(SEQ ID NO:1)或VEGF(SEQ ID NO:3),并且还可用于防止mRNA的翻译(参见,例如,PCT国际公开号WO 90/11364;Sarver等,(1990)Science,247:1222-1225和美国专利号5,093,246)。尽管能够在位点特异性识别序列切割mRNA的核酶可用于破坏特定的mRNAs,但锤头核酶的使用是特别有用的。锤头核酶能在由旁侧区限定的位置切割mRNAs,所述旁侧区形成了与靶mRNA的互补碱基配对。唯一的要求是,靶mRNA具有两个碱基的以下序列:5′-UG-3′。锤头核酶的构建和生产是本领域所公知的,并且更全面地描述于以下文献中:Haseloff和Gerlach((1988)Nature,334:585)。
本发明的核酶还包括RNA内切核糖核酸酶(以下称之为“Cech-型核酶”),如在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然存在的酶(被称作IVS,或L-19IVS RNA),并且其在以下文献中业已被Thomas Cech及同事进行过充分的介绍(参见Zaug等,(1984)Science,224:574-578;Zaug和Cech(1986)Science,231:470-475;Zaug,等,(1986)Nature,324:429-433;国际专利申请号WO88/04300;Been和Cech(1986)Cell,47:207-216)。Cech-型核酶具有八个碱基对的活性位点,它能与靶RNA序列杂交,然后发生靶RNA的切割。本发明包括所述Cech-型核酶,它靶定八个碱基对的活性位点序列。尽管本发明不局限于操作机制的特定理论,但锤头核酶在本发明中的使用,与使用PDGF/VEGF-定向的反义相比具有优点,因为最新的报导表明,锤头核酶通过阻断RNA翻译和/或mRNA靶的特异性切割起作用。
正如在反义方法中那样,核酶可以由修饰过的寡核苷酸构成(例如,用于改善的稳定性、靶定等),并且被送递到能表达靶mRNA的细胞。有用的送递方法涉及使用“编码”所述核酶的DNA构建体,它受强组成型pol III或pol II启动子的控制,从而受感染的细胞能产生足够量的核酶,以破坏靶定的信使并且抑制翻译。由于核酶与反义分子不同,是催化性的,所以需要较低的细胞内浓度实现它的效力。
如上文所述,如果需要的话,核酸酶抗性是通过本领域所公知的任何方法提供的,它大体上不会干扰反义寡脱氧核苷酸或核酶的生物学活性,正如使用和送递方法所需要的(Iyer等,(1990)J.Org.Chem.,55:4693-99;Eckstein(1985)Ann.Rev.Biochem.,54:367-402;Spitzer和Eckstein(1988)Nucleic Acids Res.,18:11691-704;Woolf等,(1990)Nucleic Acids Res.,18:1763-69;和Shaw等,(1991)Nucleic Acids Res.,18:11691-704)。正如上文对适体所描述的,可以对反义寡核苷酸或核酶进行非限定性代表性修饰,以增强核酸酶抗性,包括修饰磷酸酯主链上的亚磷或氧杂原子、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。这些包括,例如制备2′-氟化的、O-甲基化的、膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和吗啉代寡聚体。例如,所述反义寡核苷酸或核酶可以具有硫代磷酸酯键,其连接在四-六个3′-末端核苷酸碱基之间。另外,硫代磷酸酯键可以连接所有的核苷酸碱基。硫代磷酸酯反义寡核苷酸在有效并且在动物体内表现出足够的药物动力学半衰期的浓度下通常不表现出明显的毒性(参见Agarwal等,(1996)TIBTECH,14:376)并且是核酸酶抗性的。另外,对AS-ODN的核酸酶抗性可以通过在3′-末端具有形成环的九核苷酸序列提供,它的核苷酸序列为CGCGAAGCG。抗生物素蛋白-生物素缀合反应的使用,还可用于改善AS-ODNs对血清核酸酶降解的保护作用(参见Boado和Pardridge(1992)Bioconj.Chem.,3:519-23)。根据这种概念,在它们的3′-末端对AS-ODN试剂进行单一生物素化。在与抗生物素蛋白起反应时,它们形成了紧密的、核酸酶抗性复合物,其与未缀合的ODNs相比,具有6倍高的稳定性。
其他研究业已表明了反义寡脱氧核苷酸的体内延伸(Agarwal等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88:7595)。据推测,该方法可用作从循环中排除外来AS-寡核苷酸的清除机制,这取决于在发生了延伸的附着的寡核苷酸中游离的3′-末端的存在。因此,在所述重要位置上的部分硫代磷酸酯、环保护或生物素-抗生物素蛋白应当足以确保所述AS-寡脱氧核苷酸的稳定性。
除了使用上述修饰过的碱基之外,可以制备核苷酸的类似物,其中,核苷酸的结构发生了根本的改变,并且,所述核苷酸类似物更适合作为治疗剂或实验试剂。核苷酸类似物的例子是肽核酸(PNA),其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链被聚酰胺主链所取代,它与在肽上出现的情况类似。业已显示PNA类似物能够抗酶的降解作用,并且在体内和体外具有延长的寿命。另外,业已显示PNAs与互补DNA序列的结合比DNA分子更强。这种观察是由于PNA链和DNA链之间的电荷排斥的缺乏造成的。可以对寡核苷酸进行的其他修饰包括聚合物主链、吗啉代聚合物主链(参见,例如,美国专利号5,034,506,所述文献的内容被收作本文参考)、环状主链或无环主链、糖模拟物或任何其他修饰,包括能够改善寡核苷酸的药物动力学特性的修饰。
本发明的另一方面涉及利用DNA酶减弱靶mRNA的表达,例如,PDGF或VEGF。DNA酶整合了反义和核酶技术的某些机制特征。设计DNA酶,从而它们能识别特定的靶核酸序列,这点更像是反义寡核苷酸,不过,它们能催化并且特异性地切割靶核酸这点更像是核酶。
目前有两种基本类型的DNA酶,并且,这两种酶都是由Santoro和Joyce鉴定的(参见,例如,美国专利号6,110,462)。10-23DNA酶包括环状结构,该结构连接两个臂。这两个臂通过识别特定靶核酸序列提供了特异性,而所述环状结构提供了在生理学条件下的催化功能。
简单地讲,为了设计能特异性地识别并且切割靶核酸的DNA酶,本领域技术人员首先必须鉴定独特的靶序列。这可以使用与反义寡核苷酸相同的方法实现。在某些例子中,所述独特的或重要的序列是富含G/C的大约18-22个核苷酸。高G/C含量有助于确保DNA酶和靶序列之间的较强的相互作用。
在合成DNA酶时,能将所述酶靶向信使的特异性反义识别序列是分开的,从而它构成DNA酶的两个臂,并且将DNA酶的环放在这两个特殊的臂之间。
制备和施用DNA酶的方法可以参见,例如,U.S.6110462。类似地,体外或体内送递DNA核酶的方法包括本文所阐述的送递RNA核酶的方法。另外,本领域技术人员可以认识到,与反义寡核苷酸类似,可以对DNA酶进行任选地修饰,以提高稳定性并且改善对降解的抗性。
RNAi拮抗剂
本发明的某些实施方案利用了用于通过RNA干扰(RNAi)实现VEGF和PDGF的抑制的材料和方法。RNAi是序列特异性的转录后基因抑制方法,它可在真核细胞中发生。一般,该方法涉及通过与所述序列同源的双链RNA(dsRNA)诱导的特定序列的mRNA的降解。例如,相当于特定单链mRNA(ss mRNA)的序列的长的dsRNA的表达,会使所述信使不稳定,从而“干扰”相应基因的表达。因此,通过导入dsRNA能够抑制任何选定的基因,所述dsRNA相当于所述基因的mRNA的全部或主要部分。看来,当长的dsRNA表达时,首先通过核糖核酸酶III将它加工成长度为少至21-22个碱基对的较短的dsRNA寡核苷酸。因此,RNAi可以通过相对较短的同源dsRNAs的导入或表达实现。实际上,相对较短的同源dsRNAs的使用,可能具有某些优点,正如下文所讨论的。
哺乳动物细胞具有受双链RNA(dsRNA)影响的至少两个途径。在RNAi(序列特异性)途径上,首先将最初的dsRNA分解成短的干扰(si)RNAs,如上文所述。siRNAs具有大约21个核苷酸的有义和反义链,它在各自的3’末端与两个核苷酸的突出端形成大约19个核苷酸的si RNAs。短的干扰RNAs被认为提供了允许靶定特定信使RNA进行降解的序列信息。相反,非特异性途径是通过具有任何序列的dsRNA触发的,只要它的长度至少为大约30个碱基对就行。非特异性作用的发生是因为dsRNA激活了两种酶:PKR(双链RNA-激活的蛋白激酶),在它的活性形式下能对翻译起始因子eIF2进行磷酸化,以关闭所有的蛋白合成,以及2’,5′寡腺苷酸合成酶(2′,5′-AS),它合成的分子能激活RNA酶L,即一种靶定所有mRNAs的非特异性酶。所述非特异性途径可能代表了宿主对应激或病毒感染的反应,并且,一般,所述非特异性途径的影响在本发明的特别有用的方法中得到了最小化。值得注意地是,似乎需要较长的dsRNAs来诱导非特异性途径,因此,短于大约30个碱基对的dsRNAs在通过RNAi实现基因抑制方面是特别有用的(参见,例如,Hunter等,(1975)J.Biol.Chem.,250:409-17;Manche等,(1992)Mol.CellBiol.,12:5239-48;Minks等,(1979)J.Biol.Chem.,254:10180-3;和Elbashir等,(2001)Nature,411:494-8)。
用于实现RNAi的某些双链寡核苷酸的长度小于30个碱基对,并且可能包括核糖核酸的大约25、24、23、22、21、20、19、18或17个碱基对。本发明的dsRNA寡核苷酸任选地包括3’突出端。非限定性的示例性的2-核苷酸3′突出端可以由任何类型的核糖核苷酸残基组成,并且甚至可以由2′-脱氧胸苷残基组成,这降低了RNA合成的成本,并且可以提高siRNAs在细胞培养基以及在转染过的细胞中的核酸酶抗性(参见Elbashi等,(2001)Nature,411:494-8)。
具有50、75、100或者甚至500个碱基对或更多的较长的dsRNAs还可用于本发明的某些实施方案中。用于实现RNAi的dsRNAs的示例性浓度为大约0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM或100nM,尽管根据处理过的细胞的性质、基因靶和本领域技术人员能够方便地认识的其他因素可以使用其他浓度。示例性的dsRNAs可以化学合成或者使用合适的表达载体在体外或体内生产。示例性的合成的RNAs包括使用本领域已知方法化学合成的21个核苷酸的RNAs(例如,加速RNA亚磷酰胺和胸苷亚磷酰胺(Proligo,德国))。合成的寡核苷酸可以使用本领域公知的方法脱保护,并且凝胶纯化(参见例如,Elbashir等,(2001)Genes Dev.,15:188-200)。较长的RNAs可以从启动子转录,如本领域公知的T7RNA聚合酶启动子。沿两种可能的方向放置在体外启动子下游的单一RNA靶能够转录所述靶的两股链,以形成具有需要的靶序列的dsRNA寡核苷酸。
用于设计寡核苷酸的特定序列可以是包含在表达的靶基因信使中的任何连续的核苷酸序列(例如,PDGF的序列(例如,SEQ ID NO:2)或VEGF的序列(例如,SEQ ID NO:4)。可以用本领域已知的程序和算法选择合适的靶序列。另外,可以按上文另外所述选择最佳序列,其中使用为了预测特定单链核酸序列的二级结构,并且允许选择有可能出现在折叠的mRNA的暴露的单链区的那些序列而设计的程序。用于设计合适的寡核苷酸的方法和组合物可以参见,例如,美国专利号6,251,588,所述文献的内容被收作本文参考。一般,mRNA被认为是线性分子,它包括指导蛋白在核糖核苷酸序列内合成的信息。不过,研究业已揭示在大部分mRNAs中存在大量二级和三级结构。RNA中的二级结构元件大部分是通过相同RNA分子的不同区域之间的沃森-克里克类型的相互作用形成的。重要的二级结构元件包括分子内双链区、发夹环、双链体RNA中的凸起和内部环。三级结构元件是在二级结构元件彼此接触或者与单链区接触时形成的,以产生更复杂的三维结构。很多研究人员业已测量了大量RNA双链体结构的结合能,并且已推导出可用于预测RNA二级结构的一系列规则(参见例如,Jaeger等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86:7706(1989);和Turner等,(1988)Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.,17:167)。所述规则可用于鉴定RNA结构元件,并且具体地讲,用于鉴定单链RNA区,它可能代表了mRNA的靶向沉默RNAi、核酶或反义技术的特别有用的片段。因此,可以鉴定mRNA靶的特定片段,以用于设计介导RNAi的dsRNA寡核苷酸,以及用于设计本发明的合适的核酶和锤头核酶组合物。
可以通过用异源靶基因转染将dsRNA寡核苷酸导入细胞,其中使用本领域所公知的诸如脂质体的载体组合物,例如Lipofectamine2000(Life Technologies,Rockville MD),正如生产商对于贴壁细胞系所描述的。靶定内源基因的dsRNA寡核苷酸的转染可以使用Oligofectamine(Life Technologies)进行。对于哺乳动物细胞系来说,在共转染编码hGFP的pAD3之后,可以通过荧光显微镜术检查转染效力(Kehlenback等,(1998)J.Cell.Biol.,141:863-74)。RNAi的效力可以在导入dsRNAs之后通过多种测定方法中的任意一种评估。所述方法包括,但不局限于使用抗体的蛋白印迹分析,所述抗体在新蛋白合成抑制之后使内源库周转足够时间后识别靶定的基因产物,以及RNA印迹分析,用于测定现有靶mRNA的水平。
用于本发明的RNAi技术的其他组合物、方法和应用提供于以下文献中:美国专利号6,278,039、5,723,750和5,244,805,所述文献的被收作本文参考。
受体酪氨酸激酶抑制剂拮抗剂
本发明还包括本领域所公知的酪氨酸激酶拮抗剂以及它的变体和替代物,这些变体和替代物可以使用本领域的常规技术获得,并且将现有技术的教导收作本文参考。PDGF(和VEGF)的细胞外信号通过由所述PDGF受体(和VEGF受体)实现的酪氨酸激酶介导的磷酸化事件与细胞的其他部分联系,并且它影响了细胞膜结合的信号传导复合物下游的底物蛋白。因此,作用于PDGF(和/或VEGF)信号传导的受体激酶阶段的拮抗剂也可用于实施本发明的方法。
对于诸如PDGFR或VEGFR的酪氨酸激酶受体酶来说具有选择性的多种类型的酪氨酸激酶抑制剂是已知的(参见,例如,Spada和Myers((1995)Exp.Opin.Ther.Patents,5:805)和Bridges((1995)Exp.Opin.Ther.Patents,5:1245)。另外,Law和Lydon业已归纳了酪氨酸激酶抑制剂的抗癌潜力((1996)Emerging Drugs:TheProspect For Improved Medicines,241-260)。例如,美国专利号6,528,526描述了取代过的喹喔啉化合物,它能选择性地抑制血小板衍生生长因子-受体(PDGFR)酪氨酸激酶活性。PDGFR酪氨酸激酶活性的已知抑制剂包括基于喹啉的抑制剂,其由Maguire等,((1994)J.Med.Chem.,37:2129)和Dolle,等,((1994)J.Med.Chem.,37:2627)报道。一种类型的基于苯基氨基-嘧啶的抑制剂最近由Traxler等,在EP 564409,由Zimmerman等,((1996)Biorg.Med.Chem.Lett.,6:1221-1226),以及由Buchdunger等,((1995)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),92:2558)报道。可用于抑制PDGF受体酪氨酸激酶活性的喹唑啉衍生物包括双单-和双环芳基化合物和杂芳基化合物(参见,例如,WO 92/20642)、喹喔啉衍生物(参见(1994)Cancer Res.,54:6106-6114)、嘧啶衍生物(日本公开专利申请No.87834/94)和二甲氧基喹啉衍生物(参见Abstracts of the 116th Annual Meeting of the Pharmaceutical Societyof Japan(Kanazawa)(1996),2,p.275,29(C2)15-2)。
VEGFR酪氨酸激酶抑制剂的例子包括噌啉衍生物,例如,描述于美国专利号6,514,971中的那些,该专利的内容以它们的全文形式收作本文参考。其他这样的噌啉衍生物同样是已知的,例如,(1995)J.Med Chem.,38:3482-7公开了4-(3-溴苯胺基)噌啉;(1968)J.Chem.Soc.C,(9):1152-5公开了6-氯-4-苯氧基噌啉;(1984)J.Karnatak Univ.,Sci.,29:82-6公开了某些4-苯胺基噌啉;和(1973)Indian J.Chem.,11:211-13公开了某些4-苯基硫代噌啉。另外,(1973)J.Karnatak Univ.,18:25-30公开了某些4-苯氧基噌啉,(1984)J.Karnatak Univ.,Sci.,29:82-6公开了两种化合物:4-(4-甲氧基苯胺基)-6,7-二甲氧基噌啉和4-(3-氯苯胺基)-6,7-二甲氧基噌啉。另外,在4-号位置上具有通过选自--O--、--S--、--NH--和--CH2--的基团连接的苯环的某些噌啉描述于以下文献中:美国专利号5,017,579、美国专利号4,957,925、美国专利号4,994,474和EP 0302793A2。
用于抑制VEGFR和/或PDGFR的其他相关的化合物可以通过筛选新型化合物对目标受体酪氨酸激酶活性的影响获得,其中使用常规测定方法。候选PDGFR或VEGFR小分子有机抑制剂的有效抑制作用,可以使用基于细胞的测定系统监控,以及使用本领域所公知的其他测定系统。
例如,对于针对VEGF-受体酪氨酸激酶的活性的一种检测如下。所述检测是使用Flt-1VEGF-受体酪氨酸激酶进行的。详细过程如下:在室温下将溶于20mM Tris.HCl pH 7.5、3mM二氯化锰(MnCl2)、3mM氯化镁(MgCl2)、10μM钒酸钠、0.25mg/ml聚乙二醇(PEG)20000、1mM二硫苏糖醇和3μg/.mu.l poly(Glu、Tyr)4∶1(Sigma,Buchs,瑞士)、8μM[33P]-ATP(0.2μCi)、1%二甲基亚砜和0-100μM的要检测的化合物中的30μl激酶溶液(10ng的Flt-1的激酶结构域(参见Shibuya,等,(1990)Oncogene,5:519-24)一起温育10分钟。然后通过添加10μl的0.25M乙二胺四乙酸(EDTA)pH 7终止所述反应。使用多通道分配器(LAB SYSTEMS,美国),将20μl的等分试样应用到PVDF(=聚二氟乙烯(polyvinyl difluoride))Immobilon P膜(Millipore,美国)上,通过微量滴定过滤器歧管并且与真空连接。在完全消除液体之后,在含有0.5%磷酸(H3PO4)的水浴中连续洗涤所述膜四次,并且用乙醇洗涤一次,每次振荡温育10分钟,然后安装在Hewlett Packard TopCount Manifold上,并且在添加10μl Microscint.RTM.(β-闪烁计数器液体)之后测量放射性。通过对三种浓度的每一种化合物的抑制百分比的线性回归分析测定IC50-值(浓度通常为0.01μmol、0.1μmol和1μmol)。活性酪氨酸抑制剂化合物的IC50-值可以在0.01μM-100μM范围内。
另外,VEGF-诱导的VEGFR酪氨酸激酶/自身磷酸化活性可以用其他实验在细胞上证实。简单地讲,将能永久性表达人VEGF受体(VEGFR/KDR)的转染过的CHO细胞接种到六孔细胞培养平板中的完全培养基中(含有10%胎牛血清(FCS)),并在37℃下,在5%CO2中温育,直到表现出大约80%的汇合。在培养基(不含FCS,含有0.1%牛血清清蛋白)中稀释要检测的化合物,并且添加到细胞中(对照包括不含实验化合物的培养基)。在37℃下温育2小时之后,添加重组VEGF,最终的VEGF浓度为20ng/ml)。在37℃下再温育5分钟之后,用冰冷的PBS洗涤细胞两次,并且马上在每孔100μl的裂解缓冲液中裂解。然后对裂解液进行离心,以除去细胞核,并且使用商业化蛋白测定(BIORAD)来测定上清液的蛋白浓度。所述裂解液随后可以直接使用,或者需要的话在-200℃下保存。
然后进行夹心ELISA,以测量KDR-受体磷酸化:将KDR的单克隆抗体固定在黑色ELISA平板上(购自Packard的OptiPlateTM,HTRF-96)。然后洗涤所述平板,并且用溶于PBS的1%BSA饱和其余的游离蛋白结合位点。然后将细胞裂解液(20μg蛋白/孔)与和碱性磷酸酶偶联的抗磷酸酪氨酸抗体(例如,PY20:AP购自Transduction Laboratories,Lexington,KY)一起在4℃下在所述平板上温育过夜。再次洗涤所述平板,然后使用发光AP底物(CDP-Star,ready to use,with Emerald II;Applied-Biosystems TROPIX Bedford,MA)证实抗磷酸酪氨酸抗体与捕获的磷酸化受体的结合。用PackardTop Count Microplate Scintillation Counter测量发光。正对照(用VEGF或PDGF刺激的)和负对照(不用VEGF或PDGF刺激)信号之间的差异,相当于VEGF-诱导的KDR-受体磷酸化(=100%)。测试物质的活性是作为VEGF-诱导的KDR-受体磷酸化的%抑制计算的,其中,诱导最大抑制作用1/2的所述物质的浓度被定义为ED50(50%抑制作用的有效剂量)。活性酪氨酸抑制剂化合物的ED50值在0.001μM-6μM范围内,通常在0.005μM-0.5μM范围内。
药用制剂和治疗施用
所述抗-VEGF和抗-PDGF剂可用于治疗新血管疾病,包括银屑病、类风湿性关节炎和眼新血管疾病。特别感兴趣的是使用PDGF-B拮抗剂化合物与VEGF-A拮抗剂的组合抑制诸如黄斑变性或糖尿病性视网膜病的眼新血管疾病的治疗方法。因此,一旦诊断患者有危险发展为新血管疾病或患有这种疾病,就通过施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合对所述患者进行治疗,以分别阻断PDGF和VEGF的消极作用,从而抑制新血管疾病的发展,并且减轻与新生血管形成相关的有害作用。本发明方法的实施,不会导致角膜水肿。正如上文所讨论的,可以将多种PDGF和VEGF拮抗剂用于本发明中。
根据本发明的抗-PDGF和抗-VEGF组合治疗可以单独进行或者与其他治疗组合进行,并且可以在家庭、医务室、诊所、医院门诊部或医院提供。一般,治疗是在医院开始的,从而医生能够密切观察治疗效果,并且进行任何需要的调整。组合治疗的持续时间取决于要治疗的新血管疾病的类型、患者的年龄和状况、患者疾病的阶段和类型以及患者对治疗的反应。另外,有发展为新血管疾病的较大风险的人(例如,糖尿病患者)可以接受治疗,以抑制或延缓症状的发作。本发明所提供的一个显著优点是,将PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂组合用于治疗新血管疾病,使得能够施用低剂量的每一种拮抗剂,以及较少的总的活性拮抗剂,因此以较低毒性和副作用以及低成本提供了类似的功效。
组合治疗的每一种拮抗剂的施用都可以通过任何合适的方法进行,它导致了与其他拮抗剂组合的所述拮抗剂的浓度能有效治疗新血管疾病。例如,每一种拮抗剂都可以与合适的载体物质混合,并且一般它的使用量占组合物总重量的1-95%。所述组合物还能够以适合眼、口、肠胃外(例如,静脉内、肌内、皮下)、直肠、经皮、鼻或吸入施用的剂量形式提供。因此,所述组合物可以是以下形式的,例如,片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、悬浮液、乳剂、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏、乳膏、药膏、送递装置、栓剂、灌肠剂、可注射的、植入物、喷雾剂或气溶胶。含有一种拮抗剂或两种或两种以上拮抗剂的所述药用组合物可以按照常规制药方法制备(参见,例如,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(20th ed.)ed.A.R.Gennaro,2000,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA.和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.,J.Swarbrick和J.C.Boylan,1988-2002,Marcel Dekker,NewYork)。
在一个有用的方面,将PDGF和VEGF拮抗剂的组合进行肠胃外施用(例如,通过肌内、腹膜内、静脉内、眼内、玻璃体内、眼球后、结膜下、subtenon或皮下注射或植入)或全身性施用。用于肠胃外或全身性施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂。可以使用多种含水载体,例如,水、缓冲过的水、盐水等。其他合适媒介物的例子包括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、水凝胶、氢化naphalenes和可注射的有机酯,如油酸乙酯。所述制剂还可以包括辅助物质,如防腐剂、湿润剂、缓冲剂、乳化剂和/或分散剂。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制活性成分的释放。
另外,可以通过口摄入施用PDGF和VEGF拮抗剂的组合。用于口服使用的组合物能够以固体或液体形式制备,其按照药用组合物生产领域的任何已知方法进行。
用于口服施用的固体剂量形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。一般,所述药用制剂包括与无毒的可以药用的赋形剂混合的活性成分(如PDGF小有机分子拮抗剂和VEGF小有机分子拮抗剂)。所述赋形剂可以包括,例如,惰性稀释剂,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、纤维素、淀粉、磷酸钙、磷酸钠、高岭土等。还可以使用粘合剂、缓冲剂和/或润滑剂(例如,硬脂酸镁)。片剂和丸剂还可以使用肠溶衣制备。所述组合物可任选地包括增甜剂、增香剂、着色剂、加香剂和防腐剂,以提供更可口的制剂。
例如,所述PDGF和VEGF拮抗剂可以通过玻璃体内注射进行眼内施用,进入眼,以及进行结膜下和subtenon注射。其他施用途径包括经巩膜、眼球后、腹膜内、肌内和静脉内。另外,拮抗剂的组合可以使用药物送递装置或眼内植入物送递(参见下文)。
用于口服施用的液体剂量形式包括可以药用的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和软的胶囊。这些形式包括本领域常用的惰性稀释剂,如水或油介质,并且还可以包括佐剂,如湿润剂、乳化剂和悬浮剂。
在某些场合下,PDGF和VEGF拮抗剂的组合还可以局部施用,例如,通过贴剂或通过直接施用于区域,如容易患或患有新血管疾病的表皮或眼,或通过离子电渗疗法。
用于眼使用的与无毒的可以药用的赋形剂混合的制剂包括含有活性成分的片剂。所述赋形剂可以是,例如,惰性稀释剂或填料(例如,蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗结合剂(例如,硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
所述PDGF和VEGF拮抗剂可以在片剂或其他媒介物中混合,或者可以分隔。在一种例子中,第一种拮抗剂包含在片剂的内侧,而第二种拮抗剂在外侧,从而第二种拮抗剂的大部分是在第一种拮抗剂释放之前释放的。如果需要的话,片剂形式的拮抗剂可以使用药用送递装置送递(参见下文)。
一般,每一种拮抗剂的使用量应当足以抑制或减弱或消除新血管疾病的有害作用或症状。与载体材料混合以生产单一剂量的活性拮抗剂成分的用量可以根据要治疗的受试者和特定的施用模式改变。
请求保护的组合的每一种拮抗剂的剂量取决于若干因素,包括状况的严重性,所述状况是要治疗的还是要预防的,以及接受治疗的人的年龄、体重和健康。另外,有关特定患者的药物基因组学(pharmacogenomic)(基因型对治疗的药物代谢动力学、药物动力学或效力特征的影响)信息可能影响使用的剂量。另外,本领域技术人员可以理解能够根据多种因素稍微调整确切的单一剂量,所述因素包括要施用的特定的PDGF和VEGF拮抗剂的组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速度、要治疗的特定的新血管疾病、疾病的严重性以及新血管疾病的解剖学位置(例如,眼相对体腔)。考虑到多种施用途径的不同的效力,预计需要的剂量有较大的波动。例如,一般,预计口服施用需要比通过静脉内或玻璃体内注射施用更高的剂量水平。可以通过标准经验的最优化途径调整所述剂量水平的变化,所述途径为本领域所熟知。确切的治疗有效剂量水平和模式通常是通过主治医师,如眼科医生考虑上述因素确定的。
一般,在给人口服施用时,所述PDGF拮抗剂或VEGF拮抗剂的剂量通常在大约0.001mg-大约200mg/天范围内,理想地为大约1mg-100mg/天,更理想地为大约5mg-大约50mg/天。最高达大约200mg/天的剂量可能是必要的。为了通过注射施用所述PDGF拮抗剂或VEGF拮抗剂,所述剂量通常大约为0.1mg-大约250mg/天,理想地为大约1mg-大约20mg/天,或大约3mg-大约5mg/天。注射可以每天进行最多约四次。一般,在通过肠胃外途径或全身地给人施用时,与所述PDGF拮抗剂组合使用的VEGF拮抗剂的剂量通常为大约0.1mg-大约1500mg/天,或大约0.5mg-大约10mg/天,或大约0.5mg-大约5mg/天。最高达大约3000mg/天的剂量可能是必要的。
在给人眼施用时,与所述PDGF拮抗剂组合使用的VEGF拮抗剂的剂量通常为大约0.15mg-大约3.0mg/天,或大约0.3mg-大约3.0mg/天,或大约0.1mg-1.0mg/天。
例如,为了眼的使用,PDGF-B和VEGF-A适体药物物质是在pH 5-7的磷酸缓冲盐水中配制的。可以添加氢氧化钠或盐酸进行pH调节。在一种工作制剂中,PDGF-B适体和VEGF-A适体,如EYE001是以三种不同的浓度单独配制的:3mg/100μl、2mg/100μl和1mg/100μl,包装在装有无菌的27号针头的无菌的1ml,USP I型等级玻璃注射器中。药物产品的组合是不含防腐剂的,并且只可用于玻璃体内一次注射使用。所述活性成分是PDGF-B和VEGF-A药物物质,浓度为30mg/ml、20mg/ml和10mg/ml。所述赋形剂是氯化钠,USP;磷酸二氢钠,一水合物,USP;磷酸氢二钠,七水合物,USP;氢氧化钠,USP;盐酸,USP;和注射用水,USP。这种形式下,所述PDGF-B和VEGF-A适体药物产物是可直接使用的无菌溶液形式的,它是在一次性使用的玻璃注射器中提供的。在使用之前至少30分钟(不过不超过4小时)将注射器从冷藏中取出,以使溶液达到室温。注射器内容物的施用,涉及将带螺纹的塑料柱塞杆连接在注射器筒内的橡胶塞子。然后取出所述橡胶端帽,以施用所述产品。PDGF-B和VEGF-A适体是以100μl的玻璃体内注射液形式施用的,施用三次,间隔28天。患者每次就诊接受3mg/注射。如果必要,将剂量降低到2mg或1mg,并进一步到0.1mg。
所施用的药物的具体量取决于成分的具体组合。在需要的剂量组合中,PDGF拮抗剂与VEGF拮抗剂的重量比为大约50∶1,大约20∶1,大约10∶1,或大约4∶1,大约2∶1,或大约1∶1。
有用的组合治疗包括PDGF-B适体拮抗剂和VEGF-A适体拮抗剂。所述拮抗剂是以所述PDGF-B适体拮抗剂与VEGF-A适体拮抗剂的重量比为从大约0.1比大约5.0至大约5.0比0.1组合使用的。这两种拮抗剂(PDGF-B与VEGF-A拮抗剂)的有用范围为从大约0.5至大约2.0,或从大约2.0至0.5,不过,另一种有用的比例为从大约1.0至大约1.0,最终取决于所述PDGF-B适体拮抗剂和VEGF-A适体拮抗剂的选择。
在组合治疗中每一种药物的施用可独立地为每天1-4次,施用一天至一年时间,并且甚至可以使患者终生施用。慢性的、长期施用在很多情况下需要指出。所述剂量可以作为单剂施用或者分成多剂。一般,需要的剂量应当以设定的间隔时间施用较长时间,通常至少用几周时间,尽管几个月或更长的施用时间可能是必要的。
除了治疗以前存在的新血管疾病之外,包括PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合治疗可以预防性地进行施用,以预防或延缓所述疾病的发作。在预防性应用中,给易患或另外有风险患特定新血管疾病的患者施用所述PDGF和VEGF拮抗剂。另外,施用的确切时间选择和施用的量取决于多种因素,如患者的健康状态、体重等。
在一种工作实例中,给需要用它治疗的哺乳动物施用所述PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合,通常以可以注射的药用组合物形式施用。在所述组合方面,例如,PDGF-B适体和VEGF-A适体可以单独施用或者以包括这两种成分的药用组合物形式施用。一般,优选的是,所述施用可以通过注射或通过使用药物送递装置进行。肠胃外、全身性或经皮施用也是可以接受的。
如上文所讨论的,当所述PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂同时施用时,所述施用可以是在时间上依次进行的或者同时进行的,依次施用的方法是一种施用模式。当所述PDGF和VEGF拮抗剂依次施用时,每一种成分的施用可以通过相同或不同的方法进行。不过,对于依次施用来说,可以使用以下方法:在大约五秒钟时间内施用所述PDGF拮抗剂(最多达大约三次注射),然后每六周时间持续施用VEGF拮抗剂,最多达每年注射大约九次。所述PDGF拮抗剂可以在每一次VEGF拮抗剂注射的同时施用,或者可以使用的次数更少,这由医生决定。依次施用还包括组合,其中,单独的拮抗剂可以以不同次数施用,或者通过不同的途径施用,或者为上述两者,但它们组合起作用以提供有利的效果,例如,抑制新血管疾病。还要指出的是,通过注射施用是特别有用的。
可以将本发明的药用组合物配制成基本上在施用之后马上或者在施用之后任何预定时间段释放活性PDGF和VEGF拮抗剂,其中使用控释制剂。例如,包括PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂中的至少一种的药用组合物能够以持续释放组合物的形式提供。马上或持续释放组合物的使用取决于要治疗的状况的性质。如果所述状况由急性或超急性疾病组成的话,一般用马上释放形式进行治疗优于长时间释放组合物。对某些预防性或长期治疗来说,持续释放组合物也可能是合适的。
在控释制剂中施用每一种拮抗剂是有用的,其中,所述拮抗剂单独或组合具有(i)窄的治疗指数(例如,导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度和导致治疗效果的血浆浓度之间的差异较小;一般,治疗指数TI被定义为半致死剂量(LD50)与半有效剂量(ED50)的比例);(ii)在胃肠道中的窄的吸收窗口;或(iii)短的生物学半衰期,从而在一天内需要经常服药,以便将血浆水平维持在治疗水平上。
可以采用多种策略获得控释,其中,释放速度超过了治疗性拮抗剂的降解或代谢速度。例如,控释可以通过适当选择制剂参数和成分获得,包括例如,合适的控释组合物和包衣。其例子包括单一或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳剂、微型胶囊剂、小球体、纳米颗粒(nanoparticle)、贴剂和脂质体。用于制备所述持续释放或控释制剂的方法为本领域所熟知。
包括PDGF拮抗剂和/或VEGF拮抗剂或这两者的药用组合物还可以使用药物送递装置,如植入物送递。所述植入物可以是生物可降解的或生物相容性植入物,或者可以是不能生物降解的植入物。所述植入物可以是活性剂能够渗透或不能渗透的。眼用药物送递装置可以插入眼的腔室,如前部或后部腔室,或者在巩膜、脉络膜间隙或者玻璃体外部的无血管区之中或之上植入。在一种实施方案中,所述植入物可以放置在无血管部位上面,如巩膜上,从而能够进行药物的经巩膜扩散,使药物到达需要的部位,例如,眼内间隙和眼的黄斑。另外,经巩膜扩散的部位可以靠近新生血管形成部位,如接近黄斑的部位。
如上文所述,本发明涉及将独立的药用组合物组合在药物包中。因此,本发明的组合是以药物包的成分形式提供的。可以将至少两种拮抗剂配制在一起,或者单独配制,并且以独立的剂量使用。本发明的拮抗剂在以盐的形式制备时也是有用的。
一般,所述药物包包括(1)一定量的PDGF拮抗剂,和可以药用的载体、媒介物或稀释剂,它在第一种单位剂量形式中;(2)一定量的VEGF拮抗剂,和可以药用的载体、媒介物或稀释剂,它在第二种单位剂量形式中;和(3)容器。所述容器可用于分隔成分,并且可以包括,例如,分隔开的瓶子或分隔开的箔包装。如果需要,所述独立的拮抗剂组合物还可以容纳在单一的、未分开的容器中。所述药物包还可以包括施用独立的PDGF和VEGF拮抗剂的指南。当独立的成分是以不同的剂量形式施用时,以不同的剂量水平施用的,或者需要由处方医生决定所述组合的单独成分的效价时,所述药物包是特别有利的。在一种实施方案中,将所述药物包设计成每次分配一个所述PDGF和VEGF拮抗剂的剂量,以用于它们预期的用途。在另一种例子中,将药物包设计成包括在包装中并排放置的一排PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂,通过包装上的说明告知用户要施用的一对拮抗剂。一种示例性的药物包是所谓的气泡(blister)包装,这种包装为药物包装工业所熟知。
效力
新血管疾病的抑制是通过任何可接受的测量血管生成是否延缓或减弱的方法评估的。这包括直接观察和间接评估,如通过评估主观症状或客观生理学指标。例如,治疗效力,可以根据新生血管形成、微血管病、血管泄漏或血管水肿或它们的任何组合的预防或恢复评估。用于评估眼新血管疾病的抑制作用的治疗效力还可以以稳定或改善视敏度的形式确定。
在确定特定组合治疗在治疗或预防眼新血管疾病时的效力时,还可以由眼科医生在注射之后几天以及紧在下一次注射前的至少一个月后对患者进行临床评估。还可以根据眼科医生的要求在前四个月每个月一次地进行ETDRS视敏度、柯达彩色胶片照相术和荧光素血管造影术。
例如,为了评估PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂组合治疗眼新生血管形成的效力,进行的研究涉及施用一次或多次的玻璃体内注射PDGF-B适体与VEGF-A适体的组合(例如,EYE001的PEG化的形式),用于患有对于年龄相关性黄斑变性继发的凹窝下(subfoveal)脉络膜新生血管形成的患者,其按照眼科学领域所熟知的标准方法进行。在一种工作研究中,患有对于年龄相关性黄斑变性(AMD)继发的凹窝下脉络膜新生血管形成(CNV)的患者接受PDGF-B适体和VEGF-A适体的一次玻璃体内注射。监控所述组合的效力,例如,通过眼科评估。在治疗之后三个月患者表现出稳定的或改善的视力,例如,在ETDRS图表上表现出视力的3-线或更多改善被认为接受了有效剂量的PDGF-B适体和VEGF-A适体的组合,该剂量能抑制眼新血管疾病。
在工作研究例子中,患有对于年龄相关性黄斑变性继发的凹窝下CNV并且在ETDRS图表上视敏度低于20/200的患者接受PDGF-B适体和VEGF-A适体的一次玻璃体内注射。起始剂量为每次在玻璃体内注射0.25mg的每一种拮抗剂。还实验了每一种拮抗剂的0.5mg、1、2mg和3mg的剂量。还通过眼底照相和荧光素血管造影术进行了全面的眼科检查。组合的药物产品是可直接使用的无菌溶液,它由溶解在10mM磷酸钠和0.9%氯化钠缓冲液注射液中的所述PDGF-B适体和VEGF-A适体组成,所述注射液处于无菌的、无致热原的1cc玻璃注射器筒中,将包衣的塞子连接在塑料柱塞上,并且将橡胶端盖连接在预先连接的27号针头上。所述PDGF-B和VEGF-A适体是以每一种适体1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml或30mg/ml的药物浓度提供的(用寡核苷酸含量表示),以提供100μl的送递体积。在注射所述PDGF-B和VEGF-A适体之后大约3个月,进行敏度研究,以便评估治疗效果。在治疗之后,患者表现出稳定的或改善的视力,例如,在ETDRS图表上表现出3-线或以上的视力增加的患者被认为接受了有效剂量的组合的PDGF-B和VEGF-A适体,它们抑制眼新血管疾病。
实施例
以下实施例说明了制备和实施本发明的某些方式,但是,并不意味着限定本发明的范围,因为可以用其他方法获得类似结果。
实施例1:角膜新生血管形成(角膜NV)
角膜新生血管形成是广泛使用的动物模型,它允许明确显现眼中的异常血管生长。生长成正常无血管角膜的血管可以很好地建立,使它成为研究血管退化的有吸引力的模型。为了诱导实验角膜NV,通过肌内施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)对雄性C57BL/6小鼠(18-20g;Charles River,Wilmington,MA)进行麻醉。局部施用NaOH(2μl,0.2mM)。通过使用#21刀片(Feather,Osaka,日本)施加平行于角膜缘的旋转运动,取出角膜和角膜缘上皮。7天之后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanibsodium(MacugenTM(Eyetech Pharmaceuticals,New York,NY),抗-VEGF适体试剂,又被称作EYE001),或通过每天两次管饲法口服施用50mg/kg的((又被称作CGP57148B),2-苯基氨基嘧啶-相关的酪氨酸激酶-抑制性抗-PDGF剂,购自NovartisPharma AG,Basel,瑞士)或这两者,共处理小鼠7天时间。在角膜NV诱导之后14天,使小鼠静脉内接受20μg/g的异硫氰酸荧光素偶联的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories,Burlingame,CA),同时用盐酸甲苯噻嗪和盐酸氯胺酮进行深度麻醉。30分钟之后,摘出小鼠眼,并且对角膜进行扁平封固(flat-mounted)。通过荧光显微镜术显现角膜NV,并且使用Openlab软件定量。由血管覆盖的角膜的百分比是以角膜总面积的百分比形式计算的。
研究了在应用NaOH之后pegaptanib sodium和Gleevec对角膜新生血管形成的影响,以及对角膜缘和角膜上皮的损伤。与未处理过的和Gleevec处理的眼相比,用pegaptanib sodium(Macugen)处理过的动物表现出血管生长的19.6%的降低(p=0.0014)(图5)。与对照和用Gleevec单独处理的动物相比,用pegaptanib sodium和Gleevec(Mac+Glee)处理的动物在角膜上表现出新血管生长的显著减弱(35.6%p<0.0001)(图5)。在减弱血管生长方面,组合治疗同样比pegaptanib sodium(Macugen)单独治疗更有效(16%p<0.0145)。
在图6和7中还示出了代表性的角膜新生血管形成实验的结果。图6(D)是荧光显微镜图像的照片图示,表明与用Macugen(图6(C))或Gleevec(图6(B))处理的个体相比,组合(Mac+Gleevec)-处理的角膜表现出新血管形成的有效抑制。图6(A)是荧光显微镜图像的照片图示,示出了在对照(PEG-处理的)角膜上新生血管形成的程度。图7是荧光显微镜图像的照片图示,表示单独(图7(A)(APB5-处理的)和图7(B)(Gleevec-处理的))和组合处理(图7(C))只能抑制新血管生长,而不能影响形成的血管。图7(D)是荧光显微镜图像的照片图示,示出了在对照(PEG-处理的)角膜上新生血管形成的程度。
实施例2:脉络膜新生血管形成(CNV)
实验CNV通常被用作年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。在该模型中,脉络膜的血管生长突破玻璃膜,并且进入视网膜,与AMD患者体内观察到的类似。为了诱导实验CNV,通过肌内施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)对雄性C57BL/6小鼠(18-20g;Charles River,Wilmington,MA)进行麻醉,并且用1%托品酰胺扩张瞳孔。使用二极管激光凝固(75-μm斑点大小,0.1-秒持续时间,90mW,Oculight SL laser,IRIDEX,Mountain View,CA)和作为接触透镜的手持式盖玻片产生四个灼伤。灼伤位于视网膜后极的3、6、9和12点钟的位置。在激光时产生的气泡,表明了玻璃膜的破裂,它是获得脉络膜新生血管形成的重要因素,因此,仅将在所有四个灼伤上都产生气泡的小鼠用在本研究中。7天之后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanib sodium或通过每天两次管饲50mg/kg的(Novartis Pharma AG,Basel,瑞士)或同时进行这两者来处理小鼠7天时间。在使用APB5(抗-小鼠PDGFRb(CD140b)抗体(抗-PDGF剂),购自eBioscience,SanDiego,CA)的实验中,通过腹膜内注射每天两次施用5mg/kg抗体,在用PECAM染色的扁平封固的脉络膜中测量脉络膜NV损伤的面积。通过荧光显微镜术检查扁平封固,并且通过Openlab软件定量。
与未处理过的对照相比,用pegaptanib sodium(MacugenTM)处理的眼表现出CNV面积降低了24%(p=0.007)(图8)。相反,APB5-处理的眼与对照相比没有明显的差别(与对照相比CNV面积减少了6.5%)。与对照眼或用pegaptanib sodium(22%p=0.011)或APB5(39.5%p<0.0001)单独处理的眼相比,用pegaptanib sodium和APB5二者处理的眼表现出CNV面积的明显减少(46%p=0.001)(图8)。
在使用PDGFRβ抑制剂时,观察到了类似的倾向。处理的眼与对照眼相比没有表现出显著差别(4.2%)(图9)。不过,用pegaptanib sodium(MacugenTM)处理的眼的CNV面积与对照明显不同(少27%,p=0.0034)。重要的是,用pegaptanib sodium和Gleevec处理过的动物(Macugen+Gleevec)与对照眼相比表现出最小量的CNV(46%p<0.0001),且与pegaptanib sodium单独处理的眼相比表现出CNV面积减少了19%(p=0.0407)(图9)。
实施例3:新生小鼠模型
研究了施用pegaptanib sodium(MacugenTM)和ARC-127(Archemix Corp.,Cambridge,MA),即具有序列CAGGCUACGNCGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(SEQ ID NO:20)(参见来自U.S.6,582,918的SEQ ID NO:146,所述文献被以全文形式收作本文参考)的PEG化的抗-PDGF适体或这两者对视网膜血管发育的影响,所述序列在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”上具有六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向的T(即,3′-3′-连接的)。新生的C57BL/6小鼠每天一次注射(腹膜腔内)100μg的ARC-127或100μg的Macugen或这两者,在出生后当天0(P0)开始。在P4摘出小鼠眼。在扁平封固的视网膜上显现视网膜脉管系统,其通过用PECAM和NG-2免疫染色,或者通过用ConA-FITC灌注,并且通过荧光显微镜术分析实现。
注射ARC-127,能完全阻断壁细胞被招募用于发育视网膜的血管。另外,与对照未-处理的视网膜相比,在P4观察到了较少的血管生长。相反,Macugen不会干扰正常的血管发育。不过,与单独使用ARC-127处理的小鼠相比,用Macugen和ARC-127两者处理的小鼠表现出类似的,但是明显更严重的缺陷。
在图10中示出的结果表明,Macugen对发育中的视网膜的血管没有影响。PDGFR-B拮抗剂ARC-127能影响血管长出和形态学。不过,Macugen与ARC-127组合,比它们单独对血管的影响更严重。
实施例4:用抗-PDGF适体和抗-VEGF抗体的组合治疗
在本实施例中,用上述角膜新生血管形成模型,用抗-PDGF适体和抗-VEGF抗体证实了组合治疗的效力。为了诱导实验角膜NV,通过肌内施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)对雄性C57BL/6小鼠(18-20g;Charles River,Wilmington,MA)进行麻醉。局部应用NaOH(2μl,0.2mM)。通过使用#21刀片(Feather,Osaka,日本)施加平行于角膜缘的旋转运动取出角膜和角膜缘上皮。7天之后,通过腹膜内注射25mg/kg具有以下结构40KdPEG-5′-CAGGCTACGCGTAG-AGCATCATGATCCTG(iT)-3′(SEQID NO:21)的抗-PDGF适体(其中,iT表示最后的核苷酸是沿反方向的(3′-3′连接的))和描述于U.S.6,342,221(被收作本文参考)中的100μg的抗-VEGF抗体2C3组合处理所述小鼠。在角膜NV诱导之后14天,小鼠静脉内接受20μg/g的异硫氰酸荧光素偶联的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories,Burlingame,CA),同时用盐酸甲苯噻嗪和盐酸氯胺酮深度麻醉。30分钟之后,摘出小鼠眼,并且对角膜进行扁平封固。通过荧光显微镜术观察角膜NV,并且通过Openlab软件定量。由血管覆盖的角膜的百分比是作为总角膜面积的百分比计算的。结果表明,组合治疗的效力优于用抗-PDGF适体或抗-VEGF抗体单独治疗的结果。
在单独实验中,检验了两种相关的抗-PDGF适体与U.S.6,342,221中所描述的100μg的抗-VEGF抗体2C3组合的效果。检验了PEG化的和未-PEG化的的形式的以下两种抗-PDGF适体:
(i)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(SEQID NO:20)(参见U.S.6,582,918的SEQ ID NO:146,所述文献被以全文形式收作本文参考),其在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”上具有六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向的T(即,3′-3′-连接的);和
(ii)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(SEQID NO:22)(参见U.S.5,723,594的SEQ ID NO:87,所述文献被以全文形式收作本文参考),其在8号位置的C上具有O-甲基-2-脱氧胞苷,在9、17和31号位置的Gs上具有2-O-甲基-2-脱氧鸟苷,在22号位置的A上具有2-O-甲基-2-脱氧腺嘌呤,在30号位置上具有2-O-甲基-2-脱氧尿苷,在6和20号位置的U上具有2-氟-2-脱氧尿苷,在21、28和29号位置的C上具有2-氟-2-脱氧胞苷,在10和23号位置的N上具有五甘醇(pentaethylene glycol)亚磷酰胺间隔基,并且在32号位置上具有颠倒方向的T(即,3′-3′-连接的)。提供适当的对照,以便检测与单独的抗-PDGF适体或抗-VEGF抗体的治疗相比,组合治疗的改善了的抗新血管作用。以上结果证实了组合治疗的效力好于单独使用抗-PDGF适体或抗-VEGF抗体的治疗的效力。
实施例5:抗-PDGF适体和抗-VEGF适体的组合能阻断脉络膜
新生血管形成(CNV)
在本实施例中,利用上述脉络膜新生血管形成模型证实了用抗-PDGF适体和抗-VEGF适体在阻断脉络膜新生血管形成方面的组合治疗效力。实验性的CNV通常被用作年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。在该模型中,脉络膜的血管生长突破玻璃膜,并且进入视网膜,与在AMD患者中观察到的类似,为了诱导实验CNV,通过肌内施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)对雄性C57BL/6小鼠(18-20g;Charles River,Wilmington,MA)进行麻醉,并且用1%托品酰胺扩张瞳孔。使用二极管激光凝固(75-μm斑点大小,0.1-秒持续时间,90mW,Oculight SL laser,IRIDEX,Mountain View,CA)和作为接触透镜的手持式盖玻片产生四个灼伤。所述灼伤位于视网膜后极的3、6、9和12点钟的位置上。在激光时产生气泡,表明了玻璃膜的破裂,它是获得脉络膜新生血管形成的重要因素,因此,仅将在所有四个灼伤都产生了气泡的小鼠用于本研究。7天之后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanib sodium处理小鼠。在使用抗-PDGF适体的实验中,将具有以下结构40KdPEG-5′-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGA-TCCTG(iT)-3′(SEQID NO:21)(其中iT表示最后的核苷酸是颠倒方向的(3′-3′连接的))的25mg/kg的抗-PDGF适体与pegaptanib sodium共施用。在用PECAM染色的扁平封固的脉络膜中测量脉络膜NV损伤的面积。通过荧光显微镜术检查扁平封固,并且通过Openlab软件定量。结果表明,用组合治疗处理的眼与对照眼或与单独使用pegaptanib sodium或抗-PDGF适体处理的眼相比表现出明显更小的CNV面积。
在独立实验中,与抗-VEGF治疗组合检验了两种相关的抗-PDGF适体的效果,其通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanibsodium实现。实验了PEG化的和未-PEG化的形式的以下两种抗-PDGF适体:
(i)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(SEQID NO:20)(参见U.S.6,582,918的SEQ ID NO:146,所述文献被以全文形式收作本文参考),在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”上具有六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向的T(即,3′-3′-连接的);和
(ii)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(SEQID NO:22)(参见U.S.5,723,594的SEQ ID NO:87,所述文献被以全文形式收作本文参考),在8号位置的C上具有O-甲基-2-脱氧胞苷,在9、17和31号位置的Gs上具有2-O-甲基-2-脱氧鸟苷,在22号位置的A上具有2-O-甲基-2-脱氧腺嘌呤,在30号位置上具有2-O-甲基-2-脱氧尿苷,在6和20号位置的U上具有2-氟-2-脱氧尿苷,在21、28和29号位置的C上具有2-氟-2-脱氧胞苷,在10和23号位置的N上具有五甘醇亚磷酰胺间隔基,且在32号位置上具有颠倒方向的T(即,3′-3′-连接的)。提供了合适的对照,以便检测与单独的抗-PDGF适体或抗-VEGF适体治疗相比,组合治疗具有改善了的抗-新血管作用。结果表明,组合治疗在阻断脉络膜新生血管形成方面的效力,好于用抗-PDGF适体或抗-VEGF适体单独治疗的效力。
实施例6:角膜新生血管形成(角膜NV)-退化
将实施例1的角膜NV模型用于研究抗-VEGF适体和抗-PDGF适体的组合。10天之后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanib sodium(MacugenTM,Eyetech Pharmaceuticals,NewYork,NY),抗-VEGF适体试剂)和/或每天一次施用50mg/kg的ARC-127(Archemix Corp.,Cambridge,MA,抗-PDGF适体,具有以下结构40KdPEG-5′-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGA-TCCTG(iT)-3′(SEQID NO:21)(其中iT表示最后的核苷酸是颠倒方向的(3′-3′连接的))处理小鼠10天时间。在角膜NV诱导之后第20天,摘出眼,并且对角膜进行扁平封固。使用CD31染色(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)显现角膜NV,并且用Metamorph软件进行定量。由血管覆盖的角膜的百分比是以角膜总面积的百分比形式计算的。
在图11和12中示出了pegaptanib sodium和/或ARC-127对于在应用NaOH之后使角膜新生血管形成退化和对角膜缘和角膜的上皮损伤方面的作用。与第20天的对照相比,用ARC-127处理的动物没有表现出血管生长的明显减弱。与第10天的对照相比,第20天的对照表现出角膜新生血管形成增加了12.92%。与第20天的对照相比,单独使用pegaptanib sodium(Macugen)处理过的动物表现出血管生长减弱了13.81%(p≤.016)。与对照相比,用pegaptanib sodium和ARC-127处理的动物表现出角膜新血管生长的明显减弱(26.85%,p≤.002)。
实施例7:角膜新生血管形成(角膜NV)-退化
将实施例1的角膜NV模型用于研究抗-VEGF适体和抗所述PDGFB受体的抗体的组合。在14天后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanib sodium(Macugen,抗-VEGF适体试剂)和/或每天两次通过管饲口服施用50mg/kg的APB5(抗所述PDGFB受体的多克隆抗体)处理小鼠14天。在角膜NV诱导之后第28天,小鼠通过静脉内途径接受20μg/g的异硫氰酸荧光素偶联的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories,Burlingame,CA),同时用盐酸甲苯噻嗪和盐酸氯胺酮进行深度麻醉。30分钟之后,摘出小鼠眼,并且对角膜进行扁平封固。通过荧光显微镜术显现角膜NV,并且通过Openlab软件定量。由血管覆盖的角膜的百分比是以角膜总面积的百分比形式计算的。
在图13中示出了pegaptanib sodium和/或APB5对在应用NaOH之后使角膜新生血管形成退化,以及对角膜缘和角膜上皮损伤的影响。与对照相比,用pegaptanib sodium(Macugen)处理过的动物表现出血管生长减弱了8.3%。与对照相比,用pegaptanib sodium和APB5处理的动物在角膜上表现出显著更少的新血管生长(21.4%)。
实施例8:角膜新生血管形成(角膜NV)-退化(添加治疗剂的
顺序)
将实施例1的角膜NV模型用于研究使用抗-VEGF适体和抗所述PDGFB受体的抗体进行组合治疗的添加顺序的影响。14天之后,通过每天两次腹膜内注射25mg/kg的pegaptanib sodium(Macugen,抗-VEGF适体试剂)和/或通过每天两次管饲口服施用50mg/kg的APB5(eBioscience,San Diego,CA),即抗所述PDGFB受体的多克隆抗体,在不同的时间点处理小鼠7天时间。在角膜NV诱导之后第28天,小鼠通过静脉内途径接受20μg/g的异硫氰酸荧光素偶联的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories,Burlingame,CA),同时用盐酸甲苯噻嗪和盐酸氯胺酮深度麻醉。30分钟之后,摘出小鼠眼,并且对角膜进行扁平封固。通过荧光显微镜术显现角膜NV,并且通过Openlab软件定量。由血管覆盖的角膜的百分比是以角膜总面积的百分比形式计算的,并且结果如图14所示。
与对照相比,在应用NaOH之后对角膜新生血管形成的退化和对角膜缘和角膜上皮的损伤方面,在第21-28天单独使用pegaptanibsodium或在第14-21天单独使用APB5随后不进行处理的作用具有很小的影响。与对照相比,从第14-21天用APB5处理,以及从21-28天用pegaptanib sodium处理的动物在角膜上表现出更少的新血管生长(13.4%)。
等同方案
在不超出本发明的范围和精神的前提下,对本发明上述方法和体系所进行的各种修饰和改变对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管业已结合特定的理想实施方案对本发明进行了说明,但应当理解的是,所请求保护的发明不应当过分局限于所述具体实施方案。本领域技术人员可以理解或者能够在只进行常规实验的情况下确定,本文所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。所述等同方案意在包括在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种药用组合物,其包括:(i)PDGF拮抗剂;(ii)VEGF拮抗剂;和(iii)可药用的载体,其中,所述的PDGF拮抗剂是抗-PDGF-B剂,其中所述抗-PDGF-B剂是PEG化或非PEG化的下述抗-PDGF-B适体:
所述适体的序列如CAGGCUACGN CGTAGAGCAUCANTGATCCU GT所示,其在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”来自六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向即,3′-3′-连接的T;
所述的VEGF拮抗剂是抗-VEGF-A抗体或其结合片段,
所述PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂以有效治疗患者的潮湿型年龄相关性黄斑变性的量存在。
2.PDGF拮抗剂与VEGF拮抗剂在制备用于治疗潮湿型年龄相关性黄斑变性的药物中的用途,其中,所述的PDGF拮抗剂是抗-PDGF-B剂,其是PEG化或非PEG化的下述抗-PDGF-B适体:
所述适体的序列如CAGGCUACGN CGTAGAGCAUCANTGATCCU GT所示,其在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”来自六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向即,3′-3′-连接的T;
所述的VEGF拮抗剂是抗-VEGF-A抗体或其结合片段,且
其中,所述的PDGF拮抗剂和所述的VEGF拮抗剂同时或先后施用。
3.如权利要求1的组合物,其中所述PDGF拮抗剂是PEG化抗-PDGF-B适体。
4.如权利要求2的用途,其中,所述PDGF拮抗剂是PEG化的抗-PDGF-B适体。
5.药物包,其包括:(i)含PDGF拮抗剂的组合物;(ii)含VEGF拮抗剂的组合物;其中,所述的PDGF拮抗剂是抗-PDGF-B剂,其是PEG化或非PEG化的下述抗-PDGF-B适体:
所述适体的序列如CAGGCUACGN CGTAGAGCAUCANTGATCCU GT所示,其在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”来自六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向即,3′-3′-连接的T;
所述的VEGF拮抗剂是抗-VEGF-A抗体或其结合片段。
6.如权利要求5的药物包,其中,所述PDGF拮抗剂是PEG化抗-PDGF-B适体。
7.PDGF拮抗剂与VEGF拮抗剂在制备用于治疗患者中的潮湿型年龄相关性黄斑变性的药物包中的用途,
其中所述的PDGF拮抗剂是抗-PDGF-B剂,其是PEG化或非PEG化的下述抗-PDGF-B适体:
所述适体的序列如CAGGCUACGN CGTAGAGCAUCANTGATCCU GT所示,其在6、20和30号位置上具有2′-氟-2′-脱氧尿苷,在8、21、28和29号位置上具有2′-氟-2′-脱氧胞苷,在9、15、17和31号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧鸟苷,在22号位置上具有2′-O-甲基-2′-脱氧腺苷,在10和23号位置的“N”来自六甘醇亚磷酰胺,并且在32号位置上具有颠倒方向即,3′-3′-连接的T;
其中所述的VEGF拮抗剂是抗-VEGF-A抗体或其结合片段,且
其中所述的PDGF拮抗剂和所述的VEGF拮抗剂同时或先后施用。
8.如权利要求7的用途,其中,所述PDGF拮抗剂是PEG化抗-PDGF-B适体。
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