CN115397850A

CN115397850A - 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法

Info

Publication number: CN115397850A
Application number: CN202180026339.7A
Authority: CN
Inventors: 罗兰·贝克曼; 克里斯蒂安·赫伯特·延森; 胡贝特·克滕贝格尔; 雅尼娜·施佩克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2022-11-25
Also published as: EP4126940A1; JP2023520414A; US20230105324A1; WO2021198034A1

Abstract

本发明涉及抗VEGF/抗PDGF‑B抗体及其使用方法。

Description

与VEGF和PDGF-B结合的抗体及其使用方法

技术领域

本发明涉及抗VEGF/抗PDGF-B抗体及其使用方法。

背景技术

之前已经提出了使用单独的VEGF和PDGF拮抗剂来阻断VEGF和PDGF以治疗眼部新生血管疾病的组合疗法(WO2005/020972、WO2010/127029、WO2016/025313)。

与PDGF-B和VEGF结合的双特异性抗体先前已有报道，并被建议用于治疗眼部血管疾病(WO2016/075036，抗体“0117”)。双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体0117是一种全长IgG样抗体，在一个结合臂中具有结构域交叉交换(Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)。VEGF结合臂包含抗VEGF抗体雷珠单抗的VH和VL结构域。

在一对可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)中包含两个互补位的多特异性抗体已经描述于WO2008/027236；WO2010/108127和Bostrom,J.,等人,Science 323(2009)1610-1614以及于WO2012/163520中。

WO2012/163520公开了在一对VH和VL结构域(“DutaFab”)中包含两个非重叠互补位的双特异性抗体。WO2012/163520的双特异性抗体的每个互补位包含来自重链和来自轻链CDR的氨基酸，其中重链CDR-H1和CDR-H3以及轻链CDR-L2促成第一互补位，而轻链CDR-L1和CDR-L3以及重链CDR-H2促成第二互补位。从两个独立的Fab文库中独立筛选包含单独互补位的单特异性抗体。鉴定所述单特异性抗体的氨基酸序列，并合并成双互补位的VH和VL对。WO2012/163520中公开了一种与VEGF和IL-6特异性结合的示例性Fab片段。

需要与VEGF和PDGF-B结合的改进的治疗性抗体。

发明内容

本发明涉及双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体及其使用方法。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中VEGF互补位包含来自抗体的CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基，其中PDGF-B互补位包含来自抗体的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在VL结构域和VH结构域的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中可变轻链结构域和可变重链结构域对同时结合人VEGF和人PDGF-B。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在VL结构域和VH结构域的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中包含在VEGF互补位中的氨基酸无一包含在PDGF-B互补位中。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在VL结构域和VH结构域的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中抗体与具有SEQ IDNO:11的可变重链结构域和SEQ ID NO:21的可变轻链结构域的抗体相比，与人VEGF上的相同表位和与人PDGF-B上的相同表位结合。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。在一个实施例中，抗体包含VEGF互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及包含在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及PDGF-B互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、D73、D74、T75、N76、R94、D96、D98、D101和T102，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：E55和H56。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。在一个实施例中，抗体包含VEGF互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及PDGF-B互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、D73、D74、T75、N76、R94、D96、D98、D101和T102，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：E55和H56。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中该VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、R66、D73、D74、T75、N76和R94；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中该VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、H68和E69，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一个实施例中，抗体包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:21的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗体包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:32的氨基酸序列的轻链框架区1(L-FR-1)。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:31的VL序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:19的轻链氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:30的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含SEQID NO:30的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，其中抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；其中该抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

在一个方面，本发明提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

本发明的一个实施例涉及与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体片段。本发明的一个实施例涉及与人VEGF和与人PDGF-B结合的双特异性抗体片段。在一个实施例中，抗体片段选自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂或由其衍生的单链抗体。本发明的一个实施例涉及与人VEGF和与人PDGF-B结合的Fab片段。本发明的一个实施例涉及与人VEGF和与人PDGF-B结合的Fv片段。

本发明的一个实施例涉及与人VEGF和与人PDGF-B结合的全长IgG抗体。

在一个方面，本发明提供了一种编码本发明抗体的分离的核酸。

一方面，本发明提供了一种包含本发明核酸的宿主细胞。

一方面，本发明提供了一种包含本发明核酸的表达载体。

在一个方面，本发明提供了一种产生与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体的方法，其包括培养本发明所述的宿主细胞，从而产生抗体。

一方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的抗体。

在一个方面，本发明提供了一种包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的药物配制物。

在一个方面，本发明提供了用作药物的本发明的抗体，在一个实施例中，其用于治疗血管疾病。

在一个方面，本发明提供了本发明的抗体或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，在一个实施例中，其用于制备治疗血管疾病的药物。

在一个方面，本发明提供了一种治疗患有血管疾病的个体的方法，其包括向个体施用有效量的本发明的抗体或本发明的药物组合物。

在一个方面，本发明提供了一种抑制个体中血管生成的方法，其包括向个体施用有效量的本发明的抗体或本发明的药物组合物以抑制血管生成。

根据本发明，提供了治疗性抗VEGF/抗PDGF-B抗体，即使当以双特异性Fab片段形式提供时，所述也能够同时结合其靶抗原。此外，本发明的抗体提供了允许其治疗应用的几个有价值的性质，如高亲和力、亲水性、高稳定性和高VEGF121和VEGF165阻断活性。本发明的抗体可以以高浓度液体配制剂提供，其粘度适合于眼部应用。本发明的抗体适用于眼部血管疾病的治疗。

附图说明

图1：本发明的抗VEGF/抗PDGF-B抗体的Fab片段的示意图。显示的是同源VH/VL对的俯视图，包括CDR氨基酸的排列(上图)。VH结构域以灰色表示，VL结构域以白色表示。此外，指示了CDR区的空间排列。高亮显示本发明的抗体的互补位区域(下图)，其中VEGF互补位被排列在H-CDR2、L-CDR1和L-CDR2的区域中，PDGF-B互补位被排列在H-CDR1、H-CDR3和L-CDR2的区域中。LN：VL结构域的N末端；HN：VH结构域的N末端；

图2：本发明的示例性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的VH结构域的氨基酸序列。指示了氨基酸位置的Kabat编号，以及CDR和FR区。突出显示了促成VEGF互补位的氨基酸位置，以及在实例8中鉴定的PDGF-B互补位。

图3：本发明的示例性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的VL结构域的氨基酸序列。指示了氨基酸位置的Kabat编号，以及CDR和FR区。突出显示了促成VEGF互补位的氨基酸位置，以及在实例8中鉴定的PDGF-B互补位。

图4：实例7中检测的指示抗体的VEGF121和VEGF165阻断活性。

具体实施方式

1.定义

除非本文另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知的和常用的。

除非本文另有定义，否则术语“包括”应包括术语“由……组成”。

如本文结合特定值(例如温度、浓度、时间等)使用的术语“约”应指术语“约”指的特定值的+/-1％的变化。

本文的术语“抗体”在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的单个抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些实施例中，抗体是IgG1同种型。在某些实施例中，抗体是具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能的IgG1同种型。在其他实施例中，抗体是IgG2同种型。在某些实施例中，抗体是在铰链区具有S228P突变的IgG4同种型，以改善IgG4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ、。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。

“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。在本发明的抗体中，单一VH结构域和VL结构域对，即同源的VH/VL对，与其两个靶标特异性结合：VEGF和PDGF-B。

“DutaFab”是如WO2012/163520中所公开的双特异性抗体。在DutaFab中，单一VH结构域和VL结构域对与两个不同的表位特异性结合，其中一个互补位包含来自CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基，另一个互补位包含来自CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基。DutaFab包含在同源VH/VL对内的两个不重叠的互补位，并且可以同时与两个不同的表位结合。WO2012/163520中公开了DutaFab及其通过筛选包含单特异性Fab片段的文库而产生的方法。

“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组III。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文可互换使用的，“互补位”或“抗原结合位点”是指识别并结合抗原的抗体的一部分。互补位是由来自抗体重链和轻链可变结构域中排列的几个单个氨基酸残基形成的，这些残基在Fv区的三级结构中空间邻近排列。本发明的抗体包含在一个同源的VH/VL对中的两个“非重叠”互补位。“非重叠”是指包含在两个互补位之一中的氨基酸都不包含在另一个互补位中。

如本文所用，“VEGF互补位”是与VEGF结合的互补位或抗原结合位点。本发明的抗体的VEGF互补位包含来自抗体的CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基。

如本文所用，“PDGF-B互补位”是与PDGF-B结合的互补位或抗原结合位点。本发明的抗体的PDGF-B互补位包含来自抗体的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“VEGF”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然VEGF，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工VEGF，以及通过细胞中加工产生的任何形式的VEGF。该术语还涵盖VEGF的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人VEGF121的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:23中。

术语“抗VEGF抗体”和“结合VEGF的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合VEGF，使得所述抗体可用作靶向VEGF的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗VEGF抗体与不相关的、非VEGF蛋白的结合程度小于抗体与VEGF结合的约10％。在某些实施例中，与VEGF结合的抗体具有≤1nM或≤0.1nM的解离常数(K_D)。当抗体的K_D为1μM或更小时，则称该抗体“特异性结合”VEGF。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“PDGF-B”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PDGF-B，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工PDGF-B，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PDGF-B。该术语还涵盖PDGF-B的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人PDGF-B的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:24中。

术语“抗PDGF-B抗体”和“与抗PDGF-B结合的抗体”是指能够以足够的亲和力与抗PDGF-B结合，使得抗体可用作靶向抗PDGF-B的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施例中，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗抗PDGF-B抗体与不相关的、非抗PDGF-B蛋白的结合程度小于抗体与抗PDGF-B的结合的约10％。在某些实施例中，与PDGF-B结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM的解离常数(K_D)。当抗体的K_D为1μM或更小时，则称该抗体与抗PDGF-B“特异性结合”。

本发明的抗体“同时与人VEGF和人PDGF-B结合”，这意味着(a)与人PDGF-B结合的本发明的抗体Fab片段(也)与人VEGF特异性结合，并且(b)与人VEGF结合的本发明的抗体Fab片段(也)与人PDGF-B特异性结合。同时结合可以利用本领域已知的方法(例如通过表面等离子体共振)来评定。

如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上是高变的并且包含抗原接触残基。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH结构域中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL结构域中(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。除非另有说明，否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如FR残基)根据Kabat编号系统在本文中编号(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。

如本文所用，“框架”或“FR”是指除CDR残基以外的可变结构域氨基酸残基。可变结构域的框架通常由以下四个框架结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR氨基酸序列通常在(a)VH结构域中以以下序列出现：FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；以及在(b)VL结构域中以以下序列出现：FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4。

根据本文使用的Kabat编号系统，框架和CDR区位于可变结构域的以下区域：

	FR1	CDR-1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								VH	1-30	31-35b*	36-49	50-65	66-94	95-102	103-113
VL	1-23	24-34	35-49	50-56	57-88	89-97	98-107

*如图2所示，在CDR-H1中，可能存在35b位和36位之间的其他氨基酸，此处称为“35c”、“35d”和“35e”位。

根据本文所指的Kabat编号系统的氨基酸位置以与本发明抗体的氨基酸序列比对示出于图2中。通过指出各自的氨基酸和氨基酸位置，例如氨基酸序列，在本文中如在本领域中众所周知的那样提及氨基酸序列内某个位置的氨基酸，例如“E2”是指位于相应抗体结构域的氨基酸序列的Kabat 2位的谷氨酸残基。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。本文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。

术语“表位”表示抗原结合的蛋白质或非蛋白质抗原上的位点。表位既可以由连续的氨基酸伸长段(线性表位)形成，也可以通过包含非连续的氨基酸(构象表位)形成，例如由于抗原折叠，即由于蛋白质抗原的三级折叠而在空间上接近。在蛋白质抗原暴露于变性剂后，线性表位通常仍被抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理后被破坏。表位包含独特的立体构象中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8至10个氨基酸。

抗体结合的筛选可以使用本领域常规的方法进行，例如但不限于丙氨酸扫描、肽印迹(参见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、表位切除，表位提取、抗原的化学修饰(参见Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉阻断(参见“Antibodies”,Harlow andLane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。

基于抗原结构的抗体谱分析(ASAP)，也称为修饰辅助谱分析(MAP)，允许基于来自众多抗体的每种抗体和化学或酶修饰的抗原表面的结合谱，将多种与VEGF或PDGF-B特异性结合的单克隆抗体分类(参见例如US 2004/0101920)。每个组中的抗体结合相同的表位，该表位可以是独特的表位，该独特的表位与另一个组所代表的表位明显不同或部分重叠。

竞争性结合也可用于容易地确定抗体是否与本发明的参考抗体结合相同的VEGF或PDGF-B表位，或竞争结合本发明的参考抗体。例如，作为参考抗体的“与VEGF和PDGF-B上的相同表位结合的抗体”是指在各自的竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，并且相反，参考抗体在各自的竞争测定中将抗体与其抗原的结合阻断了50％或更多。同样例如，为了确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，使参考抗体在饱和条件下结合VEGF或PDGF-B。除去过量的参考抗体后，评估所讨论的抗体与VEGF或PDGF-B结合的能力。如果所讨论抗体在参考抗体饱和结合后能够结合VEGF或PDGF-B，则可以得出结论，所讨论的抗体与参考抗体结合不同的表位。但是，如果所讨论的抗体在参考抗体饱和结合后不能与VEGF或PDGF-B结合，则所讨论的抗体可以与参考抗体结合相同的表位。为了确认所讨论的抗体是结合于同一表位还是由于空间原因而使其受阻，可以使用常规实验(例如，使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或任何其他本领域可获得的定量或定性的抗体结合测定法进行的肽突变和结合分析)。该测定应以两种设置进行，即，两种抗体均为饱和抗体。如果在两种设置中，只有第一(饱和)抗体能够与VEGF或PDGF-B结合，那么可以得出结论，所讨论的抗体和参考抗体竞争与VEGF或PDGF-B的结合。

在一些实施例中，如在竞争性结合测定中测量的，如果一种抗体1、5、10、20或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更高，则认为两种抗体结合相同或重叠的表位(参见例如Junghans等人,Cancer Res.50(1990)1495-1502)。

在一些实施例中，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同的表位。如果只有一种减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体被认为具有“重叠表位”。

相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且出于比对的目的在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且在WO 2000/005319中有所描述。

然而，除非另有说明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序生成氨基酸序列同一性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。

术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。

“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

“编码抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或不同的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。

如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。

术语“药物组合物”或“药物配制物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。

“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。

药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该个体或受试者为人。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，术语“眼部疾病”包括与病理性血管生成和/或萎缩相关的任何眼部疾病。眼部疾病的特征可以在于新血管改变或不受调节的增殖和/或侵袭到诸如视网膜或角膜的眼部组织的结构中。眼部疾病的特征可以是视网膜组织(感光器和下面的视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜毛细血管)萎缩。非限制性眼病包括例如AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD和地图状萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心性DME以及弥漫性、涉及中心的DME)、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高海拔DR)、其他与缺血有关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉闭塞(RVO)(例如中心(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、中心浆液性视网膜病变(CSR)、病理性近视、希佩尔-林道综合征、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、与骨质疏松症-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)相关的视网膜异常、结膜下出血、红肿、眼部新血管病、新生血管性青光眼、色素性视网膜炎(RP)、高血压性视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊状黄斑水肿(CME)、血管炎、乳头水肿、视网膜炎(包括但不限于CMV视网膜炎)、眼黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非感染性(例如过敏性结膜炎))、利伯先天性黑蒙(也称为雷氏黑蒙或LCA)、葡萄膜炎(包括感染性和非感染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、眼外伤、干燥疾病和其他眼科疾病(其中该疾病与眼新血管生成、血管渗漏和/或视网膜水肿或视网膜萎缩有关)。另外的示例性眼部疾病包括视网膜分裂症(视网膜神经感觉层的异常分裂)、与虹膜红变相关的疾病(角部新生血管形成)以及由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。与角膜新生血管形成相关的示例性疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、接触镜过度症、特应性角膜炎、上缘性角膜炎、干燥性角膜炎、干燥综合征、酒渣鼻痤疮、小水疱病、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹病毒感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕蚀性角膜溃疡、Terrien角膜边缘变性、边缘性角膜溶解、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多发性动脉硬化、创伤、韦格纳氏结节病(Wegener’s sarcoidosis)、巩膜炎、史提芬强生症候群、放射状角膜切开术和角膜图排斥反应。与脉络膜新生血管形成和视网膜脉管系统缺陷有关的示例性疾病(包括血管渗漏增加、动脉瘤和毛细血管脱落)包括但不限于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹力纤维性假黄瘤、佩吉特氏病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯氏病、白塞氏病、感染引起的视网膜炎或脉络膜炎(例如多焦点脉络膜炎)、推测的眼组织胞浆菌病、贝斯特氏病(玻璃体黄斑变性)、近视、视神经凹陷、睫状体平坦部炎、视网膜脱离(例如慢性视网膜脱落)、高黏度综合征、弓形体病、创伤和激光后并发症。与视网膜组织(光感受器和底层RPE)萎缩相关的示例性疾病包括但不限于萎缩性或非渗出性AMD(例如，地图状萎缩或晚期干性AMD)、黄斑性萎缩(例如，与新血管生成和/或地图状萎缩相关的萎缩)地理萎缩)、糖尿病性视网膜病变、斯特格氏病、眼底营养不良、视网膜分裂症和色素性视网膜炎。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

2.具体实施方式

一方面，本发明部分基于提供用于治疗应用的双特异性抗体。在某些方面，提供了与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。本发明的抗体可用于例如诊断或治疗血管疾病，例如眼部血管疾病。

A.与人VEGF和人PDGF-B结合的示例性抗体

在一个方面，本发明提供与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。在一个方面，提供了与人VEGF和人PDGF-B结合的分离的抗体。在一个方面，本发明提供与人VEGF和人PDGF-B特异性结合的抗体。

在某些方面，提供了一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含在VL结构域和VH结构域的一个同源对内的VEGF互补位(即与VEGF结合的抗原结合位点)和PDGF-B互补位(即与PDGF-B结合的抗原结合位点)，其中

·VEGF互补位包含来自抗体的CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基，其中PDGF-B互补位包含来自抗体的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基；和/或

·可变轻链结构域和可变重链结构域对与人VEGF和人PDGF-B同时结合；和/或

·包含在VEGF互补位中的氨基酸无一包含在PDGF-B互补位中；和/或

·抗体与具有SEQ ID NO:11的可变重链结构域和SEQ ID NO:21的可变轻链结构域的抗体相比，与人VEGF上的相同表位和与人PDGF-B上的相同表位结合；和/或

·抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM；和/或

·抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，该VH结构域包含

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3；或

·VH结构域，该VH结构域包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。在一个实施例中，抗体包含VEGF互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及包含在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及PDGF-B互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、D73、D74、T75、N76、R94、D96、D98、D101和T102，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：E55和H56。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。在一个实施例中，抗体包含VEGF互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及PDGF-B互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、D73、D74、T75、N76、R94、D96、D98、D101和T102，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：E55和H56。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含

·VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含

·(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；或

·(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；或

·(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；或

·(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1：(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:28的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:28的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:11的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:11的3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:21的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:11的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:11的3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:25的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:28的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:28的3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:25的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位；或

·(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ IDNO:28的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:28的3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:31的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含VH结构域，该VH结构域包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D72、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，该VL结构域包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和可变轻链结构域，其包含具有1至15个、1至10个、或1至5个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

·含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的L-FR-1；或

·含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的L-FR-1；或

·含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的L-FR-1；或

·含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，该VL结构域包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的L-FR-1。

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的L-FR-1，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的L-FR-1，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的L-FR-1，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或

·(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，该VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(g)含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的L-FR-1，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供包含VH结构域的抗体，该VH结构域与SEQ ID NO:11或SEQID NO:28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该VH序列的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体保留了与人VEGF和人PDGF-B结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:28中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定方面，VH包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3。

在一个方面，本发明提供包含VL结构域的抗体，该VL结构域与SEQ ID NO:21、SEQID NO:25或SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该VH序列的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体保留了与人VEGF和人PDGF-B结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:31中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定方面，VL包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含如以上提供的任何方面中的VH序列和如以上提供的任何方面中的VL序列。在一个方面，该抗体分别包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个方面，该抗体分别包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:25中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个方面，该抗体分别包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:25中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个方面，该抗体分别包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:19的轻链氨基酸序列。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含SEQID NO:30的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

在另一方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，其中该抗体包含SEQID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列。

在本发明的另一方面，根据上述任何方面的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体是单克隆抗体。在一个方面，与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)₂片段。在另一方面，抗体为全长抗体。

在另一方面，根据以上任何方面的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体可以单独或组合地结合任何特征，如以下第1-7节中所述：

1.抗体亲和力

在某些实施例中，本文提供的抗体以解离常数(K_D)≤1nM或≤0.1nM与VEGF结合。在某些实施例中，与PDGF-B结合的抗体具有≤1μM、≤100nM或≤10nM的解离常数(K_D)。

在一个方面，如实例3所述，使用

表面等离子体共振测定法测量K_D。

例如，在25℃用C1芯片上固定化的VEGF121，以～10个应答单位(RU)，在使用

-2000或

-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定法中测量抗体与VEGF结合的K_D。为了进行动力学测量，在25℃，以大约30μl/min的流速将Fab的两倍连续稀释液(1.2–100nM)注入HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4、0.05％表面活性剂P20)中。使用简单的一对一Langmuir结合模型(

Evaluation Software3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(k_on)与解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_off/k_on。参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。

2.抗体片段

在某些方面，本文提供的抗体是抗体片段。

一方面，抗体片段是Fab’、Fab’-SH或F(ab’)₂片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括VL结构域和CL结构域的轻链以及包括VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基端添加残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。对于包含挽救受体结合表位残基并且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌、CHO)重组产生，如本文所述。

3.热稳定性

本文提供的抗体表现出优异的热稳定性。在某些实施例中，本文提供的抗体的Fab片段表现出大于68℃的聚集起始温度。

4.源自文库的抗体

在某些方面，本文提供的抗体衍生自文库。可以通过筛选组合文库中具有一个或多个所需活性的抗体来分离本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆初始库(例如，来自人)以为多种非自身抗原和自身抗原提供单一的抗体来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。此外，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal ofMolecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。

本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods inMolecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。

在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。

5.多特异性抗体

在某些方面，本文提供的抗体是多特异性抗体。“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。

具有具有三种或更多种结合特异性，包含本文提供的抗体的多特异性抗体可以以不对称形式提供，在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中具有结构域交叉，即通过交换VH/VL结构域(参见例如WO 2009/080252和WO 2015/150447)，CH1/CL结构域(参见例如WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如WO 2009/080251，WO 2016/016299，也参见Schaefer等人,PNAS,108(2011)1187-1191,和Klein等人,MAbs 8(2016)1010-20)。多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。

6.抗体变体

在某些方面中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

在某些方面，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。保守取代显示在下表的“优选取代”标题下。更多实质性改变提供于表1的“示例性取代”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。

表

可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别的成员。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简要地说，对一个或多个CDR残基进行突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。

例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴别。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些方面，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的某些变体VH和VL序列中，每个CDR要么保持不变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT(抗体定向酶前药治疗))或多肽融合。

a)Fc区变体

在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄ Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。

在某些方面，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为其中抗体的体内半衰期很重要而某些效应子功能(例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))不必要或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏Fc R结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcRIII，而单核细胞表达FcRI、FcRII和FcRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox

非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929Al)。

具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。

描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)

在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的298、333和/或334位的取代(残基的EU编号)。

在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的234位和235位的取代(残基的EU编号)。一方面，取代是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体进一步包含在衍生自人IgG₁ Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。一方面，在衍生自人IgG₁ Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见例如WO2012/130831)。在另一方面，在衍生自人IgG₁ Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。

在一些方面，在Fc区中进行导致改变(即，改善或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人.J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。

具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(参见，例如美国专利号7,371,826；Dall'Acqua,W.F.等人.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。

通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人.J.Immunol 169(2002)5171-5180)。相互作用涉及残基I253、H310、H433、N434和H435(EU索引编号)(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的研究已表明，残基I253、S254、H435和Y436对于该相互作用至关重要(Firan,M.等人，Int.Immunol.13(2001)993；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道并且检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。

在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的253、和/或310和/或435位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置253、310和435位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是I253A、H310A和H435A。参见，例如Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。

在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的310、和/或433和/或436位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置310、433和436位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是H310A、H433A和Y436A。(参见，例如，WO 2014/177460 Al)。

在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个增加FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的252、和/或254和/或256位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置252、254和256位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG₁ Fc区的Fc区中，取代是M252Y、S254T和T256E。有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。

如本文报道的抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，氨基酸位置的EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。

b)半胱氨酸工程抗体变体

在某些方面，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMAB^TM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO2016040856中所述产生。

7.免疫缀合物

本发明还提供了免疫缀合物，其包含与本文公开的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，该抗体缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。

一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。

B.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。

一方面，提供了编码本发明抗体的分离的核酸。

在一个方面，提供了一种制备与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含如上提供的编码该抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收该抗体。

为了重组产生与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，将例如如上所述的编码该抗体的核酸分离，并插入到一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.主编，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。

一方面，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。

C.药物组合物

在其他方面，提供了包含本文提供的任一种抗体的药物组合物，其例如用于以下任一种治疗方法中。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的抗体中的任一者，以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含任一种本文提供的抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。

通过将具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药用载体混合，来制备本文所述的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体的药物组合物(Remington's PharmaceuticalSciences 16版,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干组合物或水溶液的形式。药用载体在所用的剂量和浓度下对受治疗者一般无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

Halozyme,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。

示例性的冻干抗体组合物描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体组合物包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者中的组合物包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的药物组合物还可以含有多于一种对于所治疗的特定适应症必需的活性成分，优选地是具有不会对彼此造成不利影响的互补活性的那些活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)中。

可以制备用于缓释的药物组合物。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

D.治疗方法和施用途径

本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体中的任一种均可用于治疗方法。

在一个方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的用作药物的抗体。在其他方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的用于治疗血管疾病的抗体。在某些方面，提供了一种用于治疗方法的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。在某些方面，本发明提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，该抗体用于治疗患有血管疾病的个体的方法中，该方法包括向个体施用有效量的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。在一个这样的方面，例如如下所述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。在其他方面，本发明提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，该抗体用于抑制血管生成。在某些方面，本发明提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体，该抗体用于在个体中抑制血管生成的方法中，该方法包括向个体施用有效量的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体以抑制血管生成。根据上述方面中的任一者的“个体”优选地是人。

在其他方面，提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的用于治疗眼部疾病的抗体。在一个实施例中，眼部疾病选自：AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD和地图状萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(在一个实施例中，局部、非中心性DME以及弥漫性、涉及中心的DME)、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变(DR)(在一个实施例中为增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高海拔DR)、其他与缺血有关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉闭塞(RVO)(在一个实施例中为中心(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(在一个实施例中为近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、中心浆液性视网膜病变(CSR)、病理性近视、希佩尔-林道综合征、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、与骨质疏松症-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)相关的视网膜异常、结膜下出血、红肿、眼部新血管病、新生血管性青光眼、色素性视网膜炎(RP)、高血压性视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊状黄斑水肿(CME)、血管炎、乳头水肿、视网膜炎(包括但不限于CMV视网膜炎)、眼黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非感染性(在一个实施例中为过敏性结膜炎))、利伯先天性黑蒙(也称为雷氏黑蒙或LCA)、葡萄膜炎(包括感染性和非感染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、眼外伤、干燥疾病和其他眼科疾病(其中该疾病与眼新血管生成、血管渗漏和/或视网膜水肿或视网膜萎缩有关)。在一个实施例中，眼部疾病选自：AMD(在一个实施例中为湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD和地图状萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(在一个实施例中为局部、非中心性DME以及弥漫性、涉及中心的DME)、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变(DR)(在一个实施例中为增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高海拔DR)。

在其他方面，本发明提供了一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体在药物的生产或制备中的用途。一方面，所述药物用于治疗血管疾病。在其他方面，药物用于治疗血管疾病的方法，该方法包括向患有血管疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的方面，例如如下所述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。

一方面，所述药物用于治疗眼部疾病。在其他方面，药物用于治疗眼部疾病的方法，该方法包括向患有眼部疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的方面，例如如下所述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。

在其他方面，本发明提供了一种用于治疗血管疾病的方法。在一个方面，该方法包括向患有此类血管疾病的个体施用有效量的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。在一个这样的方面，例如如下所述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗眼部疾病的方法。在一个方面，该方法包括向患有此类眼部疾病的个体施用有效量的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体。在一个这样的方面，例如如下所述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。

根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是人。

在其他方面，本发明提供了包含本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体中的任一种的药物组合物，例如，用于以上任何治疗方法中。在一个方面，药物组合物包含本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体中的任一种以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体中的任一种和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。

本发明的抗体可以单独施用或用于组合疗法。例如，该组合疗法包括施用本发明的抗体并且施用至少一种另外的治疗剂(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。

例如，在某些实施例中，任何前述方法进一步包括施用一种或多种另外的化合物。在某些实施例中，本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与另外的化合物同时施用。在某些实施例中，与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体在另外的化合物之前或之后施用。在某些实施例中，另外的化合物与第二生物学分子结合，该第二生物学分子选自由以下项组成的组：IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素；爱帕琳肽/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质，诸如补体途径组分C2、B因子、H因子、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白介素8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施例中，另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。

在根据(或应用于)以上任何实施例的某些实施例中，眼部疾病是眼内新血管疾病，其选自由以下项组成的组：增生性视网膜病变、脉络膜新生血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其他与缺血相关的视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道综合征、眼睛组织胞浆菌病、包括CRVO和BRVO在内的视网膜静脉闭塞(RVO)、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成和早产儿视网膜病变(ROP)。

在一些情况下，可以将本文提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与至少一种其他治疗剂组合施用用于治疗眼部疾患，例如本文所述的眼部疾患(例如，AMD(例如湿性AMD)、DME、DR、RVO或GA)。用于治疗眼部疾患的组合疗法的示例性其他治疗剂包括但不限于：抗血管生成剂，例如VEGF拮抗剂，包括例如抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab

(雷珠单抗))、可溶性受体融合蛋白(例如，重组可溶性受体融合蛋白

(阿帕西普，也称为VEGF Trap Eye；再生元/安万特)、适体(例如抗VEGF聚乙二醇化适体

(哌加他尼钠；NeXstar制药公司/OSI制药公司))和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司马沙尼(SU5416；SUGEN)和

(舒尼替尼))；色胺酰基-tRNA合成酶(TrpRS)；角鲨胺；

(用于长效悬浮液的阿奈可他；阿尔康公司)；康普立停A4前药(CA4P)；

(美服培酮-ru486)；结膜下曲安奈德；玻璃体内结晶曲安奈德；基质金属蛋白酶抑制剂(例如普马司他(AG3340；辉瑞))；醋酸氟轻松(包括氟轻松眼内植入物；Bausch&Lom/控制递送系统)；三羧氨基喹啉；整联蛋白β3功能抑制剂；血管抑素及其组合。可以与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用的这些和其他治疗剂描述于例如美国专利申请号2014/0017244中，其通过引用整体并入本文。

可以用于与本文提供的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合以治疗眼部疾患(例如AMD、DME、DR、RVO或GA)的其他治疗剂的进一步实例包括但不限于：

(维替泊芬；一种光活化药物，通常与非热激光的光动力疗法结合使用)、PKC412、Endovion(NS3728；NeuroSearch A/S)、神经营养因子(例如神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CNTF))、地尔硫卓、多佐胺、

9-顺-视网膜、眼药(例如，磷化碘、乙膦硫胆碱或碳酸酐酶抑制剂)、veovastat(AE-941；AEterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics,Inc.)、神经营养蛋白(仅作为示例，包括NT-4/5，基因泰克)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和Abbott Laboratories的那些)、EG-3306(ArkTherapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利度胺(例如，由EntreMed，Inc.使用)、心肌营养蛋白-1(基因泰克)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(东丽株式会社)、NTC-200(Neurotech)、四硫代钼酸盐(密歇根大学)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻类化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(滨松光子)、TGF-beta 2(健赞/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，来自Allergan、SUGEN或辉瑞的抑制剂)、NX-278-L(NeXstar制药公司/吉利德科学公)、Opt-24(OPTISFrance SA)、视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(得克萨斯州A&M大学系统)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、环孢菌素A、用于光动力疗法的治疗剂(例如，

受体靶向的PDT，百时美施贵宝公司；带有PDT用于注射的卟吩姆钠；维替泊芬，QLT Inc；带有PDT的罗培泊芬，Miravent MedicalTechnologies；带有PDT的他拉泊芬钠，日本石油公司；和莫特沙芬镥，Pharmacyclics，Inc.)、反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA和ISIS-13650，IonisPharmaceuticals测试的产品)，及其组合。

如本文提供的一种与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体可以与用于治疗眼部疾患(例如、AMD、DME、DR、RVO或GA)的疗法或外科手术方法组合施用、包括例如、激光光凝(例如，全视网膜光凝(PRP))、玻璃疣激光、黄斑裂孔手术、黄斑移位手术、植入式微型望远镜、PHI运动血管造影术(也称为微激光疗法和饲养血管治疗)、质子束疗法、微刺激疗法、视网膜脱落和玻璃体手术、巩膜扣、黄斑手术、经瞳孔热疗法、光系统I疗法、使用RNA干扰(RNAi)、体外流产术(也称为膜差分过滤和流变疗法)、微芯片植入、干细胞疗法、基因替代疗法、核酶基因疗法(包括用于缺氧应答元件的基因疗法、牛津生物医药公司；Lentipak，Genetix；和PDEF基因疗法，GenVec)、视细胞/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin、Inc.；视网膜细胞移植，例如阿斯特拉斯制药美国公司，ReNeuron，CHA Biotech)、针灸及其组合。

在一些情况下，可以将与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与抗血管生成剂组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。可以将任何合适的抗血管生成剂与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合使用，所述抗血管生成剂包括但不限于Carmeliet等人，Nature 407:249-257,2000列出的那些。在一些实施例中，抗血管生成剂是VEGF拮抗剂，包括但不限于：抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab

(雷珠单抗)、RTH-258(以前称为ESBA-1008、抗VEGF单链抗体片段；诺华)、或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成肽2双特异性抗体，例如faricimab；罗氏))、可溶性重组受体融合蛋白(例如

(阿帕西普))、VEGF变体、可溶性VEGFR片段、能够阻断VEGF的适体(例如哌加他尼钠)或VEGFR、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、抗VEGF

(例如abicipar pegol、Molecular Partners AG/Allergan)、抑制VEGF或VEGFR表达的小干扰RNA、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司马沙尼(SU5416；SUGEN)和

(舒尼替尼))及其组合。

可以与如本文所提供的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用以治疗眼部疾患的其他合适的抗血管生成剂(例如、AMD、DME、DR、RVO或GA)包括皮质类固醇、拮抗剂类固醇、乙酸阿奈可他、血管抑素、内皮抑素、酪氨酸激酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、基质衍生因子(SDF-1)拮抗剂(例如抗SDF-1抗体)、色素上皮衍生因子(PEDF)、γ-分泌酶、δ样配体4、整联蛋白拮抗剂、缺氧诱导因子(HIF)-1α拮抗剂、蛋白激酶CK2拮抗剂、抑制干细胞(例如，内皮祖细胞)定位到新血管形成位点的制剂(例如，抗血管内皮钙粘蛋白(CD-144)抗体和/或抗SDF-1抗体)及其组合。

在其他实例中，在某些情况下，与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体和/或其聚合物制剂可以与具有抗新血管形成作用的活性的药剂组合施用以治疗眼部疾患(例如AMD、DME、DR、RVO或GA)，例如抗炎药、雷帕霉素抑制剂(例如雷帕霉素、

(依维莫司)和

(替西罗莫司))的哺乳动物靶标(mTOR)、环孢菌素、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂(例如、抗TNFα抗体或其抗原结合片段(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗和戈利木单抗)或可溶性受体融合蛋白(例如依那西普))、抗补体药、非类固醇性抗炎剂(NSAID)或其组合。

在又进一步的实例中，在某些情况下，可以将与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与具有神经保护作用并可以潜在的减少干性AMD转变为湿性AMD的药剂组合施用，所述药剂例如为称为“神经类固醇”的药物，其包括诸如脱氢表雄酮(DHEA)(品牌名称：PRASTERA^TM和

)、硫酸脱氢表雄酮和硫酸孕烯醇酮的药物。

可以将任何合适的AMD治疗剂作为另外的治疗剂与本文所述的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用，用于治疗眼部疾患(例如，AMD，DME，DR，RVO或GA)，所述合适的AMD治疗剂包括但不仅限于：VEGF拮抗剂、例如抗VEGF抗体(例如

(雷珠单抗)、RTH-258(以前为ESBA-1008，抗VEGF单链抗体片段；诺华)或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成肽2双特异性抗体，例如faricimab；罗氏))、可溶性VEGF受体融合蛋白(例如，

(阿帕西普))、抗VEGF

(例如abicipar pegol)；MolecularPartners AG/Allergan)或抗VEGF适体(例如

(哌加他尼钠))；血小板衍生的生长因子(PDGF)拮抗剂，例如抗PDGF抗体、抗PDGFR抗体(例如REGN2176-3)、抗PDGF-BB聚乙二醇化适体(例如；

Ophthotech/诺华)、可溶性PDGFR受体融合蛋白或双重PDGF/VEGF拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体))；与光动力疗法组合的

(维替泊芬)；抗氧化剂；补体系统拮抗剂、例如补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech)或抗C5抗体(例如，LFG-316；诺华)、备解素拮抗剂(例如，抗备解素抗体，例如CLG-561；爱尔康)，或补体因子D拮抗剂(例如，抗补体因子D抗体，例如兰帕利珠单抗；罗氏))；C3阻断肽(例如APL-2，Appellis)；视觉周期调节剂(例如，emixustat盐酸盐)；角鲨胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；维生素和矿物质补充剂(例如，与年龄有关的眼部疾病研究1(AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和研究2(AREDS2；锌、抗氧化剂、叶黄素、玉米黄质和/或omega-3脂肪酸)中所述的那些)；基于细胞的疗法，例如，NT-501(Renexus)；PH-05206388(辉瑞)、huCNS-SC细胞移植(StemCells)、CNTO-2476(脐带干细胞系；Janssen)、OpRegen(RPE细胞悬浮液；Cell Cure Neurosciences)或MA09-hRPE细胞移植(OcataTherapeutics)；组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-肾上腺素能受体激动剂(例如酒石酸溴莫尼定；Allergan)；肽疫苗(例如，S-646240；盐野义)；淀粉样蛋白β拮抗剂(例如，抗β淀粉样蛋白单克隆抗体，例如，GSK-933776)；S1P拮抗剂(例如，抗S1P抗体，例如，iSONEP^TM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗剂(例如，抗ROBO4抗体，例如DS-7080a；第一三共株式会社)；表达内皮抑素和血管抑素的慢病毒载体(例如，RetinoStat)；及其任何组合。在一些情况下，可以将AMD治疗剂(包括任何先前的AMD治疗剂)共同配制。例如，抗PDGFR抗体REGN2176-3可以与阿帕西普

共同配制。在某些情况下，此类共配制剂可以与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(雷珠单抗)组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(阿帕西普)组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(哌加他尼钠)组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与和光动力疗法组合的

(维替泊芬)组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与PDGF拮抗剂组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。可以与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合使用的示例性PDGF拮抗剂包括抗PDGF抗体、抗PDGFR抗体、小分子抑制剂(例如角鲨胺)、抗PDGF-B聚乙二醇化适体，例如，

(E10030；Ophthotech/诺华)或双重PDGF/VEGF拮抗剂(例如小分子抑制剂(例如DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体)。例如，

可以作为本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体的辅助疗法施用。OHR-102可以与VEGF拮抗剂(例如

或

)组合施用。在一些实施例中，可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与OHR-102、

和/或

组合施用。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与RTH-258组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。RTH-258可以例如通过玻璃体内注射或眼内输注来施用。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与abicipar pegol组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

可以将任何合适的DME和/或DR治疗剂与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用以治疗眼部疾患(例如，AMD、DME、DR、RVO或GA)，所述合适的DME和/或DR治疗剂包括但不限于VEGF拮抗剂(例如

或

)、皮质类固醇(例如皮质类固醇植入物(例如

(地塞米松玻璃体内植入物)或

(醋酸氟轻松玻璃体内植入物)，或配制用于通过玻璃体内注射施用的皮质类固醇(例如曲安奈德)或其组合。在某些情况下，眼部疾患是DME和/或DR。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(雷珠单抗)组合施用以治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(阿帕西普)组合施用以治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(地塞米松玻璃体内植入物)组合施用以治疗DME和/或DR。

可以将本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体与

(地塞米松玻璃体内植入物)组合施用以治疗DME和/或DR。

在一些情况下，TAO/PRN治疗方案或TAE治疗方案可用于与本发明的人VEGF和人PDGF-B结合的抗体组合施用AMD治疗剂(例如雷珠单抗或阿帕西普)，和/或其聚合物配制剂。在某些情况下，眼部疾患是AMD(例如湿性AMD)。在某些情况下，眼部疾患是GA。

上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文所述的本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，本发明的与人VEGF和人PDGF-B结合的抗体的施用和另外的治疗剂的施用各自发生在约一、二、三、四或五个月内，或在约一、二或三周，或在大约一、二、三、四、五或六天内。

本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。

本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。所述抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。这些其他制剂的有效量取决于药物组合物中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用分子用于预防还是治疗目的、患者的病史和对抗体的应答以及主治医师的酌处权。抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg--10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，之后施用一次或多次较低剂量。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。

E.制品

在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该方面中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述制品可以还包括从商业和用户角度来看所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

3.本发明的具体实施例

下面列出本发明的具体实施例。

1.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中VEGF互补位包含来自抗体的CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基，其中PDGF-B互补位包含来自抗体的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基。

2.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中可变轻链结构域和可变重链结构域对同时结合人VEGF和人PDGF-B。

3.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中包含在VEGF互补位中的氨基酸无一包含在PDGF-B互补位中。

4.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中抗体与具有SEQ ID NO:11的可变重链结构域和SEQ ID NO:21的可变轻链结构域的抗体相比，与人VEGF上的相同表位和与人PDGF-B上的相同表位结合。(RO7113083).

5.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中

·抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

6.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

7.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

8.与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

9.与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

10.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，以及(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

11.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，以及(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

12.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

13.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

14.实施例13所述的抗体，其包含

-VEGF互补位，其在VH结构域中包含以下氨基酸残基：G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及包含在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及

-PDGF-B互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、D73、D74、T75、N76、R94、D96、D98、D101和T102，以及在VL结构域中的以下氨基酸残基：E55和H56。

15.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

16.实施例15所述的抗体，其包含

-VEGF互补位，其在VH结构域中包含以下氨基酸残基：G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66，以及包含在VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；以及

17.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其在一对VL结构域和VH结构域内包含：(i)VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

18.实施例17所述的抗体，其包含

-VEGF互补位，其包含在VH结构域中的以下氨基酸残基：G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65和R66；以及VL结构域中的以下氨基酸残基：A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；和

19.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其在一对VL结构域和VH结构域内包含：VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

20.实施例19所述的抗体，其包含

21.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

22.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

23.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

24.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

25.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

26.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

27.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

28.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

29.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

30.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

31.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

32.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

33.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，其包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中该VH结构域包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、R66、D73、D74、T75、N76和R94；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中该VL结构域包含氨基酸残基A1、I2、H68和E69，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

34.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

35.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含：(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

36.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含：(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

37.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含：(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

38.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含：(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

39.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:25的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

40.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:25的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

41.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:28的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于3至24、29、30、35c至52、52b、54、59、60、67至72、77至93、95、97、99或103至113位；和(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其中氨基酸取代位于SEQ ID NO:31的3至25、27d至54、57至67、70至91或97至107位，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

42.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

43.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，该抗体包含(a)VH结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及(b)可变轻链结构域，其包含具有多至15个氨基酸取代的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

44.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的L-FR-1。

45.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的L-FR-1。

46.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的L-FR-1。

47.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:11的VH序列和SEQID NO:21的VL序列。

48.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:11的VH序列和SEQID NO:25的VL序列。

49.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQID NO:25的VL序列。

50.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQID NO:31的VL序列。

51.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其包含SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。

52.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列。

53.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其包含SEQ ID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的轻链氨基酸序列。

54.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:19的轻链氨基酸序列。

55.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其包含SEQ ID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:19的轻链氨基酸序列。

56.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:18的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

57.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:30的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。

58.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:30的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列。

59.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中该抗体的抗体Fab片段结合(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，并且(ii)结合人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

60.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体的抗体Fab片段结合(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，并且(ii)结合人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

61.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，其中该抗体的抗体Fab片段结合(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，并且(ii)结合人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

62.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和I2的FR1，(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，其中该抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

63.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其在一对VH结构域和VL结构域内包含：(i)VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，其中该抗体的抗体Fab片段结合(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，并且(ii)结合人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

64.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，其包含：(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；该抗体包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；其中该抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

65.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

66.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

67.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

68.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含：(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1和以及I2的FR1，和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

69.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其在一对VH结构域和VL结构域内包含：(i)VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中VH结构域和VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统，其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

70.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其中该抗体包含VH结构域，其包含：(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，该抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；其中该抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

71.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。

72.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其为与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体片段。

73.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中抗体为双特异性。

74.根据前述实施例中任一项所述抗体，其中所述抗体为Fab片段。

75.根据前述实施例中任一项所述抗体，其中所述抗体为双特异性抗体片段。

76.根据前述实施例中任一项所述的抗体，其中抗体为多特异性抗体。

77.一种分离的核酸，其编码根据实施例1至76中任一项所述的抗体。

78.一种宿主细胞，其包含根据实施例77所述的核酸。

79.一种表达载体，其包含根据实施例77所述的核酸。

80.一种产生与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体的方法，其包括培养根据实施例78所述的宿主细胞，从而产生抗体。

81.根据实施例80所述的方法，其进一步包括从宿主细胞回收抗体。

82.通过实施例80或81所述的方法产生的抗体。

83.一种药物配制物，其包含根据实施例1至76中任一项所述的抗体以及药用载体。

84.根据实施例1至76中任一项所述的抗体，其用作药物。

85.根据实施例1至76中任一项所述的抗体，其用于治疗血管疾病。

86.根据实施例1至76中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。

87.根据实施例1至76中任一项所述的抗体或根据实施例83所述的药物组合物在制造药物中的用途。

88.根据实施例1至76中任一项所述的化合物或根据实施例83所述的药物组合物在制备用于抑制血管生成的药物中的用途。

89.一种治疗患有血管疾病的个体的方法，其包括向个体施用有效量的实施例1至76之一所述的抗体或实施例83所述的药物组合物。

90.一种治疗患有眼部血管疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的实施例1至76之一所述的抗体或实施例83所述的药物组合物。

91.一种抑制个体中血管生成的方法，其包括向个体施用有效量的根据实施例1至76中任一项所述的抗体或根据实施例83中任一项所述的药物组合物以抑制血管生成。

氨基酸序列的描述

实例

提供以下实例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

实例1：

双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的产生

利用合成Fab片段的两个不同的噬菌体展示文库，其中在第一噬菌体展示文库中，Fab片段的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2区内的残基是多样化的，并且其中在第二噬菌体展示文库中，Fab片段的CDR-L1、CDR-L3和CDR-H2区内的残基是多样化的。在每个文库中，其他三个CDR区保持不变，作为不变的假序列。在两个文库中，Fab片段的CH1结构域均经由连接基与截短的基因III蛋白融合，以促进噬菌体展示。

通过噬菌体文库淘选，第一个文库富集了针对人PDGF-B的结合物，第二个文库富集了针对人VEGF-A的结合物。淘选后，为噬菌粒载体的两个富集池产生质粒微量制备物。用限制酶消化小量制备物以切除编码截短的基因III蛋白的区域，并通过连接使其重新环化，以获得编码可溶性Fab片段的表达载体池，该Fab片段分别富集了PDGF-B结合物或VEGF-A结合物。将这些载体池转化到TG1大肠杆菌细胞中，并挑选单个菌落并进行培养，以在微量滴定板中可溶性表达单个Fab克隆。使用标准的ELISA方法筛选包含可溶性Fab片段的上清液与PDGF-B或VEGF-A的结合，然后对产生特异性结合物的TG1克隆进行DNA质粒制备和测序，以获得分别与PDGF-B或VEGF-A特异性结合的VH和VL序列对。

VEGF-PDGF应用的双特异性设计说明：

通过以下方式计算机模拟设计双特异性VH和VL序列对：(1)放置VH残基1-3包括重链N末端区、23-35包括CDR-H1、71-77包括VH外环区，和93-102包括来自PDGF-B特异性Fab序列的CDR-H3以及VH残基50-65包括与VH3和JH框架序列同框的来自VEGF-A特异性Fab序列的CDR-H2，以及(2)放置VL残基1-3包括轻链N末端区、24-34包括CDR-L1、66-71包括VL外环区，和89-97包括来自VEGF-A特异性Fab序列的CDR-L3以及VL残基49-57包括与Vkappa1和JK框架序列同框的来自PDGF-B特异性Fab序列的CDR-L2。

所得双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体“P1AE2845”，其特征在于重链为SEQ ID NO:9，轻链为SEQ ID NO:10。

实例2：

双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段P1AE2845的表达

合成设计的双特异性DutaFab VH和VL序列对，并克隆到编码CH1和Cκ结构域的基因序列的背景下大肠杆菌表达载体中。将载体转化到TG1大肠杆菌细胞中，并培养单个菌落以可溶性表达双特异性Fab片段。验证了通过亲和色谱从TG1培养上清液中纯化的双特异性Fab片段，以及与PDGF-B和VEGF-A的特异性结合。

实例3：

双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段P1AE2845的表征

如下所示，评估双特异性抗体P1AE2845的结合亲和力、亲水性和热稳定性：

通过表面等离子体共振(SPR)评估的VEGF结合动力学：

使用标准的胺偶联化学将抗His捕获抗体(GE Healthcare 28995056)固定在S系列传感器芯片C1(GE Healthcare 29104990)上，得到约500个共振单位(RU)的表面密度。使用HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液。人VEGF121-His被捕获到表面，所得的配体密度分别约为10RU和20RU。依次注射一系列稀释的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段(1.2-100nM，1:3稀释)，每次90s，以30μl/min的流速(单循环动力学)监测解离3600s。通过持续60s注入10mM，pH 1.5的甘氨酸进行表面再生。通过减去空白注射并通过减去从没有捕获人VEGF121的对照流通池获得的应答来校正大折射率偏差。使用Biacore评估软件中的1:1Langmuir结合模型进行曲线拟合。为了提供更强健的拟合，选择了“多重Rmax”选项以同时使用两种配体密度进行全局拟合。

通过表面等离子体共振(SPR)评估的PDGF-B结合动力学：

人PDGF-BB结合ELISA：使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术进行结合分析。将在PBS、0.5％BSA和0.05％Tween中的抗原人PDGF-BB(Cell Signaling，目录号8921BF)(以125ng/mL的浓度，25μL)固定在384孔微量滴定板(Thermo Scientific，目录号464718)上。以下每个步骤之后进行90μL PBS 3次洗涤程序，并进行分配和抽吸：1)封闭步骤：饱和未结合的表面(1小时，2％BSA)；2)抗PDGF-BB抗体以增加的浓度持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:3000(ECL抗兔IgG-POD、NA9340V+ECL抗人IgG-POD、NA933V或可替代地鼠抗体ECL抗小鼠IgG-POD；NA 9310V)。20-30分钟。加入底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，目录号34021)后，在370nm处测定光密度。EC50使用GraphPad Prism 6.0软件用四参数逻辑模型来计算。

食蟹猴PDGF-BB结合ELISA：使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术进行结合分析。将在PBS、0.5％BSA和0.05％Tween中的抗原人PDGF-BB(以125ng/mL的浓度，25μL)固定在384孔微量滴定板(Thermo Scientific，目录号464718)上。以下每个步骤之后进行90μL PBS、0.5％BSA、0.05％Tween 3次洗涤程序，并进行分配和抽吸：1)封闭步骤：饱和未结合的表面(1小时，2％BSA)；2)抗PDGF-BB抗体以增加的浓度持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:3000(ECL抗兔IgG-POD、NA9340V+ECL抗人IgG-POD、NA933V或可替代地鼠抗体ECL抗小鼠IgG-POD；NA 9310V)。20-30分钟。加入底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，目录号34021)后，在370nm处测定光密度。EC50使用GraphPad Prism 6.0软件用四参数逻辑模型来计算。

疏水作用层析(HIC)：

通过将20μg的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段注入用25mM磷酸钠，1.5M硫酸铵，pH 7.0平衡的HIC-Ether-5PW(Tosoh)色谱柱上，确定表观疏水性。在60分钟内，使用0至100％的缓冲液B(25mM磷酸钠，pH 7.0)的线性梯度进行洗脱。将保留时间与具有已知疏水性的蛋白质标准品进行比较。

热稳定性：

在20mM组氨酸/组氨酸氯化物、140mM NaCl、pH 6.0中，以1mg/mL的浓度制备双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的样品，通过经由0.4μm滤板离心而转移到384孔光学板中，并用石蜡油覆盖。在DynaPro读板仪(Wyatt)上通过动态光散射重复测量流体动力学半径，同时将样品以0.05℃/分钟的速度从25℃加热到80℃。可替代地，将样品转移到10μL微量比色皿阵列中，并用Optim1000仪器(Avacta Inc.)记录了静态光散射数据和266nm激光激发后的荧光数据，同时将它们以0.1℃/分钟的速度从25℃加热到90℃。

聚集起始温度定义为处于流体动力学半径(DLS)时的温度或散射光强度(Optim1000)开始增大时的温度。

结果在表1和表2中示出。

表1：通过SPR评估的P1AE2845的VEGF和PDGF-B结合动力学

表2：P1AE2845的热稳定性和疏水性

Tagg(℃)	HIC(相对保留时间)
		73	0.40

实例4：

双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段P1AE2845的改善

对于临床应用，该抗体得到了进一步改善，例如关于PDGF-B和VEGF的结合。通过在VH和VL结构域中引入不同的氨基酸取代，进行了几轮成熟。在成熟期间，基于它们在产率、亲和力、同时的抗原结合、亲水性、稳定性、粘度和其他参数方面的期望特性，筛选和选择衍生自抗体P1AE2845的候选抗体。

从多个测试的候选抗体分子中选择改善的候选抗体P1AA9124、以及28.01、28.02、RO7113083和28.07。在表3中鉴定了那些改善的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的氨基酸序列。

表3：双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的氨基酸序列(数字指本文所用的SEQID NO)

	VH	VL	重链	轻链
					P1AE2845	1	2	9	10
P1AA9124	11	12	18	19
					RO7113083	11	21	18	20
28.01	11	25	18	27
					28.02	28	25	30	27
28.07	28	31	30	33

图2和图3示出了所产生的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的可变重链结构域和可变轻链结构域的比对。VH和VL结构域内的氨基酸位置编号根据的是Kabat编号系统。为简单起见，图中包括了编号，进一步说明了框架和CDR氨基酸的位置。

实例5：

改善的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的抗原结合动力学如实例3所述，使用所示的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段(氨基酸序列如表3所示)评估候选抗体与VEGF和PDGF-B的结合动力学。

PDGF-B结合动力学的结果示于表4a、4b和表5a、b和c中。为了比较，描述了如WO2016/075036中所公开的现有技术的抗VEGF/抗PDGF-B抗体0117(全长IgG抗体)的抗原结合动力学。此外，描述了现有技术的PDGF抑制剂pegpleranib

(一种聚乙二醇化适体)的PDGF结合动力学。

表4a：通过SPR平行评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体和pegpleranib的人PDGF-B结合动力学

表4b：通过SPR平行评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体和pegpleranib的人PDGF-B结合动力学(来自WO2016/075036的现有技术抗体0117的数据)

表5a：通过SPR评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的食蟹猴PDGF结合动力学

表5b：通过SPR评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的小型猪PDGF结合动力学

表5c：通过SPR评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的兔PDGF-B结合动力学

表5d：通过SPR评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的PDGF-AA结合动力学

*…“无结合可检测”

VEGF结合动力学的结果示于表6a和b中。

表6a：通过SPR平行评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体和pegpleranib的人VEGF121结合动力学

表6b：通过SPR评估的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的人VEGF121结合动力学(来自WO2016/075036的现有技术抗体0117的数据)

实例6：

改善的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段的生物物理特性(稳定性和疏水性)

如实例3所述，使用所示的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段(氨基酸序列如表3所示)评估候选抗体的指示生物物理特性。

表7说明了所分析抗体的热稳定性和疏水性。为了比较，包括了如WO2016/075036中所公开的现有技术的抗VEGF/抗PDGF-B抗体0117(全长IgG抗体)的热稳定性。

表7：双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体的热稳定性和疏水性(来自WO2016/075034的现有技术抗体0032的数据)

实例7：

VEGF121和VEGF165阻断活性(VEGF基线测定)

Maxisorp 96孔板(ThermoScientific#442404)用50μL/孔的hVEGFR-1-Fc在200mMNaHCO₃中(pH 9.4)以1μg/mL的最终浓度在室温包被1小时。将指示的候选Fab片段稀释至在280μL PBST-1％BSA中409.6nM的浓度。对于2倍连续稀释，将140μL稀释的Fab样品与140μLPBST-1％BSA混合，并通过轻轻移液混合7次。将2倍稀释步骤重复9次以上。向圆底96孔板预填充50μL/孔的2nM VEGF121或2nM VEGF165在PBST-1％BSA中。将50μL Fab稀释液添加到VEGF板中，混合6次并孵育1.5小时。随后，将maxisorp板用PBST洗涤2次，然后加入200μL2％MPBST，然后在室温孵育45分钟。之后，将板用PBST洗涤两次。将50μl Fab-VEGF预混物转移至Maxisorp板并在室温孵育1.5小时。之后，将板用PBST洗涤两次，并加入50μL抗VEGF-bio抗体(以1:2000稀释在PBST中)和SA-HRP(以1:2000稀释在PBST中)并在室温孵育30分钟。将板用PBST洗涤6次，加入50μL TMB底物溶液并在室温孵育30分钟。最后，加入50μL 1N硫酸以停止反应并在450nm处读取吸光度。结果在图4中示出。

实例8：

改善的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段P1AA9124的结构分析

从具有VEGF和PDGF-B的复合物中的双特异性抗VEGF/抗PDGF-B Fab片段P1AA9124的晶体结构中鉴定出与各自的抗原VEGF和PDGF-B接触的氨基酸残基。

Fab-VEGF复合物的结晶：为了获得具有VEGFA-121(Peprotech-目录号100-20A)的复合物中的Fab片段P1AA9124的晶体，两种蛋白质都以相对于VEGF单体的1:1摩尔比混合。将复合物浓缩至11mg/ml，并在20℃通过悬滴蒸汽扩散对0.1M MES pH 6.5和1.6M硫酸镁进行结晶。针状晶体在约120天内生长，并在液氮(其中含有20％甘油作为低温保护剂)中冷冻。

数据收集和晶体结构测定Fab-VEGF复合物：在瑞典隆德MAX IV实验室I911-3站于100K温度收集数据，该实验室配备MarMosaic 225检测器。共收集了200张衍射图像，曝光时间为30秒，每张图像的振荡范围为1°。使用XDS(J.Appl.Cryst.(1993).26,795-800)对数据进行积分和缩放，然后使用XDSCONV进行合并并转换为MTZ格式。CCP4套件(Acta Cryst.(2011).D67,235-242)用于通过分子置换法求解和细化DutaFab:VEGF复合物的结构，使用的是Phaser(J.Appl.Cryst.(2007).40,658-674)。溶剂含量和Matthews系数分别计算为43.5％和

其对应于不对称单元中的两个Fab:VEGF复合物。作为搜索模型，VEGF(PDB 1BJ1)和相关Fab(PDB 1JPS)的结构分别用于在不对称单元中搜索一个和两个拷贝。Phaser可以定位二聚体VEGF和两个Fab分子。分子置换后，在Refmac5(Acta Cryst.(1997).D53,240-255)中进行刚体细化。Refmac5中的迭代约束细化和Coot(Acta Cryst.(2004).D60,2126-2132)中的模型构建导致最终结构，其中R和R_free值分别为22.2％和27.2％。

Fab-PDGF复合物的结晶：为了获得具有PDGF-BB(Peprotech-目录号100-13A)的复合物中的Fab片段P1AA9124的晶体，两种蛋白质都以相对于PDGF单体的1:1摩尔比混合。将复合物浓缩至12mg/ml，并在20℃通过悬滴蒸汽扩散对0.1M Tris pH 7.5、42％(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)进行结晶。板状晶体在几周内生长，并在液氮(其中含有20％甘油作为低温保护剂)中冷冻。

数据收集和晶体结构测定Fab-PDGF复合物：数据是在配备Pilatus3 6M检测器的英国Diamond Light Source I03站于100K温度收集的。共收集了800张衍射图像，曝光时间为0.1秒，每张图像的振荡范围为0.2°。使用XDS(J.Appl.Cryst.(1993).26,795-800)对数据进行积分和缩放，然后使用XDSCONV进行合并并转换为MTZ格式。CCP4套件(Acta Cryst.(2011).D67,235-242)用于通过分子置换法求解和细化DutaFab:PDGF-BB复合物的结构，使用的是Phaser(J.Appl.Cryst.(2007).40,658-674)。溶剂含量和Matthews系数分别计算为53.2％和

其对应于不对称单元中的两个DutaFab:PDGF复合物。作为搜索模型，单体PDGF(PDB4QCI)和来自DutaFab:VEGF结构的Fab用于各自在不对称单元中搜索两个拷贝。Phaser可以定位两个Fab分子。分子置换后，在Refmac5(Acta Cryst.(1997).D53,240-255)中进行刚体细化。第一轮约束细化产生了足够清晰的地图，可以手动放置二聚体PDGF-BB。Refmac5中的迭代约束细化和Coot(Acta Cryst.(2004).D60,2126-2132)中的模型构建导致最终结构，其中R和R_free值分别为26.7％和30.9％。

晶体学数据收集和细化统计

^a括号中的值用于最高分辨率壳层。

VH和VL结构域内的互补位氨基酸残基的位置说明如图2所示。如图所示，VEGF互补位和PDGF-B互补位不重叠。促成VEGF互补位的氨基酸不促成PDGF-B互补位。反之，促成PDGF-B互补位的氨基酸不促成VEGF互补位。

来自轻链CDR1和CDR3以及重链CDR2的氨基酸促成VEGF互补位。VEGF互补位不包含来自轻链CDR2、重链CDR1和重链CDR3的氨基酸。

在下面的表8(对于可变的重链结构域氨基酸残基)和表9(对于可变的轻链结构域氨基酸残基)中鉴定出鉴定为促成抗原结合的氨基酸残基。根据Kabat编号系统对氨基酸位置进行编号(在图1和2中使用相同的编号)。抗原结合中涉及的氨基酸位置由其在VH或VL结构域中的Kabat位置确定(另请参见图1和2中的编号)。

表8：如通过双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体P1AA9124的晶体结构分析所鉴定的，抗原结合涉及的可变重链氨基酸残基

表9：如通过双特异性抗VEGF/抗PDGF-B抗体P1AA9124的晶体结构分析所鉴定的，抗原结合涉及的可变轻链氨基酸残基

VL	VEGF	PDGF-B
			FR1	1,2	-
L-CDR1	26、27、27a、27b、27c	-
			FR2	-	-
L-CDR2	-	55,56
			FR3	68,69	-
L-CDR3	92、93、94、95、96	-
			FR4	-	-

序列表

<110> 豪夫迈罗氏有限公司

<120> 与 VEGF 和 PDGF-B 结合的抗体及其使用方法

<130> P36018-WO

<150> EP 20166630.2

<151> 2020-03-30

<160> 33

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 VH 结构域

<400> 1

Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Trp Phe Glu Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Asn Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Glu Gly Tyr Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 VL 结构域

<400> 2

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Tyr Trp Leu His Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PVHL、27.01、28.01、28.02、28.06 和 28.07 的 H-CDR1

<400> 3

Tyr Thr Asp Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 H-CDR2

<400> 4

Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Asn Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 H-CDR3

<400> 5

Asp Glu Gly Tyr Phe Asp Glu

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 L-CDR1

<400> 6

Gln Ala Ser Tyr Trp Leu His Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 L-CDR2

<400> 7

Asp Ala Ser Glu Leu Glu Tyr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL 的 L-CDR3

<400> 8

Gln Asn Tyr Arg Tyr His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL Fab 片段的重链

<400> 9

Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Trp Phe Glu Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Asn Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Glu Gly Tyr Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PHVL Fab 片段的轻链

<400> 10

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Tyr Trp Leu His Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01 和 28.06 的 VH 结构域

<400> 11

Asp Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asp Gly Trp Trp Phe Gly Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01 的 VL 结构域

<400> 12

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01 和 28.06 的 H-CDR2

<400> 13

Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01、28.02、28.06 和 28.07 的 H-CDR3

<400> 14

Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Thr

1 5

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01、28.02、28.06 和 28.07 的 L-CDR1

<400> 15

His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01、28.02、28.06 和 28.07 的 L-CDR2

<400> 16

Asp Gly Lys Glu Arg Glu His

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01、28.02、28.06 和 28.07 的 L-CDR3

<400> 17

Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 18

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01、28.01 和 28.06 Fab 片段的重链

<400> 18

Asp Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asp Gly Trp Trp Phe Gly Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 19

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27.01 Fab 片段的轻链

<400> 19

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.06 Fab 片段的轻链

<400> 20

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.06 的 VL 结构域

<400> 21

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.06 的 L-FR1

<400> 22

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg

115 120

<210> 24

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg

20 25 30

Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg

35 40 45

Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln

50 55 60

Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys

65 70 75 80

Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala

85 90 95

Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Gly Ser Gly

100 105 110

Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Ser

115 120 125

Glu Pro Glu Ala

130

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.01、28.02 的 VL 结构域

<400> 25

Ala Ile His Met Tyr Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.01、28.02 的 L-FR1

<400> 26

Ala Ile His Met Tyr Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 27

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.01、28.02 Fab 片段的轻链

<400> 27

Ala Ile His Met Tyr Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 28

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.02 和 28.07 Fab 片段的 VH 结构域

<400> 28

Asp Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asp Gly Trp Trp Phe Gly Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.02 和 28.07 Fab 片段的 H-CDR2

<400> 29

Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.02 和 28.07 Fab 片段的重链

<400> 30

Asp Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asp Gly Trp Trp Phe Gly Tyr Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Gly His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.07 的 VL 结构域

<400> 31

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.07 的 L-FR1

<400> 32

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 33

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28.07 Fab 片段的轻链

<400> 33

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Glu Arg Glu His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含在可变轻链结构域(VL结构域)和可变重链结构域(VH结构域)的一个同源对内的VEGF互补位和PDGF-B互补位，其中所述VEGF互补位包含来自所述抗体的CDR-H2、CDR-L1和CDR-L3的氨基酸残基，其中所述PDGF-B互补位包含来自所述抗体的CDR-H1、CDR-H3和CDR-L2的氨基酸残基。

2.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含

-VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3；或

-VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及VL结构域，其包含(d)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(e)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3。

3.一种与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体，其包含

-VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1、I2的FR1和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3；或

-VH结构域，其包含(a)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3，(d)人重链框架，其具有(i)含有氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27和W28的FR1，(ii)含有氨基酸残基D73、D74、T75、N76和R94的FR3；以及VL结构域，其包含(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，(g)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3和(h)人轻链框架，其具有(i)含有氨基酸残基A1、I2的FR1和(ii)含有氨基酸残基H68和E69的FR3，其中所述VH结构域和所述VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

4.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其在一对VL结构域和VH结构域内包含：

-(i)VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、S56、T57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96；或

-VH结构域，其包含氨基酸残基D1、L2、D25、G26、W27、W28、Y31、T35b、Y52a、G55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、D73、D74、T75、N76、R94、D96、Y98、D101和T102，以及(ii)VL结构域，其包含氨基酸残基A1、I2、S26、Y27、W27a、L27b、S27c、E55、H56、H68、E69、R92、Y93、H94、P95和Y96，其中所述VH结构域和所述VL结构域的编号根据的是Kabat编号系统。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含

-(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

-(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

-(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

-(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32的氨基酸序列的L-FR-1。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含

-SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列；

-SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；

-SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

-SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:31的VL序列。

8.一种与人VEGF和与人PDGF-B特异性结合的抗体，其包含

-SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列；

-SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；

-SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列；或

-SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:31的VL序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的抗体Fab片段与以下项结合：(i)人VEGF121，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于50pM，和(ii)人PDGF-B，其中通过表面等离子体共振测量的K_D小于10nM。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的抗体Fab片段表现出68℃或更高的聚集起始温度。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为Fab片段。

12.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的抗体。

13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的核酸。

14.一种表达载体，其包含根据权利要求13所述的核酸。

15.一种产生与人VEGF和与人PDGF-B结合的抗体的方法，其包括培养根据权利要求13所述的宿主细胞从而产生所述抗体，进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体。