JP2017537896A - 二重特異性抗体及び眼科に使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、二重特異性抗体及び、例えば、眼科にそれを使用する方法に関する。
眼血管疾患、例えば、加齢黄斑変性(AMD)及び糖尿病性網膜症(DR)はそれぞれ、異常な脈絡膜又は網膜の血管新生による。これらは、先進国における失明の主因である。網膜は、ニューロン、グリア、及び血管の構成要素の十分に定義された層からなるため、比較的小さい障害、例えば、血管増殖又は浮腫に見られる障害より、視覚的機能の著しい損失がもたらされるおそれがある。遺伝性の網膜変性、例えば、網膜色素変性症(RP)も、血管異常、例えば、動脈狭窄及び血管萎縮に関連している。これらは、3,500人に1人もの数で発症し、多くの場合、完全な失明に進行する、進行性の夜盲症、視野喪失、視神経萎縮、動脈衰弱、及び視野中心の喪失により特徴付けられる。
a)
(a)配列番号:02のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:04のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:07のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む重鎖可変ドメインと、
(a)配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
a)(a)配列番号:30のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:37のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:39のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:40のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:42のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:46のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:49のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
a)(a)配列番号:57のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:58のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:60のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:62のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:63のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:64のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:66のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:76のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:80のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:82のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
d)(a)配列番号:84のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:85のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:87のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:89のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:90のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:91のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
a)(a)配列番号:93のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:94のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:96のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:97のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:98のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:99のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:101のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:102のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:104のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:106のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:107のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:108のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である。
i) a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されているか、又は
ii) b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されている。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である。
i)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
v)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vi)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
x)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである。
抗体は、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
i)I253A、H310A、及びH435A、又は
ii)H310A、H433A、及びY436A、又は
iii)L251D、L314D、及びL432D、又は
iv) i)〜iii)の組み合わせ
を含む。
I.定義
本明細書における目的で、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されているヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、又は、同フレームワークは、アミノ酸配列の変化を含有してもよい。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、又は2以下である。一部の実施態様では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して同一の配列である。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)において生じる超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)と、
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、及び95〜102(H3)において生じるCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)と、
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、及び93〜101(H3)において生じる抗原コンタクト(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))と、
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、及び94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組み合わせとを
含む。
100×分数X/Y
本明細書において、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒトPDGF−B)からなる群より選択される種々の抗原に特異的に結合する新規な二重特異性抗体が報告される。この場合、本抗体は、抗ANG2/VEGF二重特異性抗体ではない。本発明の抗体は、例えば、眼血管疾患、例えば、黄斑変性の処置に有用である。
A.1 本明細書で報告された二重特異性抗体の抗IL−1ベータ結合部位を得ることができる抗IL1ベータ抗体
本明細書において、4つの新規な抗ヒトIL−1ベータ抗体が提供される。
本明細書において、種々の新規な抗ヒトPDGF−B抗体が提供される。
好ましい一実施態様では、抗VEGF抗体は、配列番号:107の重鎖可変ドメインに含まれる、HVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3を含む。HVRは、Kabatに従ったCDRを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号:108の重鎖可変ドメインに含まれる、HVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3を更に含む。HVRは、Kabatに従ったCDRを含む。
本明細書で報告された一態様は、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
i) a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、負に荷電したアミノ酸により置換されているか、又は
ii) b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、負に荷電したアミノ酸により置換されている。
i) a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されているか、又は
ii) b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されている。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二価の二重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)1〜4つの更なる抗原に特異的に結合する(すなわち、第2及び/又は第3及び/又は第4及び/又は第5の抗原、好ましくは、1つの更なる抗原、すなわち、第2の抗原に特異的に結合する)、1、2、3、又は4つの一本鎖Fabフラグメントとを含み、
前記b)の一本鎖Fabフラグメントが、前記a)の全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC末端又はN末端において融合しており、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、多重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH)、又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)及び抗体定常ドメイン1(CH1)からなる第1のポリペプチドであって、前記第1のポリペプチドが、そのVHドメインのN末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の2つの重鎖の内の一方のC末端に融合している第1のポリペプチドと、
c)
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)からなる第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドが、VLドメインのN末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の2つの重鎖の内の他方のC末端に融合している第2のポリペプチドとを含み、
第1のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と第2のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)とが共に、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成しており、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、三価の二重特異性抗体である。
i)重鎖可変ドメインの44位と軽鎖可変ドメインの100位、又は
ii)重鎖可変ドメインの105位と軽鎖可変ドメインの43位、又は
iii)重鎖可変ドメインの101位と軽鎖可変ドメインの100位(通常、Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)
の間へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋により安定化されている。
a)第1の抗原に特異的に結合する全長抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する全長抗体の第2の(改変)軽鎖及び第2の(改変)重鎖であって、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の(改変)軽鎖及び第2の(改変)重鎖と、
c)1〜4つの抗原結合ペプチドであって、これらが、1つ又は2つの更なる抗原に(すなわち、第3及び/又は第4の抗原に)特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、a)及び/又はb)の軽鎖又は重鎖のC末端又はN末端に融合している1〜4つの抗原結合ペプチドとを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々抗原である、三重特異性又は四重特異性抗体である
a)抗体の2つの軽鎖及び2つの重鎖であって、これらが、第1の抗原に特異的に結合する(かつ、2つのFabフラグメントを含む)2つの軽鎖及び2つの重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の2つの更なるFabフラグメントであって、前記更なるFabフラグメントが両方とも、ペプチドリンカーを介して、a)の重鎖のC末端又はN末端のいずれかに融合している2つの更なるFabフラグメントを含み、
Fabフラグメントにおいて、下記改変が行われている、
i) a)の両Fabフラグメント及びb)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
ii) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、かつ
b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
iii) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、かつ
b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
iv) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、b)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
v) a)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性の四価抗体である。
i) a)の両Fabフラグメント又はb)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている。
i) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている。
i) a)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている。
i) b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている。
i) b)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている。
a)第1の抗原に特異的に結合し、第1のVH−CH1ドメインペアを含む第1の抗体の(改変)重鎖であって、前記重鎖のC末端に、前記第1の抗体の第2のVH−CH1ドメインペアのN末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第1の抗体の(改変)重鎖と、
b)前記a)の第1の抗体の2つの軽鎖と、
c)第2の抗原に特異的に結合し、第1のVH−CLドメインペアを含む第2の抗体の(改変)重鎖であって、前記重鎖のC末端に、前記第2の抗体の第2のVH−CLドメインペアのN末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第2の抗体の(改変)重鎖と、
d)前記c)の第2の抗体の2つの(改変)軽鎖であって、それぞれが、CL−CH1ドメインペアを含む第2の抗体の2つの(改変)軽鎖とを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性の四価抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のN末端が、軽鎖のC末端に、ペプチドリンカーを介して連結している第2の全長抗体の重鎖及び軽鎖とを含み、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)第2の抗原に特異的に結合し、VH2ドメイン及びVL2ドメインを含むFvフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに連結しているFvフラグメントとを含み、
VH2ドメイン又はVL2ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第1の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合しており、
第1及び第2の抗原が、(ヒト)ANG2、(ヒト)VEGF、(ヒト)IL−1ベータ、及び(ヒト)PDGF−Bからなる群より選択される種々の抗原である、二重特異性抗体である。
−411位におけるアミノ酸Tを、N、R、Q、K、D、E、及びWから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、
−399位におけるアミノ酸Dを、R、W、Y、及びKから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、
−400位におけるアミノ酸Sを、E、D、R、及びKから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、
−405位におけるアミノ酸Fを、I、M、T、S、V、及びWから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、
−390位におけるアミノ酸Nを、R、K、及びDから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、及び
−392位におけるアミノ酸Kを、V、M、R、L、F、及びEから選択されるアミノ酸により置換すること(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)である。
i)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
v)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vi)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
x)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである。
抗体は、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
i)I253A、H310A、及びH435A、又は
ii)H310A、H433A、及びY436A、又は
iii)L251D、L314D、及びL432D、又は
iv) i)〜iii)の組み合わせ
を含む。
KD値を決定するための方法は、以下の実施例に概説されている。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号;及び、Morrison, S.L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域)と、ヒト定常領域とを含む。更なる例では、キメラ抗体は、「クラススイッチ」抗体である。同抗体では、クラス又はサブクラスが、親抗体のクラス又はサブクラスから変更されている。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
本明細書で提供された抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2種類の部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、一方の結合特異性は、IL−1ベータに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、IL−1ベータの2種類のエピトープに結合することができる。また、二重特異性抗体は、細胞毒剤を、IL−1ベータを発現している細胞に局在させるのにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体のアミノ酸変異体が想到される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することにより又はペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸残基からの欠失、及び/又は、同配列内への挿入、及び/又は、同配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物を得るのに行うことができる。ただし、最終的な構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合性を有するという条件である。
特定の実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異原性の対象となる部位は、HVR及びFRを含む。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下の表に示す。更なる置換的変更は、表1中の「例示的な置換」の見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスへの言及において更に以下に記載される。アミノ酸置換は、対象となる抗体、ならびに、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合性、低下した免疫原性、又は改善されたADCCもしくはCDCについてスクリーニングされた生成物に導入することができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)天然の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族性:Trp、Tyr、Phe
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、抗体がグリコシル化されている度合いを向上又は低下させるように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を改変させることにより、都合良く達成することができる。これにより、1つ以上のグリコシル化部位が形成又は除去される。
特定の実施態様では、1つ以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供された抗体のFc領域に導入することにより、Fc領域変異体を生成することができる。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置において、アミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、「チオMAb」を形成するのが望ましい場合がある。同抗体において、抗体の1つ以上の残基は、システイン残基により置換されている。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセッシブル部位において起こる。システインによりそれらの残基を置換することにより、反応性チオール基は、抗体のアクセッシブル部位に位置することで、抗体を他の部分、例えば、薬剤部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートして、本明細書で更に記載された免疫コンジュゲートを形成するのに使用することができる。特定の実施態様では、任意の1つ以上の下記残基:軽鎖のV205(Kabatナンバリング);重鎖のA118(EUナンバリング);及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)は、システインにより置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されているように生成することができる。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、当技術分野において公知であり、容易に利用できる、更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造中での利点を有する場合がある。このポリマーは、任意の分子量のものであることができ、分岐鎖又は非分岐鎖であることができる。抗体に付着するポリマー数は変化させることができ、2つ以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じか又は異なる分子であることができる。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定条件下での治療に使用されるであろうかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているリコンビナント法及び組成物を使用して産生することができる。一実施態様において、本明細書で記載された抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードすることができる。更なる実施態様では、このような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含むホスト細胞が提供される。1つのこのような実施態様では、ホスト細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクターを含む(例えば、(1)又は(2)によりトランスフォーメーションされている)。一実施態様において、ホスト細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ球細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、本明細書で報告された抗体を製造する方法が提供される。ここで、同方法は、抗体の発現に適した条件下において、本明細書で提供された抗体をコードする核酸を含むホスト細胞を培養することと、場合により、ホスト細胞(又はホスト細胞培養培地)から、抗体を回収することとを含む。
本明細書で報告された抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイ法により、その物理的/化学的特性及び/又は生体活性を特定し、スクリーニングし、又は、特徴付けることができる。例示的なアッセイ法は、実施例に報告されている。
また、本発明は、1つ以上の細胞毒剤、例えば、化学療法剤又は薬剤、増殖阻害剤、トキシン(例えば、タンパク質トキシン、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性トキシン、またはそれらのフラグメント)又は放射性同位体にコンジュゲートした、本明細書で報告された抗体を含む免疫コンジュゲートも提供する。
本明細書で記載された多重特異性抗体の医薬製剤は、所望の度合いの純度を有するこのような抗体を、1つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の状態で調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);ならびに/又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されない。本明細書において、例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質薬分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)を更に含む。rhuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許出願公開公報第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。一態様において、sHASEGPは、1つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
本明細書で提供された多重特異性抗体のいずれかを、治療法に使用することができる。
本発明の別の態様では、上記された障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、該容器上又は該容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等を含む。容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成することができる。容器は、組成物自体、又は、症状を治療、予防、及び/又は診断するのに有効な別の組成物との組み合わせで、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を処置するのに使用されることを示す。さらに、本製品は、(a)本製品に含有される組成物を含む第1容器であって、同組成物が本発明の抗体を含む第1容器と、(b)本製品に含有される組成物を含む第2容器であって、同組成物が更なる細胞毒又はその他の方法での治療剤を含む第2容器とを含んでもよい。本発明のこの実施態様における製品は、組成物が特定の症状を処置するのに使用することができることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に又は付加的に、本製品は、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第2(又は第3)容器を更に含む。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザ視点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
1.ヒトANG2、ヒトVEGF、ヒトIL−1ベータ、及びヒトPDGF−Bからなる群より選択される2種類の抗原に特異的に結合する、二重特異性抗体。
a)
(a)配列番号:02のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:04のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:07のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む重鎖可変ドメインと、
(a)配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜4のいずれか1つ記載の抗体。
a)(a)配列番号:07のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、
(a)配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜5のいずれか1つ記載の抗体。
a)(a)配列番号:30のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:37のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:39のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:40のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:42のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:46のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:49のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜6のいずれか1つ記載の抗体。
(a)配列番号:30のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:37のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜7のいずれか1つ記載の抗体。
(a)配列番号:39のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:40のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:42のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:46のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜7のいずれか1つ記載の抗体。
(a)配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:49のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1〜7のいずれか1つ記載の抗体。
a)(a)配列番号:57のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:58のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:60のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:62のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:63のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:64のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:66のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:76のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:80のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:82のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
d)(a)配列番号:84のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:85のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:87のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:89のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:90のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:91のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1、2、及び5〜10のいずれか1つ記載の抗体。
(a)配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:76のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:80のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:82のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、実施態様1、2、及び5〜11のいずれか1つ記載の抗体。
a)配列番号:107の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3と、配列番号:108の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3とを含むか、又は
b)配列番号:109の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3と、配列番号:110の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3とを含む、実施態様1、3、及び5〜12のいずれか1つ記載の抗体。
配列番号:107及び配列番号:108それぞれにおけるHC及びLC配列を含み、同HC及びLC配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む、実施態様1、3、及び5〜13のいずれか1つ記載の抗体。
配列番号:109及び配列番号:110それぞれにおけるHC及びLC配列を含み、同HC及びLC配列が、それらの配列の翻訳後修飾を含む、実施態様1、3、及び5〜13のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
i) a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されているか、又は
ii) b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されている、実施態様20記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)1〜4つの更なる抗原に特異的に結合する(すなわち、第2及び/又は第3及び/又は第4及び/又は第5の抗原、好ましくは、1つの更なる抗原、すなわち、第2の抗原に特異的に結合する)、1、2、3、又は4つの一本鎖Fabフラグメントとを含み、
前記b)の一本鎖Fabフラグメントが、前記a)の全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC末端又はN末端において融合している、多重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH)、又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)及び抗体定常ドメイン1(CH1)からなる第1のポリペプチドであって、前記第1のポリペプチドが、そのVHドメインのN末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の2つの重鎖の内の一方のC末端に融合している第1のポリペプチドと、
c)
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)からなる第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドが、VLドメインのN末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の2つの重鎖の内の他方のC末端に融合している第2のポリペプチドとを含み、
第1のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と第2のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)とが共に、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成している、三価の二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
i)重鎖可変ドメインの44位と軽鎖可変ドメインの100位、又は
ii)重鎖可変ドメインの105位と軽鎖可変ドメインの43位、又は
iii)重鎖可変ドメインの101位と軽鎖可変ドメインの100位(通常、Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、
の間へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋により安定化されている、実施態様29記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する全長抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する全長抗体の第2の(改変)軽鎖及び第2の(改変)重鎖であって、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の(改変)軽鎖及び第2の(改変)重鎖と、
c)1〜4つの抗原結合ペプチドであって、これらが、1つ又は2つの更なる抗原に(すなわち、第3及び/又は第4の抗原に)特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、a)及び/又はb)の軽鎖又は重鎖のC末端又はN末端に融合している1〜4つの抗原結合ペプチドとを含む、三重特異性又は四重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する(かつ、2つのFabフラグメントを含む)抗体の2つの軽鎖及び2つの重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の2つの更なるFabフラグメントであって、前記更なるFabフラグメントが、ペプチドリンカーを介して、a)の重鎖のC末端又はN末端のいずれかに融合している2つの更なるFabフラグメントを含み、
Fabフラグメントにおいて、下記改変が行われている、
i) a)の両Fabフラグメント及びb)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、及び/又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
ii) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、かつ
b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
iii) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、かつ
b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
iv) a)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられており、b)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、
又は
v) a)の両Fabフラグメントにおいて、定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられており、b)の両Fabフラグメントにおいて、可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられている、
二重特異性の四価抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合し、第1のVH−CH1ドメインペアを含む第1の抗体の(改変)重鎖であって、前記重鎖のC末端に、前記第1の抗体の第2のVH−CH1ドメインペアのN末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第1の抗体の(改変)重鎖と、
b)前記a)の第1の抗体の2つの軽鎖と、
c)第2の抗原に特異的に結合し、第1のVH−CLドメインペアを含む第2の抗体の(改変)重鎖であって、前記重鎖のC末端に、前記第2の抗体の第2のVH−CLドメインペアのN末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第2の抗体の(改変)重鎖と、
d)前記c)の第2の抗体の2つの(改変)軽鎖であって、それぞれが、CL−CH1ドメインペアを含む第2の抗体の2つの(改変)軽鎖とを含む、二重特異性の四価抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する第2の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のN末端が、軽鎖のC末端に、ペプチドリンカーを介して連結している、二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2つの抗体重鎖及び2つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
b)第2の抗原に特異的に結合し、VH2ドメイン及びVL2ドメインを含むFvフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに連結しているFvフラグメントとを含み、
VH2ドメイン又はVL2ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第1の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合している、二重特異性抗体である、実施態様1〜19のいずれか1つ記載の抗体。
i)第1のFc領域ポリペプチドが、
−ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG2 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG3 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異K392Dを有するヒトIgG1、IgG2、又はIgG4、及び
−突然変異N392Dを有するヒトIgG3を含む群より選択され、
ii)第2のFc領域ポリペプチドが、
−ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG2 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG3 Fc領域ポリペプチド、
−ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異Y349C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、Y349C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、Y349C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異Y349C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、Y349C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異P329G、Y349C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチド、
−突然変異D399K、D356K、及び/又はE357Kを有するヒトIgG1、ならびに
−突然変異D399K、E356K、及び/又はE357Kを有するヒトIgG2、IgG3、又はIgG4を含む群より選択される、実施態様1〜35のいずれか1つ記載の抗体。
i)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
v)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vi)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、又は
x)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである、実施態様1〜35のいずれか1つ記載の抗体。
抗体が、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
i)I253A、H310A、及びH435A、又は
ii)H310A、H433A、及びY436A、又は
iii)L251D、L314D、及びL432D、又は
iv) i)〜iii)の組み合わせ
を含む、実施態様1〜37のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1及び第2のFc領域ポリペプチドが両方とも、ヒトIgG1又はヒトIgG4サブクラス(ヒト起源由来)であり、第1及び第2のFc領域ポリペプチドにおける全ての突然変異がまとまった際に、突然変異i)I253A、H310A、及びH435A、又は、ii)H310A、H433A、及びY436A、又は、iii)L251D、L314D、及びL432Dが突然変異(ヒト)IgGクラスFc領域に含まれるように、第1のFc領域ポリペプチドにおいて、i)群I253A、H310A、及びH435A、又は、ii)群H310A、H433A、及びY436A、又は、iii)群L251D、L314D、及びL432D(Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング)から選択される1つ又は2つの突然変異と、第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A、及びY436A(Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング)を含む群から選択される1つ又は2つの突然変異とを含み、あるいは
b)第1及び第2のFc領域ポリペプチドが両方とも、ヒトIgG1又はヒトIgG4サブクラス(すなわち、ヒト起源由来)であり、第1及び第2のFc領域ポリペプチドにおける全ての突然変異がまとまった際に、突然変異i)I253A、H310A、及びH435A、又は、ii)H310A、H433A、及びY436A、又は、iii)L251D、L314D、及びL432DがFc領域に含まれるように、第1及び第2のFc領域ポリペプチドの両方が、Fc領域において、突然変異I253A/H310A/H435AもしくはH310A/H433A/Y436AもしくはL251D/L314D/L432D、又はそれらの組み合わせ(Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング)を含み、全ての突然変異が、第1又は第2のFc領域ポリペプチドにおけるものであるか、又は、1つもしくは2つの突然変異が、第1のFc領域ポリペプチドにおけるものであり、1つもしくは2つの突然変異が、第2のFc領域ポリペプチドにおけるものであるかのいずれかであり、あるいは、
c)第1及び第2のFc領域ポリペプチドが両方とも、ヒトIgG1又はヒトIgG4サブクラス(すなわち、ヒト起源由来)であり、第1及び第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異I253A/H310A/H435AもしくはH310A/H433A/Y436AもしくはL251D/L314D/L432D(Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング)を含むか、又は、第1のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異I253A/H310A/H435Aの組み合わせを含み、第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異H310A/H433A/Y436Aの組み合わせ(Kabat EUインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリング)を含む、実施態様1〜37のいずれか1つ記載の抗体。
a)第1の突然変異Fc領域ポリペプチドが、第1の親IgGクラスFc領域ポリペプチドから得られ、第2の突然変異Fc領域ポリペプチドが、第2の親IgGクラスFc領域ポリペプチドから得られ、第1の親IgGクラスFc領域ポリペプチドが、第2の親IgGクラスFc領域ポリペプチドと同一であるか、又は、第2の親IgGクラスFc領域ポリペプチドとは異なり、
b)第1の突然変異Fc領域ポリペプチドが、第2の突然変異Fc領域ポリペプチドとは、第1の親IgGクラスFc領域ポリペプチドが第2の親IgGクラスFc領域ポリペプチドとは異なるそれらのアミノ酸残基以外の1つ以上のアミノ酸残基において異なり、
c)第1の突然変異Fc領域ポリペプチド及び第2の突然変異Fc領域ポリペプチドを含むIgGクラスFc領域が、a)の第1の親IgGクラスFc領域ポリペプチド及びa)の第2の親IgGクラスFc領域ポリペプチドを含むIgGクラスFc領域の親和性とは異なるヒトFcレセプターに対する親和性を有し、
第1のFc領域ポリペプチドもしくは第2のFc領域ポリペプチドのいずれか又は両方のFc領域ポリペプチドが、それぞれ独立して、下記突然変異:
−T307H、又は
−Q311H、又は
−E430H、又は
−N434H、又は
−T307H及びQ311H、又は
−T307H及びE430H、又は
−T307H及びN434A、又は
−T307H及びN434H、又は
−T307Q及びQ311H、又は
−T307Q及びE430H、又は
−T307Q及びN434H、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434A、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434H、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434Y、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434A、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434H、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434Y、又は
−T307Q及びV308P及びN434Y及びY436H、又は
−T307H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−Q311H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−E430H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−N434H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びQ311H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びE430H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びN434A及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びN434H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びQ311H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びE430H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びN434H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434A及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307H及びQ311H及びE430H及びN434Y及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434A及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434H及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びQ311H及びE430H及びN434Y及びM252Y及びS254T及びT256E、又は
−T307Q及びV308P及びN434Y及びY436H及びM252Y及びS254T及びT256Eの内の1つ又は同突然変異の組み合わせを含む、実施態様1〜37のいずれか1つ記載の抗体。
第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異Y349C、T366S、L368A、及びY407V(ホール鎖)を含み、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S354C及びT366W(ノブ鎖)を含み、
第1のFc領域ポリペプチド(ホール鎖)が、突然変異
i)I253A又はI253G、及び
ii)L314A又はL314G又はL314Dを含み、
第1のFc領域ポリペプチドと第2のFc領域ポリペプチドとが、1つ以上のジスルフィド架橋により連結されており、
第1のポリペプチドのCH3ドメイン及び第2のポリペプチドのCH3ドメインが両方とも、プロテインAに結合するか、又は、両方ともプロテインAに結合しない(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)、実施態様1〜37のいずれか1つ記載の抗体。
i)I253AもしくはI253G、及び
ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、及び
iii)T250Q、及び/又は
iv)T256EもしくはT256Aを含む、実施態様41記載の抗体。
i)I253AもしくはI253G、及び
ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、及び
iii)場合により、a)T250Q及び/もしくはT256EもしくはT256A、及び
iv) a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、及び/又はb)H310AもしくはH310Gを含む、実施態様41又は42記載の抗体。
i)I253AもしくはI253G、及び
ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、及び
iii) a)T250Q及び/又はT256EもしくはT256A、及び
iv) a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、及び/又はb)H310AもしくはH310G、
v)場合により、a)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、及び/又はb)Q311H、及び/又はc)M252Y、及び/又はd)S254Tを含む、実施態様41〜43のいずれか1つ記載の抗体。
i)T250Q、及び/又は
ii)M252Y、及び/又は
iii)S254T、及び/又は
iv)T256EもしくはT256A、及び/又は
v)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、及び/又は
vi)Q311Hを含む、実施態様41〜44のいずれか1つ記載の抗体。
有効量の実施態様1〜45のいずれか1つ記載の抗体を、個体に投与することを含む、
方法。
実施態様1〜45のいずれか1つ記載の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することにより、眼血管疾患を患う患者を処置する、方法。
a)場合により、実施態様1〜45のいずれか1つ記載の抗体をコードする1つ以上の核酸により、哺乳類細胞をトランスフェクションする工程と、
b)この細胞を、この抗体を発現するように培養する工程と、
c)この抗体を、細胞又は培養培地から回収することにより、この抗体を製造する工程とを含む、
実施態様1〜45のいずれか1つ記載の抗体を製造するための方法。
下記は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供された全体的な説明から、種々の他の実施態様が実施することができることが理解される。
マウス抗IL1ベータ抗体H34の元の生成及び特徴決定
材料−メスのBALB/cマウスを、Banting and Kingman(Freemont, CA)から得た。完全及び不完全フロイントアジュバント(CFA and IFA)を、Difco(Detroit, MI)から得た。HB101を、Hana Biologics, Inc.(Berkeley, CA)から得た。カルシウム及びマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ならびにグルタミンを、GIBCO Labs(Grand Island, NY)から得た。ウシ胎児血清を、Hyclone Labs(Logan, UT)から得た。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT)及びヒポキサンチン−チミジン(HT)補助剤ならびに50% ポリエチレングリコール(PEG)1450を、Bethesda Research Labs(Gaithersburg, MD)から得た。ウサギ抗マウスIgG+A+Mペルオキシダーゼコンジュゲート、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ、マウスIgGアイソタイプ特定キット、及びオルトフェニレンジアミン(OPD)を、Zymed Labs(South San Francisco, CA)から得た。セファロースプロテイン−A及びSephadex G-25を、Pharmacia(Piscataway, NJ)から得た。プリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンデカン)を、Aldrich Chem. Co.(Milwaukee, WI)から得た。125I Bolton-Hunter試薬を、New England Nuclear(Boston, MA)から得た。他の全ての化学薬品を、Sigmaからの分析グレードとした。
マウスの免疫化
NMRIマウスの免疫化について、RIMMS(「急速な免疫化、複数個所」)スケジュールを使用した。
抗IL−1ベータ抗体血清力価の決定
ヒトリコンビナントIL−1ベータを、96ウェルNUNC Maxisorbプレートにおいて、PBS中の2.5μg/ml、100μl/ウェルで免疫化した。続けて、このプレートを、PBS中の2% CroteinCにより、200μl/ウェルでブロッキングした。抗血清の系列希釈を、PBS中の0.5% CroteinCに、100μl/ウェルにおいて、ダプリケートで加えた。PBS中の0.5% CroteinCに1:16,000希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch)により、100μl/ウェルで検出した。全ての工程について、プレートを、37℃で1時間インキュベーションした。全ての工程間において、プレートを、PBS中の0.05% Tween 20で3回洗浄した。シグナルを、100μl/ウェルで、BM Blue POD Substrate soluble(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を加えることにより発色させ、100μl/ウェルで、1M HClを加えることにより停止させた。吸光度を、参照としての690nmに対して、450nmにおいて読み取った。力価を、最大半値シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
ヒトIL−1ベータ結合ELISA
変異体1
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトIL−1ベータ(Peprotech Cat. No 200-01B)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度500ng/mLでPBS 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗IL−1ベータ抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:2000(ロバF(ab)2抗ウサギIgG POD、Amersham, NA9340V又はヒツジIgG抗マウスIgG POD、Amersham RPN4201)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるHisタグ付きヒトIL−1ベータ(Sino Biologics, Cat. No. 10139-H07E)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度0.25μg/mLでPBS 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗IL−1ベータ抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:2000(ロバF(ab)2抗ウサギIgG POD、Amersham, NA9340V又はヒツジIgG抗マウスIgG POD、Amersham RPN4201)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
カニクイザルIL−1ベータ結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトIL−1ベータ(Sino Biologics, Cat. No. 90010CNAE)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度0.5μg/mLでPBS 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗IL−1ベータ抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:2000(ロバF(ab)2抗ウサギIgG POD、Amersham, NA9340V又はヒツジIgG抗マウスIgG POD、Amersham RPN4201)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
マウスIL−1ベータ結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるマウスIL−1ベータ(Sino Biologics, Cat. No. 50101-MNAE)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度0.5μg/mLでPBS 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗IL−1ベータ抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:2000(ロバF(ab)2抗ウサギIgG POD、Amersham, NA9340V又はヒツジIgG抗マウスIgG POD、Amersham RPN4201)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No 11835033001)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法:ヒトIL−1ベータ:ヒトIL−1レセプター1型
ヒトIL−1ベータのヒトIL−1レセプターI型に対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。ヒトHisタグ付きIL−1ベータタンパク質(Sino Biologics, Cat.No.10139-H07E)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific Cat. No. 464718)において、濃度1μg/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程、結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)濃度を増大させる抗IL−1ベータ抗体 12.5μLを、300ng/mL Fcタグ付きヒトIL−1ベータレセプター(Sino Biologics, Ca.No10126-H02H) 12.5μLと、容量250μL中で1時間インキュベーションした。3)検出を、ペルオキシダーゼラベルされた抗huFc抗体(ヤギF(ab2)抗ヒトFC POD、Jackson, Cat. No 109-036-098)を使用して達成した。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Cat. No. 11835033001)を加えた10〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。IC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法:ヒトIL−1ベータ:ヒトIL−1レセプター2型
ヒトIL−1ベータのヒトIL−1レセプターII型に対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。ヒトHisタグ付きIL−1ベータタンパク質(Sino Biologics, Cat.No.10139-H07E)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度1μg/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)濃度を増大させる抗IL−1ベータ抗体 12.5μLを、30ng/mL Fcタグ付きヒトIL−1ベータレセプター(RnD, Ca.No.663-2R-50) 12.5μLと、容量250μL中で1時間インキュベーションした。3)検出を、ペルオキシダーゼラベルされた抗huFc抗体(ヤギF(ab2)抗ヒトFC POD、Jackson, Cat. No 109-036-098)を使用して達成した。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No. 11835033001)を加えた10〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。IC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
マウスハイブリドーマH34マウス抗IL−1ベータ抗体生成ハイブリドーマの発現
培地には、下記試薬:RPMI(PAN)、20% 牛胎児血清、2mM グルタミン(PAN)、1×ピルビン酸ナトリウム(PAN)、1×NEAS(PAN)が含まれている。
マウスハイブリドーマからの抗体精製
抗体含有H34ハイブリドーマ上清をろ過し、2回のクロマトグラフィー工程により精製した。抗体を、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrapプロテインG(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、25mM クエン酸バッファー、pH3.0で回収し、溶出直後に、1M Tris−塩基、pH9.0で、pH6.0に中和した。Superdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、2番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存した。
HEK細胞におけるヒト化抗体のトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬である293-free(Novagen)による懸濁液適合HEK293F(FreeStyle 293-F細胞;Invitrogen)細胞における、抗体の一過性発現
HEK上清からの抗体精製
抗体含有培養上清をろ過し、2回のクロマトグラフィー工程により精製した。PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。抗体を、50mM クエン酸バッファー、pH2.8で回収し、溶出直後に、1M Tris−塩基、pH9.0で、pH6.0に中和した。Superdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、2番目の精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存した。
抗体調製物の分析
抗体調製物のタンパク質濃度を、280nmでの光学密度(OD)を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用することにより決定した。
抗体からのFabフラグメントの調製及び分析:
12mg 抗体(20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の1mg/ml)を、L−システイン溶液 240μl(Merck Millipore;20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の250mM)及びパパイン 327μl(Roche Life Science;0.001U/mg 抗体)と共に、37℃で120分間インキュベーションした。開裂後、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなIgG及びFcフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、2回目の精製工程としてのSuperdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行った。Fabフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存した。
A549細胞のIL−1ベータ刺激後のICAM−1発現
A549細胞(10,000個/ウェル)を、10% FCSを加えたRPMI1640中で、一晩増殖させた。その後、この培地を、0.5% 血清を加えたHunger培地に置き換えた。
A549細胞のIL−1ベータ刺激後のIL−6決定(Quantikine ELISA, R&D Systems)
A549細胞(10,000個/ウェル)を、10% FCSを加えたRPMI1640中で、一晩増殖させた。その後、この培地を、0.5% 血清を加えたHunger培地に置き換え、培養を、96時間継続した。
生物活性アッセイ法
マウスのヘルパーTリンパ球(Th−2)D10.G4.1株が、IL−1(インターロイキン−1)の生物活性についての、信頼性があり、好感度のアッセイ法として広く使用されている。D10細胞は、IL−1又はフィーダー細胞の不存在下において、con Aに対して最少にのみ増殖するであろうためである(Symons, J.A., et al. in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (Eds): IRL Press. 272 (1987)を参照のこと)。この効果についてのED50は、典型的には、12pg/mL未満である。
IL−1ベータにより誘引されたHUVEC細胞でのICAM−1アップレギュレーション
対応する培地EBM/EGM(Cat# CC-4176)中のHUVEC細胞(Lonza, Cat#00191027)を、96ウェル培養プレート(Costar, Cat#3596)に、40,000個/ウェルで、EBM+2% BSA中に、200μl/ウェルで播種した。細胞を、5% CO2インキュベーター中において、37℃で24時間インキュベーションして、回収した。最終的に要求されるものの40倍濃縮された、2つの希釈系列を行った。EBM+2% BSA中に、一方は、抗IL−1b抗体 huH34−2を含み、他方は、リコンビナントヒトIL−1ベータ(R&D Systems, Cat#201-LB)を含む。2つの系列を、互いに1:1で混合し、RTで1時間インキュベーションした。このIL−1ベータ/抗IL−1ベータ抗体混合物 10μlを、細胞に加え、穏やかに混合した。インキュベーションを、5% CO2インキュベーター中において、37℃で20時間行った。その後、全ての培地を、細胞から除去し、細胞を、PBSで2回洗浄した。1×Cell Dissociation Solution Non-enzymatic(Sigma, Cat# C5914)での1回の洗浄後、Cell Dissociation Solution 100μlとのインキュベーションを、37℃で行った。5分毎に顕微鏡で観察することにより、剥離をチェックした。80% 細胞が球状になった時点で、細胞を、FACSプレート(96ウェル、容量340μl、PP、V底プレート(Falcon Cat#353263))に移した。残りの細胞を、PBS+1% BSA 100μlで、4回吸引することにより、培養プレートから剥離した。これも、FACSプレートに加えた。300×gによる5分の遠心分離後、上清を捨てた。ペレットを、PBS+1% BSA+10μg/ml ヒトIgG(Sigma; Cat#I2511) 100μl中に再懸濁させ、RTで15分間インキュベーションした。抗ヒトICAM−1フルオレセインコンジュゲート(CD54)(R&D Systems, Cat#BBA20) 10μlを加え、続けて、4℃で30〜45分間インキュベーションした。300×gによる5分の遠心分離後、上清を捨てた。ペレットを、PBS+1% BSA 110μl中に再懸濁させ、LSRIIにおいて測定した。
THP1細胞におけるMSU誘引TNFアルファ生成
THP1細胞(Invitrogen, Cat. No. thp-null)を、10% FBS(熱不活性化)を加えた増殖培地RPMI 1640(Gibco, Cat#A10491)中で、密度1×106個/mlまで増殖させ、Falconチューブに移した。PMA(ホルボールミリスチン酸酢酸、Invitrogen, Cat# tlrl-pma)を、終濃度300ng/mlで加え、5% CO2インキュベーター中において、37℃で3時間インキュベーションした。細胞を、PBSで1回洗浄し(300×gでの5分の遠心分離、上清を廃棄)、2mM L−グルタミン及び10% FBS(熱不活性化)を加えたHunger RPMI(Gibco, Cat#31870-025)中に、密度1.33×106個/mlで再懸濁させた。150μl/ウェル 細胞懸濁液を、96ウェル培養プレート(Costar, Cat#3596)において、2×105個/ウェルで播種した。一晩のインキュベーションを、5% CO2インキュベーター中において、37℃で行った。4倍濃縮したMSU懸濁液(尿酸一ナトリウム結晶、Invitrogen, Cat# tlrl-msu) 50μlを、Hunger培地中に終濃度250μg/mlで加え、5% CO2インキュベーター中において、37℃で6時間インキュベーションした。抗IL−1ベータ抗体の希釈系列を、増殖培地中で行った。THP1細胞からの上清を捨て、ウェルを、PBSで1回洗浄した。ついで、調製された抗IL−1b抗体の希釈系列を、このウェルに加えた。一晩のインキュベーションを、5% CO2インキュベーター中において、37℃で行った。上清を収集し、TNFアルファシングルプレックスにより分析した。
化学的分解試験
サンプルを、3つのアリコートに分割し、20mM His/His*HCl、140mM NaCl、pH6.0又はPBS中にそれぞれ再度緩衝させ、40℃(His/NaCl)又は37℃(PBS)で保存した。対照サンプルを、−80℃で保存した。
熱安定性
サンプルを、濃度1mg/mLで、20mM ヒスチジン/ヒスチジン塩酸、140mM NaCl、pH6.0中において調製し、0.4μmフィルタプレートを通した遠心分離により、光学384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学半径を、動的光散乱により、サンプルを0.05℃/分の速度で、25℃から80℃に加熱しながら、DynaProプレートリーダー(Wyatt)において繰返し測定した。
免疫化
マウス(NMRIマウス)及びウサギ(ヒトIgローカストランスジェニックウサギ)の免疫化のために、RIMMS(「急速な免疫化、複数の部位」)に基づくスケジュールを使用した。抗原を、ヒトPDGF−BB(Cell Signaling Tech.)とした。
抗PDGF−B抗体の血清力価の決定
ヒトリコンビナントPDGF−Bを、96ウェルNUNC Maxisorbプレートにおいて、2.5μg/ml(マウス)又は1.0μg/ml(ウサギ)で、PBS中に100μl/ウェルで免疫化し、続けて、PBS中の2% CroteinCにより、200μl/ウェルでブロッキングし、抗血清の系列希釈を、PBS中の0.5% CroteinCに、100μl/ウェルで、ダプリケートにおいて加えた。マウス血清について、PBS中の0.5% CroteinCに1:16,000希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch)により、又は、ウサギ血清について、PBS中の0.5% CroteinCに、1:5,000希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ抗体(Southern Biotech)及び1:8,000希釈したHRP−コンジュゲートストレプトアビジンにより、100μL/ウェルで検出した。全ての工程について、プレートを、37℃で1時間インキュベーションした。全ての工程間において、プレートを、PBS中の0.05% Tween 20で3回洗浄した。シグナルを、100μL/ウェルで、BM Blue POD Substrate soluble(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を加えることにより発色させ、100μL/ウェルで、1M HClを加えることにより停止させた。吸光度を、参照としての690nmに対して、450nmにおいて読み取った。力価を、最大半値シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
ウサギからのB細胞クローニング
ウサギ末梢血単核球(PBMC)の単離
血液サンプルを、3匹の免疫化ウサギから採取した。EDTA含有白血球を、lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)を使用し、製造メーカーの仕様に従って、密度遠心分離する前に、1×PBS(PAA, Pasching, Austria)で2倍希釈した。PBMCを、1×PBSで2回洗浄した。
10% FCS(Hyclone, Logan, UT, USA)、2mM グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA, Pasching, Austria)、2mM ピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)、及び0.05mM β−メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を加えたRPMI 1640(Pan Biotech, Aidenbach, Germany)を使用した。
無菌の細胞培養6ウェルプレートを、PBGF−BB(2μg/ml)又はPDGF−AAとPDGF−CCタンパク質との混合物(1μg/ml PDGF−AA及びPDGF−CC)のいずれかで、炭酸バッファー(0.1M 炭酸ナトリウム、34mM 炭酸水素二ナトリウム、pH9.55)中において、4℃で一晩コートした。使用前に、プレートを、無菌のPBSで、3回洗浄した。
半分の血液サンプルのPBMCを、無菌の6ウェルプレート(細胞培養グレード)に播種し、非特異的な付着により、マクロファージ及び単球を枯渇させた。
PDGF BBタンパク質でコートした6ウェル組織培養プレートに、培地 4ml当たりに、最大6×106個 PBLを播種し、インキュベーター中において、37℃で1時間結合させた。付着しなかった細胞を、1×PBSで1〜2回、注意深くウェルを洗浄することにより除去した。残った付着細胞を、トリプシンにより、インキュベーター中において、37℃で10分間剥離した。トリプシン処理を、EL-4B5培地で停止させた。免疫蛍光染色まで、細胞を、氷上で維持した。
抗IgG FITC(AbD Serotec, Dusseldorf, Germany)を、単一細胞分取に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、FITCにコンジュゲートさせた抗IgG抗体と共に、PBS中においてインキュベーションし、4℃において暗所で45分間インキュベーションした。染色後、PBMCを、氷冷PBSで2回洗浄した。最後に、PBMCを、氷冷PBS中に再懸濁させ、直ちに、FACS分析に供した。FACS分析の前に、死んだ細胞と生きている細胞とを区別するために、濃度5μg/ml ヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)を加えた。
簡潔に、単一分取されたウサギB細胞を、Pansorbin細胞(1:100,000)(Calbiochem(Merck), Darmstadt, Deutschland)、5 % ウサギ胸腺細胞上清(MicroCoat, Bernried, Germany)、及びγ線照射マウスEL-4B5胸腺細胞(2.5×104細胞/ウェル)を含有する、200μl/ウェル EL-4B5培地により、96ウェルプレートにおいて、インキュベーター中で、37℃において7日間インキュベーションした。B細胞培養の上清を、スクリーニングのために除去し、残った細胞を、直ちに収集し、RLTバッファー(Qiagen, Hilden, Germany) 100μl中において、−80℃で凍結させた。
ハイブリドーマ生成
細胞培養
マウス骨髄腫細胞株P3x63-Ag8.653を、マウス−マウスハイブリドーマの生成のための融合パートナーとして使用した。細胞を、融合前約14日で融解させ、8−アザグアニンの存在下において培養した。3〜4日毎に、細胞を分割し、濃度1〜2×105個/mlに調節した。
材料:
マウスハイブリドーマ培地(RPMI 1640(PAN)、FBS ultra-low-IgG、2mM L−グルタミン、1mM Na−ピルビン酸、NEAA、muIL-6を含むNutridoma-CS、HAZ(SIGMA, #A9666))を、RTで調節した。
RPMI 1640培地(37℃)
RPMI 1640培地(4℃)
PEG(37℃)
ハイブリドーマの培養
約5×106個の細胞を、Hyclone培地 50ml中に懸濁させる。培養混合物を、96時間インキュベーションする。その後、Hyclone培地 75mlを加えた。培養を、7日間継続した。生存率が40%を下回って低下した場合、細胞懸濁液を、0.22μmフィルタでろ過し、ろ液を、精製に使用した。
B細胞のクローニング
VドメインのPCR増幅
トータルRNAを、B細胞ライゼート(RLTバッファー- Qiagen - Cat. No 79216中に再懸濁)から、NucleoSpin 8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;740709.4, 740698)を使用し、製造メーカーのプロトコルに従って調製した。RNAを、RNAseフリー水 60μlにより溶出した。RNA 6μlを使用して、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)及びオリゴdT−プライマーを使用するリバーストランスクリプターゼ反応により、製造メーカーの説明に従って、cDNAを生成した。全ての工程を、Hamilton ML Starシステムにおいて行った。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域(VH及びVL)を、AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)により、終容量50μl中において、野生型ウサギB細胞の重鎖用のプライマーrbHC.up及びrbHC.doならびに軽鎖用のrbLC.up及びrbLC.doと、トランスジェニックウサギB細胞の軽鎖用のBcPCR_FHLC_leader.fw及びBcPCR_huCkappa.revとを使用して増幅するのに、cDNA 4μlを使用した。全てのフォワードプライマーは、(VH及びVLそれぞれの)シグナルペプチドに特異的であった。一方、リバースプライマーは、(VH及びVLそれぞれの)定常領域に特異的であった。RbVH+RbVLについてのPCR条件を、以下の通りとした。高温での開始、94℃で5分間、94℃で20秒、70℃で20秒、68℃で45秒を35サイクル、及び最後の伸張、68℃で7分間。HuVLについてのPCR条件を、以下の通りとした。高温での開始、94℃で5分間、94℃で20秒、52℃で20秒、68℃で45秒を40サイクル、及び最後の伸張、68℃で7分間。
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現のために、VH又はVLをコードするPCR産物を、cDNAとして、発現ベクター内に、オーバーハングクローニング法(RS Haun et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518;MZ Li et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256)によりクローニングした。この発現ベクターには、イントロンAを含む5’CMVプロモーターと、3’BGHポリアデニル化配列とからなる発現カセットが含まれる。発現カセットに加えて、プラスミドには、E.coli中でのプラスミド増幅のための、pUC由来の複製起点と、アンピシリン抵抗性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子が含まれる。基本的なプラスミドの3つの変異体を使用した。1つのプラスミドは、VH領域を受容するように設計されたウサギIgG定常領域を含有する。2つのプラスミドは、VL領域を受容するウサギ又はヒトのカッパLC定常領域を含有する。
ウサギモノクローナル一価抗体のリコンビナント発現
モノクローナル一価抗体として選択された候補のリコンビナント発現のために、全てのVH鎖のウサギ定常領域を、CH3セグメント中にノブ突然変異を包含するヒト定常領域に変換した。ウサギの野生型B細胞由来のVL鎖について、ウサギCカッパ定常領域を、ヒトに変換した。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域を、AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)により、終容量50μl中において、シグナルペプチドに特異的なフォワードプライマーと、(VH及びVLそれぞれの)ヒト定常領域に相同性を有するオーバーラップ配列(20bp)を(3’端に)有するCDR3−J領域に特異的なリバースプライマーとを使用して増幅するのに、選択された候補のcDNA 4μlを使用した。VH及びVL鎖増幅用のPCR条件を、以下の通りとした。高温での開始、94℃で5分間、94℃で20秒、68℃で20秒、68℃で45秒を35サイクル、及び最後の伸張、68℃で7分間。
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトPDGF−BB(Cell Signaling, Cat. No. 8921BF)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA 9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, Cat. No. 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
カニクイザルPDGF−BB結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトPDGF−BBを、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB,Piercenet, 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
マウスPDGF−BB結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるマウスPDGF−BB(Peprotech 315-18)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
ラットPDGF−BB結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるラットPDGF−BB(R&D, 520-BB)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
ヒトPDGF−AA結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトPDGF−AA(Peprotech, Cat. No. AF-100-13A)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
ヒトPDGF−CC結合ELISA
結合分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。抗原であるヒトPDGF−CC(Peprotech, AF-100-00C)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度125ng/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS、0.5% BSA、0.05% Tween 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)抗PDGF−BB抗体の濃度を1時間増大させる。3)検出抗体、希釈=1:3000(ECL抗ウサギIgG−POD、NA9340V+ECL抗ヒトIgG−POD、NA933V、あるいは、マウス抗体については、ECL抗マウスIgG−POD;NA9310V)。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, 34021)を加えた20〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。EC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
タンパク質−タンパク質相互作用阻害アッセイ法:ヒトPDGF−B:PDGF−BBレセプター
ヒトPDGF−BBのヒトPDGF−BBレセプターに対するタンパク質−タンパク質相互作用阻害分析を、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)系技術を使用して行った。ヒトFcタグ付きPDGF−BBレセプタータンパク質(RnD, Cat.No.385-PR-100)を、384ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Cat. No. 464718)において、濃度750μg/mLでPBS、0.5% BSA及び0.05% Tween 25μL中において固定した。全ての下記工程を、PBS 90μLの注入及び吸引による3回の洗浄ルーチンにより行った。1)ブロッキング工程:結合していない表面を飽和させる(1時間、2% BSA)。2)濃度を増大させる抗PDGF−BB抗体 15μLを、75nM ビオチン化ヒトPDGF−BB(Cell Signaling, 8921BF) 15μLと、容量30μL中で1時間インキュベーションした。3)検出を、ペルオキシダーゼラベルされたストレプトアビジン(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 11089153001)を使用して達成した。基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet, 34021)を加えた10〜30分後に、光学密度を、370nmで決定した。IC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用する、4パラメータロジスティックモデルにより算出した。
マウスハイブリドーマからの抗体精製
抗体含有ハイブリドーマ上清をろ過し、2回のクロマトグラフィー工程により精製した。抗体を、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrapプロテインG(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーにより捕捉する。結合しなかったタンパク質を、平衡化バッファーで洗浄することにより除去する。抗体を、25mM クエン酸バッファー、pH3.0で回収し、溶出直後に、1M Tris−塩基、pH9.0で、pH6.0に中和する。Superdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを、2番目の精製工程として使用する。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行う。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存する。
ヒトPDGF−BB結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ法
結合分析を、BIAcore B4000システム(GE Healthcare)を適用する表面プラズモン共鳴分光系技術を使用して行った。抗原であるヒトPDGF−BB(Cell Signaling, 8921BF)を、C1センサチップ(GE Healthcare, BR-1005-35)において、濃度1μg/mLでPBS、0.1% BSA、0.05% Tween中において、アミンカップリング化学を使用して固定した。濃度を増大させる抗PDGF−BB抗体を、10mM HEPES pH7.2、150mM NaCl中に加えた。180秒の会合期及び600秒の解離期のリードアウト時間を利用して、見掛けのka及び見掛けのkdを算出した。見掛けのKD(結合力)を、BIAcore T200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して算出した。
カニクイザルPDGF−BB結合表面プラズモン共鳴分光アッセイ法
結合分析を、BIAcore B4000システム(GE Healthcare)を適用する表面プラズモン共鳴分光系技術を使用して行った。抗原であるカニクイザルPDGF−BBを、C1センサチップ(GE Healthcare, BR-1005-35)において、濃度1μg/mLでPBS、0.1% BSA及び0.05% Tween中において、アミンカップリング化学を使用して固定した。濃度を増大させる抗PDGF−BB抗体を、10mM HEPES pH7.2、150mM NaCl中に加えた。180秒の会合期及び600秒の解離期のリードアウト時間を利用して、見掛けのka及び見掛けのkdを算出した。見掛けのKD(結合力)を、BIAcore T200 v2.0フィッティングソフトウェアを使用して算出した。
HEK細胞中でのヒト化抗体のトランスフェクション及び一過性発現
トランスフェクション試薬である293-free(Novagen)による懸濁液適合HEK293F(FreeStyle 293-F細胞;Invitrogen)細胞における、抗体の一過性発現
抗体からのFabフラグメントの調製及び分析
5mg 抗体(20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の約1mg/ml)を、L−システイン溶液 90μl(Merck Millipore;20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の250mM)及びパパイン 12μl(Roche Life Science;3.2U/mg 抗体)と共に、37℃で120分間インキュベーションした。開裂後、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなIgG及びFcフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、2回目の精製工程としてのSuperdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行った。Fabフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存した。
3T3細胞増殖ELISA
増殖阻害を決定するために、BrdU発色アッセイ法を、製造メーカーのマニュアルに従って使用した(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, # 11 647 229 001)。このアッセイ法において、5ng/ml ヒトPDGF−BB及び抗体を使用した。
ホスホ−PDGF−Rベータ(Tyr751)サンドイッチELISA
10,000個 3T3細胞/ウェルを、10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地中において、24時間培養した。その後、細胞を、Hunger培地(0.5% ウシ新生仔血清を含むDMEM培地)中において、24時間インキュベーションした。
細胞遊走アッセイ法
CIM−プレート 16(ACEA Biosciences Inc., no05665817001、メンブラン孔径 8μm)を使用。
使用前に、初代ヒト網膜周皮細胞(hTERTにより不死化された(ACBRI 183 CellSystems))を、(成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地(boSF-4ZR-500-S中において)一晩飢餓状態にする(50〜70%コンフルエント)。
上側チャンバ:(50μl 培地+100μl 細胞懸濁液)
細胞を、細胞剥離バッファーで剥離し、この細胞を、成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地(noSF-4ZR-500-S)中に、1.5×105個/mlで再懸濁させる。CIM−プレート16を、RTCA分析器から取り出し、UCに、基礎培地(成長因子を含まないCellSystems CSC血清フリー培地 noSF-4ZR-500-S) 100μl当たりに、15,000個 初代ヒト網膜周皮細胞(hTERTにより不死化された(ACBRI 183 CellSystems))/ウェルを加える。このプレートを、RTCA分析器に戻し、10〜20時間の間、測定を直ちに開始する。
細胞増殖アッセイ法
CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞増殖アッセイ法(Promega, G3580)。
増殖培地=CSC完全培地、培養追加免疫(ACBRI no4Z=-500)
アッセイ培地=成長因子を含まないCSC血清フリー培地(ACBRI noSF-4ZR-500-S)
増殖培地=DMEM(Gibco no41966)、10% NBCS
アッセイ培地=DMEM(Gibco no41966)、0.4 % NBCS
アッセイ前に、細胞を、増殖培地中に、24〜48時間播種する。細胞が80〜90%コンフルエントとなった時点で、細胞を、トリプシン溶液で収集する。細胞を、増殖培地中において、0.25×105個/ml(又は0.5×105個/ml)で再懸濁させる。細胞懸濁液 100μlを、96ウェルプレートの各ウェルに加える。増殖培地を除去し、アッセイ培地 100μlを、各ウェルに加える。24時間インキュベーションする。標準又はサンプル 100μlを、各ウェルに加える(2×濃縮、アッセイバッファー中で希釈)。37℃、5% CO2で、72時間インキュベーションする。染料溶液 40μlを細胞に加え、37℃でインキュベーションする。種々の時点(1時間〜8時間)において、490nmで読み取る。
抗PDGF−BB抗体の動力学スクリーニング
ヒトPDGF−BBに対する抗PDGF−BB抗体の結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約20共鳴単位(RU)のリコンビナントヒトPDGF−BB(5μg/ml;オーダーコード220-BB;R&D Systems)を、シリーズS C1チップ(GE Healthcare BR-1005-35)に、pH4.0において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、HBS−N pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、HBS−P pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05% 界面活性剤P20、pH7.4、GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、ランニングバッファーで2回下塗りした。
抗PDGF−BB Fabの動力学特徴決定
ヒトPDGF−BBに対する抗PDGF−BB Fabサンプルの結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約50共鳴単位(RU)のリコンビナントヒトPDGF−BB(0.5μg/ml;オーダーコード220-BB;R&D Systems)を、シリーズS CM3チップ(GE Healthcare BR-1005-36)に、pH4.0において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、HBS−N pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、HBS−P pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05% 界面活性剤P20、pH7.4、GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、ランニングバッファーで2回下塗りした。
抗体からのFabフラグメントの調製及び分析
12mg 抗体(20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の1mg/ml)を、L−システイン溶液 240μl(Merck Millipore;20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の250mM)及びパパイン 327μl(Roche Life Science;0.001U/mg 抗体)と共に、37℃で120分間インキュベーションした。開裂後、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH7.4で平衡化させた、HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を使用する親和性クロマトグラフィーを、インタクトなIgG及びFcフラグメントを除去するのに使用した。その後、MabSelectSuReクロマトグラフィーのフロースルーを、2回目の精製工程としてのSuperdex 200(商標)(GE Healthcare)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。このサイズ排除クロマトグラフィーを、20mM ヒスチジンバッファー、0.14M NaCl、pH6.0において行った。Fabフラグメント含有溶液を、Biomax-SKメンブラン(Millipore, Billerica, MA)を備えるUltrafree-CL遠心分離フィルタユニットにより濃縮し、−80℃で保存した。
成熟XFabのANG2結合動力学及び交叉反応性
ヒトANG2−RBD−Fc領域融合物に対する成熟XFabの結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約4000RU 抗ヒト抗体(10μg/ml 抗ヒトIgG(Fc)抗体;オーダーコードBR-1008-39;GE Healthcare)を、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)に、pH5.0において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。HBS−N(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、HBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、0.05% 界面活性剤P20;GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで2回下塗りした。
生物学的活性
この方法により、ANG2のそのレセプターであるTie2への結合を阻害する、抗体の能力を決定される。細胞表面上でのTie2レセプターチロシンキナーゼの発現のために、ヒト胚腎細胞株であるHEK293細胞株を、ヒトTie2についての発現ベクターで安定的にトランスフェクションして、細胞株HEK293_Tie2を得た。
二重特異性抗体の生成及び精製
トランスフェクション試薬である293-free(Novagen)による、DNAのトランスフェクション後の懸濁液適合HEK293F(FreeStyle 293-F細胞;Invitrogen)細胞における、二重特異性抗体の一過性発現
二重特異性抗体の動力学特徴決定
PDGF−BB
ヒトPDGF−BBに対する二重特異性抗PDGF−BB/ANG2抗体の結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約50共鳴単位(RU)のリコンビナントヒトPDGF−BB(0.5μg/ml;オーダーコード220-BB;R&D Systems)を、シリーズS CM3チップ(GE Healthcare BR-1005-36)に、pH4.0において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。固定用のランニングバッファーを、HBS−N pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)とした。下記動力学特徴決定について、ランニング及び希釈バッファーを、HBS−P pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05% 界面活性剤P20、pH7.4、GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、ランニングバッファーで2回下塗りした。
ヒトANG2−RBD−マウスFc領域融合物に対する二重特異性抗体の結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。約4000RU 抗マウスFc領域抗体(10μg/ml 抗マウス(Fc)抗体)を、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)に、pH5.0において、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。HBS−N(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、HBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、0.05% 界面活性剤P20;GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで2回下塗りした。
ヒトVEGFアイソフォーム121に対する二重特異性抗体の結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。抗ヘキサヒスチジン抗体を、CM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)に、製造メーカーの説明に従って、GE Healthcareにより提供されているアミンカップリングキットを使用することによりカップリングさせた。HBS−N(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、GE Healthcare)を、固定手順の間のランニングバッファーとして使用した。下記動力学特徴決定について、サンプル及びランニングバッファーを、HBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4、0.05% 界面活性剤P20;GE Healthcare)とした。フローセルを、25℃に設定し、サンプルブロックを、12℃に設定し、動力学特徴決定前に、ランニングバッファーで2回下塗りした。
ヒトIL−1ベータに対する抗IL−1ベータ抗体の結合動力学を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、HBS−P(10mM His、140mM NaCl、0.05% Tween20、pH7.4)を使用して、25℃で行った。抗ヒトFc抗体を、シリーズS CM5センサチップ(GE Healthcare)に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。二重特異性抗体を、捕捉応答100〜200RUをもたらすように、表面に捕捉させた。ヒトIL−1ベータを、0.74〜最大60nM(1:3系列希釈)の濃度で、表面上に90秒間注入した(会合期)。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、600秒間モニターした。表面を、3M MgCl2(抗ヒトFc抗体用)又は10mM グリシン pH1.5(抗マウスFc抗体用)を、流速5μl/分で60秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた(=二重参照)。得られた曲線を、ラングミュア1:1結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
X−線構造決定
Apo FabフラグメントH34
FabフラグメントH34についての結晶化スクリーニングを、濃度32mg/mlで行った。結晶化滴を、タンパク質溶液 0.1μlを貯留液 0.1μlと混合することにより、蒸気拡散シッティングドロップ実験において、21℃でセットアップした。結晶が、沈殿剤としてPEGを含有する種々の条件で現れた。H34の構造を決定するのに使用された結晶は、0.1M HEPES pH7.0、20% PEG4000、及び0.1M カコジル酸ナトリウム、15% PEG4000において、2日以内に現れた。
結晶化スクリーニング前に、FabフラグメントH34を、IL−1ベータ(Peprotech)と、モル比1.2:1で混合した。タンパク質混合物を、21℃で2時間インキュベーションした。結晶化実験に使用されたタンパク質濃度を、32mg/mlとした。結晶化滴を、タンパク質 0.1μlを貯留液 0.1μlと混合することにより、蒸気拡散シッティングドロップ実験において、21℃でセットアップした。結晶は、0.1M Tris pH8.0、20% PEG4000において、2日以内に現れ、4日以内に、最終サイズ0.15mm×0.06mm×0.01mmに成長した。
抗IL−1ベータ抗体の結合動力学及び交叉反応性
ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスIL−1ベータに対する抗IL−1ベータ抗体の結合動力学と、ヒトIL−1ベータ及びヒトIL−1アルファに対する交叉反応性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、HBS−P(10mM His、140mM NaCl、0.05% Tween20、pH7.4)を使用して、25℃で行った。抗ヒト又は抗マウスFc抗体を、シリーズS CM5センサチップ(GE Healthcare)に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。抗IL−1ベータ抗体を、捕捉応答100〜200RUをもたらすように、表面に捕捉させた。IL−1ベータ分子を、0.74〜最大60nM(1:3系列希釈)の濃度で、表面上に90秒間注入した(会合期)。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、600秒間モニターした。ヒトIL−1ベータ及びヒトIL−1αに対する交叉反応性を、上記された条件に従って、100nM 抗原の1回の注入により決定した。表面を、3M MgCl2(抗ヒトFc抗体用)又は10mM グリシン pH1.5(抗マウスFc抗体用)を、流速5μl/分で60秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた(二重参照)。得られた曲線を、ラングミュア1:1結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
抗IL−1ベータ Fabと比較した抗IL−1ベータ IgGの結合動力学
ヒトIL−1ベータに対する抗IL−1ベータ IgG及びFabの結合性を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、HBS−P(10mM His、140mM NaCl、0.05% Tween20、pH7.4)を使用して、25℃で行った。抗ヒトFc又は抗ヒトFab抗体を、シリーズS CM5センサチップ(GE Healthcare)に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。抗IL−1ベータ IgG及びFabを、約100及び50RUの捕捉応答それぞれをもたらすように、表面に捕捉させた。ヒトIL−1ベータを、0.74〜最大60nM(1:3系列希釈)の濃度で、流速30μl/分において表面上に90秒間注入した(会合期)。解離期を、ランニングバッファーで洗浄することにより、600秒間モニターした。表面を、3M MgCl2(抗ヒトFc抗体用)又は10mM グリシン pH1.5(抗マウスFc抗体用)を、流速5μl/分で60秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入を差し引いた(二重参照)。得られた曲線を、ラングミュア1:1結合モデルに、BIAevaluationソフトウェアを使用して当て嵌めた。
抗IL−1ベータ抗体の作用分析方式
ヒトIL−1RIに対する抗体IL−1ベータの結合阻害を、BIACORE T200機器(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験を、ランニング及び希釈バッファーとして、HBS−P(10mM His、140mM NaCl、0.05% Tween20、pH7.4)を使用して、25℃で行った。ヒトIL−1RIを、シリーズS CM5センサチップ(GE Healthcare)に、標準的なアミンカップリング化学を使用して固定した。10nM ヒトIL−1ベータを、100nM〜0.098nMに低下させる濃度(1:2系列希釈)での、抗IL−1ベータ抗体と共に予めインキュベーションした。IL−1ベータ/抗IL−1ベータ抗体混合物を、フローセル上に5μl/分で注入した。60秒後の結合応答(RU)を使用して、阻害をモニターした。表面を、10mM NaOHを流速5μl/分で60秒間注入することにより再生させた。バルク屈折率差を、モック表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。
Claims (14)
- ヒトIL−1ベータと、ヒトANG2、ヒトVEGF、及びヒトPDGF−Bからなる群より選択される第2の抗原とに特異的に結合し、
a)
(a)配列番号:02のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:03のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:07のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む重鎖可変ドメインと、
(a)配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、
二重特異性抗体。 - ヒトPDGF−Bと、ヒトANG2、ヒトVEGF、及びヒトIL−1ベータからなる群より選択される第2の抗原とに特異的に結合し、
a)(a)配列番号:30のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:37のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:39のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:40のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:42のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:46のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:49のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、
二重特異性抗体。 - ヒトANG−2に更に特異的に結合し、更に、
a)(a)配列番号:57のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:58のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:60のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:62のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:63のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:64のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:66のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:76のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:80のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:82のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
d)(a)配列番号:84のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:85のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:87のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:89のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:90のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:91のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項1又は2記載の二重特異性抗体。 - ヒトVEGFに更に特異的に結合し、更に、
a)配列番号:107の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3と、配列番号:108の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3とを含むか、又は
b)配列番号:109の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3と、配列番号:110の重鎖可変ドメインに含有されるHVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3とを含む、請求項1又は2記載の二重特異性抗体。 - ヒトIL−1ベータ及びヒトPDGF−Bに特異的に結合し、
−
a)(a)配列番号:02のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:03のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:07のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む重鎖可変ドメインと、
(a)配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、
あるいは、
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ヒトIL−1ベータに特異的に結合する第1の結合部位と、
−
a)(a)配列番号:30のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:37のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
b)(a)配列番号:39のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:40のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:42のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:46のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、又は
c)(a)配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号:49のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変ドメインと、(a)配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ヒトPDGF−Bに特異的に結合する第2の結合部位とを含む、
二重特異性抗体。 - 抗体が、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の可変ドメインVL及びVHが、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。 - 抗体が、
i) a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されているか、又は
ii) b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位におけるアミノ酸(Kabatに従ってナンバリング)が、リシン(K)、アルギニン(R)、又はヒスチジン(H)により独立して(好ましい一実施態様では、リシン(K)又はアルギニン(R)により独立して)置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位におけるアミノ酸又は213位におけるアミノ酸(Kabat EUインデックスに従ってナンバリング)が、グルタミン酸(E)又はアスパラギン酸(D)により独立して置換されている、請求項6記載の抗体。 - 抗体が、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖及び第1の重鎖と、
b)第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖及び第2の重鎖であって、第2の軽鎖及び第2の重鎖の定常ドメインCL及びCH1が、互いに置き換えられている第2の軽鎖及び第2の重鎖とを含む、二価の二重特異性抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。 - 抗体が、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドを含み、
i)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、又は
v)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
vi)第1のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、又は、
x)第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。 - 抗体が、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドを含み、
抗体が、第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
i)I253A、H310A、及びH435A、又は
ii)H310A、H433A、及びY436A、又は
iii)L251D、L314D、及びL432D、又は
iv) i)〜iii)の組み合わせ
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。 - 請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体と、場合により、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤。
- 医薬として使用するための、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 医薬が、眼血管疾患の処置、好ましくは、黄斑変性の処置のためのものである、請求項12又は13記載の使用。
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US11130804B2 (en) * | 2018-12-21 | 2021-09-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibody that binds to VEGF and IL-1beta and methods of use |
EP4041312A4 (en) | 2019-10-10 | 2023-12-20 | Kodiak Sciences Inc. | METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER |
CN115397850A (zh) * | 2020-03-30 | 2022-11-25 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法 |
WO2022253314A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子以及其用途 |
CN117467025B (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-16 | 上海鼎新基因科技有限公司 | 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013526485A (ja) * | 2010-05-07 | 2013-06-24 | ゾーマ テクノロジー リミテッド | IL−1β関連病態の治療のための方法 |
WO2014009465A1 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases |
WO2014072876A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Pfizer Inc. | Platelet-derived growth factor b specific antibodies and compositions and uses thereof |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4935343A (en) | 1986-08-08 | 1990-06-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Monoclonal antibodies for interleukin-1β |
GB0020685D0 (en) | 2000-08-22 | 2000-10-11 | Novartis Ag | Organic compounds |
US7658924B2 (en) | 2001-10-11 | 2010-02-09 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
WO2003073982A2 (en) | 2002-02-28 | 2003-09-12 | Eli Lilly And Company | Anti-interleukin-1 beta analogs |
DK1517921T3 (da) | 2002-06-28 | 2006-10-09 | Domantis Ltd | Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf |
AU2004207741B2 (en) | 2003-01-24 | 2011-02-10 | Applied Molecular Evolution, Inc | Human IL-1 beta antagonists |
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US20050226863A1 (en) | 2003-11-20 | 2005-10-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-domain antibodies and uses thereof |
US20050282233A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-12-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Multivalent antibody materials and methods for VEGF/PDGF family of growth factors |
AU2005319382B2 (en) | 2004-12-21 | 2011-04-07 | Astrazeneca Ab | Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof |
WO2006138181A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | Amgen Inc. | Self-buffering protein formulations |
US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
JP5575636B2 (ja) | 2007-05-07 | 2014-08-20 | メディミューン,エルエルシー | 抗icos抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用 |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
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US20110189172A1 (en) | 2008-06-06 | 2011-08-04 | Xoma Technology, Ltd. | Methods for the treatment of rheumatoid arthritis |
RU2368359C1 (ru) | 2008-07-22 | 2009-09-27 | Государственное учреждение "УФИМСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ" Академии наук Республики Башкортостан (УфНИИ ГБ АН РБ) | Способ лечения возрастной макулярной дегенерации |
US8268314B2 (en) | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
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CA2775402A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Abbott Laboratories | Il-1 binding proteins |
TWI426920B (zh) * | 2010-03-26 | 2014-02-21 | Hoffmann La Roche | 雙專一性、雙價抗-vegf/抗-ang-2抗體 |
TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
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CN103328511B (zh) | 2010-09-10 | 2016-01-20 | 埃派斯进有限公司 | 抗-IL-1β抗体及其使用方法 |
CA2821976A1 (en) | 2010-12-21 | 2012-09-13 | Abbvie Inc. | Il-1 -alpha and -beta bispecific dual variable domain immunoglobulins and their use |
CA2830254C (en) | 2011-03-16 | 2019-09-10 | Amgen Inc. | Fc variants |
EP2726088B1 (en) | 2011-06-29 | 2019-01-02 | Amgen Inc. | Predictive biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma |
EP2867360B1 (en) * | 2012-06-28 | 2019-05-08 | Molecular Partners AG | Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor |
AU2013322564A1 (en) | 2012-09-28 | 2015-03-12 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Pharmaceutical combinations comprising dual Angiopoietin-2 / Dll4 binders and anti-VEGF agents |
BR112015006363A2 (pt) | 2012-09-28 | 2017-08-08 | Boehringer Ingelheim Int | combinações farmacêuticas compreendendo ligantes angiopoietina-2/dll4 duplos e agentes anti-vegf-r |
KR20210133321A (ko) | 2012-11-08 | 2021-11-05 | 클리어사이드 바이오메디컬, 인코포레이드 | 인간 대상체에서 안구 질병을 치료하기 위한 방법 및 장치 |
JO3405B1 (ar) | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
AU2014227732A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-17 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17 |
KR20210094669A (ko) * | 2013-04-29 | 2021-07-29 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 인간 fcrn-결합 변형된 항체 및 사용 방법 |
EP3082857B1 (en) | 2013-12-20 | 2018-07-25 | F. Hoffmann-La Roche AG | Combination therapy with an anti-ang2 antibody and a cd40 agonist |
JP6786392B2 (ja) | 2014-01-15 | 2020-11-18 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | FcRn結合特性が改変され、プロテインA結合特性が保持されているFc領域変異体 |
UA117289C2 (uk) * | 2014-04-02 | 2018-07-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Мультиспецифічне антитіло |
CA2963606A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Anti-ang2 antibodies and methods of use |
JP2017537896A (ja) | 2014-11-10 | 2017-12-21 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 二重特異性抗体及び眼科に使用する方法 |
RU2017120358A (ru) | 2014-11-10 | 2018-12-13 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Анти-il-1-бета антитела и способы их применения |
WO2016075036A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anti-pdgf-b antibodies and methods of use |
WO2016209972A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Amgen Inc. | Biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma with a vegfr inhibitor and an ang2 inhibitor |
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DENGL et al. | Patent 2963719 Summary |
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