JP6786392B2 - FcRn結合特性が改変され、プロテインA結合特性が保持されているFc領域変異体 - Google Patents
FcRn結合特性が改変され、プロテインA結合特性が保持されているFc領域変異体 Download PDFInfo
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Description
費用効率の高い製造プロセスに対する需要が、1つ以上のアフィニティークロマトグラフィー工程を含む下流側の精製の最適化の必要性につながっていた。処理すべきものの体積がより大きいことと、定置洗浄(CIP)プロトコールについての要件がより厳しいことが、解決を要する特性のうちのいくつかである(Hober, S., J. Chrom. B. 848 (2007) 40-47)。
本明細書においては、ブドウ球菌プロテインAと特異的に結合し、ヒトFcRnと結合しない変異Fc領域が報告される。これらの変異Fc領域は、CH2及びCH3ドメイン中に特定のアミノ酸突然変異を含む。これらの突然変異は、ヘテロ二量体Fc領域のホール鎖又はノブ鎖中で用いると、ヘテロ二量体Fc領域の精製、即ちヘテロ二量体Fc領域のホモ二量体Fc領域からの分離を可能にすることが見出された。
N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド、及び、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチドを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
ポリペプチドである。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド、
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、S228P、L235E及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、S228P、L235E及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、S228P、L235E及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、S228P、L235E及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、S228P、L235E及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、S228P、L235E及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、S228P、L235E及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、S228P、L235E及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド、
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、前記第1及び前記第2のscFvは、第2の抗原と特異的に結合し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド、
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、前記第1及び前記第2のscFvは、第2の抗原と特異的に結合し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A、Y407V、L234A、L235A及びP329Gを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366W、L234A、L235A及びP329Gを含み、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含み(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)、
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の1つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
a)前記(二量体)ポリペプチドをコードする1種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
b)前記(二量体)ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
c)前記(二量体)ポリペプチドをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製して、前記(二量体)ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
I.定義
用語「約」は、その後に続く数値の+/−20%の範囲を意味する。一つの実施態様において、用語約は、その後に続く数値の+/−10%の範囲を意味する。一つの実施態様において、用語約は、その後に続く数値の+/−5%の範囲を意味する。
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(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)及び96〜101(H3)に現れる超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)89〜97(L3)、31〜35B(H1)、50〜65(H2)及び95〜102(H3)に現れるCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)及び93−101(H3)に現れる抗原接点(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));並びに
(d)HVRアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)及び94−102(H3)を含む、(a)、(b)及び/又は(c)の組み合わせ
分率X/Y×100
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBのアライメントにおいて、完全一致(identical match)と採点したアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Aの、Bへのアミノ酸配列同一性%が、Bの、Aへのアミノ酸配列同一性%と等しくないことは、理解されるであろう。別途具体的に明言しない限り、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性%値は全て、直前の段落に記載したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得る。
一つの態様において、本発明は、一部において、免疫グロブリンFc領域の、新生児Fc−レセプター(FcRn)との結合に影響を及ぼす、即ち、Fc領域のFcRnとの結合を減少させ、又は消失させもする、特定の突然変異又は突然変異の組み合わせが、同時にFc領域のブドウ球菌プロテインAとの結合をも消失させるものではないとの発見に基づくものである。このことは、採用しうる精製方法に対し重大な影響を及ぼすものであり、これは例えば、特異的で、種が制限されたアフィニティークロマトグラフィー材料(例えば、カッパ軽鎖を含む抗体のみと結合するKappaSelectのような)を必要としないことによる。よって、本明細書において報告される突然変異の組み合わせにより、ブドウ球菌プロテインAとの結合を維持しつつ、同時にFcRnとの結合を減少させ、又は消失させることさえも可能である。
新生児Fc−レセプター(FcRn)は、インビボにおけるIgGクラスの抗体の代謝運命に関して重要である。FcRnは、野生型IgGをリソゾーム分解経路から救出するように機能し、クリアランスの減少と半減期の延長をもたらす。これは、2種のポリペプチド:50kDaのクラスI主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質(α−FcRn)及び15kDaのβ2−ミクログロブリン(β2m)からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体のFc領域のCH2−CH3部と高い親和性をもって結合する。クラスIgGの抗体とFcRnの間の相互作用はpH依存性であり、1:2の化学量論において生じる、即ち、1個のIgG抗体分子は、その2本の重鎖Fc領域ポリペプチドを介して、2個のFcRn分子と相互作用することができる(例えば、Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照)。
眼血管疾患は、眼組織(網膜又は角膜など)の構造への、新たな血管の変化した又は調節されない増殖及び侵入により特徴付けられる、あらゆる病理学的状態である。
一つの態様において、二量体ポリペプチドであって、
各々、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド及び第2のポリペプチド
を含み、
i)前記第1及び前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、又は
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含む、
ポリペプチドが提供される。
a)前記二量体ポリペプチドをコードする1種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
b)前記二量体ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
c)前記二量体ポリペプチドをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製して、前記二量体ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
各々、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド及び第2のポリペプチド
を含み、
前記第1の、前記第2の又は前記第1及び前記第2のポリペプチドは、突然変異Y436A(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)を含む、
ポリペプチドである。
a)本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸分子を含む1種以上のベクターで、宿主細胞を形質転換する工程、
b)前記宿主細胞を、前記二量体ポリペプチドの製造を可能にする条件下で培養する工程、及び
c)前記二量体ポリペプチドを培養物から回収して、前記二量体ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
更なる一つの態様において、前記実施態様のいずれかによる二量体ポリペプチドは、下記セクション1−6に記載されているようにして、単独又は組み合わせで、あらゆる特徴を組み入れ得る:
一つの実施態様においては、BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、Kdを測定する。例えば、BIACORE(登録商標)-2000又はBIACORE(登録商標)-3000(GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を用い、約10応答単位(RU)で結合パートナーが固定されたCM5チップにより25℃でアッセイを行う。一つの実施態様においては、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare Inc.)を、供給者の指示に従い、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。結合パートナーを10mM酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(約0.2μM)に希釈してから、5μl/分の流速で注入して、およそ10応答単位(RU)の結合パートナーのカップリングを達成する。結合パートナーの注入に続いて、未反応基を保護するために1Mエタノールアミンを注入する。速度論的測定のために、二量体ポリペプチド含有融合ポリペプチド又は抗体の2倍段階希釈液(0.78nM〜500nM)を、0.05%ポリソルベート20(TWEEN-20(商標))界面活性剤を含むPBS(PBST)中、25℃、およそ25μl/分の流速で注入する。単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウェア・バージョン3.2)を用い、会合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度(kon)及び解離速度(koff)を計算する。平衡解離定数(Kd)を、比koff/konとして計算する(例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照)。上記の表面プラズモン共鳴アッセイで、オン速度が106M−1s−1を上回る場合は、抗原の濃度を増加させつつ、ストップフロー付き分光測光器(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AMINCO(商標)分光測光器(ThermoSpectronic)のような分光計で測定される、PBS(pH7.2)中、20nMの抗抗原抗体(Fab型)の、25℃における蛍光発光強度(励起=295nm;蛍光=340nm、帯域幅16nm)の増減を測定する蛍光消光技術を使って、オン速度を決定することができる。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、キメラ抗体である。あるキメラ抗体が、例えば、米国特許第4816567号及びMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)に記載されている。一例では、キメラ抗体が、非ヒト可変領域(例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルのような非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体が、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて製造できる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に全般的に記載されている。
特定の実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ライブラリー由来抗体である。ライブラリー由来抗体は、コンビナトリアルライブラリーを所望の活性を有する抗体についてスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を有する抗体についてスクリーニングするための多種多様な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、また、例えばMcCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に更に記載されている。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一方が第1の抗原に対するものであり、他方が別の第2の抗原に対するものである。ある実施態様では、二重特異性抗体が、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はまた、前記抗原の少なくとも1つを発現する細胞に細胞毒性物質を局在化するためにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
ある実施態様では、本明細書において報告される 二量体ポリペプチド は、抗体である。更なる実施態様では、本明細書において 提供する抗体のアミノ酸配列改変体が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸 配列 変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入するか、又はペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び/又は挿入、及び/又は置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴(例えば、抗原結合)を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換のいかなる組み合わせをも行うことができる。
ある実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換突然変異誘発のための関心ある部位には、HVR及びFRが含まれる。下記表では、保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化は、下記表の「例示的な置換」という見出しの下に示し、これはアミノ酸側鎖クラスに関連して以下に更に記載する通りである。アミノ酸置換を関心ある抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、低減した免疫原性、又は改善されたADCC若しくはCDCについて、スクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある実施態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために、本明細書に規定する抗体を変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドに1つ以上の更なるアミノ酸改変を導入することにより、Fc領域変異体を生成させてもよい。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば置換/突然変異)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4Fc領域)を含みうる。
ある実施態様では、例えば、「チオMAb(thioMAb)」と同様に、抗体の1つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作(cysteine engineered)二量体ポリペプチドを作出することが望ましい可能性がある。特定の実施態様では、置換残基が二量体ポリペプチドの接近可能部位に見いだされる。それらの残基をシステインで置換することにより、二量体ポリペプチドの接近可能部位に反応性のチオール基が置かれることになり、本明細書において更に説明するように、それを使って、二量体ポリペプチドを他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作出することができる。ある実施態様では、以下の残基のいずれか1つ以上をシステインで置換してよい:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作二量体ポリペプチドは、例えば、米国特許第7521541号に記載されているようにして生成させてよい。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを、当技術分野において公知であり、容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、更に改変してよい。二量体ポリペプチドの誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、それらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれも)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール(propropylene glycol)ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド(prolypropylene oxide)/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。二量体ポリペプチドに取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、例えば、改善しようとする二量体ポリペプチドの特定の特性又は機能、二量体ポリペプチド誘導体が所定の条件下で治療に使用されるか否かを初めとする考慮事項(これらに限定されない)に基づいて決定することができる。
ヘテロ二量体化を強めるためのCH3改変には、いくつかのアプローチが存在し、それらは例えば、国際公開公報第96/27011号、国際公開公報第98/050431号、欧州特許第1870459号、国際公開公報第2007/110205号、国際公開公報第2007/147901号、国際公開公報第2009/089004号、国際公開公報第2010/129304号、国際公開公報第2011/90754号、国際公開公報第2011/143545号、国際公開公報第2012058768号、国際公開公報第2013157954号、国際公開公報第2013096291号に十分に記載されている。典型的には、そのようなアプローチ全てにおいて、第1のCH3ドメイン及び第2のCH3ドメインの両者を相補的な様式で操作し、各CH3ドメイン(又はそれを含む重鎖)が、それ自身とのホモ二量体化はもはやできず、相補的に操作された他のCH3ドメインとヘテロ二量体化することを余儀なくされるようにする(そうすることにより、前記第1及び第2のCH3ドメインはヘテロ二量体化し、2本の前記第1の、又は2本の第2のCH3ドメインの間でのホモ二量体は、形成されない)。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれら種々のアプローチは、誤対合してベンスージョーンズ型副生物となる軽鎖を減少させる、本発明による多重特異性抗体における重鎖−軽鎖改変(一方の結合腕におけるVH及びVL交換/置換及びCH1/CL界面における、電荷が逆の荷電アミノ酸による置換の導入)と組み合わされる、種々の選択肢として意図される。
前記抗体の前記第1の重鎖の前記第1のCH3ドメイン(a)とする)(under a))及び前記抗体の前記第2の重鎖の前記第2のCH3ドメイン(b)とする)(under b))が各々、前記抗体CH3ドメインの間の元の界面を含む界面において接触し(meet)、
前記界面が、多重特異性抗体の形成を促進するように変化しており、前記変化が、
i)一方の重鎖のCH3ドメインが変化しており、
そのことにより、前記多重特異性抗体における、他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と接触する、一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、このことにより、前記一方の重鎖のCH3ドメインの界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞内に配置され得る突起が生成し、かつ
ii)他方の重鎖のCH3ドメインが変化しており、
そのことにより、前記多重特異性抗体における、前記第1のCH3ドメインの元の界面と接触する、前記第2のCH3ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、このことにより、前記第2のCH3ドメインの界面内に空洞が生成し、その中に、前記第1のCH3ドメインの界面内の突起が配置され得る
ことを特徴とする。
抗体は、例えば米国特許第4816567号に記載されているようなリコンビナント方法及びリコンビナント組成物を使って製造することができる。一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、前記二量体ポリペプチドの前記第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び/又は前記第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするものでありうる。更なる一つの実施態様において、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。更なる一つの実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような実施態様の一つでは、宿主細胞が、下記(1)又は(2)を含む(例えば、それにより形質転換されている):(1)二量体ポリペプチドの前記第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び二量体ポリペプチドの前記第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、(2)二量体ポリペプチドの前記第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び二量体ポリペプチドの前記第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一つの実施態様において、宿主細胞は真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ球系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを製造するする方法であって、先に規定した二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、二量体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び場合により、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収する工程を含む方法が提供される。
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は本明細書において報告される医薬処方物を、本明細書に記載の1つ以上の眼血管疾患の処置のために、単独で(追加の治療的薬剤を伴わない)投与する。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドの医薬処方物は、所望の純度を有するそのような二量体ポリペプチドを、1つ以上の場合による薬学的に許容し得る担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed.) (1980))と混合することにより、凍結乾燥処方物又は水溶液の形態に調製される。薬学的に許容し得る担体は一般に、使用される投薬量及び濃度において、受容者にとって無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;単糖、二糖その他の糖質、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン;キレート化剤、例えばEDTA;糖類、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えばZn−タンパク質複合体);及び/又は非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における、例示的な薬学的に許容し得る担体には更に、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような、間質薬物分散剤、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)のような、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を初めとするある例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公報第2005/0260186号並びに同第2006/0104968号に記載されている。一つの態様において、sHASEGPが、1つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、いずれも治療方法に使用することができる。
本発明の他の一つの態様において、前記障害の処置、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなど、種々の材料で形成されうる。容器は、単独で、又は別の組成物との組み合わせで、前記状態を処置、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性物質は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドである。前記ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。更に、前記製造品は、(a)本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む組成物が入っている第1の容器、及び(b)更なる細胞毒性物質又は他の治療剤を含む組成物が入っている第2の容器を含んでいてよい。本発明のこの実施態様の製造品は、特定の状態を処置するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を更に含みうる。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液のような、薬学的に許容し得る緩衝液を含む第2(又は第3)の容器を更に含みうる。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを、更に含みうる。
1.二量体ポリペプチドであって、
第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含み、前記第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは各々、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含み、前記第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは各々、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
前記第1の、前記第2の又は前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異Y436A(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)を含む、
二量体ポリペプチド。
前記第1のポリペプチドが、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを更に含み、前記第2のポリペプチドが、突然変異Y349C及びT366Wを含み、かつ/又は
b)i)前記第1及び第2のポリペプチドが、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドが、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドが、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドが、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドが、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドが、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドが、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドが、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドが、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
項23〜27のいずれか1項記載の二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異S228P、L235E及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異S228P、L235E及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド、
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、前記第1及び前記第2のscFvは、第2の抗原と特異的に結合し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチド性リンカー及び第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド、
を含み、
前記第1の重鎖可変ドメインと前記第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインと前記第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、前記第1及び前記第2のscFvは、第2の抗原と特異的に結合し、
i)前記第1のポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)前記第1のポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
ii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、
iii)前記第1及び第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含むか、
iv)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含むか、
v)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251D、L314D及びL432Dを含むか、又は
vi)前記第1のポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、前記第2のポリペプチドは、突然変異L251S、L314S及びL432Sを含む、
二量体ポリペプチド。
a)項1〜51のいずれか1項記載の二量体ポリペプチドをコードする1種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
b)前記二量体ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
c)前記二量体ポリペプチドをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程
を含む方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的記載に基づいて、その他様々な実施態様を実施し得ることが理解されよう。
エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI−MS)
N−グリカナーゼplus(Roche)0.5μL及びリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.1)を添加し、最終試料体積115μLを得ることによってタンパク質アリコート(50μg)を脱グリコシル化した。この混合物を37℃で18時間インキュベートした。その後、還元及び変性のために、4M 塩酸グアニジン(Pierce)に溶かした0.5M TCEP(Pierce)60μL及び8M 塩酸グアニジン50μLを添加した。この混合物を37℃で30分間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィー(セファロースG−25、アイソクラティック、2%ギ酸を含む40%アセトニトリル)によって試料を脱塩した。ナノESI供給源(TriVersa NanoMate、Advion)を装備されたQ−TOF機器(maXis、Bruker)を用いて、ESI質量スペクトル(+ve)を記録した。MSパラメーター設定は次のとおりであった:移動:ファンネルRF、400Vpp;ISCIDエネルギー、0eV;多重極RF、400Vpp;四重極:イオンエネルギー、4.0eV;低質量、600m/z;供給源:乾燥ガス、8L/分;乾燥ガスの温度、160℃;コリジョンセル:衝突エネルギー、10eV;衝突RF:2000Vpp;イオンクーラー:イオンクーラーRF、300Vpp;移動時間:120μ秒;プレパルス蓄積、10μ秒;スキャン範囲m/z600〜2000。データを評価するために、施設内で開発したソフトウェア(MassAnalyzer)を使用した。
FcRnに対する野生型抗体及び変異体の結合特性を、BIAcore T100機器(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって解析した。この方式は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。これにより、リガンド/分析物結合を連続的にリアルタイムでモニタリングし、従って、様々なアッセイ法設定において動態パラメーターを測定することが可能になる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと溶液中に注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が示唆される。分子が、表面の固定化されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、解離する場合は質量が減少する。本アッセイ法においては、400応答単位(RU)のレベルまで、アミンカップリングによってFcRnレセプターをBIAcore CM5バイオセンサーチップ(GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)上に固定化した。アッセイ法は、PBS、0.05%Tween20 pH6.0(GE Healthcare Bioscience)をランニング(running)バッファー及び希釈用緩衝液として用いて室温で実施した。200nMの試料を室温、流速50μL/分で注入した。結合時間は180秒であった。解離相は360秒に及んだ。HBS−P、pH8.0を短時間注入することにより、チップ表面の再生を達成した。注入後180秒及び注入後300秒における生物学的応答シグナルの高さを比較することによって、SPRデータの評価を行った。対応するパラメーターは、RU最大レベル(注入後180秒)及び後期の安定性(注入終了後300秒)である。
本アッセイは、表面プラズモン共鳴分光法に基づくものである。SPRバイオセンサーの表面に、プロテインAを固定する。SPR分光計のフローセルに試料を注入することにより、それが固定されたプロテインAと複合体を形成し、このことが、センサーチップ表面上における増加する質量をもたらし、従ってより高い応答に至る(1RUは1pg/mm2と定義されているので)。その後、試料-プロテインA複合体を解離することにより、センサーチップを再生させる。次いで、得られた応答を、応答単位(RU)の高い信号及び解離挙動に関して評価する。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報が、以下において与えられる:Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸残基は、EUナンバリングに従ってナンバリングし、参照する(Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))。
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)に記載のようにして、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、Geneart(Regensburg, Germany)での所与の仕様に従って注文した。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)又はSequiserve GmbH(Vaterstetten, Germany)で実施した二本鎖配列決定により決定した。
GCGの(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomaxのVector NT1 Advance suite version 8.0を、配列の作成、マッピング、分析、注釈及び図示のために使用した。
記載する抗体の発現のために、CMV−イントロンAプロモーターを伴う、若しくは伴わないcDNA組織化、又はCMVプロモーターを伴うゲノム組織化のいずれかに基づく、一過性発現(例えば、HEK293−Fにおける)のための発現プラスミドを用いた。
− E. coliにおけるこのプラスミドの複製を可能にする複製の起点、
− E. coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、及び
− 真核細胞における選択可能なマーカーとしての、ハツカネズミからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子。
−5’末端の固有の制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−cDNA組織化の場合、イントロンA配列が続く、
−ヒト抗体遺伝子の5’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードする核酸、
−免疫グロブリンエクソン−イントロン組織化を伴う、cDNAとしての、又はゲノム組織化におけるヒト抗体鎖(野生型、又はドメイン交換を伴うもの)をコードする核酸、
−ポリアデニル化シグナル配列を伴う3’非翻訳領域、及び
−3’末端の固有の制限部位。
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載される通りに使用した。
発現及び精製
HEK293−Fシステムにおける一過性トランスフェクション
単一特異性及び二重特異性抗体を、製造者の指示に従ってHEK293−Fシステム(Invitrogen)を用いて、それぞれのベクター(例えば、重鎖及び改変重鎖、並びに対応する軽鎖及び改変軽鎖をコードする)での一過性トランスフェクションにより生成した。簡単には、振盪フラスコ中又は撹拌発酵槽中のいずれかで、無血清FreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)中、懸濁液中で成長するHEK293−F細胞(Invitrogen)を、それぞれの発現ベクターと、293フェクチン(商標)又はフェクチン(Invitrogen)の混合物を用いてトランスフェクトした。2L振盪フラスコ(Corning)では、HEK293−F細胞を、600mL中、1×106個細胞/mLの密度で播種し、120rpm、8%CO2でインキュベートした。翌日、細胞を、A)重鎖又は改変重鎖のそれぞれ及び等モル比の対応する軽鎖をコードする600μgの全ベクターDNA(1μg/mL)を含むOpti-MEM(Invitrogen) 20mLと、B)293フェクチン又はフェクチン(2μl/mL) 1.2mLを含むOpti-MEM 20mLの混合物約42mLを用いて、約1.5×106個細胞/mLの細胞密度でトランスフェクトした。グルコース消費に従い、発酵の過程の間にグルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含む上清を、5−10日後に採取し、抗体を上清から直接精製するか、又は上清を凍結及び保存した。
二重特異性抗体を、細胞培養上清から、MabSelectSure-セファロース(商標)(非IHH−AAA突然変異体用)(GE Healthcare, Sweden)又はkappaSelect-アガロース(IHH−AAA突然変異体用)(GE Healthcare, Sweden)を用いるアフィニティークロマトグラフィー、ブチルセファロース(GE Healthcare, Sweden)を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー及びスーパーデックス200サイズ排除(GE Healthcare, Sweden)クロマトグラフィーにより精製した。
分析&発展性
小規模DLSベース粘度測定
粘度測定は本質的に、(He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143)に記載されるようにして実施した。簡単には、試料を、200mMコハク酸アルギニン、pH5.5中の種々のタンパク質濃度に濃縮し、その後、ポリスチレンラテックスビーズ(直径300nm)及びポリソルベート20(0.02%v/v)を添加する。試料を、0.4μmフィルタープレートを通した遠心分離により、光学的384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。ラテックスビーズの見かけ上の直径を、25℃での動的光散乱により決定する。溶液の粘度を、η=η0(rh/rh、0)(η:粘度;η0:水の粘度;rh:ラテックスビーズの見かけの流体力学的半径;rh、0:水中でのラテックスビーズの流体力学半径)として算出することができる。
(S:タンパク質の流体力学的相互作用パラメータ;K:自己込み合い因子;Φ:溶解したタンパク質の体積分率)
試料は、20mM ヒスチジン/塩酸ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、濃度1mg/mLで調製し、0.4μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。試料を、0.05℃/分の速度で、25℃から80℃まで加熱しつつ、流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定する。凝集開始温度を、流体力学的半径が増加し始める温度と定義する。結果を図3に示す。Fc部分にIHH−AAA突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016に対する、IHH−AAA突然変異のないVEGF/ANG2-0015の凝集を、図3に示す。VEGF/ANG2-0016は、61℃の凝集開始温度を示したのに対し、IHH−AAA突然変異のないVEGF/ANG2-0015は、60℃の開始温度を示した。
試料は、20mM ヒスチジン/塩酸ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、濃度1mg/mLで調製し、0.4μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。試料を145時間まで50℃の一定温度に保持しつつ、流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定する。この実験において、高温度でのネイティブな、アンフォールドタンパク質の凝集傾向は、経時的に、平均粒径の増加をもたらしうる。このDLSベースの方法は、凝集物について非常に鋭敏である。なぜなら、凝集物が過剰比例的に散乱光強度に寄与するためである。50℃(凝集開始温度に近い温度、前記を参照)では、145時間後でさえ、VEGF/ANG2-0015及びVEGF/ANG2-0016の両方について、見出された平均粒径の増加はわずかに0.5nm未満であった。
試料を、200mM コハク酸アルギニン、pH5.5中、100mg/mLの最終濃度まで濃縮し、滅菌濾過し、静止状態で7日間にわたり40℃で保存する。保存の前と後に、高分子量及び低分子量種(それぞれHMW及びLMW)の含量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定する。保存した試料と調製直後に測定した試料の間の、HMW及びLMW含量における差を、それぞれ「HMW増加」及び「LMW増加」として報告する。結果を下記表及び図4に示すが、それらは、VEGF/ANG2-0015(IHH−AAA突然変異なし)が、VEGF/ANG2-0016(IHH−AAA突然変異を伴う)に比して、主ピークのより高い低下及びより高いHMW増加を示すことを示している。驚くべきことに、VEGF/ANG2-0016(IHH−AAA突然変異を伴う)は、VEGF/ANG2-0015(IHH−AAA突然変異なし)に比して低い凝集傾向を示した。
VEGF、ANG2、FcガンマR及びFcRnとの結合
種交差反応性の評価を含む、VEGFアイソフォームの動力学的親和性
約12000共鳴単位(RU)の捕捉システム(10μg/mlヤギ抗ヒトF(ab)’2;オーダーコード:28958325;GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いて、pH5.0で、CM5チップ(GE Healthcare BR−1005−30)上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、PBS−T(0.05%Tween20を含む10mM リン酸緩衝生理食塩水)pH7.4であった。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニングバッファー2回で準備した。二重特異性抗体を、5μL/分の流量で、30秒間にわたり50nM 溶液を注入することにより捕捉した。溶液中の種々の濃度(300nMで開始し、1:3希釈)のヒトhVEGF121、マウスmVEGF120又はラットrVEGF164を、30μL/分の流量で、300秒間にわたり注入することにより、会合を測定した。解離相を1200秒間までモニターし、試料溶液からランニングバッファーへの切り替えにより誘発した。流速30μL/分でのグリシンpH2.1溶液による60秒間の洗浄により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ヤギ抗ヒトF(ab’)2表面から得られた応答を減算することにより補正した。ブランク注入も減算する(=二重参照)。見かけのKDその他の動力学的パラメータの算出のために、ラングミュア1:1モデルを使用した。結果を以下に示す。
溶液親和性は、平衡混合物中の遊離の相互作用パートナーの濃度を決定することにより、相互作用の親和性を測定する。溶液親和性アッセイは、抗VEGF/ANG2抗体(一定濃度に保つ)の、種々の濃度のリガンド(=ANG2)との混合を含む。最大の可能な共鳴単位(例えば、17000共鳴単位(RU))の抗体を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用い、pH5.0で、CM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)表面に固定化した。試料及びシステム緩衝液は、HBS−P pH7.4であった。フローセルを25℃に、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニングバッファー2回で準備した。検量線を作成するために、ANG2を、濃度を増加させて、固定化抗VEGF/ANG2抗体を含むBIAcoreフローセルに注入した。結合したANG2の量を共鳴単位(RU)で決定し、濃度に対してプロットした。各リガンド溶液(抗VEGF/ANG2抗体について、0〜200nMまでの11濃度)を、10nM ANG2と共にインキュベートし、室温で平衡に到達させた。既知量のANG2を含む溶液の応答を測定する前後に生成した遊離のANG2濃度を、検量線から決定した。4パラメータ適合を、遊離ANG2濃度をy軸、阻害のために使用した抗体の濃度をx軸として用いるモデル201を用い、XLfit4(IDBS Software)を用いて設定した。親和性は、この曲線の変曲点を決定することにより算出した。0.85%H3PO4溶液による、流速30μL/分で30秒間の洗浄1回により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランクカップリング表面から得られた応答を、減算することにより補正した。結果を以下に示す。
FcRn測定のために、定常状態の親和性を用いて、二重特異性抗体を互いに比較した。ヒトFcRnをカップリング緩衝液(10μg/ml、酢酸Na、pH5.0)中に希釈し、BIAcore wizardを用いる標的固定化手順により、最終応答200RUとなるよう、C1-Chip(GE Healthcare BR-1005-35)上に固定化した。フローセルを25℃に、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニングバッファー2回で準備した。試料及びシステム緩衝液は、PBS−T(0.05%Tween20を含む10mM リン酸緩衝生理食塩水)pH6.0であった。各抗体について異なるIgG濃度を評価するために、濃度62.5nM、125nM、250nM及び500nMを調製した。流速を30μL/分に設定し、種々の試料をチップ表面に連続的に注入し、180秒の会合時間を選んだ。流速30μL/分で60秒間にわたり注入したPBS−T pH8により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランク表面から得られた応答を、減算することにより補正した。緩衝液注入も減算する(=二重参照)。定常状態の親和性を算出するために、BIA-Evaluation softwareからの方法を使用した。簡単には、RU値を分析された濃度に対してプロットし、用量反応曲線を生成した。2パラメトリック適合に基づき、上部漸近線を算出し、最大半量RU値、そして親和性の決定を可能にする。結果を図5及び下記表に示す。同様に、カニクイザル、マウス及びウサギFcRnとの親和性を決定することができる。
FcガンマRIIIa測定のために、直接結合アッセイを使用した。約3000共鳴単位(RU)の捕捉システム(1μg/ml Penta-His;Quiagen)を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、pH5.0で、CM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、HBS−P+ pH7.4であった。フローセルを25℃に、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニングバッファー2回で準備した。FcガンマRIIIa−His−レセプターを、流量5μL/分で60秒間にわたり、100nM溶液を注入することにより捕捉した。100nMの、二重特異性抗体又は単一特異性対照抗体(IgG1サブクラス及びIgG4サブクラス抗体に対し、抗ジゴキシゲニン抗体)の流量30μL/分での180秒にわたる注入により、結合を測定した。流速30μL/分でのグリシンpH2.5溶液による120秒間の洗浄により、表面を再生した。FcガンマRIIIa結合は、ラングミュア1:1モデルと異なるため、結合/無結合だけを、このアッセイを用いて決定した。同様の様式において、FcガンマRIa及びFcガンマRIIa結合を決定することができる。結果を図6に示し、そこでは、変異P329G LALAの導入により、FcガンマRIIIaへの結合がそれ以上検出できなかった、という結果になっている。
約3500共鳴単位(RU)の捕捉システム(10μg/mLヤギ抗ヒトIgG;GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、pH5.0で、CM4チップ(GE Healthcare BR-1005-34)上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、PBS−T(0.05%Tween20を含む10mM リン酸緩衝生理食塩水)pH7.4であった。フローセルの温度を25℃に、サンプルブロックの温度を12℃に設定した。捕捉前に、フローセルを、ランニングバッファー2回で準備した。
1.180秒間にわたる濃度200nMのヒトVEGFの注入(抗原の単独結合を同定する)。
2.180秒間にわたる濃度100nMのヒトANG2の注入(抗原の単独結合を同定する)。
3.180秒間にわたる濃度200nMのヒトVEGFの注入と、それに続く180秒間にわたる濃度100nMのヒトANG2の追加注入(VEGFの存在下でのANG2の結合を同定する)。
4.180秒間にわたる濃度100nMのヒトANG2の注入と、それに続く濃度200nMのヒトVEGFの追加注入(ANG2の存在におけるVEGFの結合を同定する)。
5.180秒間にわたる、濃度200nMのヒトVEGF及び濃度100nMのヒトANG2の同時注入(VEGF及びANG2の結合を同時に同定する)。
第1に、約1600共鳴単位(RU)のVEGF(20μg/ml)を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、pH5.0で、CM4チップ(GE Healthcare BR-1005-34)上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、PBS−T(0.05%Tween20を含む10mM リン酸緩衝生理食塩水)pH7.4であった。フローセルを25℃に、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニングバッファー2回で準備した。第2に、二重特異性抗体の50nM溶液を、流量30μL/分で180秒間にわたり注入した。第3に、hANG2を、流量30μL/分で180秒間にわたり注入した。hANG2の結合応答は、VEGFと結合した二重特異性抗体の量に依存し、同時結合を示す。流速30μL/分での0.85%H3PO4溶液による60秒間の洗浄により、表面を再生した。先にVEGFと結合した抗VEGF/ANG2抗体への、hANG2の追加の特異的な結合のシグナルにより、同時結合が示される。二重特異性抗体VEGF/ANG2-0015及びVEGF/ANG2-0016の両者について、抗VEGF/ANG2抗体へのVEGF及びANG2の同時結合を検出することができた(データは示されていない)。
質量分析法
このセクションでは、正確な組み立てに重点を置き、抗VEGF/ANG2抗体の特徴付けを記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化された、インタクトな又はIdeS消化された(S. pyogenesのIgG分解酵素)抗VEGF/ANG2抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)により確認した。IdeS消化は、精製抗体 100μgを用い、これをIdeSプロテアーゼ(Fabricator) 2μg(100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、pH7.1中)と共に、37℃で5時間インキュベートして行った。その後、抗体を、1mg/mLのタンパク質濃度で、N−グリコシダーゼF、ノイラミニダーゼ及びO−グリコシダーゼ(Roche)(100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、pH7.1中)を用い、37℃で16時間まで脱グリコシル化し、その後、セファデックス G25カラム(GE Healthcare)上でのHPLCにより脱塩した。全質量を、TriVersa NanoMateソース(Advion)を備えたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム(Bruker Daltonik)上で、ESI−MSにより決定した。
Fc−Rnクロマトグラフィー
ストレプトアビジンセファロースとのカップリング:
ビオチン化し、透析したレセプターに、ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare) 1gを添加し、振盪しつつ2時間インキュベートした。レセプター誘導化セファロースを、1mL XKカラム(GE Healthcare)に充填した。
条件:
カラム寸法:50mm×5mm
ベッド高さ:5cm
負荷:試料50μg
平衡緩衝液:150mM NaClを含む20mM MES、pH5.5に調整
溶出緩衝液:150mM NaClを含む20mM トリス/HCl、pH8.8に調整
溶出:7.5CV平衡緩衝液、100%溶出緩衝液へ(30CV)、10CV溶出緩衝液
ヒトFcRnを含むアフィニティーカラム上での抗VEGF/ANG2抗体の保持時間を下記表に示す。データは前記条件下で得た。
IHH−AAA突然変異を伴う抗体の薬物動力学的(PK)特性
ヒトFcRnについてトランスジェニックなFc−Rnマウスを用いたPKデータ
生存中相:
研究対象には、マウスFcRn欠損であるが、ヒトFcRn(huFcRn、系統276−/tg)についてはヘミ接合性トランスジェニックである、雌性C57BL/6Jマウス(バックグラウンド)を含めた。
全てのマウスに対し、2μL/動物の適切な溶液(即ち、21μg化合物/動物(VEGF/ANG2-0015(IHH−AAA突然変異なし))、又は23.6μg化合物/動物(VEGF/ANG2-0016(IHH−AAA突然変異を伴う))を用いて、右眼中に1回、硝子体内注射を行った。
全てのマウスに対し、200μL/動物の適切な溶液(即ち、21μg化合物/動物(VEGF/ANG2-0015(IHH−AAA突然変異なし))、又は23.6μg化合物/動物(VEGF/ANG2-0016(IHH−AAA突然変異を伴う))を用いて、尾静脈を介して1回、静脈内注射を行った。
実験動物からの眼球全体の物理化学的分解により、眼球溶解物を得た。機械的破壊のために、各々の眼球を、底が円錐形の1.5mLマイクロバイアルに移した。凍結及び解凍後、細胞洗浄緩衝液(Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011) 1mLを用いて、眼球を1回洗浄した。次工程において、新たに調製した細胞溶解緩衝液 500μLを添加し、1.5mL組織破砕用乳棒(Kimble Chase, 1.5 mL pestle, Art. No. 749521-1500)を用いて眼球を破砕した。次いで、混合物を5回凍結及び解凍し、再度粉砕した。残存組織から溶解物を分離するため、試料を、4500×gで4分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ELISAにおける更なる分析まで、−20℃で保存した。
マウス血清及び眼球溶解物中の抗VEGF/ANG2抗体の濃度を、固相酵素免疫検定法(ELISA)を用いて決定した。
薬物動力学的評価プログラムWinNonlin(商標)(Pharsight)、バージョン5.2.1を用いて、非コンパートメント分析により薬物動態学的パラメータを算出した。
A)血清中濃度
血清中濃度についての結果を、下記表及び図7B〜7Cに示す。
B)左眼及び右眼の眼球溶解物中の濃度
眼球溶解物中の濃度についての結果を、下記表及び図7D〜7Eに示す。
硝子体内適用後、本明細書において報告される二重特異性抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016(IHH−AAA突然変異を伴う)は、IHH−AAA突然変異のない二重特異性抗VEGF/ANG2抗体であるVEGF/ANG2-0015に比して、同様の眼球溶解物中の濃度(96及び168時間後)を示す。
マウス角膜マイクロポケット血管形成アッセイ
各々、配列番号20及び21のVEGF結合性VH及びVL、並びに配列番号28及び29のANG2結合性VH及びVLを有する、二重特異性抗VEGF/ANG2抗体の、インビボVEGF誘導血管形成に対する抗血管形成効果を試験するために、マウス角膜血管形成アッセイを実施した。このアッセイにおいては、VEGFを浸したNylafloディスクを、角膜縁血管までの距離を一定にして、無血管角膜のポケット内に埋め込んだ。血管は直ちに、角膜内の方に、発生中のVEGF勾配に向かって成長する。8〜10週齢の雌性Balb/cマウスを、Charles River(Sulzfeld, Germany)から購入した。プロトコールは、Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550により記載された方法に従って改変する。簡単には、幅約500μmのマイクロポケットを、麻酔したマウスにおいて、外科用ブレード及び鋭利なピンセットを用い、角膜縁から約1mmの位置に、角膜の上部に向かって、顕微鏡下で調製する。直径0.6mmのディスク(Nylaflo(登録商標), Pall Corporation, Michigan)を埋め込み、埋め込んだ領域の表面を平滑化した。ディスクを、対応する成長因子又は賦形剤中で、少なくとも30分間インキュベートする。3、5及び7日後(又は、これに替えて、3、5又は7日後だけ)、眼の写真を撮影し、血管応答を測定する。角膜の全面積当たりの、新たな血管の面積のパーセンテージを算出することにより、アッセイを数値化する。
HHY−AAA突然変異を伴う抗体の薬物動力学的(PK)特性
ヒトFcRnについてトランスジェニックなFc−Rnマウスを用いたPKデータ
生存中相:
研究対象には、マウスFcRn欠損であるが、ヒトFcRn(huFcRn、系統276−/tg)についてはヘミ接合性トランスジェニックである、雌性C57BL/6Jマウス(バックグラウンド)を含めた。
全てのマウスに対し、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液(即ち、22.2μg化合物/動物のIGF-1R 0033、24.4μg化合物/動物のIGF-1R 0035、32.0μg化合物/動物のIGF-1R及び32.0μg化合物/動物のIGF-1R 0045)を用いて、右眼中に1回、硝子体内注射を行った。
全てのマウスに対し、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液(即ち、22.2μg化合物/動物のIGF-1R 0033、24.4μg化合物/動物のIGF-1R 0035、32.0μg化合物/動物のIGF-1R及び32.0μg化合物/動物のIGF-1R 0045)を用いて、尾静脈を介して1回、静脈内注射を行った。
factor 1 100μL、factor 2 50μL及び細胞溶解緩衝液 24.73mL(いずれもBio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011)を注意深く混合し、PMSF溶液(フェニルメチルスルホニルフルオリド 174.4mg、2.0mL DMSO中に希釈) 125μLを添加する。
実験動物からの眼球全体の物理化学的分解により、眼球溶解物を得た。機械的破壊のために、各々の眼球を、底が円錐形の1.5mLマイクロバイアルに移した。解凍後、細胞洗浄緩衝液(Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011) 1mLを用いて、眼球を1回洗浄した。次工程において、新たに調製した細胞溶解緩衝液 500μLを添加し、1.5mL組織破砕用乳棒(VWR Int., Art. No. 431-0098)を用いて眼球を破砕した。次いで、混合物を5回凍結及び解凍し、再度粉砕した。残存組織から溶解物を分離するため、試料を、4500×gで4分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ELISAにおける更なる分析まで、−20℃で保存した。
マウス血清試料中の抗体の定量のため、捕捉抗体及び検出抗体としてビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いた、標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施した。血清は、全血液試料体積の約50%を占める。
マウス眼球溶解物試料における分析物の濃度は、非GLP条件下での、ELECSYS(登録商標)機器プラットフォーム(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)に基づく適格(qualified)電気化学発光免疫測定法(ECLIA)を用いて決定した。
A)血清中濃度
血清中濃度についての結果を下記表及び図17に示す。
B)左眼及び右眼の眼球溶解物中の濃度
眼球溶解物中の濃度についての結果を、下記表及び図18〜20に示す。
硝子体内適用後、本明細書において報告される抗IGF−1R抗体0035及び0045(一方又は両方にHHY−AAA突然変異を伴う)は、HHY−AAA突然変異のない抗IGF−1R抗体(IGF-1R 0033)に比して、同様の眼球溶解物中の濃度(96及び168時間後)を示す。
Claims (17)
- 抗体であって、
第1のFc領域ポリペプチド及び第2のFc領域ポリペプチドを含み、該第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは各々、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンCH2ドメイン及び免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
i)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含む、
抗体。 - i)前記第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを更に含み、前記第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S354C及びT366Wを更に含むか、又はii)前記第1のFc領域ポリペプチドが、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを更に含み、前記第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異Y349C及びT366Wを更に含む、請求項1記載の抗体。
- 前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンCH2ドメイン及び前記免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG1サブクラスのものである、請求項1又は2記載の抗体。
- 前記第1のFc領域ポリペプチド及び前記第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異L234A及びL235Aを更に含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンCH2ドメイン及び前記免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG2サブクラスのものである、請求項1又は2記載の抗体。
- 前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンCH2ドメイン及び前記免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG4サブクラスのものである、請求項1又は2記載の抗体。
- 前記第1のFc領域ポリペプチド及び前記第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異S228P及びL235Eを更に含む、請求項1、2及び6のいずれか1項記載の抗体。
- 前記第1のFc領域ポリペプチド及び前記第2のFc領域ポリペプチドが、突然変異P329Gを更に含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項1〜8のいずれか1項記載の抗体。
- 抗体であって、
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のFc領域ポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のFc領域ポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
該第1の重鎖可変ドメインと該第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変ドメインと該第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
該第1及び第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含む、
抗体。 - 抗体であって、
N末端からC末端の方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のFc領域ポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のFc領域ポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第1の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端の方向に、第2の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含み、
該第1の重鎖可変ドメインと該第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原と特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変ドメインと該第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原と特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
i)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異S354C及びT366Wを含むか、又はii)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異S354C、T366S、L368A及びY407Vを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異Y349C及びT366Wを含み、
該第1及び第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異L234A、L235A及びP329Gを更に含み、
i)該第1のFc領域ポリペプチドは、突然変異I253A、H310A及びH435Aを含み、該第2のFc領域ポリペプチドは、突然変異H310A、H433A及びY436Aを含む、
抗体。 - 硝子体内適用のための、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体。
- 眼血管疾患処置用の、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む医薬処方物。
- 可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 1種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 眼疾患の処置に使用するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体。
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