BR112019018747A2 - proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas - Google Patents

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Ardourel Dan
William DEMONTE Daniel
L Kuijper Joseph
F Maurer Mark
Kornacker Michael
Swanson Ryan
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Alpine Immune Sciences Inc
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Abstract

a presente invenção refere-se a polipeptídeos cd80 variantes, proteínas imunomoduladoras compreendendo polipeptídeos cd80 variantes e ácidos nucleicos que codificam tais proteínas. as proteínas imunomoduladoras fornecem utilidade terapêutica para uma variedade de condições imunológicas e oncológicas. composições e métodos para produção e usos das mesmas são aqui fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROTEÍNAS IMUNOMODULADORAS VARIANTES DE CD80 E USOS DAS MESMAS.
Referência Cruzada A Pedidos Relacionados [001] O pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório US 62/472.558, depositado em 16 de março de 2017, pedido de patente provisório US 62/472.569 depositado em 16 de março de 2017, pedido de patente provisório US 62/472.554 depositado em 16 de março de 2017, pedido de patente provisório US 62/472.572, depositado em 16 de março de 2017, o pedido de patente provisório US 62/472.573, depositado em 17 de março de 2017, o pedido de patente provisório US 62/475.204, arquivado em 22 de março de 2017, o pedido de patente provisório US 62/537.939, depositado em 27 de julho de 2017, pedido de patente provisório US 62/574.165, depositado em 18 de outubro de 2017, e pedido de patente provisório US 62/582.266, depositado em 6 de novembro de 2017, cujo conteúdo é incorporado por referência na sua totalidade.
Incorporação Por Referência De Listagem De Sequências [002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma listagem de sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo com o nome 761612001640SeqList.txt, criado em 12 de março de 2018, que possui 4.888.576 bytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequências são incorporadas por referência em sua totalidade.
Campo [003] A presente divulgação refere-se a composições terapêuticas para modular a resposta imunológica no tratamento de câncer e doenças imunológicas. Em alguns aspectos, a presente divulgação refere-se a variantes particulares de CD80 que exibem ligação altera
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2/474 da, tal como afinidade ou seletividade de ligação, para um parceiro de ligação cognato, tal como afinidade aumentada para CTLA-4 e/ou PDL1 e/ou afinidade diminuída para CD28.
Antecedentes [004] A modulação da resposta imunológica através da intervenção nos processos que ocorrem na sinapse imunológica (IS) formada por e entre células apresentadoras de antígenos (APCs) ou célulasalvo e linfócitos é de crescente interesse médico. De modo mecânico, as proteínas da superfície celular no SI podem envolver a interação coordenada e frequentemente simultânea de múltiplos alvos proteicos com uma única proteína à qual eles se ligam. As interações entre SI ocorrem em íntima associação com a junção de duas células, e uma única proteína nessa estrutura pode interagir tanto com uma proteína na mesma célula (cis) quanto com uma proteína na célula associada (trans), provavelmente ao mesmo tempo. Tempo. Embora se conheçam terapias que possam modular o SI, são necessárias terapêuticas melhoradas. São fornecidas proteínas imunomoduladoras, incluindo proteínas solúveis ou proteínas imunomoduladoras transmembranares capazes de serem expressas nas células, que satisfazem tais necessidades.
Sumário [005] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um polipeptídeo CD80 variante contendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos, em uma ou mais posições, em um CD80 não modificado ou em um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo à posição (ou posições) 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 e/ou 84 com referência à numeração da SEQ ID NO: 2. Em algumas modali
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3/474 dades, a uma ou mais modificações de aminoácidos no CD80 não modificado ou no fragmento de ligação específica do mesmo, corresponde à posição (ou posições) 26, 35, 46, 57 e/ou 71 com referência à numeração da SEQ ID NO:2. Em qualquer das modalidades, a modificação de aminoácidos é uma substituição, inserção ou deleção de aminoácidos.
[006] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições, em um CD80 não modificado ou em um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, E23D, E23G, A26E, A26P, A26S, A26T, I30F, I30T, I30V, K34E, E35D, E35G, D46E, D46V, P51A, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, L65P, A71D, A71G, R73H, R73S, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, C82R, V84A e V84I, onde a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácido corresponde à numeração das posições de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2.
[007] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante fornecido contém uma ou mais modificações adicionais em uma ou mais posições correspondentes à posição (ou posições) 7, 12, 13,15,
16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 41,42,43,
44, 46, 47, 48, 51, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73,
74, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94,95 e/ou 97 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as modificações adicionais incluem uma ou mais substituições de aminoácidos no CD80 ou fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, V16E, E23G, E24D, L25S, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, Q27L, I30F, I30T, Y31S, Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R, T41S, M42I, M42V, M43L, M43T, D46E, D46V, M47I, M47L, M47V, N48H, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48Y, N48Y, P51A, Y53F,
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K54E, K54N, K54R, N55D, N55I, T57A, T57I, 158V, 161F, 161V, T62A, T62N, L65P, I67L, I67V, V68E, V68L, I69F, L70M, L70P, L70Q, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K87M, Y87C, Y87H, E88V, F92S, F94V, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M e L97Q onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde à numeração das posições de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2.
[008] Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é selecionada entre: I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/ M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D,
N55D/L70P/E77G, T57A/I69T, N55D/K86M, L72P/ T79I, T79P, E35D/ M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, A71D, T13A/I61N/A71 D, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I,
K36R/G78A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, Q33R/K54N/T57I/ I67V/A71D, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D,
A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/ A71D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/ M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/ E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/ E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/ L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/ L70R, H18Y/A71D/L 72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/ T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/ R94W, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/
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L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/ E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/ M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/ T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/ R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/
L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/ V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/ E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/ L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F, V22A/E35D/V68E/ A71D, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L97Q, Q33L/ E35D/ M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/ A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/ A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/ L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, R29H/E35D/M43V/M47I/I49V, Q27H/ E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T 62S/ L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/ M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/ L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, V30V/E35D/M47V/A71G/A91V, I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/
A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/A71D, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/
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M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N,
Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/ A71G, E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/ M47L/A71G/L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, V22D/E35D/ M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/ D90G/ L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, Q33L/E35D/M43I/Y53F/ T62S/ L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/
L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/ D46V/ M47I/A71G, T13R/H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q27L/ Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/ V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M T13R/Q33R/ E35D/ M38I/ M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/ M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/ Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/E35D/M47L/V68M, S15T/H18Y/ E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, H18Y/V22A/E35D/T41S/ M47V/T62N/A71G/A91G, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, H18Y/ A26E/E35D/M47L, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M, H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G, H18Y/A26E/ E35D/M47L/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/ E35D/M47L/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M, H18Y/A26E/E35D/
V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/ V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G, H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/D90G, H18Y/A26E/M47L/A71G, H18Y/A26E/
M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M, H18Y/A26E/M47L/
V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/ V68M/D90G, H18Y/A26E/M47L/D90G, H18Y/A26E/V68M/A71G,
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H18Y/A26E/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/V68M/D90G, H18Y/A26E/ A71G/D90G, H18Y/E35D, H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, H18Y/ E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L,
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47L/ V68M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G, H18 Y/E35D/M47L/ V68M/ A71G/L85M, H18Y/E35D/M87L/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/ V68M/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/ A71G, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/D90G, H18Y/E35D/M47V/N48K, H18Y/E35D/M47V/ V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G, H18Y/E35D/V68M/A71G/
D90G, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/
D90G, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/
L85M, H18Y/E35D/A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G, H18Y/ M47L/ V68M/A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/D90G, H18Y/M47L/ A71G/ D90G, H18Y/V68M/A71G/D90G, S21P/E35D/K37E/D46E/ M40I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, V22A/E35D/ M47L/A71G, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/
M47L/V68M/L85M/D90G, V24D/E24D/M35V/V68M, E24D/Q27R/
E35D/ T41S/M47V/L85Q, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q,
A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, A26E/E35D/M47L/V68M, A26E/ E35D/M47L/V68M/A71G, A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, A26E/ E35D/M47L/V68M/D90G, A26E/E35D/M47L/A71G, A26E/E35D/M47L/ A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/D90G, A26E/E35D/V68M/A71G,
A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/D90G, A26E/
E35D/A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/A71G, A26E/M47L/V68M/
A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/D90G, A26E/M47L/A71G/D90G,
A26E/V68M/A71G/D90G, Q27L/Q35L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/ L85M, Q27H/E35D/M47I, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, R29C/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/
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E35D/M38I/M47L/V68M, Q33R/M47V/T62N/A71G, E35D, E35DZ T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, E35D/T41S/N48T, E35D/M43I/ D46E/A71G/L85M, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/D46E, E35D/D46E/M47I, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/
L85M/Y87C, E35D/D46E/M47L/V68M/A85G/Y87C/K93R, E35D/D46E/ M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M,
E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46V, E35D/D46V/M47L, E35D/D46V/M47L/V68M, E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L/V68M/E88D, E35D/D46V/ M47L/V68M/K89N, E35D/D46V/M47L/V68M/D90G, E35D/D46V/ M47L/L70M, E35D/D46V/M47L/L70M/L85Q, E35D/D46V/M47L/L85Q, E35D/D46V/M47V/N48K/V68M, E35D/D46V/M47V/V68M/K89N, E35D/ D46V/M47V/V68M/L85Q, E35D/D46V/V68M, E35D/D46V/V68M/L85Q, E35D/D46V/L85Q, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47I/T62S/L85Q/ E88D, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L, E35D/M47L/Y53F/
V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47L/V68M, E35D/M47L/V68M/A71G, E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, E35D/M47L/V68M/D90G, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/
M47L/V68M/L85Q, E35D/M47L/L70M, E35D/M47L/A71G, E35D/ M47L/A71G/L85M, E35D/M47L/A71G/D90G, E35D/M47L/L85Q, E35D/ M47V, E35D/M47V/N48K, E35D/M47V/N48K/V68M, E35D/M47V/ N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L85M, E35D/
M47V/ N48K/V68M/L85Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, E35D/ M47V/ N48K/L85M, E35D/M47V/N48K/K89N, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/T62S/L85Q, E35D/M47V/V68M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N,
E35D/M47V/V68M/K89N, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/
K89N, E35D/N48K, E35D/N48K/V68M, E35D/N48K/V68M/K89N, E35D/N48K/L72V, E35D/N48K/K89N, E35D/V68M, E35D/V68M/
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A71G/D90G, E35D/V68M/L85Q, E35D/V68M/K89N, E35D/L85Q, E35D/K89N, E35D/L97R, M43I/M47L/A71G, D46V, D46V/M47I/A71G, D46V/M47L, D46V/M47L/V68M, D46V/M47L/V68M/L85Q, D46V/M47L/ L85Q, D46V/V68M, D46V/V68M/L85Q, D46V/L85Q, M47I/A71G, M47L, M47L/V68M, M47L/V68M/A71G/D90G, M47L/V68M/L85Q, M47L/L85Q, M47V, M47V/N48K, M47V/N48K/V68M, M47V/N48K/ V68M/K89N, M47V/N48K/K89N, M47V/V68M, M47V/V68M/K89N, M47V/K89N, N48K, N48K/V68M, N48K/V68M/K89N, N48K/K89N, V68M, V68M/L85Q, V68M/K89N, L85Q, K89N e delE10-A98, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas em SEQ ID NO: 2. [009] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um polipeptídeo CD80 variante contendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais substituições de aminoácidos em uma solução não modificada. CD80 ou fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, V20A, V20I, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, Q27L, T28Y, I30F, I30T, I30V, Y31C, Y31S, Q33E,
Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R, T41S, M42I, M42V,
M43L, M43T, D46E, D46V, M47I, M47L, M47V, N48D, N48H, N48K,
N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, Y53H, K54E, K54N, K54R,
N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, 161V, T62A, T62N, N63D, L65P, I67L, I67V, V68E, V68L, I69F, L70M, L70P, L70Q, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87Q, E88V, F92S, F92V, R94Q, R 94W, E95D, E95V, L97M e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde à numeração das posi
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10/474 ções de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2.
[0010] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante fornecido contém uma ou mais modificações adicionais em uma ou mais posições correspondentes à posição (ou posições) 7, 12, 13, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 63, 65, 67, 68,
69, 70, 71,72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95 e/ou 97 com referência à numeração da SEQ ID
NO: 2. Em algumas modalidades, as modificações adicionais incluem uma ou mais substituições de aminoácidos no CD80 ou fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, A12T, A12V, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18L, H18Y, V20A, V20I, V22A, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, Q27L, T28Y, R29H, I30T, I30T, I30V, Y31C, Y31H, Y31S, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R,
K37E, M38T, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V, M43I, M43L, M43T,
M43V, S44P, D46E, D46V, M47I, M47L, M47T, M47V, N48D, N48H,
N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, K54E, Y53F, Y53H, K54R,
N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, L65P, I67L, I67T, V68A, V68L, V68M, I69F, I69T, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, P74S, D76H, E77GE77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K,
C82R, V83A, V83I, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K86E, K87M,
Y87C, Y87D, Y87H, Y87N, E88D, E88G, K89E, K89E, K89N, D90G,
D90N, A91S, A91T, A91V, F92L, F 92S, F92V, F92Y, K93E, K93R,
K93T, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q, E95V e L97R, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde à numeração de posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0011] Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais
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11/474 aminoácidos é selecionada entre: I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/ M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D,
N55D/L70P/E77G, T57A/I69T, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, A71D,
E81K/A91S, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/ A71D, M47I/E88D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/ A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/ A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/ M43I/ L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/ A71D/V83I, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35 D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/ L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/
D76H, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/ M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/ Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/ M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/ M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/ K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L37Q,
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Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/ L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/ L85Q, Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/ K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M 43I/M47L/L85Q/ K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N85D/L85Q/K89N, H18Y/V20A /Q33L/E35D/M47V/Y53F, V22A/E35D/V68E/A71 D, Q33L/E35D/M47L/ A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/ R94W, H18Y/E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/ A71G/L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/ M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/T62A/A71G/ V83A/Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/ E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/ A71G, R29H/E35D/M43V/M47I/I49V, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/ A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/ E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/ E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/ E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/A71 D, E35D/T41S/ M43I/A71G/D 90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/ M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, Q27H/ E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G, E35D/ D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/D46E/ M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/ L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, V22D/E35D/M47L/L70M/ L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R,
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E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/ A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G,
M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/ T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/ E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35 D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/ 161V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18YZ E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46EZ M47LZ V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27RZ E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71GZ L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/ V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/E35D/T41SZ M47V/T62N/A71G/A91G, E35D/M47L/L70M, E35D/M47L/V68M,
E35D/D46V/M47L/V68M/E88D, E35D/D46V/M47L/V68M/D90G, E35DZ D46V/M47L/V68M/K89N, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/D46VZ M47L/V68M, E35D/D46V/M47L/V70M, E35D/D46V/M47L/V70M/L85Q, E35D/M47V/N48K/V68M, E35D/E35D/M47L/V68M/E85V/L97Q, E35DZ D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/ E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47VZ N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L85M, E35DZ
M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/T41SZ
D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R85L,
H18Y/E35D/M38I/M87L/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N,
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/
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L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/ V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/ V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/
E35D/V68M/T85M/L85M, H18Y/V22D/M35V/N48K/V68M, Q27L/Q33L/ E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/ L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/ L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/ M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/H18Y/E35D/V68M/ L85IW R94Q, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M38V/T62S/ V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/ M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/ L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33 R/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/M35/M55/V68M M47V/V68M,
E35D/D46V, E35D/V68M, E35D/L85Q, D46V/M47L, D46V/V68M, D46V/L85Q, M47L/V68M, M47L/L85Q, V68M/L85Q, E35D/D46V/ M47L, E35D/D46V/V68M, E35D/D46V/L85Q, E35D/V68M/L85Q, D46V/M47L/V68M, D46V/M47L/L85Q, D46V/V68M/L85Q, M47L/ V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L/L85Q, E35D/D46V/V68M/L85Q, E35D/ M47L/V68M/L85Q, D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/N48K, E35D/K89N, M47V/N48K, M47V/V68M, M47V/K89N, N48K/V68M, N48K/K89N, E35D/M47V/N48K, E35D/M47V/V68M, E35D/M47V/K89N, E35D/ N48K/V68M, E35D/N48K/K89N, E35D/V68M/K89N, M47V/N48K/ V68M, M47V/N48K/K89N, M47V/V68M/K89N, N48K/V68M/K89N, E35D/M47V/N48K/K89N, E35D/M47V/V68M/K89N, E35D/N48K/V68M/ K89N, M47V/N48K/V68M/K89N, E35D/D46V/M47V/N48K/V68M,
E35D/D46V/M47V/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47V/V68M/K89N, E35D/ M47V/N48K/V68M/L85Q, E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N, A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G,
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26 E/E35D/V68M/A71G/
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D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G, E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/V68M/
A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/
M47L/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M, A26E/M47L/V68M/A71G/ D90G, A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/A71G, H18Y/ E35D/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/E35D/ M47L/V68M/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/ A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/ A71G, H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G, M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/V68M/ A71G/D90G, H18Y/A26E/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/D90G,
H18Y/A26E/E35D/M47L, E35D/V68M/A71G/D90G, E35D/M47L/A71G/ D90G, E35D/M47L/V68M/D90G, E35D/M47L/V68M/A71G, A26E/ V68M/A71G/D90G, A26E/M47L/A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/
D90G, A26E/M47L/V68M/A71G, A26E/E35D/A71G/D90G, A26E/ E35D/V68M/D90G, A26E/E35D/V68M/A71G, A2 6E/E35D/M47L/ D90G, A26E/E35D/M47L/V68M, H18Y/M47L/A71G/D90G, H18Y/ M47L/V68M/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G, H18Y/E35D/A71G/
D90G, H18Y/E35D/V68M/D90G, H18Y/E35D/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47L/D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G, H18Y/E35D/M47L/V68M, H18Y/A26E/V68M/D90G, H18Y/A26E/V68M/A71G, H18Y/A26E/
M47L/D90G, H18Y/A26E/M47L/A71G, H18Y/A26E/M47L/V68M, H18Y/ A26E/E35D/A71G e H18Y/A26E/E35D/V68M, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0012] Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos é selecionada entre V20I, V22I, V22L, A26E, Q27H, Q33L, Q33R, E35D, E35G, T41S, M43L, D46E, D46V, M47I, M47L,
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M47V, N55D, T57I, 161V, L70M, A71D, A71G, L72V e L85M, L85Q, R94W e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos é selecionada entre V20I, V22L, A26E, Q27H, Q33L, Q33R, E35D, E35G, M47I, D46E, D46V, M47L, M47V, T57I, L70M, A71D, A71G, L72V e L85M, L85Q, L97Q ou a modificação de um ou mais aminoácidos é selecionada entre A26E, Q33L, E35D, M47I, M47L, M47V, T57I, L70M, A71D, A71G e L85Q; ou a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas entre A26E, E35D, D46V, M47L, M47V, L70M, A71G e L85Q; ou a modificação de um ou mais aminoácidos compreende A26E; ou a modificação de um ou mais aminoácidos compreende E35D; ou a modificação ou modificação de um ou mais aminoácidos compreende D46V; ou a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem M47L; ou a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem M47V; ou a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem A71G, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde à numeração de posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos selecionada entre A26E, Q33L, E35D, M47I, M47L, M47V, T57I, L70M, A71D, A71G e L85Q, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0013] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um polipeptídeo CD80 variante contendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou ligação específica um seu fragmento, em que as modificações
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17/474 de aminoácidos compreendem E35D/D46E, E35D/D46V, E35D/M47I, E35D/M47L, E35D/M47V, E35D/V68M, E35D/A71G ou E35D/D90G; D46E/M47I, D46E/M47L, D46E/M47V, D46E/V68M, D46E/A71G ou D46E/D90G; M47I/V68M, M47I/A71G, M48I/D90G; M47L/V68M, M47L/A71G, M47L/D90G; M47V/V68M, M47V/A71G, M47V/D90G; V68M/A71G ou V68M/D90G; A71G/D90G; ou E35D/M47I/V68M, E35D/M47L/V68M, E35D/M47V/V68M, em que a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácidos corresponde à numeração das posições de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2 [0014] Em algumas modalidades, é fornecido um polipeptídeo CD80 variante, contendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais substituições de aminoácidos, a uma ou mais substituições de aminoácidos contendo pelo menos a substituição de aminoácidos L70P mas não contendo as substituições de aminoácidos V68M, L72P e/ou K86E, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde (s) à posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é selecionada entre: L70P, I30F/L70P, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, N55D/L70P/E77G e L70P/ F92S.
[0015] Em algumas modalidades, o CD80 não modificado é um CD80 de mamífero. Em algumas modalidades, o CD80 é um CD80 humano.
[0016] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém: o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo; e o domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
[0017] Em algumas modalidades, o CD80 não modificado contém
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18/474 (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; ou (iii) é uma porção da mesma contendo um domínio IgV ou domínio IgC ou seus fragmentos de ligação específica. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC tem um comprimento de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou mais aminoácidos; o fragmento de ligação específica do domínio IgV contém um comprimento que é pelo menos 80% do comprimento do domínio IgV estabelecido como aminoácidos 35-135, 35-138, 37-138 ou 35-141 da SEQ ID NO: 1; ou o fragmento de ligação específica do domínio IgC contém um comprimento que é de pelo menos 80% do comprimento do domínio IgC apresentado como aminoácidos 145-230, 154-232 ou 142-232 da SEQ ID NO: 1.
[0018] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 Modificações de aminoácidos, opcionalmente substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
[0019] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe uma ligação alterada ao ectodomínio de CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28 em comparação com a ligação do CD80 não modificado ao ectodomínio de CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, a ligação alterada é afinidade de ligação alterada e/ou seletividade de ligação alterada.
[0020] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante
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19/474 contém o domínio IgV ou um seu fragmento específico e o domínio IgC ou um seu fragmento específico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 2297-2507 e 2930-2960 ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS:
3-75, 2009-2104, 2297-2507 e 2930-2960, ou um fragmento de ligação específica do mesmo, que contenha uma ou mais das substituições de aminoácidos.
[0021] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
[0022] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929 e 2961 a 3022, ou um fragmento de ligação específica do mesmo ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929 e 2961 a 3022, ou um fragmento de ligação específica do mesmo, que contém uma ou mais das substituições de aminoácidos.
[0023] Em algumas modalidades, o domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
[0024] Em algumas modalidades, o CD80 variante apresenta afinidade de ligação alterada e/ou seletividade de ligação alterada ao ectodomínio de CTLA4, PD-L1 ou CD28, em comparação com a especifi
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20/474 cidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA4, PD-L1 ou CD28. Em algumas modalidades, o CTLA-4 é um CTLA-4 humano. Em algumas modalidades, o CD28 é um CD28 humano. Em algumas modalidades, a PD-L1 é uma PD-L1 humana.
[0025] Em algumas modalidades, o CD80 variante exibe uma maior afinidade de ligação ao ectodomínio de CTLA4 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA4. Em algumas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CTLA-4 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4.
[0026] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou em um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondentes às posições 7, 23, 26, 30, 35, 46, 57, 58, 71, 73, 79 e/ou 84, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, V20I, V22D, V22L, E23D, E23G, E24D, A26E, A26P,
A26S, A26T, Q27H, Q27L, I30V, Q33L, Q33R, E35D, E35G, T42S,
M42V, M43L, M43T, D46E, D46V, M47I, M47L, M47V, N48D, N48H,
N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, Y53F, K54E, K54R, T57A, T57I,
I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, I67L, V68E, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, P74S, T79I, T79M, E81G, E81K, V84I, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, E88V, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições do conjunto CD80 adiante na SEQ ID
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NO: 2.
[0027] Em qualquer uma das modalidades fornecidas, o polipeptídeo CD80 pode exibir uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Em algumas dessas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 ou 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, ou 200 vezes, em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo às posições 23, 26, 35, 46, 55, 57, 58, 71, 79, e/ou 84, com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre T13R, S15T, V20I, V22D, V22L, E23D, E23G, E24D, A26E, A26P, A26S., A26T, Q27H, Q27L, Q33R, E35D, E35G, T41S, M42V, M43L, D46E, D46V, M47I, M47L, M47V, N48K, N48Y, Y53F, K54E, N57I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, I67L, V68E, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, T79I, T79M, V84I, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, E88V, R94Q, R94W, E95V e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde (s) às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0028] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado
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22/474 para o ectodomínio de PD-L1. Em algumas de tais modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 é aumentada mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1. Em algumas dessas modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo às posições 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 e/ou 84, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, V20A, V20I, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G E24D, L25S, A26E, A26P, A26S,
A26T, Q27H, Q27L, I30T, I30V, Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E,
E35D, K36R, T41S, M42I, M42V, M43L, M43T, D46E, D46V, M47I,
M47L, M47V, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A,
Y53F, K54R, N55D, N55I, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, L65P, I67L, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73S, P74S, D76H, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V85I, L85M, L85M, K87M, Y87C, Y87D, F92S, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde (s) às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0029] Em algumas modalidades, o CD80 variante exibe afinidade de ligação diminuída para o ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Em algumas modalidades, a menor afinidade para o ec
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23/474 todomínio de CD28 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
[0030] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente ao ectodomínio de CTLA-4 com seletividade aumentada em comparação com o CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4. Em algumas dessas modalidades, a seletividade aumentada inclui uma razão maior de ligação do polipeptídeo variante para CTLA-4 versus CD28 em comparação com a razão de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para CTLA-4 versus CD28. Em algumas dessas modalidades, a razão de ligação CTLA-4 versus CD28 é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou mais.
[0031] Em qualquer uma das modalidades fornecidas, o polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente ao ectodomínio de PD-L1 com seletividade aumentada em comparação com o CD80 não modificado do ectodomínio de PD-L1. Em algumas de tais modalidades, a seletividade aumentada inclui uma razão maior de ligação do polipeptídeo variante para PD-L1 versus CD28 em comparação com a razão de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para PD-L1 versus CD28. Em algumas dessas modalidades, a razão é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou mais.
[0032] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é uma proteína solúvel. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está ligado a um domínio de multimerização. Em algumas
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24/474 modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é um polipeptídeo multimérico, opcionalmente um polipeptídeo dimérico, contendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado a um domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um domínio de multimerização. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são diferentes.
[0033] Em algumas modalidades, o domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante da mesma com função efetora reduzida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está ligado a uma porção que aumenta a meia-vida biológica do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está ligado a um domínio Fc ou a uma variante do mesmo com função efetora reduzida.
[0034] Em algumas modalidades, o domínio Fc é mamífero, opcionalmente humano; ou o domínio Fc variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos em comparação com um domínio Fc não modificado que é mamífero, opcionalmente humano. Em algumas modalidades, o domínio Fc ou sua variante contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 359, ou SEQ ID NO: 1712, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 359, ou SEQ ID NO: 1712. Em algumas modalidades, o domínio Fc contém uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas entre E233P, L234A, L234V, L235A, L235E, G236del, G237A, S267K, N297G, V302C e K447del, cada uma por numeração EU. Em algumas modalidades, em que a região Fc não é um Fc de lgG1 humana contendo as mutações R292C, N297G e V302C (correspondendo a R77C, N82G e V87C com referência a lgG1 Fc humana de tipo selvagem
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25/474 apresentada na SEQ ID NO: 277). Em algumas modalidades, o Fc não é o Fc estabelecido na SEQ ID NO: 356. Em algumas modalidades, o domínio Fc contém a modificação de aminoácidos C220S pela numeração EU. Em algumas modalidades, o domínio Fc contém a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 356-358, 376 e 1713-1715 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ. ID NOS: 356-358, 376 e 1713-1715 e exibe função efetora reduzida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante de CD80 é ligado ao domínio de multimerização ou Fc indiretamente através de um ligante, opcionalmente, um ligante GSG4S (SEQ ID NO: 1716). Em algumas modalidades, 0 ligante não consiste em três alaninas (AAA). [0035] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma proteína imunomoduladora, contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui fornecidos e uma porção que se estende meia-vida. Em algumas modalidades, a porção que se estende meia-vida contém um domínio de multimerização, albumina, um polipeptídeo de ligação à albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade beta da gonadotrofina coriônica humana, polietileno glicol (PEG), longas sequências hidrofílicas não estruturadas de aminoácidos (XTEN), hidroxietilamido (HES), uma molécula pequena de ligação à albumina, ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, a porção que se prolonga da meia-vida é ou contém Pro/Ala/Ser (PAS) e 0 polipeptídeo CD80 variante é PASilado. Em algumas modalidades, a porção que se prolonga de meia-vida é ou contém um domínio de multimerização. Em algumas modalidades, 0 domínio de multimerização é selecionado a partir de uma região Fc de uma imunoglobulina, um zíper de leucina, um zíper de isoleucina ou um dedo de zinco.
[0036] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é um multímero contendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado
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26/474 a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero contendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes. Em algumas modalidades, o multímero é um dímero. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais. Em algumas modalidades, o dímero é um homodímero. Em algumas modalidades, o dímero é um heterodímero.
[0037] Em algumas modalidades, o domínio de multimerização é ou contém uma região Fc de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a região Fc é de uma proteína imunoglobulina G1 (lgG1) ou uma imunoglobulina G2 (lgG2). Em algumas modalidades, a proteína imunoglobulina é humana e/ou a região Fc é humana. Em algumas modalidades, a região Fc contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 278 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 278. Em algumas modalidades, a região Fc contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 277.
[0038] Em algumas modalidades, a região Fc exibe uma ou mais funções efetoras. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc, opcionalmente em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antigeno, opcionalmente em que as células T compreendem células Jurkat expressando um repórter de IL-2. Em algumas modalidades, a região Fc apresenta uma ou mais funções efetoras reduzidas em comparação com uma região Fc de tipo selvagem,
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27/474 opcionalmente em que a região Fc de tipo selvagem é um Fc humano de lgG1 humana. Em algumas modalidades, a uma ou mais funções efetoras são selecionadas entre citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento, morte celular programada e fagocitose celular.
[0039] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc variante contendo uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com a região Fc de tipo selvagem. Em algumas dessas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos da região Fc variante são selecionadas de Fc N297G, R292C/N297G/V302C, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc variante contém ainda a substituição de aminoácidos C220S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc contém a sequência da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 356-358 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer de SEQ ID NOS: 356-358 e contém as substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a região Fc contém K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc contém a sequência da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1713-1715 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1713-1715 e contém as substituições de aminoácidos.
[0040] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui fornecidos
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28/474 que exibem uma afinidade aumentada para PD-L1.
[0041] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, opcionalmente em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antígeno expressando PD-L1, opcionalmente em que as células T compreendem células Jurkat expressando um repórter de IL-2 ou células T humanas primárias produtoras de citocinas inflamatórias, tais como IL-2.
[0042] Em algumas modalidades da proteína imunomoduladora, o polipeptídeo CD80 variante está ligado, direta ou indiretamente através de um ligante, ao domínio de multimerização. Em algumas dessas modalidades, o ligante contém 1 a 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é selecionado a partir de AAA, G4S (SEQ ID NO: 1717) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 330).
[0043] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é uma proteína imunomoduladora transmembranar contendo ainda um domínio transmembranar ligado ao domínio extracelular (ECD) ou um fragmento de ligação específica do mesmo do polipeptídeo CD80 variante. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar contém a sequência de aminoácidos estabelecida como resíduos 243-263 da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência aos resíduos 243-263 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda um domínio de sinalização citoplasmático ligado ao domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático contém a sequência de aminoácidos estabelecida como resíduos 264-288 da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência aos resíduos 254-288 da SEQ ID NO: 1 [0044] Em algumas de qualquer uma das modalidades fornecidas,
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29/474 o polipeptídeo CD80 variante modula uma resposta de uma célula imunológica, tal como uma célula T. Em algumas modalidades, a resposta, por exemplo, a resposta das células T, é aumentada ou é diminuída. Em algumas modalidades, o CD80 variante aumenta a expressão de IFN-gama (interferon- gama) em relação ao CD80 não modificado em um ensaio de células T primárias in vitro. Em algumas modalidades, o CD80 variante diminui a expressão de IFN-gama ( interferon-gama) relativamente ao CD80 não modificado em um ensaio in vitro de células T primárias. Em algumas modalidades de qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui descritos, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização de células T relativamente ao CD80 não modificado, tal como determinado utilizando um ensaio repórter envolvendo uma célula T (por exemplo, Jurkat) manipulada com um repórter (por exemplo, luciferase) operacionalmente ligado a um promotor de IL-2. Em algumas modalidades de qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui descritos, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização de células T relativamente ao CD80 não modificado, tal como determinado utilizando um ensaio repórter envolvendo uma célula T (por exemplo, Jurkat) manipulada com um repórter (por exemplo, luciferase) operacionalmente ligado a um promotor de IL-2. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é fornecido em qualquer de uma variedade de formatos, tais como solúvel ou imobilizado (por exemplo, ligado a placas).
[0045] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é deglicosilado.
[0046] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma proteína imunomoduladora, contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes fornecidos ligados a um segundo polipeptídeo contendo um domínio de superfamília de imunoglobulina (IgSF). Em algumas modalidades, o domínio IgSF é modificado por afinidade e exibe uma liga
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30/474 ção alterada a um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos em comparação com o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o domínio IgSF exibe ligação aumentada a um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos em comparação com o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem.
[0047] Em algumas modalidades, o CD80 variante é um primeiro polipeptídeo variante CD80 e o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF de um segundo polipeptídeo CD80 variante que é qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, em que a primeira e segunda variantes CD80 são iguais ou diferente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é capaz de se ligar especificamente a CTLA-4 e o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é capaz de se ligar a um parceiro de ligação cognato diferente de um especificamente ligado pelo polipeptídeo variante CD80. Em algumas modalidades, o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é uma porção localizadora de tumor que se liga a um ligando expresso em um tumor. Em algumas modalidades, o ligando expresso em um tumor é B7H6.
[0048] Em algumas modalidades, o domínio IgSF é de NKp30.
[0049] Em algumas modalidades, o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF de um ligando que se liga a um receptor inibidor, ou é um domínio IgSF modificado por afinidade do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio IgSF modificado por afinidade apresenta uma maior afinidade de ligação e/ou seletividade de ligação para o receptor inibidor em comparação com a ligação do domínio IgSF não modificado ao receptor inibidor. Em algumas modalidades, o receptor inibidor é TIGIT ou PD-1; ou o ligando do receptor inibidor é CD155, CD112, PD-L1 ou PD-L2.
[0050] Em algumas modalidades, o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF modificado por afinidade contendo: (i)
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31/474 um CD112 de tipo selvagem compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 269, 734 ou 829 ou um polipeptídeo CD112 variante contendo um domínio IgSF de qualquer uma das SEQ ID NOS apresentadas na Tabela 3, opcionalmente, qualquer uma das SEQ ID NO: 735-828, 830-917, 918-999, 14301501; (ii) um CD155 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 268, 378 ou 421 ou um polipeptídeo CD155 variante contendo um domínio IgSF de qualquer uma das SEQ ID NOS estabelecidas na Tabela 4, opcionalmente, qualquer das SEQ ID NOS: 379-420, 422-539, 540-733, 1502-1573, 1548-1711, (iii) um PD-L1 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 251, 1000, 1721 ou 1196 ou um polipeptídeo variante de PD-L1 contendo uma IgSF de qualquer uma das SEQ ID NOS apresentadas na Tabela 5, opcionalmente qualquer das SEQ ID NOs: 1001 a 1065, 1718-1900, 1931 a 1996; (iv) um PD-L2 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 252, 1197 ou 1257, polipeptídeo PD-L2 variante contendo um domínio IgSF de qualquer uma das SEQ ID NOS expostas na Tabela 6, opcionalmente qualquer uma dos SEQ ID NO: 1198-1248, 1250-1325, 1327-1401, 1403-1426 1719, 1720, 1901 a 1930, (v) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS em (i) - (iv) e que contém a substituição de aminoácidos; ou (vi) um fragmento de ligação específica de qualquer um de (i) - (v). Em algumas modalidades, o domínio IgSF é ou contém um domínio IgV. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é ou contém um domínio IgV.
[0051] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém um domínio de multimerização ligado a um ou a ambos o poli
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32/474 peptídeo CD80 variante e ao domínio IgSF do segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante da mesma com função efetora reduzida. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é dimérica. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é homodimérica. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é heterodimérica. [0052] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um conjugado, contendo um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido ou um polipeptídeo imunomodulador aqui fornecido ligado a uma porção. Em algumas modalidades, a porção é uma porção de direcionamento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, a porção de direcionamento se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula imunológica, opcionalmente, em que a célula imunológica é uma célula apresentadora de antígeno ou um linfócito. Em algumas modalidades, a célula imunológica é uma célula apresentadora de antígeno ou um linfócito. Em algumas modalidades, a porção de direcionamento é uma porção localizadora de tumor que se liga a uma molécula na superfície de um tumor. Em algumas modalidades, a porção é uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopartícula. Em algumas modalidades, a unidade é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o conjugado é divalente, tetravalente, hexavalente ou octavalente. Representações exemplificativas de tais conjugados são apresentadas nas Figuras 6A e 6B. Em algumas modalidades, o conjugado é uma proteína de fusão.
[0053] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma molécula de ácido nucleico, codificando um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, um polipeptídeo imunomodulador aqui fornecido, ou um conjugado que é uma proteína de fusão contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados. Em algumas modalidades,
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33/474 a molécula de ácido nucleico é ácido nucleico sintético. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é cDNA.
[0054] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um vetor contendo a molécula de ácido nucleico aqui fornecida. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão de mamífero ou um vetor viral.
[0055] Em algumas modalidades, é fornecida aqui uma célula, contendo um vetor aqui fornecido. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana.
[0056] Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um polipeptídeo CD80 variante ou uma proteína imunomoduladora, contendo a introdução da molécula de ácido nucleico aqui fornecida ou vetor fornecido aqui em uma célula hospedeira sob condições para expressar a proteína na célula. Em algumas modalidades, o método inclui adicionalmente isolar ou purificar o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora da célula.
[0057] Em algumas modalidades, é fornecido um método de engenharia de uma célula que expressa um polipeptídeo variante CD80 variante que inclui a introdução de uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido em uma célula hospedeira sob condições em que o polipeptídeo é expresso na célula.
[0058] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma célula manipulada, expressando um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, uma proteína imunomoduladora fornecida aqui, um conjugado aqui fornecido, a molécula de ácido nucleico aqui fornecida ou o vetor aqui fornecido.
[0059] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora contém um peptídeo sinal. Em algumas
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34/474 modalidades, o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora não contém um domínio transmembranar e/ou não é expresso na superfície da célula. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora é secretada a partir da célula manipulada.
[0060] Em algumas modalidades, a célula manipulada contém um polipeptídeo CD80 variante que contém um domínio transmembranar e/ou é uma proteína imunomoduladora transmembranar aqui fornecida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é expresso na superfície da célula. Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célula imunológica. Em algumas modalidades, a célula imunológica é uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou um linfócito.
[0061] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célula primária. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é um linfócito que é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula é uma APC que é uma APC artificial. Em algumas modalidades, a célula manipulada contém ainda um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T modificado.
[0062] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um agente infeccioso, contendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, um polipeptídeo imunomodulador aqui fornecido ou um conjugado de fusão CD80 variante aqui fornecido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante codificado ou polipeptídeo imunomodulador não contém um domínio transmembranar e/ou não é expresso na superfície de uma célula na qual é expresso. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante codificado, polipeptídeo imunomodulador ou conjugado é secre
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35/474 tado a partir de uma célula na qual é expresso.
[0063] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante codificado contido no agente infeccioso contém um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante codificado é expresso na superfície de uma célula na qual é expresso.
[0064] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria ou um vírus. Em algumas modalidades, o vírus é uma construção lentiviral ou retroviral ou um híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus oncolítico. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico é um adenovirus, vírus adenoassociado, vírus herpes, vírus herpes simplex, reovírus, vírus da doença de Newcastle, parvovirus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Coxsackie ou um vírus Vaccinia.
[0065] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus que visa especificamente as células dendríticas (DCs) e/ou é trópico de células dendríticas. Em algumas modalidades, o vírus é um vetor lentiviral que é pseudotipado com um produto de envelope do vírus Sindbis modificado.
[0066] Em algumas modalidades, o agente infeccioso contém ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um outro produto genético que resulta na morte de uma célula-alvo ou que pode aumentar ou reforçar uma resposta imunológica. Em algumas modalidades, o produto genético adicional selecionado de um agente anticâncer, um agente antimetastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imunomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imunológico, um anticorpo, uma citocina, um fator de crescimento, um antígeno, um produto genético citotóxico, um produto genético pró-apoptótico, um produto genético antiapoptótico, um gene degradativo da matriz celular, genes para regeneração de tecidos e reprogramação de células somáticas humanas para pluripotência.
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36/474 [0067] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma composição farmacêutica, contendo um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, uma proteína imunomoduladora fornecida aqui, um conjugado aqui fornecido, uma célula manipulada aqui fornecida ou um agente infeccioso aqui fornecido. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é estéril.
[0068] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um artigo de fabricação contendo a composição farmacêutica aqui fornecida em um frasco. Em algumas modalidades, o frasco é selado.
[0069] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um kit contendo uma composição farmacêutica aqui fornecida e instruções para uso. Em algumas modalidades, é fornecido aqui um kit contendo um artigo de fabricação fornecido aqui e instruções para uso.
[0070] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um método de modulação de uma resposta imunológica em um indivíduo, tal como aumentar ou diminuir uma resposta imunológica, contendo a administração de uma composição farmacêutica aqui fornecida ao indivíduo.
[0071] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um método de modular uma resposta imunológica em um indivíduo que inclui a administração de uma proteína imunomoduladora fornecida aqui, tal como uma proteína imunomoduladora que exibe afinidade de ligação aumentada para PD-L1. Em algumas modalidades, a resposta imunológica é aumentada. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é uma proteína imunomoduladora aqui fornecida que exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é uma proteína imunomoduladora aqui fornecida que exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, opcionalmente em que a proteína imunomoduladora contém um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido.
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37/474 [0072] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, contendo a administração das células manipuladas fornecidas aqui. Em algumas modalidades, as células manipuladas são autólogas ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células manipuladas são alogênicas para o indivíduo.
[0073] É aqui também fornecido um método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, por exemplo, aumentar ou diminuir uma resposta imunológica, incluindo administrar ao indivíduo um polipeptídeo CD80 variante, ou uma proteína imunomoduladora ou conjugado contendo o polipeptídeo CD80 variante ou uma célula manipulada ou agente infeccioso segregando ou expressando o polipeptídeo CD80 variante, em que o polipeptídeo CD80 variante se liga a CTLA-4 com afinidade aumentada ou seletivamente comparado com a ligação do CD80 não modificado ao CTLA-4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CTLA-4 variante contém uma ou mais modificações como aqui descrito.
[0074] Em algumas modalidades do método, o polipeptídeo CTLA4 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um polipeptídeo CD80 não modificado ou em um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a posições selecionadas de 12, 13, 16, 18, 20 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 51, 54, 55, 57, 58 61, 62, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 88, 90, 91, 92, 93 94 e/ou 95 com referência às posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante de CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um CD80 não modificada ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo à posição (ou posições) 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 ou 84 com
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38/474 referência à numeração de SEQ ID NO: 2.
[0075] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações são selecionadas de A12T, A12V, T13R, C16R, H18Y, V20I, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, Q27L, 30F, I30T, I30V, Y31H, Q33E, K34E, E35D, E35G, K36R, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V, M43I, M43L, S44P, D46E, D46V, M47I, M47L, M47T, M47V, N48H, P51A, K54E, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, 161V, T62N, L65P, I67L, V68A, V68M, I69F, I69T, L70M, L70P, L70R, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, D76H, E77G, G78A, T79I, T79P, E81K, C82R, V83I, V84A, V85I, L85M, L85Q, K86M, E88D, E88V, D90N, A91S, A91T, F92S, K93R, R94W, E95K e E95V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais substituições de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E23D, E23G, A26E, A26P, A26S, A26T, I30F, I30T, I30V, K34E, E35D, E35G, D46E, D46V, P51A, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, L65P, A71D, A71G, R73S, G78A, T79I, T79P, C82R, V84A, V84I, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde à numeração das posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[0076] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações são selecionadas de L70P, I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71 D/ L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/L70P/ E77G, T57A/I69T, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/P74S/ E81G/E91D, A71D, T13A/I61N/A71 D, E81K/A91S, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I,
K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/
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39/474
I61V/A71D, P51A/A71D, Η18Υ/Μ47Ι/Τ57Ι/Α71G, V20I/M47V/T57I/ V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/ M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V,
E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/
T57A/ A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L,
E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70 M/A71D/E95K, N55I/T57I/ I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/ E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, E35G/ K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D e Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W.
[0077] Em algumas modalidades, o método inclui a administração ao indivíduo de um polipeptídeo CD80 variante solúvel de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, uma proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das modalidades descritas ou um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o método inclui a administração ao indivíduo de um agente infeccioso que codifica um polipeptídeo CD80 variante de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas.
[0078] Em algumas modalidades, a modulação da resposta imunológica trata uma doença ou condição no indivíduo. Em algumas modalidades, a resposta imunológica é aumentada. Vários formatos de um polipeptídeo CD80 variante são contemplados para administração a um indivíduo para aumentar uma resposta imunológica, tal como formatos antagonistas de um CD80 variante. Em alguns casos, tais métodos são realizados sob condições em que a sinalização pelo receptor inibitório CTLA-4 é bloqueada ou atenuada pela administração.
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40/474 [0079] Em algumas modalidades, nos métodos fornecidos de modular uma resposta imunológica, é administrado ao indivíduo um polipeptídeo CD80 variante ou uma proteína imunomoduladora que é solúvel. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora solúvel é uma proteína de fusão Fc imunomoduladora.
[0080] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem a administração de um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, ou uma proteína imunomoduladora aqui fornecida, ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma célula manipulada contendo um polipeptídeo CD80 variante secretável, aqui fornecida, é administrada ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma célula manipulada fornecida aqui é administrada ao indivíduo.
[0081] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, um agente infeccioso codificando um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora secretável é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula tumoral ou célula imunológica e a proteína imunomoduladora secretável é secretada da célula infectada.
[0082] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, a doença ou condição é um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, a doença ou patologia é selecionada de melanoma, câncer do pulmão, câncer da bexiga, malignidade hematológica, câncer do fígado, câncer do cérebro, câncer renal, câncer da mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do baço, câncer da próstata, câncer testicular, câncer do ovário, câncer do útero, carcinoma gástrico, um câncer musculoesquelético, um câncer da cabeça e do pescoço, um câncer gastrointestinal, um câncer das células germinativas ou um câncer endócrino e neuroendócrino. Em algumas de tais modalidades, o CD80 variante é administrada em um formato que aumenta uma resposta imunológica no indivíduo.
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41/474 [0083] Vários formatos de um polipeptídeo CD80 variante são contemplados para administração a um indivíduo para diminuir uma resposta imunológica, tal como formatos agonistas de um CD80 variante. Em alguns casos, tais métodos são realizados sob condições em que a sinalização pelo receptor inibitório CTLA-4 é ativada ou estimulada ou induzida pela administração.
[0084] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, a resposta imunológica é diminuída. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, uma proteína ou conjugado imunomodulador contendo um polipeptídeo CD80 variante ligado a uma porção que se localiza em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório é administrado ao indivíduo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação contém um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou contém um segundo polipeptídeo contendo um domínio IgSF de tipo selvagem ou variante do mesmo.
[0085] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, uma proteína imunomoduladora fornecida aqui ou um conjugado aqui fornecido é administrado ao indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora transmembranar é administrado ao indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos proporcionados, uma célula manipulada contendo um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora transmembranar aqui fornecida é administrada ao indivíduo.
[0086] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, um agente infeccioso codificando um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora transmembranar é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula tumoral ou célula imunológica e a proteína imunomoduladora transmembranar é expressa na superfície da célula infec
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42/474 tada.
[0087] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma vasculite associada a anticorpos citoplasmáticos de antineutrófilo (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença gastrointestinal inflamatória, uma doença ocular inflamatória, uma doença neurológica inflamatória, doença pulmonar inflamatória, doença endócrina inflamatória ou doença hematológica autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou condição é selecionada de doença inflamatória do intestino, transplante, doença de Crohn, oolite ulcerativa, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou psoríase. Em algumas de tais modalidades, o CD80 variante é administrada em um formato que diminui uma resposta imunológica no indivíduo.
[0088] Em algumas modalidades, é fornecido um método para tratar uma doença ou condição incluindo a administração de uma proteína imunomoduladora, contendo um polipeptídeo CD80 variante, contendo uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições sin do domínio IgV ou domínio IgC ou uma ligação específica um seu fragmento de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1. Em algumas modalidades, é fornecido um método para mediar o agonismo de CD28 por coestimulação de CD28 dependente de PD-1 em um indivíduo, compreendendo o método administrar uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante,
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43/474 compreendendo o referido polipeptídeo CD80 variante uma ou mais modificações de aminoácidos a uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou no fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PDL1. Em qualquer uma das modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 é aumentada mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
[0089] Em algumas modalidades, o método é para uso no tratamento de uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 avaliada em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antígeno expressando PD-L1, opcionalmente em que o ensaio de estimulação de células T um ensaio in vitro, opcionalmente em que as células T compreendem células Jurkat que expressam um repórter de IL-2 ou células T humanas primárias que produzem citocinas inflamatórias, tal como IL-2.
[0090] Em algumas modalidades dos modos proporcionados, antes da administração, selecionado um indivíduo para tratamento que possui um tumor compreendendo células positivas para a superfície PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positivas para PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor.
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44/474 [0091] Em algumas modalidades, a seleção de um indivíduo compreende (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de PD-L1; (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente, em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies de células positivas para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento.
[0092] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, antes da administração, é selecionado um indivíduo para tratamento que possui um tumor compreendendo superfícies de células positivas para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positiva para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+.
[0093] Em algumas modalidades, a seleção do indivíduo inclui (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de CD28; (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente, em que as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente, em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies de células positivas para CD28, selecionar o indivíduo para tratamento.
[0094] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos de
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45/474 seleção de um indivíduo para tratamento, incluindo os métodos: (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente PD-L1; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tumor compreender um nível detectável de superfície celular positiva para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento com uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, compreendendo o referido polipeptídeo CD80 variante uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou no fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PDL1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
[0095] Em algumas modalidades, os métodos incluem ainda o contato da amostra de tecido tumoral com um reagente de ligação capaz de se ligar especificamente a CD28, em que o indivíduo é selecionado se a amostra de tecido tumoral compreender ainda um nível detectável de linfócitos de infiltração tumoral positivos para CD28, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+.
[0096] Em algumas modalidades, a amostra de tecido tumoral contém células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estromais ou qualquer combinação destas.
[0097] Em algumas modalidades, o reagente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ligando de proteína ou parceiro de ligação, um aptâmero, um afímero, um peptídeo ou um
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46/474 hapteno. Em algumas modalidades, o reagente de ligação é um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o reagente de ligação é um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de ligação.
[0098] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para ligação a PD-L1 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[0099] Em algumas modalidades, o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a uma porção que é uma porção detectável ou uma porção capaz de detecção. Em algumas modalidades, a porção é uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é não humana, opcionalmente é de camundongo ou coelho.
[00100] Em algumas modalidades, a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imuno-histoquímica, pseudo-imunohistoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
[00101] Em algumas modalidades, os métodos incluem ainda a administração da proteína imunomoduladora ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano.
[00102] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreendendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes. Em algumas modalidades, o multímero
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47/474 é um dímero. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais.
[00103] Em algumas modalidades, o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc, opcionalmente uma região Fc variante contendo uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com uma região Fc de tipo selvagem, em que a região Fc exibe uma ou mais funções efetoras que são reduzidas em comparação com a região Fc de tipo selvagem, opcionalmente onde o Fc de tipo selvagem é lgG1 humana.
[00104] Em algumas dessas modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo às posições 7, 12, 13, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,33, 34, 35, 36, 37, 38, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 63, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e/ou 97, com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo CD80 contém uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado de E7D, A12V, T13A, T13R, S15P, C16R, H18L, H18Y, V20A, V20I, V22A., V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, T28Y, R29H, I30T, Y31H, Y31S, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, K37E, M38T, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V, M43I, M43L, M43T, M43V, S44P, D46E, D46V, M47I, M47L, M47T, M48V, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, P51A, Y53F, Y53H, K54R, N55D, N55I, T57I, I58V, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, L65P, I67L, I68T, V68L, V68L, V68M, I69F, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79P, E81G, E81K, C82R, V83A, V83I, V84I, V84I, L85E, L85M,
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L85Q, K86E, K86M, Y87H, Y87N, Y87Q, E88D, E88G, K89E, K89N, D90G, D90N, A91T, A91V, F92L, F92S, F92V, F92Y, K93E, K93R, K93T, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q e L97R, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
[00105] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante retém a ligação a CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante retém pelo menos ou pelo menos cerca de 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20 %, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da afinidade para o ectodomínio de CD28, comparado com a afinidade de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe uma maior afinidade de ligação ao ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Em algumas dessas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
[00106] Em algumas modalidades, o aumento da resposta imunológica trata uma doença ou condição no indivíduo. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, a doença ou patologia é selecionada de melanoma, câncer do pulmão, câncer da bexiga, malignidade hematológica, câncer do fígado, câncer do cérebro, câncer renal, câncer da mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do baço, câncer da próstata, câncer testicular, câncer do ovário, câncer do útero, carcinoma gástrico, um
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49/474 câncer musculoesquelético, um câncer da cabeça e do pescoço, um câncer gastrointestinal, um câncer das células germinativas ou um câncer endócrino e neuroendócrino.
[00107] Em algumas modalidades, é fornecido um método de detecção de um parceiro de ligação a CD80 em uma amostra biológica, compreendendo o método: (a) colocar em contato uma amostra biológica com um reagente de ligação compreendendo qualquer um dos polipeptídeos variantes CD80 aqui proporcionados; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado nas células da amostra biológica. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação é PD-L1, CD28, CTLA-4 ou suas combinações.
[00108] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou no fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe um aumento afinidade de ligação ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
[00109] Em algumas modalidades, a amostra biológica é ou compreende uma amostra de fluido corporal, célula ou tecido, tal como fluido corporal que é soro, plasma ou urina ou uma amostra de tecido que é uma amostra de tecido tumoral. Em algumas modalidades, a amostra de tecido tumoral contém células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estromais ou qualquer combinação destas.
[00110] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de
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50/474 ligação.
[00111] Em algumas modalidades, o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a uma etiqueta que é uma porção detectável ou a uma porção capaz de detecção. Em algumas modalidades, a porção é uma região Fc, que é opcionalmente não humana, tal como uma região Fc de camundongo ou coelho. Em algumas modalidades, a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imunohistoquímica, pseudo-imuno-histoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
Breve Descrição Dos Desenhos [00112] As Figuras 1A-1C representam vários formatos das moléculas do domínio IgSF variante fornecidas. A Figura 1A representa moléculas solúveis, incluindo: (1) um domínio IgSF variante (vlgD) fundido a uma cadeia Fc; (2) uma molécula de pilha contendo um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vlgD) e um segundo domínio IgSF, tal como um segundo domínio IgSF variante (segundo vlgD); (3) uma molécula de IgSF de direcionamento tumoral contendo um primeiro domínio IgSF variante (vlgD) e um domínio IgSF que tem como alvo um antigeno tumoral, tal como um domínio IgK de NKP30; e (4) um domínio IgSF variante (vlgD) ligado a um anticorpo (V-mAb). A Figura 1B representa uma proteína imunomoduladora transmembranar (TIP) contendo um domínio IgSF variante (vlgD) expresso na superfície de uma célula. Em uma modalidade exemplificativa, o parceiro de ligação cognato do vlgD ligado transmembranar é um receptor inibidor (por exemplo, CTLA-4), e o TIP contendo o vlgD (por exemplo, CD80 vlgD) antagoniza ou bloqueia a sinalização negativa do receptor inibidor, resultando em uma célula T ativada ou uma célula T efetora. Em alguns casos, se o agrupamento do receptor inibitório (CTLA-4) estiver próximo de um receptor ativador (por exemplo, CD28), então a atividade agonizante pelo TIP pode ser realizada. A Figura 1C representa
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51/474 uma proteína imunomoduladora secretada (SIP) na qual um domínio IgSF variante (vlgD) secretado a partir de uma célula, tal como uma primeira célula T (por exemplo, célula T CAR). Em uma modalidade exemplificativa, o parceiro de ligação cognato do vlgD secretado é um receptor inibidor (por exemplo, CTLA-4), que pode ser expresso pela primeira célula (por exemplo, célula T, tal como uma célula T CAR) e/ou uma segunda célula (por exemplo, célula T; endógena ou manipulada, como uma célula T CAR). Após ligação do SIP com o seu parceiro de ligação cognato, o SIP antagoniza ou bloqueia a sinalização negativa através do receptor inibidor, resultando assim em uma célula T ativada ou em uma célula T efetora. Em todos os casos, o vlgD pode ser apenas um domínio V (IgV), a combinação do domínio V (IgV) e do domínio C (IgC), incluindo todo o domínio extracelular (ECD), ou qualquer combinação de domínios Ig do membro da superfamília IgSF.
[00113] A Figura 2 representa um esquema exemplificativo da atividade de um domínio IgSF variante (vlgD) fundido a um Fc (vlgD-Fc) em que o vlgD é uma variante de um domínio IgSF de CD80. Como mostrado, um vlgD solúvel de CD80 interage com seus parceiros de ligação cognatos para bloquear a interação de CD80 com CTLA-4, bloqueando assim o receptor inibidor de CTLA-4 e, em alguns casos, permitindo que a célula T se diferencie em um fenótipo efetor.
[00114] A Figura 3A representa um esquema exemplificativo da atividade de um domínio IgSF variante (vlgD) - conjugado com um Fc no qual o CD80-Fc afeta a atividade agonista de CD28 dependente de PD-L1. Como mostrado, a ligação do CD80-Fc a PD-L1, expressa na superfície de uma célula tumoral, pode impedir a associação do PD-L1 na célula tumoral e o receptor PD-1 inibitório, expresso na superfície de uma célula T. Adicionalmente, o CD80-Fc está disponível para ligar o receptor CD28 coestimulatório nas superfícies de uma célula T, localizando assim a célula T ao tumor enquanto promove a ativação de
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52/474 células T por meio da coestimulação CD28 do sinal de TCR.
[00115] A Figura 3B representa um esquema exemplificador da atividade de um domínio IgSF variante de CD80 (vlgD), conjugado com um Fc, em que o CD80-Fc bloqueia a atividade inibidora de CTLA-4. Como mostrado, a ligação do CD80 vlgD-Fc a CTLA-4, expressa na superfície de células T (por exemplo, células Treg e Tef), antagonizando assim a ligação de CTLA-4 aos seus parceiros de ligação cognatos CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), indicado como B7, e bloqueando a sinalização inibitória de CTLA-4, reduzindo o limiar de sinalização de TCR e promovendo a ativação de células T.
[00116] A Figura 4 representa um esquema exemplificativo de uma molécula de pilha que é um antagonista de pontos de checagem multialvo contendo um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vlgD) que é um vlgD PD-L1 ou PD-L2 e um segundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo vlgD) que se liga a um segundo receptor inibitório. No esquema exemplificativo, o segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo vlgD) é um CD80 vlgD. Como mostrado, o primeiro vlgD e o segundo vlgD interagem com seus parceiros de ligação cognatos para bloquear interações de PD-L1 ou PD-L2 com PD-1 e CD80 com receptores inibidores de CTLA-4, respectivamente.
[00117] A Figura 5 representa um esquema exemplificativo de uma molécula de pilha para localizar a IgSF variante (vlgD) em uma célula tumoral. Neste formato, a molécula de pilha contém um primeiro domínio de IgG variante (primeiro vlgD) e um segundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo vlgD) em que o segundo domínio IgSF (por exemplo, um segundo vlgD) é um domínio IgSF dirigido a tumor que se liga a um antígeno tumoral. Um exemplo de domínio IgSF dirigido a tumor é um domínio IgSF de NKp30, que se liga ao antígeno tumoral B7-H6. Nesta descrição, o primeiro domínio IgSF variante (vlgD) é uma variante de um domínio IgSF de CD80. Como mostrado, a ligação
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53/474 do domínio IgSF dirigido ao tumor à superfície da célula tumoral localiza o primeiro domínio IgSF variante na superfície da célula tumoral onde pode interagir com um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos expressos na superfície de uma célula imunológica adjacente (por exemplo, célula T) para antagonizar o receptor inibidor cognato CTLA-4.
[00118] A Figura 6A representa várias configurações exemplificativas de uma molécula de pilha contendo um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vlgD) e um segundo domínio IgSF, tal como um segundo domínio IgSF variante (segundo vlgD). Como mostrado, o primeiro domínio IgG e segundo domínio IgSF estão independentemente ligados, direta ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Para gerar uma molécula Fc homodimérica, a região Fc é aquela que é capaz de formar um homodímero com uma região Fc compatível por coexpressão das regiões Fc individuais em uma célula. Para gerar uma molécula Fc heterodimérica, as regiões Fc individuais contêm mutações (por exemplo, mutações knob-into-hole no domínio CH3), de tal forma que a formação do heterodímero seja favorecida em comparação com os homodímeros quando as regiões Fc individuais são coexpressas em uma célula.
[00119] A Figura 6B representa várias configurações exemplificativas de uma molécula de pilha contendo um primeiro domínio IgSF variante (primeiro vlgD), um segundo domínio IgSF, tal como um segundo domínio IgSF variante (segundo vlgD) e um terceiro domínio IgSF, tal como um terceiro domínio IgSF variante (terceiro vlgD). Como mostrado, o primeiro domínio IgGD, segundo domínio IgSF e terceiro domínio IgSF estão independentemente ligados, direta ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Para gerar uma molécula Fc homodimérica, a região Fc é aquela que é capaz de formar um homodímero com uma região Fc compatível por coexpressão das regiões Fc
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54/474 individuais em uma célula.
[00120] A Figura 7 representa um esquema exemplificativo da atividade de um domínio IgSF variante (vlgD) - conjugado com um anticorpo (V-Mab) em que o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-HER2) se liga a um antigeno na superfície da célula tumoral para localizar o vlgD na célula. Como mostrado, a ligação do anticorpo à superfície da célula tumoral localiza o vlgD na superfície da célula tumoral onde pode interagir com um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos expressos na superfície de uma célula imunológica adjacente (por exemplo, célula T) para agonizar ou antagonizar a sinalização do receptor. Em uma modalidade exemplificativa como mostrado, o domínio IgSF variante (vlgD) uma variante de um domínio de IgSO de CD80 que se liga, tal como tem maior afinidade para, ao receptor inibidor CTLA-4. A ligação do CD80 vlgD ao receptor inibidor de CTLA-4 antagoniza ou bloqueia a sinalização negativa do receptor inibidor, desse modo resultando em uma célula T ativada ou em uma célula T efetora. Em alguns casos, se o agrupamento do receptor inibitório (CTLA-4) for proximal a um receptor ativador (por exemplo, CD28), então a agonização da atividade do receptor inibidor pelo TIP pode ser realizada.
[00121] As Figuras 8A-8C descrevem várias configurações exemplificativas de um conjugado de anticorpo IgSF variante (V-Mab). A Figura 8A mostra várias configurações em que um domínio IgSF variante está ligado, direta ou indiretamente, ao terminal N e/ou C da cadeia leve de um anticorpo. A Figura 8B mostra várias configurações em que um domínio IgSF variante está ligado, direta ou indiretamente, ao terminal N e/ou C da cadeia pesada de um anticorpo. A Figura 8C representa os resultados das configurações V-Mab quando uma cadeia leve da Figura 8A e uma cadeia pesada da Figura 8B são coexpressas em uma célula.
[00122] A Figura 9A representa a ligação de variantes CD80 IgV-Fc
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55/474 exemplificativas a ligandos PD-L1, CD28 e CTL44 expressos na superfície celular.
[00123] A Figura 9B descreve coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 dependente da dose em uma linha de repórter Jurkat/IL-2 induzida por variantes de CDV IgV-Fc exemplificativas.
[00124] A Figura 9C representa a produção de citocinas de células T primárias humanas após coestimulação dependente de PD-L1 induzida por variantes de IgV-Fc CD80 exemplificativas.
[00125] A Figura 9D representa a capacidade de candidatos de CD80 IgV-Fc exemplificativos se ligarem a PD-L1 e bloquearem a ligação PD-1 conjugada com fluorescência.
[00126] A Figura 9E representa a interação PD-1/PD-L1 e subsequente atividade antagonista da atividade funcional de variantes de CD80-Fc variante exemplificativas.
[00127] A Figura 10 representa a atividade antitumoral in vivo de polipeptídeos CD80 variantes exemplificativos fundidos a lgG1 Fc de tipo selvagem (WT Fc) ou IgG 1 Fc inerte (Fc inerte).
[00128] A Figura 11 representa os volumes de tumor mediano (painel esquerdo) e médio (painel direito) em um modelo de camundongo após tratamento com 50 pg, 100 pg e 500 pg de uma variante de CD80 IgV-Fc (inerte) exemplificativa e 100 de anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab).
[00129] A Figura 12 representa a concentração de IFNy em lisados de tumor hPD-L1MC38 após tratamento in vivo com 50 pg, 100 pg e 500 pg de uma variante exemplificativa de CD80 IgV-Fc (inerte) e 100 pg de anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab).
[00130] A Figura 13 representa os volumes tumorais mediano (painel esquerdo) e médio (painel direito) em um modelo de camundongo após tratamento com múltiplas variantes de CD80 IgV-Fc (inertes) e anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab).
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56/474 [00131] A Figura 14 representa os volumes do tumor mediano (painel esquerdo) e médio (painel direito) em camundongos, designados pós-tratamento isento de tumor com variantes de CD80 IgV-Fc (inerte) e anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab), após desafio com células tumorais huPD-L1/MC38.
[00132] A Figura 15 representa a detecção de Fc de controle negativo ligado, Fc variante de CD80 e anticorpo anti-PD-L1 por citometria de fluxo em suspensões de células únicas de células tumorais negativas de CD45 vivas (CD45 neg.; CD45).
[00133] A Figura 16 representa os volumes de tumor mediano (painel esquerdo) e médio (painel direito) em um modelo de camundongo após o tratamento com uma variante exemplificativa do anticorpo CD80 IgV-Fc (inerte) e anti-PD-L1 (durvalumab).
[00134] As Figuras 17A e 17B representam a percentagem de células CD8 detectadas por citometria de fluxo no linfonodo (A) drenante do tumor e no tumor (B) de camundongos tratados com Fc de controle negativo, Fc variante de CD80 e anticorpo anti-PD-L1.
[00135] A Figura 17C representa a percentagem de reagentes detectados com Fc anti-humano em tumores negativos para CD45 tratados in vivo com Fc de controle negativo, IgV de CD80-Fc e anticorpo anti-PD-L1 humano.
[00136] A Figura 18 representa atividade citotóxica específica de variantes CD80 de IgV-Fc contra células de tumor MC38 transduzidas com huPD-L1, mas MC38 parentais não transduzidas, demonstrando morte específica de huPDLI.
[00137] As Figuras 19A e B representam a ligação das variantes de CD80 IgV-Fc a células T humanas primárias (A) e monócitos humanos primários (B).
[00138] A Figura 20 representa o antagonismo da variante de CD80 IgV-Fc do recrutamento de SHP-2 mediado por PD-L1 para PD
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57/474 utilizando um ensaio de complementação enzimática.
[00139] A Figura 21 representa o antagonismo da variante de CD80 IgV-Fc da ligação CD80/CTLA-4.
Descrição Detalhada [00140] São aqui fornecidas proteínas imunomoduladoras que são ou contêm variantes ou mutantes de CD80 e fragmentos de ligação específica dos mesmos que exibem atividade de ligação ou afinidade alterada a pelo menos um parceiro de ligação cognato do ligando-alvo (também denominado proteína de ligando de contraestrutura). Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes contêm uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições de aminoácidos) em comparação com um polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes contêm uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação com um polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos estão em um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem.
[00141] Em algumas modalidades, a atividade de ligação alterada, tal como afinidade de ligação e/ou seletividade de ligação, por exemplo, maior ou menor afinidade ou seletividade de ligação, é para pelo menos uma proteína parceira de ligação CD28, PD-L1 ou CTLA-4. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes exibem atividade de ligação ou afinidade alterada ou aumentada a um ou mais CD28, PD-L1 ou CTLA-4 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem que não contém a uma ou mais modificações.
[00142] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes exibem uma afinidade de ligação aumentada a CTLA-4 e/ou PD-L1 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem que não
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58/474 contém uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes exibem uma afinidade de ligação diminuída para CD28 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem que não contém uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes exibem uma afinidade de ligação aumentada a um ou a ambos CTLA-4 e PD-L1 e diminuem a afinidade de ligação a CD28 comparativamente com o CD80 não modificado ou selvagem que não contém uma ou mais modificações.
[00143] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados apresentam seletividade aumentada para ligação a CTLA-4 versus CD28 em comparação com a seletividade do CD80 não modificado ou de tipo selvagem que não contém as mais uma modificação para ligação a CTLA-4 versus CD28. A seletividade aumentada pode ser caracterizada como uma razão maior de ligação, por exemplo, afinidade de ligação, do polipeptídeo CD80 variante para CTLA-4 versus CD28 comparado à razão de ligação, por exemplo, afinidade de ligação, do CD80 não modificado ou de tipo selvagem para ligação de CTLA-4 versus CD28. Em algumas modalidades, a razão é aumentada mais ou mais que cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 6,0 vezes, 7,0 vezes, 8,0 vezes, 9,0 vezes, 10,0 vezes, 15,0 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[00144] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados apresentam seletividade aumentada para ligação a PD-L1 versus CD28 em comparação com a seletividade do CD80 não modificado ou de tipo selvagem que não contém as mais uma modificação para ligação a PD-L1 versus CD28. A seletividade aumentada pode ser caracterizada como uma razão maior de ligação, por exemplo, afinidade de ligação, do polipeptídeo CD80 variante para PDL1 versus CD28 em comparação com a razão de ligação, por exemplo,
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59/474 afinidade de ligação, do CD80 não modificado ou de tipo selvagem ligação de PD-L1 versus CD28. Em algumas modalidades, a razão é aumentada mais ou mais que cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 6,0 vezes, 7,0 vezes, 8,0 vezes, 9,0 vezes, 10,0 vezes, 15,0 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[00145] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras são solúveis. Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras são proteínas imunomoduladoras transmembranares capazes de serem expressas na superfície das células. Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras são proteínas imunomoduladoras secretáveis capazes de serem segregadas a partir de uma célula na qual são expressas. Em algumas modalidades, também são fornecidas aqui uma ou mais outras proteínas imunomoduladoras que são conjugados ou fusões contendo um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido e uma ou mais outras unidades ou polipeptídeos. Em alguns aspectos, são fornecidas células manipuladas contendo as proteínas imunomoduladoras transmembranares ou proteínas imunomoduladoras secretáveis. Em alguns aspectos, são proporcionados agentes infecciosos capazes de entregar a expressão das proteínas imunomoduladoras transmembranares ou proteínas imunomoduladoras secretáveis em uma célula na qual o agente infeccioso infecta. Em algumas modalidades, também são fornecidas aqui uma ou mais outras proteínas imunomoduladoras que são conjugados ou fusões contendo um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido e uma ou mais outras unidades ou polipeptídeos.
[00146] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes e as proteínas imunomoduladoras modulam uma resposta imunológica, tal como aumentar ou diminuir uma resposta imunológica. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes e proteínas
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60/474 imunomoduladoras aqui proporcionados podem ser utilizados para o tratamento de doenças ou condições que estão associadas a uma resposta imunológica desregulada.
[00147] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes proporcionados modulam a ativação, expansão, diferenciação e sobrevivência das células T através de interações com moléculas sinalizadoras coestimuladoras. Em geral, a ativação de células T específicas para antígenos geralmente requer dois sinais distintos. O primeiro sinal é fornecido pela interação do receptor de células T (TCR) com os principais antígenos associados ao complexo de histocompatibilidade (MHC) presentes nas células apresentadoras de antígenos (APCs). O segundo sinal é coestimulatório, por exemplo, um sinal coestimulatório de CD28, para o acoplamento de TCR e necessário para evitar a apoptose ou anergia de células T.
[00148] Em algumas modalidades, sob condições fisiológicas normais, a resposta imunológica mediada por células T iniciada por reconhecimento de antígeno pelo receptor de células T (TCR) e regulada por um equilíbrio de sinais coestimuladores e inibidores (por exemplo, proteínas de checagem imunológica).O sistema imunológico baseia-se em pontos de checagem imunológicos para evitar a autoimunidade (ou seja, a autotolerância) e proteger os tecidos contra danos excessivos durante uma resposta imunológica, por exemplo, durante um ataque contra uma infecção patogênica. Em alguns casos, no entanto, essas proteínas imunomoduladoras podem ser desreguladas em doenças e condições, incluindo tumores, como mecanismo de evasão do sistema imunológico.
[00149] Em algumas modalidades, entre os receptores coestimulatórios de células T conhecidos o CD28, que o receptor coestimulatório de células T para os ligandos B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), ambos presentes nas APCs. Estes mesmos ligandos podem também ligar-se ao
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61/474 receptor de células T inibidor CTLA4 (proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos) com maior afinidade do que para CD28; a ligação ao CTLA4 atua para diminuir a resposta imunológica.
[00150] Em algumas modalidades, o CD80 é capaz de se ligar ao ligando de morte programado 1 (PD-L1). O CD80 tem uma afinidade semelhante à do PD-L1 em relação ao CD28. PD-L1 é um dos dois ligantes para o receptor imune inibitório, morte programada 1 (PD-1).A interação de PD-L1 com PD-1 regula negativamente a atividade imunológica, promovendo a inativação de células T e modulando negativamente a atividade das células T. A expressão de PD-1 nas células T pode ser induzida após as células T terem sido ativadas como uma estratégia para evitar o excesso de atividade das células T. Muitas células tumorais expressam PD-L1 na sua superfície, levando potencialmente a interações PD-1/PD-L1 e à inibição das respostas das células T contra o tumor. A ligação de CD80 a PD-L1 pode bloquear a interação entre PD-L1 e PD-1 e, desse modo, impedir a inibição de respostas de células T, por exemplo, no local de um tumor e potenciar eficazmente ou aumentar a resposta imunológica. Ao mesmo tempo, no entanto, o CD80 também pode estar disponível para se ligar aos receptores CD28 ou CTLA4 e estar envolvido na indução ou inibição das respostas das células T. Assim, em alguns casos, as interações de CD80 com PD-L1, CD28 e CTLA-4 podem produzir efeitos sobrepostos e complementares. Em algumas modalidades, CD28 e PD-L1 podem desempenhar papéis complementares na modelagem de uma resposta imunológica.
[00151] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 ou proteínas imunomoduladoras variantes modulam (por exemplo, aumentam ou diminuem) a atividade imunológica induzida ou associada ao receptor inibidor CTLA-4, ao complexo regulador negativo PD-L1/PD-1 e/ou ao receptor coestimulatório CD28. Por exemplo, em algumas modali
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62/474 dades, os polipeptídeos CD80 fornecidos, por exemplo, formas solúveis dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, ligam o receptor inibidor de CTLA-4, bloqueando a sua interação com CD80, expresso em uma APC, impedindo assim a sinalização reguladora negativa de o receptor de CTLA-4 ligado a CD80 como representado na Figura 2. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 fornecidos, por exemplo, formas solúveis dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, são capazes de se ligar à PD-L1 em uma célula tumoral ou APC, bloqueando desse modo a interação do PD-L1 e da inibição do receptor PD-1, impedindo assim a sinalização reguladora negativa que teria resultado da interação PD-L1/PD-1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 fornecidos, por exemplo, formas solúveis dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, podem bloquear a interação PD-L1/PD-1 enquanto, ligando e coestimulando um receptor CD28 em uma célula T localizada, promovendo desse modo uma resposta imunológica (Figura 3A). Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 fornecidos, por exemplo, formas solúveis dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, podem antagonizar a ligação de B7/CTLA-4, impedindo a sinalização inibitória de CTLA-4, reduzindo o limiar de sinalização de TCR, promovendo assim a ativação de células T e resposta imunológica (Figura 3B). Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variante fornecidos podem ser empilhados ou conjugados com outros polipeptídeos imunomoduladores para modular adicionalmente a atividade imunológica (Figura 4) ou empilhados ou conjugados com moléculas alvo para localizar a atividade imunológica (Figura 5 e Figura 7). Assim, em algumas modalidades, os polipeptídeos fornecidos ultrapassam estas restrições fornecendo variantes CD80 com afinidades de ligação independentes a CTLA-4 e/ou PD-L1 e, em alguns casos, CD28, agonizando ou antagonizando assim os efeitos complementares de coestimulação por re
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63/474 ceptores. Métodos de criação e uso dessas variantes CD80 também são fornecidos.
[00152] Também são fornecidos vários formatos dos polipeptídeos variantes fornecidos. Como mostrado aqui, formatos alternativos podem facilitar a manipulação da resposta imunológica e, portanto, a aplicação terapêutica. A capacidade para formatar os polipeptídeos variantes em várias configurações para, dependendo do contexto, antagonizar ou agonizar uma resposta imunológica, oferece flexibilidade em aplicações terapêuticas baseadas na mesma ligação aumentada e atividade de um CD80 variante para parceiros de ligação. Como exemplo, as proteínas CD80 variantes de amarração a uma superfície podem fornecer um sinal costimulatório localizado, enquanto, em outros casos, apresentar CD80 em uma forma solúvel não localizada confere atividade antagônica. Por exemplo, a distribuição de proteína CD80 aumentada em formatos solúveis com afinidade aumentada para CTLA-4 e/ou PD-L1 pode antagonizar a sinalização de um receptor inibidor, tal como bloquear um sinal inibitório na célula que pode ocorrer para diminuir a resposta a um estímulo de ativação, por exemplo, sinal costimulatório CD3 e/ou CD28 ou um sinal mitogênico. Em alguns casos, o resultado disso pode ser aumentar a resposta imunológica.
[00153] Além disso, certos formatos, em alguns casos, também podem mediar o agonismo do CD28. Em alguns casos, o agonismo CD28 é mediado por certos polipeptídeos CD80 variantes, exibindo uma ligação aumentada à PD-L1, facilitando assim a ligação ou reticulação da molécula CD80 variante a uma superfície na sinapse imunológica para interação com CD28, facilitando assim a ativação das células T, proporcionando um sinal coestimulatório. Esta atividade, aqui designada como coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, devese, em alguns aspectos, à capacidade de um polipeptídeo CD80 vari
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64/474 ante se ligar tanto a PD-L1 como a CD80 de uma forma não competitiva e/ou ao fornecimento de um formato dimérico de um polipeptídeo CD80 variante (ver, por exemplo, a Figura 3). Em alguns casos, tal coestimulação dependente de PD-L1 não requer um Fc com função efetora e pode ser mediada por uma proteína de fusão Fc contendo uma molécula Fc sem agente ou inerte. Em alguns aspectos, a fixação ou reticulação também, adicionalmente ou alternativamente, pode ser conseguida através do receptor Fc quando um polipeptídeo CD80 variante é fornecido como uma proteína de fusão com uma região Fc de tipo selvagem de uma imunoglobulina que retém ou exibe função efetora, aqui designada como coestimulação de CD28 dependente do receptor de Fc. Em alguns aspectos, a reticulação do receptor Fc pode iniciar funções efetoras mediadas por anticorpos dependentes de anticorpos (ADCC) e, portanto, efetuar a depleção de células-alvo expressando o parceiro de ligação cognato, como células que expressam CTLA-4 (por exemplo, CTLA-4- expressando células T reguladoras) ou células que expressam PD-L1 (por exemplo, tumores PD-L1hi).
[00154] O aumento ou supressão da atividade destes receptores tem significado clínico para o tratamento de distúrbios inflamatórios e autoimunes, câncer e infecções virais. Em alguns casos, no entanto, as terapias para intervir e alterar os efeitos coestimulatórios de ambos os receptores são limitadas pelos requisitos de orientação espacial, bem como pelas limitações de tamanho impostas pelos limites da sinapse imunológica. Em alguns aspectos, os fármacos terapêuticos existentes, incluindo fármacos de anticorpos, podem não ser capazes de interagir simultaneamente com as múltiplas proteínas-alvo envolvidas na modulação dessas interações. Além disso, em alguns casos, os medicamentos terapêuticos existentes podem ter apenas a capacidade de antagonizar, mas não de agonizar, uma resposta imunológica. Adicionalmente, as diferenças farmacocinéticas entre fármacos que
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65/474 visam independentemente um ou outro destes dois receptores podem criar dificuldades na manutenção adequada de uma concentração sanguínea desejada de tais combinações de fármaco ao longo do curso do tratamento. Os polipeptídeos CD80 variantes e as proteínas imunomoduladoras fornecidos, e outros formatos como descrito, referem-se a tais problemas.
[00155] Todas as publicações, incluindo patentes, pedidos de patentes, artigos científicos e bases de dados, mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os efeitos na mesma medida como se cada publicação individual, incluindo patente, pedido de patente, artigo científico ou base de dados, fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Se uma definição aqui estabelecida é contrária ou inconsistente com uma definição estabelecida nas patentes, aplicações, pedidos publicados e outras publicações que são aqui incorporadas por referência, a definição aqui estabelecida prevalece sobre a definição que é aqui incorporada por referência.
[00156] Os cabeçalhos de seção usados aqui são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.
I. DEFINIÇÕES [00157] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos técnicos e científicos ou terminologia aqui utilizados têm a intenção de ter o mesmo significado como é vulgarmente entendido por um versado na técnica ao qual o objeto reivindicado se refere. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para clareza e/ou para referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica.
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66/474 [00158] Os termos utilizados ao longo deste relatório descritivo são definidos da seguinte forma, salvo limitação em contrário em instâncias específicas. Como usado na especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma e o/a incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. A menos que definido de outro modo, todos os termos, acrônimos e abreviaturas técnicas e científicas aqui utilizados têm o mesmo significado que é geralmente entendido por um versado na técnica à qual a invenção pertence. Salvo indicação em contrário, as abreviaturas e símbolos para nomes químicos e bioquímicos são indicados por nomenclatura IUPAC-IUB. Salvo indicação em contrário, todos os intervalos numéricos incluem os valores que definem o intervalo, bem como todos os valores inteiros entre eles.
[00159] O termo afinidade modificada como usado no contexto de um domínio de superfamília de imunoglobulina, significa um domínio de superfamília de imunoglobulina de mamífero (IgSF) tendo uma sequência de aminoácidos alterada (relativa ao correspondente domínio IgSF parental ou não modificado do tipo selvagem) tal que uma afinidade de ligação aumentada ou diminuída ou avidez a pelo menos um dos seus parceiros de ligação cognatos (alternativamente contraestruturas) em comparação com o domínio de controle de IgSF parental de tipo selvagem ou não modificado (isto é, não modificado por afinidade). Incluído neste contexto está um domínio IgSF CD80 modificado por afinidade. Em algumas modalidades, o domínio IgSF modificado por afinidade pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais diferenças de aminoácidos, tais como substituições de aminoácidos, em um domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado. Um aumento ou diminuição na afinidade de ligação ou avidez pode ser determinado utilizando ensaios de ligação bem conhecidos, tais como citometria de
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67/474 fluxo. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443453 (2005). Veja-se também, Linsley et al., Immunity, Vol. 1 (9: 793801 (1994). Um aumento na afinidade de ligação de uma proteína ou avidez ao seu parceiro (ou parceiros) de ligação cognato a urn valor pelo menos 10% maior do que o do controle do domínio IgSF do tipo selvagem e em algumas modalidades, pelo menos 20%, 30%, 40 %, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1.000%, 5.000% ou 10.000% maior do que o valor de controle do domínio IgSF do tipo selvagem. Uma diminuição na afinidade de ligação de uma proteína ou avidez a pelo menos um dos seus parceiros de ligação cognatos em um valor não superior a 90% do controle, mas não inferior a 10% do valor de controle do domínio IgSF do tipo selvagem e, em algumas modalidades, não superior a 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30% ou 20%, mas não inferior a 10% do valor de controle do domínio IgSF do tipo selvagem. Uma proteína modificada por afinidade é alterada na sequência primária de aminoácidos por substituição, adição ou eliminação de resíduos de aminoácidos. O termo domínio IgSF modificado por afinidade não deve ser interpretado como impondo qualquer condição para qualquer composição ou método inicial particular pelo qual o domínio IgSF modificado por afinidade foi criado. Assim, os domínios de IgSF modificados por afinidade da presente invenção não estão limitados aos domínios de IgSF de tipo selvagem que são então transformados em um domínio IgSF modificado por afinidade por qualquer processo particular de modificação de afinidade. Um polipeptídeo do domínio IgSF modificado por afinidade pode, por exemplo, ser gerado partindo da informação da sequência do domínio IgSF de mamífero selvagem, depois modelado em silica para ligação ao seu parceiro de ligação cognato e finalmente sintetizado de modo recombinante ou quico para produzir a composição do domínio IgSF modificado por afinidade de importam. Em apenas um exemplo alternativo, pode ser criado um
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68/474 domínio IgSF modificado por afinidade por mutagênese dirigida ao local de um domínio IgSF de tipo selvagem. Assim, o domínio IgSF modificado por afinidade denota um produto e não necessariamente um produto produzido por qualquer processo dado. Pode ser utilizada uma variedade de técnicas, incluindo métodos recombinantes, síntese química ou suas combinações.
[00160] O termo alogênico, tal como é aqui utilizado, significa uma célula ou tecido que é removido de um organismo e, em seguida, transferido ou transferido adotivamente para um organismo geneticamente diferente da mesma espécie. Em algumas modalidades da invenção, a espécie é murina ou humana.
[00161] O termo autólogo como usado aqui significa uma célula ou tecido que é removido do mesmo organismo para o qual é posteriormente infundido ou transferido de forma adotiva. Uma célula ou tecido autólogo pode ser alterado, por exemplo, por metodologias de DNA recombinante, de tal modo que já não é geneticamente idêntico à célula nativa ou tecido nativo que é removido do organismo. Por exemplo, uma célula T autóloga nativa pode ser geneticamente modificada por técnicas de DNA recombinante para se tornar uma célula autóloga manipulada expressando uma proteína imunomoduladora transmembranar e/ou um receptor de antígeno quimérico (CAR), que em alguns casos envolve a engenharia de uma célula T ou TIL (linfócito infiltrante tumoral). As células manipuladas são então infundidas em um paciente cuja célula T nativa foi isolada. Em algumas modalidades, o organismo é humano ou murino.
[00162] Os termos afinidade de ligação e avidez de ligação, como aqui utilizados, significam a afinidade de ligação específica e a avidez de ligação específica, respectivamente, de uma proteína para a sua contraestrutura sob condições de ligação específicas. Na cinética bioquímica, a avidez refere-se à força acumulada de múltiplas afinida
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69/474 des de interações individuais de ligação não covalente, tais como entre CD80 e suas contraestruturas PD-L1, CD28 e/ou CTLA-4. Como tal, a avidez é distinta da afinidade, que descreve a força de uma única interação. Um aumento ou atenuação na afinidade de ligação de um CD80 variante contendo um domínio lg80 CD850 modificado por afinidade para a sua contraestrutura é determinada em relação à afinidade de ligação do CD80 não modificado, tal como um CD80 não modificado contendo o domínio IgSF nativo ou selvagem, como o domínio IgV. Os métodos para determinar a afinidade ou avidez de ligação são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Larsen et al., American Journal of Transplantation, vol. 5: 443-453 (2005). Em algumas modalidades, um CD80 variante, tal como contendo um domínio IgSF modificado por afinidade, liga-se especificamente a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 medido por citometria de fluxo com uma afinidade de ligação que produz um valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior que um controle de CD80 não modificado em um ensaio de ligação tal como descrito no Exemplo 6.
[00163] O termo meia-vida biológica refere-se à quantidade de tempo que uma substância, como um polipeptídeo imunomodulador contendo um polipeptídeo CD80 variante da presente invenção, demora a perder metade da sua atividade ou concentração farmacológica ou fisiológica. A meia-vida biológica pode ser afetada pela eliminação, excreção, degradação (por exemplo, enzimática) da substância, ou absorção e concentração em certos órgãos ou tecidos do corpo. Em algumas modalidades, a meia-vida biológica pode ser avaliada determinando o tempo que leva para a concentração no plasma sanguíneo da substância atingir metade do seu nível de estado estacionário (meia-vida plasmática). Os conjugados que podem ser utilizados para derivar e aumentar a meia-vida biológica dos polipeptídeos da in
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70/474 venção são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), hidroxietilamido (HES), XTEN (peptídeos recombinantes estendidos (WQ2013130683), albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), lipídeos (acilação) e poli-ProAla-Ser (PAS), ácido poliglutâmico (glutamilação).
[00164] O termo receptor de antigeno quimérico ou CAR, como usado aqui, refere-se a uma proteína transmembranar artificial (isto é, artificial) expressa em uma célula de mamífero contendo pelo menos um ectodomínio, uma transmembrana e um endodomínio. Opcionalmente, a proteína CAR inclui um espaçador que liga covalentemente o ectodomínio ao domínio transmembrana. Um espaçador é frequentemente um polipeptídeo que liga o ectodomínio ao domínio transmembranar através de ligações peptídicas. O CAR é tipicamente expresso em um linfócito de mamíferos. Em algumas modalidades, o CAR é expresso em uma célula de mamífero, tal como uma célula T ou um linfócito infiltrante de tumor (TIL). Um CAR expresso em uma célula T é referido aqui como uma célula T-CAR ou CAR-T. Em algumas modalidades, a CAR-T uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica, uma célula T natural killer, uma célula T de memória, uma célula T reguladora ou uma célula T gama delta. Quando utilizado clinicamente em, por exemplo, transferência celular adotiva, uma CAR-T com especificidade de ligação ao antigeno ao tumor do paciente é tipicamente modificada para expressar em uma célula T nativa obtida do paciente. A célula T manipulada expressando o CAR é então infundida de volta no paciente. O CAR-T é assim, frequentemente, um CAR-T autólogo, embora os CAR-Ts alogênicos estejam incluídos no âmbito da invenção. O ectodomínio de um CAR contém uma região de ligação ao antigeno, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo (por exemplo, scFv), que se liga especificamente sob condições fisiológicas com um antígeno-alvo, tal como um antigeno
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71/474 específico de tumor após ligação específica a uma cadeia bioquímica de eventos (isto é, transdução de sinal) resulta na modulação da atividade imunológica do CAR-T. Assim, por exemplo, após ligação específica pela região de ligação ao antígeno do CAR-T ao seu antígenoalvo pode levar a alterações na atividade imunológica da atividade das células T como refletido por alterações na citotoxicidade, proliferação ou produção de citocinas. A transdução de sinal após ativação de CAR-T é realizada em algumas modalidades pela cadeia CD3-zeta (CD3-z) que está envolvida na transdução de sinal em células T de mamífero nativas. CAR-Ts podem ainda conter múltiplos domínios de sinalização tais como CD28, 41 BB ou 0X40, para modular ainda mais a resposta imunomoduladora da célula-T. O CD3-z contém um motivo conservado conhecido como um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) que está envolvido na transdução de sinal do receptor de célula T.
[00165] O termo coletivamente ou coletivo quando usado em referência à produção de citocinas induzida pela presença de dois ou mais polipeptídeos CD80 variantes em um ensaio in vitro, significa o nível geral de expressão de citocinas independentemente da produção de citocinas induzida pelos polipeptídeos CD80 variantes individuais. Em algumas modalidades, a citocina a ser testada é IFN-gama em um ensaio de células T primárias in vitro tal como descrito no Exemplo 7. [00166] O termo parceiro de ligação cognato (usado alternadamente com contraestrutura) em referência a um polipeptídeo, como em referência a um domínio IgSF de um CD80 variante, refere-se a pelo menos uma molécula (tipicamente uma proteína nativa de mamífero) à qual o polipeptídeo referenciado liga-se especificamente sob condições de ligação específicas. Em alguns aspectos, um CD80 variante contendo um domínio IgSF modificado por afinidade liga-se especificamente à contraestrutura do correspondente CD80 nativo ou sel
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72/474 vagem, mas com afinidade aumentada ou atenuada. Uma espécie de ligando reconhecida e especificamente ligada ao seu receptor cognato sob condições de ligação específicas é um exemplo de uma contraestrutura ou parceiro de ligação cognato desse receptor. Um parceiro de ligação à superfície celular cognato é um parceiro de ligação cognato expresso na superfície celular de um mamífero. Uma espécie molecular da superfície celular é um parceiro de ligação cognato de ligantes da sinapse imunológica (IS), expressa em células e por células, tais como células de mamíferos, formando a sinapse imunológica.
[00167] Como aqui utilizado, conjugado, conjugação ou suas variações gramaticais referem-se à junção ou ligação de dois ou mais compostos resultando na formação de outro composto, por qualquer método de união ou ligação conhecido na técnica. Pode também referir-se a um composto que é gerado pela junção ou ligação de dois ou mais compostos. Por exemplo, um polipeptídeo CD80 variante ligado direta ou indiretamente a uma ou mais porções químicas ou polipeptídeo é um conjugado exemplificative. Tais conjugados incluem proteínas de fusão, aquelas produzidas por conjugados químicos e aquelas produzidas por quaisquer outros métodos.
[00168] O termo ligação competitiva como aqui utilizado significa que uma proteína é capaz de se ligar especificamente a pelo menos dois parceiros de ligação cognatos, mas que a ligação específica de um parceiro de ligação cognato inibe, tal como previne ou impede a ligação simultânea do segundo parceiro de ligação cognato. Assim, em alguns casos, não é possível que uma proteína ligue os dois parceiros de ligação cognatos ao mesmo tempo. Geralmente, os fichários competitivos contêm o mesmo ou o site de ligação sobreposto para uma ligação específica, mas isso não é um requisito. Em algumas modalidades, a ligação competitiva provoca uma inibição mensurável (parcial ou completa) da ligação específica de uma proteína a um dos seus
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73/474 parceiros de ligação cognatos devido à ligação específica de um segundo parceiro de ligação cognato. Sabe-se que uma variedade de métodos quantifica a ligação competitiva, tal como ensaios ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima).
[00169] O termo substituição conservativa de aminoácido como aqui utilizado significa uma substituição de aminoácido na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos conservatives de substituição de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
[00170] O termo correspondente a com referência a posições de uma proteína, tal como a recitação de que nucleotídeos ou posições de aminoácidos correspondem a nucleotídeos ou posições de aminoácidos em uma sequência divulgada, tal como apresentado na Listagem de Sequências, refere-se a nucleotídeos ou posições de aminoácidos identificadas após alinhamento com a sequência divulgada com base no alinhamento de sequências estruturais ou utilizando um algoritmo de alinhamento padrão, tal como o algoritmo GAP. Por exemplo, os resíduos correspondentes podem ser determinados por alinhamento de uma sequência de referência com a sequência de CD80 de tipo
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74/474 selvagem apresentada na SEQ ID NO: 2 (domínio de ECD) ou apresentada na SEQ ID NO: 76, 3030 ou 3031 (domínio de IgV) por meio de métodos de alinhamento estrutural como descrito aqui. Ao alinhar as sequências, um versado na técnica pode identificar os resíduos correspondentes, por exemplo, utilizando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias.
[00171] Os termos diminuir ou atenuar ou suprimir, como usado aqui, significa diminuir por uma quantidade estatisticamente significativa. Uma diminuição pode ser de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.
[00172] Os termos derivados ou derivatizados referem-se à modificação de uma proteína ligando-a covalentemente, direta ou indiretamente, a uma composição de modo a alterar características como meia vida biológica, biodisponibilidade, imunogenicidade, solubilidade, toxicidade, potência ou eficácia, mantendo ou aumentando seu benefício terapêutico. Derivados de polipeptídeos imunomoduladores da invenção estão dentro do âmbito da invenção e podem ser feitos, por exemplo, por glicosilação, PEGuilação, lipidação ou fusão com Fc.
[00173] Como aqui utilizado, a detecção inclui métodos que permitem a visualização (por olho ou equipamento) de uma proteína. Uma proteína pode ser visualizada usando um anticorpo específico para a proteína. A detecção de uma proteína também pode ser facilitada por fusão da proteína com uma etiqueta incluindo um marcador que seja detectável ou por contato com um segundo reagente específico para a proteína, tal como um anticorpo secundário, que inclua um marcador que seja detectável.
[00174] Como aqui utilizado, domínio (tipicamente uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 7 ou mais aminoácidos, tal como 10 a 200 resíduos de aminoácidos) refere-se a uma porção de uma molécula, tal como uma proteína ou codificando ácido nucleico, que é estru
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75/474 turalmente e/ou funcionalmente distinta de outras porções da molécula e é identificável. Por exemplo, os domínios incluem as porções de uma cadeia polipeptídica que podem formar uma estrutura dobrada independentemente dentro de uma proteína constituída por um ou mais motivos estruturais e/ou que reconhecida em virtude de uma atividade funcional, tal como atividade de ligação. Uma proteína pode ter um ou mais de um domínio distinto. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido ou distinguido por homologia da sequência primária ou estrutura para membros da família relacionados, tais como homologia para motivos. Em outro exemplo, um domínio pode ser distinguido pela sua função, tal como uma capacidade para interagir com uma biomolécula, tal como um parceiro de ligação cognato. Um domínio independentemente pode exibir uma função ou atividade biológica tal que o domínio independentemente ou fundido com outra molécula possa realizar uma atividade, tal como, por exemplo, ligação. Um domínio pode ser uma sequência linear de aminoácidos ou uma sequência não linear de aminoácidos. Muitos polipeptídeos contêm uma pluralidade de domínios. Tais domínios são conhecidos e podem ser identificados pelos especialistas na técnica. Para exemplificação aqui, as definições são fornecidas, mas entende-se que está bem dentro da habilidade na técnica reconhecer domínios particulares pelo nome. Se necessário, software apropriado pode ser empregado para identificar domínios.
[00175] O termo ectodomínio como usado aqui refere-se à região de uma proteína de membrana, tal como uma proteína transmembrana, que fica fora da membrana vesicular. Os ectodomínios contêm frequentemente domínios de ligação que se ligam especificamente a ligandos ou receptores da superfície celular, tal como através de um domínio de ligação que se liga especificamente ao ligando ou receptor da superfície celular. O ectodomínio de uma proteína transmembranar celular alternativamente referido como domínio extracelular.
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76/474 [00176] Os termos quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz referem-se a uma quantidade e/ou concentração de uma composição terapêutica da invenção, incluindo uma composição proteica ou composição celular, que quando administrada ex vivo (por contato com uma célula de um paciente) ou in vivo (por administração em um paciente) quer sozinho (isto é, como monoterapia) quer em combinação com agentes terapêuticos adicionais, origina uma diminuição estatisticamente significativa na progressão da doença como, por exemplo, melhorando ou eliminando os sintomas e/ou a causa da doença. Uma quantidade eficaz pode ser uma quantidade que melhora, diminui ou alivia pelo menos um sintoma ou resposta biológica ou efeito associado a uma doença ou distúrbio, previne a progressão da doença ou distúrbio, ou melhora o funcionamento físico do paciente. No caso da terapia celular, a quantidade eficaz é uma dose eficaz ou número de células administradas a um paciente por terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, o paciente é um mamífero, tal como um primata não humano ou um paciente humano.
[00177] O termo endodomínio, como aqui utilizado, refere-se à região encontrada em algumas proteínas de membrana, tais como proteínas transmembranares, que se estendem para o espaço interior definido pela membrana da superfície celular. Nas células de mamíferos, o endodomínio é a região citoplasmática da proteína da membrana. Nas células, o endodomínio interage com constituintes intracelulares e pode desempenhar um papel na transdução de sinal e, portanto, em alguns casos, pode ser um domínio de sinalização intracelular. O endodomínio de uma proteína transmembrana celular é alternativamente referido como um domínio citoplasmático, que, em alguns casos, pode ser um domínio de sinalização citoplasmática.
[00178] Os termos reforçada ou aumentada como aqui utilizados no contexto do aumento da atividade imunológica de um linfócito de
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77/474 mamífero significa aumentar uma ou mais atividades do linfócito. Uma atividade aumentada pode ser uma ou mais de aumento da sobrevivência celular, proliferação celular, produção de citocinas ou citotoxicidade de células T, tal como por uma quantidade estatisticamente significativa. Em algumas modalidades, a referência à atividade imunológica aumentada significa aumentar a produção de interferon gama (IFNgama), tal como por uma quantidade estatisticamente significativa. Em algumas modalidades, a atividade imunológica pode ser avaliada em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR). Os métodos de condução de ensaios de MLR são conhecidos na técnica. Wang et al., Cancer Immunol Res. Setembro de 2014: 2 (9): 846-56. Outros métodos de avaliação de atividades de linfócitos são conhecidos na técnica, incluindo qualquer ensaio como aqui descrito. Em algumas modalidades, um melhoramento pode ser um aumento de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400% ou 500% maior do que um valor de controle não zero.
[00179] O termo célula manipulada, como aqui utilizado, refere-se a uma célula de mamífero que foi geneticamente modificada por intervenção humana, tal como por métodos de DNA recombinante ou transdução viral. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imunológica, tal como um linfócito (por exemplo, célula T, célula B, célula NK) ou uma célula apresentadora de antígeno (por exemplo, célula dendrítica). A célula pode ser uma célula primária de um paciente ou pode ser uma linhagem celular. Em algumas modalidades, uma célula manipulada da invenção contém um CD80 variante da invenção manipulada para modular a atividade imunológica de um CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 expressando células T, ou um PD-L1 expressando APC, ao qual o polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente. Em algumas modalidades, o CD80 variante, uma proteína imunomoduladora transmembranar (doravante referida como TIP) contendo o domínio
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78/474 extracelular ou uma porção do mesmo contendo o domínio IgV ligado a um domínio transmembranar (por exemplo, um domínio transmembranar CD80) e, opcionalmente um domínio de sinalização intracelular. Em alguns casos, a TIP é formatada como um receptor quimérico contendo um domínio de sinalização citoplasmático heterólogo ou endodomínio. Em algumas modalidades, uma célula manipulada é capaz de expressar e segregar uma proteína imunomoduladora, como aqui descrito. Entre as células manipuladas fornecidas, encontram-se também células contendo ainda um receptor de células T (TCR) manipulado ou um receptor de antígeno quimérico (CAR).
[00180] O termo engenharia de célula T como usado aqui referese a uma célula T tal como uma célula T auxiliar, célula T citotóxica (alternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL), célula T natural killer, célula T reguladora, células T de memória, gama ou gama delta, que foram geneticamente modificadas por intervenção humana, tais como métodos de DNA recombinante ou métodos de transdução viral. Uma célula T manipulada contém uma proteína imunomoduladora transmembranar CD80 variante (TIP) ou proteína imunomoduladora secretada (SIP) da presente invenção que é expressa na célula T e é modificada para modular a atividade imunológica da própria célula T manipulada, ou uma célula de mamífero à qual o CD80 variante expressa na célula T se liga especificamente.
[00181] O termo receptor de célula T manipulado ou TCR manipulado refere-se a um receptor de célula T (TCR) manipulado para se ligar especificamente com uma afinidade desejada a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC)/antígeno peptídeo-alvo que é selecionado, clonado, e/ou subsequentemente introduzido em uma população de células T, frequentemente usada para imunoterapia adotiva. Em contraste com os TCRs modificados, os CARs são manipulados para ligar antígenos-alvo de uma maneira independente do MHC.
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79/474 [00182] O termo expresso em como aqui utilizado é utilizado em referência a uma proteína expressa na superfície de uma célula, tal como uma célula de mamífero. Assim, a proteína é expressa como uma proteína de membrana. Em algumas modalidades, a proteína expressa é uma proteína transmembranar. Em algumas modalidades, a proteína é conjugada a uma porção de molécula pequena, tal como um fármaco ou marcador detectável. As proteínas expressas na superfície de uma célula podem incluir proteínas da superfície celular, tais como receptores da superfície celular que são expressos em células de mamífero.
[00183] O termo porção que se estende pela meia-vida refere-se a uma porção de uma fusão polipeptídica ou conjugado químico que prolonga a meia-vida de uma proteína circulante no soro sanguíneo de mamíferos em comparação com a meia-vida da proteína que não é tão conjugada à porção. Em algumas modalidades, a meia-vida é prolongada em mais do que ou maior do que cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes ou 6,0 vezes. Em algumas modalidades, a meia-vida é prolongada em mais de 6 horas, mais de 12 horas, mais de 24 horas, mais de 48 horas, mais de 72 horas, mais de 96 horas ou mais de 1 semana após administração in vivo em comparação com a proteína sem a porção que se estende da meia-vida. A meia-vida refere-se à quantidade de tempo que leva para a proteína perder metade de sua concentração, quantidade ou atividade. A meiavida pode ser determinada, por exemplo, usando um ensaio ELISA ou um ensaio de atividade. Porções extensas de meia-vida exemplificativas incluem um domínio Fc, um domínio de multimerização, polietilenoglicol (PEG), hidroxietilamido (HES), XTEN (peptídeos recombinantes estendidos; ver, WO2013130683), albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), lipídeos (acilação) e poli-ProAla-Ser (PAS) e ácido poliglutâmico (glutamilação).
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80/474 [00184] O termo sinapse imunológica ou sinapse imune como aqui utilizado significa a interface entre uma célula de mamífero que expressa MHC I (complexo principal de histocompatibilidade) ou MHC II, tal como uma célula apresentadora de antigeno ou célula tumoral e um linfócito mamífero como uma célula T efetora ou célula Natural Killer (NK).
[00185] Uma região Fc (cristalizável por fragmento) ou domínio de uma molécula de imunoglobulina (também denominada um polipeptídeo Fc) corresponde largamente à região constante da cadeia pesada de imunoglobulina e é responsável por várias funções, incluindo a função (ou funções) efetora do anticorpo. O domínio Fc contém parte ou todo o domínio da dobradiça de uma molécula de imunoglobulina mais um domínio CH2 e CH3. O domínio Fc pode formar um dímero de duas cadeias polipeptídicas ligadas por uma ou mais ligações dissulfureto. Polipeptídeos dimerizados exemplificativos estão representados nas Figuras 6A e 6B. Em algumas modalidades, o Fc é uma variante Fc que exibe atividade reduzida (por exemplo, reduzida maior que 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) para facilitar uma função efetora. Em algumas modalidades, a referência a substituições de aminoácidos em uma região Fc é pelo sistema de numeração EU, a menos que seja descrito com referência a uma SEQ ID NO. A numeração EU é conhecida e está de acordo com a mais recente atualização do IMGT Scientific Chart (IMGT®, o sistema internacional de informação ImMunoGeneTics®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/HuJGHGnber.html (criado em 17 de maio de 2001, última atualização: 10 de janeiro de 2013) e o índice EU, conforme relatado em Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5a ed. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, publicação NIH n° 91 a 3242 (1991).
[00186] Uma fusão de imunoglobulina Fc (fusão Fc), tal como uma
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81/474 proteína de fusão Fc imunomoduladora, é uma molécula que compreende um ou mais polipeptídeos (ou uma ou mais moléculas pequenas) operacionalmente ligados a uma região Fc de uma imunoglobulina. Uma fusão Fc pode compreender, por exemplo, a região Fc de um anticorpo (que facilita a farmacocinética) e um polipeptídeo CD80 variante. Uma região Fc de imunoglobulina pode ser ligada indiretamente ou diretamente a um ou mais polipeptídeos CD80 variantes ou moléculas pequenas (parceiros de fusão). Vários ligantes são conhecidos na técnica e podem, opcionalmente, ser utilizados para ligar um Fc a um parceiro de fusão para gerar uma fusão Fc. As fusões Fc de espécies idênticas podem ser dimerizadas para formar homodímeros de fusão Fc, ou utilizando espécies não idênticas para formar heterodímeros de fusão Fc. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc de mamífero tal como um Fc murino, de coelho ou humano.
[00187] O termo célula hospedeira refere-se a uma célula que pode ser utilizada para expressar uma proteína codificada por um vetor de expressão recombinante. Uma célula hospedeira pode ser um procariota, por exemplo, E. coli, ou pode ser um eucariota, por exemplo, um eucariota unicelular (por exemplo, uma levedura ou outro fungo), uma célula vegetal (por exemplo, um tabaco ou tomate célula vegetal), uma célula animal (por exemplo, uma célula humana, uma célula de macaco, uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundongo ou uma célula de inseto) ou um hibridoma. Exemplos de células hospedeiras incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) ou seus derivados, tais como Veggie CHO, DG44, Expi CHO ou CHOZN e linhagens celulares relacionadas que crescem em meio isento de soro ou cepa CHO DX-B11, que é deficiente em DHFR. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana, uma célula de macaco, uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundon
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82/474 go ou uma célula de inseto).
[00188] O termo imunoglobulina (abreviado Ig) como usado aqui refere-se a uma proteína imunoglobulina de mamífero incluindo qualquer uma das cinco classes humanas de anticorpo: IgA (que inclui subclasses lgA1 e lgA2), IgD, IgE, IgG (que inclui subclasses lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4) e IgM. O termo também inclui as imunoglobulinas que são menos que o comprimento total, total ou parcialmente sintéticas (por exemplo, síntese recombinante ou química) ou naturalmente produzidas, como fragmento de ligação ao antígeno (Fab), fragmento variável (Fv) contendo VH e VL, o fragmento variável de cadeia única (scFv) que contém VH e VL ligados em uma cadeia, bem como outros fragmentos da região V do anticorpo, tais como Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmentos de polipeptídeo diacorpo, Fc e Fd de dsFv. Anticorpos biespecíficos, homobispecíficos e heterobispecíficos, estão incluídos dentro do significado do termo.
[00189] O termo superfamília de imunoglobulina ou IgSF, como aqui utilizado, significa o grupo de proteínas de superfície e solúveis celulares que estão envolvidas nos processos de reconhecimento, ligação ou adesão das células. As moléculas são categorizadas como membros dessa superfamília com base em características estruturais compartilhadas com imunoglobulinas (isto é, anticorpos); todos eles possuem um domínio conhecido como domínio ou dobra de imunoglobulina. Os membros da IgSF incluem receptores de antígenos da superfície celular, correceptores e moléculas coestimulatórias do sistema imune, moléculas envolvidas na apresentação de antígenos a linfócitos, moléculas de adesão celular, certos receptores de citocinas e proteínas musculares intracelulares. Eles são comumente associados a papéis no sistema imunológico. Proteínas na sinapse imunológica são frequentemente membros da IgSF. IgSF também pode ser classificado em subfamílias com base em propriedades compartilhadas, como
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83/474 função. Tais subfamílias consistem tipicamente de 4 a 30 membros de IgSF.
[00190] Os termos domínio IgSF ou domínio de imunoglobulina ou domínio Ig, como aqui utilizados, referem-se a um domínio estrutural de proteínas IgSF. Domínios Ig são nomeados após as moléculas de imunoglobulina. Eles contêm cerca de 70-110 aminoácidos e são classificados de acordo com seu tamanho e função. Os domínios Ig possuem uma dobra de Ig característica, que tem uma estrutura tipo sanduíche formada por duas folhas de cadeias beta antiparalelas. Interações entre aminoácidos hidrofóbicos no lado interno do sanduíche e ligações dissulfeto altamente conservadas formadas entre resíduos de cisteína nas cadeias B e F estabilizam a dobra de Ig. Uma extremidade do domínio Ig possui uma seção chamada região determinante de complementaridade que é importante para a especificidade de anticorpos para seus ligantes. Os domínios semelhantes a Ig podem ser classificados (em classes) como: IgV, lgC1, lgC2 ou Igl. A maioria dos domínios de Ig é variável (IgV) ou constante (IgC). Os domínios de IgV com 9 cadeias beta são geralmente mais longos que os domínios de IgC com 7 cadeias beta. Os domínios Ig de alguns membros da IgSF assemelham-se aos domínios IgV na sequência de aminoácidos, mas são semelhantes em tamanho aos domínios IgC. Estes são chamados domínios lgC2, enquanto os domínios padrão IgC são chamados de domínios lgC1. Cadeias de receptor de células T (TCR) contêm dois domínios Ig na porção extracelular; um domínio IgV no terminal N e um domínio lgC1 adjacente à membrana celular. O CD80 contém dois domínios Ig: IgV e IgC.
[00191] [191] O termo espécies de IgSF, como aqui utilizado, significa um conjunto de proteínas do membro de IgSF com sequência de aminoácidos primários idêntica ou substancialmente idêntica. Cada membro da superfamília de imunoglobulina (IgSF) de mamífero define
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84/474 uma identidade única de todas as espécies de IgSF que pertencem a esse membro de IgSF. Assim, cada membro da família de IgSF exclusivo de outros membros da família de IgSF e, consequentemente, cada espécie de um membro da família de IgSF particular é única das espécies de outro membro da família de IgSF. No entanto, a variação entre moléculas que são da mesma espécie de IgSF pode ocorrer devido a diferenças na modificação pós-traducional, tais como glicosilação, fosforilação, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipidação. Adicionalmente, pequenas diferenças de sequência dentro de uma única espécie de IgSF devido a polimorfismos genéticos constituem outra forma de variação dentro de uma única espécie de IgSF, tal como as formas truncadas do tipo selvagem de espécies de IgSF, devido, por exemplo, à divagem proteolítica. Uma espécie de IgSF da superfície celular é uma espécie de IgSF expressa na superfície de uma célula, geralmente uma célula de mamífero.
[00192] O termo atividade imunológica como usado aqui no contexto de linfócitos de mamíferos tais como células T refere-se a uma ou mais atividades de sobrevivência celular, proliferação celular, produção de citocinas (por exemplo, interferon gama) ou citotoxicidade de células T. Em alguns casos, uma atividade imunológica pode significar sua expressão de citocinas, como quimiocinas ou interleucinas. Os ensaios para determinar o aumento ou supressão da atividade imunológica incluem os ensaios de MLR (reação mista de linfócitos) medindo os níveis de citocina do interferon gama nos sobrenadantes da cultura (Wang et al., Cancer Immunol Res. Setembro de 2014: 2 (9): 846-56), Ensaio de estimulação de células T SEB (enterotoxina estafilocócica B) T (Wang et al., Cancer Immunol Res. Setembro de 2014: 2 (9): 846-56) e ensaios de estimulação de células T anti-CD3 (Li e Kurlander, J Transi Med. 2010: 8: 104). Uma vez que a ativação de células T está associada à secreção de citocina IFN-gama, a de
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85/474 tecção de níveis de IFN-gama em sobrenadantes de cultura destes ensaios de células T humanas in vitro pode ser testada utilizando kits ELISA comerciais kits (Wu et al, Immunol Lett 2008 Apr 15; 117(1): 5762). A indução de uma resposta imunológica resulta em um aumento na atividade imunológica em relação aos linfócitos quiescentes. Uma proteína imunomoduladora, tal como um polipeptídeo CD80 variante contendo um domínio IgSF modificado por afinidade, como aqui fornecido, pode aumentar ou, em modalidades alternativas, diminuir a expressão de IFN-gama ( interferon-gama) em um ensaio primário de células T em relação a um membro IgSF do tipo selvagem ou controle do domínio IgSF. Os versados reconhecerão que o formato do ensaio de células T primárias utilizado para determinar um aumento na expressão de IFN-gama será diferente do utilizado para testar uma diminuição na expressão de IFN-gama. No ensaio da capacidade de uma proteína imunomoduladora ou domínio IgSF modificada por afinidade da invenção para diminuir a expressão de IFN-gama em um ensaio primário de células T, pode ser utilizado um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) como descrito no Exemplo 6. Convenientemente, uma forma solúvel de um domínio IgSF modificado por afinidade da invenção pode ser empregue para determinar a sua capacidade para antagonizar e, desse modo, diminuir a expressão de IFN-gama em uma MLR, tal como descrito no Exemplo 6. Alternativamente, no ensaio da capacidade de uma proteína imunomoduladora ou domínio IgSF modificado por afinidade da invenção para aumentar a expressão de IFNgama em um ensaio primário de células T, pode ser utilizado um ensaio de coimobilização. Em um ensaio de coimobilização, utilizado um sinal do receptor de células T, fornecido em algumas modalidades pelo anticorpo anti-CD3, em conjunto com um domínio IgSF modificado por afinidade coimobilizado, tal como um CD80 variante, para determinar a capacidade para aumentar expressão de IFN-gama em relação ao
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86/474 controle do domínio IgSF do tipo selvagem. Modos para ensaiar a atividade imunológica de células modificadas, incluindo para avaliar a atividade de uma proteína imunomoduladora transmembranar CD80 variante, são conhecidos na especialidade e incluem, mas não estão limitados à capacidade para expandir células T após a estimulação com antígeno, sustentar a expansão das células T e na ausência de reestimulação e atividades anticancerígenas em modelos animais apropriados. Os ensaios incluem ensaios para avaliar a citotoxicidade, incluindo um ensaio de liberação de 51 Cr padrão (ver, por exemplo, Milone et al, (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464) ou ensaios de citotoxicidade com base, ou um ensaio de citotoxicidade baseado em fluxo ou um ensaio de citotoxicidade baseado em impedância (Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405: 192-198).
[00193] Um polipeptídeo imunomodulador ou proteína imunomoduladora é um polipeptídeo ou molécula de proteína que modula a atividade imunológica. Por modulação ou modulação de uma resposta imunológica entende-se que a atividade imunológica é aumentada ou diminuída. Uma proteína imunomoduladora pode ser uma única cadeia polipeptídica ou um multímero (dímeros ou multímeros de ordem superior) de pelo menos duas cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente entre si por, por exemplo, ligações dissulfureto intercadeias. Assim, os polipeptídeos multiméricos monoméricos, diméricos e de ordem superior estão dentro do âmbito do termo definido. Os polipeptídeos multiméricos podem ser homomultiméricos (de cadeias polipeptídicas idênticas) ou heteromultiméricos (de cadeias polipeptídicas não idênticas). Uma proteína imunomoduladora pode compreender um polipeptídeo CD80 variante.
[00194] O termo aumento, como usado aqui, significa aumentar em uma quantidade estatisticamente significativa. Um aumento pode ser de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% ou
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87/474 maior que um valor de controle diferente de zero.
[00195] Uma isoforma de CD80 é uma dentre uma pluralidade de polipeptídeos CD80 de ocorrência natural que diferem na sequência de aminoácidos. As isoformas podem ser o produto de variantes de splicing de um transcrito de RNA expresso por um único gene, ou o produto de expressão de genes altamente semelhantes, mas diferentes, produzindo uma proteína funcionalmente semelhante, tal como pode ocorrer da duplicação gênica. Como aqui utilizado, o termo isoforma de CD80 também se refere ao produto de diferentes alelos de um gene CD80.
[00196] O termo marcador refere-se a um composto ou composição que pode ser ligado ou ligado, direta ou indiretamente, para fornecer um sinal detectável ou que pode interagir com um segundo marcador para modificar um sinal detectável. O marcador pode ser conjugado direta ou indiretamente com um polipeptídeo, de modo a gerar um polipeptídeo marcado. O marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, marcadores de radioisotipos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de uma composição de composto de substrato que é detectável. Exemplos não limitativos de marcadores incluíram porções fluorogênicas, proteína verde fluorescente ou luciferase.
[00197] O termo linfócito como aqui utilizado significa qualquer um dos três subtipos de glóbulos brancos em um sistema imunitário de mamífero. Incluem células natural killer (células NK) (que funcionam na imunidade inata citotóxica mediada por células), células T (para imunidade adaptativa citotóxica mediada por células) e células B (para imunidade adaptativa humoral, dirigida por anticorpos). As células T incluem: células T auxiliares, células T citotóxicas, células T natural killer, células T de memória, células T reguladoras ou células T gama delta. Células linfoides inatas (ILC) também estão incluídas na defini
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88/474 ção de linfócitos.
[00198] Os termos mamífero ou paciente incluem especificamente referência a pelo menos um de: humano, chimpanzé, macaco rhesus, macaco cynomolgus, cão, gato, camundongo ou rato.
[00199] O termo proteína de membrana como aqui usado significa uma proteína que, sob condições fisiológicas, está ligada direta ou indiretamente a uma bicamada lipídica. Uma bicamada lipídica que forma uma membrana pode ser uma membrana biológica tal como uma membrana celular eucariótica (por exemplo, mamífero) ou uma membrana artificial (isto é, feita pelo homem) tal como a encontrada em um lipossoma. A ligação de uma proteína de membrana à bicamada lipídica pode ser por meio de ligação covalente ou por meio de interações não covalentes, tais como interações hidrofóbicas ou eletrostáticas. Uma proteína de membrana pode ser uma proteína de membrana integral ou uma proteína de membrana periférica. Proteínas de membrana que são proteínas da membrana periférica são ligadas de forma não covalente à bicamada lipídica ou ligadas de forma não covalente a uma proteína de membrana integral. Uma proteína de membrana periférica forma uma ligação temporária à bicamada lipídica de tal modo que sob a gama de condições que são fisiológicas em um mamífero, a proteína de membrana periférica pode se associar e/ou desassociar da bicamada lipídica. Ao contrário das proteínas membranares periféricas, as proteínas membranares integrais formam uma ligação substancialmente permanente bicamada lipídica da membrana de tal modo que sob a gama de condições que são fisiológicas em um mamífero, as proteínas membranares integrais não se desassociam da sua ligação bicamada lipídica. Uma proteína de membrana pode formar uma ligação à membrana por meio de uma camada da bicamada lipídica (monotópica), ou fixada por meio de ambas as camadas da membrana (politópica). Uma proteína de membrana integral que interage com
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89/474 apenas uma bicamada lipídica é uma proteína monotópica integral. Uma proteína de membrana integral que interage com ambas as bicamadas lipídicas é uma proteína politópica integral, alternativamente referida aqui como uma proteína transmembranar.
[00200] Os termos modular (modulating) ou modular (modulate), como usados aqui no contexto de uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de mamíferos, referem-se a qualquer alteração, como um aumento ou uma diminuição, de respostas imunológicas existentes ou potenciais que ocorrem como um resultado da administração de um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante da presente invenção ou como resultado da administração de células manipuladas expressa uma proteína imunomoduladora, tal como uma proteína imunomoduladora transmembranar CD80 variante da presente invenção. Assim, refere-se a uma alteração, tal como um aumento ou diminuição, de uma resposta imunológica em comparação com a resposta imunológica que ocorre ou está presente na ausência da administração da proteína imunomoduladora compreendendo o CD80 variante. Tal modulação inclui qualquer indução, ativação, supressão ou alteração em grau ou extensão da atividade imunológica de uma célula imunológica. As células imunes incluem células B, células T, células NK (natural killer), células T NK, células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) e células apresentadoras de antígenos não profissionais e células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos, monócitos, eosinófilos e basófilos). A modulação inclui qualquer alteração transmitida em uma resposta imunológica existente, uma resposta imunológica em desenvolvimento, uma resposta imunológica potencial ou a capacidade para induzir, regular, influenciar ou responder a uma resposta imunológica. A modulação inclui qualquer alteração na expressão e/ou função de genes, proteínas e/ou outras moléculas nas células imunes como parte de uma resposta
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90/474 imunológica. A modulação de uma resposta imunológica ou modulação da atividade imunológica inclui, por exemplo, o seguinte: eliminação, eliminação ou sequestro de células imunológicas; indução ou geração de células imunes que podem modular a capacidade funcional de outras células, como linfócitos autorreativos, células apresentadoras de antígenos ou células inflamatórias; indução de um estado sem resposta nas células imunes (isto é, anergia); aumentando ou suprimindo a atividade ou função das células imunológicas, incluindo, mas não se limitando a alterar o padrão de proteínas expressas por estas células. Exemplos incluem produção alterada e/ou secreção de certas classes de moléculas tais como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, fatores de transcrição, quinases, moléculas coestimulatórias, ou outros receptores da superfície celular ou qualquer combinação desses eventos modulatórios. A modulação pode ser avaliada, por exemplo, por uma alteração na expressão de IFN-gama ( interferon gama) em relação ao controle de CD80 de tipo selvagem ou não modificado em um ensaio de células T primárias (ver, Zhao e Ji, Exp Cell Res. 1 de janeiro de 2016; 340 (1): 132-138). A modulação pode ser avaliada, por exemplo, por uma alteração de uma atividade imunológica de células modificadas, tal como uma alteração na atividade citotóxica de células modificadas ou uma alteração na secreção de citocinas de células modificadas relativamente a células manipuladas com uma proteína transmembranar CD80 de tipo selvagem.
[00201] O termo domínio de multimerização refere-se a uma sequência de aminoácidos que promove a interação estável de uma molécula polipeptídica com uma ou mais moléculas polipeptídicas adicionais, cada uma contendo um domínio de multimerização complementar (por exemplo, um primeiro domínio de multimerização e um segundo domínio de multimerização), que pode ser o mesmo ou um domínio de multimerização diferente. As interações entre domínios de multime
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91/474 rização complementar, por exemplo, interação entre um primeiro domínio de multimerização e um segundo domínio de multimerização, formam uma interação proteína-proteína estável para produzir um multímero da molécula polipeptídica com a molécula polipeptídica adicional. Em alguns casos, o domínio de multimerização é o mesmo e interage consigo mesmo para formar uma interação proteína-proteína estável entre duas cadeias polipeptídicas. Geralmente, um polipeptídeo é ligado direta ou indiretamente ao domínio de multimerização. Domínios de multimerização exemplificativos incluem as sequências de imunoglobulina ou porções destas, zíperes de leucina, regiões hidrofóbicas, regiões hidrofílicas e domínios de interação proteína-proteína compatível. O domínio de multimerização, por exemplo, pode ser uma região ou domínio constante de imunoglobulina, tal como, por exemplo, o domínio Fc ou suas porções de IgG, incluindo os subtipos lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, IgA, IgE, IgD e IgM e formas modificadas dos mesmos.
[00202] Os termos ácido nucléico e polinucleotídeo são usados indistintamente para se referir a um polímero de resíduos de ácido nucléico (por exemplo, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) na forma de fita simples ou dupla. Exceto se especificamente limitado, os termos abrangem ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais e que têm propriedades de ligação semelhantes e são metabolizados de um modo semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência particular de ácido nucleico engloba também implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências nucleotídicas complementares, bem como a sequência explicitamente indicada (uma sequência de referência). Especificamente, podem ser obtidas substituições de códon degeneradas gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base
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92/474 mista e/ou desoxiinosina. O termo ácido nucleico ou polinucleotídeo abrange cDNA ou mRNA codificado por um gene.
[00203] O termo espécies moleculares como aqui utilizado significa um conjunto de proteínas com sequência de aminoácidos primários idêntica ou substancialmente idêntica. Cada membro da superfamília de imunoglobulina (IgSF) de mamífero define uma coleção de espécies moleculares idênticas ou substancialmente idênticas. Assim, por exemplo, o CD80 humano é um membro IgSF e cada molécula CD80 humana é uma espécie molecular de CD80. A variação entre moléculas que são da mesma espécie molecular pode ocorrer devido a diferenças na modificação pós-traducional, como glicosilação, fosforilação, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipidação. Além disso, pequenas diferenças de sequência dentro de uma única espécie molecular devido a polimorfismos genéticos constituem outra forma de variação dentro de uma única espécie molecular como as formas truncadas de tipo selvagem de uma única espécie molecular devido, por exemplo, à divagem proteolítica. Uma espécie molecular da superfície celular é uma espécie molecular expressa na superfície de uma célula de mamífero. Duas ou mais espécies diferentes de proteínas, cada uma das quais está presente exclusivamente em uma ou exclusivamente (mas não em ambas) das duas células de mamíferos que formam o SI, são consideradas em cis ou configuração cis uma com a outra. Duas espécies diferentes de proteínas, a primeira das quais está exclusivamente presente em uma das duas células de mamíferos que formam o SI e a segunda das quais está presente exclusivamente na segunda das duas células de mamíferos que formam o SI, são consideradas trans ou configuração trans. Duas espécies diferentes de proteína, cada uma das quais está presente em ambas as células de mamífero que formam o IS, estão em ambas as configurações cis e trans nestas células.
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93/474 [00204] O termo ligação não competitiva como aqui utilizado significa a capacidade de uma proteína para se ligar especificamente a pelo menos dois parceiros de ligação cognatos. Assim, a proteína é capaz de se ligar a pelo menos dois parceiros de ligação cognatos diferentes ao mesmo tempo, embora a interação de ligação não precise ser pela mesma duração, de tal forma que, em alguns casos, a proteína está especificamente ligada a apenas um dos parceiros de ligação cognatos. Em algumas modalidades, a ligação ocorre sob condições de ligação específicas. Em algumas modalidades, a ligação simultânea é tal que a ligação de um parceiro de ligação cognato não inibe substancialmente a ligação simultânea a um segundo parceiro de ligação cognato. Em algumas modalidades, a ligação não competitiva significa que a ligação de um segundo parceiro de ligação cognato ao seu local de ligação na proteína não desloca a ligação de um primeiro parceiro de ligação cognato ao seu local de ligação na proteína. Os métodos para avaliar a ligação não competitiva são bem conhecidos na técnica, tal como o método descrito em Perez de Ia Lastra et al., Immunology, 1999 Abr: 96 (4): 663-670. Em alguns casos, em interações não competitivas, o primeiro parceiro de ligação cognato liga-se especificamente a um local de interação que não se sobrepõe ao sítio de interação do segundo parceiro de ligação cognato de modo que a ligação do segundo parceiro de ligação cognato não interfira diretamente com a ligação do primeiro parceiro de ligação cognato. Assim, qualquer efeito na ligação do parceiro de ligação cognato pela ligação do segundo parceiro de ligação cognato é através de um mecanismo diferente da interferência direta com a ligação do primeiro parceiro de ligação cognato. Por exemplo, no contexto de interações enzima-substrato, um inibidor não competitivo liga-se a um local diferente do sítio ativo da enzima. A ligação não competitiva engloba interações de ligação não competitivas nas quais um segundo parceiro de ligação cognato se
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94/474 liga especificamente a um sítio de interação que não se sobrepõe à ligação do primeiro parceiro de ligação cognato, mas liga-se ao segundo sítio de interação apenas quando o primeiro sítio de interação é ocupado pelo primeiro parceiro de ligação cognato.
[00205] O termo composição farmacêutica refere-se a uma composição adequada para uso farmacêutico em um indivíduo mamífero, frequentemente um humano. Uma composição farmacêutica compreende tipicamente uma quantidade eficaz de um agente ativo (por exemplo, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante ou células manipuladas expressando uma proteína imunomoduladora transmembranar CD80 variante) e um transportador, excipiente ou diluente. O transportador, excipiente ou diluente é tipicamente um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, respectivamente.
[00206] Os termos polipeptídeo e proteína são aqui utilizados indistintamente e referem-se a uma cadeia molecular de dois ou mais aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. Os termos não se referem a um comprimento específico do produto. Assim, peptideos e oligopeptídeos estão incluídos na definição de polipeptídeo. Os termos incluem modificações pós-traducionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Os termos também incluem moléculas em que um ou mais análogos de aminoácidos ou aminoácidos não canônicos ou não naturais que podem ser sintetizados ou expressos de forma recombinante utilizando técnicas de engenharia de proteínas conhecidas. Além disso, as proteínas podem ser derivatizadas.
[00207] O termo ensaio de células T primárias, tal como é aqui utilizado, refere-se a um ensaio in vitro para medir a expressão do interferon gama (IFN-gama). Uma variedade destes ensaios primários de células T é conhecida na técnica, tal como a descrita no Exemplo 6.
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Em uma modalidade preferencial, o ensaio utilizado é o ensaio de coimobilização anti-CD3. Neste ensaio, as células T primárias são estimuladas por anti-CD3 imobilizadas com ou sem proteínas recombinantes adicionais. Os sobrenadantes da cultura são colhidos em pontos no tempo, geralmente de 24 a 72 horas. Em outra modalidade, o ensaio utilizado é uma reação mista de linfócitos (MLR). Neste ensaio, as células T primárias são simuladas com APC alogênico. Os sobrenadantes da cultura são colhidos em pontos no tempo, geralmente de 24 a 72 horas. Os níveis de IFN-gama humanos são medidos em sobrenadantes de cultura por técnicas de ELISA padrão. Kits comerciais estão disponíveis nos fornecedores e o ensaio é realizado de acordo com a recomendação do fabricante.
[00208] O termo purificado como aplicado aos ácidos nucléicos, tais como codificando proteínas imunomoduladoras da invenção, geralmente denota um ácido nucléico ou polipeptídeo que é substancialmente livre de outros componentes como determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo purificado ou polinucleotideo forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugação em gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que dá origem essencialmente a uma banda em um gel eletroforético é purificado. Um ácido nucleico purificado ou proteína da invenção é pelo menos cerca de 50% puro, usualmente pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% ou mais puro (por exemplo, por cento em peso ou em uma base molar).
[00209] O termo recombinante indica que o material (por exemplo, um ácido nucléico ou um polipeptídeo) foi artificialmente (isto é, não naturalmente) alterado pela intervenção humana. A alteração pode ser realizada no material dentro ou removido de seu ambiente natural ou estado. Por exemplo, um ácido nucleico recombinante é aquele que
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96/474 é feito recombinando ácidos nucléicos, por exemplo, durante a clonagem, modificação de afinidade, embaralhamento de DNA ou outros procedimentos biológicos moleculares bem conhecidos. Uma molécula de DNA recombinante é composta de segmentos de DNA unidos por meio de tais técnicas biológicas moleculares. O termo proteína recombinante ou polipeptídeo recombinante, tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de proteína que é expressa utilizando uma molécula de DNA recombinante. Uma célula hospedeira recombinante é uma célula que contém e/ou expressa um ácido nucleico recombinante ou que é de outro modo alterada por engenharia genética, por exemplo, introduzindo na célula uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante, como uma proteína imunomoduladora transmembranar fornecida aqui. Sinais de controle transcricional em eucariotos compreendem elementos promotores e intensificadores. Promotores e potenciadores consistem em pequenos conjuntos de sequências de DNA que interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição. Elementos promotores e potenciadores foram isolados a partir de uma variedade de fontes eucarióticas incluindo genes em leveduras, células de insetos e mamíferos e vírus (elementos de controle análogos, isto é, promotores, são também encontrados em procariotas). A seleção de um promotor e potenciador particular depende do tipo de célula a ser utilizado para expressar a proteína de interesse. Os termos em combinação operável, em ordem operável e 'Operacionalmente ligados como aqui utilizados referem-se à ligação de sequências de ácido nucleico de tal maneira ou orientação que uma molécula de ácido nucleico capaz de dirigir a transcrição de um dado gene e/ou a síntese de uma molécula de proteína desejada é produzida.
[00210] O termo vetor de expressão recombinante, como usado aqui, refere-se a uma molécula de DNA contendo uma sequência de
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97/474 codificação desejada e sequências de ácido nucléico apropriadas necessárias para a expressão da sequência de codificação operacionalmente ligada em uma célula hospedeira particular. As sequências de ácido nucleico necessárias para expressão em procariotas incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um local de ligação ao ribossoma e possivelmente outras sequências. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, intensificadores e sinais de terminação e poliadenilação. Uma sequência peptídica sinal secretora também pode, opcionalmente, ser codificada pelo vetor de expressão recombinante, operacionalmente ligado sequência codificante para a proteína recombinante, tal como uma proteína de fusão recombinante, de modo que a proteína de fusão expressa possa ser secretada pela célula hospedeira recombinante, para facilitar o isolamento da proteína de fusão da célula, se desejado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Entre os vetores estão vetores virais, como vetores lentivirais.
[00211] O termo seletividade refere-se à preferência de uma proteína ou polipeptídeo em questão, para ligação específica de um substrato, tal como um parceiro de ligação cognato, em comparação com ligação específica para outro substrato, tal como um parceiro de ligação cognato diferente da proteína em causa. A seletividade pode ser refletida como uma razão da atividade de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) de uma proteína em questão e um primeiro substrato, como um primeiro parceiro de ligação cognato (por exemplo, Kcu) e a atividade de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) da mesma proteína em questão com um segundo parceiro de ligação cognato (por exemplo, Kd2).
[00212] O termo identidade de sequência, como aqui utilizado, refere-se à identidade de sequência entre genes ou proteínas ao nível
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98/474 dos nucleotídeos ou dos aminoácidos, respectivamente. Identidade de sequência é uma medida de identidade entre proteínas no nível de aminoácidos e uma medida de identidade entre ácidos nucléicos no nível dos nucleotídeos. A identidade da sequência proteica pode ser determinada comparando a sequência de aminoácidos em uma dada posição em cada sequência quando as sequências estão alinhadas. Analogamente, a identidade da sequência de ácido nucleico pode ser determinada comparando a sequência de nucleotídeos em uma dada posição em cada sequência quando as sequências estão alinhadas. Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O algoritmo BLAST calcula a porcentagem de identidade de sequência e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para executar a análise BLAST está disponível publicamente através do site do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI).
[00213] O termo solúvel, como aqui usado em referência a proteínas, significa que a proteína não é uma proteína de membrana. Em geral, uma proteína solúvel contém apenas o domínio extracelular de um receptor membro da família de IgSF, ou uma porção do mesmo contendo um domínio ou domínios de IgSF ou fragmentos de ligação específica dos mesmos, mas não contém o domínio transmembranar. Em alguns casos, a solubilidade de uma proteína pode ser melhorada por ligação ou ligação, direta ou indiretamente através de um ligante, a um domínio Fc, que, em alguns casos, também pode melhorar a estabilidade e/ou meia-vida da proteína. Em alguns aspectos, uma proteína solúvel é uma proteína de fusão Fc.
[00214] O termo espécie como aqui utilizado em relação a polipeptídeos ou ácidos nucleicos significa um conjunto de moléculas com sequências idênticas ou substancialmente idênticas. A variação entre
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99/474 polipeptídeos que são da mesma espécie pode ocorrer devido a diferenças na modificação pós-traducional, tais como glicosilação, fosforilação, ubiquitinação, nitrosilação, metilação, acetilação e lipidação. As sequências de polipeptídeos ligeiramente truncadas que diferem (ou codificam uma diferença) das espécies completas no terminal amina ou no terminal carboxila por não mais de 1, 2 ou 3 resíduos de aminoácidos são consideradas de uma única espécie. Tais microheterogeneidades são uma característica comum das proteínas fabricadas. [00215] O termo fragmento de ligação específica como aqui utilizado em referência a um polipeptídeo CD80 de mamífero de tipo selvagem de comprimento completo ou um domínio IgV ou IgC deste, significa um polipeptídeo possuindo uma subsequência de um domínio IgV e/ou IgC e que se liga especificamente in vitro e/ou in vivo a um CD28 de mamífero, PD-L1 de mamífero e/ou CTLA-4 de mamífero, tai como um CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 humano ou murino. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica do CD80 IgV ou do CD80 IgC é de pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do comprimento da sequência da sequência de tipo selvagem de comprimento total. O fragmento de ligação específica pode ser alterado em sequência para formar o CD80 variante. [00216] O termo liga-se especificamente como usado aqui significa a capacidade de uma proteína, sob condições específicas de ligação, de se ligar a uma proteína-alvo de tal modo que sua afinidade ou avidez seja pelo menos 5 vezes maior, mas opcionalmente pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 ou 500 vezes maior, ou mesmo pelo menos 1.000 vezes maior que a afinidade ou avidez média da mesma proteína a uma coleção de peptídeos ou polipeptídeos aleatórios de tamanho estatístico suficiente. Uma proteína de ligação específica não necessita se ligar exclusivamente a uma única molécula-alvo, mas pode ligar-se especificamente a uma molécula não-alvo devido à seme
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100/474 lhança na conformação estrutural entre o alvo e o não alvo (por exemplo, parálogos ou ortólogos). Os versados reconhecerão que a ligação específica a uma molécula com a mesma função em uma espécie diferente de animal (isto é, ortólogo) ou a uma molécula não-alvo tendo um epítopo substancialmente semelhante à molécula-alvo (por exemplo, parálogo) é possível e não diminui a especificidade da ligação que é determinada em relação a uma coleção estatisticamente válida de não alvos únicos (por exemplo, polipeptídeos aleatórios). Assim, um polipeptídeo da invenção pode ligar-se especificamente a mais de uma espécie distinta de molécula-alvo devido à reatividade cruzada. Os imunoensaios de ELISA de fase sólida ou ressonância de plasmônica de superfície (por exemplo, Biacore) podem ser usados para determinar a ligação específica entre duas proteínas. Geralmente, as interações entre duas proteínas de ligação têm constantes de dissociação (Kd) inferior a 1x10-5 M, e muitas vezes tão baixas quanto 1x10-12 M. Em determinadas modalidades da presente divulgação, as interações entre duas proteínas de ligação têm constantes de dissociação de 1x10’6 M, 1x10’7 M, 1x10’8 M, 1x10 9 Μ, 1x10 w M ou 1x1011 M.
[00217] Os termos superfície expressa ou expressão de superfície em referência a uma célula de mamífero expressando um polipeptídeo significa que o polipeptídeo é expresso como uma proteína de membrana. Em algumas modalidades, a proteína de membrana é uma proteína transmembranar.
[00218] Como aqui utilizado, sintético, com referência a, por exemplo, uma molécula sintética de ácido nucleico ou um gene sintético ou um peptídeo sintético refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou molécula polipeptídica que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
[00219] O termo porção de direcionamento, como aqui utilizado, refere-se a uma composição que está ligada covalentemente ou não
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101/474 covalentemente a, ou encapsula fisicamente, um polipeptídeo que compreende um CD80 variante. A porção de direcionamento tem afinidade de ligação específica para uma contraestrutura desejada tal como um receptor da superfície celular (por exemplo, o membro da família B7 PD-L1) ou um antigeno tumoral tal como antigeno específico de tumor (TSA) ou um antigeno associado a tumor (TAA) como B7-H6. Tipicamente, a contraestrutura desejada está localizada em um tecido específico ou tipo de célula. Porções-alvo incluem: anticorpos, fragmento de ligação ao antigeno (Fab), fragmento variável (Fv) contendo VH e VL, o fragmento variável de cadeia simples (scFv) contendo VH e VL ligados em conjunto em uma cadeia, bem como outros fragmentos da região V de anticorpos, tais como Fab', F(ab)2, F(ab')2, diacorpo dsFv, nanocorpos, receptores solúveis, ligandos de receptores, receptores maturados por afinidade ou ligandos, bem como composições de moléculas pequenas (<500 Dalton) (por exemplo, composições de receptores de ligação específica). As porções direcionadas também podem ser ligadas covalentemente ou não covalentemente à membrana lipídica de lipossomas que encapsulam um polipeptídeo da presente invenção.
[00220] O termo proteína transmembranar, como aqui utilizado, significa uma proteína membranar que cobre substancialmente ou completamente uma bicamada lipídica, como as bicamadas lipídicas encontradas em uma membrana biológica, tal como uma célula de mamífero, ou em um construto artificial, tal como um lipossoma. A proteína transmembranar compreende um domínio transmembranar (domínio transmembranar) pelo qual é integrado na bicamada lipídica e através do qual a integração é termodinamicamente estável sob condições fisiológicas. Os domínios transmembranares são geralmente previsíveis a partir da sua sequência de aminoácidos através de qualquer número de aplicações de software de bioinformática disponí
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102/474 veis comercialmente com base na sua elevada hidrofobicidade relativamente a regiões da proteína que interagem com ambientes aquosos (por exemplo, citosol, fluido extracelular). Um domínio transmembrana é muitas vezes uma hélice alfa hidrofóbica que atravessa a membrana. Uma proteína transmembrana pode passar através das duas camadas da bicamada lipídica uma ou várias vezes. Uma proteína transmembranar inclui as proteínas imunomoduladoras transmembranares fornecidas aqui descritas. Para além do domínio transmembranar, uma proteína imunomoduladora transmembranar da invenção compreende ainda um ectodomínio e, em algumas modalidades, um endodomínio. [00221] Os termos tratar, tratamento ou terapia de uma doença ou distúrbio como aqui utilizados significam retardar, parar ou reverter a progressão da doença ou distúrbios, como evidenciado pela diminuição, cessação ou eliminação de sintomas clínicos ou diagnósticos, por administração de uma composição terapêutica (por exemplo, contendo uma proteína imunomoduladora ou células manipuladas) da invenção, isoladamente ou em combinação com outro composto como aqui descrito. Tratar, tratamento ou terapia também significa uma diminuição na gravidade dos sintomas em uma doença ou distúrbio agudo ou crônico ou uma diminuição na taxa de recaída, como por exemplo no caso de uma doença autoimune recidivante ou remitente ou uma diminuição na inflamação no caso de um aspecto inflamatório de uma doença autoimune. Como usado aqui no contexto de câncer, os termos tratamento ou inibir, inibindo ou inibição de câncer referem-se a pelo menos um de: uma diminuição estatisticamente significativa na taxa de crescimento tumoral, uma cessação de crescimento tumoral ou redução no tamanho, massa, atividade metabólica ou volume do tumor, conforme medido por critérios padrão, como, mas não se limitando, aos Critérios de Avaliação de Resposta para Tumores Sólidos (RECIST) ou a um aumento estatisticamente significativo na sobrevida
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103/474 livre de progressão (PFS) ou sobrevida global (OS). Prevenir, profilaxia ou prevenção de uma doença ou distúrbio como usado no contexto desta invenção refere-se à administração de um polipeptídeo imunomodulador ou células manipuladas da invenção, isoladamente ou em combinação com outro composto, para prevenir a ocorrência ou o surgimento de uma doença ou distúrbio ou alguns ou todos os sintomas de uma doença ou distúrbio ou diminuir a probabilidade do aparecimento de uma doença ou distúrbio.
[00222] O termo antígeno específico do tumor ou TSA, como usado aqui, refere-se a uma contraestrutura que está presente primariamente em células tumorais de um mamífero, mas geralmente não encontrada em células normais do indivíduo mamífero. Um antígeno específico do tumor não precisa ser exclusivo das células tumorais, mas a porcentagem de células de um determinado mamífero que possui o antígeno específico do tumor é suficientemente alta ou os níveis do antígeno específico do tumor na superfície do tumor são suficientemente altos de modo que possam ser alvos de produtos terapêuticos antitumorais, tais como polipeptídeos imunomoduladores da invenção, e proporcionar a prevenção ou tratamento do mamífero dos efeitos do tumor. Em algumas modalidades, em uma amostra estatística aleatória de células de um mamífero com um tumor, pelo menos 50% das células que exibem uma TSA são cancerosas. Em outras modalidades, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% das células exibindo uma TSA são cancerosas.
[00223] O termo variante (também modificado ou mutante) como usado em referência a um CD80 variante significa um CD80, tal como um CD80 de mamífero (por exemplo, humano ou murino) criado por intervenção humana. O CD80 variante é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos alterada, relativamente a um CD80 não modificado ou de tipo selvagem. O CD80 variante é um polipeptí
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104/474 deo que difere de uma sequência de isoforma CD80 de tipo selvagem por uma ou mais substituições, deleções, adições ou combinações de aminoácidos destas. Para os propósitos aqui descritos, o CD80 variante contém pelo menos um domínio modificado por afinidade, pelo que uma ou mais das diferenças de aminoácidos ocorrem em um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV). Um CD80 variante pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais diferenças de aminoácidos, tais como substituições de aminoácidos. Um polipeptídeo CD80 variante exibe geralmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um CD80 de tipo selvagem ou não modificado correspondente, tal como a sequência da SEQ ID NO: 1, uma sequência madura da mesma ou uma porção da mesma contendo um domínio extracelular ou um domínio IgSF do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante exibe pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com um CD80 de tipo selvagem ou não modificado correspondente compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 76, ou SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 3030 ou SEQ ID NO: 3031.
[00224] Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente, bem como os aminoácidos que ocorrem naturalmente, estão incluídos no âmbito das substituições ou adições permitidas. Um CD80 variante não está limitada a qualquer método particular de produção e inclui, por exemplo, síntese química de novo, técnicas de DNA recombinante de novo ou suas combinações. Um CD80 variante da invenção liga-se especificamente a pelo menos um ou mais de: CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 de uma espécie de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência de
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105/474 aminoácidos alterada resulta em uma afinidade de ligação ou avidez alterada (isto é, aumentada ou diminuída) a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 em comparação com a proteína CD80 não modificada ou de tipo selvagem. Um aumento ou diminuição na afinidade de ligação ou avidez pode ser determinado utilizando ensaios de ligação bem conhecidos, tais como citometria de fluxo. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Veja-se também, Linsley et al., Immunity, Vol. 1 (9): 793-801 (1994). Um aumento na variante da afinidade ou avidez de ligação a CD80 a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 pode ser urn valor pelo menos 5% maior do que o CD80 não modificado ou de tipo selvagem e em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% maior do que o valor de controle de CD80 não modificado ou selvagem. Uma diminuição na afinidade ou avidez de ligação de CD80 a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 em um valor não superior a 95% dos valores de controle de CD80 não modificados ou de tipo selvagem e, em algumas modalidades, não superior a 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, ou sem afinidade de ligação detectável ou avidez dos valores de controle de CD80 não modificados ou de tipo selvagem. Um polipeptídeo CD80 variante é alterado na sequência primária de aminoácidos por substituição, adição ou deleção de resíduos de aminoácidos. O termo variante no contexto do polipeptídeo CD80 variante não deve ser interpretado como impondo qualquer condição para qualquer composição ou método inicial particular pelo qual o CD80 variante é criada. Um CD80 variante pode, por exemplo, ser gerado partindo de informação de sequência de CD80 de mamífero selvagem, então modelado em silica para ligação a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 e finalmente sintetizado recombinantemente ou quimicamente para produzir o CD80 variante. Em apenas um exemplo alternativo, o CD80 variante pode ser criado por mutagênese dirigida ao local de um CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Assim, o
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CD80 variante denota uma composição e não necessariamente um produto produzido por um dado processo. Pode ser utilizada uma variedade de técnicas, incluindo métodos recombinantes, síntese química ou suas combinações.
[00225] O termo tipo selvagem ou natural ou nativo como usado aqui é usado em conexão com materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucléico, proteínas (por exemplo, CD80), membros de IgSF, células hospedeiras e similares, refere-se a aqueles que são encontrados na natureza e não modificados pela intervenção humana.
II. POLIPEPTÍDEOS DE CD80 VARIANTE [00226] São aqui fornecidos polipeptídeos CD80 variantes que exibem atividade de ligação ou afinidade alterada (aumentada ou diminuída) para um ou mais parceiros de ligação a CD80. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação a CD80 é CD28, PD-L1 ou CTLA-4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos, tais como uma ou mais substituições (alternativamente, mutações ou substituições), deleções ou adições em um domínio de superfamília de imunoglobulina (IgSF) (IgD) em relação a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado ou uma porção de um CD80 de tipo selvagem ou não modificado contendo o IgD ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Assim, um polipeptídeo CD80 variante fornecido é ou compreende uma IgD variante (daqui em diante denominada vlgD) na qual a uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) está em uma IgD.
[00227] Em algumas modalidades, a IgD compreende um domínio IgV ou um domínio IgC (por exemplo, lgC2) ou fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC (por exemplo, lgC2), ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a IgD pode ser apenas uma IgV, a combinação da IgV e IgC, incluindo todo o domínio
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107/474 extracelular (ECD), ou qualquer combinação de domínios lg de CD80. A Tabela 2 fornece exemplos de resíduos que correspondem às regiões IgV ou IgC de CD80. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém um domínio IgV, ou um domínio IgC ou fragmentos de ligação específica dos mesmos, nos quais a modificação de pelo menos um aminoácido (por exemplo, substituição) no domínio IgV ou no domínio IgC ou o fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém um domínio IgV ou seus fragmentos de ligação específica nos quais a pelo menos uma das modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) está no domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, em virtude da atividade de ligação alterada ou afinidade, o domínio IgV ou domínio IgC alterado um domínio IgSF modificado por afinidade.
[00228] Em algumas modalidades, a variante modificada em mais um domínio IgSF relativamente sequência de uma sequência CD80 não modificada. Em algumas modalidades, a sequência CD80 não modificada é um CD80 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o CD80 não modificado ou de tipo selvagem tem a sequência de um CD80 nativo ou um ortólogo deste. Em algumas modalidades, o CD80 não modificado é ou compreende o domínio extracelular (ECD) de CD80 ou uma porção deste contendo um ou mais domínios de IgSF (ver Tabela 2). Por exemplo, um polipeptídeo CD80 não modificado é ou compreende um domínio IgV estabelecido como aminoácidos 35135 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 35-138 da SEQ ID NO: 1 (ver SEQ ID NO: 3030), ou aminoácidos 35-141 da SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, um polipeptídeo CD80 não modificado é ou compreende um domínio IgC estabelecido como aminoácidos 145-230 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 142-232 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um polipeptídeo CD80 não modificado
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108/474 ou de tipo selvagem compreende um domínio IgV e um domínio ou domínios IgC. No entanto, o polipeptídeo CD80 variante não necessita de compreender tanto o domínio IgV como o domínio ou domínios IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende ou consiste essencialmente no domínio IgV ou em um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende ou consiste essencialmente no domínio IgC ou nos fragmentos de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o CD80 variante é solúvel e não possui um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o CD80 variante compreende ainda um domínio transmembranar e, em alguns casos, também um domínio citoplasmático.
[00229] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado é um polipeptídeo CD80 de mamífero, tal como, mas não limitado a, um humano, um camundongo, um macaco cynomolgus ou um polipeptídeo CD80 de rato. Em algumas modalidades, a sequência CD80 selvagem ou não modificada é humana.
[00230] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado possui (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou uma forma madura da mesma sem a sequência sinal, (ii) uma sequência de aminoácidos que exibe a menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade sequencial com a SEQ ID NO 1 ou uma forma madura da mesma, ou (iii) é uma porção de (i) ou (ii) contendo um domínio de IgV ou um domínio de IgC ou respectivos fragmentos de ligação específica.
[00231] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado é ou compreende um domínio extracelular do CD80 ou uma porção do mesmo. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem
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109/474 compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um seu ortólogo. Por exemplo, o polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem pode compreender (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou (iii) é um fragmento de ligação específica de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou um domínio IgC. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de tipo selvagem ou não modificado de CD80 capaz de se ligar a uma ou mais proteínas de ligação a CD80, tal como um ou mais de CTLA-4, PD-L1 ou CD28.
[00232] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado contém um domínio IgV ou um domínio IgC, ou um fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio IgV do polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 76, 150, 3030 ou 3031 ou um seu ortólogo. Por exemplo, o domínio IgV do polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem pode conter (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 76, 150, 3030 ou 3031, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade sequencial a SEQ ID NO: 76, 150, 3030 ou 3031, ou (iii) é um fragmento de ligação específica de (i) ou (ii). Em algumas modalidades, o domínio de IgV de tipo selvagem ou não modificado capaz de se ligar a uma ou mais proteínas de ligação a CD80, tal como um ou mais de CTLA-4, PD-L1 ou CD28.
[00233] Em algumas modalidades, o domínio IgC do polipeptídeo CD80 do tipo selvagem ou não modificado compreende a sequência
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110/474 de aminoácidos estabelecida como resíduos 145-230, 154-232, ou 142-232 da SEQ ID NO: 1, ou um seu ortólogo. Por exemplo, o domínio IgC do polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem pode conter (i) a sequência de aminoácidos estabelecida como resíduos 145-230, 154-232, ou 142-232 da SEQ ID NO: 1, (ii)) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com os resíduos 145-230, 154-232, ou 142-232 da SEQ ID NO: 1, ou (iii) é um fragmento de ligação específica de (i) ou (ii). Em algumas modalidades, o domínio de IgC selvagem ou não modificado capaz de se ligar a uma ou mais proteínas de ligação a CD80.
[00234] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado contém um fragmento de ligação específica de CD80, tal como um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica pode ligar-se a CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. O fragmento de ligação específica pode ter um comprimento de aminoácidos de pelo menos 50 aminoácidos, tal como pelo menos 60, 70, 80, 90, 100 ou 110 aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica do domínio IgV contém uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% do comprimento do domínio de IgV apresentado como aminoácidos 35-135, 35-138, 37-138 ou 35141 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação específica do domínio IgC compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% do comprimento do domínio IgC estabelecido como aminoácidos 145-230, 154-232, 142232 da SEQ ID NO: 1.
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111/474 [00235] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio ECD ou uma porção deste compreendendo um ou mais domínios de IgSF modificados por afinidade. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes podem compreender um domínio IgV ou um domínio IgC, ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do domínio IgC em que pelo menos um dos domínios IgV ou IgC contém o ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições). Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes podem compreender um domínio IgV e um domínio IgC, ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV e um fragmento de ligação específica do domínio IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um domínio IgV de comprimento total. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um domínio IgC de comprimento total. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um domínio IgV de comprimento total e um domínio IgC de comprimento total. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um domínio IgV de comprimento total e um fragmento de ligação específica de um domínio IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um fragmento de ligação específica de um domínio IgV e um domínio IgC de comprimento total. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um fragmento de ligação específica de um domínio IgV e um fragmento de ligação específica de um domínio IgC.
[00236] Em qualquer de tais modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) dos polipeptídeos
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CD80 variantes podem estar localizadas em qualquer um ou mais dos domínios de polipeptídeos CD80. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) estão localizadas no domínio extracelular do polipeptídeo CD80 variante. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) estão localizadas no domínio IgV ou fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) estão localizadas no domínio IgC ou fragmento de ligação específica do domínio IgC.
[00237] Geralmente, cada um dos vários atributos de polipeptídeos é descrito separadamente abaixo (por exemplo, polipeptídeos solúveis e ligados à membrana, afinidade de CD80 para CTLA-4, PD-L1 e CD28, número de variações por cadeia polipeptídica, número de cadeias polipeptídicas ligadas, o número e a natureza das alterações de aminoácidos por variante CD80, etc.). No entanto, como ficará claro para o versado na técnica, qualquer polipeptídeo particular pode compreender uma combinação destes atributos independentes. Entendese que a referência a aminoácidos, incluindo a uma sequência específica estabelecida como uma SEQ ID NO utilizada para descrever a organização do domínio de um domínio IgSF, é para fins ilustrativos e não pretende limitar o âmbito das modalidades fornecidas. Entende-se que os polipeptídeos e a descrição dos seus domínios são derivados teoricamente com base na análise de homologia e alinhamentos com moléculas semelhantes. Assim, o locus exato pode variar e não é necessariamente o mesmo para cada proteína. Assim, o domínio IgE específico, tal como domínio IgV específico ou domínio IgC, pode ter vários aminoácidos (tal como um, dois, três ou quatro) mais longos ou mais curtos.
[00238] Além disso, várias modalidades da invenção, como discuti
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113/474 do abaixo, são frequentemente fornecidas dentro do significado de um termo definido, como divulgado acima. As modalidades descritas em uma definição particular devem, portanto, ser interpretadas como sendo incorporadas por referência quando o termo definido é utilizado na discussão dos vários aspectos e atributos aqui descritos. Assim, os títulos, a ordem de apresentação dos vários aspectos e modalidades e a divulgação separada de cada atributo independente não pretendem ser uma limitação ao âmbito da presente divulgação.
A. Modificações Exemplificativas [00239] São aqui fornecidos polipeptídeos CD80 variantes contendo pelo menos um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV ou IgC) ou um fragmento de ligação específica do mesmo relativo a um domínio IgSF contido em um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tal que o polipeptídeo CD80 variante exibe atividade de ligação ou afinidade alterada (aumentada ou diminuída) para um ou mais parceiros de ligação cognatos, CTLA-4, PD-L1 ou CD28, em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação para CTLA-4, PD-L1 ou CD28 que difere daquela de uma sequência de controle do polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificada como determinado, por exemplo, por imunoensaios ELISA de fase sólida, citometria de fluxo ou ressonância plasmônica de superfície (Biacore). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. O CD28, PD-L1 e/ou o CTLA-4 podem ser uma proteína de mamífero, tal como uma proteína humana ou uma proteína murina.
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114/474 [00240] A atividade de ligação ou afinidade alterada, por exemplo aumentada ou diminuída, para CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28 é conferida por uma ou mais modificações de aminoácidos em um domínio IgSF de um domínio IgSF selvagem ou não modificado. A sequência CD80 de tipo selvagem ou não modificada não tem necessariamente de ser utilizada como uma composição de partida para gerar os polipeptídeos CD80 variantes aqui descritos. Por isso, a utilização do termo substituição não implica que as modalidades proporcionadas estejam limitadas a um método particular de produção de polipeptídeos CD80 variantes. Variantes Os polipeptídeos CD80 podem ser feitos, por exemplo, por síntese peptídica de novo e, assim, não requerem necessariamente uma substituição no sentido de alterar um códon para codificar a substituição. Este princípio também se estende aos termos adição e deleção de um resíduo de aminoácido que também não implica um método particular de fabricação. Os meios pelos quais os polipeptídeos variantes CD80 são concebidos ou criados não estão limitados a qualquer método particular. Em algumas modalidades, no entanto, um ácido nucleico codificando CD80 de tipo selvagem ou não modificado mutagenizado de material gênico CD80 de tipo selvagem ou não modificado e pesquisado quanto a afinidade de ligação específica desejada e/ou indução de expressão de IFN-gama ou outra atividade funcional de acordo com os métodos divulgados nos Exemplos ou outros métodos conhecidos de um versado na técnica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante é sintetizado de novo utilizando sequências de proteína ou de ácido nucleico disponíveis em qualquer número de bases de dados disponíveis ao público e depois rastreado. O Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia fornece essas informações e seu site é acessível publicamente pela Internet, assim como o banco de dados UniProtKB, conforme discutido anteriormente.
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115/474 [00241] Salvo indicação em contrário, tal como indicado ao longo da presente divulgação, as modificações de aminoácidos são designadas pelo número de posição de aminoácidos correspondendo à numeração de posições da sequência de ECD não modificada apresentada na SEQ ID NO: 2 ou, quando aplicável, a sequência de IgV não modificada apresentada na SEQ ID NO: 76, 150, 3030 ou 3031 como se segue:
[00242] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMV LTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKY EKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPE PHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCL IKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN (SEQ ID NO: 2) [00243] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMV LTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKY EKDAFKREHLAEVT (SEQ ID NO: 76) [00244] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVL TMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVIQALRPSDEGTYECVVLKYE KDGFKREHLAEVTLSVKAD (SEQ ID NO: 150) [00245] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVL TMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYE KDAFKREHLAEVTLSV (SEQ ID NO: 3030) [00246] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVL TMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYE KDAFKREHLAEVTLSVKAD (SEQ ID NO: 3031) [00247] Está dentro do nível de um versado na técnica identificar a posição correspondente de uma modificação, por exemplo, substituição de aminoácidos, em um polipeptídeo CD80, incluindo a sua porção contendo um domínio IgSF (por exemplo, IgV) do mesmo, tal como por alinhamento de uma sequência de referência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 150 ou SEQ ID NO: 3030 ou SEQ
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ID NO: 3031. Na listagem de modificações ao longo desta divulgação, a posição de aminoácido é indicada no meio, com o correspondente aminoácido não modificado (por exemplo, tipo selvagem) antes do número e a substituição de aminoácidos variante identificada listada após o número. Se a modificação é uma deleção da posição, um dei é indicado, e se a modificação é uma inserção na posição, um ins é indicado. Em alguns casos, uma inserção é listada com a posição de aminoácido indicada no meio, com o correspondente aminoácido não modificado (por exemplo, tipo selvagem) listado antes e depois do número e da inserção de aminoácidos variante identificados listados após o aminoácido não modificado (por exemplo, tipo selvagem).
[00248] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em uma sequência CD80 de tipo selvagem ou não modificada. A uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) podem estar no ectodomínio (domínio extracelular) da sequência CD80 de tipo selvagem ou não modificada, tal como o domínio extracelular. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) estão no domínio de IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) estão no domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades do polipeptídeo CD80 variante, algumas das modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições) estão no domínio IgV ou em um fragmento de ligação específica do mesmo, e algumas das modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições) estão no domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
[00249] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou
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117/474 modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições). As modificações (por exemplo, substituições) podem estar no domínio IgV ou no domínio IgC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) no domínio de IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem até 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) no domínio de IgC ou seu fragmento de ligação específica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem pelo menos cerca de 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031.
[00250] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica correspondente às posições 7, 13, 15, 16, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 41,42, 43, 46, 47, 48, 51, 53, 54, 55,
57, 58, 61,62, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 92, 94, 95 e/ou 97 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica correspondente às posições 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57,
58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 ou 84 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma modificação, por exemplo, substituição de aminoácidos, em qual
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118/474 quer 2 ou mais das posições precedentes, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais das posições.
[00251] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas entre E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18T, H18T, H18V, V20A, V20I, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P, A26Q, A26R, A26S, A26T, Q27H, Q27L, T28Y, I30F, I30T, I30V, Y31C, Y31S,
Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R, T41S, M42I,
M42V, M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47V,
M48Y, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F,
Y53H, K54E, K54N, K54R, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, N63D, L65P, I67L, I67V, V68E, V68I, V68L, I69F, L70M, L70P, L70Q, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S, D76H, E77A,
G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R,V84A,
V84I, L85E, L85M, L85Q, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87Q,E88V,
D90P, F92S, F92V, K93T, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M eL97Q.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de E7D, E23D, E23G, A26E, A26P, A26S, A26T, I30T, I30T, E35G, D35E, D35V, P51A, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, L65P, A71D, A71G, R73S, G78A, T79A, T79I, T79L, T79P, C82R, V84A, V84I, L85Q ou uma substituição de aminoácido conservativa do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende quaisquer 2 ou mais das substituições de aminoácidos anteriores, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais das substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes compreendem apenas uma diferença de aminoácido em comparação com o polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem compreendendo apenas uma das substituições de aminoácidos preceden
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119/474 tes.
[00252] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais (por exemplo, substituições) em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente à posição (ou posições) 12, 18, 29, 31, 37, 38, 41, 43, 44, 47, 61,67, 68, 69, 70, 72, 77, 83, 88, 89, 90, 91, ou 93 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas entre A12T, A12V, H18L, H18Y, R29H, Y31H, K37E, M38T, T41A, M43I, S44P, M47L, M47T, I67T, V68A, V68M, I69T, L70P, L70R, L70Q, L72P, E77G, V83A, V83I, E88D, K89E, K89N, D90G, D90N, A91T, K93R.
[00253] Uma substituição de aminoácidos conservativa é qualquer aminoácido que se enquadre na mesma classe de aminoácidos que os aminoácidos substituídos, além do aminoácido de tipo selvagem ou não modificado. As classes de aminoácidos são alifáticas (glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina), contendo hidroxila ou enxofre (serina, cisteína, treonina e metionina), cíclica (prolina), aromática (fenilalanina, tirosina, triptofano), básica (histidina, lisina e arginina) e ácida/amida (aspartato, glutamato, asparagina e glutamina). Assim, por exemplo, uma substituição conservativa de aminoácidos da substituição A26E inclui as substituições de aminoácidos A26D, A26N e A26Q. [00254] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 18, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é a substituição de aminoácidos H18Y ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modali
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120/474 dades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, subestações de aminoácidos, em uma ou mais posições 26, 35, 46, 47, 68, 71, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos uma ou mais substituições de aminoácidos A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G, L85Q ou D90G ou uma sua substituição de aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/A26E, H18Y/E35D, H18Y/D46E, H18Y/D46V, H18Y/M47I, H18Y/M47L, H18Y/V68M, H18Y/A71G, H18Y/L85Q, H18Y/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode proporcionar modificações adicionais de aminoácidos de acordo com as modalidades fornecidas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00255] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 26, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido é a substituição de aminoácido A26E ou uma substituição conservadora de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 35, 46, 47, 68, 71, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G, L85Q ou D90G ou uma sua substituição de aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/A26E, A26E/E35D, A26E/D46E, A26E/D46V, A26E/M47I,
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A26E/M47L, A26E/V68M, A26E/A71G, A26E/L85Q, A26E./D90G. Ο polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito. [00256] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácido em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 35, com referência à numeração de posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é a substituição de aminoácidos E35D ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 46, 47, 68, 71, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G, L85Q ou D90G ou uma sua substituição de aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/ E35D, A26E/E35D, E35D/D46E, E35D/D46V, E35D/M47I, E35D/ M47L, E35D/V68M, E35D/A71G, E35D/L85Q, E35D./D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 46, com referência à numeração de posições apresen
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122/474 tadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos a substituição de aminoácidos D46E ou D46V ou uma sua substituição de aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 47, 68, 71, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a modificação de um ou mais aminoácidos é uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, M47I, M47L, V68M, A71G, L85Q ou D90G, ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/D46E, A26E/D46E, E35D/D46E, D46E/M47I, D46E/M47L, D46E/V68M, D46E/A71G, D46E/L85Q, D46E/D90G. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/D46V, A26E/D46V, E35D/D46V, D46V/M47I, D46V/M47L, D46V/V68M, D46V/A71G, D46V/L85Q, D46V/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00257] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácido em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 47, com referência à numeração de posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido é a substituição de aminoácido M47I ou M47L ou uma substituição conservadora de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 46, 68, 71, 85 ou 90. Em
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123/474 algumas modalidades, a modificação de um ou mais aminoácidos é uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, V68M, A71G, L85Q ou D90G, ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/M47I, A26E/M47I, E35D/M47I, M47I/D46E, M47I/D46V, M47I/V68M, M47I/ A71G, M47I/L85Q ou M47I/D90G. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/M47L, A26E/M47L, E35D/M47L, M47L/D46E, M47L/D46V, M47L/V68M, M47L/A71G, M47L/L85Q ou M47L/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00258] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou em um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 68, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é a substituição de aminoácidos V68M ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 46, 47, 71, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a modificação de um ou mais aminoácidos é uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, A71G, L85Q ou D90G, ou uma substituição conservativa de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/ V68M, A26E/V68M, E35D/V68M, D46E/V68M, D46V/D68M, M47I/
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V68M, M47L/V68M, V68M/A71G, V68M/L85Q, V68M/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00259] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 71, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido é a substituição de aminoácido A71G ou uma substituição conservadora de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 46, 47, 68, 85 ou 90. Em algumas modalidades, a modificação de um ou mais aminoácidos é uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, L85Q ou D90G, ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/A71G, A26E/A71G, E35D/A71G, D46E/A71G, D46V/D68M, M47I/A71G, M47L/A71G, V68M/A71G, A71G/L85Q, A71G/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00260] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 85, com referência à numeração de po
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125/474 sições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é a substituição de aminoácidos L85Q ou uma substituição de aminoácidos conservativa da mesma. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 46, 47, 68, 71 ou 90. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G ou D90G ou uma sua substituição de aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/L85Q, A26E/L85Q, E35D/L85Q, D46E/L85Q, D46V/D68M, M47I/L85Q, M47L/L85Q, V68M/L85Q, A71G/L85Q, L85Q/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito.
[00261] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma modificação de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente à posição 90, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é a substituição de aminoácidos D90G ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante contém ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições 18, 26, 35, 46, 47, 68, 71 ou 85. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos uma ou mais substituições de aminoácidos H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G ou L85Q ou uma sua substituição de
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126/474 aminoácidos conservativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/D90G, A26E/D90G, E35D/D90G, D46E/D90G, D46V/D68M, M47I/D90G, M47L/D90G, V68M/D90G, A71G/D90G, L85Q/D90G. O polipeptídeo CD80 variante pode incluir outras modificações de aminoácidos, tais como quaisquer aqui descritas, de acordo com as modalidades proporcionadas. A Tabela 1 apresenta modificações de aminoácidos exemplificativas e polipeptídeos CD80 variantes como descrito. [00262] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são H18Y/M47I/T57I/A71G, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q ou H18Y/A71D/L72P/E88V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 41, 59, 66, 115, 133, 140, 189, 207 ou 214.
[00263] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são A 26E/E35D/M47L/L85Q. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 73, 147 ou 221.
[00264] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, E35D/A71D, E35D/M47I, E35D/T57I/
L70Q/A71D, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D. E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, E35D/T57A/
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A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E35D/
M43I/A71 D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/ E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, A26E/ E35D/ M47L/L85Q, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 19, 20, 28, 29, 37, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59. 60, 64, 68, 69, 70, 73, 75, 93, 94, 102, 103, 111, 120, 121, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 138. 142, 143, 144, 147, 149, 167, 168, 176, 177, 185, 194, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 207, 208, 212, 216, 217, 218, 221 ou 223.
[00265] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são E 35D/D46V/L85Q, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V ou D46E/A71D. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 55, 69, 74, 129, 143, 148, 203, 217 ou 222.
[00266] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, E35D/M47I, M47L/V68A, M47I/E88D,
H18Y/M47I/T57I/A71G, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D/M47I/L70M, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, E35D/M47L, A26E/E35D/M47L/ L85Q. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 19, 20, 29, 33, 38, 41, 49, 51, 56, 60, 73, 93, 94, 103, 107, 112. 115, 123, 125, 130, 134, 147, 167, 168, 177, 181, 186, 189, 197, 199, 204, 208, 221.
[00267] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80
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128/474 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são A26E/E35D/M47L/L85Q. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 62, 136, 210.
[00268] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são H18Y/M47I/T57I/A71G ou V22L/E35D/M43L/A71G/D76H. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado nas SEQ ID NO: 41, 70, 115, 144, 189 ou 218.
[00269] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são A26P/E35D/M43I/L85Q/ E88D, E35D/D46V/L85Q, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/ A71D/L85Q ou A26E/E35D/M47L/L85Q. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 54, 55, 58, 59, 73, 128, 129, 132, 133, 147, 202, 203, 206, 207 ou 221.
[00270] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo em uma posição correspondente a E35D e M47L. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D e M47I. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D e A71G. Em algumas modalidades, o polipep
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129/474 tídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D e M47V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D e V68M. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a H18Y e E35D.
[00271] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende pelo menos três modificações de aminoácidos, em que as pelo menos três modificações incluem uma modificação em três ou mais posições correspondentes às posições 18, 26, 35, 46, 47, 68, 71, 85 ou 90, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a modificação de pelo menos três aminoácidos compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a H18Y, A26E, E35D, D46E, D46V, M47I, M47L, V68M, A71G, L85Q ou D90G ou uma substituição conservadora de aminoácidos do mesmo.
[00272] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D/M47L/V68M.
[00273] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a E35D/M47V/V68M.
[00274] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modifi
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130/474 cado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondendo a E35D/M47L/L85Q.
[00275] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a H18Y/E35D/M47I.
[00276] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende qualquer uma das substituições (mutações) listadas na Tabela 1. A Tabela 1 também proporciona sequências exemplificativas por referência à SEQ ID NO para o domínio extracelular (ECD) ou domínio de IgV de CD80 de tipo selvagem ou polipeptídeos CD80 variantes exemplificativos. Conforme indicado, o locus ou os resíduos exatos correspondentes a um determinado domínio podem variar, dependendo dos métodos usados para identificar ou classificar o domínio. Além disso, em alguns casos, os aminoácidos adjacentes de N e/ou Cterminal de um dado domínio (por exemplo, IgV) também podem ser incluídos em uma sequência de um polipeptídeo IgSF variante, de modo a garantir o dobramento adequado do domínio quando expresso. Assim, entende-se que a exemplificação das SEQ ID NOs na Tabela 1 não deve ser interpretada como limitativa. Por exemplo, o domínio particular, tal como o domínio IgV, de um polipeptídeo CD80 variante pode ter vários aminoácidos mais compridos ou mais curtos, tais como 1 a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos mais compridos ou mais curtos, do que a sequência de aminoácidos apresentada na respectiva SEQ ID NO.
[00277] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende qualquer uma das sequências do domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 375, 2009-2104, 2297-2507, 2930-2960). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma sequência polipeptídica
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131/474 que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tais como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências do domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-75, 2009- 2104, 2297-2507, 2930-2960) e contém a modificação (ou modificações) de aminoácidos, por exemplo, substituição (ou substituições), não presente no CD80 selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências do domínio extracelular (ECD) listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 22972507, 2930 -2960) e contém a modificação (ou modificações) de aminoácidos, por exemplo, substituição (ou substituições), não presente no CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929, 2961 a 3022). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante compreende uma sequência polipeptídica que exibe pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, tal como pelo menos 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105- 2296, 2508-2929, 2961 a 3022) e contém a modificação (ou modificações) de aminoácidos, por exemplo, substituição (ou substituições), não presente no CD80 selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 vari
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132/474 ante compreende um fragmento de ligação específica de qualquer uma das sequências de IgV listadas na Tabela 1 (isto é, qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929, 2961 3022) e contém a modificação (ou modificações) de aminoácidos, por exemplo, substituição (substituições), não presente no CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00278] A Tabela 1 também proporciona sequências exemplificativas por referência a SEQ ID NO para o domínio extracelular (ECD) ou domínio de IgV de CD80 de tipo selvagem ou polipeptídeos CD80 variantes exemplificativos. Conforme indicado, o locus ou os resíduos exatos correspondentes a um determinado domínio podem variar, dependendo dos métodos usados para identificar ou classificar o domínio. Além disso, em alguns casos, os aminoácidos adjacentes de N e/ou C-terminal de um dado domínio (por exemplo, ECD) também podem ser incluídos em uma sequência de um polipeptídeo IgSF variante, tal como assegurar o dobramento adequado do domínio quando expresso. Assim, entende-se que a exemplificação da SEQ ID NOS na Tabela 1 não deve ser interpretada como limitativa. Por exemplo, o domínio particular, tal como o domínio IgV, de um polipeptídeo CD80 variante pode ser vários aminoácidos mais longos ou mais curtos, tal como 1 a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos mais longos ou mais curtos, do que a sequência de aminoácidos apresentada na respectiva SEQ ID NO.
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TABELA 1
Tabela 1: Polipepitídeos CD80 variantes exemplificativos
Mutação(ões) CD80 ECD SEQ ID NO IgV
SEQ ID NO
Tipo selvagem 2 76 3031
L70P 3 77 151
I30F/L70P 4 78 152
Q27H/T41S/A71D 5 79 153
I30T/L70R 6 80 154
T13R/C16R/L70Q/A71D 7 81 155
T57I 8 82 156
M43I/C82R 9 83 157
V22L/M38V/M47T/A71D/L85M 10 84 158
I30V/T57I/L70P/A71D/A91T 11 85 159
V22I/L70M/A71D 12 86 160
N55D/L70P/E77G 13 87 161
T57A/I69T 14 88 162
N55D/K86M 15 89 163
L72P/T79I 16 90 164
L70P/F92S 17 91 165
T79P 18 92 166
E35D/M47I/L65P/D90N 19 93 167
L25S/E35D/M47I/D90N 20 94 168
A71D 22 96 170
E81K/A91S 24 98 172
A12V/M47V/L70M 25 99 173
K34E/T41A/L72V 26 100 174
T41S/A71D/V84A 27 101 175
E35D/A71D 28 102 176
E35D/M47I 29 103 177
K36R/G78A 30 104 178
Q33E/T41A 31 105 179
M47V/N48H 32 106 180
M47L/V68A 33 107 181
S44P/A71D 34 108 182
Q27H/M43I/A71D/R73S 35 109 183
E35D/T57I/L70Q/A71D 37 111 185
M47I/E88D 38 112 186
M42I/I61V/A71D 39 113 187
P51A/A71D 40 114 188
H18Y/M47I/T57I/A71G 41 115 189
V20I/M47V/T57I/V84I 42 116 190
V20I/M47V/A71D 43 117 191
A71D/L72V/E95K 44 118 192
V22L/E35G/A71D/L72P 45 119 193
E35D/A71D 46 120 194
E35D/I67L/A71D 47 121 195
Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I 48 122 196
T13R/M42V/M47I/A71D 49 123 197
E35D 50 124 198
E35D/M47I/L70M 51 125 199
E35D/A71D/L72V 52 126 200
E35D/M43L/L70M 53 127 201
A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D 54 128 202
E35D/D46V/L85Q 55 129 203
Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D 56 130 204
M47V/I69F/A71D/V83I 57 131 205
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E35D/T57A/A71D/L85Q 58 132 206
H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q 59 133 207
E35D/M47L 60 134 208
E23D/M42V/M43I/I58V/L70R 61 135 209
V68M/L70M/A71D/E95K 62 136 210
N55I/T57I/I69F 63 137 211
E35D/M43I/A71D 64 138 212
T41S/T57I/L70R 65 139 213
H18Y/A71D/L72P/E88V 66 140 214
V20I/A71D 67 141 215
E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M 68 142 216
A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V 69 143 217
V22L/E35D/M43L/A71G/D76H 70 144 218
E35G/K54E/A71D/L72P 71 145 219
L70Q/A71D 72 146 220
A26E/E35D/M47L/L85Q 73 147 221
D46E/A71D 74 148 222
Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W 75 149 223
A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E 2009 2105 2201
A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q 2010 2106 2202
E35D/M47L/L85Q 2011 2107 2203
A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2012 2108 2204
A26E/Q33L/E35D/M47L 2013 2109 2205
H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2014 2110 2206
Q33L/E35D/M47I 2015 2111 2207
H18Y/Q33L/E35D/M47I 2016 2112 2208
Q33L/E35D/D46E/M47I 2017 2113 2209
Q33R/E35D/D46E/M47I 2018 2114 2210
H18Y/E35D/M47L 2019 2115 2211
Q33L/E35D/M47V 2020 2116 2212
Q33L/E35D/M47V/T79A 2021 2117 2213
Q33L/E35D/T41S/M47V 2022 2118 2214
Q33L/E35D/M47I/L85Q 2023 2119 2215
Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q 2024 2120 2216
Q33L/E35D/M47V/L85Q 2025 2121 2217
A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q 2026 2122 2218
Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q 2027 2123 2219
V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V 2028 2124 2220
E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q 2029 2125 2221
S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2030 2126 2222
E7D/E35D/M47I/L97Q 2031 2127 2223
Q33L/E35D/T41S/M43I 2032 2128 2224
E35D/M47I/K54R/L85E 2033 2129 2225
Q33K/E35D/D46V/L85Q 2034 2130 2226
Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G 2035 2131 2227
H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q 2036 2132 2228
Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K 2037 2133 2229
Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R 2038 2134 2230
E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W 2039 2135 2231
A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W 2040 2136 2232
Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N 2041 2137 2233
H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F 2042 2138 2234
V22A/E35D/V68E/A71D 2043 2139 2235
Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S 2044 2140 2236
V22A/R29H/E35D/D46E/M47I 2045 2141 2237
Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W 2046 2142 2238
H18Y/E35D/V68M/L97Q 2047 2143 2239
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Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D 2048 2144 2240
Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G 2049 2145 2241
E35D/M47L/A71G/L97Q 2050 2146 2242
E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q 2051 2147 2243
H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q 2052 2148 2244
E35D/D46E/M47V/L97Q 2053 2149 2245
E35D/D46V/M47I/A71G/F92V 2054 2150 2246
E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M 2055 2151 2247
Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q 2056 2152 2248
E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q 2057 2153 2249
E35D/M47V/N48K/V68M/K89N 2058 2154 2250
Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G 2059 2155 2251
R29H/E35D/M43V/M47I/I49V 2060 2156 2252
Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G 2061 2157 2253
E35D/M47I/L85Q/D90G 2062 2158 2254
E35D/M47I/T62S/L85Q 2063 2159 2255
A26E/E35D/M47L/A71G 2064 2160 2256
E35D/M47I/Y87Q/K89E 2065 2161 2257
V22A/E35D/M47I/Y87N 2066 2162 2258
Hl8Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G 2067 2163 2259
E35D/M47L/A71G/L85Q 2068 2164 2260
E35D/M47V/A71G/E88D 2069 2165 2261
E35D/A71G 2070 2166 2262
E35D/M47V/A71G 2071 2167 2263
I30V/E35D/M47V/A71G/A91V 2072 2168 2264
I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M 2073 2169 2265
V22D/E35D/M47L/L85Q 2074 2170 2266
H18Y/E35D/N48K 2075 2171 2267
E35D/T41S/M47V/A71G/K89N 2076 2172 2268
E35D/M47V/N48T/L85Q 2077 2173 2269
E35D/D46E/M47V/A71D/D9OG 2078 2174 2270
E35D/D46E/M47V/A71D 2079 2175 2271
E35D/T41S/M43I/A71G/D90G 2080 2176 2272
E35D/T41S/M43I/M47V/A71G 2081 2177 2273
E35D/T41S/M43I/M47L/A71G 2082 2178 2274
H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G 2083 2179 2275
Hl8Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D9OG 2084 2180 2276
E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N 2085 2181 2277
Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G 2086 2182 2278
V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G 2087 2183 2279
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D 2088 2184 2280
E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G 2089 2185 2281
E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q 2090 2186 2282
E35D/M47V/T62A/A71D/K93E 2091 2187 2283
E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E 2092 2188 2284
E35D/M43I/M47V/K89N 2093 2189 2285
E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y 2094 2190 2286
E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q 2095 2191 2287
V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q 2096 2192 2288
E35D/T41S/M47V/L97Q 2097 2193 2289
E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R 2098 2194 2290
E35D/A71D/L72V/R73H/E81K 2099 2195 2291
Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q 2100 2196 2292
E35D/M38T/D46E/M47V/N48S 2101 2197 2293
Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L 2102 2198 2294
E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q 2103 2199 2295
T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G 2104 2200 2296
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E35D/N48K/L72V 2297 2508 2719
E35D/T41S/N48T 2298 2509 2720
D46V/M47I/A71G 2299 2510 2721
M47I/A71G 2300 2511 2722
E35D/M43I/M47L/L85M 2301 2512 2723
E35D/M43I/D46E/A71G/L85M 2302 2513 2724
Hl8Y/E35D/M47L/A71G/A9IS 2303 2514 2725
E35D/M47I/N48K/I61F 2304 2515 2726
E35D/M47V/T62S/L85Q 2305 2516 2727
M43I/M47L/A71G 2306 2517 2728
E35D/M47V 2307 2518 2729
E35D/M47L/A71G/L85M 2308 2519 2730
V22A/E35D/M47L/A71G 2309 2520 2731
E35D/M47L/A71G 2310 2521 2732
E35D/D46E/M47I 2311 2522 2733
Q27H/E35D/M47I 2312 2523 2734
E35D/D46E/L85M 2313 2524 2735
E35D/D46E/A91G 2314 2525 2736
E35D/D46E 2315 2526 2737
E35D/L97R 2316 2527 2738
H18Y/E35D 2317 2528 2739
Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M 2318 2529 2740
E35D/M47V/I61V/L85M 2319 2530 2741
E35D/M47V/L85M/R94Q 2320 2531 2742
E35D/M47V/N48K/L85M 2321 2532 2743
H18Y/E35D/M47V/N48K 2322 2533 2744
A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q 2323 2534 2745
E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L 2324 2535 2746
E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D 2325 2536 2747
E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q 2326 2537 2748
S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q /D90N 2327 2538 2749
E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G 2328 2539 2750
H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L 2329 2540 2751
deltaE10-A98 2330 2541 2752
Q33R/M47V/T62N/A71G 2331 2542 2753
H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G 2332 2543 2754
E35D/M47L/L70M 2333 2544 2755
E35D/M47L/V68M 2334 2545 2756
E35D/D46V/M47L/V68M/E88D 2335 2546 2757
E35D/D46V/M47L/V68M/D90G 2336 2547 2758
E35D/D46V/M47L/V68M/K89N 2337 2548 2759
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q 2338 2549 2760
E35D/D46V/M47L/V68M 2339 2550 2761
E35D/D46V/M47L/V70M 2340 2551 2762
E35D/D46V/M47L/V70M/L85Q 2341 2552 2763
E35D/M47V/N48K/V68M 2342 2553 2764
E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2343 2554 2765
E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C 2344 2555 2766
E35D/D46E/M47I/V68M/L85M 2345 2556 2767
E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R 2346 2557 2768
E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M 2347 2558 2769
E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q 2348 2559 2770
E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q 2349 2560 2771
E35D/M43I/M47L/V68M 2350 2561 2772
E35D/M47I/V68M/Y87N 2351 2562 2773
E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2352 2563 2774
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3270/3680
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E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V 2353 2564 2775
E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M 2354 2565 2776
E35D/M47V/N48K/V68M/L85M 2355 2566 2777
E35D/M47V/V68M/L85M 2356 2567 2778
E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D 2357 2568 2779
E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V 2358 2569 2780
H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L 2359 2570 2781
H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M 2360 2571 2782
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N 2361 2572 2783
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2362 2573 2784
H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2363 2574 2785
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G 2364 2575 2786
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V 2365 2576 2787
H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M 2366 2577 2788
H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V 2367 2578 2789
H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q 2368 2579 2790
H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M 2369 2580 2791
H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M 2370 2581 2792
Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M 2371 2582 2793
Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M 2372 2583 2794
Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M 2373 2584 2795
R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2374 2585 2796
S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M 2375 2586 2797
S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L 2376 2587 2798
T13R/E35D/M47L/V68M 2377 2588 2799
T13R/H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q 2378 2589 2800
T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M /L85M 2379 2590 2801
T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M 2380 2591 2802
T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M 2381 2592 2803
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M 2382 2593 2804
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q 2383 2594 2805
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M 2384 2595 2806
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q 2385 2596 2807
T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M 2386 2597 2808
T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M 2387 2598 2809
V22D/E24D/E35D/M47L/V68M 2388 2599 2810
V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G 2389 2600 2811
V22D/E24D/E35D/M47V/V68M 2390 2601 2812
D4 6V 2391 2602 2813
M47L 2392 2603 2814
V68M 2393 2604 2815
L85Q 2394 2605 2816
E35D/D46V 2395 2606 2817
E35D/V68M 2396 2607 2818
E35D/L85Q 2397 2608 2819
D46V/M47L 2398 2609 2820
D46V/V68M 2399 2610 2821
D46V/L85Q 2400 2611 2822
M47L/V68M 2401 2612 2823
M47L/L85Q 2402 2613 2824
V68M/L85Q 2403 2614 2825
E35D/D46V/M47L 2404 2615 2826
E35D/D46V/V68M 2405 2616 2827
E35D/D46V/L85Q 2406 2617 2828
E35D/V68M/L85Q 2407 2618 2829
D46V/M47L/V68M 2408 2619 2830
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3271/3680
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D46V/M47L/L85Q 2409 2620 2831
D46V/V68M/L85Q 2410 2621 2832
M47L/V68M/L85Q 2411 2622 2833
E35D/D46V/M47L/L85Q 2412 2623 2834
E35D/D46V/V68M/L85Q 2413 2624 2835
E35D/M47L/V68M/L85Q 2414 2625 2836
D46V/M47L/V68M/L85Q 2415 2626 2837
M4 7V 2416 2627 2838
N48K 2417 2628 2839
K89N 2418 2629 2840
E35D/N48K 2419 2630 2841
E35D/K89N 2420 2631 2842
M47V/N48K 2421 2632 2843
M47V/V68M 2422 2633 2844
M47V/K89N 2423 2634 2845
N48K/V68M 2424 2635 2846
N48K/K89N 2425 2636 2847
V68M/K89N 2426 2637 2848
E35D/M47V/N48K 2427 2638 2849
E35D/M47V/V68M 2428 2639 2850
E35D/M47V/K89N 2429 2640 2851
E35D/N48K/V68M 2430 2641 2852
E35D/N48K/K89N 2431 2642 2853
E35D/V68M/K89N 2432 2643 2854
M47V/N48K/V68M 2433 2644 2855
M47V/N48K/K89N 2434 2645 2856
M47V/V68M/K89N 2435 2646 2857
N48K/V68M/K89N 2436 2647 2858
E35D/M47V/N48K/K89N 2437 2648 2859
E35D/M47V/V68M/K89N 2438 2649 2860
E35D/N48K/V68M/K89N 2439 2650 2861
M47V/N48K/V68M/K89N 2440 2651 2862
E35D/D46V/M47V/N48K/V68M 2441 2652 2863
E35D/D46V/M47V/V68M/L85Q 2442 2653 2864
E35D/D46V/M47V/V68M/K89N 2443 2654 2865
E35D/M47V/N48K/V68M/L85Q 2444 2655 2866
E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N 2445 2656 2867
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2446 2657 2868
Hl8Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D9OG 2447 2658 2869
Hl8Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D9OG 2448 2659 2870
Hl8Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D9OG 2449 2660 2871
Hl8Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D9OG 2450 2661 2872
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2451 2662 2873
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2452 2663 2874
E35D/M47L/V68M/A71G/D9OG 2453 2664 2875
Hl8Y/M47L/V68M/A71G/D9OG 2454 2665 2876
Hl8Y/A26E/V68M/A71G/D9OG 2455 2666 2877
Hl8Y/A26E/E35D/A71G/D9OG 2456 2667 2878
Hl8Y/A26E/E35D/M47L/D9OG 2457 2668 2879
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M 2458 2669 2880
A26E/M47L/V68M/A71G/D9OG 2459 2670 2881
A26E/E35D/V68M/A71G/D9OG 2460 2671 2882
A26E/E35D/M47L/A71G/D9OG 2461 2672 2883
A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2462 2673 2884
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2463 2674 2885
Hl8Y/E35D/V68M/A71G/D9OG 2464 2675 2886
Hl8Y/E35D/M47L/A71G/D9OG 2465 2676 2887
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3272/3680
139/474
H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G 2466 2677 2888
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G 2467 2678 2889
Hl8Y/A26E/M47L/A71G/D90G 2468 2679 2890
H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G 2469 2680 2891
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G 2470 2681 2892
H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G 2471 2682 2893
H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G 2472 2683 2894
Hl8Y/A26E/E35D/M47L/A71G 2473 2684 2895
M47L/V68M/A71G/D9OG 2474 2685 2896
Hl8Y/V68M/A71G/D9OG 2475 2686 2897
Hl8Y/A26E/A71G/D9OG 2476 2687 2898
Hl8Y/A26E/E35D/D9OG 2477 2688 2899
H18Y/A26E/E35D/M47L 2478 2689 2900
E35D/V68M/A71G/D9OG 2479 2690 2901
E35D/M47L/A71G/D9OG 2480 2691 2902
E35D/M47L/V68M/D90G 2481 2692 2903
E35D/M47L/V68M/A71G 2482 2693 2904
A26E/V68M/A71G/D9OG 2483 2694 2905
A26E/M47L/A71G/D9OG 2484 2695 2906
A26E/M47L/V68M/D90G 2485 2696 2907
A26E/M47L/V68M/A71G 2486 2697 2908
A26E/E35D/A71G/D9OG 2487 2698 2909
A26E/E35D/V68M/D90G 2488 2699 2910
A26E/E35D/V68M/A71G 2489 2700 2911
A26E/E35D/M47L/D9OG 2490 2701 2912
A26E/E35D/M47L/V68M 2491 2702 2913
Hl8Y/M47L/A71G/D9OG 2492 2703 2914
H18Y/M47L/V68M/D90G 2493 2704 2915
H18Y/M47L/V68M/A71G 2494 2705 2916
Hl8Y/E35D/A71G/D9OG 2495 2706 2917
H18Y/E35D/V68M/D90G 2496 2707 2918
H18Y/E35D/V68M/A71G 2497 2708 2919
H18Y/E35D/M47L/D90G 2498 2709 2920
Hl8Y/E35D/M47L/A71G 2499 2710 2921
H18Y/E35D/M47L/V68M 2500 2711 2922
H18Y/A26E/V68M/D90G 2501 2712 2923
H18Y/A26E/V68M/A71G 2502 2713 2924
Hl8Y/A26E/M47L/D9OG 2503 2714 2925
Hl8Y/A26E/M47L/A71G 2504 2715 2926
H18Y/A26E/M47L/V68M 2505 2716 2927
Hl8Y/A26E/E35D/A71G 2506 2717 2928
H18Y/A26E/E35D/V68M 2507 2718 2929
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G 2930 2961 2992
H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 2931 2962 2993
H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 2932 2963 2994
Hl8L/A26N/D46E/V68M/A71G/D9OG 2933 2964 2995
Hl8L/E35D/M47V/V68M/A71G/D9OG 2934 2965 2996
H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G 2935 2966 2997
H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G 2936 2967 2998
H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G 2937 2968 2999
H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G 2938 2969 3000
H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 2939 2970 3001
H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2940 2971 3002
H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G 2941 2972 3003
H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 2942 2973 3004
H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G 2943 2974 3005
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2944 2975 3006
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3273/3680
140/474
A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G 2945 2976 3007
H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2946 2977 3008
H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2947 2978 3009
Hl8V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2948 2979 3010
H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2949 2980 3011
H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G 2950 2981 3012
Hl8A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2951 2982 3013
Hl8A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2952 2983 3014
H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G 2953 2984 3015
Hl8F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2954 2985 3016
H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K 2955 2986 3017
Hl8Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G 2956 2987 3018
H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G 2957 2988 3019
H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G 2958 2989 3020
H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P 2959 2990 3021
Hl8F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G 2960 2991 3022
[00279] Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos de um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido produz pelo menos um domínio IgSF modificada por afinidade (por exemplo, IgV ou IgC) ou um fragmento de ligação específica do mesmo relativamente a um domínio IgSF contido polipeptídeo CD80 do tipo ou não modificado tal que o polipeptídeo CD80 variante exibe atividade de ligação alterada ou aumentada (ou diminuída) ou afinidade para um ou mais parceiros de ligação, CTLA-4, PD-L1 ou CD28, comparativamente com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação para CTLA-4, PD-L1 ou CD28 que difere daquela de uma sequência de controle do polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificada como determinado, por exemplo, por imunoensaios ELISA de fase sólida, citometria de fluxo ou ressonância plasmônica de superfície (Biacore). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. O CD28, PD-L1 e/ou o CTLA-4 podem ser uma proteína de mamífero, tal como uma proteína humana ou uma proteína mu
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3274/3680
141/474 rina.
[00280] Afinidades de ligação para cada um dos parceiros de ligação são independentes; isto é, em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para um, dois ou três de CD28, PD-L1 e CTLA-4 e/ou uma afinidade de ligação diminuída para um, dois ou três de CD28, PD-L1 e CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00281] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00282] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e uma afinidade de ligação
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3275/3680
142/474 diminuída para PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00283] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e uma afinidade de ligação diminuída para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Nessas modalidades, o [00284] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1 e uma afinidade de ligação diminuída para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para PDL1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para PD-L1 e uma afinidade de ligação aumentada para CD28, relativamente a um poli
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3276/3680
143/474 peptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00285] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação ao ectodomínio da CTLA-4 humana que não é superior à afinidade de ligação do CD80 não modificado ou do tipo selvagem para o ectodomínio da CTLA-4 humana.
[00286] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4, PD-L1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e PD-L1 e uma afinidade de ligação diminuída para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e CD28 e uma afinidade de ligação diminuída para PD-L1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e PD-L1 e uma afinidade de ligação aumentada para CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 e uma afinidade de ligação diminuída para PD-L1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma afinidade de ligação diminuída para CTLA-4, PD-L1 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma
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144/474 afinidade de ligação diminuída para CTLA-4 e uma afinidade de ligação aumentada para PD-L1 e CD-28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00287] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante com maior ou maior afinidade de ligação a CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 terá um aumento na afinidade de ligação em relação ao controle do polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado de pelo menos cerca de 5%, tal como pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 35% ou 50% para o parceiro (ou parceiros) de ligação CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o aumento na afinidade de ligação em relação ao polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado é superior a 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes ou mais. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00288] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante com afinidade de ligação diminuída ou reduzida a CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28 terá diminuído na afinidade de ligação relativamente ao controle do polipeptídeo CD80 selvagem ou no modificado de pelo menos 5%, tal como pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais para CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, a diminuição na afinidade de ligação em relação ao polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado é superior a 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes 40 ou 50 vezes. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3278/3680
145/474 não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00289] Em algumas modalidades, a dissociação constante de equilíbrio (Kd) de qualquer uma das modalidades anteriores para CTLA-4, DP-L1, e/ou CD28 pode ser, pelo menos, 1x10-5 M, 1x10’6 M, 1x10-7 M, 1x10 8 M, 1x10’9 M, 1x10’1° M ou 1x1011 M ou 1x1012 M.
[00290] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes fornecidos contendo pelo menos um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV ou IgC) ou um fragmento de ligação específica do mesmo relativo a um domínio IgSF contido em um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado exibem alterações (aumenta estimula induzida por um ou mais parceiros de ligação funcionais, tais como CTLA-4 ou CD28, expressos na superfície de uma célula capaz de sinalizar, tal como uma célula T capaz de libertar citocina em resposta ao sinal intracelular, em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado por ligação do outro parceiro (ou parceiros) de ligação. Em algumas modalidades, a sinalização alterada difere daquela efetuada por uma sequência de controle de polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificada, no mesmo formato, como determinado, por exemplo, por um ensaio que mede a liberação de citocina (por exemplo, liberação de IL-2), após incubação com o polipeptídeo CD80 variante especificado e/ou de tipo selvagem ou não modificado. Um ensaio exemplar é descrito nos Exemplos 810. Em ensaios exemplificativos, a liberação de citocinas é uma função da soma das atividades de sinalização dos parceiros de ligação funcionais expressos na superfície da célula de liberação de citocinas. Como discutido aqui noutro local, em algumas modalidades, o formato dos polipeptídeos CD80 variantes proporcionados pode influenciar o tipo de atividade, por exemplo, agonista ou antagonista.
[00291] Uma vez que o CTLA-4 induz a sinalização inibitória, o au
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146/474 mento da sinalização de CTLA-4 resulta em uma diminuição da libertação de citocinas em alguns ensaios exemplificativos. Por outro lado, a diminuição da sinalização do CTLA-4 resulta em diminuição da sinalização inibitória, o que não diminui a liberação de citocinas e pode resultar no aumento da liberação de citocinas em alguns ensaios. Como a sinalização de CD28 estimula a liberação de citocinas, o aumento da sinalização de CD28 resulta no aumento da liberação de citocinas em ensaios exemplificativos. Por outro lado, diminuiu CD28 sinalização resulta em diminuição da libertação de citocinas em ensaios exemplificativos.
[00292] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização mediada por CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização mediada por CD28, PD- L1 e/ou CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00293] Afinidades de ligação para cada um dos parceiros de ligação cognatos são independentes; assim, em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante pode aumentar a sinalização induzida por um, dois ou três de CD28, PD-L1 e CTLA-4, e/ou diminuir a sinalização induzida por um, dois ou três de CD28, PD-L1 e CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. [00294] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por PD-L1/PD-1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CD28, após ligação, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades preferenciais, o polipeptídeo
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CD80 variante diminui a sinalização induzida por CD28, após ligação, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o CD80 variante diminui a sinalização induzida por PD-L1/PD-1, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização induzida por CTLA-4, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00295] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4 e diminui a sinalização induzida por CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização induzida por CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00296] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4 e diminui a sinalização induzida por CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante aumenta a sinalização induzida por CTLA-4 e CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização induzida por CTLA-4 e aumenta a sinalização induzida por CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização induzida por CTLA-4 e aumenta a sinalização induzida por CD28, relativamente
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148/474 a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante diminui a sinalização induzida por CTLA-4 e CD28, relativamente a um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
[00297] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que estimula ou aumenta a sinalização inibitória induzida por CTLA-4 produzirá um sinal que é 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou menos do que o sinal induzido pelo polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00298] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que estimula ou aumenta a sinalização induzida por CD28 produzirá um sinal que é pelo menos 105%, 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, ou mais do sinal induzido pelo polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00299] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que inibe ou diminui a sinalização inibitória induzida por CTLA-4 produzirá um sinal que é pelo menos 105%, 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, ou mais, do sinal induzido pelo polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00300] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante
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149/474 que inibe ou diminui a sinalização inibitória induzida por CD28 produzirá um sinal que é 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ou menos, do sinal induzido pelo polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00301] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que afeta a sinalização inibitória induzida por CTLA-4 e/ou afeta a sinalização por CD28 produzirá uma soma da sinalização de CTLA-4 e CD28 que é menor que a soma do CTLA-4 e sinalização de CD28 efetuada pelo correspondente polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em tais modalidades, a soma da sinalização de CTLA-4 e CD28 é de 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%., 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ou menos, do sinal efetuado pelo correspondente polipeptídeo CD80 do tipo selvagem ou não modificado. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado correspondente tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
[00302] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que afeta a sinalização inibitória induzida por CTLA-4 e/ou afeta a sinalização por CD28 produzirá uma soma da sinalização de CTLA-4 e CD28 que é maior que a soma do CTLA-4 e sinalização de CD28 efetuada pelo correspondente polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em tais modalidades, a soma da sinalização de CTLA-4 e CD28 é de pelo menos 105%, 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, ou mais do sinal efetuado pelo polipeptídeo
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CD80 de tipo selvagem ou não modificado correspondente. Em tais exemplos, o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado correspondente tem a mesma sequência que o polipeptídeo CD80 variante, exceto que não contém as modificações de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituições).
1. CTLA4 [00303] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CTLA-4 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CTLA-4 e afinidade diminuída para o ectodomínio de CD28, em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CTLA-4 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4.
[00304] Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 em comparação com um polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado, tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 7, 12, 13, 16, 18, 20, 22, 23, 24,
26, 27, 30, 33, 35, 37, 38, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 52, 53, 54, 57, 58,
61,62, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 79, 81, 83, 84, 85, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e/ou 97 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou
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3031. Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe afinidade de ligação aumentada para CTLA-4 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 7, 23, 26, 30, 35, 46, 57, 58, 71, 73, 79 e/ou 84 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031.
[00305] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em E7D, A12T, T13A, T13R, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18L, H18T, H18V, H18Y, V20L, S21P, V22A, V22D, V22L, E23D, E23G, E24D, A26D, A26E, A26G, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A27, A27, A27, Q27R, Q27R, I30V, Q33L E35G, K37E,
M38I, M38T, M38V, T41S, M42V, M43I, M43L, M43T, M43V, S44P,
D46E, D46N, D46V, M47I, M47L, M47T, M47V, M47Y, N48D, N48H,
N48K, N48R, N48S N48T, N48Y, E52D, Y53F, Y53H, K54E, K54R,
T57A, T57I, I58V, 161F, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, N63S, I67L, I67T, V68E, V68I, V68L, V68M, I69F, L70M, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73H, P74S, E77A, T79I, T79M, E81G, E81K, V83I, V84I, L85M, L87Q, Y87C, Y87D, Y87N, E88D, E88V, K89N, D90G, D90N, D90P, A91G, A91S, A91V, F92V, F92Y, K93E, K93R, K93T, R94L, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97Q e L97R. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18T, H18T,
H18V, V20I, V22D, V22L, E23D., E23G, E24D, A26D, A26E, A26G,
A26H, A26K, A26N, A26P, A26R, A26R, A26T, A26T, Q27L, Q27L, Q33L, Q33L, E35G, T41S, M42V, M43L, M43T, D46E D46N, D46V,
M47I, M47L, M47V, M47Y, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48Y,
Y53F, K54E, K57R, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, I67L, V68E V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, P74S, T79I,
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T79M, E81G, E81K, V84I, L85M, L87Q, Y87C, E88V, D90P, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V e L97Q.
[00306] Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é Q27H/T41S/A71D, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, S44P/I67T/P74S/E81G/E95D, A71D, T13A/I61N/A71D, E35D/M47I, M47V/N48H, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/ A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/ M47I/ A71D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/ L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/ M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/A71 D/
L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/
M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, E35D/M43I/A71 D, T41S/ T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/ E35D/ T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q,
D46E/A71D, E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/M47L, A26E/E35D/M43T/ M47L/L85Q/R94Q, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, E7D/E35D/ M47I/L97Q, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/ L85Q/R94Q/E95K, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, V22A/E35D/
V68E/A71D, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/L85Q/ K93T/E95V/L97Q, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/ D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, V22A/E35D/ M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47V/A71G/ E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D, E35D, E35D, E35D T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/ V35A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, E35D/D46V/M47L/V68M/
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L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G, E35D/D46E/M47V/ N63D/ L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/D46E/M47V/V68M/ D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E85D/L85Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/ A71G/D90G/L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, E35D/M38T/D46E/ M47V/N48S, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/
M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/
A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, Μ43Ι/ M47L/ A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/ M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/ Ν48Κ, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/M47I/T62S/L85Q/ E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/ T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/
T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/ M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/ D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/ V68M/T79M/ L85M, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/ M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/ V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/ M47V/N48K/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/
V68M/L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, Η18Υ/ E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L,
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, Η18Υ/ E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M87L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/ V68M/E95V/
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L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/V68M/ A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/ A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/ T85M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, S21P/E35D/K37E/ D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/ E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/ V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/ Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/ E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68 M/A71G, H18L/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/ D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/ V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/ M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/ E35D/ M47L/V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G,
H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/ M47 V/V68 M/A71G/D90G, H18 V/A26S/E35D/M47L/V68 M/A71G/
D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/ M47V/V68M/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/ A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90K, H18Y/A26N/E35D/M87A/V68M/A71G/D90G, H18Y/
A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/ V68M/A71G/D90P ou H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/ D90G.
[00307] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante
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155/474 exibe seletividade aumentada para CTLA-4 versus CD28 em comparação com a razão de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado (por exemplo, estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031) para CTLA-4 versus CD28, tal como indicado por uma razão de ligação de CTLA-4 à ligação a CD28 (relação de ligação a CTLA4: CD28) que é superior a 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe uma razão de ligação CTLA-4 versus CD28 que é superior ou superior a cerca de 1,1 ou 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou mais. Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante possui uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 30, 35, 57, 71 ou 84 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T13A, T13R, S15T, V22I, V22L, Q27H, I30V, Q33R, E35D, E35G, T41S, M47I, M47L, M47V, N48Y., Y53F, T57I, 161F, 161V, I67L, L70M, A71D, A71G, L72V, T79M, E81G, E81K, V84A, V84I e L85M, Y87C, Y87D. Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é Q27H/T41S/A71D, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T,
V22I/L70M/A71 D, L72P/T79I, L25S/E35D/M47I/D90N, A71D, E81K/ A91S, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A,
E35D/M47I, M47V/N48H, Q27H/M43I/A71D/R73S, M47I/E88D, M42I/ I61V/A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/ V84I, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/I67L/A71 D, E35D, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/T57A/ A71D/L85Q, E35G/K54E/A71D/L72P, A26E/E35D/M47L/L85Q, E35D/ N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G,
E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/
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M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/
E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/ E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E,
E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/ 161V/ L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L8 5M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/ M47I/ T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/ H18Y/ E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/ A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, H18Y/V22A/ E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E85V/ L97Q, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/ A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/
D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/
V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/ V68M/ A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/ N48K/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/
L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/ D46E/ M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/ E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/ E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/ A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/ A85G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/ T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, S21P/E35D/K37E/ D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/ M38I/M47L/V68M/E38V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/ L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/ E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/
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E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/ E24D/M35V/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/
E35D/ M47L/V68M/A71G, H18L/A26P/E35D/M71V/V68M/A71G, H18L/ A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M87V/V68M/ A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/ V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/
E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, A26P/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M 47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26S/E35D/
M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26Q/E35D/M47V/ V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/ A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, Η18F/A26H/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/ E35D/M47Y/V681/A71G/D90G, Η18 Y/A26Q/E35D/M47T/V68 Μ/Α71G/ D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, ou H18F/ A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G.
2. CD28 [00308] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 é aumentada mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8vezes, 9 vezes, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 vezes, comparado
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158/474 com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
[00309] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 e o ectodomínio de CTLA-4 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28, o ectodomínio de PD-L1 e o ectodomínio de CTLA-4 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada em SEQ. ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 e um ou ambos de CTLA-4 e PD-L1 é aumentada independentemente mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 -divida, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4 ou PD-L1.
[00310] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 e uma afinidade diminuída para o ectodomínio de CTLA-4, em comparação com o polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 e o ectodomínio de PD-L1 e menor afinidade para o ectodomínio de CTLA-4, em comparação com o polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76, 150,
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3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade diminuída para o ectodomínio de CTLA-4 é diminuída mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4.
[00311] Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe afinidade de ligação aumentada para CD28 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado possui uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 12, 13, 18, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 31,35, 41,42, 43, 46, 47, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 79, 83, 84, 85, 88, 90, 93, 94 e/ou 95 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe afinidade de ligação aumentada para CD28 em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 23, 26, 35, 46, 55, 57, 58, 71, 79 e/ou 84 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031.
[00312] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em A12T, T13R, S15T, H18A, H18C, H18F, H18T, H18T, H18V, H18Y, V20I, S21P, V22A, V22D, V22L, E23D, E23G, E24D, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26P, A26P, A26R, A26S, A26T, A27T, Q27L, Q27R, Y31H, Q33R, E35D, E35G, K37E, M38I, T41S, M42V, M43I, M43L, D46E, D46N, D46V, M47I, M47L, M47V, M47Y, N48K, N48Y, Y53F, K54E, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, T62S, N64S, I67L, V68E, V68I, V68L, V68M, I69F, L70M, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, T79I, T79M, V83I, V84I, L85M, Y87C, Y87D, Y87N, E88D, E88V, D90G, D90P, D90P, A91G, A91S,
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K93E, K93R, R94L, R94Q, R94W, E95K, E95V e L97Q. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T13R, S15T, H18A, H18F, H18F, H18T, H18T, V18I, V22L, V22D, E23D,
E23G, E24D, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P, A26Q,
A26R, A26S, A26T, Q27H, Q27R, E35G, E35G, T41S, M42V, M43L,
D46E, D46N, D46V, M47I, M47L, M47V, M47Y N48K, N48Y, Y53F,
K54E, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, I67L, V68E, V68I, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, T79I, T79M, V84I, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, E88V, D90P, R94Q, R94W, E95V, L97Q.
[00313] Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é Q27H/T41S/A71D, V20I/M47V/T57I/V84I,
V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P,
E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I,
T13R/M42V/M47I/A71D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I,
E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K,
N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/ L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, E35G/K54E/A71D/L72P,
L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/ V68L/K93R/R94W, V22A/E35D/V68E/A71 D, E35D/D46E/M47V/V68M/ D90G/K93E, E35D/N48K/L72V, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G,
E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/
E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/ E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E,
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H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/
E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/ E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/
L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/
M47I/V68M/A71G/R94L, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/ A91G, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/ V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/ M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/ M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/Y53F/V68M/
A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/ N48K/ V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/ L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/ D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M40I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/ M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V 68M/E95V/L97Q, H18Y/ E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/ K93R/E95V, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/ E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/ V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/ V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, S21P/E35D/ K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L,
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T22R/Q33R/E35D/ M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/ M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/E35D/ M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/ E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/ E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/
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162/474
V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/
E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, Η18V/A26G/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/ E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26P/E35D/M37V/V68L/A71G/ D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K, H18Y/A26P/E35D/M47Y/ V68I/A71G/D90G, H18Y/A26Q/E35D/M36T/V68M/A71G/D90G, H18R/ A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, ou H18F/A26D/E35D/ D46E/ M47T/V68M/A71G/D90G.
3. PD-L1 [00314] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para PD-L1 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 e o ectodomínio de CTLA-4 em comparação com o polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
[00315] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 e afinidade
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163/474 diminuída para o ectodomínio de CTLA-4, em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID. NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 e afinidade diminuída para o ectodomínio de CD28, em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, tal como compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas modalidades, a afinidade diminuída para o ectodomínio de CTLA-4 ou CD28 é diminuída mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4 ou CD28.
[00316] Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe afinidade de ligação aumentada para PD-L1 em comparação com um polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado possui uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 7, 12, 13, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 41,42, 43, 44, 46,
47, 48, 51,53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 63, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 76, 77, 78, 79, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, e/ou 97 da SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031. Em algumas destas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante que exibe uma maior afinidade de ligação para PD-L1 em comparação com um polipeptídeo CD80 selvagem ou não modificado, tem uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) correspondentes às posições 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 e/ou 84, de SEQ ID NO: 2, 76, 150, 3030 ou 3031.
[00317] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante
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164/474 tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em E7D, A12V, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18T, H18V, H18L, H18Y., V20A, V20I, S21P, V22A, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26D, A26E, A26G, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A27, Q27, Q27„ R29C, T28Y, R29H, I30T, I30V, Y31H, Y31S, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, K37E, M38I, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V, M43I, M43L, M43T, M43V, S44P, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47T, M47V, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P53A, Y53F, Y53H, K54R, N55D, N55I, T57I, I58V, 161F, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, N64S, L65P, I67L, I68T, V68A, V68L, V68L, V68M, I69F, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V83A, V83I, V84I, V85I, L85M, L85M, K86E, K87M, Y87C, Y87D, Y87D, Y87N, Y87Q, E88D, E88G, K89E, K8 9N, D90G, D90N, D90P, A91G, A91S, A 91T, A91V, F92L, F92S, F92V, F92Y, K93E, K93R, K93T, R94L, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q e L97R. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18T, H18T, H18V, V20A, V20I, V22D, V22I., V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26D, A26E, A26G, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A27, Q27L, I30T, I30V, Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, T41S, M42I, M42V, M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47V, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, K54R, N55D N55I, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, L65P, I67L, V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73S, P74S, D76H, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K87M, Y87C, Y87D, D90P, F92S, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M e L97Q.
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165/474 [00318] Em algumas modalidades, a substituição de um ou mais aminoácidos é Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/ A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/ L70P/ A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/P74S/E81G/E95D, A71D, T13A/I61N/A71 D, E81K, A12V/ M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D,
M47I/E88D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, E35D/ A71D, E35D/I67L/A71 D, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/ L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/
L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, M47V/I69F/A71D/V83I, H18Y/A26T/ E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/ L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/ L70R, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, V22L/ E35D/ M43L/A71G/D76H, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, A26E/Q33R/E35D/M87L/L85Q/K85E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/ E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/ E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/ M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/ E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M85V/L85Q, A26E/E35D/M43T/ M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/ E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/ M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97E, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/ M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/M47L/
T88L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/ L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3299/3680
166/474
L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/
E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F,
Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/
E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/
V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/ L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/
A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V,
E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/
L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N,
Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/
M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G,
E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/
M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D,
E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, V22D/
E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N,
E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/T41S/
M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/
M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/
M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N,
Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/
D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G,
E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E,
E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y, V22D/E35D/
M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/
L97R, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/
N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/
N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G, E35D/N48K/L72V,
E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/
M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/
A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3300/3680
167/474
M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/ A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I,
E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/ N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46E/M47L/V68M/ L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/ M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, Η18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/ R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/ A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/M47I/ T62A/V68M/ L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/D46E/ M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T85M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47V/V68M/ L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/ V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/ M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L85M,
E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/T41S/ D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L,
H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N,
Η18 Y/E35D/M47I/V68 Μ/Υ87Ν, Η18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M87L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/ L97Q, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q H18Y/E35D/M53L/Y53F/ V68M/A71G/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, Η18Υ/ E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, Η18Υ/ E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, Η18Υ/ E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/ E35D/M47V/N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/ L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M, R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46/
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M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/ M47L/V68M, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M62L/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M38V/M62L/ V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/ E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/ L85IW R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T22R/Q33R/E35D/ M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/M87L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/E35D/
M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/ E35D/ M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G,
H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/ A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/ V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/
V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/ E35D/M71V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/ E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/ V68 M/A71G/D90G, H18 V/A26 D/E35D/M47 V/V68 M/A71G/D90G,
H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/ A26H/E35D/M87V/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47F/V68M/ A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/ E35D/M47T/V68M/A71G/D91G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/ A71G/D90P ou H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G.
[00319] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados que exibem afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1, em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado, podem exibir coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 ou podem afetar a atividade coestimulatória de CD28 dependente de PD-L1. Em algumas modalidades, em que um
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169/474 polipeptídeo CD80 variante medeia ou afeta a atividade coestimulatória de CD28 dependente de PD-L1, a afinidade do polipeptídeo CD80 variante é aumentada pelo menos 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 dobrar, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes 60 vezes, 70 vezes, 80 -divida, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
[00320] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados que exibem, medeiam ou afetam a atividade coestimulatória de CD28 dependente de PD-L1, retêm a ligação ao ectodomínio de CD28 em comparação com um CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Por exemplo, o polipeptídeo CD80 variante pode reter pelo menos ou cerca de pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da afinidade para o ectodomínio do CD28, comparado com a afinidade de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
[00321] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados que exibem, medeiam ou afetam a atividade coestimulatória de CD28 dependente de PD-L1 exibem uma afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28, comparativamente com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28. Por exemplo, o polipeptídeo CD80 variante pode exibir uma afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 que é aumentado mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 vezes, 150 vezes, ou 200 vezes, em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
III. FORMATO DE POLIPEPTÍDEOS VARIANTES
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170/474 [00322] O polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante, aqui fornecido, que contém umo vlgD, pode ser formatado de várias formas, incluindo como proteína solúvel, proteína ligada à membrana ou proteína secretada. Em algumas modalidades, o formato particular pode ser escolhido para a aplicação terapêutica desejada. Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um polipeptídeo CD80 variante é fornecido em um formato para antagonizar ou bloquear a atividade do seu parceiro de ligação, por exemplo, CTLA-4, CD28 e/ou PD-L1. Em algumas modalidades, o antagonismo de CTLA-4 ou PD-L1/PD-1 pode ser útil para promover imunidade em oncologia. Em alguns casos, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um polipeptídeo CD80 variante é fornecido em um formato para agonizar ou estimular a atividade do seu parceiro de ligação, por exemplo, CTLA-4 e/ou CD28. Em algumas modalidades, o agonismo de CD28 pode ser útil para promover imunidade em oncologia. Em algumas modalidades, o agonismo de CD28 pode ser dependente ou reforçado pela ligação CD80 de PD-L1. Tal agonismo dependente de PD-L1 de CD28 pode ser útil para promover imunidade em oncologia. Em algumas modalidades, o agonismo de CTLA-4 pode ser útil para o tratamento de inflamação ou autoimunidade. Um versado pode facilmente determinar a atividade de um formato particular, tal como para antagonizar ou agonizar um ou mais parceiros de ligação específicas. Métodos exemplificativos para avaliar tais atividades são aqui fornecidos, incluindo nos exemplos.
[00323] Em alguns aspectos, são fornecidas proteínas imunomoduladoras compreendendo um vlgD de CD80 em que tais proteínas são solúveis, por exemplo, fundidas a uma cadeia Fc. Em alguns aspectos, um ou mais domínios de IgSF adicionais, tais como um ou mais vlgD adicional, podem ser ligados a um vlgD de CD80 como aqui fornecido (doravante denominado uma proteína imunomoduladora de pilha ou
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171/474 empilhada). Em algumas modalidades, o formato modular das proteínas imunomoduladoras fornecidas proporciona flexibilidade para engenharia ou geração de proteínas imunomoduladoras para atividade de modulação de múltiplas contrarestruturas (múltiplos parceiros de ligação cognatos). Em algumas modalidades, tais moléculas de pilha podem ser fornecidas em um formato solúvel ou, em alguns casos, podem ser fornecidas como proteínas ligadas à membrana ou segregadas. Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora CD80 variante é fornecida como um conjugado no qual está contido um vlgD de CD80 ligado, direta ou indiretamente, a um agente de direcionamento ou fração, por exemplo, a um anticorpo ou outras moléculas de ligação que se ligam especificamente a um ligante por exemplo, um antígeno, por exemplo, para direccionar ou localizar o vlgD para um ambiente ou célula específicos, tal como quando administrado a um indivíduo. Em algumas modalidades, o agente de direcionamento, por exemplo, anticorpo ou outra molécula de ligação, liga-se a um antígeno tumoral, localizando assim o CD80 variante contendo o vlgD ao microambiente tumoral, por exemplo, para modular a atividade de linfócitos de infiltração tumoral (TILs) específicos para o microambiente tumoral.
[00324] Em algumas modalidades, proteínas imunomoduladoras fornecidas são expressas em células e fornecidos como parte de uma terapia celular manipulada (ECT). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é expresso em uma célula, tal como uma célula imunológica (por exemplo, célula T ou célula apresentadora de antígeno), na forma ligada à membrana, proporcionando assim uma proteína imunomoduladora transmembranar (a seguir designada também por TIP). Em algumas modalidades, dependendo do parceiro de ligação cognato reconhecido pelo TIP, as células manipuladas expressando um TIP podem agonizar um parceiro de ligação cognato fornecendo
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172/474 um sinal coestimulatório, positivo ou negativo, a outras células manipuladas e/ou a células T endógenas. Em alguns aspectos, o polipeptídeo CD80 variante é expresso em uma célula, tal como uma célula imunológica (por exemplo, célula T ou célula apresentadora de antigeno), em uma forma secretável para desse modo produzir uma forma secretada ou solúvel do polipeptídeo CD80 variante (daqui em diante também denominada um SIP), como quando as células são administradas a um indivíduo. Em alguns aspectos, um SIP pode antagonizar um parceiro de ligação cognato no ambiente (por exemplo, microambiente tumoral) no qual ele é secretado. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante é expresso em um agente infeccioso (por exemplo, agente viral ou bacteriano) que, após administração a um indivíduo, é capaz de infectar uma célula in vivo, tal como uma célula imunológica (por exemplo, célula T ou célula apresentadora de antigeno), para distribuição ou expressão do polipeptídeo variante como um TIP ou um SIP na célula.
[00325] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodulador solúvel, tal como um CD80 variante contendo umo vlgD, pode ser encapsulado dentro de um lipossoma que por si próprio pode ser conjugado a qualquer uma ou qualquer combinação dos conjugados fornecidos (por exemplo, uma porção de direcionamento). Em algumas modalidades, os polipeptídeos imunomoduladores solúveis ou ligados à membrana da invenção são desglicosilados. Em modalidades mais específicas, a sequência CD80 variante é deglicosilada. Em modalidades ainda mais específicas, o domínio ou domínios de IgV e/ou IgC (por exemplo, lgC2) do CD80 variante é deglicosilado.
[00326] Exemplos não limitativos dos formatos fornecidos são descritos nas Figuras 1A-1C e adicionalmente descritos abaixo.
A. Proteína Solúvel [00327] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora
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173/474 contendo um polipeptídeo CD80 variante é uma proteína solúvel. Os versados apreciarão que as proteínas da superfície celular têm tipicamente um domínio intracelular, transmembranar e extracelular (ECD) e que uma forma solúvel dessas proteínas pode ser preparada utilizando o domínio extracelular ou uma subsequência imunologicamente ativa do mesmo. Assim, em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contendo um polipeptídeo CD80 variante não possui um domínio transmembranar ou uma porção do domínio transmembranar. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contendo um CD80 variante não possui o domínio intracelular (citoplasmático) ou uma porção do domínio intracelular. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contendo o polipeptídeo CD80 variante contém apenas a porção vlgD contendo o domínio ECD ou uma porção desta contendo um domínio IgV e/ou domínio IgC (por exemplo, lgC2) ou domínios ou fragmentos de ligação específica contendo o aminoácido modificação (ou modificações) do mesmo.
[00328] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante pode incluir um ou mais polipeptídeos CD80 variantes da invenção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo da invenção compreenderá exatamente 1, 2, 3, 4, 5 sequências CD80 variantes. Em algumas modalidades, pelo menos duas das variantes CD80 variantes são sequências CD80 variantes idênticas.
[00329] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador fornecido compreende duas ou mais sequências vlgD de CD80. Os polipeptídeos CD80 de múltiplas variantes dentro da cadeia polipeptídica podem ser idênticos (isto é, as mesmas espécies) entre si ou ser sequências CD80 não idênticas (isto é, espécies diferentes). Adicionalmente às modalidades da cadeia polipeptídica simples, em algumas modalidades, dois, três, quatro ou mais dos polipeptídeos da invenção
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174/474 podem ser ligados covalentemente ou não covalentemente uns aos outros. Assim, proteínas multiméricas monoméricas, diméricas e de ordem superior (por exemplo, 3, 4, 5 ou mais) são aqui fornecidas. Por exemplo, em algumas modalidades, exatamente dois polipeptídeos da invenção podem ser ligados covalentemente ou não covalentemente uns aos outros para formar um dímero. Em algumas modalidades, a ligação é feita através de ligações dissulfureto de cisteína intercadeias. Composições compreendendo dois ou mais polipeptídeos da invenção podem ser de uma espécie idêntica ou espécies substancialmente idênticas de polipeptídeo (por exemplo, um homodímero) ou de espécies não idênticas de polipeptídeos (por exemplo, um heterodímero). Uma composição tendo uma pluralidade de polipeptídeos ligados da invenção pode, como notado acima, ter um ou mais polipeptídeos CD80 variantes idênticos ou não idênticos da invenção em cada cadeia polipeptídica.
[00330] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é ou contém um polipeptídeo CD80 variante que está na forma de monómero e/ou que exibe ligação monovalente ao seu parceiro de ligação. Em alguns aspectos, um polipeptídeo CD80 variante como descrito, tal como um CD80 variante que é solúvel e/ou que não possui um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, está ligado, direta ou indiretamente, a uma porção adicional. Em algumas modalidades, a porção adicional é uma proteína, peptídeo, molécula pequena ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora monovalente é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a porção é uma molécula que se prolonga por meia vida. Exemplos de tais moléculas que se prolongam na meia-vida incluem, mas não se limitam a, albumina, um polipeptídeo de ligação a albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade beta da gonadotropina coriônica humana, polietilenoglicol (PEG), lon
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175/474 gas sequências hidrofílicas não estruturadas de aminoácidos (XTEN), hidroxietilamido (HES), uma molécula pequena de ligação à albumina ou uma combinação dos mesmos.
[00331] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante pode ser ligado a uma porção que inclui sequências polipeptídicas conformacionalmente desordenadas compostas pelos aminoácidos Pro, Ala e Ser (ver, por exemplo, WO2008/155134, SEQ ID NO: 904). Em alguns casos, a repetição do aminoácido é de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais resíduos de aminoácido, em que cada repetição compreende um resíduo (ou resíduos) Ala, Ser e Pro. Assim, é aqui fornecida uma proteína imunomoduladora que é uma proteína PASilada em que o polipeptídeo CD80 variante está ligado, direta ou indiretamente através de um ligante, a Pro/Ala/Ser (PAS). Em algumas modalidades, uma ou mais estruturas de ligação adicionais podem ser utilizadas.
[00332] Em algumas modalidades, a porção facilita a detecção ou purificação do polipeptídeo CD80 variante. Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreende um marcador ou domínio de fusão, por exemplo, marcador de afinidade ou purificação, ligado, direta ou indiretamente, ao terminal N e/ou C do polipeptídeo CD80. Vários marcadores polipeptídicos e/ou domínios de fusão adequados são conhecidos e incluem, mas não estão limitados a um marcador de polihistidina (His), um marcador FLAG (SEQ ID NO: 3037), um marcador Myc e marcador de proteína fluorescente (por exemplo, EGFP, estabelecido em SEQ ID NOs: 3033-3035). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante compreende pelo menos seis resíduos de histidina (apresentados na SEQ ID NO: 3038). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante compreende ainda várias combinações de unidades.
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Por exemplo, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante compreende ainda um ou mais marcadores de polihistidina e marcador FLAG.
[00333] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 está ligado a uma região constante (Fc) de cadeia pesada de imunoglobulina modificada que permanece na forma monovalente, tal como apresentado na SEQ ID NO: 374.
[00334] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém um polipeptídeo CD80 variante que está ligado, direta ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização. Em alguns aspectos, o domínio de multimerização aumenta a meia-vida da molécula. A interação de dois ou mais polipeptídeos CD80 variantes pode ser facilitada pela sua ligação direta ou indireta a qualquer porção ou outro polipeptídeo que seja capaz de interagir para formar uma estrutura estável. Por exemplo, cadeias de polipeptídeo CD80 variantes codificadas separadas podem ser unidas por multimerização, pelo que a multimerização dos polipeptídeos é mediada por um domínio de multimerização. Tipicamente, o domínio de multimerização proporciona a formação de uma interação proteína-proteína estável entre um primeiro polipeptídeo CD80 variante e um segundo polipeptídeo CD80 variante.
[00335] Polipeptídeos homo ou heteromultiméricos podem ser gerados a partir da coexpressão de polipeptídeos CD80 variantes separados. A primeira e segunda variante de polipeptídeos CD80 podem ser iguais ou diferentes. Em modalidades particulares, o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes são os mesmos em um homodímero e cada um está ligado a um domínio de multimerização que é o mesmo. Em outras modalidades, os heterodímeros podem ser formados ligando o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes de que são diferentes. Em algumas dessas modalidades, o primeiro e segun
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177/474 do polipeptídeos CD80 variantes estão ligados a diferentes domínios de multimerização capazes de promover a formação de heterodímeros.
[00336] Em algumas modalidades, um domínio de multimerização inclui qualquer um capaz de formar uma interação proteína-proteína estável. Os domínios de multimerização podem interagir através de uma sequência de imunoglobulina (por exemplo, domínio Fc; ver, por exemplo, publicações de pedido internacional n° WO 93/10151 e WO 2005/063816; publicação US n° 2006/0024298; patente US n° 5.457.035); zíper de leucina (por exemplo, das proteínas nucleares transformadoras fos e jun ou do proto-oncogene c-myc ou do Controle Geral de Nitrogênio (GCN4)) (por exemplo, Busch e Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6: 36-40; Gentz et al., (1989) Science, 243: 1695-1699) ; uma região hidrofóbica; uma região hidrofílica; ou um tiol livre que forma uma ligação dissulfureto intermolecular entre as moléculas quiméricas de um homo ou heteromultímero. Adicionalmente, um domínio de multimerização pode incluir uma sequência de aminoácidos compreendendo uma protuberância complementar a uma sequência de aminoácidos compreendendo um orifício, tal como é descrito, por exemplo, na patente n° 5.731.168; publicação de patentes internacional WO 98/50431 e WO 2005/063816; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9: 617-621. Uma tal região de multimerização pode ser manipulada de tal modo que as interações estáticas não promovam apenas interação estável, mas promovam ainda a formação de heterodímeros sobre homodímeros a partir de uma mistura de monômeros químicos. Geralmente, as protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são opcionalmente criadas na interface do se
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178/474 gundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Os domínios de multimerização exemplificativos são descritos abaixo. [00337] O polipeptídeo CD80 variante pode ser unido em qualquer local, mas tipicamente através do seu terminal N ou C, ao terminal N ou C de um domínio de multimerização para formar um polipeptídeo químico. A ligação pode ser direta ou indireta através de um ligante. O polipeptídeo quimérico pode ser uma proteína de fusão ou pode ser formado por ligação química, tal como através de interações covalentes ou não covalentes. Por exemplo, quando se prepara um polipeptídeo quimérico contendo um domínio de multimerização, o ácido nucleico que codifica todo ou parte de um polipeptídeo CD80 variante pode ser operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica a sequência do domínio de multimerização, direta ou indiretamente ou opcionalmente através de um domínio ligante. Em alguns casos, a construção codifica uma proteína quimérica em que o terminal C do polipeptídeo CD80 variante está ligado ao terminal N do domínio de multimerização. Em alguns casos, uma construção pode codificar uma proteína quimérica em que o terminal N do polipeptídeo CD80 variante está ligado ao terminal C do domínio de multimerização.
[00338] Um multímero polipeptídico contém múltiplas, tal como duas proteínas quiméricas criadas ligando, direta ou indiretamente, dois dos mesmos ou diferentes polipeptídeos CD80 variantes, direta ou indiretamente a um domínio de multimerização. Em alguns exemplos, quando o domínio de multimerização é um polipeptídeo, uma fusão gênica que codifica o polipeptídeo CD80 variante e o domínio de multimerização é inserida em um vetor de expressão apropriado. A proteína química ou de fusão resultante pode ser expressa em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante e deixada a reunir em multímeros, onde os domínios de multimerização in
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179/474 teragem para formar polipeptídeos multivalentes. A ligação química de domínios de multimerização a polipeptídeos CD80 variantes pode ser realizada utilizando ligantes heterobifuncionais.
[00339] Os polipeptídeos quiméricos resultantes, tais como proteínas de fusão e multímeros formados a partir dele, podem ser purificados por qualquer método adequado tal como, por exemplo, por cromatografia de afinidade sobre colunas de Proteína A ou Proteína G. Quando duas moléculas de ácido nucleico que codificam diferentes polipeptídeos são transformadas em células, ocorrerá a formação de homo e heterodímeros. As condições para expressão podem ser ajustadas de modo a favorecer a formação de heterodímeros sobre a formação de homodímeros.
[00340] Em algumas modalidades, o domínio de multimerização é um domínio Fc ou partes do mesmo de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora compreende um polipeptídeo CD80 variante ligado a uma imunoglobulina Fc (produzindo uma fusão Fc imunomoduladora, tal como uma variante da fusão CD80-Fc, também denominada fusão CD80 vlgD-Fc). Em algumas modalidades, a ligação do polipeptídeo CD80 variante está no terminal N da Fc. Em algumas modalidades, a ligação do polipeptídeo CD80 variante está no terminal C da Fc. Em algumas modalidades, dois ou mais polipeptídeos CD80 variantes (iguais ou diferentes) estão independentemente ligados ao terminal N e ao terminal C.
[00341] Em algumas modalidades, o Fc é Fc murino ou humano. Em algumas modalidades, o Fc é uma região de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 Fc de mamífero ou humana. Em algumas modalidades, o Fc é derivado de lgG1, tal como lgG1 humana. Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277, 359 ou 1712 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%,
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95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NO: 277, 359 ou 1712.
[00342] Em algumas modalidades, a região Fc contém mais uma modificação para alterar (por exemplo, reduzir) uma ou mais das suas funções normais. Em geral, a região Fc é responsável pelas funções efetoras, como a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), além da capacidade de ligação ao antigeno, que é a principal função das imunoglobulinas. Adicionalmente, a sequência FcRn presente na região Fc desempenha o papel de regular o nível de IgG no soro aumentando a meia-vida in vivo por conjugação a um receptor FcRn in vivo. Em algumas modalidades, tais funções podem ser reduzidas ou alteradas em um Fc para utilização com as proteínas de fusão Fc fornecidas.
[00343] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de uma fusão de variante CD80-Fc aqui fornecida, gerando assim uma variante da região Fc. Em algumas modalidades, a variante da região Fc tem função efetora diminuída. Existem muitos exemplos de alterações ou mutações nas sequências Fc que podem alterar a função efetora. Por exemplo, WO 00/42072, W02006019447, WO2012125850,
WO2015/107026, US2016/0017041 e Shields et al. J Biol. Chem. 9 (2): 6591 a 6604 (2001) descrevem variantes Fc exemplificativas com ligação melhorada ou diminuída a FcRs. O conteúdo dessas publicações é especificamente incorporado aqui por referência.
[00344] Em algumas modalidades, as fusões CD80-Fc variantes fornecidas compreendem uma região Fc que exibe funções efetoras reduzidas, o que o torna um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida da fusão variante CD80-Fc in vivo é importante, mas certas funções efetoras (como CDC e ADCC) são desnecessários ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser
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181/474 realizados para confirmar a redução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, podem ser realizados ensaios de ligação ao receptor de Fc (FcR) para assegurar que a fusão variante de CD80-FC não possui ligação a FcyR (portanto, provavelmente falta de atividade ADCC), mas retém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRI I e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente n° 5.500.362 (ver, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 83: 7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat'1 Acad.Sci. EUA 82: 1499-1502 (1985); patente US n° 5.821.337 (ver, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351 a 1361 (1987)). Alternativamente, podem ser empregues métodos de ensaio não radioativos (ver, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, Califórnia; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96™ (Promega, Madison, Wis.). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al. Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 95: 652-656 (1998). Os ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que a fusão variante de CD80-Fc é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, não tem atividade de CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC (ver, por exemplo,
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Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.Methods 202: 163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); e Cragg, MS e MJ Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). A ligação de FcRn e as determinações da depuração/meia-vida in vivo podem também ser realizadas utilizando modos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)).
[00345] Fusões variantes CD80-Fc com função efetora reduzida incluem aquelas com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 por numeração EU (Patente US n° 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327 por numeração EU, incluindo o chamado mutante Fc DANA com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (patente US n° 7.332.581).
[00346] Em algumas modalidades, a região Fc das fusãos variantes de CD80-Fv tem uma região Fc na qual qualquer um ou mais dos aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 e 329 (indicado pela numeração EU) são substituídos por diferentes aminoácidos em comparação com a região Fc nativa.Tais alterações da região Fc não se limitam a alterações acima descritas, e incluem, por exemplo, alterações tais como cadeias deglicosiladas (N297A e N297Q), lgG1 a N297G, lgG1 a L234A/L235A, lgG1 a L234A/L235E/G237A, lgG1 a A325A/A330S/P331S, lgG1 a C226S/C229S, lgG1 a C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, lgG1 a E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, lgG1 a L234F/L235E/P331S, lgG1 a S267E/L328F, lgG2-V234A/G237A, lgG2H268Q/V309L/A330S/A331S, lgG4- L235A/G237A/E318A, e lgG4L236E descrito em Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; alterações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/ L328R e N325LL328R descritas no documento WO 2008/092117; in
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183/474 serções de aminoácidos nas posições 233, 234, 235 e 237 (indicadas pela numeração EU); e alterações nos locais descritos no documento WO 2000/042072.
[00347] Determinadas variantes de Fc com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs são descritas (ver, por exemplo, a patente US n° 6.737.056; WO 2004/056312, W02006019447 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591 a 6604 (2001)).
[00348] Em algumas modalidades, é fornecida uma fusão variante CD80-Fc compreendendo uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a meia-vida e/ou melhoram a ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn). Anticorpos com meia-vidas aumentadas e ligação melhorada a FcRn são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.) ou WO2015107026. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434 por numeração da EU, por exemplo, substituição do resíduo da região Fc 434 (Patente US n° 7.371.826).
[00349] Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão variante CD80-Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos E356D e M358L por numeração EU. Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão variante CD80-Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos C220S, C226S e/ou C229S por numeração EU. Em algumas modalidades, a região Fc de uma fusão variante CD80 compreende uma ou mais substituições de aminoácidos R292C e V302C. Ver também Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); patente US n° 5.648.260; patente US n° 5.624.821; e WO 94/29351 relativas a outros exemplos de variantes da região Fc.
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184/474 [00350] Em algumas modalidades, são feitas alterações na região Fc que resultam na ligação diminuída de C1q e/ou Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC), por exemplo, como descrito na patente n° 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et at., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[00351] Em algumas modalidades, é fornecida uma fusão variante CD80-Fc compreendendo uma região Fc variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos, em que a região Fc variante derivada de lgG1, tal como lgG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc variante é derivada da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277. Em algumas modalidades, o Fc contém pelo menos uma substituição de aminoácido que é N82G por numeração de SEQ ID NO: 277 (correspondendo a N297G por numeração EU). Em algumas modalidades, o Fc contém ainda pelo menos uma substituição de aminoácido que é R77C ou V87C por numeração da SEQ ID NO: 277 (correspondendo a R292C ou V302C por numeração EU). Em algumas modalidades, a região Fc variante compreende ainda uma modificação de aminoácidos C5S por numeração de SEQ ID NO: 277 (correspondendo a C220S por numeração da EU), tal como a região Fc apresentada na SEQ ID NO: 1429 .Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc variante compreende as seguintes modificações de aminoácidos: V297G e uma ou mais das seguintes modificações de aminoácidos C220S, R292C ou V302C por numeração EU (correspondendo a N82G e um ou mais dos seguintes aminoácidos modificações C5S, R77C ou V87C com referência a SEQ ID NO: 277), por exemplo, a região Fc compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 356. Em algumas modalidades, a região Fc variante compreende uma ou mais das modificações de aminoácidos C220S, L234A, L235E ou G237A, por exemplo, a região Fc compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 357. Em algumas mo
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185/474 dalidades, a região Fc variante compreende uma ou mais das modificações de aminoácidos C220S, L235P, L234V, L235A, G236del ou S267K, por exemplo, a região Fc compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 358. Em algumas modalidades, a variante Fc compreende uma ou mais das modificações de aminoácidos C220S, L234A, L235E, G237A, E356D ou M358L, por exemplo, a região Fc compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 376.
[00352] Em algumas modalidades, a fusão variante CD80-Fc aqui fornecida contém um polipeptídeo CD80 variante de acordo com a descrição apresentada na Seção II acima. Em algumas modalidades, é fornecida uma fusão do CD80 variante-Fc compreendendo qualquer um do polipeptídeo CD80 variante descrito ligado a uma região Fc variante, em que a região Fc variante não é um Fc de lgG1 humana contendo as mutações R292C, N297G e V302C para R77C, N82G e V87C com referência a lgG1 Fc humana de tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: xxx). Em algumas modalidades, é fornecida uma fusão do CD80 variante-Fc compreendendo qualquer um do polipeptídeo CD80 variante ligado a uma região Fc ou região Fc variante, em que o polipeptídeo CD80 variante não está ligado ao Fc com um ligante consistindo em três alaninas.
[00353] Em algumas modalidades, a região Fc não possui a lisina C-terminal correspondente à posição 232 da Fc do tipo selvagem ou ηϊ^1Λ modificada apresentada na SEQ ID NO: 277 (correspondendo a K447del pela numeração EU). Em alguns aspectos, tal região Fc pode adicionalmente incluir uma ou mais modificações adicionais, por exemplo, substituições de aminoácidos, tal como qualquer como descrito. Exemplos de tal região Fc são apresentados na SEQ ID NO: 356-358, 376 ou 1713-1715.
[00354] Em algumas modalidades, é fornecida uma fusão variante CD80-Fc compreendendo uma região Fc variante em que a variante
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Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 376, 356, 357, 358, 1429 ou 1713-1715 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 376, 356, 357, 358, 1429 ou 1713-1715.
[00355] Em algumas modalidades, o Fc é derivado de lgG2, tal como a lgG2 humana. Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 278 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NO: 278.
[00356] Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1427 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1427. Em algumas modalidades, a lgG4 Fc é um Fc estabilizado em que o domínio CH3 da lgG4 humana é substituído pelo domínio CH3 da lgG1 humana e que exibe a formação de agregados inibidos, um anticorpo em que os domínios CH3 e CH2 da lgG4 humana estão substituídos por os domínios CH3 e CH2 da lgG1 humana, respectivamente, ou um anticorpo no qual a arginina na posição 409 indicada no índice EU proposto por Kabat et al. A lgG4 humana é substituída por lisina e exibe uma formação de agregados inibida (ver, por exemplo, a patente US n° 8.911.726. Em algumas modalidades, o Fc é um lgG4 contendo a mutação S228P, que foi mostrado para impedir a recombinação entre um anticorpo terapêutico e uma lgG4 endógena por troca de braço Fab (ver, por exemplo, Labrijin et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27 (8): 767-71). Em algumas modalidades, o Fc compreende a sequência de aminoácidos
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187/474 apresentada na SEQ ID NO 1428 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1428.
[00357] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está indiretamente ligado à sequência Fc, tal como através de um ligante. Em algumas modalidades, um ou mais ligantes peptídicos ligam o polipeptídeo CD80 variante e o domínio Fc. Em algumas modalidades, um ligante peptídico pode ser um único resíduo de aminoácido ou maior em comprimento. Em algumas modalidades, o ligante peptídico tem pelo menos um resíduo de aminoácido, mas não é mais do que 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante flexível. Em algumas modalidades, o ligante é (no código de aminoácido de uma letra): GGGGS (4GS ou G4S; SEQ ID NO: 1717) ou multímeros do ligante 4GS, tais como repetições de 2, 3, 4, ou 5 ligantes 4GS, tal como estabelecido na SEQ ID NO: 330 (2xGGGGS; (G4S)2) ou SEQ ID NO: 329 (3xGGGGS; (G4S)3). Em algumas modalidades, 0 ligante pode incluir uma série de resíduos de alanina isoladamente ou em adição a outro ligante peptídico (tal como um ligante a 4GS ou um seu multímero). Em algumas modalidades, 0 número de resíduos de alanina em cada série é 2, 3, 4, 5 ou 6 alaninas. Em algumas modalidades, 0 ligante são três alaninas (AAA). Em algumas modalidades, 0 polipeptídeo CD80 variante está indiretamente ligado à sequência Fc através de um ligante, em que 0 ligante não consiste em três alaninas. Em alguns exemplos, 0 ligante é um 2xGGGGS seguido por três alaninas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 331). Em algumas modalidades, 0 ligante pode ainda incluir aminoácidos introduzidos por clonagem e/ou de um local de restrição, por exemplo, 0 ligante pode incluir os aminoácidos GS (no código de ami
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188/474 noácido de uma letra) como introduzido pelo uso do local de restrição BAMHI. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante (em código de uma letra dos aminoácidos) é GSGGGGS (SEQ ID NO: 1716), GS (G4S)3 (SEQ ID NO: 3028), ou GS (G4S)5 (SEQ ID NO: 3029). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante rígido. Por exemplo, o ligante é um ligante α-helicoidal. Em algumas modalidades, o ligante é (no código de aminoácido de uma letra): EAAAK ou multímeros do ligante EAAAK, tais como repetições de 2, 3, 4 ou 5 ligantes EAAAK, tal como apresentado na SEQ ID NO: 3026 (IxEAAAK), SEQ ID NO: 3027 (3xEAAAK) ou SEQ ID NO: 3036 (õxEAAAK). Em alguns casos, o polipeptídeo imunomodulador compreendendo uma CD80 variante compreende várias combinações de ligantes peptídicos.
[00358] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está diretamente ligado à sequência Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante está diretamente ligado a um Fc, tal como um Fc inerte, que foi adicionalmente desprovido de toda ou de uma porção da região de dobradiça. Um exemplo de Fc, sem uma porção (6 aminoácidos) da região dobradiça é apresentado na SEQ ID NO: 30 25. Em algumas modalidades, em que o polipeptídeo CD80 está diretamente ligado à sequência Fc, o polipeptídeo CD80 pode ser truncado no terminal C em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é truncado para remover 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos que ligam a região IgV à região IgC. Por exemplo, os polipeptídeos CD80 variantes podem conter modificações no esqueleto CD80 exemplificative do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 3030).
[00359] Em algumas modalidades, a proteína de fusão variante CD80-Fc é um dímero formado por dois polipeptídeos CD80 Fc variantes ligados a um domínio Fc. Em algumas modalidades específicas, espécies idênticas ou substancialmente idênticas (permitindo 3 ou me
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189/474 nos diferenças de sequência de aminoácidos no terminal N ou no terminal C) de polipeptídeos de fusão variantes CD80-Fc serão dimerizadas para criar urn homodimero. Em algumas modalidades, o dímero é um homodimero em que os dois polipeptídeos CD80 Fc variantes são os mesmos. Alternativamente, diferentes espécies de polipeptídeos de fusão variante CD80-Fc podem ser dimerizadas para produzir um heterodímero. Assim, em algumas modalidades, o dímero é um heterodímero em que os dois polipeptídeos CD80 Fc variantes são diferentes.
[00360] São também fornecidas moléculas de ácido nucleico codificando a variante da proteína de fusão CD80-Fc. Em algumas modalidades, para produo de uma proteína de fuso Fc, uma molcula de cácido nucleico codificando uma proteína de fuso CD80-Fc variante inserida em um vetor de expresso apropriado. A variante resultante da proteína de fusão CD80-FC pode ser expressa em células hospedeiras transformadas com a expressão onde a reunio entre os domínios Fc ocorre por ligações dissulfureto intercadeias formadas entre as porções Fc para originar proteínas de fusão dimicas, tais como divalentes variantes de CD80-Fc.
[00361] As proteínas de fusão Fc resultantes podem ser facilmente purificadas por cromatografia de afinidade sobre colunas de Proteína A ou Proteína G. Para a geração de heterodímeros, etapas adicionais para purificação podem ser necessárias. Por exemplo, quando dois ácidos nucleicos que codificam diferentes polipeptídeos CD80 variantes são transformados em células, a formação de heterodímeros tem de ser alcançada bioquimicamente, uma vez que as moléculas CD80 variantes contendo o domínio Fc também serão expressas como homodímeros ligados por dissulfureto. Assim, os homodimeros podem ser reduzidos sob condições que favorecem a ruptura de dissulfuretos intercadeias, mas não afetam dissulfuretos intercadeia. Em alguns ca
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190/474 sos, diferentes monómeros variantes de CD80 Fc são misturados em quantidades equimolares e oxidados para formar uma mistura de homo e heterodimeros. Os componentes desta mistura são separados por técnicas cromatográficas. Alternativamente, a formação deste tipo de heterodímero pode ser influenciada por engenharia genética e expressando moléculas de fusão de Fc que contém um polipeptídeo CD80 variante, utilizando os métodos knob-into-hole descritos abaixo. [00362] B. Moléculas de Pilha com Domínios IgSF Adicionais [00363] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras podem conter qualquer um dos polipeptídeos variantes CD80 aqui proporcionados ligados, direta ou indiretamente, a um ou mais outro domínio da superfamília de imunoglobulina (IgSF) (construção de proteína imunomoduladora empilhada e também denominada imunomodulador Tipo II proteína). Em alguns aspectos, isso pode criar proteínas imunomoduladoras de múltiplos domínios exclusivas que se ligam a dois ou mais, como três ou mais parceiros de ligação cognatos, proporcionando assim uma modulação de múltiplos alvos da sinapse imunológica.
[00364] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora compreende uma combinação (uma combinação não selvagem) e/ou arranjo (um arranjo do tipo não selvagem ou permutação do tipo não selvagem) de um domínio CD80 variante com uma ou mais sequências de domínio IgE modificado por afinidade e/ou sem afinidade modificada de outro membro da família IgSF (por exemplo, um membro da família de IgSF de mamífero) que não se encontram em membros da família de IgSF de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém 2, 3, 4, 5 ou 6 domínios da superfamília de imunoglobulina (IgSF), em que pelo menos um dos domínios de IgSF é um domínio IgSF CD80 variante (vlgD de CD80) de acordo com a descrição fornecida.
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191/474 [00365] Em algumas modalidades, as sequências dos domínios de IgSF adicionais podem ser um domínio IgSF modificado que contém uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, substituições, em comparação com um domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, o domínio IgSF pode ser modificado sem afinidade (por exemplo, tipo selvagem) ou ter sido modificado por afinidade. Em algumas modalidades, o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem pode ser de rato, rato, macaco cinomolgo ou origem humana, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os domínios de IgSF adicionais podem ser um domínio IgSF de um membro da família de IgSF apresentados na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional pode ser um domínio IgSF modificado por afinidade contendo uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, substituições, em comparação com um domínio IgSF contido em um membro da família de IgSF apresentado na Tabela 2.
[00366] Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é um domínio IgSF modificado por afinidade ou sem afinidade contido em um membro da família IgSF de uma família selecionada da Família de Proteína Reguladora de Sinal (SIRP), Receptor de Desencadeamento Expresso em Células Mieloides Como Família (TREML), Molécula de Adesão Celular Relacionada com o Antígeno Carcinoembrionário (CEACAM) Família, Família de Butirofilina Tipo Ig Ligada a Ácido Siálico (SIGLEC), Família B7, Família CD28, Conjunto V e Família de Contenção de Domínio de Imunoglobulina (VSIG), domínio transmembrana V-set (VSTM), família do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), família da molécula de ativação linfocítica de sinalização (SLAM), receptor tipo imunoglobulina de leucócitos (LIR), família Nectina (Nec), família tipo Nectina (NECL), PVR relacionado ao receptor de poliovirus) família, família de receptores desencadeantes de citoto
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192/474 xicidade natural (NCR), família de imunoglobulinas e mucinas de células T (TIM) ou família de receptores de tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR). Em algumas modalidades, os domínios de IgSF adicionais são derivados independentemente de uma proteína de IgSF selecionada do grupo que consiste em CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1LG2 (PD- L2, CD273), ICOSLG (B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276 (B7-H3), VTCN1 (B7-H4), CD28, CTLA4, PDCD1 (PD-1), ICOS, BTLA (CD272), CD4, CD8A (CD8-alfa), CD8B (CD8-beta), LAG3, HAVCR2 (TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR (CD155), PVRL2 (CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1 (CD200R ) e NC R3 (NKp30).
[00367] A primeira coluna da Tabela 2 fornece o nome e, opcionalmente, o nome de alguns sinônimos possíveis para esse membro IgSF em particular. A segunda coluna fornece o identificador de proteína do banco de dados UniProtKB, um banco de dados disponível ao público, acessível via internet em uniprot.org ou, em alguns casos, o número do GenBank. O Universal Protein Resource (UniProt) é um recurso abrangente para dados de sequência e anotação de proteínas. Os bancos de dados UniProt incluem o UniProt Knowledgebase (UniProtKB). O UniProt é uma colaboração entre o Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI), o Instituto Suíço de Bioinformática da SIB e o Recurso de Informação sobre Proteínas (PIR) e apoiado principalmente por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH). O GenBank é o banco de dados de sequências genéticas do NIH, uma coleção anotada de todas as sequências de DNA publicamente disponíveis (Nucleic Acids Research, 2013 Jan; 41 (D1): D36-42). A terceira coluna fornece a região onde o domínio IgSF indicado está localizado. A região é especificada como um intervalo em que o domínio inclui os resíduos que definem o intervalo. A coluna 3 também indica a classe de domínio IgSF para a região IgSF especificada. A coluna 4 proporci
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193/474 ona a região onde os domínios adicionais indicados estão localizados (peptideo de sinal, S; domínio extracelular, E; domínio transmembranar, T; domínio citoplasmático, C). Entende-se que a descrição dos domínios pode variar dependendo dos métodos usados para identificar ou classificar o domínio e pode ser identificada de maneira diferente de diferentes fontes. A descrição de resíduos correspondentes a um domínio na Tabela 2 é apenas para exemplificação e pode ser vários aminoácidos (tal como um, dois, três ou quatro) mais longos ou mais curtos. A coluna 5 indica, para alguns dos membros de IgSF listados, alguns dos seus parceiros de ligação à superfície celular cognatos.
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TABELA 2. Membros de IgSF de acordo com a presente revelação.
Membro de IgSF (Sinó-nimo) Número de de NCBI/lden-tif de Proteína tKB Acesso Proteína icador UniPro- Região IgSF & Classe de de Domínio Outros Domínios Parceiros de Ligação de Superfície de Célula Cognata Sequência de Aminoácido de Membro de IgSF (SEQ ID NO)
Precursor (resíduos maduros) Madura ECD
CD80 (B7-1) NP_005182.1 P33681 35-135, 35-138, 37-138, ou 35-141 IgV, 145-230, 154-232, ou 142-232 lgC2 S: 1-34, E: 35-242, T: 243- 263, C: 264-288 CD28, CTLA4, PD-L1 1 (35-288) 279 2
CD86 (B7-2) P42081.2 33-131 IgV, 150-225 lgC2 S: 1-23, E: 24-247, T: 248- 268, C: 269-329 CD28, CTLA4 224 (24-329) 280 250
CD274 (PD-L1, B7-H1) Q9NZQ7.1 19-127, 24-130 IgV, 133- 225 lgC2 S: 1-18, E: 19-238, T: 239- 259, C: 260-290 PD-1, B7-1 225 (19-290) 281 251
PDCD1LG2 (PD-L2, CD273) Q9BQ51.2 21-118 IgV, 122-203 lgC2 S: 1-19, E: 20-220, T: 221- 241, C: 242-273 PD-1, RGMb 226 (20-273) 282 252
ICOSLG (B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2) 075144.2 19-129 IgV, 141-227 lgC2 S: 1-18, E: 19-256, T: 257- 277, C: 278-302 ICOS, CD28, CTLA4 227 (19-302) 283 253
CD276 (B7-H3) Q5ZPR3.1 29-139 IgV, 145-238 lgC2, 243-357 lgV2, 363-456, 367-453 lgC2 S: 1-28, E: 29-466, T: 467- 487, C: 488-534 228 (29-534) 284 254
VTCN1 (B7-H4) Q7Z7D3.1 35-146 IgV, 153-241 IgV S: 1-24, E: 25-259, T: 260- 280, C: 281-282 229 (25-282) 285 255
CD28 P10747.1 28-137 IgV S: 1-18, E: 19-152, T: 153- 179, C: 180-220 B7-1, B7-2, B7RP1 230 (19-220) 286 256
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CTLA4 P16410.3 39-140 IgV S: 1-35, E: 36-161, T: 162- 182, C: 183-223 B7-1, B7-2, B7RP1 231 (36-223) 287 257
PDCD1 (PD-1) Q15116.3 35-145 IgV S: 1-20, E: 21- 170, T: 171 a 191, C: 192-288 PD-L1, PD-L2 232 (21-288) 288 258
ICOS Q9Y6W8.1 30-132 IgV S: 1-20, E: 21 a 140, T: 141 161, C: 162-199 B7RP1 233 (21-199) 289 259
BTLA (CD272) Q7Z6A9.3 31-132 IgV S: 1-30, E: 31- 157, T: 158- 178, C: 179-289 HVEM 234 (31-289) 290 260
CD4 P01730.1 26-125 IgV, 126-203 lgC2, 204-317 lgC2, 317389, 318-374 lgC2 S: 1-25, E: 26-396, T: 397- 418, C: 419-458 MHC classe II 235 (26-458) 291 261
CD8A (CD8-alfa) P01732.1 22-135 IgV S: 1-21, E: 22-182, T: 183-203, C: 204235 MHC classe I 236 (22-235) 292 262
CD8B (CD8-beta) P10966.1 22-132 IgV S: 1-21, E: 22-170, T: 171- 191, C: 192-210 MHC classe I 237 (22-210) 293 263
LAG3 P18627.5 37-167 IgV, 168-252 igC2, 265-343 lgC2, 349-419 lgC2 S: 1-28, E: 29-450, T: 451- 471, C: 472-525 MHC classe II 238 (29-525) 294 264
HAVCR2 (TIM-3) Q8TDQ0.3 22-124 IgV S: 1-21, E: 22-202, T: 203- 223, C: 224-301 CEACAM-1, fosfatidilserina, Galectin-9, HMGB1 239 (22-301) 295 265
CEACAM1 P13688.2 35-142 IgV, 145-232 lgC2, 237-317 lgC2, 323413 lgC2 S: 1-34, E: 35-428, T: 429- 452, C: 453-526 TIM-3 240 (35-526) 296 266
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TIGIT Q495A1.1 22-124 IgV S: 1-21, E: 22-141, T: 142- 162, C: 163-244 CD155, CD112 241 (22-244) 297 267
PVR (CD155) P15151.2 24-139 IgV, 145-237 lgC2, 244-328 lgC2 S: 1-20, E: 21-343, T: 344- 367, C: 368-417 TIGIT, CD226, CD96, poliovirus 242 (21-417) 298 268
PVRL2 (CD112) Q92692.1 32-156 IgV, 162-256 lgC2, 261-345 lgC2 S:1-31, E: 32-360, T: 361- 381, C: 382-538 TIGIT, CD226, CD112R 243 (32-538) 299 269
CD226 Q15762.2 19-126 lgC2, 135-239 lgC2 S: 1-18, E: 19-254, T: 255- 275, C: 276-336 CD155, CD112 244 (19-336) 300 270
CD2 P06729.2 25-128 IgV, 129-209 lgC2 S: 1-24, E: 25-209, T: 210- 235, C: 236-351 CD58 245 (25-351) 301 271
CD160 095971.1 27-122 IgV N/A HVEM, MHC família de proteínas 246 (27-159) 302 272
CD200 P41217.4 31-141 IgV, 142-232 lgC2 S: 1-30, E: 31-232, T: 233- 259, C: 260-278 CD200R 247 (31-278) 303 273
CD200R1 (CD200R) Q8TD46.2 53-139 IgV, 140-228 lgC2 S: -28, E: 29-243, T: 244- 264, C: 265-325 CD200 248 (29-325) 304 274
NCR3 (NKp30) 014931.1 19-126 tipo IgC S: 1-18, E: 19-135, T: 136156, C: 157-201 B7-H6 249 (19-201) 305 275
VSIG8 Q5VU13 22-141 lgV1, 146-257 lgV2 S: 1-21 E: 22-263 T: 264-284 C: 285-414 VISTA 306 (22-414) 307 308
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O número de tais domínios de IgSF modificados por afinidade ou não modificados por afinidade presentes em uma construção de proteína imunomoduladora empilhada (quer sejam combinações de tipo não selvagem ou aranjos de tipo não selvagem) pelo menos 2, 3, 4 ou 5 e em alguns realiza-se exatamente 2, 3, 4 ou 5 domínios de IgSF (em que a determinação do número de domínios de IgSF modificados por afinidade ignora quaisquer sequências fracionárias de ligação não específica e/ou sequências fracionárias substancialmente imunologicamente inativas deste).
[00368] Em algumas modalidades de uma proteína imunomoduladora empilhada aqui fornecida, o número de domínios de IgSF é pelo menos 2, em que o número de afinidade modificada e o número de domínios IgSF modificados sem afinidade são, cada um, independentemente, pelo menos: 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6. Assim, o número de domínios de IgSF modificados por afinidade e o número de domínios de IgSF modificados por afinidade, respectivamente (domínio IgSF modificado por afinidade: domínio IgSF modificado por não afinidade), pode ser exatamente ou pelo menos: 2: 0 (modificado por afinidade: tipo selvagem), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 ou 5:1.
[00369] Em algumas modalidades de uma proteína imunomoduladora empilhada, pelo menos dois dos domínios de IgSF modificados por afinidade e/ou afinidade não modificados são domínios de IgSF idênticos.
[00370] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora empilhada aqui fornecida compreende pelo menos dois domínios de IgSF modificados por afinidade e/ou domínios de IgSF modificados por não afinidade, mas em um arranjo do tipo não selvagem (alternativamente, permutação). Um exemplo ilustrativo de uma disposição ou permutação de tipo não selvagem é uma proteína imunomoduladora
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198/474 compreendendo uma ordem não selvagem de sequências do domínio IgE modificado por afinidade e/ou domínio IgE modificado por não afinidade em relação àquelas encontradas no CD80 de tipo selvagem cujas sequências de domínio IgSF serviram como a fonte dos domínios de IgSF variantes como aqui fornecidos. Assim, em um exemplo, a proteína imunomoduladora pode compreender uma IgV proximal e uma IgC distai ao domínio transmembranar, embora em uma modificação por não afinidade e/ou afinidade modificada. A presença, em uma proteína imunomoduladora aqui fornecida, de ambas as combinações de tipo não selvagem e arranjos do tipo não selvagem de domínios de IgSF modificados por não afinidade e/ou modificados por afinidade, também estão dentro do âmbito do assunto fornecido.
[00371] Em algumas modalidades de uma proteína imunomoduladora empilhada, os domínios de IgSF modificados por afinidade e/ou afinidade não modificados são domínios de IgSF não idênticos (ie, diferentes).Os domínios de IgSF modificados por afinidade não idênticos ligam-se especificamente, sob condições de ligação específicas, diferentes parceiros de ligação cognatos e são não idênticos independentemente de os domínios de IgSF selvagens ou não modificados a partir dos quais são manipulados serem iguais. Assim, por exemplo, uma combinação de tipo não selvagem de pelo menos dois domínios IgSF não idênticos em uma proteína imunomoduladora pode compreender pelo menos uma sequência do domínio IgSF cuja origem de e exclusiva de um CD80, e pelo menos um de uma segunda sequência do domínio IgSF cuja origem de e exclusiva de outro membro da família IgSF que é não CD80, em que os domínios IgSF da proteína imunomoduladora estão na forma modificada e/ou modificada por afinidade sem afinidade. No entanto, em modalidades alternativas, os dois domínios de IgSF não idênticos originam-se da mesma sequência de domínio IgSF, mas pelo menos um deles é modificado por afinidade de
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199/474 tal modo que se ligam especificamente a diferentes parceiros de ligação cog natos.
[00372] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras fornecidas, além de conter um polipeptídeo CD80 variante, também contêm pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 domínios adicionais da superfamília de imunoglobulina (IgSF), tais como um domínio IgD de um membro da família de IgSF estabelecido na Tabela 2. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, segundo domínio IgSF). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos dois domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo e terceiro domínios de IgSF). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos três domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro e quarto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos quatro domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro, quarto e quinto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos cinco domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos seis domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto e sétimo). Em algumas modalidades, cada um dos domínios de IgSF na proteína imunomoduladora são diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos um dos domínios IgSF adicionais é o mesmo que pelo menos um outro domínio IgSF na proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, cada um dos domínios IgSF é de ou derivado de um membro diferente da família IgSF. Em algumas modalidades, pelo menos dois dos domínios IgSF são do ou derivam do mesmo membro da família IgSF.
[00373] Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional com
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200/474 preende um domínio IgV ou um domínio ou domínios IgC (por exemplo, lgC2), ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios IgC (por exemplo, lgC2). Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um domínio IgV de comprimento total. Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um domínio ou domínios IgC de comprimento total (por exemplo, lgC2). Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um fragmento de ligação específica do domínio IgV. Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional é ou compreende um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios de IgC (por exemplo, lgC2). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos dois domínios de IgSF adicionais de um único (mesmo) membro de IgSF. Por exemplo, em alguns aspectos, a proteína imunomoduladora cont um ECD ou porção do mesmo de um membro de IgSF contendo um domínio de IgV de tamanho completo e um domínio ou domínios IgC de comprimento total (por exemplo, lgC2) ou seus fragmentos de ligação específica.
[00374] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras fornecidas contêm pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, um segundo ou, em alguns casos, também um terceiro domínio IgSF e assim por diante) em que pelo menos um domínio IgSF adicional ou secundário é um conjunto de domínios IgSF em diante em um domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo contido na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS: 224-249 e 306. Em algumas modalidades, o domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado um domínio de IgV ou um domínio de IgC, tal como um domínio lgC1 ou lgC2.
[00375] Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras
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201/474 fornecidas, além de conter um polipeptídeo CD80 variante, também contêm pelo menos um domínio IgSF modificado por afinidade adicional (por exemplo, um segundo ou, em alguns casos, também um terceiro domínio IgSF modificado por afinidade e assim ) em que pelo menos um domínio IgSF adicional é um vlgD que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituição, deleção ou mutação) em comparação com um domínio IgSF em um domínio IgSF selvagem ou não modificado, como um domínio IgSF em um membro da família IgSF apresentado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio adicional de IgSF modificado por afinidade, por exemplo, segundo ou terceiro, compreende pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo contido na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 224 -249 e 306. Em algumas modalidades, o domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado um domínio de IgV ou um domínio de IgC, tal como um domínio lgC1 ou lgC2. Em algumas modalidades, o domínio IgSF adicional, por exemplo, segundo ou terceiro, é um domínio IgV e/ou IgC modificado por afinidade. Em algumas modalidades, o um ou mais domínio IgSF adicional é um domínio IgSF modificado por afinidade que contém um domínio IgV e/ou um domínio ou domínios IgC (por exemplo, lgC2), ou um fragmento de ligação específica do domínio IgV e/ou um fragmento de ligação específica do domínio ou domínios de IgC (por exemplo, lgC2), em que o domínio IgV e/ou IgC contém a modificação (ou modificações) de aminoácidos (por exemplo, substituição (ou substituições)). Em algumas modalidades, o um ou mais domínios de IgSF modificados por afinidade adicionais contêm um domínio IgV contendo a modificação (ou modificações) de aminoácidos (por exemplo, substituição (ou substituições)). Em algumas mo
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202/474 dalidades, o um ou mais domínios de IgSF modificados por afinidade adicionais incluem domínios IgSF presentes no ECD ou uma porção do ECD do correspondente membro da família de IgSF não modificado, tal como um domínio de IgV de comprimento completo e IgC de comprimento completo (por exemplo, lgC2) domínio ou domínios, ou seus fragmentos de ligação específica, nos quais uma ou ambas IgV e IgC contêm a modificação (ou modificações) de aminoácidos (por exemplo, substituição (ou substituições)).
[00376] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora fornecida contém pelo menos um domínio IgSF adicional ou secundário que é um vlgD que contém uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um domínio IgSF não modificado ou selvagem CD80 [00377] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios de domínio IgSF adicional (por exemplo, segunda ou terceira IgSF) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de outro membro da família de IgSF que também se liga a um receptor inibidor. Em alguns aspectos, um ou mais domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segunda ou terceira IgSF) são um domínio IgSF modificado por afinidade que é um domínio IgSF variante (vlgD) de um membro da família IgSF que se liga a um receptor inibitório e que contém uma ou mais substituições de aminoácidos em um domínio IgSF (por exemplo, IgV), em que, em alguns casos, uma ou mais modificações de aminoácidos resultam em uma ligação aumentada ao receptor inibidor. Em algumas modalidades, o vlgD contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) em um domínio IgSF de tipo selvagem ou não modificado (por exemplo, IgV) de um membro da família de IgSF que se liga a um receptor inibitório. Além de CTLA-4, exemplos de tais receptores inibidores são PD-1, LAG3, TIGIT, TIM-3 ou BTLA. Em algumas modalidades, o um ou mais domínios IgSF adicio
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203/474 nais de um membro da família de IgSF selecionado de CD155, CD112, PD-L1, PD-L2 ou CEACAM1. Assim, em alguns aspectos, são proporcionados antagonistas de checagem de múltiplos alvos que visam ou bloqueiam a atividade de mais do que um receptor inibidor. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora em um antagonista de pontos de checagem de múltiplos alvos que visa ou bloqueia a atividade de pelo menos dois, três, quatro ou mais receptores inibidores.
[00378] Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes e um ou mais domínios de IgSF de um receptor inibidor, tal como um receptor inibidor de tipo selvagem ou não modificado. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes e um ou mais domínios de Ig 1 de CD112, por exemplo, CD112 de tipo selvagem ou não modificado, tal como um domínio de IgV estabelecido na SEQ ID NO: 734 ou 829 ou um ECD ou uma porção da mesma (contendo o domínio IgV e IgC ou os seus fragmentos de ligação específica) apresentados na SEQ ID NO: 269 ou em uma porção da mesma. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes e um ou mais domínios IgSF de CD155, por exemplo, CD155 de tipo selvagem ou não modificado, tal como um domínio IgV estabelecido na SEQ ID NO: 421 ou um ECD ou uma sua porção (contendo o domínio IgV e IgC ou os seus fragmentos de ligação específica) apresentados na SEQ ID N 268 ou em uma sua porção. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes e um ou mais domínios de IgSF de PD-L1, por exemplo, PD-L1 de tipo selvagem ou não modificado, tal como um domínio IgV estabelecido em SEQ ID. NO: 1000 ou 1196 ou um ECD ou uma sua porção (contendo o domínio IgV e IgC ou os seus fragmentos de ligação específi
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204/474 ca) apresentados na SEQ ID NO: 251 ou 1721 ou em uma sua porção. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes e um ou mais domínios de IgSF de PD-L2, por exemplo, PD-L2 de tipo selvagem ou não modificada, tal como o domínio IgV estabelecido na SEQ ID NO: 1197 ou 1257 ou um ECD ou uma sua porção (contendo o domínio IgV e IgC ou os seus fragmentos de ligação específica) apresentados na SEQ ID NO: 252 ou em uma sua porção.
[00379] Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo um ou mais domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segunda ou terceira IgSF) que é um vlgD de um membro da família IgSF que se liga a um receptor inibidor no qual a uma ou mais modificações de aminoácidos um domínio IgSF (por exemplo, IgV) resulta em aumento da afinidade de ligação do vlgD, ou uma proteína de fusão ou imunomoduladora contendo o vlgD, para o seu parceiro de ligação cognato do receptor inibido em comparação com o domínio IgSF não modificado, tal como afinidade de ligação 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30vezes 40 vezes ou 50 vezes. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações de aminoácidos em um domínio IgSF (por exemplo, IgV) resulta em uma seletividade aumentada do vlgD, ou uma proteína de fusão ou imunomoduladora contendo o vlgD, para o seu receptor inibidor em comparação com o domínio IgSF não modificado. Em algumas modalidades, a seletividade aumentada é uma razão maior de ligação do vlgD para o receptor inibidor versus outro parceiro de ligação cognato, tal como um parceiro de ligação cognato que não é um receptor inibidor, comparado com a razão de ligação da IgSF não modificada para o receptor inibitório versus o outro parceiro de ligação cognato. Em algumas modalidades, a razão é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 ve
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205/474 zes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes 40 ou 50 vezes.
[00380] Em algumas modalidades, o pelo menos um vlgD adicional (por exemplo, segunda ou terceira) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo CD112 variante que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) no domínio IgSF (por exemplo, IgV) comparado com CD112 não modificado ou de tipo selvagem, que são membros da família IgSF que se ligam ao receptor TIGIT inibidor. Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD contendo IgV e IgC) de um polipeptídeo CD112 variante, são apresentados na Tabela 3. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo CD112 variante contendo um domínio IgV incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 3, tal como o domínio IgV estabelecido em qualquer SEQ ID NOS: 782-828, 830-876, 918-999, 1454-1501 ou um domínio de IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer das SEQ ID NOS: 782-828, 830-876, 918-999, 1454-1501 e contém a um ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo CD112 variante contendo um ECD ou uma porção deste contendo os domínios IgV e/ou IgC, em que está contida qualquer das modificações de aminoácidos estabelecidas na Tabela 3, tal como o ECD estabelecido em qualquer das SEQ ID NOS: 735-781, 877-917, 1430-1453 ou um ECD que contenha pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 735-781, 877
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917, 1430-1453 e contém a uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00381] Em algumas modalidades, o pelo menos um vlgD adicional (por exemplo, segundo ou terceiro) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo CD155 variante que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) no domínio IgSF (por exemplo, IgV) comparado com CD155 não modificado ou de tipo selvagem, que são membros da família de IgSF que se ligam ao receptor TIGIT inibidor. Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD contendo IgV e IgC) de um polipeptídeo CD155 variante, são apresentados na Tabela 4. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo CD155 variante contendo um domínio IgV incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 4, tal como o domínio IgV estabelecido em qualquer SEQ ID NOS: 400-420, 422-442, 540-733, 1502-1547, 1572, 1573, 1620-1711 ou um domínio de IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 400-420, 422-442, 540-733, 15021547, 1572, 1573, 1620-1711 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes fornecidos e um polipeptídeo CD155 variante contendo um ECD ou uma porção do mesmo contendo os domínios IgV e/ou IgC, no qual estão contidos quaisquer das modificações de aminoácidos estabelecidas na Tabela 4, tal como o ECD apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 379-399, 443-539, 1548-1571, 1574-1619 ou um ECD que contenha pelo menos 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%,
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91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 379-399, 443-539, 1548 -1571, 1574-1619 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00382] Em algumas modalidades, o pelo menos um vlgD adicional (por exemplo, segundo ou terceiro) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo PD-L1 variante que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) no domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD) em comparação com PD-L1 não modificado ou selvagem, o que, em alguns aspectos, resulta em aumento da ligação ao receptor inibidor PD-1. Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD contendo IgV e IgC) de um polipeptídeo PD-L1 variante são apresentados na Tabela 5. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo PD-L1 variante contendo um domínio IgV incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 5, tal como o domínio IgV estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1066-1195, 1719, 1720, 1901 a 1930 ou um domínio de IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1066-1195, 1719, 1720, 1901 a 1930 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD180 variantes fornecidos e um polipeptídeo PD-L1 variante contendo um ECD ou uma porção deste contendo os domínios IgV e/ou IgC, em que está contido qualquer um dos aminoácidos modificações apresentadas na Tabela 5, tal como o ECD apresentado em qualquer das SEQ ID NOS: 1001 a 1065, 1718, 1722-1900, 1931 a 1996 ou um ECD que contém pelo menos 85%, 86%, 87%, 88 %,
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89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1001-1065, 1718, 1722-1900, 19311996 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00383] Em algumas modalidades, o pelo menos um vlgD adicional (por exemplo, segundo ou terceiro) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo PD-L2 variante que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) no domínio IgSF (por exemplo, IgV) comparado com PD-L2 não modificado ou selvagem, o que, em alguns aspectos, resulta em aumento da ligação ao receptor inibidor PD-1. Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD contendo IgV e IgC) de um polipeptídeo PD-L2 variante são apresentados na Tabela 6. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo PD-L2 variante contendo um domínio IgV incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 6, tal como o domínio IgV estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1275-1325, 1327-1401, 1403-1426 ou um domínio de IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1275-1325, 1327-1401, 1403-1426 e cont a uma ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes fornecidos e um polipeptídeo PD-L2 variante contendo um ECD ou uma porção deste contendo os domínios IgV e/ou IgC, em que está contido qualquer um dos aminoácidos modificações apresentadas na Tabela 6, tal como o ECD estabelecido em qualquer das SEQ ID NOS: 1198-1248, 1250-1256, 1258-1274 ou um ECD que contém pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
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95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1198-1248, 1250-1256, 1258-1274 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00384] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora aqui fornecida que contém um domínio IgSF (por exemplo IgV) de CD155, CD112, PD-L1 ou PD-L2 ou uma variante de qualquer um dos mencionados anteriormente é uma na qual está contido um polipeptídeo CD80 variante de acordo com a descrição estabelecida na Seção II acima. Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora fornecida contendo um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de CD155, CD112, PD-L1 ou PD-L2 ou uma variante de qualquer um dos domínios anterior e IgSF de um polipeptídeo CD80 variante é aquela em que o o polipeptídeo CD80 variante não contém modificações de aminoácidos em um polipeptídeo CD80 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 2, 76 ou 150 em que as únicas modificações de aminoácidos são L70PI30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/ L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/ T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/L70P/E77G, T57A/ I69T, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/ L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/P74S/E81G/E85D, A71D, T13A/I61N/A71D, E81K/A91S, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/ L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71 D/ R73S, E24X/Q33R/K54N/T57I/I67V/A71 D, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T5 7I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/ E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/
A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/
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A71D/V83I, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/ L72P/ E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/
D76H, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D ou Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante não é o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 3-75, 77-149 ou 151-223.
[00385] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora fornecida não contém um domínio IgSF de CD155 ou uma variante de ambos. Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora fornecida não contém um domínio IgSF de CD112 ou uma variante de ambos. Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora fornecida não contém um domínio IgSF de PD-L1 ou uma variante de ambos. Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora fornecida não contém um domínio IgSF de PD-L2 ou uma variante de ambos.
[00386] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios de domínio IgSF adicional (por exemplo, segundo ou terceiro IgSF) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de outro membro da família de IgSF que se liga ou reconhece um antígeno tumoral. Em tais modalidades, o membro da família IgSF serve como uma porção de localização no tumor, trazendo assim o vlgD de CD80 muito próximo das células imunológicas no microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o domínio adicional de IgSF (por exemplo, segunda IgSF) é um domínio IgSF de NKp30, que se liga ou reconhece B7-H6 expresso em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio IgSF adicional (por exemplo, segundo), por exemplo, NKp30, é um domínio IgSF modificado por afinidade ou vlgD que contém uma ou
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211/474 mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições). Em algumas modalidades, as modificações de um ou mais aminoácidos aumentam a afinidade de ligação e/ou seletividade para B7-H6 em comparação com o domínio IgSF não modificado, por exemplo, NKp30, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes ou 50 vezes. Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, ECD semelhante a IgC ou ECD completo) de um polipeptídeo NKp30 variante, são apresentados na Tabela 7. Entre os polipeptídeos exemplificativos está uma variante de NKp30 que contém as mutações L30V/A60V/S64P/S86G com referência a posições no domínio extracelular de NKp30 correspondente às posições estabelecidas na SEQ ID NO: 275. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo NKp30 variante contendo um domínio semelhante a IgC incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 7, tal como o conjunto de domínios semelhantes a IgC, em qualquer das SEQ ID NOS: 344-348 ou um domínio IgV que tenha pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 344-348 e cont a uma ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD180 variante fornecidos e um polipeptídeo NKp30 variante contendo um ECD ou uma porção da mesma contendo um domínio ou domínios de IgSF, em que está contida qualquer uma das modificações de aminoácidos estabelecidas em Tabela 7, tal como o ECD apresentado em qualquer das SEQ ID NOS: 334-338 ou um ECD que contenha pelo
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212/474 menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 334-338 e contém a uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00387] Em algumas modalidades, o pelo menos um vlgD adicional (por exemplo, segundo ou terceiro) é um domínio IgSF (por exemplo, IgV) de um polipeptídeo CD86 variante que contém uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições) no domínio IgSF (por exemplo, IgV) comparado com CD86 não modificado ou de tipo selvagem, que, em alguns aspectos, resulta em aumento da ligação ao seu parceiro de ligação cognato.Exemplos de modificações de aminoácidos, tais como substituições, deleções ou adições, em um domínio IgSF (por exemplo, IgV ou ECD contendo IgV e IgC) de um polipeptídeo CD86 variante, são apresentados na Tabela 8. Entre os polipeptídeos exemplificativos incluem-se variantes de CD86 que cont as mutações Q35H/H90L/Q102H com referência a posições no domínio extracelular de CD86 correspondentes posições estabelecidas na SEQ ID NO: 250. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo CD86 variante contendo um domínio IgV incluindo qualquer uma das modificações de aminoácidos apresentadas na Tabela 8, tal como o domínio IgV estabelecido em qualquer SEQ ID NOS: 350-353 ou um domínio de IgV que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer uma das SEQ ID NOS: 350-353 e contém uma ou mais modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína imunomoduladora contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variante fornecidos e um polipeptídeo CD86 variante contendo um ECD ou uma porção deste contendo os domínios IgV e/ou IgC, em que está contida qualquer uma das modificações de aminoácidos estabelecidas na Tabela 8, tal
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213/474 como o ECD apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 339342 ou um ECD que contenha pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para qualquer das SEQ ID NOS: 339-342 e contém a uma ou mais modificações de aminoácidos.
[00388] As Tabelas 3 a 8 proporcionam polipeptídeos exemplificativos contendo um ou mais domínios de IgSF modificados por afinidade que podem ser utilizados em construções de pilha aqui proporcionadas.
TABELA 3: Polipeptídeos CD112 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv
SEQ ID NO
Tipo selvagem 269 734 829
Y33H, A112V, G117D 735 782 830
V19A, Y33H, S64G, S80G, G98S, N106Y,A112V 736 783 831
L32P, A112V 737 784 832
A95V, A112I 738 785 833
P28S, A112V 739 786 834
P27A, T38N, V101A, A112V 740 787 835
S118F 741 788 836
R12W, H48Y, F54S, S118F 742 789 837
R12W, Q79R, S118F 743 790 838
T113S, S118Y 744 791 839
S118Y 745 792 840
N106I, S118Y 746 793 841
N106I, S118F 747 794 842
A95T, L96P, S118Y 748 795 843
Y33H, P67S, N106Y, A112V 749 796 844
N106Y, A112V 750 797 845
T18S, Y33H, A112V 751 798 846
P9S, Y33H, N47S.A112V 752 799 847
P42S, P67H.A112V 753 800 848
P27L, L32P, P42S, A112V 754 801 849
G98D, A112V 755 802 850
Y33H, S35P, N106Y, A112V 756 803 851
L32P, P42S, T100A, A112V 757 804 852
P27S, P45S, N106I, A112V 758 805 853
Y33H, N47K, A112V 759 806 854
Y33H, N106Y, A112V 760 807 855
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3347/3680
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TABELA 3: Polipeptídeos CD112 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv
SEQ ID NO
K78R, D84G, A112V, F114S 761 808 856
Y33H, N47K, F54L, A112V 762 809 857
Y33H, A112V 763 810 858
A95V, A112V 764 811 859
R12W, A112V 765 812 860
R12W, P27S, A112V 766 813 861
Y33H, V51M, A112V 767 814 862
Y33H, A112V, S118T 768 815 863
Y33H, V101A, A112V, P115S 769 816 864
H24R, T38N, D43G,A112V 770 817 865
A112V 771 818 866
P27A, A112V 772 819 867
A112V, S118T 773 820 868
R12W, A112V, M122I 774 821 869
Q83K, N106Y, A112V 775 822 870
R12W, P27S, A112V, S118T 776 823 871
P28S, Y33H, A112V 777 824 872
P27S, Q90R, A112V 778 825 873
L15V, P27A, A112V, S118T 779 826 874
Y33H, N106Y, T108I, A112V 780 827 875
Y33H, P56L, V75M, V101M, A112V 781 828 876
N47K, Q79R, S118F 877 918 959
Q40R, P60T, A112V, S118T 878 919 960
F114Y, S118F 879 920 961
Y33H, K78R, S118Y 880 921 962
R12W, A46T, K66M, Q79R, N106I, T113A, S118F 881 922 963
Y33H, A112V, S118F 882 923 964
R12W, Y33H, N106I, S118F 883 924 965
L15V, Q90R, S118F 884 925 966
N47K, D84G, N106I, S118Y 885 926 967
L32P, S118F 886 927 968
Y33H, Q79R, A112V, S118Y 887 928 969
T18A, N106I, S118T 888 929 970
L15V, Y33H, N106Y, A112V, S118F 889 930 971
V37M, S118F 890 931 972
N47K, A112V, S118Y 891 932 973
A46T, A112V 892 933 974
P28S, Y33H, N106I, S118Y 893 934 975
P30S, Y33H, N47K, V75M, Q79R, N106I, S118Y 894 935 976
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3348/3680
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TABELA 3: Polipeptídeos CD112 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv
SEQ ID NO
V19A, N47K, N106Y, K116E, S118Y 895 936 977
Q79R, T85A, A112V, S118Y 896 937 978
V101M, N106I, S118Y 897 938 979
Y33H, Q79R, N106I, A112V, S118T 898 939 980
Q79R, A112V 899 940 981
Y33H.A46T, Q79R, N106I, S118F 900 941 982
A112V, G121S 901 942 983
Y33H, Q79R, N106I, S118Y 902 943 984
Y33H, N106I, A112V 903 944 985
Y33H, A46T, V101M, A112V, S118T 904 945 986
L32P, L99M, N106I, S118F 905 946 987
L32P, T108A, S118F 906 947 988
R12W, Q79R, A112V 907 948 989
Y33H, N106Y, E110G, A112V 908 949 990
Y33H, N106I, S118Y 909 950 991
Q79R, S118F 910 951 992
Y33H, Q79R, G98D, V101M, A112V 911 952 993
N47K, T81S, V101 Μ, A112V, S118F 912 953 994
G82S, S118Y 913 954 995
Y33H, A112V, S118Y 914 955 996
Y33H, N47K, Q79R, N106Y,A112V 915 956 997
Y33H, S118T 916 957 998
R12W, Y33H, Q79R, V101M.A112V 917 958 999
Y33H, Q83K, A112V, S118T 1430 1454 1478
V29M, Y33H, N106I, S118F 1431 1455 1479
Y33H, A46T, A112V 1432 1456 1480
Y33H, Q79R, S118F 1433 1457 1481
Y33H, N47K, F74L, S118F 1434 1458 1482
R12W, V101M, N106I, S118Y 1435 1459 1483
A46T, V101A, N106I, S118Y 1436 1460 1484
N106Y, A112V, S118T 1437 1461 1485
S76P, T81I, V101M, N106Y, A112V, S118F 1438 1462 1486
P9R, L21V, P22L, I34M, S69F, F74L, A87V, A112V, L125A 1439 1463 1487
Y33H, V101M, A112V 1440 1464 1488
V29A, L32P, S118F 1441 1465 1489
Y33H, V101M, N106I, A112V 1442 1466 1490
R12W, Y33H, N47K, Q79R, S118Y 1443 1467 1491
Y33H, A46T, A112V, S118T 1444 1468 1492
Y33H, A112V, F114L, S118T 1445 1469 1493
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3349/3680
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TABELA 3: Polipeptídeos CD112 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv
SEQ ID NO
Y33H, T38A, A46T, V101M, A112V 1446 1470 1494
P28S, Y33H, S69P, N106I, A112V, S118Y 1447 1471 1495
Y33H, P42L, N47K, V101M, A112V 1448 1472 1496
Y33H, N47K, F74S, Q83K, N106I, F111L, A112V, S118T 1449 1473 1497
Y33H, A112V, S118T, V119A 1450 1474 1498
Y33H, N106I, A112V, S118F 1451 1475 1499
Y33H, K66M, S118F, W124L 1452 1476 1500
N106I, A112V 1453 1477 1501
TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
Tipo selvagem 268 378 421
P18S, P64S, F91S 379 400 422
P18S, F91S,L104P 380 401 423
L44P 381 402 424
A56V 382 403 425
P18L, L79V, F91S 383 404 426
P18S, F91S 384 405 427
P18T, F91S 385 406 428
P18T, S42P, F91S 386 407 429
G7E, P18T, Y30C, F91S 387 408 430
P18T, F91S, G111D 388 409 431
P18S, F91P 389 410 432
P18T, F91S, F108L 390 411 433
P18T, T45A, F91S 391 412 434
P18T, F91S, R94H 392 413 435
P18S, Y30C, F91S 393 414 436
A81V, L83P 394 415 437
L88P 395 416 438
R94H 396 417 439
A13E, P18S, A56V, F91S 397 418 440
P18T, F91S, V115A 398 419 441
P18T, Q60K 399 420 442
S52M 443 540 637
T45Q, S52L, L104E, G111R 444 541 638
S42G 445 542 639
Q62F 446 543 640
S52Q 447 544 641
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3350/3680
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TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQ ID NO
S42A, L104Q, G111R 448 545 642
S42A, S52Q, L104Q, G111R 449 546 643
S52W, L104E 450 547 644
S42C 451 548 645
S52W 452 549 646
S52M, L104Q 453 550 647
S42L, S52L, Q62F, L104Q 454 551 648
S42W 455 552 649
S42Q 456 553 650
S52L 457 554 651
S52R 458 555 652
L104E 459 556 653
G111R 460 557 654
S52E 461 558 655
Q62Y 462 559 656
T45Q, S52M, L104E 463 560 657
S42N, L104Q, G111R 464 561 658
S52M, V57L 465 562 659
S42N, S52Q, Q62F 466 563 660
S42A, S52L, L104E, G111R 467 564 661
S42W, S52Q, V57L, Q62Y 468 565 662
L104Q 469 566 663
S42L, S52Q, L104E 470 567 664
S42C, S52L 471 568 665
S42W, S52R, Q62Y, L104Q 472 569 666
T45Q, S52R, L104E 473 570 667
S52R, Q62F, L104Q, G111R 474 571 668
T45Q, S52L, V57L, L104E 475 572 669
S52M, Q62Y 476 573 670
Q62F, L104E, G111R 477 574 671
T45Q, S52Q 478 575 672
S52L, L104E 479 576 673
S42V, S52E 480 577 674
T45Q, S52R, G111R 481 578 675
S42G, S52Q, L104E, G111R 482 579 676
S42N, S52E, V57L, L104E 483 580 677
S42C, S52M, Q62F 484 581 678
S42L 485 582 679
S42A 486 583 680
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3351/3680
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TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
S42G, S52L, Q62F, L104Q 487 584 681
S42N 488 585 682
P18T, S65A, S67V, F91S 489 586 683
P18F, T39A, T45Q, T61R, S65N, S67L, E73G, R78G 490 587 684
P18T, T45Q, T61R, S65N, S67L 491 588 685
P18F, S65A, S67V, F91S 492 589 686
P18F, T45Q, T61R, S65N, S67L, F91S, L104P 493 590 687
P18S, L79P, L104M 494 591 688
P18S, L104M 495 592 689
L79P, L104M 496 593 690
P18T, T45Q, L79P 497 594 691
P18T, T45Q, T61R, S65H, S67H 498 595 692
P18T, A81E 499 596 693
P18S, D23Y, E37P, S52G, Q62M, G80S,A81P, G99Y, S112N 500 597 694
A13R, D23Y, E37P, S42P, Q62Y,A81E 501 598 695
A13R, D23Y, E37P, G99Y, S112N 502 599 696
A13R, D23Y, E37P, Q62M.A77V, G80S,A81P, G99Y 503 600 697
P18L, E37S, Q62M, G80S,A81P, G99Y, S112N 504 601 698
P18S,L104T 505 602 699
P18S, Q62H, L79Q, F91S 506 603 700
T45Q, S52K, Q62F, L104Q, G111R 507 604 701
T45Q, S52Q, Q62Y, L104Q, G111R 508 605 702
T45Q, S52Q, Q62Y, L104E, G111R 509 606 703
V57A, T61M, S65W, S67A, E96D, L104T 510 607 704
P18L, V57T, T61S, S65Y, S67A, L104T 511 608 705
P18T, T45Q 512 609 706
P18L, V57A, T61M, S65W, S67A, L104T 513 610 707
T61M, S65W, S67A, L104T 514 611 708
P18S, V41A, S42G, T45G, L104N 515 612 709
P18H, S42G, T45I, S52T, G53R, S54H, V57L, H59E, T61S, S65D, E68G, L104N 516 613 710
P18S, S42G, T45V, F58L, S67W, L104N 517 614 711
P18S, T45I, L104N 518 615 712
P18S, S42G, T45G, L104N, V106A 519 616 713
P18H, H40R, S42G, T45I, S52T, G53R, S54H, V57L, H59E, T61S, S65D, E68G, L104Y, V106L, F108H 520 617 714
E37V, S42G, T45G, L104N 521 618 715
P18S, T45Q, L79P, L104T 522 619 716
P18L, Q62R 523 620 717
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3352/3680
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TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
A13R, D23Y, E37P, S42L, S52G, Q62Y,A81E 524 621 718
P18L, H49R, L104T, D116N 525 622 719
A13R, D23Y, E37P, Q62M, G80S,A81P, L104T 526 623 720
S65T, L104T 527 624 721
A13R, D23Y, E37P, S52G, V57A, Q62M, K70E, L104T 528 625 722
P18L, A47V, Q62Y, E73D, L104T 529 626 723
H40T, V41M, A47V, S52Q, Q62L, S65T, E73R, D97G, E98S, L104T, D116N 530 627 724
P18L, S42P, T45Q, T61G, S65H, S67E, L104T, D116N 531 628 725
P18S, H40T, V41M, A47V, S52Q, Q62L, S65T, E73R, L104M, V106A 532 629 726
H40T, V41M, A47V, S52Q, Q62L, S65T, E68G, E73R, D97G, E98S,L104T 533 630 727
T45Q, S52E, L104E 534 631 728
T45Q, S52E, Q62F, L104E 535 632 729
P18F, T26M, L44V, Q62K, L79P, F91S, L104M, G111D 536 633 730
P18S, T45S, T61K, S65W, S67A, F91S, G111R 537 634 731
P18S, L79P, L104M, T107M 538 635 732
P18S, S65W, S67A, M90V, V95A, L104Q, G111R 539 636 733
P18S, A47G, L79P, F91S, L104M, T107A, R113W 1548 1502 1525
P18T, D23G, S24A, N35D, H49L, L79P, F91S, L104M, G111R 1549 1503 1526
V9L, P18S, Q60R, V75L, L79P, R89K, F91S, L104E, G111R 1550 1504 1527
P18S, H49R, E73D, L79P, N85D, F91S, V95A, L104M, G111R 1551 1505 1528
V11A, P18S, L79P, F91S, L104M, G111R 1552 1506 1529
V11A, P18S, S54R, Q60P, Q62K, L79P, N85D, F91S, T107M 1553 1507 1530
P18T, S52P, S65A, S67V, L79P, F91S, L104M, G111R 1554 1508 1531
P18T, M36T, L79P, F91S, G111R 1555 1509 1532
D8G, P18S, M36I, V38A, H49Q, A76E, F91S, L104M, T107A, R113W 1556 1510 1533
P18S, S52P, S65A, S67V, L79P, F91S, L104M, T107S, R113W 1557 1511 1534
T15I, P18T, L79P, F91S, L104M, G111R 1558 1512 1535
P18F, T26M, L44V, Q62K, L79P, E82D, F91S, L104M, G111D 1559 1513 1536
P18T, E37G, G53R, Q62K, L79P, F91S, E98D, L104M, T107M 1560 1514 1537
P18L, K70E, L79P, F91S, V95A, G111R 1561 1515 1538
V9I, Q12K, P18F, S65A, S67V, L79P, L104T, G111R, S112I 1562 1516 1539
P18F, S65A, S67V, F91S, L104M, G111R 1563 1517 1540
V9I, V10I, P18S, F20S, T45A, L79P, F91S, L104M, F108Y, G111R, S112V 1564 1518 1541
V9L, P18L, L79P, M90I, F91S, T102S, L104M, G111R 1565 1519 1542
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3353/3680
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TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
P18C, T26M, L44V, M55I, Q62K, L79P, F91S, L104M, T107M 1566 1520 1543
V9I, P18T, D23G, L79P, F91S, G111R 1567 1521 1544
P18F, L79P, M90L, F91S, V95A, L104M, G111R 1568 1522 1545
P18T, M36T, S65A, S67E, L79Q, A81T, F91S, G111R 1569 1523 1546
V9L, P18T, Q62R, L79P, F91S, L104M, G111R 1570 1524 1547
P18S, S65W, S67A, L104Q, G111R 1571 1572 1573
P18T, G19D, M36T, S54N, L79P, L83Q, F91S, T107M, F108Y 1574 1620 1666
V9L, P18L, M55V, S69L, L79P, A81E, F91S, T107M 1575 1621 1667
P18F, H40Q, T61K, Q62K, L79P, F91S, L104M, T107V 1576 1622 1668
P18S, Q32R, Q62K, R78G, L79P, F91S, T107A, R113W 1577 1623 1669
Q12H, P18T, L21S, G22S, V57A, Q62R, L79P, F91S, T107M 1578 1624 1670
V9I, P18S, S24P, H49Q, F58Y, Q60R, Q62K, L79P, F91S, T107M 1579 1625 1671
P18T, W46C, H49R, S65A, S67V, A76T, L79P, S87T, L104M 1580 1626 1672
P18S, S42T, E51G, L79P, F91S, G92W, T107M 1581 1627 1673
V10F, T15S, P18L, R48Q, L79P, F91S, T107M, V115M 1582 1628 1674
P18S, L21M, Y30F, N35D, R84W, F91S, T107M, D116G 1583 1629 1675
P18F, E51V, S54G, Q60R, L79Q, E82G, S87T, M90I, F91S, G92R, T107M 1584 1630 1676
Q16H, P18F, F91S, T107M 1585 1631 1677
P18T, D23G, Q60R, S67L, L79P, F91S, T107M, V115A 1586 1632 1678
D8G, V9I, V11A, P18T, T26M, S52P, L79P, F91S, G92A, T107L, V115A 1587 1633 1679
V9I, P18F, A47E, G50S, E68G, L79P, F91S.T107M 1588 1634 1680
P18S, M55I, Q62K, S69P, L79P, F91S, T107M 1589 1635 1681
P18T, T39S, S52P, S54R, L79P, F91S, T107M 1590 1636 1682
P18S, D23N, L79P, F91S, T107M, S114N 1591 1637 1683
P18S, P34S, E51V, L79P, F91S, G111R 1592 1638 1684
P18S, H59N, V75A, L79P, A81T, F91S, L104M, T107M 1593 1639 1685
P18S, W46R, E68D, L79P, F91S, T107M, R113G 1594 1640 1686
V9L, P18F, T45A, S65A, S67V, R78K, L79V, F91S, T107M, S114T 1595 1641 1687
P18T, M55L, T61R, L79P, F91S, V106I, T107M 1596 1642 1688
T15I, P18S, V33M, N35F, T39S, M55L, R78S, L79P, F91S, T107M 1597 1643 1689
P18S, Q62K, K70E, L79P, F91S, G92E, R113W 1598 1644 1690
P18F, F20I, T26M, A47V, E51K, L79P, F91S 1599 1645 1691
P18T, D23A, Q60H, L79P, M90V, F91S, T107M 1600 1646 1692
P18S, D23G, C29R, N35D, E37G, M55I, Q62K, S65A, S67G, 1601 1647 1693
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TABELA 4: Polipeptídeos CD115 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
R78G, L79P, F91S, L104M, T107M, Q110R
A13E, P18S, M36R, Q62K, S67T, L79P, N85D, F91S, T107M 1602 1648 1694
V9I, P18T, H49R, L79P, N85D, F91S, L104T, T107M 1603 1649 1695
V9A, P18F, T61S, Q62L, L79P, F91S, G111R 1604 1650 1696
D8E, P18T, T61A, L79P, F91S, T107M 1605 1651 1697
P18S, V41A, H49R, S54C, L79S, N85Y, L88P, F91S, L104M, T107M 1606 1652 1698
V11E, P18H, F20Y, V25E, N35S, H49R, L79P, F91S, T107M, G111R 1607 1653 1699
V11A, P18F, D23A, L79P, G80D, V95A, T107M 1608 1654 1700
P18S, K70R, L79P, F91S, G111R 1609 1655 1701
V9L, V11M, P18S, N35S, S54G, Q62K, L79P, L104M, T107M, V115M 1610 1656 1702
V9L, P18Y, V25A, V38G, M55V, A77T, L79P, M90I, F91S, L104M 1611 1657 1703
V10G, P18T, L72Q, L79P, F91S, T107M 1612 1658 1704
P18S, H59R.A76G, R78S, L79P 1613 1659 1705
V9A, P18S, M36T, S65G, L79P, F91S, L104T, G111R, S112I 1614 1660 1706
P18T, S52A, V57A, Q60R, Q62K, S65C, L79P, F91T, N100Y, T107M 1615 1661 1707
V11A, P18F, N35D, A47E, Q62K, L79P, F91S, G99D, T107M, S114N 1616 1662 1708
V11A, P18T, N35S, L79P, S87T, F91S 1617 1663 1709
V9D, V11M, Q12L, P18S, E37V, M55I, Q60R, K70Q, L79P, F91S, L104M, T107M 1618 1664 1710
T15S, P18S, Y30H, Q32L, Q62R, L79P, F91S, T107M 1619 1665 1711
TABELA 5: Polipeptídeos PD-L1 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
Tipo selvagem 251 1721 1000 1196
K28N/M41V/N45T/H51N/K57E 1001 1931 1066 1131
I20L/I36T/N45D/I47T 1002 1932 1067 1132
I20L/M41K/K44E 1003 1933 1068 1133
P6S/N45T/N78I/I83T 1004 1934 1069 1134
N78I 1005 1935 1070 1135
M41K/N78I 1006 1936 1071 1136
N45T/N78I 1007 1937 1072 1137
I20L/N45T 1008 1938 1073 1138
N45T 1009 1939 1074 1139
M41K 1010 1940 1075 1140
I20L/I36T/N45D 1011 1941 1076 1141
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3355/3680
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TABELA 5: Polipeptídeos PD-L1 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
N17D/N45T/V50A/D72G 1012 1942 1077 1142
I20L/F49S 1013 1943 1078 1143
N45T/V50A 1014 1944 1079 1144
I20L/N45T/N78I 1015 1945 1080 1145
I20L/N45T/V50A 1016 1946 1081 1146
M41V/N45T 1017 1947 1082 1147
M41K/N45T 1018 1948 1083 1148
A33D/S75P/D85E 1019 1949 1084 1149
M18I/M41K/D43G/H51R/N78I 1020 1950 1085 1150
V11E/I20L/I36T/N45D/H60R/S75P 1021 1951 1086 1151
A33D/V50A 1022 1952 1087 1152
S16G/A33D/K71E/S75P 1023 1953 1088 1153
E27G/N45T/M97I 1024 1954 1089 1154
E27G/N45T/K57R 1025 1955 1090 1155
A33D/E53V 1026 1956 1091 1156
D43G/N45D/V58A 1027 1957 1092 1157
E40G/D43V/N45T/V50A 1028 1958 1093 1158
Y14S/K28E/N45T 1029 1959 1094 1159
A33D/N78S 1030 1960 1095 1160
A33D/N78I 1031 1961 1096 1161
A33D/N45T 1032 1962 1097 1162
A33D/N45T/N78I 1033 1963 1098 1163
E27G/N45T/V50A 1034 1964 1099 1164
N45T/V50A/N78S 1035 1965 1100 1165
I20L/N45T/V110M 1036 1966 1101 1166
I20L/I36T/N45T/V50A 1037 1967 1102 1167
N45T/L74P/S75P 1038 1968 1103 1168
N45T/S75P 1039 1969 1104 1169
S75P/K106R 1040 1970 1105 1170
S75P 1041 1971 1106 1171
A33D/S75P 1042 1972 1107 1172
A33D/S75P/D104G 1043 1973 1108 1173
A33D/S75P 1044 1974 1109 1174
I20L/E27G/N45T/V50A 1045 1975 1110 1175
I20L/E27G/D43G/N45D/V58A/N78I 1046 1976 1111 1176
I20L/D43G/N45D/V58A/N78I 1047 1977 1112 1177
I20L/A33D/D43G/N45D/V58A/N78I 1048 1978 1113 1178
I20L/D43G/N45D/N78I 1049 1979 1114 1179
E27G/N45T/V50A/N78I 1050 1980 1115 1180
N45T/V50A/N78I 1051 1981 1116 1181
V11A/I20L/E27G/D43G/N45D/H51Y/S99G 1052 1982 1117 1182
I20L/E27G/D43G/N45T/V50A 1053 1983 1118 1183
I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R 1054 1984 1119 1184
I20L/I36T/N45D 1055 1985 1120 1185
I20L/K28E/D43G/N45D/E53G/V58A/N78I 1056 1986 1121 1186
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TABELA 5: Polipeptídeos PD-L1 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
A33D/D43G/N45D/V58A/S75P 1057 1987 1122 1187
K23R/D43G/N45D 1058 1988 1123 1188
I20L/D43G/N45D/V58A/N78I/D90G/G101D 1059 1989 1124 1189
D43G/N45D/L56Q/V58A/G101 G-ins 1060 1990 1125 1190
I20L/K23E/D43G/N45D/V58A/N78I 1061 1991 1126 1191
I20L/K23E/D43G/N45D/V50A/N78I 1062 1992 1127 1192
T19I/E27G/N45I/V50A/N78I/M97K 1063 1993 1128 1193
I20L/M41K/D43G/N45D 1064 1994 1129 1194
K23R/N45T/N78I 1065 1995 1130 1195
I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R/G101 G-ins (G101GG) 1718 1996 1719 1720
K57R/S99G 1722 1812 1901 1916
K57R/S99G/F189L 1723 1813
M18V/M97L/F193S/R195G/E200K/H202Q 1724 1814
136S/M41K/M97L/K144Q/R195G/E200K/H202Q/L206F 1725 1815
C22R/Q65L/L124S/K144Q/R195G/E200N/H202Q/T221L 1726
M18V/I98L/L124S/P198T/L206F 1727 1816
S99G/N117S/1148V/K171R/R180S 1728 1817
I36T/M97L/A103V/Q155H 1729 1818
K28I/S99G 1730 1819 1902 1917
R195S 1731 1820
A79T/S99G/T185A/R195G/E200K/H202Q/L206F 1732 1821
K57R/S99G/L124S/K144Q 1733 1822
K57R/S99G/R195G 1734 1823
D55V/M97L/S99G 1735 1824 1903 1918
E27G/I36T/D55N/M97L/K111E 1736 1825 1904 1919
E54G/M97L/S99G 1737 1826 1905 1920
G15A/I36T/M97L/K111E/H202Q 1738 1827
G15A/I36T/V129D 1739 1828
G15A/I36T/V129D/R195G 1740 1829
G15A/V129D 1741 1830
I36S/M97L 1742 1831 1906 1921
I36T/D55N/M97L/K111E/A204T 1743 1832
136T/D55N/M97L/K111E/V129A/F173L 1744 1833
I36T/D55S/M97L/K111E/I148V/R180S 1745 1834
I36T/G52R/M97L/V112A/K144E/V175A/P198T 1746 1835
I36T/I46V/D55G/M97L/K106E/K144E/T185A/R195G 1747 1836
I36T/I83T/M97L/K144E/P198T 1748 1837
I36T/M97L/K111E 1749 1838 1907 1922
I36T/M97L/K144E/P198T 1750 1839
136T/M97L/Q155H/F193S/N201Y 1751 1840
I36T/M97L/V129D 1752 1841
L35P/I36S/M97L/K111E 1753 1842 1908 1923
M18I/136T/E53G/M97L/K144E/E199G/V207A 1754 1843
M18T/136T/D55N/M97L/K111E 1755 1844 1909 1924
M18V/M97L/T176N/R195G 1756 1845
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3357/3680
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TABELA 5: Polipeptídeos PD-L1 variantes exemplífícadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
M97L/S99G 1757 1846 1910 1925
N17D/M97L/S99G 1758 1847 1911 1926
S99G/T185A/R195G/P198T 1759 1848
V129D/H202Q 1760 1849
V129D/P198T 1761 1850
V129D/T150A 1762 1851
V93E/V129D 1763 1852
Y10F/M18V/S99G/Q138R/T203A 1764 1853
N45D 1765 1854 1912 1927
K160M/R195G 1766 1855
N45D/K144E 1767 1856
N45D/P198S 1768 1857
N45D/P198T 1769 1858
N45D/R195G 1770 1859
N45D/R195S 1771 1860
N45D/S131F 1772 1861
N45D/V58D 1773 1862 1913 1928
V129D/R195S 1774 1863
I98T/F173Y/L196S 1775 1864
N45D/E134G/L213P 1776 1865
N45D/F173I/S177C 1777 1866
N45D/I148V/R195G 1778 1867
N45D/K111T/R195G 1779 1868
N45D/N113Y/R195S 1780 1869
N45D/N165Y/E170G 1781 1870
N45D/Q89R/I98V 1782 1871 1914 1929
N45D/S131F/P198S 1783 1872
N45D/S75P/P198S 1784 1873
N45D/V50A/R195T 1785 1874
E27D/N45D/T183A/1188V 1786 1875
F173Y/T183I/L196S/T203A 1787 1876
K23N/N45D/S75P/N120S 1788 1877
N45D/G102D/R194W/R195G 1789 1878
N45D/G52V/Q121L/P198S 1790 1879
N45D/1148V/R195G/N201D 1791 1880
N45D/K111T/T183A/I188V 1792 1881
N45D/Q89R/F189S/P198S 1793 1882
N45D/S99G/C137R/V207A 1794 1883
N45D/T163I/K167R/R195G 1795 1884
N45D/T183A/T192S/R194G 1796 1885
N45D/V50A/I119T/K144E 1797 1886
T19A/N45D/K144E/R195G 1798 1887
V11E/N45D/T130A/P198T 1799 1888
V26A/N45D/T163I/T185A 1800 1889
K23N/N45D/L124S/K167T/R195G 1801 1890
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3358/3680
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TABELA 5: Polipeptídeos PD-L1 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
K23N/N45D/Q73R/T163I 1802 1891
K28E/N45D/W149R/S158G/P198T 1803 1892
K28R/N45D/K57E/I98V/R195S 1804 1893
K28R/N45D/V129D/T163N/R195T 1805 1894
M41K/D43G/N45D/R64S/R195G 1806 1895
M41K/D43G/N45D/R64S/S99G 1807 1896 1915 1930
N45D/R68L/F173L/D197G/P198S 1808 1897
N45D/V50A/1148V/R195G/N201D 1809 1898
M41K/D43G/K44E/N45D/R195G/N201D 1810 1899
N45D/V50A/L124S/K144E/L179P/R195G 1811 1900
TABELA 6: Polipeptídeos PD-L2 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
Tipo selvagem 252 1197 1257
H15Q 1198 1275 1351
N24D 1199 1276 1352
E44D 1200 1277 1353
V89D 1201 1278 1354
Q82R/V89D 1202 1279 1355
E59G/Q82R 1203 1280 1356
S39I/V89D 1204 1281 1357
S67L/V89D 1205 1282 1358
S67L/I85F 1206 1283 1359
S67L/I86T 1207 1284 1360
H15Q/K65R 1208 1285 1361
H15Q/Q72H/V89D 1209 1286 1362
H15Q/S67L/R76G 1210 1287 1363
H15Q/R76G/I85F 1211 1288 1364
H15Q/T47A/Q82R 1212 1289 1365
H15Q/Q82R/V89D 1213 1290 1366
H15Q/C23S/I86T 1214 1291 1367
H15Q/S39I/I86T 1215 1292 1368
H15Q/R76G/I85F 1216 1293 1369
E44D/V89D/W91R 1217 1294 1370
I13V/S67L/V89D 1218 1295 1371
H15Q/S67L/I86T 1219 1296 1372
I13V/H15Q/S67L/I86T 1220 1297 1373
I13V/H15Q/E44D/V89D 1221 1298 1374
113V/S39I/E44D/Q82R/V89D 1222 1299 1375
I13V/E44D/Q82R/V89D 1223 1300 1376
I13V/Q72H/R76G/I86T 1224 1301 1377
I13V/H15Q/R76G/I85F 1225 1302 1378
H15Q/S39I/R76G/V89D 1226 1303 1379
H15Q/S67L/R76G/I85F 1227 1304 1380
H15Q/T47A/Q72H/R76G/I86T 1228 1305 1381
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TABELA 6: Polipeptídeos PD-L2 variantes exemplífícadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO
H15Q/T47A/Q72H/R76G 1229 1306 1382
113V/H15Q/T47A/Q72H/R76G 1230 1307 1383
H15Q/E44D/R76G/I85F 1231 1308 1384
H15Q/S39I/S67L/V89D 1232 1309 1385
H15Q/N32D/S67L/V89D 1233 1310 1386
N32D/S67L/V89D 1234 1311 1387
H15Q/S67L/Q72H/R76G/V89D 1235 1312 1388
H15Q/Q72H/Q74R/R76G/I86T 1236 1313 1389
G28V/Q72H/R76G/I86T 1237 1314 1390
113V/H15Q/S39I/E44D/S67L 1238 1315 1391
E44D/S67L/Q72H/Q82R/V89D 1239 1316 1392
H15Q/V89D 1240 1317 1393
H15Q/T47A 1241 1318 1394
I13V/H15Q/Q82R 1242 1319 1395
I13V/H15Q/V89D 1243 1320 1396
I13V/S67L/Q82R/V89D 1244 1321 1397
I13V/H15Q/Q82R/V89D 1245 1322 1398
H15Q/V31M/S67L/Q82R/V89D 1246 1323 1399
I13V/H15Q/T47A/Q82R 1247 1324 1400
113V/H15Q/V31A/N45S/Q82R/V89D 1248 1325 1401
H15Q/T47A/H69L/Q82R/V89D 1250 1327 1403
113V/H15Q/T47A/H69L/R76G/V89D 1251 1328 1404
112V/I13V/H15Q/T47A/Q82R/V89D 1252 1329 1405
113V/H15Q/R76G/D77N/Q82R/V89D 1253 1330 1406
113V/H15Q/T47A/R76G/V89D 1254 1331 1407
113V/H15Q/T47A/Q82R/V89D 1255 1332 1408
113V/H15Q/N24D/Q82R/V89D 1256 1333 1409
113V/H15Q/136V/T47A/S67L/V89D 1258 1334 1410
H15Q/T47A/K65R/S67L/Q82R/V89D 1259 1335 1411
H15Q/L33P/T47A/S67L/P71S/V89D 1260 1336 1412
113V/H15Q/Q72H/R76G/I86T 1261 1337 1413
H15Q/T47A/S67L/Q82R/V89D 1262 1338 1414
F2L/H15Q/D46E/T47A/Q72H/R76G/Q82R/V89D 1263 1339 1415
113V/H15Q/L33F/T47A/Q82R/V89D 1264 1340 1416
113V/H15Q/T47A/E58G/S67L/Q82R/V89D 1265 1341 1417
H15Q/N24S/T47A/Q72H/R76G/V89D 1266 1342 1418
113V/H15Q/E44V/T47A/Q82R/V89D 1267 1343 1419
H15Q/N18D/T47A/Q72H/V73A/R76G/I86T/V89D 1268 1344 1420
113V/H15Q/T37A/E44D/S48C/S67L/Q82R/V89D 1269 1345 1421
H15Q/L33H/S67L/R76G/Q82R/V89D 1270 1346 1422
113V/H15Q/T47A/Q72H/R76G/I86T 1271 1347 1423
H15Q/S39I/E44D/Q72H/V75G/R76G/Q82R/V89D 1272 1348 1424
H15Q/T47A/S67L/R76G/Q82R/V89D 1273 1349 1425
113V/H15Q/T47A/S67L/Q72H/R76G/Q82R/V89 1274 1350 1426
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TABELA 7: Polipeptídeos NKp30 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO IgC SEQID NO
Tipo selvagem 275 343
L30V/A60V/S64P/S86G 334 344
L30V 335 345
A60V 336 346
S64P 337 347
S86G 338 348
TABELA 8: Polipeptídeos CD86 variantes exemplificadores
Mutação (ou mutações) ECD SEQ ID NO igv SEQID NO
Tipo selvagem 250 349
Q35H/H90L/Q102H 339 350
Q35H 340 351
H90L 341 352
Q102H 342 353
[00389] Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios de IgSF, incluindo um vlgD de CD80 e um ou mais domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo ou terceiro domínio IgSF variante) de outro membro da família de IgSF, estão covalentemente ou não covalentemente ligados. Uma pluralidade de não afinidade modificada e/ou os domínios de IgSF modificados por afinidade em uma cadeia polipeptídica de proteína imunomoduladora empilhada não necessitam de ser diretamente ligados covalentemente uns aos outros. Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios de IgSF estão ligados direta ou indiretamente, tal como através de um ligante. Em algumas modalidades, um intervalo intermediário de um ou mais resíduos de aminoácidos liga-se indiretamente de forma covalente a domínios IgSF entre si. A ligação pode ser através dos resíduos N-terminal para C-terminal. Em algumas modalidades, a ligação pode ser feita através de cadeias laterais de resíduos de aminoácidos que não estão localizados no terminal N ou no terminal C do domínio (ou domínios) da IgSF. Assim, as ligações podem ser feitas através de resíduos de aminoácidos terminais ou internos ou combinações dos mesmos.
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228/474 [00390] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos dois domínios IgSF, cada um ligado direta ou indiretamente através de um ligante. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora contém pelo menos três proteínas imunomoduladoras, cada uma ligada direta ou indiretamente através de um ligante. Várias configurações são mostradas na Figura 5A e 5B.
[00391] Em algumas modalidades, um ou mais ligantes peptídicos ligam o vlgD de CD80 e um ou mais domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo ou terceiro domínio IgSF variante). Em algumas modalidades, um ligante peptídico pode ser um único resíduo de aminoácido ou maior em comprimento. Em algumas modalidades, o ligante peptídico tem pelo menos um resíduo de aminoácido, mas não é mais do que 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante flexível. Em algumas modalidades, o ligante é (no código de aminoácido de uma letra): GGGGS (4GS) ou multímeros do ligante 4GS, tais como repetições de 2, 3, 4 ou 5 ligantes 4GS. Em algumas modalidades, o ligante peptídico é (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 330) ou (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 329). Em algumas modalidades, o ligante também pode incluir uma série de resíduos de alanina isoladamente ou em adição a outro ligante peptídico (tal como um ligante 4GS ou um seu multímero). Em algumas modalidades, o número de resíduos de alanina em cada série é: 2, 3, 4, 5 ou 6 alaninas. Em algumas modalidades, o ligante também pode incluir uma série de resíduos de alanina isoladamente ou em adição a outro ligante peptídico (tal como um ligante 4GS ou um seu multímero). Em algumas modalidades, o número de resíduos de alanina em cada série é: 2, 3, 4, 5 ou 6 alaninas. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante rígido. Por exemplo, o ligante é um ligante α-helicoidal. Em algumas modalidades, o ligante é (no código de aminoácido de uma le
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229/474 tra): EAAAK ou multimeros do ligante EAAAK, tais como repetições de 2, 3, 4 ou 5 ligantes EAAAK, tal como apresentado na SEQ ID NO: 3026 (IxEAAAK), SEQ ID NO: 3027 (3xEAAAK) ou SEQ ID NO: 3036 (õxEAAAK). Em algumas modalidades, o ligante pode ainda incluir aminoácidos introduzidos por clonagem e/ou de um local de restrição, por exemplo, o ligante pode incluir os aminoácidos GS (no código de aminoácido de uma letra) como introduzido pelo uso do local de restrição BAMHI. Em alguns exemplos, o ligante é um 2xGGGGS seguido por três alaninas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 331).
[00392] Em algumas modalidades, os domínios de IgSF modificados por afinidade e/ou modificados por não afinidade são ligados por ligantes peptídicos de tipo selvagem inseridos no terminal N e/ou terminal C de domínios IgS modificados por afinidade e/ou modificados por não afinidade. Estes ligantes são também chamados sequências anteriores (N-terminal para domínio IgSF modificado por afinidade ou modificado por não afinidade) ou sequências posteriores (C-terminal para domínio IgSF modificado por afinidade ou modificado por não afinidade), e sequências que existem no tipo selvagem proteína que se expande imediatamente fora da predição estrutural da dobra de Ig da IgSF. Em algumas modalidades, o ligante do tipo selvagem é uma sequência de aminoácidos que existe após a sequência sinal, mas antes no domínio IgSF, tal como o domínio IgV definido, na sequência de aminoácidos da proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o ligante tipo selvagem é uma sequência de aminoácidos que existe imediatamente após o domínio IgSF, tal como imediatamente após o domínio IgV definido, mas antes do domínio IgC, na sequência de aminoácidos da proteína do tipo selvagem. Estas sequências de ligação podem contribuir para o enrolamento e função adequados do domínio (ou domínios) de IgSF vizinho (ou vizinhos). Em algumas modalidades, existe um ligante peptídico líder inserido no terminal N do pri
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230/474 meiro domínio IgSF e/ou uma sequência final inserida no terminal C do primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade. Em algumas modalidades, existe um segundo promotor peptídico líder inserido no terminal N do segundo domínio IgSF e/ou uma segunda sequência final inserida no terminal C do segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade. Quando o primeiro e o segundo domínios de IgSF modificados por afinidade e/ou modificados por não afinidade são derivados da mesma proteína parental e estão ligados na mesma orientação, os ligantes peptídicos de tipo selvagem entre o primeiro e o segundo domínios IgSF modificados por afinidade e/ou modificados por não afinidade não são duplicados. Por exemplo, quando o primeiro ligante peptídico de tipo selvagem posterior e o segundo ligante peptídico de tipo selvagem anterior são iguais, a proteína imunomoduladora de Tipo II não compreende o primeiro ligante peptídico de tipo selvagem posterior ou o segundo ligante peptídico de tipo selvagem anterior.
[00393] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora do Tipo II compreende um primeiro ligante peptídico de tipo selvagem inserido no terminal N do primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade, em que o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem anterior compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na proteína de tipo selvagem a partir da qual o primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgE parental e o domínio imediatamente anterior (tal como um peptídeo sinal ou um domínio IgSF). Em algumas modalidades, o primeiro ligante peptídico do tipo selvagem anterior compreende a sequência inteira interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por
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231/474 não afinidade é derivado entre o domínio da IgSF parental e o domínio imediatamente anterior (tal como um peptídeo sinal ou um domínio IgSF).
[00394] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de Tipo II compreende ainda um primeiro ligante peptídico de tipo selvagem posterior inserido no terminal C do primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade, em que o primeiro ligante peptídico de tipo selvagem posterior compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um dos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgE parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio transmembranar). Em algumas modalidades, o primeiro ligante peptídico de tipo selvagem posterior compreende toda a sequência interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o primeiro domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio transmembranar).
[00395] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de Tipo II compreende ainda um segundo ligante peptídico do tipo selvagem anterior inserido no terminal N do segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade, em que o segundo ligante peptídico de tipo selvagem anterior compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um dos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgE parental e o domínio imedia
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232/474 tamente anterior (tal como um peptídeo sinal ou um domínio IgSF). Em algumas modalidades, o segundo ligante peptídico de tipo selvagem anterior compreende a sequência inteira interveniente na proteína do tipo selvagem a partir da qual o segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente anterior (tal como um peptídeo sinal ou um domínio IgSF).
[00396] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de Tipo II compreende ainda um segundo ligante peptídico de tipo selvagem posterior inserido no terminal C do segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade, em que o segundo ligante peptídico de tipo selvagem posterior compreende pelo menos 5 (tal como pelo menos cerca de qualquer um dos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais) aminoácidos consecutivos da sequência interveniente na proteína de tipo selvagem a partir da qual o o segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgE parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio transmembranar). Em algumas modalidades, o segundo ligante peptídico de tipo selvagem anterior compreende a sequência inteira interveniente na proteína de tipo selvagem a partir da qual o segundo domínio IgSF modificado por afinidade e/ou modificado por não afinidade é derivado entre o domínio IgSF parental e o domínio imediatamente seguinte (tal como um domínio IgSF ou um domínio transmembranar).
[00397] Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios de IgSF, incluindo um vlgD de CD80 e um ou mais domínios de IgSF adicionais (por exemplo, segundo e/ou terceiro domínio IgSF variante) de outro membro da família de IgSF, estão ligados a um Fc para formar uma fusão de Fc, que, após expressão em uma célula, pode, em alguns aspectos, produzir uma proteína imunomoduladora de pilha múl
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233/474 tiplos domínioss dimérica. Assim, também são proporcionadas proteínas imunomoduladoras múltiplos domínioss diméricas.
[00398] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante e um ou mais domínios IgSF estão independentemente ligados, direta ou indiretamente, ao terminal N ou C de uma região Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante e pelo menos um dos um ou mais domínios IgSF adicionais estão ligados, direta ou indiretamente, e um dos CD80 variantes e um ou mais domínios IgSF adicionais estão também ligados, direta ou indiretamente, para o terminal N ou C de uma região Fc. Em algumas modalidades, o terminal N ou C da região Fc está ligado ao polipeptídeo CD80 variante ou um ou mais domínios IgSF adicionais e o outro terminal N ou C da região Fc está ligado ao outro do CD80 variante ou outro do um ou mais domínios IgSF adicionais. Em algumas modalidades, a ligação ao Fc é através de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a ligação entre o CD80 variante e o ou mais domínios de IgSF adicionais é através de um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, o vlgD de CD80, o um ou mais domínios de IgSF adicionais e o domínio Fc podem ser ligados em conjunto em qualquer uma das numerosas configurações como representado na Figura 5 A e 5B. Configurações exemplificativas são descritas nos Exemplos.
[00399] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora empilhada é um dímero formado por dois polipeptídeos de fusão Fc imunomoduladores. Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das proteínas imunomoduladoras empilhadas. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de pilha de múltiplos domínios dimérica pode ser produzida em células por expressão, ou em alguns casos coexpressão, de polipeptídeos de
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234/474 fusão de Fc imunomoduladores em pilha, tal como descrito acima de acordo com a geração de proteínas de fusão Fc diméricas.
[00400] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de pilha de múltiplos domínios dimérica é divalente para cada região Fc, monovalente para cada subunidade, ou divalente para uma subunidade e tetravalente para a outra.
[00401] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de pilha de múltiplos domínios dimérica é uma proteína Fc de pilha de múltiplos domínios homodimérica. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora de pilha de múltiplos domínios dimérica compreende um primeiro polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador de pilha e um segundo polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador de pilha em que o primeiro e segundo polipeptídeo são iguais. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios contém um primeiro polipeptídeo de fusão de Fc contendo um domínio CD80 variante e um segundo domínio IgSF e um segundo polipeptídeo de fusão Fc contendo o CD80 variante e o segundo domínio IgSF. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios contém um primeiro polipeptídeo de fusão contendo Fc contendo um CD80 variante, um segundo domínio IgSF e um terceiro domínio IgSF e um segundo polipeptídeo de fusão Fc contendo o CD80 variante, o segundo domínio IgSF e o terceiro domínio IgSF. Em algumas modalidades, a porção Fc do primeiro e/ou segundo polipeptídeo de fusão pode ser qualquer Fc como descrito acima. Em algumas modalidades, a porção Fc ou região do primeiro e segundo polipeptídeos de fusão é a mesma.
[00402] Em algumas modalidades, a molécula de pilha de vários domínios é heterodimérica, compreendendo dois polipeptídeos de fusão Fc diferentes, por exemplo, um primeiro e um segundo polipeptídeos de fusão Fc, em que pelo menos um é um polipeptídeo de fusão Fc contendo pelo menos um polipeptídeo CD80 variante e/ou pelo
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235/474 menos um é um polipeptídeo de fusão de Fc contendo um segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante). Em algumas modalidades, o primeiro ou o segundo polipeptídeo de fusão de Fc contém ainda um terceiro domínio IgSF (por exemplo, terceiro domínio IgSF variante). Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios contém um primeiro polipeptídeo de fusão Fc contendo um CD80 variante e um segundo polipeptídeo de fusão Fc contendo um segundo domínio IgSF, em que, em alguns casos, o primeiro ou segundo polipeptídeo de fusão Fc contém adicionalmente um terceiro domínio IgSF. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios contém um primeiro polipeptídeo de fusão de Fc contendo um CD80 variante, um segundo domínio IgSF e, em alguns casos, um terceiro domínio IgSF e um segundo polipeptídeo de fusão de Fc que não estão ligados a qualquer polipeptídeo CD80 variante ou a um domínio IgSF adicional. Em algumas modalidades, a porção Fc ou região do primeiro e segundo polipeptídeo de fusão é a mesma. Em algumas modalidades, a porção Fc ou região do primeiro e segundo polipeptídeos de fusão é diferente.
[00403] Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios contém um primeiro polipeptídeo de fusão Fc contendo 1, 2, 3, 4 ou mais polipeptídeos CD80 variantes e 1, 2, 3, 4 ou mais domínios de IgSF adicionais, em que o número total de domínios de IgSF no primeiro polipeptídeo de fusão Fc de pilha é superior a 2, 3, 4, 5, 6 ou mais.Num exemplo de uma tal modalidade, o segundo polipeptídeo de fusão Fc contém 1, 2, 3, 4 ou mais polipeptídeos CD80 variantes e 1, 2, 3, 4 ou mais domínios de IgSF adicionais, em que o número total de domínios de IgSF no polipeptídeo de fusão Fc de primeira pilha é superior a 2, 3, 4, 5, 6 ou mais. Em outro exemplo de uma tal modalidade, o segundo polipeptídeo de fusão com Fc não está ligado a um polipeptídeo CD80 variante ou a um domínio IgSF adicional.
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236/474 [00404] Em algumas modalidades, a molécula de pilha heterodimérica contém um polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador de primeira pilha e um segundo polipeptídeo de fusão de Fc imunomodulador de pilha em que o primeiro e segundo polipeptídeos são diferentes. Em algumas modalidades, uma molécula de pilha heterodimérica contém uma primeira fusão de polipeptídeo Fc contendo uma região Fc e um primeiro polipeptídeo CD80 variante e/ou segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) e uma segunda fusão polipeptídica Fc contendo uma região Fc e outro do primeiro polipeptídeo CD80 variante ou do segundo domínio IgSF. Em algumas modalidades, uma molécula de pilha heterodimérica contém uma fusão de primeiro polipeptídeo Fc contendo uma região Fc e um primeiro polipeptídeo CD80 variante e/ou segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) e uma segunda fusão polipeptídica Fc contendo uma região Fc e ambas o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo domínio IgSF variante) mas em uma orientação ou configuração diferente da primeira região Fc. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo de fusão de Fc também contém um terceiro domínio IgSF (por exemplo, terceiro domínio IgSF variante).
[00405] Em algumas modalidades, o domínio Fc de um ou ambos do primeiro e segundo polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador empilhado compreende uma modificação (por exemplo, substituição) de tal forma que a interface da molécula Fc é modificada para facilitar e/ou promover a heterodimerização. Em algumas modalidades, as modificações incluem a introdução de uma protuberância (botão) em um primeiro polipeptídeo Fc e uma cavidade (orifício) em um segundo polipeptídeo Fc de modo a que a protuberância seja posicionável na cavidade para promover a complexação do primeiro e segundo polipeptídeos contendo Fc. Os aminoácidos direccionados para substitui
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237/474 ção e/ou modificação para criar protuberâncias ou cavidades em um polipeptídeo são tipicamente aminoácidos de interface que interagem ou contatam com um ou mais aminoácidos na interface de um segundo polipeptídeo.
[00406] Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos é adicionada precedendo a sequência Fc para construções nas quais a sequência Fc é a porção N-terminal da sequência. Em alguns casos, a sequência de aminoácidos HMSSVSAQ (SEQ ID NO: 377) é adicionada imediatamente antes da sequência Fc para construções nas quais a sequência Fc é a porção N-terminal da sequência. Em algumas modalidades, uma molécula de pilha heterodimérica contém uma primeira fusão de polipeptídeo Fc contendo uma região Fc (botão; por exemplo, a sequência Fc apresentada na SEQ ID NO: 374) e um primeiro polipeptídeo variante e/ou segundo domínio IgSF (por exemplo, segundo variante de domínio IgSF) e uma segunda fusão de polipeptídeo Fc contendo uma região Fc (orifício; por exemplo, a sequência Fc apresentada na SEQ ID NO: 375) e uma sequência de sequência HMSSVSAQ (SEQ ID NO: 377) é adicionada imediatamente antes das duas regiões Fc da primeira e segunda fusão do polipeptídeo Fc.
[00407] Em algumas modalidades, um primeiro polipeptídeo que é modificado para conter aminoácidos de protuberância (orifício) inclui a substituição de um aminoácido nativo ou original por um aminoácido que tem pelo menos uma cadeia lateral que se projecta a partir da interface do primeiro polipeptídeo e é, portanto, posicionável em uma cavidade compensatória (orifício) em uma interface adjacente de um segundo polipeptídeo. Na maioria das vezes, o aminoácido de substituição é aquele que tem um volume de cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original. Um versado na técnica sabe como determinar e/ou avaliar as propriedades dos resíduos de aminoácidos para identificar aqueles que são aminoácidos de substituição ideais
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238/474 para criar uma protuberância. Em algumas modalidades, os resíduos de substituição para a formação de uma protuberância são resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e incluem, por exemplo, arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W). Em alguns exemplos, o resuo original identificado para substituição um resuo de aminoácidos que tem uma pequena cadeia lateral, tal como, por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina. [00408] Em algumas modalidades, um segundo polipeptídeo que é modificado para conter uma cavidade (orifício) é aquele que inclui a substituição de um aminoácido nativo ou original por um aminoácido que tem pelo menos uma cadeia lateral que está recuada a partir da interface do segundo polipeptídeo e assim é capaz de acomodar uma protuberância correspondente da interface de um primeiro polipeptídeo. Na maioria das vezes, o aminoácido de substituição é aquele que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original. Um versado na técnica sabe como determinar e/ou avaliar as propriedades dos resíduos de aminoácidos para identificar aqueles que são resíduos de substituição ideais para a formação de uma cavidade. Geralmente, os resíduos de substituição para a formação de uma cavidade são aminoácidos de ocorrência natural e incluem, por exemplo, alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). Em alguns exemplos, o aminoácido original identificado para a substituição é um aminoácido que possui uma cadeia lateral grande como, por exemplo, tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.
[00409] A interface CH3 da lgG1 humana, por exemplo, envolve dezesseis resíduos em cada domínio localizados em quatro β-cadeias anti-paralelas que enterram 1.090 D2 de cada superfície (ver, por exemplo, Deisenhofer et al. (1981) Biochemistry, 20: 2361 a 2370; Miller et al. (1990) J Mol. Biol. 216, 965-973; Ridgway et al., (1996) Prot. Engin. 9: 617-621; patente US n° 5.731.168). Modificações de um do
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239/474 mínio CH3 para criar protuberâncias ou cavidades são descritas, por exemplo, na patente n° 5.731.168; pedidos de patente internacional WO98/50431 e WO 2005/063816; e Ridgway et al. (1996) Prot. Engin. 9: 617-621. Em alguns exemplos, modificações de um domínio CH3 para criar protuberâncias ou cavidades são tipicamente direcionadas para resíduos localizados nas duas β-cadeias anti-paralelas centrais. O objetivo é minimizar o risco de as protuberâncias que são criadas poderem ser acomodadas projetando-se para o solvente circundante em vez de serem acomodadas por uma cavidade compensatória no domínio parceiro CH3.
[00410] Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica contém uma mutação T366W no domínio CH3 das mutações cadeia de botões e T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da cadeia de orifícios. Em alguns casos, também pode ser utilizada uma ponte dissulfureto intercadeia adicional entre os domínios CH3 (Merchant, AM, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo, introduzindo uma mutação Y349C no domínio CH3 do botão ou orifício de cadeia e uma mutação E356C ou uma mutação S354C para o domínio CH3 da outra cadeia. Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica cont mutações S354C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica compreende mutações E356C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica compreende mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações E356C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3. Em algumas modalidades, a molécula heterodimérica compreende mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios CH3 e mutações S354C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3.
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Exemplos de outras tecnologias de botões-em-orifícios são conhecidos na técnica, por exemplo, tal como descrito por EP 1 870 459 A1.
[00411] Em algumas modalidades, as regiões Fc da molécula heterodimérica podem conter adicionalmente uma ou mais outras mutações Fc, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a molécula de heterodímero contém uma região Fc com uma mutação que reduz a função efetora.
[00412] Em algumas modalidades, uma variante Fc contendo protuberância CH3 (botão) ou modificações na cavidade (orifício) podem ser unidas a um polipeptídeo imunomodulador empilhado em qualquer lugar, mas tipicamente através do seu terminal N ou C, ao terminal N ou C de um primeiro e/ou segundo empilhados polipeptídeo imunomodulador, tal como para formar um polipeptídeo de fusão. A ligação pode ser direta ou indireta através de um ligante. Tipicamente, uma molécula em forma de bots e furos gerada por coexpressão de um primeiro polipeptídeo imunomodulador empilhado ligado a uma variante Fc contendo modificação (ou modificações) de protuberância CH3 com um segundo polipeptídeo imunomodulador empilhado ligado a uma variante Fc contendo a modificação (ou modificações) da cavidade CH3.
[00413] É aqui fornecida uma molécula de pilha de múltiplos domínios homodimérica produzida a partir de um polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador contendo um domínio IgSF, por exemplo, domínio IgV, de um polipeptídeo CD80 variante e um segundo domínio IgSF, por exemplo, IgV, de um polipeptídeo CD155 variante. Em algumas modalidades, as moléculas de pilha de vários domínios resultantes ligam-se a CTLA-4 e a TIGIT. Em alguns aspectos, a ligação a TIGIT é ao mesmo grau ou grau semelhante ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a TIGIT do correspondente domínio IgSF de CD155 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns as
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241/474 pectos, a ligação a CTLA-4 é ao mesmo grau ou semelhante, ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a CTLA-4 do domínio IgSF correspondente de CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a ligação a TIGIT ou CTLA-4 é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a TIGIT ou CTLA-4 da forma empacotada do CD80 variante IgSF-Fc. Em algumas modalidades, a ligação a TIGIT é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a TIGIT da forma não empilhada da variante IgG CD155 Fc. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios resultante aumenta as respostas imunológicas de células T em comparação com a variante de não empilhamento CD80 IgSF-Fc e/ou variante CD155-lgSF-Fc, tal como determinado em um ensaio repórter. Em algumas modalidades, o aumento é superior a 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes ou mais.
[00414] É aqui fornecida uma molécula de pilha de múltiplos domínios homodimérica produzida a partir de um polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador contendo um domínio IgSF, por exemplo, domínio IgV, de um polipeptídeo CD80 variante e um segundo domínio IgSF, por exemplo, IgV, de um polipeptídeo CD112 variante. Em algumas modalidades, as moléculas de pilha de múltiplos domínios resultantes ligam-se a ambos CTLA-4 e CD112R. Em alguns aspectos, a ligação a CD112R é ao mesmo grau ou grau semelhante ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a CD112R do domínio IgSF correspondente de CD112 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns aspectos, a ligação a CTLA-4 é ao mesmo grau ou semelhante, ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a CTLA-4 do domínio IgSF correspondente de CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a ligação a CD112R ou CTLA-4 é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,
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80%, 90% ou mais da ligação a CD112R ou CTLA-4 da forma empacotada do CD80 variante IgSF-Fc. Em algumas modalidades, a ligação a CD112R é pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a CD112R da forma não empilhada da variante Igl CD112 Fc. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios resultante aumenta as respostas imunológicas de células T em comparação com a variante de não empilhamento CD80 IgSF-Fc e/ou variante CD112-lgSF-Fc, tal como determinado em um ensaio repórter. Em algumas modalidades, o aumento é superior a 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes ou mais.
[00415] É aqui fornecida uma molécula de pilha de múltiplos domínios homodimérica produzida a partir de um polipeptídeo de fusão Fc imunomodulador contendo um domínio IgSF, por exemplo, domínio IgV, de um polipeptídeo CD80 variante, um segundo domínio IgSF, por exemplo, IgV, de um polipeptídeo variante CD155 ou CD112 e um terceiro domínio IgSF, por exemplo, IgV, de um polipeptídeo variante PDL1 ou PD-L2. Em algumas modalidades, as moléculas de pilha de múltiplos domínios resultantes ligam-se a CTLA-4, TIGIT, CD112R e PD1. Em alguns aspectos, a ligação a CTLA-4 é ao mesmo grau ou grau semelhante ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a CTLA-4 do domínio IgSF correspondente de CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns aspectos, a ligação a TlGIT é ao mesmo grau ou grau semelhante ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a TIGIT do correspondente domínio IgSF de CD155 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns aspectos, a ligação a CD112R é ao mesmo grau ou grau semelhante, ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a CD112R do domínio IgSF correspondente de CD112 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns aspectos, a ligação a PD-1 é
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243/474 ao mesmo grau ou semelhante, ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a PD-1 do domínio IgSF correspondente de PD-L1 não modificado ou de tipo selvagem. Em alguns aspectos, a ligação a PD-1 é ao mesmo grau ou semelhante, ou, em alguns casos, é aumentada, em comparação com a ligação a PD-1 do domínio IgSF correspondente de PD-L2 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a ligação a CTLA-4 ou é pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a CTLA-4 da forma não empilhada da IgSF-Fc de CD80 variante. Em algumas modalidades, a ligação a TIGIT ou CD112R é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a TIGIT ou CD112R da forma não empilhada da IgSF-Fc de CD112 variante. Em algumas modalidades, a ligação a TIGIT é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a TIGIT da forma não empilhada da variante IgG CD155 Fc. Em algumas modalidades, a ligação a PD1 é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da ligação a PD-1 da forma não empilhada da IgSF-Fc de PD-1 variante. Em algumas modalidades, a molécula de pilha de múltiplos domínios resultante aumenta as respostas imunológicas de células T em comparação com a IgSF-Fc de CD80 variante não empilhada, IgSF-Fc de CD112 variante, IgSF-Fc de CD155 variante, IgSF-Fc de PD-L1 e/ou IgSF-Fc de PD-L 2, tal como determinado em um ensaio repórter. Em algumas modalidades, o aumento é superior a 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes ou mais.
C. Conjugados e Fusões de Polipeptídeos Variantes e Proteínas Imunomoduladoras [00416] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes aqui proporcionados, que são proteínas imunomoduladoras compreendendo variantes de um domínio Ig da família IgSF (vlgD), podem ser conjugados ou fundidos com uma porção, tal como uma porção efetora, tal
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244/474 como outra proteína, diretamente ou indiretamente, para formar um conjugado (conjugado de IgSF). Em algumas modalidades, a ligação pode ser covalente ou não covalente, por exemplo, através de uma interação não covalente com biotina-estreptavidina. Em algumas modalidades de uma fusão variante de CD80-Fc, qualquer um ou combinação de quaisquer dois ou mais dos conjugados anteriores pode ser ligado ao Fc ou ao polipeptídeo CD80 variante ou a ambos.
[00417] Em algumas modalidades, a porção pode ser uma porção de direcionamento, um fármaco de molécula pequena (fármaco não polipeptídico de menos de 500 Daltons de massa molar), uma toxina, um agente citostático, um agente citotóxico, um agente imunossupressor, um agente radioativo adequado para fins de diagnóstico, um íon metálico radioativo para fins terapêuticos, uma enzima ativadora de pró-fármaco, um agente que aumenta a meia-vida biológica, ou um agente diagnóstico ou detectável.
[00418] Em algumas modalidades, a porção efetora é um agente terapêutico, tal como um agente terapêutico para o câncer, que é citotóxico, citostático ou, de outro modo, proporciona algum benefício terapêutico. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma porção ou agente de direcionamento, tal como um agente que tem como alvo um antígeno da superfície celular, por exemplo, um antígeno na superfície de uma célula tumoral. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma etiqueta, que pode gerar um sinal detectável, quer direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma toxina. Em algumas modalidades, a porção efetora é uma proteína, peptídeo, ácido nucleico, uma pequena molécula ou de nanopartículas.
[00419] Em algumas modalidades, 1,2, 3, 4, 5 ou mais porções efetoras, que podem ser iguais ou diferentes, são conjugadas, ligadas ou fundidas ao polipeptídeo ou proteína variante para formar um conjugado de IgSF. Em algumas modalidades, tais porções efetoras podem
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245/474 ser ligadas ao polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora utilizando vios modos de conjugao e biologia molecular ou quica conhecidos na técnica e descritos abaixo. Em algumas modalidades, podem ser utilizados ligantes, tais como ligantes peptídicos, ligantes cliváveis, ligantes não cliváveis ou ligantes que auxiliem na reação de conjugação, para ligar ou conjugar as porções efetoras ao polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora.
[00420] Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF compreende os seguintes componentes: (proteína ou polipeptídeo), (L)q e (unidade efetora)m, em que a proteína ou polipeptídeo é qualquer um dos polipeptídeos variantes variantes ou proteínas imunomoduladoras capazes de se ligarem a um ou mais ligandos de contraestrutura cognatos como descrito; L é um ligante para ligar a proteína ou polipeptídeo à porção; m é pelo menos 1; q é 0 ou mais; e o conjugado de IgSF resultante liga-se a um ou mais ligandos de contraestrutura. Em modalidades particulares, médel a4eqéde0a8.
[00421] Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora fornecida neste documento conjugada com um agente de direcionamento que se liga a uma molécula de superfície celular, por exemplo, para distribuição direcionada do polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora para uma célula específica. Em algumas modalidades, o agente de direcionamento é uma molécula (ou moléculas) que tem a capacidade de localizar e se ligar a uma molécula presente em uma célula normal/tecido e/ou célula tumoral/tumor em um indivíduo. Em outras palavras, os conjugados de IgSF compreendendo um agente de direcionamento podem ligar-se a um ligando (direta ou indiretamente), o qual está presente em uma célula, tal como uma célula tumoral. Os agentes de direcionamento da invenção contemplados para utilização incluem anticorpos, polipeptídeos, peptídeos, aptâmeros,
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246/474 outros ligandos, ou qualquer combinação destes, que se podem ligar a um componente de uma célula ou molécula-alvo.
[00422] Em algumas modalidades, o agente de direcionamento ligase a uma ou mais células tumorais ou pode ligar-se nas proximidades de uma ou mais células tumorais (por exemplo, vasculatura tumoral ou microambiente tumoral) após administração ao indivíduo. O agente de direcionamento pode se ligar a um receptor ou ligante na superfície da célula cancerosa. Em outro aspecto da invenção, é selecionado um agente de direcionamento que seja específico para um tecido ou células não cancerosas. Por exemplo, um agente de direcionamento pode ser específico para uma molécula presente normalmente em uma célula ou tecido particular. Além disso, em algumas modalidades, a mesma molécula pode estar presente em células normais e cancerígenas. Vários componentes celulares e moléculas são conhecidos. Por exemplo, se um agente de direcionamento for específico para o EGFR, o conjugado IgSF resultante pode ter como alvo as células cancerígenas que expressam EGFR, bem como as células epidérmicas da pele normais que expressam EGFR. Por conseguinte, em algumas modalidades, um conjugado de IgSF da invenção pode operar por dois mecanismos separados (visando células cancerígenas e não cancerígenas).
[00423] Em vários aspectos da invenção aqui revelada, um conjugado de IgSF da invenção compreende um agente alvo que pode ligar/visar um componente celular, tal como um antígeno tumoral, um antígeno bacteriano, um antígeno viral, um antígeno micoplasma, um antígeno fúngico, um antígeno priônico, um antígeno de um parasita. Em alguns aspectos, um componente celular, antígeno ou molécula pode ser usado para significar, cada um, um alvo desejado para um agente de direcionamento. Por exemplo, em várias modalidades, um agente de direcionamento é específico para ou se liga a um componente, que inclui, mas não está limitado a, receptor do fator de cresci
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247/474 mento epidérmico (EGFR, ErbB-1, HERI), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB3/HER3, ErbB-4/HER4, família de ligandos EGFR; família de receptor de fator de crescimento semelhante a insulina (IGFR), proteínas de ligação a IGF (IGFBPs), família de ligandos IGFR; família do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), família do ligando PDGFR; família do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR), família do ligando do FGFR, família do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), família VEGF; família de receptores de HGF; família de receptores TRK; família de receptores de efrina (EPH); família de receptores AXL; família de receptores de tirosina quinase de leucitos (LTK); família de receptores de TIE, angiopoietina 1,2; a família do receptor do receptor órfão de tipo tirosinacinase do receptor (ROR), por exemplo, R0R1; CD171 (L1CAM); B7H6 (NCR3LG1); CD80, antígeno de glicosilação tumoral, por exemplo, sTn ou Tn, tal como sTn Ag de MUC1; LHR (LHCGR); fosfatidilserina, família de receptores do domínio de discoidina (DDR); família de receptores RET; família de receptores KLG; família de receptores RYK; família de receptores MuSK; receptores do fator de crescimento transformante-α (TGF-a), TGF-β; receptores de citocinas, receptores da classe I (família da hematopoietina) e da classe II (família da interferon/IL-10), superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNF) (TNFRSF), família dos receptores da morte; antígenos de câncer-testículo (CT), antígenos de linhagem específica, antígenos de diferenciação, alfa-actinina-4, ARTCI, produtos de fusão da região do cluster de ruptura-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, caspase-5 (CASP-5), caspase-8 (CASP-8), β-catenina (CTNNBI), ciclo de divisão celular 27 (CDC27), quinase dependente de ciclina 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, proteína de fusão de dek-can, EFTUD-2, alongamento fator 2 (ELF2), gene variante Ets 6/leucemia mieloide aguda 1 gene ETS (ETC6AML1) proteína de fusão, fibronectina (FN), por exemplo, o extradoPetição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3381/3680
248/474 maso A (EDA) de fibronectina, GPNMB, receptor lipídico de baixa densidade/GDP-L fucose: proteína de fusão β-D-galactose 2-a-Lfucosiltransferase (LDLR/FUT), troca de arginina para isoleucina HLAA2 no resíduo 170 da hélice a do domínio a2 no gene HLA-A2 (HLAA*201 a R170I), HLA-A1 1, proteína de choque térmico 70-2 mutada (HSP70-2M), K1AA0205, MART2, melanoma, 1, 2, 3 (MUM-1, 2, 3), fosfatase ácida prostática (PAP), neopap, miosina classe I, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusão pml-RARa Proteína de fusão PRSX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSX1 ou -SSX2, trioseofosfato isomerase, BAGE, BAGK-1, BAGE-2,3, 4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (Nacetilglucosaminil transferase V aberrante, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM- HN-I, LAGE, LAGE-1, antígeno reconhecido por CTL em melanoma (CAMEL), MAGE-A1 (MAGE-1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE -A8, MAGE-A9, MAGE-A1O, MAGE-AI1, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-BI, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-CI, MAGE-C2, mucina 1 (MUCI), MART-1/Melan-A (MLANA), gpIO, gplOO/Pmell7 (SILV), tirosinase (TYR), TRP-I, HAGE, NA-88, NY-ESO-I, NY-ESO-l/LAGE-2, SAGE, Spl7, SSX-1, 2,3,4, TRP2-INT2, antígeno carcino-embrionário (CEA), calicreina 4, mamaglobina-A, OA1, antígeno prostático específico (PSA), TRP-1/gp75, TRP-2, adipofilina, proteína indutivel por interferon ausente em melanoma 2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciclina Dl, molécula de adesão celular epitelial (Ep-CAM), EphA3, fator de crescimento de fibroblastos-5 (FGF-5), glicoproteina 250 (gp250), EGFR ( ERBBI), HER-2/neu (ERBB2), cadeia α2 do receptor da interleucina 13 (IL13Ra2), receptor IL-6, carboxil esterase intestinal (iCE), proteína alfa-feto (AFP), MCSF, mdm-2, MUCI, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-I, RNF43, RU2AS, SOX10, STEAPI, survivina (BIRC5), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), telomerase, gene do tumor de
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Wilms (WTI), SYCPI, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIPI, CTAGE-I, CSAGE, MMAI, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15ql4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-I, SPLOI 1, TPXI, NY- SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRD1, TEX15, FATE, TPTE, idiotipos de imunoglobulina, proteína de Bence-Jones, receptores de estrogênio (ER), receptores de andrógeno (AR), CD40, CD30, CD20, CD 19, CD33, antígeno de câncer 72-4 (CA 72-4), antígeno de câncer 15-3 (CA 15-3), antígeno de câncer 27-29 (CA 27-29), antígeno de câncer 125 (CA 125), antígeno de câncer 19-9 (CA 19-9), β-gonadotrofina coriônica humana, β-2 microglobulina, antígeno de carcinoma de células escamosas, enolase específica de neurônio, proteína de choque térmico gp96, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanina prolina (707-AP), antígeno de adenocarcinoma reconhecido pelas células T 4 (ART-4), peptídeo antígeno carcinoembrionário-1 (CAP-1), canal de cloreto ativado por cálcio-2 (CLCA2), ciclofilina B (Cyp-B), anel de sinete humano de tumor-2 (HST-2), proteínas do vírus do papiloma humano (HPV) (HPV-E6, HPV-E7, antígenos de cside maior ou menor, outros), proteínas do vírus de Epstein-Barr (EBV) (proteínas da membrana latente de EBV LMPI, LMP2; outras), proteínas do vírus da Hepatite B ou C e proteínas do HIV.
[00424] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através do seu agente de direcionamento, irá ligar um componente celular de uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou microambiente tumoral, promovendo assim a morte de células-alvo via modulação da resposta imunológica (por exemplo, por ativação de moléculas coestimuladoras ou inibição de moléculas reguladoras negativas da ativaçõ de células imunológicas), inibição de sinais de sobrevivência (por exemplo, fator de crescimento ou citocina ou antagonistas de receptores hormonais), ativação de sinais de morte e/ou citotoxicidade imunomediada, tal como através de células celulares dependentes de anticorpos citotoxici
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250/474 dade.Tais conjugados de IgSF podem funcionar através de vários mecanismos para prevenir, reduzir ou eliminar células tumorais, de modo a facilitar a entrega de porções efetoras conjugadas ao alvo tumoral, tal como através da endocitose mediada por receptor do conjugado de IgSF; ou tais conjugados podem recrutar, ligar e/ou ativar células imunológicas ( por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B). Além disso, em alguns casos, uma ou mais das vias precedentes podem operar com a administração de um ou mais conjugados de IgSF da invenção.
[00425] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através do seu agente de direcionamento, estar localizado para, tal como se ligar a, um componente celular de uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou microambiente tumoral, modulando assim as células da resposta imunológica na vizinhan do tumor. Em algumas modalidades, o agente de direcionamento facilita a entrega da IgSF conjugada (por exemplo, vlgD) ao alvo tumoral, tal como interagir com seu parceiro de ligação cognato para alterar a sinalização de células imunes (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas, Células T, células B) contendo o parceiro de ligação cognato. Em algumas modalidades, a distribuição localizada medeia uma atividade antagonista ou bloqueadora do receptor inibidor de CTLA-4. Em algumas modalidades, a distribuição localizada agoniza o receptor inibidor de CTLA-4, que, em alguns casos, pode ocorrer onde existe aglomeração proximal de um receptor de ativação.
[00426] Em algumas modalidades, o agente de direcionamento é uma imunoglobulina. Como aqui utilizado, o termo imunoglobulina inclui anticorpos mono ou polivalentes naturais ou artificiais incluindo, mas não limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos
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251/474 por uma biblioteca de expressão de Fab, Fv de cadeia simples (scFv); anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-ld para anticorpos da invenção) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos anteriores. O termo anticorpo, como usado aqui, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antigeno que se liga imunoespecificamente a um antigeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.
[00427] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através da sua porção de direcionamento de anticorpo, ir ligar um componente celular de uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou microambiente tumoral, promovendo assim a apoptose de células-alvo via modulação da resposta imunológica (por exemplo, por ativação de co moléculas estimuladoras ou inibição de moléculas reguladoras negativas da ativação de células imunológicas), inibição de sinais de sobrevivência (por exemplo, fator de crescimento ou citocina ou antagonistas de receptores hormonais), ativação de sinais de morte e/ou citotoxicidade mediada pelo sistema imunológico citotoxicidade celular. Tais conjugados de IgSF podem funcionar através de vários mecanismos para prevenir, reduzir ou eliminar células tumorais, de modo a facilitar a entrega de porções efetoras conjugadas ao alvo tumoral, tal como através da endocitose mediada por receptor do conjugado de IgSF; ou tais conjugados podem recrutar, ligar e/ou ativar células imunológicas (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagod, células dendríticas, células T, células B).
[00428] Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF, através da sua porção de direcionamento de anticorpo, ir ligar um componente
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252/474 celular de uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou microambiente tumoral, modulando assim a resposta imunológica (por exemplo, por ativação de moléculas coestimuladoras ou inibio de moléculas de ativação de células imunes). Em algumas modalidades, tais conjugados podem reconhecer, ligar e/ou modular (por exemplo, inibir ou ativar) células imunológicas (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B).
[00429] As porções de direcionamento de anticorpo da invenção incluem fragmentos de anticorpo que incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv) e fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH.Os fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender a região (ou regiões) variável sozinha ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Estão também incluídos na invenção os fragmentos de ligação ao antígeno que também compreendem qualquer combinação de regiões variáveis com uma região dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Estão também incluídos na invenção fragmentos Fc, proteínas de fusão antígeno-Fc e conjugados de unidades de direcionamento Fc ou produtos de fusão (peptídeo Fc, aptâmero Fc). As porções-alvo de anticorpo da invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Em um aspecto, as porções de direcionamento para anticorpo são humanas, murinas (por exemplo, camundongo e rato), burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho da índia, camelo, cavalo ou galinha. Além disso, tais anticorpos podem ser versões humanizadas de anticorpos animais. As porções direcionadas para anticorpo da invenção podem ser monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas ou de maior especificidade.
[00430] Em várias modalidades, um anticorpo/porção de direciona
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253/474 mento recruta, liga e/ou ativa as células imunes (por exemplo, células NK, monócitos/macrófagos, células dendríticas) via interações entre Fc (em anticorpos) e receptores Fc (em células imunes) e via os polipeptídeos variantes conjugados ou proteínas imunomoduladoras aqui proporcionadas. Em algumas modalidades, um anticorpo/porção de direcionamento reconhece ou liga um agente tumoral via e localiza na célula tumoral os polipeptídeos variantes conjugados ou proteínas imunomoduladoras aqui proporcionadas para facilitar a modulação de células imunológicas na proximidade do tumor.
[00431] Exemplos de anticorpos que podem ser incorporados em conjugados de IgSF incluem mas não estão limitados a anticorpos tais como Cetuximab (IMC-C225; Erbitux®), Trastuzumab (Herceptin®), Rituximab (Rituxan®; MabThera®), Bevacizumab (Avastin®), Alemtuzumab (Campath®; Campath-1 H®; Mabcampath®), Panitumumab (ABX-EGF; Vectibix®), Ranibizumab (Lucentis®), Ibritumomab, Ibritumomab tiuxetan, (Zevalin®), Tositumomab, Iodo I 131 Tositumomab (BEXXAR®), Catumaxomab (Removab®), Gemtuzumab, Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg®), Abatacept (CTLA4-lg; Orencia®), Belatacept (L104EA29Ylg; LEA29Y; LEA), Ipilimumab (MDX-010; MDX-101), Tremelimumab (ticilimumab; CP-675.206), PRS-010, PRS-050, Aflibercept (VEGF-Trap, AVE005), Volociximab (M200), F200, MORAb009, SS1P (CAT-5001), Cixutumumab (IMC-A12), Matuzumab (EMD72000), Nimotuzumab (h-R3), Zalutumumab (HuMax-EGFR), Necitumumab IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004, mAb-425, Panorex @(17-1 A) (anticorpo monoclonal murino); Panorex @ (17-1 A) (anticorpo monoclonal murino quimérico); IDEC-Y2B8 (murino, anti-CD2O MAb); BEC2 (MAb anti-idiotípico, mimetiza o epítopo GD) (com BCG); Oncolym (anticorpo monoclonal Lym-1); SMART MI95 Ab, 13Ί LYM-I humanizado (Oncolym), Ovarex (B43.13, MAb de camundongo antiidiotípico); MDX-210 (anticorpo biespecífico anti-HER-2 humanizado);
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3622W94 MAb que se liga ao antígeno do pancarcinoma EGP40 (171A) nos adenocarcinomas; Anti-VEGF, Zenapax (SMART Anti-Tac (receptor IL-2); SMART MI95 Ab, Ab humanizado, humanizado); MDX210 (anticorpo biespecífico anti-HER-2 humanizado); MDX-447 (anticorpo biespecífico do receptor humanizado anti-EGF); NovoMAb-G2 (pancreatinoma específico de Ab); TNT (MAb quimico para antígenos histona); TNT (MAb quimico para antígenos histona); Gliomab-H (Monoclon - Abs Humanizado); Mab GNI-250; EMD-72000 (antagonista quimico-EGF); LymphoCide (anticorpo LL2 humanizado); e o MDX-260 biespecífico, tem como alvo GD-2, ANA Ab, SMART IDIOb, SMART ABL 364Ab ou ImmuRAIT-CEA. Como ilustrado pela lista anterior, é convencional fabricar anticorpos para um determinado epítopo-alvo.
[00432] Em algumas modalidades, a porção de direcionamento de anticorpo é um anticorpo de comprimento total, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, contendo um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora é conjugado com a porção Fc da porção de direcionamento de anticorpo, tal como por conjugação com o terminal N da porção Fc do anticorpo.
[00433] Em algumas modalidades, o vlgD está ligado, direta ou indiretamente, ao terminal N ou C da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo. Em algumas modalidades, a ligação pode ser através de um ligante peptídico, tal como qualquer descrito acima. Várias configurações podem ser construídas. As Figuras 8A-8C descrevem configurações exemplificativas. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser produzido por co-expressão da cadeia pesada e leve do anticorpo em uma célula.
[00434] Em um aspecto da invenção, o agente de direcionamento é uma molécula de aptâmero. Por exemplo, em algumas modalidades, o aptâmero é composto por ácidos nucleicos que funcionam como um
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255/474 agente de direcionamento. Em várias modalidades, um conjugado de IgSF da invenção compreende um aptâmero que é específico para uma molécula em uma célula tumoral, vasculatura tumoral e/ou um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o aptâmero propriamente dito pode compreender uma sequência biologicamente ativa, além do módulo de direcionamento (sequência), em que a sequência biologicamente ativa pode induzir uma resposta imunológica à célulaalvo. Em outras palavras, tal molécula de aptâmero é um agente de dupla utilização. Em algumas modalidades, um conjugado de IgSF da invenção compreende a conjugação de um aptâmero a um anticorpo, em que o aptâmero e o anticorpo são específicos para ligação a moléculas separadas em uma célula tumoral, vasculatura tumoral, microambiente tumoral e/ou células imunológicas.
[00435] O termo aptâmero inclui DNA, RNA ou peptídeos que são selecionados com base em propriedades específicas de ligação a uma molécula em particular. Por exemplo, um aptâmero (s) pode ser selecionado para ligar um gene particular ou produto genético em uma célula tumoral, vasculatura tumoral, microambiente tumoral e/ou uma célula imunológica, como aqui divulgado, onde a seleção é feita por métodos conhecidos na técnica e familiar para um versado na técnica.
[00436] Em alguns aspectos da invenção, o agente de direcionamento é um peptídeo. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras aqui proporcionadas podem ser conjugados com um peptídeo que se pode ligar a um componente de um câncer ou células tumorais. Por conseguinte, tais conjugados de IgSF da invenção compreendem agentes de direcionamento de ptidos que se ligam a um componente celular de uma célula tumoral, vasculatura tumoral e/ou um componente de um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os ptidos do agente de direcionamento podem ser um antagonista ou agonista de uma integrina. As integrinas, que com
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256/474 preendem uma subunidade alfa e beta, incluem numerosos tipos bem conhecidos de um versado.
[00437] Em uma modalidade, o agente de direcionamento é Vvp3.A integrina Vvp3 é expressa em uma variedade de células e tem sido demonstrado que medeia vários processos biologicamente relevantes, incluindo a adesão de osteoclastos à matriz óssea, migração de células musculares lisas vasculares e angiogénese. Moléculas de direcionamento adequadas para integrinas incluem peptideos RGD ou peptidomiméticos, bem como peptideos não RGD ou peptidomiméticos (ver, por exemplo, patentes US n° 5.767.071 e 5.780.426) para outras integrinas, tais como V4,pi (VLA-4), V4- P7 (ver, por exemplo, patente US 6.365.619; Chang et al, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12: 159-163 (2002); Lin et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12: 133136 (2002).)), e similar.
[00438] Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora aqui fornecida conjugada com um agente terapóstico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico inclui, por exemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., Cancer Immunol. Imunother 21: 183-187, 1986). Em algumas modalidades, o agente terapêutico tem uma atividade intracelular. Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF é internalizado e o agente terapêutico é uma citotoxina que bloqueia a síntese proteica da célula, daí resultando a morte celular. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é uma citotoxina compreendendo um polipeptídeo possuindo atividade inativadora de ribossoma incluindo, por exemplo, gelonina, buganina, saporina, ricina, cadeia A ricina, briodina, toxina diftérica, restritina, exotoxina A de Pseudomonas e suas variantes. Em algumas modalidades, quando o agente teraptico uma citotoxina compreendendo um polipeptídeo possuindo uma atividade de inactivao de ribosso
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257/474 mas, o conjugado de IgSF deve ser internalizado por ligação de célulaalvo para que a proteína seja citotóxica para as células.
[00439] Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora aqui fornecida conjugada com uma toxina. Em algumas modalidades, a toxina inclui, por exemplo, toxinas bacterianas tais como toxina da difteria, toxinas vegetais tais como ricina, toxinas de moléculas pequenas tais como geldanamicina (Mandler et al., J. Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028 (2000); Mandler e outros, Bioconjugate Chem. 13: 786-791 (2002)), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl.Acad. Sei. EUA 93: 8618-8623 (1996)) e caliqueamicina (Lode et al., Cancer Res. 58: 2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993)). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação à tubulina, ligação ao DNA ou inibição da topoisomerase.
[00440] Em algumas modalidades, é fornecido um conjugado de IgSF compreendendo um polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora fornecida neste documento conjugada com uma etiqueta, que pode gerar um sinal detectável, indireta ou diretamente. Estes conjugados de IgSF podem ser utilizados para pesquisa ou aplicações de diagnóstico, tais como para a detecção in vivo de câncer. O marcador é preferivelmente capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, o marcador pode ser rádio-opaco ou um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 1231, 1251, 1311; um composto fluorescente (fluoróforo) ou quimioluminescente (cromoforo), tal como isotiocianato de fluorescência, rodamina ou luciferina; uma enzima, como a fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano; um agente de imagem; ou um íon metálico. Em algumas modalidades, o marcador é um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por
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258/474 exemplo, 99Tc ou 1231, ou um marcador de rotação para ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como ressonância magnética, MRI), como zircônio-89, iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro. O zircónio-89 pode ser complexado com vários agentes quelantes de metais e conjugado com anticorpos, por exemplo, para imagiologia PET (WO 2011/056983). Em algumas modalidades, o conjugado de IgSF é detectável indiretamente. Por exemplo, um anticorpo secundário que é específico para o conjugado de IgSF e contém um marcador detectável pode ser utilizado para detectar o conjugado de IgSF.
[00441] Os conjugados de IgSF podem ser preparados utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, os documentos WO 2009/067800, WO 2011/133886 e pedido de patente US n° 2014322129, aqui incorporados por referência na sua totalidade. [00442] Os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados a a porção efetora por qualquer meio através do qual os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras podem ser associados ou ligados à porção efetora. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados à porção efetora por meios químicos ou recombinantes. Meios químicos para preparar fusões ou conjugados são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para preparar o conjugado de IgSF. O método utilizado para conjugar os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e porção efetora deve ser capaz de unir os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras com a porção efetora sem interferir com a capacidade dos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras se ligarem aos seus um ou mais ligandos de contraestrutura.
[00443] Os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser ligados indiretamente ao grupo
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259/474 efetor. Por exemplo, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser diretamente ligados a um lipossoma contendo a porção efetora de um de vários tipos. A porção efetora e/ou os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras podem também estar ligadas a uma superfície sólida.
[00444] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF e a porção efetora são ambas proteínas e podem ser conjugadas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Existem centenas de crosslinkers disponíveis que podem conjugar duas proteínas. (Veja, por exemplo, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). O agente de reticulação é geralmente escolhido com base nos grupos funcionais reactivos disponíveis ou inseridos nos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e/ou porção efetora. Além disso, se não houver grupos reativos, um reticulante fotoativável pode ser usado. Em certos casos, pode ser desejável incluir um espaçador entre os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e a porção efetora. Os agentes de reticulação conhecidos na técnica incluem os agentes homobifuncionais: glutaraldeído, dimetiladipimidato e Bis (diazobenzidina) e os agentes heterobifuncionais: m Maleimidobenzoil-N-Hidroxissuccinimida e Sulfo-m Maleimidobenzoil-N-Hidroxissuccinimida.
[00445] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras de um conjugado de IgSF podem ser manipulados com resíduos específicos para ligação química da porção efetora. Os resíduos específicos utilizados para ligação química da molécula conhecida na técnica incluem lisina e cisteína. O agente de reticulação é escolhido com base nos grupos funcionais reativos inseridos nos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e disponíveis na porção efetora.
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260/474 [00446] Um conjugado de IgSF também pode ser preparado usando técnicas de DNA recombinante. Nesse caso, uma sequência de DNA que codifica os polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras é fundida com uma sequência de DNA que codifica a porção efetora, resultando em uma molécula de DNA quimérica. A sequência de DNA quimica transfectada para uma célula hospedeira que expressa a proteína de fus. A proteína de fusão pode ser recuperada da cultura celular e purificada utilizando técnicas conhecidas na técnica.
[00447] Exemplos de ligação de uma unidade efetora, que é um marcador, aos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras incluem os métodos descritos em Hunter, et al., Nature 144: 945 (1962); David, et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth 40: 219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982); Wensel e Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, Nova lorque (1983); e Colcher et al., Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice, Meth. Enzymol., 121: 802-16 (1986).
[00448] Os marcadores de rádio ou outros podem ser incorporados no conjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogênio. Marcadores tais como 99Tc ou 1231, 186Re, 188Re e 1111n podem ser ligados através de um resíduo de cisteína no peptídeo. O ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biofísica Res. Comum. 80: 49-57 (1978)) podem ser utilizados para incorporar o iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
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261/474 [00449] Os conjugados dos polipeptídeos variantes ou proteínas imunomoduladoras e um agente citotóxico podem ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometilo) ciclohexano-1 a carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (como o glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). O ácido 1 a p-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminapenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 um exemplo de agente quelante para conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Ver, por exemplo, o documento WO94/11026. O ligante pode ser um ligante clivável facilitando a liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, pode utilizar-se um ligante instável em ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotoinstável, ligante dimetila ou ligante contendo dissulfureto (Chari et al., Cancer Research 52: 127131 (1992); patente US n° 5 208 020).
[00450] Os conjugados de IgSF da invenção contemplam expressamente, mas não se limitam a, conjugados de fármacos preparados com reagentes de reticulação: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LCSMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfoEMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EUA). Veja as páginas 467-498, 2003-2004 Applica
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262/474 tions Handbook and Catalog.
D. Proteínas Imunomoduladoras Transmembranares e Secretáveis e Células Manipuladas [00451] São aqui fornecidas células manipuladas que expressam os polipeptídeos CD80 variantes imunomoduladores (alternativamente, células manipuladas). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante imunomodulador expresso é uma proteína transmembranar e é expresso na superfície. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante imunomodulador expresso é expresso e secretado da célula.
1. Proteínas Imunomoduladoras Transmembranares [00452] Em algumas modalidades, um polipeptídeo imunomodulador compreendendo um CD80 variante pode ser uma proteína ligada à membrana.Como descrito em mais detalhe abaixo, o polipeptídeo imunomodulador pode ser um polipeptídeo imunomodulador transmembranar compreendendo um CD80 variante na qual está contido: um ectodomínio contendo pelo menos um domínio IgSF modificado por afinidade (IgV ou IgC), um domínio transmembranar e, opcionalmente, um citoplasmático domínio. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar pode ser expressa na superfície de uma célula imunológica, tal como uma célula de mamífero, incluindo na superfície de um linfócito (por exemplo, célula T ou célula NK) ou célula apresentadora de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar é expressa na superfície de uma célula T de mamífero, incluindo células T como: uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica (alternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL), uma célula T natural killer, uma célula T reguladora, uma célula T de memória ou uma célula T gama delta. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula apresentadora de antígeno (APC). Tipicamente, mas não exclusivamente, o ectodomínio (alterna
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263/474 tivamente, domínio extracelular) compreende as uma ou mais variações de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos) do CD80 variante da invenção. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína transmembranar compreenderá um ectodomínio que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos de um CD80 variante da invenção.
[00453] Em algumas modalidades, as células manipuladas expressam polipeptídeos CD80 variantes são polipeptídeos imunomoduladores transmembranares (TIPs) que podem ser uma proteína de membrana, tal como uma proteína transmembranar. Em modalidades ticas, o ectodomínio de uma proteína de membrana compreende um domínio extracelular ou um domínio IgSF deste de um CD80 variante aqui fornecida em que cont uma ou mais substituições de aminoácidos em pelo menos um domínio IgSF como descrito. As proteínas imunomoduladoras transmembranares aqui proporcionadas contém adicionalmente um domínio transmembranar ligado ao ectodomínio. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar resulta em uma proteína codificada para a expressão da superfície celular em uma célula. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar está ligado diretamente ao ectodomínio. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar está ligado indiretamente ao ectodomínio por meio de um ou mais ligantes ou espaçadores. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar contém resíduos de aminoácidos predominantemente hidrofóbicos, tais como leucina e valina.
[00454] Em algumas modalidades, pode ser utilizado um domínio de ancoragem transmembranar de comprimento total para assegurar que os TIPs serão expressos na superfície da célula manipulada, tal como a célula T manipulada. Convenientemente, isto poderia ser de uma proteína nativa particular que está sendo modificada por afinidade (por exemplo, CD80 ou outra proteína IgSF nativa), e simplesmente
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264/474 fundida à sequência do primeiro domínio proximal de membrana de uma maneira similar à proteína IgSF nativa (por exemplo, CD80). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar compreende um domínio transmembranar do correspondente membro de IgSF de tipo selvagem ou não modificado, tal como um domínio transmembranar contido na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (Tabela 3). Em algumas modalidades, a forma ligada à membrana compreende um domínio transmembranar do polipeptídeo selvagem ou não modificado correspondente, tal como corresponde aos resíduos 243-263 da SEQ ID NO: 1.
[00455] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar não nativo que não é o domínio transmembranar do CD80 nativo. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar derivado de um domínio transmembranar de outro polipeptídeo membro da família não CD80 que uma proteína membranar ou uma proteína transmembranar. Em algumas modalidades, pode ser utilizado um domínio de âncora transmembranar de outra proteína em células T. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é derivado de CD8. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar pode ainda conter uma porção extracelular de CD8 que serve como um domínio espaçador. Um exemplo de domínio transmembranar derivado de CD8 é apresentado em SEQ ID NO: 332, 364 ou 1997 ou uma porção deste contendo o domínio transmembranar de CD8. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar sintético.
[00456] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar cont ainda um endodomio, tal como um domínio de sinalização citoplasmico, ligado ao domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmática induz a sinalização celular. Em algumas modalidades, o endodomínio da pro
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265/474 teína imunomoduladora transmembranar compreende o domínio citoplasmático do polipeptídeo de tipo selvagem ou não modificado correspondente, tal como um domínio citoplasmático contido na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (ver Tabela 3). [00457] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora transmembranar fornecida que é ou compreende um CD80 variante compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 279 e contém um ectodomínio compreendendo pelo menos um domínio lg80 CD80 modificado por afinidade como descrito e um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar contém uma ou mais substituições de aminoácidos em um domínio IgSF (por exemplo, domínio IgV) como descrito, incluindo qualquer apresentado na Tabela 1. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar pode ainda compreender um domínio citoplasmático como descrito. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar pode ainda conter um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é o peptídeo sinal nativo do membro de IgSF do tipo selvagem, tal como contido na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (ver, por exemplo, a Tabela 3).
[00458] Também é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica essas proteínas imunomoduladoras transmembranares. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína imunomoduladora transmembranar compreende uma sequência nucleotica que codifica uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com a SEQ ID NOS: 279 e contém um ectodomínio compreendendo pelo
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266/474 menos um domínio IgSF modificado por afinidade como descrito, um domínio transmembranar e, opcionalmente, um domínio citoplasmático. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode ainda compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é o peptídeo sinal nativo do membro de IgSF do tipo selvagem correspondente (ver, por exemplo, Tabela 3).
[00459] Em algumas modalidades, são proporcionadas proteínas imunomoduladoras transmembranares relacionadas com CAR nas quais o endodomínio de uma proteína imunomoduladora transmembranar compreende um domínio de sinalização citoplasmática que compreende pelo menos um domínio de sinalização contendo ITAM (motivo de ativação baseado em imunorreceptor tirosina). ITAM é um motivo conservado encontrado em vários domínios de sinalização proteica envolvidos na transdução de sinal de células imunes, inclusive na cadeia CD3-zeta (CD3-z) envolvida na transdução de sinal do receptor de célula T. Em algumas modalidades, o endodomínio compreende no domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 333 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para a SEQ ID NO: 333 e mantém a atividade de sinalização de células T. Em algumas modalidades, o endodomínio de uma proteína imunomoduladora transmembranar relacionada com CAR pode ainda compreender um domínio de sinalização coestimulador para modular adicionalmente respostas imunomoduladoras da célula T. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é CD28, ICOS, 41 BB ou 0X40. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é derivado de CD28 ou 4-1 BB e compreende a sequência de aminoáci
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267/474 dos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 365-368 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para a SEQ ID NO: 365-368 e mantém a atividade de sinalização costimulatória de células T. Em algumas modalidades, as proteínas imunomoduladoras transmembranares relacionadas com CAR fornecidas apresentam características de CARs para estimular a sinalização de células T após ligação de um domínio IgSF modificado por afinidade a um parceiro de ligação cognato ou contraestrutura. Em algumas modalidades, após ligação específica pelo domínio IgSF modificado por afinidade com a sua contraestrutura pode levar a alterações na atividade imunológica da atividade das células T tal como refletido por alterações na citotoxicidade, proliferação ou produção de citocinas.
[00460] Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar não contém um endodomínio capaz de mediar a sinalização citoplasmática. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar não possui o mecanismo de transdução de sinal do polipeptídeo de tipo selvagem ou não modificado e, por conseguinte, não induz, ele próprio, sinalização celular. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar não possui um domínio intracelular (citoplasmático) ou uma porção do domínio intracelular do polipeptídeo de tipo selvagem ou não modificado correspondente, tal como um domínio de sinalização citoplasmática contido na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID. NO: 1 (ver Tabela 2). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar não contém um ITIM (motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptor), tal como contido em certos receptores inibitórios, incluindo receptores inibidores da família IgSF (por exemplo, PD1 ou TIGIT). Assim, em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora transmembranar cont apenas o ectodomínio e o domínio trans
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268/474 membranar, tal como qualquer como descrito.
2. Proteínas Imunomoduladoras Secretadas e Células Manipuladas [00461] Em algumas modalidades, o polipeptídeo imunomodulador variante CD80 contendo qualquer uma ou mais das mutações de aminoácidos como aqui descrito, é secretável, tal como quando expresso a partir de uma célula. Uma tal proteína imunomoduladora CD80 variante n compreende um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora CD80 variante é não conjugada a uma parte extensora de meia-vida (tal como um domínio Fc ou um domínio de multimerização). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora CD80 variante compreende um peptídeo sinal, por exemplo, um peptídeo sinal de anticorpo ou outra sequência sinal eficiente para obter domínios fora da célula. Quando a proteína imunomoduladora compreende um peptídeo de sinal e é expressa por uma célula manipulada, o peptídeo de sinal faz com que a proteína imunomoduladora seja secretada pela célula manipulada. Geralmente, o peptídeo sinal, ou uma porção do peptídeo sinal, é clivado da proteína imunomoduladora com secreção. A proteína imunomoduladora pode ser codificada por um ácido nucleico (que pode fazer parte de um vetor de expressão). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é expressa e secretada por uma célula (tal como uma célula imunológica, por exemplo, uma célula imunológica primária).
[00462] Assim, em algumas modalidades, são proporcionadas proteínas imunomoduladoras CD80 variantes que compreendem ainda um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora CD80 variante operacionalmente ligada a uma sequência de secreção que codifica o peptídeo sinal.
[00463] Um peptídeo sinal é uma sequência no terminal N de uma proteína imunomoduladora que sinaliza a secreção da proteína imu
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269/474 nomoduladora de uma célula. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal tem cerca de 5 a cerca de 40 aminoácidos de comprimento (tal como cerca de 5 a cerca de 7, cerca de 7 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 15, cerca de 15 a cerca de 20, cerca de 20 a cerca de 25, ou cerca de 25 a cerca de 30, cerca de 30 a cerca de 35, ou cerca de 35 a cerca de 40 aminoácidos de comprimento).
[00464] Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é um peptídeo sinal nativo do correspondente CD80 de tipo selvagem (ver Tabela 2). Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é um peptídeo sinal não nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, o peptídeo sinal não nativo é um peptídeo sinal nativo mutante do correspondente CD80 de tipo selvagem e pode incluir um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais) substituições inserções ou deleções. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal não nativo é um peptídeo sinalizador ou um seu mutante de um membro da família da mesma família IgSF que o membro da família IgSF do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal não nativo é um peptídeo sinal ou um seu mutante a partir de um membro da família IgSF de uma família IgSF diferente do membro da família IgSF do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é um peptídeo sinal ou seu mutante de uma família proteica não IgSF, tal como um peptídeo sinal de uma imunoglobulina (tal como cadeia pesada de IgG ou cadeia leve IgG-capa), uma citocina (tal como interleucina-2 (IL-2) ou CD33), uma proteína albumina sérica (por exemplo, HSA ou albumina), uma sequência sinalizadora de pré-proteína azurocidina humana, uma luciferase, um tripsinogênio (por exemplo, quimotripsinogênio ou tripsinogênio) ou outro peptídeo sinal capaz de eficientemente secretam uma proteína de uma célula. Os peptideos sinal exemplificativas incluem qualquer um descrito na Tabela 9.
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TABELA 9. Peptideos Sinal Exemplificadores
SEQ ID NO Peptídeo Sinal Sequência de Peptideos
SEQ ID NO: 311 peptídeo sinal HSA MKWVTFISLLFLFSSAYS
SEQ ID NO: 312 cadeia leve de Ig capa MDMRAPAGIFGFLLVLFPGYRS
SEQ ID NO: 313 sequência de sinais de pré-proteína azurocidina humana MTRLTVLALLAGLLASSRA
SEQ ID NO: 314 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MELGLSWIFLLAILKGVQC
SEQ ID NO: 315 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MELGLRWVFLVAILEGVQC
SEQ ID NO: 316 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
SEQ ID NO: 317 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MDWTWRILFLVAAATGAHS
SEQ ID NO: 318 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MDWTWRFLFVVAAATGVQS
SEQ ID NO: 319 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MEFGLSWLFLVAILKGVQC
SEQ ID NO: 310 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MEFGLSWVFLVALFRGVQC
SEQ ID NO: 311 peptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS
SEQ ID NO: 312 sequências de sinal de cadeia leve de IgG Capa: MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC
SEQ ID NO: 313 sequências de sinal de cadeia leve de IgG Capa: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
SEQ ID NO: 314 Gaussia luciferase MGVKVLFALICIAVAEA
SEQ ID NO: 315 Albumina humana MKWVTFISLLFLFSSAYS
SEQ ID NO: 316 Quimotripsinogênio humano MAFLWLLSCWALLGTTFG
SEQ ID NO: 317 lnterleucina-2 humana MQLLSCIALILALV
SEQ ID NO: 318 Tripsinogênio-2 humano MNLLLILTFVAAAVA
[00465] Em algumas modalidades de uma proteína imunomoduladora CD80 variante secretável, a proteína imunomoduladora compreende um peptídeo de sinal quando expresso, e o peptídeo sinal (ou uma porção deste) é clivado da proteína imunomoduladora após a secreção.
[00466] Em algumas modalidades, as células manipuladas expressam polipeptídeos CD80 variantes que são secretados da célula. Em algumas modalidades, tal polipeptídeo CD80 variante é codificado por uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína imunomoduladora sob o controle operável de uma sequência sinal para secreção. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada é secretada quando expressa a partir de uma célula. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada pela molécula de ácido nucleico não compreende um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada pela molécula de ácido nucleico não compreende uma parte que se prolonga de meia-vida (tal como um domínio Fc ou um domínio de multimerização). Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora codificada pela molécula de ácido nucleico compreende um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção compreende ainda uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo secretor ou de sinal operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica a proteína imunomo
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271/474 duladora, permitindo assim a secreção da proteína imunomoduladora.
3. Células e Células Manipuladas [00467] São aqui fornecidas células manipuladas expressando qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores fornecidos. Em algumas modalidades, as células manipuladas expressam na sua superfície qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores transmembranares fornecidos. Em algumas modalidades, as células manipuladas expressam e são capazes de ou são capazes de segregar a proteína imunomoduladora das células sob condições adequadas para a secreção da proteína. Em algumas modalidades, a proteína imunomoduladora é expressa em um linfócito, tal como um linfócito infiltrante de tumor (TIL), célula T ou célula NK, ou em uma célula mieloide. Em algumas modalidades, as células manipuladas são células apresentadoras de antígeno (APCs). Em algumas modalidades, as células manipuladas são células T de mamífero manipuladas ou células de apresentação de antígenos de mamífero manipuladas (APC). Em algumas modalidades, as células T ou APCs manipuladas são células humanas ou murinas.
[00468] Em algumas modalidades, as células T manipuladas incluem, mas não estão limitadas a, célula T auxiliar, célula T citotóxica (alternativamente, linfócito T citotóxico ou CTL), célula T natural killer, célula T reguladora, célula T de memória, ou gamma delta gama. Em algumas modalidades, as células T manipuladas são CD4+ ou CD8+. Além do sinal do MHC, as células T manipuladas também exigem um sinal coestimulador. Em algumas modalidades, as células T manipuladas também podem ser moduladas por sinais inibitórios, que, em alguns casos, são proporcionados por um polipeptídeo imunomodulador CD80 transmembranar variante expresso na forma ligada a membrana como discutido anteriormente.
[00469] Em algumas modalidades, as APCs manipuladas incluem, por exemplo, CPA expressando MHC II, tais como macrófagos, células B e células dendríticas, bem como APCs artificiais (aAPCs) incluindo aAPCs celulares e acelulares (por exemplo, micropartículas poliméricas biodegradáveis). As APCs artificiais (aAPCs) são versões sintéticas de APCs que podem agir de maneira similar às APCs, pois elas apresentam antígenos às células T, assim como as ativam. A apresentação do antígeno é realizada pelo MHC
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272/474 (Classe I ou Classe II). Em algumas modalidades, em APCs manipuladas, tais como aAPCs, o antígeno que é carregado no MHC, em algumas modalidades, um antígeno específico de tumor ou um antígeno associado a tumor. O antígeno carregado no MHC é reconhecido por um receptor de células T (TCR) de uma célula T, que, em alguns casos, pode expressar CTLA-4, CD28, PD-L1 ou outras moléculas reconhecidas pelos polipeptídeos CD80 variantes aqui fornecidas. Os materiais que podem ser utilizados para manipular um aAPC incluem: poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-coglicólico), óxido de ferro, lipossomas, bicamadas lipídicas, sefarose e poliestireno.
[00470] Em algumas modalidades, um aAPC celular pode ser manipulado para conter um agonista de TIP e TCR que utilizado em terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, um aAPC celular pode ser manipulado para conter um agonista TIP e TCR que é utilizado na expansão ex vivo de células T humanas, tal como antes da administração, por exemplo, para reintrodução no paciente. Em alguns aspectos, o aAPC pode incluir a expressão de pelo menos um clone de anticorpo anticD3, por exemplo, tal como, por exemplo, OKT3 e/ou UCHT1. Em alguns aspectos, os aAPCs podem ser inativados (por exemplo, irradiados). Em algumas modalidades, o TIP pode incluir qualquer domínio IgSF variante que exiba afinidade de ligação para um parceiro de ligação cognato em uma célula T.
[00471] Em algumas modalidades, uma proteína imunomoduladora aqui fornecida, tal como uma proteína imunomoduladora transmembranar ou uma proteína imunomoduladora secretável, coexpressa ou manipulada em uma célula que expressa um receptor de ligação ao antígeno, tal como um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, a célula manipulada, tal como uma célula T manipulada, reconhece um antígeno desejado associado a câncer, distúrbios inflamatórios e autoimunes ou uma infecção viral. Em modalidades específicas, o receptor de ligação ao antígeno contém uma porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno específico do tumor ou a um antígeno associado ao tumor. Em algumas modalidades, a célula T manipulada é uma célula T CAR (receptor de antígeno quimérico) que contém um domínio de ligação ao antígeno (por
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273/474 exemplo, scFv) que se liga especificamente a um antígeno, tal como um antígeno específico de tumor ou antígeno associado a tumor. Em algumas modalidades, a proteína TIP é expressa em uma célula de receptor de células T manipuladas ou em uma célula de receptor de antígeno quimérico manipulada. Em tais modalidades, a célula manipulada coexpressa o TIP e o CAR ou TCR. Em algumas modalidades, a proteína SIP é expressa em uma célula de receptor de células T manipuladas ou em uma célula de receptor de antígeno quimérico manipulada. Em tais modalidades, a célula manipulada expressa o SIP e o CAR ou TCR.
[00472] Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) são receptores recombinantes que incluem um domínio de ligação ao antígeno (ectodomínio), um domínio transmembrana e uma região sinalizadora intracelular (endodomínio) que é capaz de induzir ou mediar um sinal de ativação na célula T após o antígeno estar ligado. Em alguns exemplos, células expressando CAR são manipuladas para expressar um fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) com especificidade para um antígeno tumoral particular ligado a uma parte de sinalização intracelular compreendendo um domínio de ativação e, em alguns casos, um domínio coestimulatório. O domínio coestimulatório pode ser derivado de, por exemplo, CD28, OX-40, 41BB/CD137, coestimulador de células T induzível (ICOS), O domínio de ativação pode ser derivado de, por exemplo, CD3, como CD3 zeta, epsilon, delta, gama ou semelhante. Em certas modalidades, o CAR é manipulado para ter dois, três, quatro ou mais domínios coestimulatórios. O scFv do CAR pode ser manipulado para direcionar um antígeno expresso em uma célula associada a uma doença ou condição, por exemplo, um antígeno tumoral, como, por exemplo, CD19, que é uma proteína transmembrana expressa por células da linhagem de células B, incluindo todas as malignidades de células B e células B normais, incluindo mas não se limitando a NHL, CLL e ALL de células não T. Terapias e construções de células CAR+ T exemplificativas são descritas nas publicações de patentes US n° 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 e 2014/0050708, e estas referências são incorporadas por referência na sua totalidade.
[00473] Em alguns aspectos, o domínio de ligação ao antígeno é um
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274/474 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal como um fragmento de cadeia simples (scFv). Em algumas modalidades, o antígeno é expresso em um tumor ou célula cancerosa. Exemplar de um antígeno é CD19. Exemplif icativo de um CAR é um CAR anticD19, tal como um CAR contendo um scFv anticD19 apresentado na SEQ ID NO: 363. Em algumas modalidades, o CAR contém ainda um espaçador, um domínio transmembranar e um domínio ou região de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização de ITAM, tal como um domínio de sinalização CD3zeta. Em algumas modalidades, o CAR inclui ainda um domínio de sinalização coestimulatório. Em algumas modalidades, o espaçador e o domínio transmembranar são o domínio de dobradiça e transmembranar derivado de CD8, tal como possuindo uma sequência exemplificativa apresentada na SEQ ID NO: 332, 364, 1997 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade sequencial com a SEQ ID NO: 332, 364, 1997. Em algumas modalidades, o endodomínio compreende no domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 333 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NO: 333 e mantém a atividade da sinalização de células T. Em algumas modalidades, o endodomínio de uma CAR pode ainda compreender um domínio ou região de sinalização coestimulante para modular adicionalmente as respostas imunomoduladoras das células T. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é ou compreende uma região coestimulatória, ou é derivado de uma região coestimuladora, de CD28, ICOS, 41 BB ou 0X40. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é derivado de CD28 ou 4-1 BB e compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 365-368 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais da identidade da sequência com a SEQ ID NO: 365 -368 e mantém a atividade de sinalização
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275/474 costimulatória de células T.
[00474] Em algumas modalidades, a construção que codifica a CAR codifica ainda uma segunda proteína, tal como um marcador, por exemplo, proteína detectável, separada da CAR por uma sequência peptídica autoclivável. Em algumas modalidades, a sequência peptídica de autocorreção é um peptídeo de autoclivagem F2A, T2A, E2A ou P2A. Sequências exemplificativas de um peptídeo de autoclivagem T2A são estabelecidas para qualquer uma das SEQ ID NOS: 369, 2004, 2008 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOS: 369, 2004, 2008. Em algumas modalidades, ο T2A é codificado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2008 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 2008. Uma sequência exemplificativa de um peptídeo de autoclivagem de P2A definida na SEQ ID NO: 2038 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 3032. Em alguns casos, uma construção de ácido nucleico que codifica mais do que um peptídeo de autoclivagem de P2A (tal como P2A1 e P2A2), em que a sequência nucleotídica P2A1 e P2A2 codificam cada uma a P2A apresentada na SEQ ID NO: 3032, a sequência de nucleotídeo pode ser diferente para evitar a recombinação entre sequências.
[00475] Em algumas modalidades, o marcador é uma proteína detectável, tal como uma proteína fluorescente, por exemplo, uma proteína verde fluorescente (GFP) ou proteína fluorescente azul (BFP). Sequências exemplificativas de um marcador de proteína fluorescente são apresentadas na SEQ ID NO: 370, 2003, 3033-3035 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 370, 2003, 3033-3035.
[00476] Em algumas modalidades, o CAR tem a sequência de aminoá
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276/474 cidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 360, 371, 372, 373, 1998, 1999, 2001, 2002 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 360, 371, 372, 373, 1998, 1999, 2001, 2002. Em algumas modalidades, o CAR codificado por uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2000 ou 2006 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NO: 2000 ou 2006.
[00477] Em outra modalidade, a célula T manipulada possui um TCR, incluindo um TCR recombinante ou manipulado. Em algumas modalidades, o TCR pode ser um TCR nativo. Os versados na técnica reconhecerão que os receptores de células T de mamífero geralmente nativos compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta (ou uma cadeia gama e delta) envolvidas no reconhecimento e ligação específica do antigeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR modificado que é modificado. Em algumas modalidades, o TCR de uma célula T manipulada se liga especificamente a um antigeno associado ao tumor ou específico do tumor apresentado por uma APC. [00478] Em algumas modalidades, os polipeptídeos imunomoduladores, tais como polipeptídeos imunomoduladores transmembranares ou polipeptídeos imunomoduladores secretáveis, podem ser incorporados em células manipuladas, tais como células T manipuladas ou APCs manipuladas, por uma variedade de estratégias, tais como as utilizadas para células hospedeiras recombinantes. Uma variedade de métodos para introduzir uma construção de DNA em células T primárias é conhecida na técnica. Em algumas modalidades, a transdução viral ou a eletroporação plasmídica são empregues. Em modalidades típicas, a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína imunomoduladora, ou o vetor de expressão, compreende um peptídeo sinal que localiza as proteínas imunomoduladoras transmembranares expressas na membrana celular ou para a secreção. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma proteína imunomoduladora transmembranar da invenção é subclonado em um vetor viral, tal como um
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277/474 vetor retroviral, que permite a expressão na célula hospedeira de mamífero. O vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira de mamífero e, em condições de cultura de células hospedeiras, a proteína imunomoduladora é expressa na superfície ou é secretada.
[00479] Em um exemplo, as células T primárias podem ser purificadas ex vivo (células CD4 ou células CD8 ou ambas) e estimuladas com um protocolo de ativação que consiste em vários agonistas de TCR/CD28, tais como contas revestidas com anticD3/anticD28. Após um processo de ativação de 2 ou 3 dias, um vetor de expressão recombinante contendo um polipeptídeo imunomodulador pode ser estavelmente introduzido nas células T primárias através dos protocolos de transdução lentiviral ou retroviral da técnica da técnica ou estratégias de eletroporação de plasm ideo. As células podem ser monitorizadas quanto à expressão de polipeptídeos imunomoduladores, por exemplo, por citometria de fluxo utilizando marcadores anti-epitopo ou anticorpos que reagem de forma cruzada com moléculas e polipeptídeos parentais nativos compreendendo o CD80 variante. As células T que expressam o polipeptídeo imunomodulador podem ser enriquecidas através de triagem com anticorpos anti-epitopo ou enriquecidas para expressão elevada ou baixa dependendo da aplicação.
[00480] Após expressão do polipeptídeo imunomodulador, a célula T manipulada pode ser ensaiada quanto à função apropriada por uma variedade de meios. A coexpressão de CAR ou TCR manipulada pode ser validada para mostrar que esta parte da célula T modificada não foi significativamente impactada pela expressão da proteína imunomoduladora. Uma vez validados, ensaios padrão de citotoxicidade, proliferação ou citocinas in vitro (por exemplo, expressão de IFN-gama) podem ser usados para avaliar a função de células T modificadas. Os parâmetros padrão exemplificativos são a porcentagem de lise da linhagem tumoral, a proliferação da expressão da proteína T das células manipuladas ou da proteína IFN-gama nos sobrenadantes das culturas. Uma construo manipulada que resulta em lise aumentada estatisticamente significativa da linha de tumor, aumento da proliferação da célula T manipulada ou aumento da expressão de IFN-gama sobre a construo de controle pode ser selecionada para. Adicionalmente, não modificadas, tais
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278/474 como células T endógenas primárias ou nativas, podem também ser incorporadas no mesmo ensaio in vitro para medir a capacidade da construção polipeptídica imunomoduladora expressa nas células manipuladas, tais como células T modificadas, para modular a atividade, incluindo, em alguns casos, para ativar e gerar a função efetora em células T nativas. A expressão aumentada de marcadores de ativação, tais como CD69, CD44 ou CD62L, pode ser monitorada em células T endenas, e o aumento da proliferação e/ou produção de citocinas pode indicar a atividade desejada da proteína imunomoduladora expressa nas células T manipuladas.
[00481] Em algumas modalidades, os ensaios semelhantes podem ser utilizados para comparar a função das células T manipuladas contendo o CAR ou TCR sozinho com as que contém o construto CAR ou TCR e um construto TIP. Tipicamente, estes ensaios in vitro são realizados através do plaqueamento de várias proporções da célula T manipulada e de uma linha celular tumoral contendo o antígeno cognato CAR ou TCR em conjunto em cultura. Os endpoints padrão são a porcentagem de lise da linhagem tumoral, a proliferação da célula T modificada ou a produção de IFN-gama nos sobrenadantes das culturas. Uma proteína imunomoduladora manipulada que resultou em lise aumentada estatisticamente significativa da linha do tumor, aumento da proliferação da célula T manipulada ou aumento da produção de IFN-gama ao longo do mesmo construto isolado de TCR ou CAR pode ser selecionada para células T humanas manipuladas podem ser analisadas em camundongos imunocomprometidos, como a cepa NSG, que não possui células T, NK e B de camundongo. As células T humanas manipuladas nas quais o CAR ou o TCR se ligam a uma contraestrutura-alvo no xenoenxerto e são coexpressas com o domínio IgE modificado por afinidade TIP podem ser transferidas adotivamente in vivo em diferentes números de células e proporções em comparação com o xenoenxerto. Por exemplo, o enxerto de linhas tumorais de leucemia CD19+ contendo um vetor luciferase/GFP pode ser monitorizado através de bioluminescência ou ex vivo por citometria de fluxo. Em uma modalidade comum, o xenoenxerto é introduzido no modelo murino, seguido pelas células T manipuladas vários dias depois. As células T manipuladas contendo a proteína imunomoduladora po
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279/474 dem ser testadas quanto a sobrevivência aumentada, eliminação do tumor ou números de células T construes expandidos relativamente a células T manipuladas contendo o CAR ou apenas TCR. Tal como no ensaio in vitro, as células T humanas endógenas, nativas (ou seja, não modificadas) podem ser transferidas de forma coadotiva para procurar a disseminação bemsucedida de epitopos nessa população, resultando em uma melhor sobrevivência ou eliminação do tumor.
E. Agentes Infecciosos Expressando Polipeptídeos Variantes e Proteínas Imunomoduladoras [00482] São também fornecidos agentes infecciosos que contêm ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou transmembranares aqui descritas. Em algumas modalidades, tais agentes infecciosos podem distribuir os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui descritos, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, a uma célula-alvo em um indivíduo, por exemplo, célula imunológica e/ou célula apresentadora de antígeno (APC) ou tumor célula em um assunto. São também fornecidos ácidos nucleicos contidos nesses agentes infecciosos, e/ou ácidos nucleicos para geração ou modificação de tais agentes infecciosos, tais como vetores e/ou plasmídeos, e composições contendo tais agentes infecciosos.
[00483] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um microorganismo ou um micróbio. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus ou uma bactéria. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria. Em algumas modalidades, esses agentes infecciosos podem administrar sequências de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou transmembranares, aqui descritas. Assim, em algumas modalidades, a célula em um indivíduo que é infectado ou contatado pelos agentes infecciosos pode ser tornada expressa na superfície celular ou segregar os polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em algumas modalidades, o agente infeccioso pode também administrar um ou mais outros
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280/474 agentes terapêuticos ou ácidos nucleicos que codificam outros agentes terapêuticos para a célula e/ou para um ambiente dentro do indivíduo. Em algumas modalidades, outros agentes terapêuticos que podem ser administrados pelos agentes infecciosos incluem citocinas ou outras moléculas imunomoduladoras.
[00484] Em algumas modalidades, o agente infeccioso, por exemplo, vírus ou bactérias, contém sequências de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou transmembranares, aqui descritas, e em virtude de contato e/ou infecção de uma célula no indivíduo, a célula expressa os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou transmembranares, codificadas pelas sequências de ácido nucleico contidas no agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso pode ser administrado ao indivíduo. Em algumas modalidades, o agente infeccioso pode ser contatado com células do indivíduo ex vivo.
[00485] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras transmembranares, expressas pela célula infectada pelo agente infeccioso são uma proteína transmembranar e são expressos na superfície. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis, expressas pela célula infectada pelo agente infeccioso são expressos e secretados da célula. A proteína imunomoduladora transmembranar ou proteína imunomoduladora secretada pode ser qualquer aqui descrita.
[00486] Em algumas modalidades, as células no indivíduo que são visadas pelo agente infeccioso incluem uma célula tumoral, uma célula imunológica e/ou uma célula apresentadora de antígeno (APC). Em algumas modalidades, o agente infeccioso atinge uma célula no microambiente tumoral (TME). Em algumas modalidades, o agente infeccioso distribui os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos variantes, tais como polipeptídeos CD80 vlgD, incluindo proteínas imunomoduladoras secretáveis ou transmembranares, a uma célula apropriada (por exemplo, uma APC, tal como
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281/474 uma célula que apresenta um peptídeo/MHC complexo na sua superfície celular, tal como uma célula dendrítica) ou tecido (por exemplo, tecido linfoide) que induzirá e/ou aumentará o efeito desejado, por exemplo, imunomodulação e/ou uma resposta imunológica específica celular, por exemplo, CD4 e/ou resposta de células T CD8, que resposta de células T CD8 pode incluir uma resposta de células T citotóxicas (CTL). Em algumas modalidades, o agente infeccioso atinge uma APC, tal como uma célula dendrítica (DC). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico administrada pelos agentes infecciosos aqui descritos inclui sequências de ácido nucleico apropriadas necessárias para a expressão das sequências de codificação operacionalmente ligadas que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes, em uma célula-alvo particular, por exemplo, elementos reguladores tais como promotores.
[00487] Em algumas modalidades, o agente infeccioso que contém sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos imunomoduladores também podem conter sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais produtos genéticos adicionais, por exemplo, citocinas, enzimas conversoras de pró-fármacos, citotoxinas e/ou produtos genéticos detectáveis.Por exemplo, em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico e o vírus pode incluir sequências de ácido nucleico que codificam produtos genéticos terapêuticos adicionais (ver, por exemplo, Kirn et al., 2009) Nat Rev Cancer 9: 64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12: 403-411, ver patentes US n° 7.588.767, 7.588.771, 7.662.398 e 7.754.221 e publicação de patente US 2007/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288,
2010/0196325, 2009/0136917 e 2011/0064650. Em algumas modalidades, o produto genético adicional pode ser um produto genético terapêutico que pode resultar na morte da célula-alvo (por exemplo, célula tumoral) ou produtos genéticos que podem ampliar ou aumentar ou regular uma resposta imunológica (por exemplo, citocina). Exemplos de produtos genéticos incluem também entre um agente anticancerígeno, um agente antimetastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imunomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imunológico, um anticorpo, uma citocina, um fator de
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282/474 crescimento, um antígeno, um produto genético citotóxico, um produto genético pró-apoptótico, um produto genético antiapoptótico, um gene degradativo da matriz celular, genes para regeneração de tecidos ou reprogramação de células somáticas humanas para pluripotência, e outros genes aqui descritos ou conhecidos de um versado na técnica. Em algumas modalidades, o produto genético adicional é o fator estimulante de colônias de granulócitosmacrófagos (GM-CSF).
Vírus [00488] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico, ou um vírus que tem como alvo células particulares, por exemplo, células imunológicas. Em algumas modalidades, o agente infeccioso atinge uma célula tumoral e/ou célula cancerígena no indivíduo. Em algumas modalidades, o agente infeccioso atinge uma célula imunológica ou uma célula apresentadora de antígeno (APC).
[00489] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus oncolítico. Os vírus oncolíticos são vírus que se acumulam nas células tumorais e se replicam nas células tumorais. Em virtude da replicação nas células e da distribuição opcional de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos CD80 variantes imunomoduladores variantes ou proteínas imunomoduladoras aqui descritas, as células tumorais são lisadas e o tumor encolhe e pode ser eliminado. Os vírus oncolíticos também podem ter um amplo intervalo de tipo de hospedeiro e célula. Por exemplo, os vírus oncolíticos podem acumular-se em células imunoprivilegiadas ou tecidos imunoprivilegiados, incluindo tumores e/ou metástases, e também incluindo tecidos e células feridos, permitindo assim a entrega e expressão de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui descritos em uma ampla gama de tipos de células. Os vírus oncolíticos também podem se replicar de uma maneira específica para células tumorais, resultando em lise de células tumorais e regressão eficiente de tumores.
[00490] Os vírus oncolíticos exemplificativos incluem adenovirus, vírus adenoassociados, vírus herpes, vírus herpes simplex, reovírus, vírus da doença de Newcastle, parvovirus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesi
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283/474 cular (VSV), virus Coxsackie e virus Vaccinia. Em algumas modalidades, os vírus oncolíticos podem colonizar especificamente tumores sólidos, enquanto não infectam outros órgãos, e podem ser utilizados como um agente infeccioso para distribuir os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui descritos a tais tumores sólidos.
[00491] Os vírus oncolíticos para utilização na administração dos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos CD80 variantes ou proteínas imunomoduladoras aqui descritos, podem ser quaisquer dos conhecidos de um versado na técnica e incluem, por exemplo, vírus de estomatite vesicular, ver, por exemplo, patentes US n° Pat. 7.731.974, 7.153.510, 6.653.103 e publicações de patente US n° 2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 e patentes EP n° 1385466, 1606411 e 1520175; vírus herpes simplex, ver, por exemplo, patentes US n° 7.897.146, 7.731.952, 7.550.296, 7.537.924, 6.723.316, 6.428.968 e publicações de patente US n° 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147,
2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604,
2004/0063094, publicações de patente internacional n° WO 2007/052029, WO 1999/038955; retrovirus, ver, por exemplo, patentes US n° 6.689.871, 6.635.472, 5.851.529, 5.716.826, 5.716.613 e publicações de patente US n° 20110212530; vírus Vaccinia, ver, por exemplo, 2016/0339066, e vírus adenoassociados, ver, por exemplo, patentes Us n° 8.007.780, 7.968.340, 7.943.374, 7.906.111, 7.927.585, 7.811.814, 7.662.627, 7.241.447, 7.238.526, 7.172.893, 7.033.826, 7.001.765, 6.897.045 e 6.632.670.
[00492] Os vírus oncolíticos também incluem vírus que foram geneticamente alterados para atenuar sua virulência, melhorar seu perfil de segurança, aumentar sua especificidade tumoral e também foram equipados com genes adicionais, por exemplo, citotoxinas, citocinas, pró-drogas que convertem enzimas para melhorar a eficácia geral dos vírus (ver, por exemplo, Kirn et al., (2009) Nat Rev Câncer 9: 64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12: 403-411; ver patentes US n° 7.588.767, 7.588.771, 7.662.398 e 7.754.221 e publicações de patente US n° 2007/0002572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244,
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2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288,
2010/0196325, 2009/0136917 e 2011/0064650). Em algumas modalidades, os vírus oncolíticos podem ser aqueles que foram modificados de modo a replicarem-se seletivamente em células cancerígenas e, assim, são oncolíticos. Por exemplo, o vírus oncolítico é um adenovirus que foi modificado para ter tropismo modificado para terapia tumoral e também como vetores de terapia genética. Exemplificativos de tal são ONYX-015, H101 e Ad5ACD (Hallden e Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16: 945-58) e TNFerade (McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12: 825-30), ou um adenovirus condicionalmente replicativo Oncorine®.
[00493] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus de herpes simplex modificado. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma versão modificada de Talimogene laherparepvec (também conhecida como T-Vec, Imlygic ou OncoVex GM-CSF), que é modificada para conter ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui descritos, tal como qualquer dos polipeptídeos variantes CD80 ou proteínas imunomoduladoras aqui descritas. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus de herpes simplex modificado que é descrito, por exemplo, nos documentos WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216 ou variantes do mesmo. [00494] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus que tem como alvo um tipo particular de células em um indivíduo ao qual se administra o vírus, por exemplo, um vírus que tem como alvo células imunológicas ou células apresentadoras de antígenos (APC). As células dendríticas (DCs) são APCs essenciais para a iniciação e controle das respostas imunológicas. As DCs podem capturar e processar antígenos, migrar da periferia para um órgão linfóide e apresentar os antígenos às células T em repouso em um modo restrito ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus que pode especificamente dirigir DCs para distribuir ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos CD80 variantes ou proteínas imunomoduladoras para expressão em DCs. Em algumas modalidades, o vírus é um lentivírus ou uma variante ou derivado do mesmo, tal como um vetor lentiviral deficiente em integração.
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Em algumas modalidades, o vírus é um lentivírus que é pseudotipado para se ligar eficientemente e infectar de modo produtivo células que expressam a não integrina (DC-SIGN) da molécula de adesão intercelular específica de célula dendrítica (DC-SIGN), tal como DCs. Em algumas modalidades, o vírus é um lentivírus pseudotipado com uma glicoproteína E2 do vírus Sindbis ou sua forma modificada, tal como os descritos no documento WO 2013/149167. Em algumas modalidades, o vírus permite a entrega e expressão de uma sequência de interesse (por exemplo, um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes ou proteínas imunomoduladoras aqui descritas) a uma CD. Em algumas modalidades, o vírus inclui aqueles descritos em WO 2008/011636 ou US 2011/0064763, Tareen et al. (2014) Mol. Ther., 22: 575-587, ou suas variantes. Exemplo de uma plataforma de vetor trópico de células dendríticas é o ZVex™.
2. Bactérias [00495] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria. Por exemplo, em algumas modalidades, as bactérias podem administrar ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui descritos, por exemplo, polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora, a uma célula-alvo no indivíduo, tal como uma célula tumoral, uma célula imunológica, uma célula apresentadora de antígeno e/ou uma célula fagocítica. Em algumas modalidades, a bactia pode ser preferencialmente direcionada para um ambiente específico em um indivíduo, tal como um microambiente tumoral (TME), para expressão e/ou secreção dos polipeptídeos imunomoduladores variantes e/ou para células específicas no ambiente para expressão dos polipeptídeos imunomoduladores variantes.
[00496] Em algumas modalidades, a bactéria fornece os ácidos nucleicos às células por meio de transferência mediada por bactérias de DNA plasmídico para células de mamífero (também referidas como bactofecção). Por exemplo, em algumas modalidades, a entrega de material genético é conseguida através da entrada de toda a bactéria em células-alvo. Em algumas modalidades, a lise bacteriana espontânea ou induzida pode conduzir à liberação de plasmídeo para expressão celular eucariótica subse
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286/474 quente. Em algumas modalidades, a bactéria pode fornecer ácidos nucleicos a células de mamífero não fagocíticas (por exemplo, células de tumor) e/ou a células fagocíticas, por exemplo, certas células imunes e/ou APCs. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos fornecidos pela bactéria podem ser transferidos para o núcleo da célula no indivíduo para expressão. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos também incluem sequências de ácido nucleico apropriadas necessárias para a expressão das sequências operacionalmente ligadas que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes em uma célula hospedeira particular, por exemplo, elementos reguladores tais como promotores ou intensificadores. Em algumas modalidades, o agente infeccioso que é uma bactéria pode fornecer ácidos nucleicos que codificam as proteínas imunomoduladoras na forma de um RNA, tal como um RNA pré-fabricado competente para tradução entregue ao citoplasma da célula-alvo para tradução pelas células-alvo maquinaria.
[00497] Em algumas modalidades, a bactéria pode replicar e lisar as células-alvo, por exemplo, células tumorais. Em algumas modalidades, a bactéria pode conter e/ou libertar sequências de ácido nucleico e/ou produtos genéticos no citoplasma das células-alvo, matando assim a célula-alvo, por exemplo, célula tumoral. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria que pode replicar-se especificamente em um ambiente particular no indivíduo, por exemplo, microambiente tumoral (TME). Por exemplo, em algumas modalidades, a bactéria pode replicar-se especificamente em microambientes anaeróbicos ou hipóxicos. Em algumas modalidades, as condições ou os fatores presentes em ambientes particulares, por exemplo, aspartato, serina, citrato, ribose ou galactose produzidos por células na TME, podem atuar como quimioatrativos para atrair a bactéria ao meio ambiente. Em algumas modalidades, a bactéria pode expressar e/ou segregar as proteínas imunomoduladoras aqui descritas no ambiente, por exemplo, TME.
[00498] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é uma bactéria que é uma Listeria sp., uma Bifidobacterium sp., uma Escherichia sp., uma Clostridium sp., uma Salmonella sp., uma Shigella sp., uma Vibrio sp. ou uma Yersinia sp. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada entre
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287/474 uma ou mais de Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Vibrio cholera, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Clostridium novyi, Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium adolescentis. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria manipulada. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria manipulada como as descritas em, por exemplo, Seow e Wood (2009) Molecular Therapy 17 (5): 767-777; Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394; Patyar et al. (2010) J Biomed Sci 17:21; Tangney et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287; van Pijkeren et al. (2010) Hum Gene Ther. 21 (4):405-416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/0293705; US 2015/0359909 e EP 3020816. A bactéria pode ser modificada para entregar sequências de ácido nucleico codificando qualquer um dos polipeptídeos, conjugados e/ou fusão imunomoduladores variantes aqui proporcionados e/ou para expressar tais polipeptídeos imunomoduladores variantes no indivíduo.
F. Ácidos Nucleicos, Vetores e Métodos para Produzir os Polipeptídeos ou Células [00499] São aqui fornecidos ácidos nucleicos isolados ou recombinantes colectivamente referidos como ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das várias modalidades proporcionadas dos polipeptídeos CD80 variantes ou polipeptídeos imunomoduladores aqui proporcionados. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos aqui proporcionados, incluindo todos os descritos abaixo, são úteis na produção recombinante (por exemplo, expressão) de polipeptídeos CD80 variantes ou polipeptídeos imunomoduladores aqui proporcionados. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos aqui proporcionados, incluindo todos os descritos abaixo, são úteis na expressão de polipeptídeos CD80 variantes ou polipeptídeos imunomoduladores aqui proporcionados em células, tais como em células manipuladas, por exemplo, células imunológicas ou células de agente infeccioso. Os ácidos nucleicos aqui proporcionados podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA e incluem mRNA, cRNA, RNA e DNA recombinante ou sintético e cDNA. Os ácidos nucleicos aqui proporcionados são tipicamente moléculas de DNA e
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288/474 usualmente moléculas de DNA de cadeia dupla. Contudo, DNA de cadeia simples, RNA de cadeia simples, RNA de cadeia dupla e ácidos nucleicos híbridos de DNA/RNA ou suas combinações compreendendo qualquer uma das sequências nucleotídicas da invenção também são proporcionados. [00500] Também são aqui proporcionados vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes úteis na produção dos polipeptídeos variantes CD80 ou polipeptídeos imunomoduladores aqui proporcionados.
[00501] São também aqui fornecidas células manipuladas, tais como células imunológicas manipuladas, contendo qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores fornecidos, tais como qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores transmembranares ou polipeptídeos imunomoduladores secretáveis.
[00502] São também aqui fornecidos agentes infecciosos, tais como células bacterianas ou virais, contendo qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores fornecidos, tais como qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores transmembranares ou polipeptídeos imunomoduladores secretáveis.
[00503] Em qualquer das modalidades proporcionadas acima, os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos imunomoduladores aqui proporcionados podem ser introduzidos em células utilizando DNA recombinante e técnicas de clonagem. Para o fazer, prepara-se uma molécula de DNA recombinante que codifica um polipeptídeo imunomodulador. Os métodos de preparação de tais moléculas de DNA são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências que codificam os peptideos podem ser excisadas do DNA utilizando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, a molécula de DNA pode ser sintetizada usando técnicas de síntese química, como o método da fosforamidita. Além disso, uma combinação dessas técnicas podería ser usada. Em alguns casos, um ácido nucleico recombinante ou sintético pode ser gerado através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas modalidades, uma inserção de DNA pode ser gerada codificando um ou mais polipeptídeos CD80 variantes contendo pelo menos um domínio IgSF modificada por afinidade e, em algumas modalidades, um
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289/474 peptídeo sinal, um domínio transmembranar e/ou um endodomínio de acordo com a descrição fornecida. Esta inserção de DNA pode ser clonada em um vetor de transdução/transfecção apropriado como é conhecido pelos especialistas na técnica. Também são fornecidos vetores de expressão contendo as moléculas de ácido nucléico.
[00504] Em algumas modalidades, os vetores de expressão são capazes de expressar as proteínas imunomoduladoras em uma célula apropriada sob condições adequadas à expressão da proteína. Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico ou um vetor de expressão compreende a molécula de DNA que codifica a proteína imunomoduladora operacionalmente ligada a sequências de controle de expressão adequadas. Os métodos para efectuar esta ligação operativa, antes ou depois da molécula de DNA ser inserida no vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, estimuladores, operadores, sítios de ligação ribossomal, sinais de início, sinais de parada, sinais cap, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle da transcrição ou tradução.
[00505] Em algumas modalidades, a expressão da proteína imunomoduladora é controlada por um promotor ou potenciador para controlar ou regular a expressão. O promotor está operacionalmente ligado à porção da molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivamente ativo (tal como um promotor constitutivamente ativo específico do tecido ou outro promotor constitutivo). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor indutível, que pode ser responsive a um agente indutor (tal como um sinal de ativação de células T).
[00506] Em algumas modalidades, um promotor constitutivo está operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora. Promotores constitutivos exemplificativos incluem o promotor do vírus vacuolante símio 40 (SV40), o promotor do citomegalovírus (CMV), o promotor da ubiquitina C (UbC) e o promotor EF-1 alfa (EF1a). Em algumas modalidades, o promotor constitutivo é específico do tecido. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor
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290/474 permite a expressão constitutiva da proteína imunomoduladora em tecidos específicos, tais como células imunes, linfócitos ou células T. Promotores específicos de tecido exemplificativas são descritos na patente US n° 5.998.205, incluindo, por exemplo, uma promotora de fetoproteína, DF3, tirosinase, CEA, proteína surfactante e ErbB2.
[00507] Em algumas modalidades, um promotor indutível está operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo variante ou proteína imunomoduladora, de tal modo que a expressão do ácido nucleico é controlável controlando a presença ou ausência do indutor de transcrição apropriado. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor regulado e um sistema de expressão de fator de transcrição, tais como os sistemas publicados regulados por tetraciclina ou outros sistemas reguláveis (ver, por exemplo, publicado no pedido PCT internacional n° WO 01/30843), para permitir a expressão regulada do polipeptídeo codificado. Um sistema promotor regulável exemplificative é o sistema Tet-On (e Tet-Off) disponível, por exemplo, da Clontech (Paio Alto, CA). Este sistema promotor permite a expressão regulada do transgene controlado por derivados de tetraciclina ou tetraciclina, tal como doxiciclina. São conhecidos outros sistemas de promotores reguláveis (ver, por exemplo, o pedido de patente US 2002-0168714 publicado, intitulado Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches, que descreve comutações genéticas que contêm domínios de ligação de ligantes e domínios reguladores transcricionais, como os dos receptores hormonais).
[00508] Em algumas modalidades, o promotor é responsive a um elemento que responde à sinalização de ativação de células T. Apenas a título de exemplo, em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um vetor de expressão que codifica a proteína imunomoduladora e um promotor operacionalmente ligado para controlar a expressão da proteína imunomoduladora. A célula T manipulada pode ser ativada, por exemplo, sinalizando através de um receptor de células T (TCR) manipulado ou de um repressor de antígeno quimérico (CAR), desencadeando desse modo a expressão e a secreção da proteína imunomoduladora através do promotor responsive.
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291/474 [00509] Em algumas modalidades, um promotor indutível está operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico que codifica a proteína imunomoduladora, de tal modo que a proteína imunomoduladora é expressa em resposta a um fator nuclear de células T ativadas (NFAT) ou ao fator nuclear potenciador da cadeia leve capa de células B ativadas (NF-κΒ). Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor indutível compreende um local de ligação para NFAT ou NF-kB. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor é um promotor NFAT ou NF-kB ou uma variante funcional da mesma. Assim, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos tomam possível controlar a expressão da proteína imunomoduladora ao mesmo tempo que também reduzem ou eliminam a toxicidade da proteína imunomoduladora. Em particular, as células imunológicas manipuladas compreendendo os ácidos nucleicos da invenção expressam e segregam a proteína imunomoduladora apenas quando a célula (por exemplo, um receptor de células T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) expresso pela célula) é especificamente estimulada por um antígeno e/ou a célula (por exemplo, a via de sinalização de cálcio da célula) estimulada de forma não especica por, por exemplo, acetato de miristato de forbol (PMA)/ioninina. Consequentemente, a expressão e, em alguns casos, a secreção de proteína imunomoduladora pode ser controlada para ocorrer somente quando e onde for necessária (por exemplo, na presença de um agente causador de doença infecciosa, câncer ou em um local do tumor), que pode diminuir ou evitar interações de proteína imunomoduladoras indesejadas.
[00510] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma proteína imunomoduladora aqui descrita compreende uma sequência nucleotídica adequada que codifica um promotor NFAT, um promotor NF-B ou uma variante funcional da mesma. Promotor NFAT, como aqui utilizado, significa um ou mais elementos responsivos a NFAT ligados a um promotor mínimo. Promotor NF-kB refere-se a um ou mais elementos responsivos a NF-kB ligados a um promotor mínimo. Em algumas modalidades, o promotor mínimo de um gene é um promotor mínimo de IL-2 humana ou um promotor de CMV. Os elementos responsivos NFAT podem compreender, por exemplo, elementos responsivos NFAT1, NFAT2, NFAT3 e/ou NFAT4. O promo
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292/474 tor NFAT, promotor NF-B ou uma variante funcional da mesma pode compreender qualquer número de motivos de ligação, por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou até doze motivos de ligação.
[00511] O vetor de expressão recombinante resultante possuindo a molécula de DNA é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um ácido nucleico aqui fornecido compreende ainda uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo secretor ou de sinal operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo imunomodulador, de modo que um polipeptídeo imunomodulador solúvel resultante seja recuperado do meio de cultura, célula hospedeira ou periplasma de célula hospedeira. Em outras modalidades, os sinais de controle de expressão apropriados são escolhidos para permitir a expressão na membrana de um polipeptídeo imunomodulador. Além disso, kits disponíveis comercialmente, bem como empresas de fabricação sob contrato, também podem ser utilizados para fabricar células manipuladas ou células hospedeiras recombinantes aqui fornecidas.
[00512] Em algumas modalidades, o vetor de expressão resultante possuindo a molécula de DNA é usado para transformar, tal como transduzir, uma célula apropriada. A introdução pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos exemplificativos incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos que codificam os receptores, incluindo através de transdução viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução e eletroporação. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é transferido para células por métodos de transdução lentivíricos ou retrovirais.
[00513] Qualquer um de um grande número de células hospedeiras de mamífero bem conhecidas e disponíveis publicamente, incluindo células T de mamífero ou APC, pode ser utilizado na preparação dos polipeptídeos ou células manipuladas. A seleção de uma célula depende de vários fatores reconhecidos pela técnica. Estes incluem, por exemplo, compatibilidade com
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293/474 o vetor de expressão escolhido, toxicidade dos peptideos codificados pela molécula de DNA, velocidade de transformação, facilidade de recuperação dos peptideos, características de expressão, biossegurança e custos. Um equilíbrio desses fatores deve ser atingido com o entendimento de que nem todas as células podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma sequência particular de DNA.
[00514] Em algumas modalidades, as células hospedeiras podem ser uma variedade de células eucarióticas, tal como em células de levedura, ou com células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou HEK293. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula em suspensão e o polipeptídeo é manipulado ou produzido em suspensão cultivada, tal como em células CHO em suspensão de cultura, por exemplo, células CHO-S. Em alguns exemplos, a linha celular é uma linha de células CHO que é deficiente em DHFR (DHFR), como DG44 e DUXB11. Em algumas modalidades, a célula é deficiente em glutamina sintase (GS), por exemplo, células CHO-S, células SV CHOK1 e células CHOZN ((R)) GS/-. Em algumas modalidades, as células CHO, tais como células CHO em suspensão, podem ser células CHO-S-2H2, células CHO-S-clone 14 ou células ExpiCHO-S.
[00515] Em algumas modalidades, as células hospedeiras também podem ser células procarióticas, tal como com E. coli. O hospedeiro recombinante transformado é cultivado sob condições que expressam o polipeptídeo e depois purificado para obter uma proteína solúvel. As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os polipeptídeos desejados sejam expressos. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os polipeptídeos aqui proporcionados podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica, incluindo sulfato de amônio ou precipitação com etanol, extração ácida, ânion ou cromatografia de permuta catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de afinidade. As etapas de redobragem de proteínas podem ser utilizadas, conforme desejado, para completar a configuração da proteí
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294/474 na madura. Finalmente, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada nas etapas finais de purificação.
[00516] Em algumas modalidades, a célula é uma célula imunológica, tal como qualquer descrita acima em relação ao preparamento de células manipuladas. Em algumas modalidades, essas células manipuladas são células primárias. Em algumas modalidades, as células manipuladas são autólogas ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células manipuladas são alogênicas ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células manipuladas são obtidas a partir de um indivíduo, tal como por leucaferese, e transformadas ex vivo para expressão do polipeptídeo imunomodulador, por exemplo, polipeptídeo imunomodulador transmembranar ou polipeptídeo imunomodulador secretável.
[00517] São também fornecidos ácidos nucleicos codificando qualquer um dos polipeptídeos imunomoduladores variantes contidos em agentes infecciosos aqui descritos. Em algumas modalidades, os agentes infecciosos distribuem os ácidos nucleicos a uma célula no indivíduo e/ou permitem a expressão dos polipeptídeos variantes codificados na célula. Também são fornecidos ácidos nucleicos que são usados para gerar, produzir ou modificar tais agentes infecciosos. Por exemplo, em algumas modalidades, são fornecidos vetores e/ou plasmídeos que contêm ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes, para a geração dos agentes infecciosos, entrega às células em um indivíduo e/ou expressão dos polipeptídeos imunomoduladores variantes nas células no assunto.
[00518] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos fornecidos são vetores virais ou bacterianos recombinantes contendo sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes. Em algumas modalidades, os vetores recombinantes podem ser utilizados para produzir um agente infeccioso que contém sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes e/ou para serem entregues a uma célula-alvo no indivíduo para expressão pela célula-alvo. Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor de expressão. Em algumas modalidades, o vetor recombinante inclui sequências apropriadas necessárias para a geração e/ou produção do agente infeccioso e ex
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295/474 pressão na célula-alvo.
[00519] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um plasmídeo ou cosmídeo. Plasmídeo ou cosmídeo contendo sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos imunomoduladores variantes, como aqui descrito, são prontamente construídos utilizando técnicas padrão bem conhecidas na técnica. Para geração do agente infeccioso, o vetor ou genoma pode ser construído em uma forma de plasmídeo que pode então ser transfectado para uma linhagem celular de empacotamento ou produtor ou uma bactéria hospedeira. Os vetores recombinantes podem ser gerados utilizando qualquer uma das técnicas recombinantes conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, os vetores podem incluir uma origem de replicação procariica e/ou um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecionável, tal como uma resistência a fármaco para propagação e/ou seleção em sistemas procarióticos.
[00520] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor viral. Os vetores virais recombinantes exemplificativos incluem um genoma de vetor lentiviral, genoma de vetor de poxvus, genoma de vetor de vírus Vaccinia, genoma de vetor de adenovirus, genoma de vetor de vírus associado a adenovirus, genoma de vetor de vírus da herpes e genoma de vetor de vírus alfa. Os vetores virais podem ser vivos, atenuados, de replicação condicional ou replicação deficiente, não patogênicos (defeituoso), vetor viral competente para replicação, e/ou são modificados para expressar um produto genético heterólogo, por exemplo, os polipeptídeos imunomoduladores variantes aqui fornecidos. Os vetores para geração de vírus também podem ser modificados para alterar a atenuação do vírus, o que inclui qualquer método de aumentar ou diminuir a carga transcricional ou translacional.
[00521] Os vetores virais exemplificativos que podem ser utilizados incluem vetores de vírus Vaccinia modificados (ver, por exemplo, Guerra et al., J. Virol.80: 985-98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992); Gheradi et al, J. Gen. Virol. 86: 2925-36 (2005); Mayr et al., Infection 3: 6-14 (1975); Hu et al., J. Virol. 75: 10300-308 (2001); patentes US n° 5.698.530, 6.998.252, 5.443.964, 7.247.615 e 7.368.116); vetor de adenovirus ou vetores de vírus associados a adenovirus (ver, por
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296/474 exemplo, Molin et al., J. Virol.72: 8358-61 (1998); Narumi et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19: 936-41 (1998); Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101: 6188-93 (2004); patentes US n° 6.143.290; 6.596.535; 6.855.317; 6.936.257; 7.125.717; 7.378.087; 7.550.296); vetores retrovirais, incluindo os baseados no virus da leucemia de murino (MuLV), virus da leucemia do macaco gibano (GaLV), retrovus ecotricos, vírus da imunodeficicia símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (VIH) e combinações (ver, por exemplo, Buchscher et al. J. Virol. 66: 2731 a 39 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635-40 (1992); Sommerfelt et al., Virology 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-78 (1989); Miller et al, J. Virol.65: 2220-24 (1991); Miller e outros, Mol. Cell Biol. 10: 4239 (1990); Kolberg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta et al. Hum.Gene Ther. 2: 215 (1991)); vetores lentivirais, incluindo aqueles baseados no Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1), HIV-2, virus da imunodeficiência felina (FIV), virus da anemia infecciosa equina, virus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus maedi/visna (ver, por exemplo, Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet 2: 177-211 (2001); Zufferey et al, J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi et al, J. Virol. 72: 8150, 1998; Philpott e Thrasher, Human Gene Therapy 18: 483, 2007; Engelman et al, J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale et al. Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown et al., J. Virol. 73: 9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams et al, J. Virol. 77: 11150, 2003; Powell et al, J. Virol. 70: 5288, 1996) ou quaisquer variantes do mesmo e/ou vetores que possam ser utilizados para gerar qualquer um dos vírus descritos acima. Em algumas modalidades, o vetor recombinante pode incluir sequências reguladoras, tais como sequências promotoras ou potenciadoras, que podem regular a expressão do genoma viral, tal como no caso de vírus de RNA, na linhagem celular de empacotamento (ver, por exemplo, 5.355.839 e 5.168.062).
[00522] Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão que permite a expressão do produto genético codificado quando entregue na célula-alvo, por exemplo, uma célula no indivíduo, por exemplo, uma célula tumoral, uma célula imunológica e/ou um APC. Em algumas modalidades, os vetores de expressão
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297/474 recombinantes contidos no agente infeccioso são capazes de expressar as proteínas imunomoduladoras na célula-alvo no indivíduo, sob condições adequadas à expressão da proteína.
[00523] Em alguns aspectos, ácidos nucleicos ou um vetor de expressão compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína imunomoduladora operacionalmente ligada a sequências de controle de expressão apropriadas. Modos de afetar esta ligação operativa, quer antes ou após a sequência de ácido nucleico codificando a proteína imunomoduladora inserida no vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, estimuladores, operadores, sítios de ligação ribossomal, sinais de início, sinais de parada, sinais cap, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle da transcrição ou tradução. O promotor pode estar operacionalmente ligado à porção da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivamente ativo na célula-alvo (tal como um promotor constitutivamente ativo específico do tecido ou outro promotor constitutivo). Por exemplo, o vetor de expressão recombinante também pode incluir elementos reguladores da transcrição específicos do tecido linfoide (TRE), tais como um linfócito B, linfócito T ou TRE específica de células dendríticas. TREs específicos do tecido linfoide são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1043-53 (1992); Todd et al. J. Exp. Med. 177: 1663-74 (1993); Penix et al. J. Exp. Med. 178: 1483-96 (1993)). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor indutível, que pode ser responsive a um agente indutor (tal como um sinal de ativação de células T). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos distribuídos à célula-alvo no indivíduo, por exemplo, célula tumoral, célula imunológica e/ou APC, podem ser operacionalmente ligados a qualquer dos elementos reguladores descritos acima.
[00524] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor bacteriano, por exemplo, um plasmídeo ou cosmídeo bacteriano. Em algumas modalidades, o vetor bacteriano é entregue à célula-alvo, por exemplo, células tumorais, células imunes e/ou APCs, através de transferência de DNA plasmidial mediada por bactérias para células de mamíferos (também referida como bac
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298/474 tofecção). Em algumas modalidades, o vetor bacteriano entregue também contém sequências de controle de expressão adequadas para expressão nas células-alvo, tais como uma sequência promotora e/ou sequências potenciadoras, ou quaisquer sequências reguladoras ou de controle descritas acima. Em algumas modalidades, o vetor bacteriano contém sequências de controle de expressão apropriadas para expressão e/ou secreção dos polipeptídeos variantes codificados no agente infeccioso, por exemplo, a bactéria.
[00525] Em algumas modalidades, os polipeptídeos aqui proporcionados podem também ser feitos por métodos sintéticos. A síntese em fase sólida é a técnica preferencial para produzir peptídeos individuais, uma vez que é o método mais eficaz em termos de custos para produzir pequenos peptídeos. Por exemplo, técnicas de síntese em fase sólida bem conhecidas incluem a utilização de grupos protetores, ligantes e suportes em fase sólida, bem como condições de reação específica de proteção e desproteção, condições de divagem de ligação, utilização de sequestrantes e outros aspectos da síntese de peptídeos em fase sólida. Os peptídeos podem então ser reunidos nos polipeptídeos como aqui proporcionados.
IV. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MODULAÇÃO IMUNOLÓGICA DE POLIPEPTÍDEOS CD80 VARIANTES E DE PROTEÍNAS IMUNOMODULADORAS [00526] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados (fragmentos ou conjugados de comprimento total e/ou específico, construções de pilha ou sua fusão ou células manipuladas) exibem atividade imunomoduladora para modular a ativação de células T. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 modulam a expressão de IFNgama em um ensaio de células T relativamente a um controle de CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em alguns casos, a modulação da expressão de IFN-gama pode aumentar ou diminuir a expressão de IFN-gama em relação ao controle. Os ensaios para determinar a ligação específica e a expressão de IFN-gama são bem conhecidos na técnica e incluem os ensaios de MLR (reação de linfócitos mistos) medindo os níveis de citocina do interferon gama nos sobrenadantes da cultura (Wang et al., Cancer Immunol
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Res. 2014 Set: 2 (9): 846-56), ensaio de estimulação de células T SEB (enterotoxina estafilócica B) (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2 (9): 846-56) e ensaios de estimulação de células T anticD3 (Li e Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104).
[00527] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante pode, em algumas modalidades, aumentar ou, em modalidades alternativas, diminuir a expressão de IFN-gama (interferon gama) em um ensaio de células T primárias relativamente a um controle de CD80 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, essa atividade pode depender se o polipeptídeo CD80 variante é fornecido em uma forma de atividade antagonista ou em uma forma de atividade agonista. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora é um antagonista do receptor inibidor, tal como bloqueia um sinal inibitório na célula que pode ocorrer para diminuir a resposta a um estímulo de ativação, por exemplo, sinal coestimulatório de CD3 e/ou CD28 ou sinal mitogênico. Os versados reconhecerão que existem diferentes formatos do ensaio de células T primárias utilizadas para determinar um aumento ou diminuição da expressão de IFN-gama.
[00528] No ensaio da capacidade de um CD80 variante para aumentar ou diminuir a expressão de IFN-gama em um ensaio de células T primárias, pode ser utilizado um ensaio de Reação de Linfócitos Mistos (MLR). Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora fornecida na forma antagonista, tal como forma solúvel, por exemplo, variante CD80-Fc ou proteína imunomoduladora secretável, bloqueia a atividade do receptor inibidor de CTLA-4 ou PD-L1 e aumenta assim a atividade de MLR no ensaio, tal como observado pelo aumento da produção de IFN-gama no ensaio. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora fornecida na forma de agonista, tal como uma pilha ou conjugado de localização de vlgD contendo uma porção localizadora de tumor ou uma célula manipulada expressando uma proteína imunomoduladora transmembranar tal como fornecida, pode estimular a atividade do receptor inibitório CTLA-4 e, assim, diminuir a atividade MLR, tal como evidenciado pela diminuição da produção de IFN-gama. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora forne
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300/474 cida na forma de agonista, tal como uma pilha ou conjugado de localização de vlgD contendo uma porção localizadora de tumor ou uma célula manipulada expressando uma proteína imunomoduladora transmembranar tal como fornecida, pode bloquear a atividade do receptor inibitório CTLA-4 e, desse modo, aumentar a atividade de MLR, tal como aumentar a produção de IFNgama.
[00529] Alternativamente, no ensaio da capacidade de um CD80 variante para modular um aumento ou diminuição da expressão de IFN-gama em um ensaio de células T primárias, pode ser utilizado um ensaio de coimobilização. Em um ensaio de coimobilização, um sinal de TCR, fornecido em algumas modalidades pelo anticorpo anticD3, utilizado em conjunto com um CD80 variante imobilizada para determinar a capacidade de aumentar ou diminuir a expressão de IFN-gama relativamente a um CD80 não modificado ou controle de tipo selvagem. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora, por exemplo, um CD80 variante imobilizada (por exemplo, CD80-Fc), aumenta a produção de IFN-gama em um ensaio de coimobilização.
[00530] Em algumas modalidades, no ensaio da capacidade de um CD80 variante para modular um aumento ou diminuição da expressão de IFN-gama, pode-se utilizar um ensaio de repórter de células T. Em algumas modalidades, a célula T é uma linha de células T Jurkat ou é derivada de linhas de células T Jurkat. Nos ensaios repórter, a linha celular repórter (por exemplo, célula repórter Jurkat) também é gerada para sobre-expressar um receptor inibidor que é o parceiro de ligação cognato do polipeptídeo do domínio IgSF variante. Por exemplo, no caso de um CD80 variante, a linha celular repórter (por exemplo, célula repórter Jurkat) é gerada para sobreexpressar CTLA-4. Em algumas modalidades, as células T repórter também contêm um construto repórter contendo um promotor indutível que responde à ativação de células T operacionalmente ligada a um repórter. Em algumas modalidades, o repórter é um repórter fluorescente ou luminescente. Em algumas modalidades, o repórter é luciferase. Em algumas modalidades, o promotor é responsive à sinalização de CD3. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor NFAT. Em algumas modalidades, o promotor res
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301/474 ponde à sinalização coestimulatória, por exemplo, sinalização coestimulatória de CD28. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de IL-2.
[00531] Em aspectos de um ensaio repórter, uma linha celular repórter é estimulada, tal como por coincubação com células apresentadoras de antigeno (APCs) expressando o ligando do tipo selvagem do receptor inibidor, por exemplo, CD80. Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais. APCs artificiais são bem conhecidas de um versado. Em algumas modalidades, as APC artificiais são derivadas de uma ou mais linhagens celulares de mamífero, tal como células K562, CHO ou 293. Em algumas modalidades, as APCs artificiais são manipuladas para expressar um anticorpo anticD3 e, em alguns casos, um ligando coestimulatório. Em algumas modalidades, a APC artificial é gerada para sobrexpressar o parceiro de ligação cognato do polipeptídeo do domínio IgSF variante. Por exemplo, no caso de um CD80 variante, a linha celular repórter (por exemplo, célula repórter Jurkat) é gerada para sobrexpressar o ligando inibidor PD-L1.
[00532] Em algumas modalidades, as células repórter Jurkat são coincubadas com APCs artificiais que sobre-expressam o ligando inibidor na presença da molécula do domínio IgSF variante ou proteína imunomoduladora, por exemplo, polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora. Em algumas modalidades, a expressão de repórter é monitorizada, tal como através da determinação da luminescência ou fluorescência das células. Em algumas modalidades, as interações normais entre o seu receptor inibidor e ligando resultam em uma repressão ou diminuição do sinal repórter, tal como comparado ao controle, por exemplo, expressão repórter por coincubação de células T de controle e APCs em que o receptor inibidor e a interação do ligante não estão presentes, por exemplo, APCs que não expressam em excesso o CD80. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora fornecida aqui antagoniza a interação, por exemplo, quando fornecida na forma solúvel como um CD80 variante-Fc ou quando expressa a partir da APC como uma proteína imunomoduladora secretável, resultando assim em um aumento do repórter sinal em comparação com a ausência do polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora. Em certas modalidades aqui proporcionadas, um polipep
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302/474 tídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora medeia o agonismo de CD28, tal como coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, por exemplo quando fornecido na forma solúvel como um CD80 variante-Fc, resultando assim em um aumento do repórter sinal em comparação com a ausência do polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora. Em alguns casos, certos formatos de um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora, como aqui fornecido, podem proporcionar uma atividade agonista de um receptor inibidor, diminuindo assim a expressão de repórter em comparação com a ausência do polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora.
[00533] A utilização de controles apropriados conhecida dos versados na técnica, no entanto, nas modalidades acima mencionadas, um controle envolve tipicamente a utilização do CD80 não modificado, tal como uma isoforma CD80 de tipo selvagem da mesma espécie de mamífero a partir da qual a variante O CD80 foi derivado ou desenvolvido. Em algumas modalidades, o CD80 nativo ou nativo é da mesma forma ou forma correspondente que a variante. Por exemplo, se o CD80 variante é uma forma solúvel contendo um ECD variante fundido a uma proteína Fc, então o controle é uma forma solúvel contendo o ECD de tipo selvagem ou nativo de CD80 fundido com a proteína Fc. Independentemente de a afinidade de ligação e/ou seletividade para uma ou mais de CTLA-4 e CD80 estar aumentada ou diminuída, um CD80 variante, em algumas modalidades, aumentará a expressão de IFN-gama e, em modalidades alternativas, diminuirá a expressão de IFNgama em um ensaio de células T relativo a um controle de CD80 de tipo selvagem.
[00534] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora aumenta a expressão de IFN-gama (isto é, expressão de proteína) relativamente a um controle de CD80 de tipo selvagem ou modificado em pelo menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou superior. Em outras modalidades, um CD80 variante ou proteína imunomoduladora diminui a expressão de IFN-gama (isto é, expressão proteica) relativamente a um controle de CD80 de tipo selvagem ou não modificado em pelo menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%,
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90% ou superior. Em algumas modalidades, o controle de CD80 de tipo selvagem é CD80 de murídeo, tal como seria tipicamente utilizado para um CD80 variante alterado em sequência daquela de uma sequência CD80 murina de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o controle de CD80 de tipo selvagem CD80 humano, tal como seria tipicamente utilizado para um CD80 variante alterada em sequência daquela de uma sequência CD80 humana de tipo selvagem correspondente, tal como uma sequência CD80 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 150 ou SEQ ID NO: 3030 ou SEQ ID NO: 3031.
V. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS [00535] São aqui fornecidas composições contendo qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes, proteínas imunomoduladoras, conjugados, células manipuladas ou agentes infecciosos aqui descritos. A composição farmacêutica pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmactica pode conter um ou mais excipientes para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em alguns aspectos, um versado na técnica compreende que uma composição farmacêutica contendo células pode diferir de uma composição farmacêutica contendo uma proteína.
[00536] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um sólido, tal como um pó, cápsula ou comprimido. Por exemplo, os componentes da composição farmacêutica podem ser liofilizados. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica sólida é reconstituída ou dissolvida em um líquido antes da administração.
[00537] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido, por exemplo, polipeptídeos CD80 variantes dissolvidos em uma solução aquosa (tal como solução salina fisiológica ou solução de Ringer). Em algumas modalidades, o pH da composição farmacêutica está entre cerca de 4,0 e cerca de 8,5 (entre cerca de 4,0 e cerca de 5,0, entre cerca de 4,5 e cerca de 5,5, entre cerca de 5,0 e cerca de 6,0, entre cerca de 5,5 e cerca
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304/474 de 6,5 6,0 e cerca de 7,0, entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, entre cerca de 7,0 e cerca de 8,0, ou entre cerca de 7,5 e cerca de 8,5).
[00538] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um enchimento, ligante, revestimento, conservante, lubrificante, agente aromatizante, agente edulcorante, agente corante, um solvente, um agente tamponante, um agente quelante ou estabilizante. Exemplos de cargas farmaceuticamente aceitáveis incluem celulose, fosfato de cálcio dibásico, carbonato de cálcio, celulose microcristalina, sacarose, lactose, glicose, manitol, sorbitol, maltol, amido pré-gelatinizado, amido de milho ou amido de batata. Exemplos de aglutinantes farmaceuticamente aceitáveis incluem polivinilpirrolidona, amido, lactose, xilitol, sorbitol, maltitol, gelatina, sacarose, polietilenoglicol, metilcelulose ou celulose. Exemplos de revestimentos farmaceuticamente aceitáveis incluem hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), goma-laca, proteína zeína de milho ou gelatina. Exemplos de desintegrantes farmaceuticamente aceitáveis incluem polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose ou amidoglicolato de sódio. Exemplos de lubrificantes farmaceuticamente aceitáveis incluem polietilenoglicol, estearato de magnésio ou ácido esteárico. Exemplos de conservantes farmaceuticamente aceitáveis incluem metilparabenos, etilparabenos, propilparabeno, ácido benzoico ou ácido sórbico. Exemplos de agentes edulcorantes farmaceuticamente aceitáveis incluem sacarose, sacarina, aspartame ou sorbitol. Exemplos de agentes tamponantes farmaceuticamente aceitáveis incluem carbonates, citratos, gluconatos, acetatos, fosfatos ou tartaratos.
[00539] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente para a liberação controlada ou sustentada do produto, tal como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas.
[00540] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é estéril. A esterilização pode ser realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis ou radiação. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser realizada antes ou depois da liofilização e reconstituição. A composição para administração parentérica pode ser
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305/474 armazenada na forma liofilizada ou em solução. Além disso, as composições parentéricas são geralmente colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00541] Em algumas modalidades, são fornecidas composições farmacêuticas contendo as proteínas imunomoduladoras transmembranares, incluindo células manipuladas expressando essas proteínas imunomoduladoras transmembranares. Em algumas modalidades, as composições e formulações farmacêuticas incluem um ou mais veículos ou excipientes opcionais farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são preferencialmente formuladas para administração intravenosa.
[00542] Tal formulação pode, por exemplo, estar em uma forma adequada para infusão intravenosa. Um transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável que está envolvido no transporte ou transporte de células de interesse de um tecido, órgão ou porção do corpo para outro tecido, órgão ou porção do corpo. Por exemplo, o transportador pode ser uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação, ou alguma combinação destes. Cada componente do transportador deve ser farmaceuticamente aceitável, pois deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Também deve ser adequado para o contato com qualquer tecido, órgão ou parte do corpo que possa encontrar, o que significa que não deve acarretar risco de toxicidade, irritação, reação alérgica, imunogenicidade ou qualquer outra complicação que supere em muito seus benefícios terapêuticos.
[00543] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um indivíduo. Geralmente, as dosagens e vias de administração
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306/474 da composição farmacêutica são determinadas de acordo com o tamanho e condição do indivíduo, de acordo com a prática farmacêutica padrão. Por exemplo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais tais como camundongos, ratos, coelhos, cães, porcos ou macacos. Um modelo animal também pode ser usado para determinar o intervalo de concentração apropriado e a via de administração. Tal informação pode então ser usada para determinar doses e vias úteis para administração em seres humanos. A dosagem exata será determinada à luz de fatores relacionados ao assunto que requer tratamento. Dosagem e administração são ajustadas para fornecer níveis suficientes do composto ativo ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em consideração incluem a gravidade do estado da doença, a saúde geral do indivíduo, a idade, o peso e o sexo do indivíduo, o tempo e a frequência da administração, a combinação (ou combinações) de fármacos, as sensibilidades à reação e a resposta à terapia.
[00544] As composições farmacêuticas de atuação prolongada podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, todas as semanas, ou quinzenalmente, dependendo da meia-vida e taxa de depuração da formulação particular. A frequência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da molécula na formulação utilizada. Tipicamente, uma composição administrada até ser alcançada uma dosagem que atinja o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, ou como doses múltiplas (nas mesmas ou diferentes concentrações/dosagens) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua. Um refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente feito. As dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados. Um número de biomarcadores ou marcadores fisiológicos para efeito terapêutico pode ser monitorado incluindo ativação ou proliferação de células T, síntese ou produção de citocinas (por exemplo, produção de TNF-a, IFN-γ, IL-2), indução de vários marcadores de ativação CD25, receptor de IL-2), inflamação, inchaço ou sensibilidade nas articulações, nível sérico de proteína Creativa, produção de anticorpo anticolágeno e/ou resposta (s) de anticorpo dependente de célula T.
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307/474 [00545] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um indivíduo através de qualquer via, incluindo oralmente, transdermicamente, por inalação, intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, aplicação direta a um local da ferida, aplicação a um local cirúrgico, intraperitonealmente, por supositório, subcutânea, intradérmica, transcutânea, por nebulização, intrapleuralmente, intraventricularmente, intra-articularmente, intraocularmente ou intraespinhal.
[00546] Em algumas modalidades, a dosagem da composição farmacêutica é uma dose única ou uma dose repetida. Em algumas modalidades, as doses são dadas a um indivíduo uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia, ou quatro ou mais vezes por dia. Em algumas modalidades, cerca de 1 ou mais (tal como cerca de 2 ou mais, cerca de 3 ou mais, cerca de 4 ou mais, cerca de 5 ou mais, cerca de 6 ou mais, ou cerca de 7 ou mais) doses são dadas em uma semana. Em algumas modalidades, doses múltiplas são dadas ao longo de dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, um ciclo de tratamento é de cerca de 1 ou mais doses (como cerca de 2 ou mais, cerca de 3 ou mais doses, cerca de 4 ou mais doses, cerca de 5 ou mais doses, cerca de 7 ou mais doses, cerca de 10 ou mais doses, cerca de 15 ou mais doses, cerca de 25 ou mais doses, cerca de 40 ou mais doses, cerca de 50 ou mais doses, ou cerca de 100 ou mais doses).
[00547] Em algumas modalidades, uma dose administrada da composição farmacêutica é de cerca de 1 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais (tal como cerca de 2 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 5 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 10 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 25 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 50 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 100 pg de proteína por kg massa corporal ou mais, cerca de 250 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 500 pg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 1 mg de proteína por kg de massa corporal ou mais, cerca de 2 mg de proteína por kg de massa corporal ou mais, ou cerca de 5 mg de proteína por kg de massa corporal ou mais).
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308/474 [00548] Em algumas modalidades, uma quantidade terapêutica de uma composição celular é administrada. Tipicamente, a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada por um médico considerando as diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e estado do paciente (indivíduo). Pode ser geralmente afirmado que uma composição farmacêutica compreendendo células manipuladas, por exemplo, células T, como aqui descritas, pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, tal como 105 a 106 células/kg de corpo peso, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos. Composições de células manipuladas, tais como composições de células T, podem também ser administradas múltiplas vezes nestas dosagens. As células podem ser administradas utilizando técnicas de infusão que são vulgarmente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). A dosagem optima e o regime de tratamento para um paciente particular podem ser prontamente determinados por um versado na técnica da medicina monitorando o paciente quanto a sinais de doença e ajustando o tratamento em conformidade.
[00549] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém agentes infecciosos contendo sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos variantes imunomoduladores. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém uma dose de agentes infecciosos adequados para administração a um indivíduo que é adequado para tratamento. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um agente infeccioso que é um vírus, em uma quantidade de dosagem única ou múltipla, entre cerca de ou entre cerca de 1x105 e cerca de 1x1012 unidades formadoras de placas (ufp), 1 x106 e 1 *1010 ufp, ou 1 *107 e 1 *1010 ufp, cada um inclusive, como pelo menos ou pelo menos cerca de 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109 ufp ou cerca de 1x1010 ufp. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter uma concentração de vírus de ou de cerca de 10 5 a cerca de 10 10 ufp/ml, por exemplo, 5x106 a 5x109 ou 1x107 a 1x109 ufp/ml, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 106 ufp/ml, 107 ufp/ml, 108 ufp/ml ou 109 ufp/ml. Em algumas
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309/474 modalidades, a composição farmacêutica contém um agente infeccioso que é uma bactéria, em uma quantidade única ou múltipla de dosagem, entre cerca de ou entre cerca de 1 χ103 e cerca de 1 χ109 unidades formadoras de colônias (ufc), 1x104 e 1x109 ufc, ou 1x105 e 1x107 ufc, incluindo, pelo menos, ou pelo menos cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108 ou 1x109 ufc. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter uma concentração bacteriana de cerca de 103 a cerca de 108 ufc/ml, por exemplo, 5x105 a 5x107 ou 1x106 a 1x107 ufc/ml, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 105 ufc/ml, 106 ufc/ml, 107 ufc/ml ou 108 ufc/ml.
[00550] São conhecidos vários meios para determinar se a administração de uma composição terapêutica da invenção modula suficientemente a atividade imunológica através da eliminação, sequestro ou inativação de células imunológicas mediadoras ou capazes de mediar uma resposta imunológica indesejada; induzir, gerar ou ligar células imunes que medeiam ou são capazes de mediar uma resposta imunológica protetora; alterar as propriedades físicas ou funcionais das células imunes; ou uma combinação destes efeitos. Exemplos de medições da modulação da atividade imunológica incluem, mas não se limitam a, exame da presença ou ausência de populações de células imunológicas (utilizando citometria de fluxo, imunohistoquímica, histologia, microscopia elétrica, reação em cadeia da polimerase (PCR)); medição da capacidade funcional de células imunológicas incluindo capacidade ou resistência em proliferar ou dividir em resposta a um sinal (tal como utilizar ensaios de proliferação de células T e análise de pepscan com base na incorporação de 3H-timidina após estimulação com anticorpo anti-CD3, anti-T anticorpo de receptor de célula, anticorpo antiCD28, ionóforos de cálcio, células apresentadoras de antígeno de 12miristato 13-acetato de PMA (12-miristato de forbol) carregadas com um antígeno peptídico ou proteico, ensaios de proliferação de células B); medição da capacidade de matar ou lisar outras células (tais como ensaios de células T citotóxicas); medições das citocinas, quimiocinas, moléculas da superfície celular, anticorpos e outros produtos das células (por exemplo, por citometria de fluxo, ensaios imunossorventes ligados a enzima, análise de Western blot, análise de microarranjos de proteína, análise de imunoprecipitação);
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310/474 medição de marcadores bioquímicos de ativação de células imunes ou vias de sinalização dentro de células imunes (por exemplo, Western blot e imunoprecipitação de fosforilação de tirosina, serina ou treonina, divagem polipeptídica e formação ou dissociação de complexos proteicos; análise de matriz proteica; transcrição de DNA, perfilação usando matrizes de DNA ou hibridação subtrativa); medições de morte celular por apoptose, necrose ou outros mecanismos (por exemplo, coloração de anexina V, ensaios TlINEL, eletroforese em gel para medir a escalonamento do DNA, histologia; ensaios fluorogênicos de caspases, análise de Western blot de substratos de caspase); medição dos genes, proteínas e outras moléculas produzidas por células imunológicas (por exemplo, análise Northern blot, reação em cadeia da polimerase, microarranjos de DNA, microarranjos de proteínas, eletroforese em gel bidimensional, análise de transferência Western blot, ensaios imunoabsorventes ligados a enzima, citometria de fluxo); e medição de sintomas clínicos ou desfechos como melhora de doenças autoimunes, neurodegenerativas e outras envolvendo autoproteínas ou autopolipeptídeos (escores clínicos, requisitos para uso de terapias adicionais, status funcional, estudos de imagem) por exemplo, medindo a taxa de recaída ou gravidade da doença (utilizando pontuações clínicas conhecidas do versado na especialidade) no caso de esclerose múltipla, medição da glicose no sangue no caso de diabetes do tipo I ou inflamação das articulações no caso de artrite reumatoide.
VI. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO E KITS [00551] Também são aqui fornecidos artigos de fabricação que compreendem as composições farmacêuticas aqui descritas em embalagens adequadas. Embalagens adequadas para composições (tais como composições oftálmicas) aqui descritas são conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, frascos (tais como frascos selados), vasos, ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico), e similar. Estes artigos de fabricação podem ainda ser esterilizados e/ou selados.
[00552] São ainda proporcionados kits compreendendo as composições farmacêuticas (ou artigos de fabricação) aqui descritos, que podem
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311/474 ainda compreender instrução (ou instruções) sobre métodos de utilização da composição, tal como as utilizações aqui descritas. Os kits aqui descritos também podem incluir outros materiais desejeis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos informativos com instruções para realizar quaisquer modos aqui descritos.
VII. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS [00553] São aqui fornecidos métodos utilizando as composições farmacêuticas fornecidas contendo uma proteína imunomoduladora variante de polipeptídeos CD80, célula manipulada ou agente infeccioso aqui descrito, para modular uma resposta imunológica, incluindo em ligação com o tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo, tal como em um paciente humano. As composições farmacêuticas aqui descritas (incluindo composição farmacêutica compreendendo os polipeptídeos CD80 variantes, as proteínas imunomoduladoras, os conjugados e as células manipuladas aqui descritas) podem ser utilizadas em uma variedade de aplicações terapêuticas, tais como o tratamento de uma doença. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é utilizada para tratar distúrbios inflamatórios ou autoimunes, câncer, transplante de órgãos, infecções virais e/ou infecções bacterianas em um mamífero. A composição farmactica pode modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) uma resposta imunológica para tratar a doença. Em algumas modalidades, os métodos são realizados com polipeptídeos CD80 variantes em um formato para aumentar uma resposta imunológica em um indivíduo. Em alguns desses aspectos, o aumento de uma resposta imunológica trata uma doença ou condição no indivíduo, tal como um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, os métodos são realizados com polipeptídeos CD80 variantes em um formato para diminuir uma resposta imunológica em um indivíduo. Em alguns desses aspectos, a diminuição de uma resposta imunológica trata uma doença ou condição em um indivíduo, tal como uma doença ou condição inflamatória, por exemplo, uma doença autoimune.
[00554] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são aplicáveis à administração terapêutica de polipeptídeos CD80 variantes, às proteí
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312/474 nas imunomoduladoras, aos conjugados, às células manipuladas e aos agentes infecciosos aqui descritos. Está dentro do nível de um versado na técnica, em vista da revelação fornecida, escolher um formato para a indicação dependendo do tipo de modulação da resposta imunológica, por exemplo, aumento ou diminuição que é desejado.
[00555] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida aqui que estimula ou aumenta a resposta imunológica é administrada, o que pode ser útil, por exemplo, no tratamento de câncer, infecções virais ou infecções bacterianas. Entre os métodos fornecidos estão métodos que envolvem a entrega de polipeptídeos CD80 variantes, tais como em formatos solúveis, com afinidade aumentada para CTLA-4 e/ou PD-L1, que podem antagonizar a sinalização de um receptor inibidor, tal como bloquear um sinal inibitório na célula que pode ocorrer para diminuir a resposta a um estímulo de ativação, por exemplo, sinal costimulatório de CD3 e/ou CD28 ou um sinal mitogênico. Em alguns casos, o resultado disso pode ser aumentar a resposta imunológica. Em algumas modalidades, o antagonismo de CTLA-4 ou PD-L1/PD-1 pode ser útil para promover imunidade em oncologia, tal como para tratamento de tumores ou cânceres. Em algumas modalidades, o agonismo de CD28, que pode ser dependente ou intensificado por coligação de CD80 PD-L1, pode ser útil para promover imunidade em oncologia, tal como para o tratamento de tumores ou cânceres.
[00556] Proporcionam-se modos para aumentar uma resposta imunológica por entrega de um polipeptídeo CD80 variante que se liga a CTLA-4, tal como liga CTLA-4 com afinidade aumentada em comparação com um polipeptídeo CD80 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um polipeptídeo CD80 variante em um formato que exibe atividade antagonista do seu parceiro de ligação cognato CTLA-4 e/ou que inibe a sinalização via CTLA-4. Formatos exemplificativos do polipeptídeo CD80 para utilização em ligação com tais aplicações terapêuticas incluem, por exemplo, um polipeptídeo CD80 variante que é solúvel (por exemplo, proteína de fusão CD80-Fc variante), uma proteína imunomoduladora ou pilha de um polipeptídeo CD80 variante e outro domínio IgSF, incluindo formas solúveis destes que são fusões de Fc, uma célula manipulada ex
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313/474 pressando uma proteína imunomoduladora secretável, ou um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína imunomoduladora secretável, tal como para expressão e secreção da proteína imunomoduladora secretável em um infectado célula (por exemplo, célula tumoral ou APC, por exemplo, célula dendrítica). Entre estes modos estão os modos realizados pela entrega de um polipeptídeo CD80 variante em um formato solúvel, que pode antagonizar a sinalização do receptor inibidor de CTLA-4 por ligação ao receptor inibidor de CTLA-4, bloqueando a sua interação com CD80 ou CD86, expresso em um APC, impedindo assim a sinalização reguladora negativa do receptor CTLA-4 ligado a CD80/CD86. Em alguns casos, o resultado disso pode ser o aumento da resposta imunológica, que, em alguns aspectos, pode tratar uma doença ou condição no indivíduo, como o tratamento de um tumor ou câncer. Formatos solúveis exemplificativos incluem qualquer como descrito. Incluídos entre estes agentes terapêuticos estão os formatos nos quais uma porção extracelular de um polipeptídeo variante CD80 contendo um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo IgV) está ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de multimerização, por exemplo, um domínio ou região Fc. Em algumas modalidades, tal agente terapêutico é uma proteína de fusão CD80-Fc variante. [00557] São proporcionados métodos para aumentar uma resposta imunológica através da entrega de uma variante de polipeptídeo CD80 que se liga a PD-L1, tal como liga PD-L1 com afinidade aumentada em comparação com um polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os polipeptídeos CD80 fornecidos, por exemplo, formas solúveis dos polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados, são capazes de se ligar à PD-L1 em uma célula tumoral ou APC, bloqueando desse modo a interação do PD-L1 e do receptor inibitório de PD-1 para evitar a sinalização reguladora negativa que teria resultado da interação PDL1/PD-1. Em alguns casos, o resultado disso pode ser o aumento da resposta imunológica, que, em alguns aspectos, pode tratar uma doença ou condição no indivíduo, como o tratamento de um tumor ou câncer. Formatos solúveis exemplificativos incluem qualquer como descrito. Incluídos entre estes agentes terapêuticos estão os formatos nos quais uma porção extracelular
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314/474 de um polipeptídeo variante CD80 contendo um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo IgV) está ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de multimerização, por exemplo, um domínio ou região Fc. Em algumas modalidades, tal agente terapêutico é uma proteína de fusão CD80Fc variante.
[00558] Também entre modalidades proporcionadas estão modos para mediar o agonismo de CD28 por coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 utilizando polipeptídeos CD80 variantes que exibem ligação aumentada a PD-L1 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado. Em alguns aspectos, tais métodos podem ser usados para aumentar uma resposta imunológica em um indivíduo administrado às moléculas, que, em alguns aspectos, podem tratar uma doença ou condição no indivíduo, tal como o tratamento de um tumor ou câncer. Entre tais métodos estão os métodos realizados pela entrega de um polipeptídeo CD80 variante em um formato solúvel. Formatos solúveis exemplificativos são aqui descritos, incluindo formatos nos quais uma porção extracelular de um polipeptídeo variante CD80 contendo um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo IgV) está ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de multimerização, por exemplo, um domínio ou região Fc. Em algumas modalidades, tal agente terapêutico é uma proteína de fusão CD80-Fc variante. Tal coestimulação dependente de PD-L1 não requer um Fc com função efetora e pode ser mediada por uma proteína de fusão Fc contendo uma molécula Fc sem agente ou inerte. Em alguns casos, tais polipeptídeos CD80 variantes, por exemplo, formas solúveis, também podem facilitar a promoção de uma resposta imunológica em ligação com os métodos terapêuticos fornecidos, bloqueando a interação PD-L1/PD-1 enquanto também se ligam e coestimulam um receptor CD28 em uma célula T localizada.
[00559] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CD80 variante que está ligado, direta ou indiretamente a um Fc que retém ou exibe a função efetora, é administrado a um indivíduo para mediar o agonismo de CD28.São proporcionados métodos para mediar o agonismo de CD28 por coestimulação dependente de receptor de CD28 utilizando polipeptídeos CD80 variantes aqui proporcionados a ligação a CD28. Em algumas modali
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315/474 dades, tal agonismo de CD28 pode ser útil para promover imunidade em oncologia, tal como para tratamento de tumores ou câncer. Em alguns casos, os polipeptídeos CD80 variantes também se ligam a CTLA-4 ou PD-L1, tais como exibem uma ligação aumentada a CTLA-4 ou PD-L1. Em alguns aspectos, a reticulação do receptor Fc pode iniciar funções efetoras mediadas por anticorpos dependentes de anticorpos (ADCC) e, portanto, efetuar a depleção de células-alvo expressando o parceiro de ligação cognato, como células que expressam CTLA-4 (por exemplo, células T reguladoras expressando CTLA-4) ou células que expressam PD-L1 (por exemplo, tumores PDL1hi). Os métodos fornecidos para modular uma resposta imunológica podem ser usados para tratar uma doença ou condição, tal como um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser utilizada para inibir o crescimento de células cancerosas de mamíferos (tais como células cancerosas humanas). Um método de tratamento do câncer pode incluir a administração de uma quantidade eficaz de qualquer das composições farmacêuticas aqui descritas a um indivíduo com câncer. A quantidade eficaz da composição farmacêutica pode ser administrada para inibir, interromper ou reverter a progressão de cânceres. Células cancerígenas humanas podem ser tratadas in vivo ou ex vivo. No tratamento ex vivo de um paciente humano, tecidos ou fluidos contendo células cancerígenas são tratados fora do corpo e depois o tecido ou fluidos são reintroduzidos de novo no paciente. Em algumas modalidades, o câncer é tratado em um paciente humano in vivo por administração da composição terapêutica no paciente. Assim, o presente invento proporciona métodos ex vivo e in vivo para inibir, parar ou inverter a progressão do tumor, ou de outro modo resultar em um aumento estatisticamente significativo da sobrevivência livre de progressão (isto é, a duração de tempo durante e após o tratamento em que um paciente está vivendo com câncer que não piora) ou sobrevida global (também chamada de taxa de sobrevivência; isto é, a porcentagem de pessoas em um estudo ou grupo de tratamento que estão vivos por um certo período de tempo após terem sido diagnosticadas com ou tratados para câncer) em relação ao tratamento com um controle.
[00560] Os cânceres que podem ser tratados pelas composições far
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316/474 macêuticas e os modos de tratamento aqui descritos incluem, mas não estão limitados a melanoma, câncer da bexiga, malignidades hematológicas (leucemia, linfoma, mieloma), câncer do fado, câncer do cérebro, câncer renal, câncer da mama, câncer de pâncreas (adenocarcinoma), câncer colorretal, câncer de pulmão (câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de baço, câncer de timo ou células do sangue (leucemia), câncer de próstata, câncer testicular, ovário câncer, câncer uterino, carcinoma gástrico, um câncer musculoesquelético, um câncer da cabeça e pescoço, um câncer gastrointestinal, um câncer das células germ inativas ou um câncer endócrino e neuroendócrino. Em algumas modalidades, o câncer é o sarcoma de Ewing. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de melanoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga e uma malignidade hematológica. Em algumas modalidades, o câncer é um linfoma, leucemia linfoide, leucemia mieloide, câncer do colo do útero, neuroblastoma ou mieloma múltiplo.
[00561] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como uma monoterapia (isto é, como um agente único) ou como uma terapia de combinação (isto é, em combinação com um ou mais agentes anticancerígenos adicionais, tais como um fármaco quimioterapêutico, uma vacina contra o câncer ou um inibidor do ponto de checagem imunológico. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica também pode ser administrada com terapia de radiação. Em alguns aspectos da presente divulgação, o inibidor do ponto de checagem imunológico nivolumab, tremelimumab, pembrolizumab, ipilimumab ou semelhantes.
[00562] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica suprime uma resposta imunológica, que pode ser útil no tratamento de distúrbios inflamatórios ou autoimunes, ou transplante de órgãos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um polipeptídeo CD80 variante em um formato que exibe atividade agonista do seu parceiro de ligação cognato CTLA-4 e/ou que estimula a sinalização inibitória via CTLA-4. Formatos exemplificativos de um polipeptídeo CD80 para utilização em ligação com tais aplicações terapêuticas incluem, por exemplo, uma proteína imunomoduladora ou pilha de um polipeptídeo CD80 variante e um domínio IgSF ou
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317/474 sua variante que se localiza em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório, um conjugado contendo um polipeptídeo CD80 variante ligado a uma porção que se localiza em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório, uma célula manipulada expressando uma proteína imunomoduladora transmembranar ou um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína imunomoduladora transmembranar, tal como para expressão da proteína imunomoduladora transmembranar em uma célula infectada.
[00563] Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou autoimune é vasculite associada a anticorpos citoplasmáticos de antineutrófilo (ANCA), uma vasculite, uma doença de pele autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença inflamatória gastrointestinal, uma doença ocular inflamatória, uma doença neurológica inflamatória, doença pulmonar inflamatória, doença endócrina inflamatória ou doença hematológica autoimune.
[00564] Em algumas modalidades, as doenças inflamatórias e autoimunes que podem ser tratadas pela composição farmacêutica aqui descrita são doenças de Addison, alergias, alopecia areata, Alzheimer, vasculite associada a anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica (Síndrome de Hughes), asma, aterosclerose, artrite reumatoide, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença da orelha interna autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, miocardite autoimune, ooforite autoimune, orquite autoimune, azoospermia, doença de Behcet, doença de Berger, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença cardiovascular Enjo celíaca/doença celíaca, síndrome de disfunção imune da fadiga crônica (CFIDS), polineurite idiopática crônica, desmielinização inflamatória crônica, polineuropatia polivalente (PDIC), polineuropatia recidivante crônica (síndrome de Guillain-Barré), síndrome de Churg-Strauss (CSS), penfigoide cicatricial, doenças por aglutinina a frio (DAC), DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica), síndrome CREST, doença de Crohn, dermatite, herpetiforme, dermatomiosite, diabetes, lúpus discoide, eczema, epidermólise bolhosa adquirida, crioglobulinemia mista essencial, síndrome de Evan, exoftalmia, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, Doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombo
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318/474 citopênica idiopática (PTI), nefropatia por IgA, doença ou distúrbio imunoproliferativo, doença inflamatória intestinal (Dll), doença pulmonar intersticial, artrite juvenil, artrite idiopática juvenil (AIJ), Doença de Kawasaki Síndrome miastênica de Lambert-Eaton, líquen plano, nefrite lúpica, hipofisite linfocítica, doença de Ménière, síndrome de Miller Fish/encefalomielorradiculopatia disseminada aguda (EMR), doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla (MS), reumatismo muscular, encefalomielite miálgica (ME), miastenia gravis, inflamação ocular, pênfigo foliáceo, pênfigo vulgar, pernici anemia, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares (síndrome de Whitaker), polimialgia reumática, polimiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária/colangiopatia autoimune, psoríase, artrite psoriásica, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter/artrite reativa, reestenose, febre reumática, doença reumática, sarcoidose, síndrome de Schmidt, esclerodermia, síndrome de Sjõrgen, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico (LES), esclerodermia sistêmica, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, tireoidite, diabetes tipo 1, oolite ulcerativa, uveíte, vasculite vitiligo, doença intestinal intersticial ou Granulomatose de Wegener. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório ou autoimune é selecionado de doença intestinal intersticial, transplante, doença de Crohn, oolite ulcerosa, esclerose múltiOpla, asma, artrite reumatoide e psoríase.
[00565] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada para modular uma condição autoimune. Por exemplo, suprimir uma resposta imunológica pode ser benéfico em métodos para inibir a rejeição de um transplante de tecido, célula ou órgão de um dador por um receptor. Consequentemente, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas são utilizadas para limitar ou prevenir doenças ou distúrbios relacionados com o enxerto ou transplantes, tais como doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são utilizadas para suprimir a rejeição autoimune de medula óssea, órgãos, pele, músculo, neurônios, ilhotas ou células parenquimatosas transplantadas ou enxertadas.
[00566] Composições farmacêuticas compreendendo células manipulaPetição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3452/3680
319/474 das e os métodos aqui descritos podem ser utilizados em aplicações de transferência celular adotiva. Em algumas modalidades, as composições celulares compreendendo células manipuladas podem ser utilizadas em modos associados para, por exemplo, modular a atividade imunológica em uma abordagem de imunoterapia ao tratamento de, por exemplo, um câncer de mamífero ou, em outras modalidades, o tratamento de distúrbios autoimunes. Os métodos empregues geralmente compreendem um método de colocar em contato um TIP da presente invenção com uma célula de mamífero sob condições que são permissivas à ligação específica do domínio IgSF modificado por afinidade e modulação da atividade imunológica da célula de mamífero. Em algumas modalidades, células imunológicas (tais como linfócitos de infiltração tumoral (TILs), células T (incluindo células T CD8+ ou CD4+) ou APCs) são manipuladas para expressarem como uma proteína membranar e/ou como um polipeptídeo CD80 variante solúvel, proteína imunomoduladora, ou conjugado como aqui descrito. As células manipuladas podem então colocar em contato uma célula de mamífero, tal como uma APC, um segundo linfócito ou célula tumoral em que a modulação da atividade imunológica é desejada e sob condições que sejam permissivas na ligação específica do domínio IgSF modificado por afinidade a uma contraestrutura na célula de mamífero, de tal modo que a atividade imunológica pode ser modulada na célula de mamífero. As células podem ser contatadas in vivo ou ex vivo.
[00567] Em algumas modalidades, as células manipuladas são células autólogas. Em outras modalidades, as células são alogênicas. Em algumas modalidades, as células são células manipuladas autólogas reinfundidas no mamífero a partir do qual foi isolado. Em algumas modalidades, as células são células manipuladas alogênicas infundidas no mamífero. Em algumas modalidades, as células são colhidas do sangue ou tumor de um paciente, manipuladas para expressar um polipeptídeo (tal como o polipeptídeo CD80 variante, proteína imunomoduladora ou conjugado como aqui descrito), expandido em um sistema de cultura in vitro (por exemplo, por estimulando as células), e reinfundido no paciente para mediar a destruição do tumor. Em algumas modalidades, o método é conduzido por transferência de células
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320/474 adotivas em que as células expressando o TIP (por exemplo, uma célula T) são infundidas de volta no paciente. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas e métodos da invenção são utilizados no tratamento de um doente mamífero de cânceres, tais como linfoma, leucemia linfóide, leucemia mieloide, câncer do colo do útero, neuroblastoma ou mieloma múltiplo.
Indivíduos para o Tratamento [00568] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são para tratar um indivíduo que tem ou é suspeito de ter a doença ou condição para a qual a aplicação terapêutica é dirigida. Em alguns casos, o indivíduo para tratamento pode ser selecionado antes do tratamento com base em uma ou mais características ou parâmetros, como para determinar a adequação para a terapia ou para identificar ou selecionar sujeitos para tratamento de acordo com qualquer uma das modalidades fornecidas, incluindo tratamento com qualquer um dos polipeptídeos CD80 variantes, proteínas imunomoduladoras, conjugados, células manipuladas ou agentes infecciosos fornecidos.
[00569] Em alguns aspectos, um indivíduo é selecionado para tratamento se em ou imediatamente antes do momento da administração da composição farmacêutica contendo um polipeptídeo CD80 variante, como descrito, o indivíduo recaiu após a remissão após tratamento com, ou tornou-se refratário ou é não responsive ao tratamento com um antagonista de PD-1/PD-L1 ou PD-1/PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista é um que não compita pela ligação a PD-L1 com um polipeptídeo CD80 variante fornecido para ser utilizado nos métodos de tratamento. Em algumas modalidades, o antagonista é um anticorpo anti-PD-1. Anticorpos anti-PD-1 exemplificativos são conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, nivolumab ou pembrolizumab, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno.
[00570] Em algumas modalidades, os métodos providenciados incluem métodos de diagnóstico, prognóstico ou monitoração utilizando ensaios de ligação em várias amostras biológicas de pacientes possuindo uma doença ou condição na qual é conhecida, suspeita ou que pode ser candidata a tratamento de acordo com as modalidades proporcionadas. Em algumas modalidades, os métodos são realizados com reagentes capazes de detectar
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CD28, PD-L1 e/ou CTLA-4 para selecionar indivíduos com tumores ou infiltrados de células tumorais que expressam um ou mais parceiros de ligação do polipeptídeo CD80 variante a ser utilizado em os métodos terapêuticos. Tais reagentes podem ser utilizados como diagnósticos associados para selecionar indivíduos que são mais prováveis de beneficiar do tratamento com as moléculas ou composições farmacêuticas fornecidas e/ou para prever a eficácia do tratamento.
[00571] Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para selecionar indivíduos e/ou prever eficácia do tratamento com terapias proporcionadas com base na atividade para antagonizar a interação PD-L1/PD1 e/ou com base no agonismo de CD28, tal como coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, incluindo em métodos para aumentar uma resposta imunológica para tratar uma doença ou condição e/ou para tratar um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de ligação a PD-L1 que se liga especificamente a PD-L1 na superfície de uma célula, tal como na superfície de uma célula tumoral ou células mieloides presentes no ambiente tumoral. Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de ligação a CD28 que se liga especificamente a CD28 na superfície de uma célula, tal como na superfície de uma célula imunológica infiltrante, tal como um linfócito, por exemplo, uma célula T. Em algumas modalidades, o reagente de ligação pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ligando de proteína ou parceiro de ligação, um aptâmero, um afímero, um peptídeo ou um hapteno. Em algumas modalidades, esses reagentes podem ser utilizados como um diagnóstico associado para selecionar ou identificar sujeitos para tratamento com um agente terapósutico ou composição farmacêutica aqui fornecida contendo um polipeptídeo CD80 variante que é ou contém um domínio IgSF (por exemplo IgV) que exibe uma ligação aumentada a PD-L1 comparado com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem, incluindo proteínas imunomoduladoras ou conjugados. Incluídos entre estes agentes terapêuticos estão os formatos nos quais uma porção extracelular de um polipeptídeo variante CD80 contendo um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV) está ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de multimerização, por exemplo, um domínio ou região Fc. Em
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322/474 algumas modalidades, tal agente terapêutico é uma proteína de fusão CD80Fc variante.
[00572] Em algumas modalidades, o reagente de ligação é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a PD-L1. Vários reagentes de diagnóstico associados para detectar PD-L1, incluindo PD-L1 intracelular ou extracelular, são conhecidos, por exemplo, Roach et al. (2016) Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., 24: 392-397; Cogswell et al. (2017) Mol. Diagn. Ther. 21: 85-93; pedido de patente internacional publicado n° WO2015/181343 ou WO2017/085307, ou pedido de patente publicado US n° US2016/0009805 ou US2017/0285037. Exemplos não limitativos de anticorpos anti-PD-L1 incluem, mas não estão limitados a, clone anti-PD-L1 de camundongo 22C3 (Merck & Co.), clone de coelho antiPD-L1 28-8 (Bristol-Myers Squibb), clones de coelho anti-PD-L1 SP263 ou SP142 (Spring Biosciences) e clone de anticorpo anti-PD-L1 de coelho E1L3N. Esses reagentes de ligação podem ser utilizados em métodos histoquímicos, incluindo aqueles disponíveis como Ensaio Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ensaio PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, ensaio Ventana PD-L1 (SP263) ou ensaio Ventana PD-L1 (SP142).
[00573] Em algumas modalidades, o reagente de ligação é ou contém um polipeptídeo CD80 variante aqui fornecido, incluindo qualquer um que exiba afinidade de ligação alterada (por exemplo, aumentada) a PD-L1, CD28 e/ou CTLA-4 em comparação com o polipeptídeo CD80 não modificado ou de tipo selvagem. Assim, também são proporcionados reagentes de ligação para utilização como um diagnóstico associado contendo qualquer um dos polipeptídeos variantes CD80 aqui proporcionados. Também é fornecido um método para detectar PD-L1, CD28 e/ou CTLA-4 em uma amostra biológica contatando a amostra biológica com um reagente de ligação compreendendo qualquer um dos polipeptídeos variantes CD80 aqui proporcionados. Em alguns aspectos, os reagentes de ligação contendo um polipeptídeo CD80 variante, incluindo proteínas imunomoduladoras ou conjugados aqui proporcionados, podem ser utilizados individualmente ou em combinação em métodos de diagnóstico, prognóstico ou monitorização utilizando ensaios de ligação em várias amostras biológicas de pacientes com uma
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323/474 doença ou condição em que é conhecido, suspeito ou que pode ser um candidato para tratamento de acordo com as modalidades fornecidas. Em algumas modalidades, os reagentes de ligação e os métodos CD80 variantes, utilizando reagentes de ligação a CD80 variantes, podem ser utilizados para selecionar sujeitos para tratamento com qualquer um dos polipeptídeos variantes CD80 variantes, proteínas imunomoduladoras, conjugados, células manipuladas ou agentes infecciosos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante do reagente de ligação é o mesmo ou contém o mesmo domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, domínio IgV) que o polipeptídeo CD80 variante utilizado para o tratamento. Em outras modalidades, o polipeptídeo CD80 variante do reagente de ligação é diferente de ou contém um domínio IgSF modificado por afinidade diferente (por exemplo, domínio de IgV) como o polipeptídeo cD80 variante para tratamento.
[00574] Um reagente de ligação que é ou contém um polipeptídeo CD80 variante pode conter qualquer uma ou mais das modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou inserções de aminoácidos) aqui descritas, incluindo qualquer descrito na Seção II. Em algumas modalidades, um reagente de ligação CD80 variante pode ser escolhido com base em qualquer atividade de ligação desejada, incluindo, nalguns casos, com base na capacidade de ligar especificamente ou detectar um, dois ou, em alguns casos, cada um dos ectodomínios de PD-L1, CD28 e CTLA-4 na superfície de uma célula em uma amostra biológica.
[00575] Em algumas modalidades, um reagente de ligação que é ou contém um polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente ao ectodomínio de CTLA-4 na superfície de uma célula, tal como na superfície de uma célula Treg. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é ou contém um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV) que exibe afinidade de ligação aumentada a CTLA-4 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem, tal como qualquer aqui fornecido. Exemplos de tais polipeptídeos variante CD80 incluem qualquer modificação (ou modificações) contendo aminoácidos de um domínio IgSF (por exemplo, IgV) como descrito na Seção II.A.1.
[00576] Em algumas modalidades, um reagente de ligação que é ou
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324/474 contém um polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente ao ectodomínio de CD28 na superfície de uma célula, tal como na superfície de uma célula infiltrante de tumor. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é ou contém um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV) que exibe uma afinidade de ligação aumentada ao CD28 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem, tal como qualquer aqui fornecido. Exemplos de tais polipeptídeos CD80 variantes incluem qualquer um contendo modificações de aminoácidos em um domínio IgSF (por exemplo, IgV) como descrito na Seção II.A.2.
[00577] Em algumas modalidades, um reagente de ligação que é ou contém um polipeptídeo CD80 variante liga-se especificamente ao ectodomínio de PD-L1 na superfície de uma célula, tal como na superfície de uma célula tumoral ou células meloides presentes no ambiente tumoral. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD80 variante é ou contém um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV) que exibe afinidade de ligação aumentada a PD-L1 em comparação com o CD80 não modificado ou de tipo selvagem, tal como qualquer aqui fornecido. Exemplos de tais polipeptídeos CD80 variantes incluem qualquer um contendo modificações de aminoácidos em um domínio IgSF (por exemplo, IgV) como descrito na Seção II.A.3.
[00578] Um reagente de ligação CD80 variante pode ser fornecido em qualquer formato, incluindo qualquer formato como aqui descrito, que seja adequado para utilização em ensaios de ligação e modos de detecção. Em algumas modalidades, o reagente de ligação contém um polipeptídeo CD80 variante que é ou contém um domínio IgSF (por exemplo, IgV), incluindo proteínas ou conjugados imunomoduladores. Incluídos entre estes agentes terapêuticos estão os formatos nos quais uma porção extracelular de um polipeptídeo variante CD80 contendo um domínio IgSF modificado por afinidade (por exemplo, IgV) está ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de multimerização, por exemplo, um domínio ou região Fc. Em algumas modalidades, esse reagente de ligação é uma proteína de fusão variante CD80Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc é um Fc não humano. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc de camundongo, tal como de uma IgG de
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325/474 camundongo, por exemplo, de uma lgG1 de camundongo, lgG2a de camundongo ou lgG2b de camundongo ou outro isotipo de camundongo. Em algumas modalidades, o Fc de camundongo é ou compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3040 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com a SEQ ID NO: 3 040. Em algumas modalidades, o Fc de camundongo é capaz de detecção com um anticorpo secundário anti-lgG de camundongo (por exemplo IgG anticamundongo de cabra). Em algumas modalidades, o Fc é um Fc de coelho, tal como o IgG de coelho. Em algumas modalidades, o coelho Fc é ou compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3039 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com a SEQ ID NO: 3039. Em algumas modalidades, o Fc de coelho é capaz de detecção com um anticorpo secundário anti-lgG de coelho (por exemplo IgG de cabra anticoelho). O polipeptídeo CD80 variante dos reagentes de ligação fornecidos pode ser ligado direta ou indiretamente ao domínio de multimerização, tal como a um domínio Fc. Em alguns aspectos, o polipeptídeo CD80 variante dos reagentes de ligação fornecidos está ligado indiretamente à sequência Fc, tal como através de um ligante, incluindo qualquer um como descrito na Seção II.
[00579] O reagente de ligação pode ser conjugado, tal como fundido, direta ou indiretamente a um marcador detectável para detecção. Em alguns casos, o reagente de ligação está ligado ou ligado a uma porção que permite a detecção direta ou a detecção através de agentes secundários, tal como através de anticorpos que se ligam ao reagente ou a uma porção do reagente e que são acoplados a uma etiqueta detectável. Os marcadores detectáveis exemplificativos incluem, por exemplo, porções quimioluminescentes, porções bioluminescentes, porções fluorescentes, radionuclides e metais. Os métodos para detectar marcadores são bem conhecidos na técnica. Tal marcador pode ser detectado, por exemplo, por inspeção visual, por espectroscopia de fluorescência, por medição de refletância, por citometria de fluxo, por raios X, por uma variedade de métodos de ressonância magnética,
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326/474 como ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (SRA). Os métodos de detecção também incluem vários métodos tomográficos, incluindo tomografia computadorizada (TC), tomografia axial computadorizada (TAC), tomografia computadorizada por feixe de elétrons (EBCT), tomografia computadorizada de alta resolução (TCAR), tomografia hipocicloidal, tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada espiral e tomografia ultrassônica. Os marcadores detectáveis exemplificativos incluem, por exemplo, porções quimioluminescentes, porções bioluminescentes, porções fluorescentes, radionuclides e metais. Entre os marcadores detectáveis estão sondas fluorescentes ou enzimas detectáveis, por exemplo, peroxidase de rábano.
[00580] Os reagentes de ligação podem detectar o parceiro de ligação, por exemplo, PD-L1, CD28 ou CTLA-4, utilizando qualquer ensaio de ligação conhecido de um versado na técnica, incluindo ensaios in vitro ou in vivo. Ensaios de ligação exemplificativos que podem ser utilizados para avaliar, avaliar, determinar, quantificar e/ou detectar especificamente a expressão ou os níveis de um parceiro de ligação, por exemplo, PD-L1, CD28 ou CTLA-4 em uma amostra incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação em fase sólida (por exemplo ensaio imunoenzimático (ELISA)), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunorradiométrico, ensaio de fluorescência, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente, western blot e métodos histoquímicos, tais como imuno-histoquímica (IHC) ou pseudo-imuno-histoquímica agente de ligação n anticorpo. Em métodos de ensaio de ligação em fase sólida, tais como métodos ELISA, por exemplo, o ensaio pode ser um formato em sanduíche ou um formato de inibição competitiva. Em outros exemplos, métodos de imagem in vivo podem ser usados. O ensaio de ligação pode ser realizado em amostras obtidas de amostras de fluido, células ou tecidos corporais de qualquer tipo, incluindo plasma, urina, tumor ou tecidos tumorais suspeitos (incluindo tecidos frescos, congelados, fixados ou embebidos em parafina), linfonodos ou medula óssea. Em métodos exemplificativos para selecionar um indivíduo para tratamento de acordo com os métodos terapêuticos aqui proporcionados, a colheita da amostra, por exemplo
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327/474 tecido tumoral, é realizada antes do tratamento do indivíduo.
[00581] Em algumas modalidades, o ensaio de ligação um ensaio de coloração de tecidos para detectar a expressão ou níveis de um parceiro de ligação em uma amostra de tecido ou célula. Os métodos de transferência de tecidos incluem, mas não estão limitados a, métodos citoquímicos ou histoquímicos, tais como imuno-histoquímica (IHQ) ou histoquímica, utilizando um agente de ligação não-anticorpo (por exemplo, pseudo-imunohistoquímica). Tais métodos histoquímicos permitem a detecção quantitativa ou semiquantitativa da quantidade do parceiro de ligação em uma amostra, tal como uma amostra de tecido tumoral. Em tais métodos, uma amostra de tecido pode ser colocada em contato com um reagente de ligação, por exemplo reagente de ligação PD-L1, e em particular um que seja detectavelmente marcado ou capaz de detecção, sob condições que permitam a ligação a um parceiro de ligação associado a tecido ou célula.
[00582] Uma amostra para utilização nos modos aqui proporcionados como determinado por histoquímica pode ser qualquer amostra biológica que esteja associada com a doença ou condição, tal como uma amostra de tecido ou celular. Por exemplo, uma amostra de tecido pode ser um tecido sólido, incluindo uma amostra de órgão ou tecido fresca, congelada e/ou preservada ou biópsia ou aspirado, ou células. Em alguns exemplos, a amostra de tecido é tecido ou células obtidas de um tumor sólido, tais como tumores primários e metastáticos, incluindo, mas não limitados a mama, cólon, reto, pulmão, estômago, ovário, colo do útero, útero, testículos, bexiga, tumores de câncer de próstata, tireoide e pulmão. Em exemplos particulares, a amostra é uma amostra de tecido de um câncer que é um câncer em estágio avançado, um câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer de ovário, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (CCE), câncer de próstata, câncer de pâncreas., câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer de cólon.
[00583] Em alguns aspectos, quando o tumor é um tumor sólido, o isolamento de células tumorais pode ser alcançado por biópsia cirúrgica. As técnicas de biópsia que podem ser utilizadas para colher células tumorais de um indivíduo incluem, mas não se limitam a biópsia por agulha, biópsia por
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328/474 agulha guiada por CT, biópsia por aspiração, biópsia endoscópica, biópsia broncoscópica, lavagem bronquial, biópsia incisional, biópsia excisional, biópsia por punção, biópsia de barbear, biópsia de pele, biópsia de medula óssea e procedimento de excisão eletrocirúrgica de alça (LEEP). Tipicamente, obtém-se uma biópsia ou espécime estéril, não necrótica, superior a 100 mg, mas que pode ser menor, tal como menos de 100 mg, 50 mg ou menos, 10 mg ou menos ou 5 mg ou menos; ou maior, tal como mais de 100 mg, 200 mg ou mais, ou 500 mg ou mais, 1 g ou mais, 2 g ou mais, 3 g ou mais, 4 g ou mais ou 5 g ou mais. O tamanho da amostra a ser extraída para o ensaio pode depender de um número de fatores incluindo, mas não limitado a, o número de ensaios a serem realizados, a saúde da amostra de tecido, o tipo de câncer e a condição do indivíduo. O tecido tumoral é colocado em um vaso estéril, tal como um tubo estéril ou placa de cultura, e pode ser opcionalmente imerso em um meio apropriado.
[00584] Em algumas modalidades, o tecido obtido a partir do paciente após a biópsia é fixado, tal como por formalina (formaldeído) ou glutaraldeído, por exemplo, ou por imersão em álcool. Para métodos histoquímicos, a amostra de tumor pode ser processada utilizando técnicas conhecidas, tais como desidratação e incorporação do tecido tumoral em uma cera de parafina ou outros suportes sólidos conhecidos dos versados na técnica (ver Plenat et al., 2001) Ann Pathol. 21 de janeiro (I): 29-47), corte do tecido em seções adequadas para coloração e processamento das seções para coloração de acordo com o modo de coloração histoquímico selecionado, incluindo remoção de suportes sólidos para integração por solventes orgânicos, por exemplo, e reidratação de tecido preservado.
[00585] Em algumas modalidades, métodos histoquímicos são empregados. Em alguns casos, o reagente de ligação é diretamente ligado ou ligado a um marcador detectável ou outra porção para detecção direta ou indireta. Reagentes detectáveis exemplificativos incluindo, mas não se limitando a, biotina, uma proteína fluorescente, proteína bioluminescente ou enzima. Em outros exemplos, os reagentes de ligação são conjugados, por exemplo, fundidos com peptídeos ou proteínas que podem ser detectados através de um parceiro ou anticorpo de ligação marcado. Em alguns exemplos, um par
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329/474 ceiro de ligação pode ser detectado por métodos de HC utilizando um reagente secundário marcado, tal como anticorpos marcados, que reconhecem uma ou mais regiões, por exemplo, epítopos, do reagente de ligação.
[00586] Em algumas modalidades, as amostras coradas resultantes, tal como obtidas por métodos histoquímicos, são cada uma delas visualizadas utilizando um sistema para visualizar o sinal detectável e adquirir uma imagem, tal como uma imagem digital da coloração. Os métodos para aquisição de imagem são bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, uma vez que a amostra tenha sido corada, qualquer dispositivo de imagem ótico ou não óptico pode ser usado para detectar a marca ou marcador biomarcador, como, por exemplo, microscópios ópticos invertidos ou verticais, microscópios confocalizadores, câmeras, varreduras ou microscópios eletrônicos de tunelamento, microscópios de sonda de varredura e detectores infravermelhos de imagem. Em alguns exemplos, a imagem pode ser capturada digitalmente. As imagens obtidas podem então ser utilizadas para determinar quantitativa ou semiquantitativamente a quantidade de um parceiro de ligação, por exemplo, PD-L1, na amostra. Vários sistemas automatizados de processamento, análise e análise de amostras adequados para utilização com imuno-histoquímica estão disponíveis na técnica. Tais sistemas podem incluir coloração automatizada e varredura microscópica, análise computadorizada de imagens, comparação de seções seriadas (para controlar a variação na orientação e tamanho de uma amostra), geração de relatórios digitais e arquivamento e rastreamento de amostras (como lâminas nas quais seções de tecido é colocado). Estão disponíveis comercialmente sistemas de imagiologia celular que combinam microscópios de luz convencionais com sistemas de processamento de imagem digital para realizar análises quantitativas em células e tecidos, incluindo amostras imunocoradas. Veja, por exemplo, o sistema CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.). Em particular, a detecção pode ser feita manualmente ou por técnicas de processamento de imagem envolvendo processadores de computador e software. Utilizando tal software, por exemplo, as imagens podem ser configuradas, calibradas, padronizadas e/ou validadas com base em fatores que incluem, por exemplo, qualidade de manchas ou intensidade de manchas, usando procedimentos
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330/474 conhecidos de especialistas na técnica (ver, por exemplo, pedido de patente US publicado n° US20100136549).
[00587] Em algumas modalidades, uma amostra biológica é detectada para superfície de células positivas para um parceiro de ligação, por exemplo, PD-L1, CD28 ou CTLA-4, se houver um nível de expressão detectável do parceiro de ligação (por exemplo, após contato com o reagente de ligação e detecção de ligante ligado) em pelo menos ou pelo menos cerca de 1% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 5% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 10% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 20% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 40% das células ou mais.
[00588] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de tecido tumoral compreendendo células do estroma, células tumorais ou células de infiltração tumoral, tais como células imunológicas que se infiltram no tumor, por exemplo, linfócitos infiltrantes de tumores. Em algumas modalidades, a amostra de tecido tumoral é detectada para a superfície celular positiva para PD-L1 se houver um nível de expressão detectável do parceiro de ligação (por exemplo, seguindo o contato com o reagente de ligação e detecção do reagente de ligação ligado) pelo menos ou pelo menos cerca de 1% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 5% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 10% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 20% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 40% das células ou mais. Em algumas modalidades, as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor. Em algumas modalidades, a amostra de tecido tumoral é detectada para células positivas à superfície para CD28 se existir um nível de expressão detectável do parceiro de ligação (por exemplo, após contato com o reagente de ligação e detecção do reagente de ligação ligado) em pelo menos ou pelo menos cerca de 1% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 5% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 10% das células, pelo menos ou pelo menos cerca de 20% das células, a menos ou pelo menos cerca de 40% das células ou mais. Em algumas modalidades, as células são linfócitos imunológicos que se infiltram no tumor.
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VIII. MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS
Entre as modalidades fornecidas estão:
1. O polipeptídeo CD80 variante compreendendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um CD80 não modificado ou respectivo fragmento de ligação específica, correspondente à posição (ou posições) 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 ou 84 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2.
2. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 1, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo às posições 26, 35, 46, 57 ou 71 com referência à numeração de SEQ ID NO: 2.
3. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 1 ou da modalidade 2, em que a modificação de um ou mais aminoácidos é uma substituição, inserção ou deleção de aminoácidos.
4. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, E23D, E23G, A26D, A26E, A26G, A26H., A26K, A26N, A26P, A26P, A26R, A26S, A26T, I30T, I30T, I30T, E35G, E35G,
D46E, D46N, D46N, D46N, P46A, N55D, T57A, T57I, L65P, A71D,
A71G, A71G, R73H, R73S, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P,
C82R, V84A e V84I, em que a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácidos corresponde à numeração das posições do conjunto CD80 adiante na SEQ ID NO: 2.
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5. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a modificação de um ou mais aminoácidos é selecionada entre: I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/
A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D,
N55D/L70P/E77G, T57A/I69T, N55D/K86M, L72P/T79I, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, A71D, T13A/
I61N/A71D, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D,
E35D/M47I, K36R/G78A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S,
Q33R/K54N/T57I/I67V/A71 D, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M42I/I61V/ A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/ A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/ M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/ M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/ E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/
A71D/ L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/ M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/ M43I/ A71D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/ 161V/ L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, E35G/K54E/
A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D,
Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/M47L/ L85Q/ K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/ E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/ M47L/L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/ D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/ M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/ M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q,
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V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L37Q, Q33L/E35D/ T41S/ M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/ E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/ E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/ M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35 D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/ M47V/Y53F, V22A/E35D/V68E/A71 D, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/ E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/ M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/ L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/
L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, R29H/ E35D/M43V/M47I/I49V, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/ L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/ M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/ L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D,
E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, I30V/ Y31C/ E35D/M47V/A71G/L85M, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/ N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/ D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/A71 D, E35D/T41S/
M43I/A71 G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/ M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D /M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N,
Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/ D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G, E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/ D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/
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A71G/L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, V22D/E35D/M47L/ L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/ A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G,
M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/ T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I,
Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/ M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/ D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/ Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/ N64S/ A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/ M47I/ V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/ E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E35D/M47L/L70M, E35D/M47L/ V68M, E35D/D46V/M47L/V68M/E88D, E35D/D46V/M47L/V68M/D90G, E35D/D46V/M47L/V68M/K89N, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/ D46V/M47L/V68M, E35D/D46V/M47L/V70M, E35D/D46V/M47L/
V70M/L85Q, E35D/M47V/N48K/V68M, E35D/E35D/M47L/V68M/
E85V/L97Q, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/ A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/ M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/ E95V, E35D/M47V/N48K/V6 8M/A71G/L85M, E35D/M47V/ N48K/ V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/
Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/
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M47I/V68M/R85L, H18Y/E35D/M38I/M87L/V68M/L85M, H18Y/E35D/ M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47L/V68M/A68G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M48V/N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/E35D/M47V/ T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/E35D/M47L/ V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/ K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/H18Y/ E35D/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/ V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/ M38V/M62L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R35Q, T13R/Q33R/E35D/ M47L/ V68M, T22R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/ E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/ E24D/ E35D/ M47V/V68M, E35D/D46V, E35D/V68M, E35D/L85Q, D46V/M47L, D46V/V68M, D46V/L85Q, E35D/D46V/M47L, E35D/ D46V/V68M, E35D/D46V/L85Q, E35D/V68M/L85Q, D46V/M47L/ V68M, D46V/M47L/L85Q, D46V/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L/L85Q, E35D/D46V/V68M/L85Q, E35D/M47L/V68M/L85Q, D46V/M47L/V68M/ L85Q, E35D/N48K, E35D/K89N, E35D/M47V/N48K, E35D/M47V/ V68M, E35D/M47V/K89N, E35D/N48K/V68M, E35D/N48K/K89N, E35D/V68M/K89N, E35D/M47V/N48K/K89N, E35D/M47V/V68M/K89N, E35D/N48K/V68M/K89N, E35D/D46V/M47V/N48K/V68M, E35D/D46V/ M47V/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47V/V68M/K89N, E35D/M47V/
N48K/ V68M/L85Q, E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N, A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G,
H18Y/ A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L V68M/
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A71G, E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G/
D90G, H18Y/A26E/V68M/A71 G/D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G/ D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M, A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, A26E/ E35D/M47L/A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/D90G, A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G, H18Y/E35D/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/ A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G, H18Y/E35D/M47L/
V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/ D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G, M47L/ V68M/A71G/D90G, H18Y/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/A71G/
D90G, H18Y/A26E/E35D/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L, E35D/ V68M/A71G/D90G, E35D/M47L/A71G/D90G, E35D/M47L/V68M/
D90G, E35D/M47L/V68M/A71G, A26E/V68M/A71G/D90G, A26E/ M47L/A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/D90G, A26E/M47L/V68M/A71G, A26E/E35D/A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/D90G, A26E/E35D/V68M/ A71G, A26E/E35D/M47L/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M, H18Y/M47L/ A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G, H18Y/E35D/A71G/D90G,
H18Y/E35D/V68M/D90G, H18Y/E35D/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/ D91G, H18Y/E35D/M47L/A71G, H18Y/E35D/M47L/V68M, H18Y/ A26E/V68M/D90G, H18Y/A26E/V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/D90G, H18Y/A26E/M47L/A71G, H18Y/A26E/M47L/V68M, H18Y/A26E/E35D/ A71G H18Y/A26E/E35D/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/ A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D36G/E36/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M37V/V68M/
A71G/ D90G, H18T/A26N/E35D/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/ M47L/ V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/ A26P/ E35D/ V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A35P/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/
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A71G/ D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/ A26R/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/
V68M/A71G/D90G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/ A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/ A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/
A26N/ E35D/M4 7V/V68M/A71G/D90K, H18Y/A26N/E35D/M47F/ V68 M/A71G/D90G, Η18 Υ/Α26 P/E35D/M47T/V68 Μ/Α71G/D90G,
H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, e H18F/A26D/ E35D/ D46E/M47T/V68M/A71G/D90G, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
6. Um polipeptídeo CD80 variante compreendendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo; selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18T, H18T, H18V, V20I, V22I, V22I, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P, A26P, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A26, A27, Q31L, Y31S, Q33L, Q33R, K33E, E35D, K36R, T41S, M42I, M42V, M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47V, M47Y, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, Y53H, K54E, K54N, K54R, N55D, N55I T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, N63D, L65P, I67L, I67V, V68E, V68L, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S,
D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K,
C82R, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K86M, Y87C, Y87D, Y87H,
Y87Q, E88V, D90P, F92S, F92V, K93T, R94Q, R94W, E95D, E95V,
L97M e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou
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338/474 substituições) de aminoácido correspondente à numeração de posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
7. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 6, em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas entre: I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/ A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/ L70P/ A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/L70P/E77G, T57A/I69T, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, A71D, E81K/A91S, A12V/M47V/L70M,
K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I,
K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D,
M42I/I61V/A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/ T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71 D/ L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/
T57A/ A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L,
E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L7 0M/A71D/E95K, N55I/T57I/ I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/ E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, E35G/ K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K85R/R85W, A26E/Q33R/E35D/M87L/L85Q/ K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/ E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/ M47L/ L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/ D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/ M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/
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M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, Q33L/E35D/ T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/ E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/ E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/ M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/ M47V/Y53F, V22A/E35D/V68E/A71 D, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/ E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/ M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/
L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/ L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/ Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/ L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, R29H/E35D/M43V/M47I/I49V, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/ M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/ M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, I30V/ Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/ N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/ D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/A71 D, E35D/T41S/
M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/ M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, Q27H/ E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G,
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E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/ D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/ A71G/L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, V22D/E35D/M47L/ L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38V/M43V/M47V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/ A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, Μ47Ι/ A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M,
H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/ T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I,
Q27H/E35D/M47I, E3 5D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/ M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/ D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/ Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/ A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/ M47I/V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/E35D/ T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E35D/M47L/L70M, E35D/M47L/V68M, E35D/D46V/M47L/V68M/E88D, E35D/D46V/M47L/V68M/D90G, E35D/ D46V/M47L/V68M/K89N, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/D46V/ M47L/V68M, E35D/D46V/M47L/V70M, E35D/D46V/M47L/V70M/L85Q, E35D/M47V/N48K/V68M, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/ D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M,
E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/ T85M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/D46E/ M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71 G/K93R/
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E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/
V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/
Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/ M47I/ V68M/R94L, H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, H18Y/E35D/ M47I/ V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M37L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/ L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/ R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/
N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/ E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/ E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/ M47V/ N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/ Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/ E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M 38I/M47L/V68M/ L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, E35D/D46V,
E35D/V68M, E35D/L85Q, D46V/M47L, D46V/V68M, D46/L85Q, M47L/V68M, M47L/L85Q, V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L, E35D/ D46V/V68M, E35D/D46V/L85Q, E35D/V68M/L85Q, D46V/M47L/ V68M, D46V/M47L/L85Q, D46V/V68M/L85Q, M47L/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L/L85Q, E35D/D46V/V68M/L85Q, E35D/M47L/V68M/ L85Q, D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/N48K, E35D/K89N, M47V/ N48K, M47V/V68M, M47V/K89N, N48K/V68M, N48K/K89N, E35D/ M47V/N48K, E35D/M47V/V68M, E35D/M47V/K89N, E35D/N48K/ V68M, E35D/N48K/K89N, E35D/V68M/K89N, M47V/N48K/V68M,
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342/474
M47V/N48K/K89N, M47V/V68M/K89N, N48K/V68M/K89N, E35D/ M47V/ N48K/K89N, E35D/M47V/V68M/K89N, E35D/N48K/V68M/ K89N, M47V/N48K/V68M/K89N, E35D/D46V/M47V/N48K/V68M, E35D/ D46V/M47V/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47V/V68M/K89N, E35D/
M47V/N48K/V68M/L85Q, E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N, A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G,
H18Y/ A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/ D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G, E35D/M47L/V68M/ A71G/ D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/V68M/ A71G/ D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/ M47L/ D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M, A26E/M47L/V68M/ A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/
A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/ A71G, H18Y/E35D/V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G/ D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/ A71G, H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G, H18Y/ A26E/E35D/V68M/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G, M47L/V68M/ A71G/D90G, H18Y/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/A71G/D90G,
H18Y/A26E/E35D/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L, E35D/V68M/ A71G/D90G, E35D/M47L/A71G/D90G, E35D/M47L/V68M/D90G,
E35D/M47L/V68M/A71G, A26E/V68M/A71G/D90G, A26E/M47L/ A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/D90G, A26E/M47L/V68M/A71G,
A26E/E35D/A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/D90G, A26E/E35D/V68M/ A71G, A26E/E35D/M47L/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M, H18Y/M47L/ A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G,
H18Y/E35D/A71G/D90G, H18Y/E35D/V68M/D90G, H18Y/E35D/
V68IW A71G, H18Y/E35D/M47L/D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G, H18Y/ E35D/M47L/V68M, H18Y/A26E/V68M/D90G, H18Y/A26E/
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V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/D90G, H18Y/A26E/M47L/A71G, H18Y/A26E/M47L/V68M, H18Y/A26E/E35D/A71G, H18Y/A26E/E35D/ V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/ V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/ V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, Η1817 A26N/ E35D/ M87L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/ V68M/ A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/ V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/ V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/ E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, A26P/ E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/ D90G, H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, Η18V/A26D/E35D/M47V/V68 M/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/ V68IW A71G/ D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/ V68 M/A71G/D90K, Η18 Υ/Α26 N/E35D/M47F/V68 Μ/Α71G/D90G,
H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/ M47V/V68M/A71G/D90P e H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/ A71G/D90G, em que a posição (ou posições) de substituição (substituições) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas em SEQ ID NO: 2.
8. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 6 ou a modalidade 7, em que:
a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de V20I, V22I, V22L, A26E, Q27H, Q33L, Q33R, E35D, E35G, T41S, M43L, D46E, D46V, M47I, M47L, M47V, N55D, T57I, 161V, L70M. A71D, A71G, L72V, L85M, L85Q, R94We L97Q;
opcionalmente em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de V20I, V22L, A26E, Q27H, Q33L,
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Q33R, E35D, E35G, M47I, D46E, D46V, M47L, M47V, T57I, L70M, A71D, A71G, L72V, L85M, L85Q e L97Q;
opcionalmente, em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de A26E, Q33L, E35D, M47I, M47L, M47V, T57I, L70M, A71D, A71G e L85Q;
opcionalmente, em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de A26E, E35D, D46V, M47L, M47V, L70M, A71G e L85Q.
onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
9. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 6 a 8, em que:
a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem A26E;
a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem E35D;
a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem D46V;
a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem M47L;
a uma ou mais modificações de aminoácidos compreendem M47V; e/ou a uma ou mais modificações de aminoácidos compreende A71G, onde a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácidos corresponde à numeração das posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
10. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 6 a 9, em que as modificações de aminoácidos são sele-
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345/474 cionadas de E35D/D46E, E35D/D46V, E35D/M47I, E35D/M47L, E35D/M47V, E35D/V68M, E35D/A71G, E35D/D90G; D46E/M47I, D46E/M47L, D46E/M47V, D46E/V68M, D46E/A71G ou D46E/D90G; M47I/V68M, M47I/A71G, M48I/D90G; M47L/V68M, M47L/A71G, M47L/D90G; M47V/V68M, M47V/A71G, M47V/D90G; V68M/A71G ou V68M/D90G, A71G/D90G, opcionalmente em que as modificações de aminoácidos são E35D/M47I/V68M, E35D/M47L/V68M,
E35D/M47V/V68M, em que a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácidos corresponde à numeração das posições de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2
11. Polipeptídeo CD80 variante, compreendendo um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos, uma ou mais substituições de aminoácidos compreendendo pelo menos a substituição de aminoácidos L70P, mas não compreendendo as substituições de aminoácidos V68M, L72P e/ou K86E, em que a posição (ou posições) da modificação (ou modifricações) de aminoácidos correspondem às posições de CD80 estabelecidas em SEQ ID NO: 2.
12. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 11, em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de: L70P, I30F/L70P, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, N55D/L70P/E77G e L70P/F92S.
13. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que o CD80 não modificado é um CD80 de mamífero.
14. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que o CD80 é um CD80 humano.
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15. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende:
o domínio de IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo; e o domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
16. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que o CD80 não modificado compreende (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2; ou (iii) é uma porção desta compreendendo um domínio IgV ou domínio IgC ou fragmentos de ligação específica da mesma.
17. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que:
o fragmento de ligação específica do domínio IgV ou do domínio IgC tem um comprimento de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou mais aminoácidos;
o fragmento de ligação específica do domínio IgV compreende um comprimento que é pelo menos 80% do comprimento do domínio IgV estabelecido como aminoácidos 35-135, 35-138, 37-138 ou 35-141 da SEQ ID NO: 1; ou o fragmento de ligação específica do domínio IgC compreende um comprimento que pelo menos 80% do comprimento do domínio IgC estabelecido como os aminoácidos 145-230, 154-232 ou 142232 da SEQ ID NO: 1.
18. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou
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347/474 modificações de aminoácidos, opcionalmente substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos.
19. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 18, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento de ligação específica da mesma.
20. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um seu fragmento específico e o domínio IgC ou um fragmento específico do mesmo.
21. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 20, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 2297-2507 e 2930-2960 ou um fragmento de ligação específica da mesma, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 2297-2507 e 2930-2960 ou um fragmento de ligação específica da mesma e que contenha uma ou mais das modificações de aminoácidos da mesma.
22. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
23. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 19 e 22, em que o domínio IgV ou o fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
24. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 19, 22 e 23, compreendendo ou consistindo na se
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348/474 quência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929, e 2961 a 3022 ou um fragmento de ligação específica da mesma, uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 25082929 e 2961 a 3022 ou um fragmento de ligação específica da mesma e que contém uma ou mais das suas modificações de aminoácidos.
25. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que o domínio IgC ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
26. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe uma ligação alterada ao ectodomínio de CTLA-4, PD-L1 e/ou CD28 em comparação com a ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio.
27. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 26, em que a ligação alterada é a afinidade de ligação alterada e/ou seletividade de ligação alterada.
28. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 26 ou modalidade 27, em que o CTLA-4 é um CTLA-4 humano.
29. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 26 a 28, em que o CD28 é um CD28 humano.
30. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 26 a 29, em que o PD-L1 é um PD-L1 humano.
31. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 30, em que o CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de CTLA4 comparada com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA4.
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32. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondente às posições 7, 23, 26, 30, 35, 46, 57, 58, 71, 73, 79 e/ou 84, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2
33. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado entre E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18T,
H18V, V20I, V22D, V22L, E23D, E23G, E24D, A26D, A26E, A26G,
A26H, A26K, A26N, A26P, A26Q, A26R, A26S, A26T, Q27H, Q27L,
I30V, Q33L, Q33R, E35D, E35G, T41S, M42V, M43L, M43T, D46E,
D46N, D46V, M47I, M47L, M47V, M47Y, N48D, N48H, N48K, N48R,
N48S, N48T, N48Y, Y53F, K54E, K54R, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, I67L, V68E, V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, P74S, T79I, T79M, E81G, E81K, V84I, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, E88V, D90P, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V e L97Q, em que a posição (ou posições) da modificação (ou modificações) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
34. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 33, em que a modificação de um ou mais aminoácidos é selecionada de:
Q27H/T41S/A71D, T13R/C16R/L70Q/A71 D, T57I,
V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, S44P/I67T/P74S/E81G/E95D, A71D, T13A/I61N/A71D, E35D/M47I, M47V/N48H, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/ A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/
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M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/ M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/ E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/
A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/
M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/
A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/ L72P/E95V, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/
M47L/L85Q, D46E/A71D, E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/M47L, A26E/ E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/ E35D/ M47L/L85Q/R94Q/E95K, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, V22A/ E35D/V68E/A71 D, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L 85M/ L97Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/ L85Q/K93T/E95V/L97Q, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/ L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, V22A/ E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47V/ A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/ A71G/A91V, V22D/E35D/M87L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/ T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/ A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/A71 D, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/ V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/ A71G/ D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, E35D/D46V/M47L/
V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G, E35D/D46E/ M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71D/K93E, E35D/D46E/M47V/ V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/ L85M/ F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/ Y53H/A71G/D90G/L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, E35D/M38T/ D46E/M47V/N48S, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, E35D/N48K/
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L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/ M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/ A71G/ A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/ A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/ A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I,
E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/ N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/M47I/T62S/L85Q/ E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/ T86A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/
T62N/ A71G/A91G, E35D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/ M47I/ T68A/V68M/ L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M,
E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/ T85IW L85M, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/ Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L8 5M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/ M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/
R94L, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/ L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/V68M/ E95V/ L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/ Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/ E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/ E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, S21P/ E35D/K37E/D46E/M40I/V68M/R37L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/ Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/
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M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/ D90G, V22D/V24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/
A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18L/A26P/E35D/M47V/ V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/ V68IW A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/ A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/ A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47I/ V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/
M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/ E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/ A71G/ D90G, H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68 M/A71G/D90G, H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/ A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47F/V68M/ A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G, H18Y/A26P/ E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, e H18F/A26D/E35D/D46E/ M47T/ V68M/A71G/D90G onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
35. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 31 a 34, em que a afinidade aumentada para o ectodomínio de CTLA-4 é aumentada mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado ectodomínio de CTLA-4.
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36. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 35, em que o polipeptídeo variante se liga especificamente ao ectodomínio de CTLA-4 com seletividade aumentada em comparação com o CD80 não modificado para o ectodomínio de CTLA-4.
37. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 36, em que a seletividade aumentada compreende uma razão maior de ligação do polipeptídeo variante para CTLA-4 versus CD28 em comparação com a razão de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para CTLA-4 versus CD28.
38. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 37, em que a razão é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou mais.
39. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que o CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
40. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 39, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondente às posições 23, 26, 35, 46, 55, 57, 58, 71, 79 e/ou 84, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2
41. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31, 39 e 40, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado de T13R, S15T, H18A, H18C, H18F, H18I, H18T, H18V, V20I, V22D,
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3487/3680
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V22L, E23D, E23G, E24D, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N,
A26P, A26R, A26R, A26T, A27T, Q27H, Q27L, Q33R, E35D, E35G,
T41S, M42V, M43L, D46E, D46N, D46V, M47I, M47L, M47V, M47Y,
N48K, N48Y, Y53F, K54E, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A,
T62N, I67L, V68E, V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, T79I, T79M, V84I, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, E88V, D90P, R94Q, R94W, E95V e L97Q, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácidos corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
42. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 39 a 41, em que a modificação de um ou mais aminoácidos é selecionada de:
Q27H/T41S/A71D, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/
A71D, A71D/L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/ I67L/A71D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M,
A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/ T57I/ L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/ L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/ E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/ E95V, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W, V22A/E35D/V68E/ A71D, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/N48K/L72V, D46V/ M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/ A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/
M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/ D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46 E/L85M, E35D/D46E/A91G,
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3488/3680
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E35D/D46E, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/ I61V/L85M, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/ Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/ Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/ M47V/T62A/ N64S/ A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/ M411/V68M/A71G/R94L, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/ A71G/ A91G, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/ V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/ M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/
M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/Y53F/ V68M/ A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/ N48K/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/
L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/ D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/ E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/ E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47L/ V68M/A85G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/ M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/ V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/
M35V/ N48K/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/ K37E/D46E/M47I/V68M/R95L, T13R/Q33R/E35D/M38I/V47M/ V68M/ E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/ M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/ E35D/ M47V/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/ E35D/ M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L /A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/ D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/ V68IW A71G, H18V/A26P/E35D/M87V/V68M/A71G, H18V/ A26P/
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E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/ E35D/M47 V/V68 M/A71G/D90G, Η18 Y/A26P/E35D/M471/V68 Μ/Α71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/ A71G/ D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/ A26S/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/ A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/ E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/ A71G/ D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/ M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/ M47V/V68M/
A71G/D90P, e H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas em SEQ ID NO: 2.
43. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 39-42, em que a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 é aumentada mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 Dobra, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, ou 200 vezes, em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
44. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que o CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1, em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
45. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das
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357/474 modalidades 1 a 31 e 44, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondente à posição (ou posições) 7, 23, 26, 30, 34, 35, 46, 51, 55, 57, 58, 65, 71, 73, 78, 79, 82 e/ou 84, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2.
46. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 44, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado de E7D, T13A, T13R, S15T, C16R, H18A H18, H18, H18, H18, H18, H18, H18, V18, V20I, V22I, V22I, V22I, V22I, V22I, V22I, V26I, A26D, A26E, A26E, A26E, A26E, A26E, A26E, A26E, Q27H, Q27L, I30T,
I30V, Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, T41S, M42I,
M42V, M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47V,
N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, K54R,
N55D, N55I, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, L65P, I67L, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73S, P74S, D76H, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V85I, L85E, L85M, L85Q, Y87C, Y87D, D90P, F92S, F92V, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M e L97Q, em que a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 apresentadas na SEQ ID NO: 2.
47. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 44 a 46, em que a ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de:
Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71 D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/ L70P/ A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/
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P74S/E81G/E85D, A71D, T13A/I61N/A71 D, E81K, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I,
K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D,
M42I/I61V/A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/ T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, E35D/A71D,
E35D/I67L/A71 D, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, M47V/I69F/A71D/V83I, H18Y/A26T/E35D/A71 D/ L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71 D/ E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, V22L/E35D/M43L/A71G/
D76H, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/
V68L/K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/ E35D/M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/ L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/ E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/ E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/ M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/ E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/ M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/
Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q,
S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q,
Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E,
Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G,
H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q,
Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W,
Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/
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M47V/Y53F, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/ M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L37Q, Q33L/ E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/ M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47V/ L97Q, E35DL97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/ E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/ A71G, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/ M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/ M47L/A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/ M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/ L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/ V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, Q27H/E35D/D46V/M47L/ A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/ E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/M70M/A71G, E35D/D46E/M47V/
N63D/L85Q, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/ K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y, V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R, Q33L/E35D/ M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/ M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M48V/N48R/L85Q, T28Y/ Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/ D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/ 161F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V,
E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/
D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/
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M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/ M47L/ N48Y/L85Q, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/ T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/ E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/ L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/ A71G, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/ M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/ Y87C/ K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/ L85Q, E35D/M43L E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/
K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/ V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/
Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/ M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/ M38I/ M47L/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/ M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/ E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/ V68M/ A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/ E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/A85G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/ E35D/V68M/T85M/L85M, H18Y/V22D/M35V/N48K/V68M, Q27L/E35D/ T41S/M48V/N48K/V68M/L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/ V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q27L/Q33L/E35D/ T41S/ M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/
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Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/ E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/ L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/M35V/V68M, H18Y/E35D/M47V/
V68IW A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/ M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/ M47 V/V68 M/A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47 L/V68 M/A71G,
H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/ V68IW A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/ E35D/ M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26/E35D/M47V/V68L/ A71G/ D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18A/A26N/
E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/ D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/ E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47A/V68I/ A71G/ D90G, H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/ E35D/ D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, e H18F/A26D/ E35D/ D46E/ M47T/V68M/A71G/D90G, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
48. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 44-47, em que a afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 é aumentada mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes,
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362/474 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 -divida, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PDL1.
49. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 38 e 44 a 48, em que o CD80 variante exibe uma afinidade de ligação diminuída para o ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
50. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 38 e 44 a 49, em que a afinidade diminuída para o ectodomínio de CD28 é aumentada em mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 60 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
51. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 50, em que o polipeptídeo variante se liga especificamente ao ectodomínio de PD-L1 com seletividade aumentada em comparação com o CD80 não modificado do ectodomínio de PD-L1.
52. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 51, em que a seletividade aumentada compreende uma razão maior de ligação do polipeptídeo variante para PD-L1 versus CD28 em comparação com a razão de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para PD-L1 versus CD28.
53. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 52, em que a razão é maior em pelo menos ou pelo menos cerca de 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou mais.
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54. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 53 que é uma proteína solúvel.
55. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 54, em que:
o polipeptídeo CD80 variante não possui o domínio transmembranar CD80 e o domínio de sinalização intracelular; e/ou o polipeptídeo CD80 variante não é capaz de ser expresso na superfície de uma célula.
56. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 55, em que o polipeptídeo CD80 variante está ligado a uma porção que aumenta a meia-vida biológica do polipeptídeo.
57. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 56, em que o polipeptídeo CD80 variante está ligado a um domínio de multimerização.
58. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 57, em que o domínio de multimerização é um domínio Fc ou um domínio Fc variante com função efetora reduzida.
59. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 58, em que:
o domínio Fc é mamífero, opcionalmente é humano, de camundongo ou de coelho; ou o domínio Fc variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em comparação com um domínio Fc não modificado que é mamífero, opcionalmente humano.
60. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 58 ou modalidade 59, em que:
o domínio Fc ou sua variante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 359, ou SEQ ID NO: 1712 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
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96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 359 ou SEQ ID NO: 1712; ou o domínio Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3039 ou 3040 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3039 ou 3040.
61. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 58 a 60, em que o domínio Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas entre E233P, L234A, L234V, L235A, L235E, G236del, G237A, S267K, N297G, V302C e K447del cada por numeração EU, opcionalmente em que uma ou mais modificações de aminoácidos estão em uma lgG1 humana.
62. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 58 a 60, em que o domínio Fc compreende a modificação de aminoácidos C220S por numeração EU.
63. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 58 a 62, em que o domínio Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 356358, 376 e 1712-1715 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial em relação a quaisquer SEQ ID NOS: 356-358, 376 e 1712-1715 e exibe função efetora reduzida.
64. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 57 a 63, em que o polipeptídeo CD80 variante está ligado ao domínio de multimerização ou Fc indiretamente através de um ligante, opcionalmente um ligante G4S.
65. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 53, em que o polipeptídeo CD80 variante é uma pro
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365/474 teína imunomoduladora transmembranar compreendendo adicionalmente um domínio transmembranar, opcionalmente em que o domínio transmembranar está ligado, direta ou indiretamente, ao domínio extracelular (ECD) ou fragmento de ligação específica do mesmo do polipeptídeo CD80 variante.
66. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 65, em que o domínio transmembranar compreende a sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 243-263 da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência aos resíduos 243-263 da SEQ ID NO: 1.
67. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 65 ou modalidade 66, compreendendo ainda um domínio de sinalização citoplasmático, opcionalmente em que o domínio de sinalização citoplasmático está ligado, direta ou indiretamente, ao domínio transmembranar.
68. O polipeptídeo CD80 variante da modalidade 67, em que o domínio de sinalização citoplasmático compreende a sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 264-288 da SEQ ID NO: 1 ou uma variante funcional da mesma que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência em relação aos resíduos 254-288 de SEQ ID NO: 1.
69. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que o CD80 variante aumenta a expressão de IFN-gama (interferon-gama) relativamente ao CD80 não modificado em um ensaio in vitro de células T primárias.
70. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que o CD80 variante diminui a expressão de IFN-gama (interferon gama) em relação ao CD80 não modificado em um ensaio de células T primárias in vitro.
71. O polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das
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366/474 modalidades 1 a 70 que é deglicosilado.
72. Uma proteína imunomoduladora compreendendo o polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71 e uma porção que se estende meia-vida.
73. A proteína imunomoduladora da modalidade 72, em que a metade que se prolonga na meia-vida compreende um domínio de multimerização, albumina, um polipeptídeo de ligação à albumina, Pro/Ala/Ser (PAS), um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade beta da gonadotrofina coriônica humana, polietilenoglicol (PEG), sequências hidrofílicas longas não estruturadas de aminoácidos (XTEN), hidroxietilamido (HES), uma molécula pequena de ligação à albumina ou uma combinação dos mesmos.
. A proteína imunomoduladora da modalidade 72 ou modalidade 73, em que a porção que se prolonga na meia- vida ou compreende Pro/Ala/Ser (PAS) e o polipeptídeo CD80 variante está PASilado.
75. A proteína imunomoduladora da modalidade 72 ou modalidade 73, em que a porção que se prolonga na semi- vida ou compreende um domínio de multimerização.
76. A proteína imunomoduladora da modalidade 75, em que o domínio de multimerização é selecionado a partir de uma região Fc de uma imunoglobulina, um zíper de leucina, um zíper de isoleucina ou um dedo de zinco.
77. A proteína imunomoduladora da modalidade 75 ou modalidade 76, em que a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreendendo o primeiro e o segundo polipeptídeos
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CD80 variantes.
78. A proteína imunomoduladora da modalidade 77, em que o multímero é um dímero.
79. A proteína imunomoduladora da modalidade 77 ou modalidade 78, em que o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais.
80. A proteína imunomoduladora da modalidade 78 ou modalidade 79, em que o dímero é um homodímero.
81. A proteína imunomoduladora da modalidade 78, em que o dímero é um heterodímero.
82. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 75 a 81, em que o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc de uma imunoglobulina.
83. A proteína imunomoduladora da modalidade 82, em que a região Fc é de uma proteína imunoglobulina G1 (lgG1) ou uma imunoglobulina G2 (lgG2).
84. A proteína imunomoduladora da modalidade 82 ou modalidade 83, em que a proteína de imunoglobulina é humana e/ou a região Fc é humana.
85. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 84, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 278 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 278.
86. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 85, em que a região Fc compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 277 ou uma variante da mesma que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
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277.
87. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 86, em que a região Fc apresenta uma ou mais funções efetoras.
88. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 87, em que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc, opcionalmente em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antígeno, opcionalmente em que as células T compreendem células Jurkat expressando uma IL-2 repórter ou células T humanas primárias produtoras de citocinas inflamatórias, tais como IL-2.
89. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 86, em que a região Fc exibe uma ou mais funções efetoras que são reduzidas em comparação com uma região Fc de tipo selvagem, opcionalmente em que a região Fc de tipo selvagem é uma Fc humana de IgG 1 humana.
90. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 87 a 89, em que a uma ou mais funções efetoras são selecionadas entre citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento, morte celular programada e fagocitose celular.
91. A proteína imunomoduladora da modalidade 89 ou modalidade 90, em que a região Fc é uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos comparativamente com a região Fc de tipo selvagem.
92. A proteína imunomoduladora da modalidade 91, em que a uma ou mais substituições de aminoácidos da região Fc variante são selecionadas de N297G, R292C/N297G/V302C, E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K ou L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
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93. A proteína imunomoduladora da modalidade 92, em que a região Fc variante compreende ainda a substituição de aminoácidos C220S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
94. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 89 a 93, em que a região Fc compreende a sequência da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 356-358 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 356358 e contém as substituições de aminoácidos.
95. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 89 a 94, em que a região Fc compreende K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
96. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 89 a 93 e 95, em que a região Fc compreende a sequência da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1713-1715 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1713-1715 e contém as substituições de aminoácidos.
97. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 82 a 96, em que o polipeptídeo CD80 variante é o polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 44 a 48.
98. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 97, em que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, opcionalmente em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antígeno expressando PD-L1, opcionalmente em que as células T compreendem células Jurkat que expressam um repórter de IL-2 ou
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370/474 células T humanas primárias produzindo citocinas inflamatórias, tais como IL-2.
99. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 98, em que o polipeptídeo CD80 variante está ligado, direta ou indiretamente, através de um ligante, à porção que se prolonga na meia-vida, opcionalmente o domínio de multimerização.
100. A proteína imunomoduladora da modalidade 99, em que o ligante compreende 1 a 10 aminoácidos.
101. A proteína imunomoduladora de modalidade 100, em que o ligante é selecionado a partir de AAA, G4S (SEQ ID NO: 1717) ou (G4S)2 (SEQ ID NO: 330).
102. Uma proteína imunomoduladora compreendendo o polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71 ligado, direta ou indiretamente, através de um ligante, a um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio de superfamília de imunoglobulina (IgSF) de um membro da família de IgSF.
103. A proteína imunomoduladora da modalidade 102, em que o domínio IgSF é um domínio IgSF modificado por afinidade, sendo que o dito domínio IgSF modificado por afinidade compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em comparação com o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF.
104. A proteína imunomoduladora da modalidade 103, em que o domínio IgSF é um domínio IgSF modificado por afinidade que exibe ligação alterada a um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos em comparação com a ligação do domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF para o mesmo ou mais parceiros de ligação cognatos.
105. A proteína imunomoduladora da modalidade 104, em que o domínio IgSF exibe uma ligação aumentada a um ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos em comparação com a ligação do
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371/474 domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF ao mesmo um ou mais parceiros de ligação cognatos.
106. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 105, em que o polipeptídeo CD80 variante é um primeiro polipeptídeo CD80 variante e o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF de um segundo polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71, em que primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes são iguais ou diferentes.
107. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 106, em que o polipeptídeo CD80 variante é capaz de se ligar especificamente a CTLA-4 e o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é capaz de se ligar a um parceiro de ligação cognato diferente de um especificamente ligado pelo polipeptídeo variante CD80.
108. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 107, em que o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é uma porção localizadora de tumor que se liga a um ligando expresso em um tumor ou que se liga a um ligando expresso em um tumor ou é uma porção localizadora inflamatória que se liga a uma célula ou tecido associado a um ambiente inflamatório.
109. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 108, em que o ligando é B7H6.
110. O polipeptídeo imunomodulador da modalidade 108 ou modalidade 109, em que o domínio IgSF é de NKp30.
111. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 107, em que o domínio IgSF do segundo polipeptídeo é um domínio IgSF de um ligando que se liga a um receptor inibidor, ou é um domínio IgSF do mesmo modificado por afinidade.
112. A proteína imunomoduladora da modalidade 111, em que o domínio IgSF modificado por afinidade exibe uma maior afinidade de ligação e/ou seletividade de ligação para o receptor inibidor em
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372/474 comparação com a ligação do domínio IgSF não modificado ao mesmo receptor inibidor.
113. A proteína imunomoduladora da modalidade 111 ou 112, em que:
o receptor inibidor é TIGIT ou PD-1; ou o ligando do receptor inibidor é CD155, CD112, PD-L1 ou PD-L2.
114. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 107 e 111 a 113, em que o segundo polipeptídeo é selecionado de:
(i) um CD112 de tipo selvagem compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 269, 734 ou 829 ou um polipeptídeo CD112 variante compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 735-828, 830999, 1430-1501;
(ii) um CD155 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 268, 378 ou 421 ou um polipeptídeo CD155 variante compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer de SEQ ID NOS: 379-420, 422-733, 1502 1711;
(iii) um PD-L1 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 251, 1000, 1721 ou 1196 ou um polipeptídeo PD-L1 variante compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 1001 a 1195, 1718-1720, 1722-1996;
(iv) um PD-L2 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer um dos polipeptídeos da PD-L2 da SEQ ID NOS: 252, 1197 ou 1257 compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer de SEQ ID NOS: 1198-1248, 1250-1256 1258-1325, 1327-1401, 1403-1426;
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373/474 (v) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ. ID NOS em (i) - (iv) e que compreende a substituição de aminoácidos; ou (vi) um fragmento de ligação específica de qualquer um de (i) - (v).
115. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 114, compreendendo ainda um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio IgSF de um membro da família IgSF ou um domínio IgSF do mesmo modificado por afinidade, sendo que o dito domínio IgSF modificado por afinidade compreende uma ou mais modificações de aminoácidos comparadas com o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF.
116. A proteína imunomoduladora da modalidade 115, em que:
o terceiro polipeptídeo é o mesmo que o primeiro e/ou segundo polipeptídeo; ou o terceiro polipeptídeo é diferente do primeiro e/ou do segundo polipeptídeo.
117. A proteína imunomoduladora da modalidade 115 e modalidade 116, em que o terceiro polipeptídeo é selecionado de:
(i) um CD112 de tipo selvagem compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 269, 734 ou 829 ou um polipeptídeo CD112 variante compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 735-828, 830999, 1430-1501;
(ii) um CD155 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 268, 378 ou 421 ou um polipeptídeo CD155 variante compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer de SEQ ID NOS: 379-420, 422-733, 1502
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1711;
(iii) um PD-L1 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 251, 1000, 1721 ou 1196 ou um polipeptídeo PD-L1 variante compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 1001 a 1195, 1718-1720, 1722-1996;
(iv) um PD-L2 de tipo selvagem compreendendo uma IgSF apresentada em qualquer um dos polipeptídeos da PD-L2 da SEQ ID NOS: 252, 1197 ou 1257 compreendendo um domínio IgSF apresentado em qualquer de SEQ ID NOS: 1198-1248, 1250-1256 1258-1325, 1327-1401, 1403-1426;
(v) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ. ID NOS em (i) (iv) e que compreende a substituição de aminoácidos; ou (vi) um fragmento de ligação específica de qualquer um de (i) - (v).
118. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 117, em que o domínio IgSF ou o domínio IgSF do mesmo modificado por afinidade, opcionalmente do segundo ou terceiro polipeptídeo é ou compreende um domínio IgV.
119. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 118, em que o polipeptídeo CD80 variante é ou compreende um domínio IgV.
120. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 115 a 119, compreendendo ainda pelo menos um polipeptídeo adicional compreendendo um domínio IgSF de um membro da família IgSF ou um seu domínio IgSF modificado por afinidade, sendo que o dito domínio IgSF modificado por afinidade compreende uma ou mais modificações de aminoácidos comparadas ao domínio
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IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF.
121. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 102 a 120, em que a proteína imunomoduladora compreende adicionalmente um domínio de multimerização ligado a pelo menos um do polipeptídeo CD80 variante, ou o segundo polipeptídeo.
122. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 115 a 120, em que a proteína imunomoduladora compreende adicionalmente um domínio de multimerização ligado a pelo menos um do polipeptídeo CD80 variante, o segundo polipeptídeo e/ou o terceiro polipeptídeo.
123. A proteína imunomoduladora da modalidade 121 ou 122, em que o domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante do mesmo com função efetora reduzida.
124. Proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 121 a 123, em que o domínio de multimerização promove a formação de heterodímeros.
125. Uma proteína imunomoduladora compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 57 a 64 em que o domínio de multimerização é um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 57 a 64 em que o domínio de multimerização é um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero contendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes.
126. Uma proteína imunomoduladora compreendendo a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 77 a 81, em que o domínio de multimerização é um primeiro domínio de multimerização e interage com um segundo domínio de multimerização para formar um multímero compreendendo a proteína imunomoduladora.
127. A proteína imunomoduladora da modalidade 126, em
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376/474 que a proteína imunomoduladora é uma primeira proteína imunomoduladora e uma segunda proteína imunomoduladora ligada diretamente ou indiretamente através de um ligante ao segundo domínio de multimerização, em que o multímero compreende a primeira e segunda proteínas imunomoduladoras.
128. A proteína imunomoduladora da modalidade 127, em que a segunda proteína imunomoduladora é uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 77 a 81, em que o domínio de multimerização é o segundo domínio de multimerização.
129. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 125 a 128, em que o multímero é um dímero.
130. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 125 a 129 que é um homodímero.
131. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 125 a 129 que é um heterodímero.
132. A roteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 125 a 131, em que o primeiro e/ou segundo domínio de multimerização é um domínio Fc ou uma variante do mesmo com função efetora reduzida.
133. A proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 125 a 132, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização são iguais ou diferentes.
134. Um conjugado que compreende um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71 ou uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133 ligadas a uma porção, opcionalmente em que o conjugado é uma proteína de fusão.
135. O conjugado da modalidade 134, em que a porção é uma porção de direcionamento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula.
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136. O conjugado da modalidade 135, em que a porção de direcionamento se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula imunitia, opcionalmente em que a célula imunológica é uma célula apresentadora de antígeno ou um linfócito.
137. O conjugado da modalidade 135, em que a porção de direcionamento é uma porção de localização de tumor que se liga a uma molécula na superfície de um tumor.
138. O conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 137, em que a porção é uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopartícula.
139. O conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 138, em que a porção é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.
140. O conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 139, em que o conjugado é divalente, tetravalente, hexavalente ou octavalente.
141. O conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 139 que é uma proteína de fusão.
142. Uma molécula (ou moléculas) de ácido nucleico, codificando um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71, uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133 ou um conjugado que é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 134 a 141.
143. A molécula de ácido nucleico da modalidade 142 que é um ácido nucleico sintético.
144. A molécula de ácido nucleico da modalidade 142 ou modalidade 143 que é cDNA.
145. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 142 a 144.
146. O vetor da modalidade 145 que é um vetor de ex
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378/474 pressão.
147. O vetor da modalidade 145 ou modalidade 146, em que o vetor um vetor de expressão de mamífero ou um vetor viral.
148. Uma célula compreendendo o vetor da modalidade 146 ou da modalidade 147.
149. A célula da modalidade 148 que é uma célula de mamífero.
150. A célula da modalidade 148 ou modalidade 149 que é uma célula humana.
151. Um método para produzir um polipeptídeo CD80 variante ou uma proteína imunomoduladora compreendendo a introdução da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 142 a 144 ou vetor de qualquer uma das modalidades 145 a 147 em uma célula hospedeira sob condições para expressar a proteína na célula.
152. O método da modalidade 151, compreendendo ainda isolar ou purificar o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora da célula.
153. Um método de manipular uma célula que expressa um polipeptídeo variante de CD80 variante, compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71 em uma célula hospedeira sob condições em que o polipeptídeo é expresso na célula.
154. Uma célula manipulada, que expressa um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71, uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133, um conjugado que é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 134 a 141, uma molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades 142 a 145 ou um vetor de qualquer uma das modalidades 145 a 147.
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155. A célula manipulada da modalidade 154, em que o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora é codificado por um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinal.
156. A célula manipulada da modalidade 154 ou modalidade 155, em que o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora não compreende um domínio transmembranar e/ou não é expresso na superfície da célula.
157. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 154 a 156, em que o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora é secretado ou é capaz de ser secretado a partir da célula manipulada.
158. A célula manipulada da modalidade 154 ou da modalidade 155, em que a célula manipulada compreende um polipeptídeo CD80 variante que compreende um domínio transmembranar e/ou é a proteína imunomoduladora transmembranar de qualquer uma das modalidades 65 a 71.
159. A célula manipulada da modalidade 154, modalidade 155 ou modalidade 158, em que o polipeptídeo CD80 variante é expresso na superfície da célula.
160. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 154 a 159, em que a célula é uma célula imunológica.
161. A célula manipulada da modalidade 160, em que a célula imunológica é uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou um linfócito.
162. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 159 a 161 que é uma célula primária.
163. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 159 a 162, em que a célula é uma célula de mamífero.
164. A célula manipulada de qualquer uma das modalida
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380/474 des 159 a 163, em que a célula é uma célula humana.
165. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 159 a 164, em que a célula é um linfócito e o linfócito é uma célula T.
166. A célula manipulada da modalidade 161, em que a célula é uma APC e a APC é uma APC artificial.
167. A célula manipulada de qualquer uma das modalidades 154 a 166, compreendendo ainda um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T manipulado.
168. Um agente infeccioso compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71, uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133 ou um conjugado que é uma proteína de fusão de qualquer uma das modalidades 134 a 141.
169. O agente infeccioso da modalidade 168, em que o polipeptídeo CD80 variante codificado, proteína ou conjugado imunomodulador não compreende um domínio transmembranar e/ou não é expresso na superfície de uma célula na qual é expresso.
170. O agente infeccioso da modalidade 168 ou modalidade 169, em que o polipeptídeo CD80, o polipeptídeo ou conjugado imunomodulador codificado é secretado ou é capaz de ser secretado de uma célula na qual é expresso.
171. O agente infeccioso da modalidade 168, em que o polipeptídeo CD80 variante codificado compreende um domínio transmembranar.
172. Um agente infeccioso da modalidade 168 ou modalidade 171, em que o polipeptídeo CD80 variante codificado é expresso na superfície de uma célula na qual é expresso.
173. O agente infeccioso de qualquer uma das modalidades 168 a 172, em que o agente infeccioso é uma bactéria ou um ví
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381/474 rus.
174. O agente infeccioso da modalidade 173, em que o agente infeccioso é um vírus e o vírus é um vírus oncolítico.
175. O agente infeccioso da modalidade 174, em que o vírus oncolítico é um adenovirus, vírus adenoassociado, herpesvirus, vírus de herpes simplex, reovírus, vírus da doença de Newcastle, parvovirus, vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Coxsackie ou um vírus Vaccinia.
176. O agente infeccioso da modalidade 175, em que o vírus visa especificamente células dendríticas (DCs) e/ou é trópico de células dendríticas.
177. O agente infeccioso da modalidade 176, em que o vírus é um vetor lentiviral que é pseudotipado com um produto de envelope de vírus Sindbis modificado.
178. O agente infeccioso de qualquer uma das modalidades 168 a 177, compreendendo ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um outro produto genético que resulta na morte de uma célula-alvo ou que pode aumentar ou impulsionar uma resposta imunológica.
179. O agente infeccioso da modalidade 178, em que o produto genético adicional é selecionado de um agente anticancerígeno, um agente antimetastático, um agente antiangiogênico, uma molécula imunomoduladora, um inibidor de ponto de checagem imunológico, um anticorpo, uma citocina, um fator de crescimento, um antígeno, um produto genético citotóxico, um produto genético pró-apoptótico, um produto genético antiapoptótico, um gene degradativo da matriz celular, genes para regeneração de tecidos ou reprogramação de células somáticas humanas para pluripotência.
180. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71,
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382/474 uma proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133, um conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 141, uma célula manipulada de qualquer uma das modalidades 154 a 167 ou um agente infeccioso de qualquer uma das modalidades 168 a 179.
181. A composição farmacêutica da modalidade 180, compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável.
182. A composição farmacêutica da modalidade 179 ou 180, em que a composição farmacêutica é estéril.
183. Um artigo de fabricação compreendendo a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 179 a 182 em um frasco.
184. O artigo de fabricação da modalidade 183, em que o frasco é selado.
185. Um kit compreendendo a composição farmactica de qualquer uma das modalidades 179 a 182 e instruções para utilização.
186. Um kit compreendendo o artigo de fabricação de acordo com a modalidade 183 e 184, e instruções para utilização.
187. Um método de modulação de uma resposta imunológica em um indivíduo, compreendendo administrar a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 180 a 182 ao indivíduo.
188. Um método de modulação de uma resposta imunológica em um indivíduo, compreendendo a administração da proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 101.
189. O método da modalidade 187 ou 188, em que a resposta imunológica é aumentada.
190. O método da modalidade 188 ou modalidade 189, em que a proteína imunomoduladora é a proteína imunomoduladora da modalidade 88 que exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc.
191. O método de qualquer uma das modalidades 186 a 188, em que a proteína imunomoduladora é a proteína imunomodula-
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383/474 dora da modalidade 98 que apresenta coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, opcionalmente em que a proteína imunomoduladora compreende o polipeptídeo CD80 variante de acordo com qualquer uma das reivindicações.
192. Um método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, compreendendo a administração das células manipuladas de qualquer uma das modalidades 154 a 167.
193. O método da modalidade 192, em que as células manipuladas são autólogas para o indivíduo.
194. O método da modalidade 192, em que as células manipuladas são alogênicas para o indivíduo.
195. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
194, em que a modulação da resposta imunológica trata uma doença ou condição no indivíduo.
196. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
195, em que a resposta imunológica é aumentada.
197. O método de qualquer uma das modalidades 187 a 191, 195, ou 196, em que um polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora que é solúvel, opcionalmente que não possui um domínio de sinalização transmembranar e intracelular CD80, é administrado ao indivíduo.
198. O método da modalidade 197, em que o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora é uma proteína de fusão Fc.
199. O método de qualquer uma das modalidades 187 a 198, em que um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 68 e 71, ou a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133 é administrado ao indivíduo.
200. O método de qualquer uma das modalidades 192 a
196, em que uma célula manipulada compreendendo um polipeptídeo
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CD80 variante secretável é administrada ao indivíduo.
201. O método de qualquer uma das modalidades 192 a 196 e 200, em que uma célula manipulada de qualquer uma das modalidades 154 a 167 é administrada ao indivíduo.
202. O método de qualquer uma das modalidades 187 a 191, 195 e 196, em que um agente infeccioso que codifica um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora secretável é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula tumoral ou célula imunológica e a proteína imunomoduladora secretável é secretada da célula infectada.
203. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
202, em que a doença ou condição é um tumor ou câncer.
204. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
203, em que a doença ou condição é selecionada de melanoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga, malignidade hematológica, câncer de fígado, câncer cerebral, câncer renal, câncer de mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do baço, câncer da próstata, câncer testicular, câncer dos ovários, câncer do útero, carcinoma gástrico, câncer musculoesquelético, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer das células germinativas ou câncer endócrino e neuroendócrino.
205. O método de qualquer uma das modalidades 187, 188 e 192 a 195, em que a resposta imunológica é diminuída.
206. O método de qualquer uma das modalidades 187, 188, 192 a 195 e 205, em que uma proteína ou conjugado imunomodulador compreendendo um polipeptídeo CD80 variante ligado a uma porção que se localiza em uma célula ou tecido de um ambiente inflamatório é administrado ao indivíduo.
207. O método da modalidade 206, em que a porção compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do
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385/474 mesmo ou compreende um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio IgSF de tipo selvagem ou variante do mesmo.
208. O método de qualquer uma das modalidades 187 a 191, 195 e 205 a 207, em que a proteína imunomoduladora de qualquer uma das modalidades 72 a 133 ou o conjugado de qualquer uma das modalidades 134 a 141 é administrado ao indivíduo, opcionalmente em que a proteína imunomoduladora ou o conjugado compreende um polipeptídeo CD80 variante que exibe uma afinidade de ligação aumentada a CTLA-4.
209. O método de qualquer uma das modalidades 187 a 195 e 205, em que um polipeptídeo CD80 variante compreendendo um domínio transmembranar é administrado ao indivíduo.
210. O método de qualquer uma das modalidades 192 a 195, 205 e 209, em que uma célula manipulada compreendendo um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora transmembranar de qualquer uma das modalidades 158 a 167 é administrada ao indivíduo.
211. O método de qualquer uma das modalidades 187, 195 e 205, em que um agente infeccioso codificando um polipeptídeo CD80 variante que é uma proteína imunomoduladora transmembranar é administrado ao indivíduo, opcionalmente sob condições em que o agente infeccioso infecta uma célula tumoral ou célula imunológica e a proteína imunomoduladora transmembranar é expressa na superfície da célula infectada.
212. O método de qualquer uma das modalidades 195 e 205 a 211, em que a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune.
213. O método de qualquer uma das modalidades 195 e 205 a 212, em que a doença ou estado é uma vasculite associada a anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), uma vasculite, uma
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386/474 doença cutânea autoimune, transplante, uma doença reumática, uma doença gastrointestinal inflamatória, uma doença ocular inflamatória, uma doença neurológica inflamatória, uma doença inflamatória pulmonar, uma doença inflamatória endócrina ou uma doença hematológica autoimune.
214. O método de qualquer uma das modalidades 195 e 205 a 213, em que a doença ou patologia é selecionada de doença inflamatória do intestino, transplante, doença de Crohn, oolite ulcerativa, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou psoríase.
215. Um método para aumentar uma resposta imunológica em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou em um fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1.
216. O método da modalidade 215, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
217. Um método de mediação do agonismo de CD28 por costimulação de CD28 dependente de PD-L1 em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, em que o dito polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no IgV domínio ou domínio IgC ou o fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o
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387/474 polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 comparado com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD -L1.
218. O método da modalidade 216 ou modalidade 217, em que a afinidade aumentada para o ectodomínio de PD-L1 é aumentada mais de 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
219. O método de qualquer uma das modalidades 215 a 219, que é para uso no tratamento de uma doença ou condição.
220. O método de qualquer uma das modalidades 217 a
219, em que a coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 é avaliada em um ensaio de estimulação de células T na presença de células apresentadoras de antígeno expressando PD-L1, opcionalmente em que o ensaio de estimulação de células T é um ensaio in vitro, opcionalmente, em que as células T compreendem células Jurkat que expressam um repórter de IL-2.
221. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
220, em que:
antes da administração, selecionar um indivíduo para tratamento que tem um tumor compreendendo células positivas para a superfície PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positivas para PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor.
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222. O método da modalidade 221, em que selecionar um indivíduo compreende:
(a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de PD-L1;
(b) detectar a presença do reagente de ligação ligado em ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies de células positivas para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento.
223. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 222, em que:
antes da administração, a seleção de um indivíduo para tratamento que tem um tumor compreendendo superfícies celulares positivas para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positivas para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos infiltrantes de tumor, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+.
224. O método da modalidade 223, em que a seleção do assunto compreende:
(a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de CD28;
(b) detectar a presença do reagente de ligação ligado em ou sobre células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente, em que
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389/474 as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente, em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies celulares positivas para CD28, selecionar o indivíduo para tratamento.
225. Um método de seleção de um indivíduo para tratamento, sendo que o método compreende:
(a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente PD-L1; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado em ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tumor compreender um nível detectável de superfície de células positivas para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento com uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, em que o dito polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou no fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado o ectodomínio de PD-L1.
226. O método da modalidade 225, compreendendo o contato da amostra de tecido tumoral com um reagente de ligação capaz de se ligar especificamente a CD28, em que o indivíduo é selecionado se a amostra de tecido tumoral compreender ainda um nível detectável de linfócitos de infiltração tumoral positivos para CD28, opcio
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390/474 nalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+.
227. O método de qualquer uma das modalidades 222 e 224 a 226, em que a amostra de tecido tumoral compreende células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estremais ou qualquer combinação destas.
228. O método de qualquer uma das modalidades 222 e 224 a 227, em que o reagente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ligando proteico ou parceiro de ligação, um aptâmero, um afímero, um peptídeo ou um hapteno.
229. O método da modalidade 222, 224, 227 ou 228, em que o reagente de ligação é um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno.
230. O método de qualquer uma das modalidades 222 a 229, em que o reagente de ligação compreende um polipeptídeo CD80 variante de qualquer uma das modalidades 1 a 71.
231. O método da modalidade 230, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
232. O método da modalidade 230 ou modalidade 231, em que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de ligação.
233. O método de qualquer uma das modalidades 230 a 232, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para ligação a PD-L1 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
234. O método de qualquer uma das modalidades 222 e 224 a 233, em que o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a uma porção que é uma porção detectável ou uma porção capaz de detecção.
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235. O método da modalidade 234, em que a porção é uma região Fc.
236. O método da modalidade 235, em que a região Fc é não humana, opcionalmente é camundongo ou coelho.
237. O método de qualquer uma das modalidades 222 e 224 a 236, em que a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imuno-histoquímica, pseudo-imuno-histoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
238. O método de qualquer uma das modalidades 225 a
237, compreendendo ainda a administração da proteína imunomoduladora ao indivíduo.
239. O método de qualquer uma das modalidades 187 a
238, em que o indivíduo é um indivíduo humano.
240. O método de qualquer de qualquer uma das modalidades 215 a 239, em que a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreendendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes.
241. O método da modalidade 240, em que o multímero é um dímero.
242. O método da modalidade 240 ou da modalidade 241, em que o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais.
243. O método de qualquer uma das modalidades 240 a 242, em que o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc.
244. O método da modalidade 243, em que a região Fc é
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392/474 uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com uma região Fc de tipo selvagem, em que a região Fc exibe uma ou mais funções efetoras que são reduzidas em comparação com a região Fc de tipo selvagem, opcionalmente onde o Fc de tipo selvagem é IgG 1 humano.
245. O método de qualquer uma das modalidades 215 a
244, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo às posições 7, 12, 13, 15, 16, 18, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 51 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 63, 64, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e/ou 97, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2.
246. O método de qualquer uma das modalidades 215 a
245, em que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modifica- ções de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, selecionado de E7D, A12V, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18L, H18T,
H18V, H18Y, V20A, V20I, S21P, V22A, V22D, V22I, V22L, E23D,
E23G, E24D, L25S, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P,
A26Q, A26R, A26S, A226, Q27H, Q27L, Q27R, T28Y, R29C, R29H,
I30T, I30V, Y31H, Y31S, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, K37E, M38I, M38T, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V,
M43I, M43L, M43T, M43V, S44P, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I,
M47L, M47T, M47V, M47Y, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T,
N48Y, P51A, Y53F, Y53H, K54R, N55D, N55I, T57I, I58V, 161F, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, N64S, L65P, I67L, I67T, V68A, V68I, V68L, V68M, I69F, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M,
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T79P, E81G, E81K, C82R, V83A, V83I, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K86E, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87N, Y87Q, E88D, E88G, K89E, K89N, D90G, D90K, D90N, A90G, A91S, A91T, A91V, F92L, F92S, F92V, F92Y, K93E, K93R, K93T, R94L, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q e L97R, onde a posição (ou posições) da substituição (ou substituições) de aminoácido corresponde às posições de CD80 estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
247. O método de qualquer uma das modalidades 215 a 245, em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de:
Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71 D, T57I, M43I/C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/ A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/
I67T/P74S/E81G/E85D, A71D, T13A/I61N/A71 D, E81K, A12V/ M47V/ L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/ I61V/A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/ V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, E35D/A71D, E35D/ I67L/A71D, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M,
E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, M47V/I69F/A71D/V83I, H18Y/A26T/E35D/A71 D/ L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71 D/ E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, V22L/E35D/M43L/A71G/
D76H, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/
V68L/K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/ E35D/ M47L/ L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/
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E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/ E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/
E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/ M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/ Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/ E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/ M47L/ T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/ L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/ L85Q/ R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/ E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/ E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L37Q, Q33L/E35D/M47L/ V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/ L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47V/L97Q,
E35DL97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/ L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/ T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/ E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/ A71G/L85Q, E35D/M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/ A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/ E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/ T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/V22A/ E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/M70M/A71G, E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q,
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E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/ M47L/A71G/L85M/F92Y, V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/ M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R, Q33L/E35D/M43I/Y53F/ T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/ L85IW F92L, E35D/M38T/M43V/M48V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/ E35D/D46V/M47I/A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/ M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/
D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/ 161F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/ M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/ D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/ L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D,
E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/ T62A/ N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/ E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/ E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E 95V/ L97Q, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/ V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/ M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q, E35D/M43L E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/ N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L85M, E35D/
M47V/ V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/T41S/ D46E/ M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/
L85M, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/ L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/ V68IW
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E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/ Y53F/ V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/ V68IW L85M, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/ A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/ L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T85M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/ N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/ E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/ E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/ E35D/ M47L/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/ V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/ Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/M35V/ V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/
V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/ V68IW A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18T/ A26N/ E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/
A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/ V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/ V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/ E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/ E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26S/E35D/M47L/ V68 M/A71G/D90G, H18 V/A26 R/E35D/M47L/V68 M/A71G/D90G,
H18V/A26/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/
V68 M/A71G/D90G, H18 A/A26 N/E35D/M47L/V68 M/A71G/D90G,
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H18F/ A26P/ E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/ V68 M/A71G/D90G, Η18 F/A26 N/E35D/M47 V/V68 Μ/Α71G/D90G,
Η18Υ/ A26P/E35D/M47A/V68I/A71G/D90G, H18Y/A26Q/E35D/M47T/ V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P e Η18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68 Μ/Α71G/D90G.
248. Ο método de qualquer uma das modalidades 215 a 247, em que o polipeptídeo CD80 variante retém a ligação a CD28.
249. O método da modalidade 248, em que o polipeptídeo CD80 variante retém pelo menos ou pelo menos cerca de 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15 %, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da afinidade ao ectodomínio de CD28, comparado com a afinidade de ligação do polipeptídeo CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
250. O método de qualquer uma das modalidades 215 a 249, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de CD28 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
251. O método da modalidade 250, em que a afinidade aumentada para o ectodomínio de CD28 é aumentada mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 150 vezes ou 200 vezes, em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de CD28.
252. O método de qualquer uma das modalidades 219 a
251, em que o aumento da resposta imunológica trata a doença ou condição no indivíduo.
253. O método de qualquer uma das modalidades 219 a
252, em que a doença ou condição é um tumor ou câncer.
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254. O método de qualquer uma das modalidades 219 a 253, em que a doença ou patologia é selecionada de melanoma, câncer do pulmão, câncer da bexiga, malignidade hematológica, câncer do fígado, câncer do cérebro, câncer renal, câncer da mama, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do baço, câncer da próstata, câncer testicular, câncer do ovário, câncer do útero, carcinoma gástrico, câncer musculoesquelético, câncer da cabeça e do pescoço, câncer gastrointestinal, câncer das células germinativas ou câncer endocrine e neuroendócrino.
255. Um método para detectar um parceiro de ligação a CD80 em uma amostra biológica, sendo que o método compreende:
(a) colocar em contato uma amostra biológica com um reagente de ligação compreendendo um polipeptídeo CD80 variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado nas células da amostra biológica.
256. O método da modalidade 255, em que o parceiro de ligação é PD-L1, CD28, CTLA-4 ou suas combinações.
257. O método da modalidade 255 ou modalidade 256, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou o fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
258. O método de qualquer uma das modalidades 255 a 257, em que a amostra biológica é ou compreende um fluido corporal, célula ou amostra de tecido.
259. O método da modalidade 258, em que o fluido corpo
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399/474 ral é soro, plasma ou urina.
260. O método da modalidade 258, em que a amostra de tecido é uma amostra de tecido tumoral.
261. O método da modalidade 260, em que a amostra de tecido tumoral compreende células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estromais ou qualquer combinação destas.
262. O método de qualquer uma das modalidades 255 a 261, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
263. O método da modalidade 262, em que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de ligação.
264. O método de qualquer uma das modalidades 255 a 263, em que o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a um marcador que é uma porção detectável ou a uma porção capaz de detecção.
265. O método da modalidade 264, em que a porção é uma região Fc.
266. O método da modalidade 265, em que a região Fc é não humana, opcionalmente é camundongo ou coelho.
267. O método de qualquer uma das modalidades 255 a 266, em que a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imuno-histoquímica, pseudo-imuno-histoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
IX. EXEMPLOS [00589] Os exemplos seguintes são incluídos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção.
EXEMPLO 1
Geração de Construtos de DNA Mutante de Domínios IgSF [00590] O Exemplo 1 descreve a geração de construtos de DNA
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400/474 mutante de domínios de IgSF CD80 humanos para tradução e expressão na superfície de levedura como bibliotecas de exibição de levedura.
A. Bibliotecas Degeneradas [00591] Os construtos foram gerados com base em uma sequência de CD80 humano de tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 3031, contendo o domínio do tipo V de imunoglobulina (IgV) como se segue:
[00592] VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVL TMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYE KDAFKREHLAEVTLSVKAD (SEQ ID NO: 3031) [00593] Para bibliotecas que visam resíduos específicos para randomização completa ou parcial com códons degenerados, códons degenerados, tais como conjuntos de bases misturadas específicas para codificar várias substituições de aminoácidos, foram gerados utilizando um algoritmo na URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/. Em geral, as posições para mutação foram escolhidas da informação de estrutura de cristal para o CD80 ligado ao CTLA4 na URL: rcsb.org/pdb/ explore/explore.do?structureld=1l8L, e uma biblioteca-alvo foi manipulada com base na interface CD80::CTLA4 para seleção de ligantes aprimorados para CTLA4. Por exemplo, a informação estrutural foi utilizada para identificar resíduos de interface de contato ou sem contato para mutagênese com códons degenerados. Esta análise foi realizada usando um visualizador de estrutura disponível na URL: spdbv.vitalit.ch.
[00594] A etapa seguinte no desenho da biblioteca foi o alinhamento das sequências de CD80 humano, murganho, rato e macaco para identificar quais dos resíduos escolhidos para mutagese eram resíduos conservados. Com base nesta análise, os resíduos-alvo conservados foram mutados com códons degenerados que apenas especificaram alterações de aminoácidos conservatives mais o resíduo do tipo selvagem. Os resíduos que não foram conservados foram mutados mais
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401/474 agressivamente, mas também incluíram o resíduo do tipo selvagem. Códons degenerados que também codificaram o resíduo do tipo selvagem foram implantados para evitar a mutagênese excessiva da proteína-alvo. Pelo mesmo motivo, apenas 20 posições foram alvo de mutagênese para cada biblioteca. A análise mutacional foi focada em resíduos interfaciais de contato e sem contato que estavam dentro de 6 A da superfície de ligação com as suas cadeias laterais dirigidas ao ligando/contraestrutura.
[00595] Para gerar o DNA que codifica a biblioteca-alvo, foram encomendados oligos de sobreposição de até 80 nucleotídeos de comprimento e contendo códons degenerados nas posições de resíduos direcionados para mutagênese, da Integrated DNA Technologies (Coralville, EUA). Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em água estéril, misturados em proporções equimolares, aquecidos a 95 °C por cinco minutos e lentamente resfriados à temperatura ambiente para recozimento. Os iniciadores oligonucleotídicos específicos para o domínio IgV que emparelham com o início e o fim da sequência genética do domínio IgV foram então utilizados para gerar o produto de PCR. Os oligonucleotídeos específicos do domínio IgV que se sobrepõem por 40 pb com o vetor de clonagem pBYDS03 (Life Technologies, EUA), além e incluindo os locais de clonagem BamHI e Kpnl, foram então utilizados para amplificar 100 ng do produto de PCR da etapa anterior para gerar um total de pelo menos 12 μ9 de DNA para cada eletroporação. Ambas as reações em cadeia da polimerase (PCRs) utilizaram a mistura principal de PCR OneTaq 2x (New England Biolabs, EUA). Os produtos da segunda PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen, Alemanha) e ressuspensos em água desionizada estéril. Alternativamente, os Ultramers® (Integrated DNA Technologies) de até 200 pb de comprimento foram utilizados em conjunto com o megaprimer PCR (URL: http;//wyw.ncbj.,nlnifojh,.goy/pmc/
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402/474 articles/PMC146891/pdf/253371.pdf) para gerar trechos maiores de códons degenerados que não poderíam ser facilmente incorporados usando múltiplos iniciadores pequenos sobrepostos. Após a geração do produto de comprimento total utilizando PCR megaprimer, a biblioteca do domínio IgV mutante foi amplificada por PCR novamente utilizando iniciadores de DNA contendo a região de sobreposição de 40 pb com a variante de clonagem pBYDS03 para recombinação homóloga em levedura.
[00596] Para preparar a inserção da biblioteca, o vetor pBYDS03 foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Kpnl (New England Biolabs, EUA) e o fragmento de vetor grande foi purificado em gel e dissolvido em água desionizada estéril. O DNA pronto para eletroporação para a próxima etapa foi gerado pela mistura de 12 pg de inserção de DNA da biblioteca com 4 pg de vetor linearizado em um volume total de 50 pl de água desionizada e estéril. Um método alternativo para gerar bibliotecas-alvo, é realizar a mutagênese sítio-dirigida (kit Multisite, Agilent, EUA) do domínio de IgV-alvo com oligonucleotídeos contendo códons degenerados. Essa abordagem é usada para gerar subbibliotecas que visam apenas alguns trechos específicos de DNA para mutagênese. Nestes casos, as sub-bibliotecas são misturadas antes de prosseguir para as etapas de seleção. Em geral, os tamanhos das bibliotecas estavam na faixa dos clones 10E7 a 10E8, exceto que as sub-bibliotecas estavam apenas na faixa de 10E4 a 10E5.
B. Bibliotecas Aleatórias [00597] As bibliotecas aleatórias foram também construídas para identificar variantes do domínio IgV de CD80 estabelecido na SEQ ID NO: 3031 (contendo o domínio IgV). O DNA que codifica o domínio CD50 de IgV de tipo selvagem foi clonado entre os locais BamHI e Kpnl do vetor de apresentação de levedura pBYDS03 e depois liberado utilizando as mesmas enzimas de restrição. O DNA liberado foi en
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403/474 tão mutagenizado com o kit Genemorph II (Agilent Genomics, EUA) para gerar uma média de três a cinco mudanças de aminoácidos por variante da biblioteca. O DNA mutagenizado foi então amplificado por PCR em duas etapas e processado adicionalmente como descrito acima para bibliotecas-alvo.
[00598] Depois de completar várias rodadas de seleção usando esferas e FACS iterative, um conjunto de clones foi posteriormente mutado por PCR propensa a erros. Assim, foi criada uma biblioteca mutante de segunda geração seguindo as etapas delineadas acima, embora utilizando como molde o DNA de saída de seleção em vez da sequência de plasmídeo de IgV de tipo selvagem como modelo.
EXEMPLO 2
Introdução de bibliotecas de DNA em levedura [00599] Para introduzir o DNA da biblioteca CD80 degenerada e aleatória em levedura, células competentes em eletroporação da linhagem de levedura BJ5464 (ATCC.org; ATCC número 208288) foram preparadas e eletroporadas em um Gene Pulser II (Biorad, EUA) com o DNA pronto para eletroporação das etapas acima essencialmente como descrito (Colby, DW et al.2004 Methods Enzymology 388, 348358). A única exceção foi que as células transformadas foram cultivadas em meio SCD-Leu seletivo mínimo não indutor para acomodar o marcador seletivo de LEU2 transportado pelo plasmídeo modificado pBYDS03. Um litro de meio SCD-Leu consiste em 14,7 gramas de citrato de sódio, 4,29 gramas de mono-hidrato de ácido cítrico, 20 gramas de dextrose, 6,7 gramas de base nitrogenada de levedura e 1,6 grama de suplemento de meio de cultura sintético de levedura sem leucina. O meio foi esterilizado por filtração antes da utilização, utilizando um dispositivo de filtro de vácuo de 0,22 μίτι.
[00600] O tamanho da biblioteca foi determinado por diluições de placas de células recentemente recuperadas em placas de agar SCD
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Leu e depois extrapolando o tamanho da biblioteca a partir do número de colônias individuais de plaqueamento que geraram pelo menos 50 colônias por placa.O restante da cultura electroporada foi cultivada até a saturação e as células desta cultura foram novamente cultivadas 1/100 no mesmo meio mais uma vez e cresceram até a saturação para minimizar a fração de células não transformadas e para permitir a segregação do plasmídeo das células que podem conter dois ou mais variantes de biblioteca. Para manter a diversidade da biblioteca, essa etapa de subcultura foi realizada utilizando um inóculo que continha pelo menos 10x mais células do que o tamanho da biblioteca calculado. As células da segunda cultura saturada foram ressuspensas em meio fresco contendo 25% (peso/volume) de glicerol estéril para uma densidade de 10E10/ml e congeladas e armazenadas a -80 °C (estoque de biblioteca congelado).
EXEMPLO 3
Seleção De Levedura [00601] O Exemplo 3 descreve a seleção de células de levedura que expressam variantes de CD80 modificadas por afinidade. Foi bem estabelecido que a ligação de CTLA4 ao CD80 antagonize a ligação de CD28 ao CD80 (Schwartz JC et al. Nature 410, 604-08, 2001). Para identificar os mutantes CD80 que se ligam seletivamente a CTLA4 em relação a CD28, as células das bibliotecas mutantes de CD80 foram submetidas a ciclos iterativos de separação por FACS e mutagênese positivas e negativas.
[00602] Um número de células igual a pelo menos 10 vezes o tamanho estimado da biblioteca foi descongelado de reservas individuais de bibliotecas, suspenso para 1,0x10E6 células/ml em meio SCD-Leu não indutor e cultivado durante a noite. No dia seguinte, um número de células iguais a 10 vezes o tamanho da biblioteca foram centrifugadas a 2.000 RPM durante dois minutos e ressuspensas para 0,5x10E6 cé
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405/474 lulas/ml em meio SCDG-Leu indutor. Um litro de meio de indução SCDG-Leu consiste em 5,4 gramas de Na2HPO4, 8,56 gramas de NaH2PO4*H2O, 20 gramas de galactose, 2,0 gramas de dextrose, 6,7 gramas de base nitrogenada de levedura e 1,6 grama de suplemento de meio de saída sintético de levedura sem leucina dissolvida em água e esterilizada através de um dispositivo de filtro de membrana de 0,22 πΐμ. A cultura foi cultivada em meio de indução durante 1 dia à temperatura ambiente para induzir a expressão de proteínas da biblioteca na superfície da célula de levedura.
[00603] As células foram separadas duas vezes utilizando esferas magnéticas de Proteína A (New England Biolabs, EUA) carregadas com ligando cognato para reduzir não ligantes e enriquecer todas as variantes de CD80 com a capacidade de se ligarem as suas proteínas exógenas de contraestrutura recombinante. Isto foi então seguido por múltiplos ciclos de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) utilizando coloração de proteína contraestrutura exógena para enriquecer a porção de células de levedura que apresenta ligação melhorada a CTLA4-Fc (R&D Systems, EUA). Estas seleções positivas foram alternadas com seleções FACS negativas para remover os clones CD80 que se ligam ao CD28-Fc. O enriquecimento de esferas magnéticas e seleções por citometria de fluxo foram realizados essencialmente como descrito em Miller KD, et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1 a 4.7.30, julho de 2008.
[00604] Com bibliotecas CD80, utilizaram-se proteínas ligando-alvo como se segue: rCTLA4-Fc humano produzido internamente, rCD28Fc humano e rPD-L1 humano (R&D Systems, Minneapolis, EUA). As esferas magnéticas de Proteína A foram obtidas da New England Biolabs, EUA. Para triagem citométrica de fluxo de duas cores foi utilizado um classificador Bio-Rad S3e. Os níveis de exposição de CD80 foram monitorados com um anticorpo anti-hemaglutinina (HA) marcado com
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Alexafluor 488 (Life Technologies, EUA). A ligação de ligandos de proteínas de fusão de Fc, rCTLA4Fc, rPD-L1 ou rCD28Fc, foi detectada com Fab de cabra específica de Ig humana conjugada com PE (Jackson ImmunoResearch, EUA). A levedura dupla foi removida utilizando os parâmetros de dispersão frontal (FSC)/dispersão lateral (SSC), e as portas de classificação foram baseadas na ligação de ligando mais elevada detectada em FL2 que possuía uma ligação de expressão de etiqueta mais limitada em FL1.
[00605] As produções de levedura dos tipos citométricos de fluxo foram testadas quanto a maior afinidade de ligação específica. A levedura de saída de ordenação foi expandida e re-induzida para expressar as variantes particulares de domínio modificado por afinidade de IgSF que codificam. Esta população pode, então, ser comparada com a cepa de levedura parental, de tipo selvagem, ou quaisquer outros resultados selecionados, tal como a população de levedura com saída de esfera, por citometria de fluxo.
[00606] Para CD80, as segundas saídas de FACS (F2) foram comparadas à levedura CD80 parental para ligação de rCTLA4Fc, rPD-L1 ou rCD28Fc por dupla coloração de cada população com expressão de etiqueta anti-HA (hemaglutinina) e Fc anti-humano secundário para detectar o ligante obrigatório.
[00607] Os domínios de IgV CD80 variantes selecionados foram ainda formatados como proteínas de fusão e testados quanto à ligação e atividade funcional, como descrito abaixo.
EXEMPLO 4
Reformatar Saídas de Seleção como Fusões de Fc e em Vários Tipos de Proteínas Imunomoduladoras [00608] O exemplo 4 descreve a reformatação das saídas de seleção identificadas no Exemplo 3 como proteínas imunomoduladoras contendo um domínio do tipo V de imunoglobulina (VV) modificado por
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407/474 afinidade (variante) de CD80 fundido com uma molécula Fc (moléculas de fusão do domínio IgV variante -Fc).
[00609] Os agrupamentos de células de saída das ordenações CD80 de citometria de fluxo final foram cultivados até densidade terminal em meio SCD-Leu.O DNA de plasmídeo de cada saída foi isolado usando um kit de isolamento de DNA de plasmídeo de levedura (Zymoresearch, EUA). Para fusões de Fc, os iniciadores de PCR com locais de restrição adicionais adequados para clonagem no vetor de fusão de Fc de escolha foram utilizados para amplificar em lotes a partir dos preps de DNA plasmídico o DNA codificador para os domínios IgV-alvo mutantes após a digestão por restrição, os produtos de PCR foram ligados em vetor de fusão Fc seguido de transformação por choque térmico em E. coli cepa XL1 Blue (Agilent, EUA) ou NEBõalfa (New England Biolabs) conforme indicado pelo fornecedor. Alternativamente, os resultados foram amplificados por PCR com iniciadores contendo regiões de sobreposição de 40 bp em cada extremidade com vetor de fusão Fc para realizar a recombinação in vitro usando Gibson Assembly Mastermix (New England Biolabs), que foi posteriormente usado na transformação de choque térmico na cepa de E. coli NEBõalpha.O exemplo de um vetor de fusão Fc é pFUSE-hlgG1 a Fc2 (InvivoGen, EUA).
[00610] As diluições das reações de transformação foram plaqueadas em LB-ágar contendo 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, EUA) para isolar colônias isoladas para seleção. Até 96 colônias de cada transformação foram então cultivadas em placas de 96 poços até saturação durante a noite a 37 °C em caldo LB carbenicilina (Teknova cat n° L8112) e uma pequena alíquota de cada poço foi submetida à sequenciação de DNA do domínio IgV em para identificar a mutação(ções) em todos os clones. A preparação da amostra para o sequenciamento de DNA foi realizada utilizando protocolos fornecidos
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408/474 pelo provedor de serviços (Genewiz; South Plainfield, NJ). Após a remoção da amostra para sequenciação de DNA, o glicerol foi então adicionado às culturas remanescentes para um conteúdo final de glicerol de 25% e as placas foram armazenadas a -20 °C para uso futuro como placas mestre (veja abaixo). Alternativamente, as amostras para sequenciação de DNA foram geradas por plaqueamento de réplica a partir de culturas líquidas crescidas em placas de agar sólida utilizando um replicador de 96 poços descartável (VWR, EUA). Estas placas foram incubadas durante a noite para gerar manchas de crescimento e as placas foram submetidas a Genewiz como especificado por Genewiz.
[00611] Após a identificação dos clones de interesse da análise de dados de sequenciamento de DNA gerados por Genewiz, os clones de interesse foram recuperados das placas mestras e individualmente crescidos para densidade em caldo LB líquido contendo 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, EUA) e culturas foram então usadas para preparação de DNA plasmídico de cada clone utilizando um kit padrão tal como o Sistema PureYield Plasmid Miniprep (Promega) ou o kit MidiPlus (Qiagen). A identificação de clones de interesse a partir de dados de sequenciamento de Genewiz envolveu geralmente as etapas a seguir. Primeiro, os arquivos de dados da sequência de DNA foram baixados do site da Genewiz. Todas as sequências foram então curadas manualmente de modo a começarem no início da região de codificação do domínio IgV. As sequências curadas foram traduzidas em lote usando um programa adequado disponível na URL: www.ebi.ac.uk/ Tools/st/emboss_transeq/. As sequências traduzidas foram então alinhadas usando um programa adequado disponível na URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Alternativamente, Genewiz sequenciados foram processados para gerar alinhamentos usando o software Ugene (http://ugene.net).
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409/474 [00612] Os clones de interesse foram então identificados a partir de alinhamentos utilizando os seguintes critérios: 1) clone idêntico ocorre pelo menos duas vezes no alinhamento e 2) uma mutação ocorre pelo menos duas vezes no alinhamento e de preferência em clones distintos. Os clones que cumprem pelo menos um destes critérios foram considerados clones que foram enriquecidos pelo processo de classificação devido à ligação melhorada.
[00613] Para gerar proteínas imunomoduladoras recombinantes que são proteínas de fusão Fc contendo um domínio IgV de CD80 com pelo menos um domínio modificado por afinidade (por exemplo, variante CD80 IgV-Fc), o DNA codificando a variante foi gerado para codificar uma proteína da seguinte forma: variante (mutante) CD80 domínio IgV seguido por um agente de ligação de três alaninas (AAA) seguido por um Fc inerte sem função efetora, apresentado na SEQ ID NO: 1713, contendo as mutações C220S, R292C, N297G e V302C pela numeração EU (correspondendo a C5S, R77C, N82G e V87C com referência a lgG1 Fc humana de tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 277); ou 1714, contendo as mutações C220S, L234A, L235E e G237A por numeração EU. Alternativamente, os domínios CD80 IgV foram fundidos de uma maneira semelhante, mas com um ligante contendo os aminoácidos (GSGGGGS; SEQ ID NO: 1716) seguido por uma Fc inerte sem função efetora, apresentada na SEQ ID NO: 1714. Em alguns casos, os domínios CD80 IgV foram fundidos de uma maneira semelhante, mas com um lgG1 Fc humano capaz de exercer atividade (efetor). Uma vez que o construto não inclui um anticorpo, cadeias leves que podem formar uma ligação covalente com uma cisteína, tal Fc de lgG1 humana exemplificativa (apresentada na SEQ ID NO: 1429) continha uma substituição do resíduo de cisteína a um resíduo de serina na posição 220 (C220S) por numeração EU (correspondendo à posição 5 (C5S) com referência ao Fc de tipo selvagem ou
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410/474 não modificado estabelecido na SEQ ID NO: 277).
EXEMPLO 5
Expressão e Purificação de Fusões-Fc [00614] O Exemplo 5 descreve a expressão e purificação de alto rendimento de proteínas de fusão Fc contendo IgV CD80 variante como descrito nos Exemplos acima.
[00615] As proteínas de fusão de Fc variantes recombinantes foram produzidas a partir de células 293 de rim embriônico humano (HEK) adaptadas à suspensão utilizando o sistema de expressão Expi293 (Invitrogen, EUA). Adicionaram-se 4 pg de cada DNA plasmídico da etapa anterior a 200 pl de Opti-MEM (Invitrogen, EUA) ao mesmo tempo que foram adicionados separadamente 10,8 pl de ExpiFectamine a outros 200 pl de Opti-MEM. Após 5 minutos, os 200 pl de DNA plasmídico foram misturados com os 200 pl de ExpiFectamine e foram ainda incubados durante mais 20 minutos antes de adicionar esta mistura de células. Dez milhões de células Expi293 foram distribuídas em poços separados de uma placa de crescimento de fundo de 24 poços, de fundo cônico e estéril de 10 ml (Thomson Instrument Company, EUA) em um volume de 4 ml de meio Expi293 (Invitrogen, EUA). As placas foram agitadas durante 5 dias a 120 rpm em um incubador de cultura de células de mamífero definido para 95% de umidade e 8% de CO2. Após uma incubação de 5 dias, as células foram sedimentadas e os sobrenadantes da cultura foram retidos.
[00616] As proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes utilizando uma placa de filtro de 96 poços de alto rendimento (número de catálogo Thomson 931919), cada uma carregada com 60 pl de esfera sedimentada Mab SelectSure (GE Healthcare n° de cat. 17543801). A proteína foi eluída com quatro frações consecutivas de 200 pl de acetato 50 mM, pH 3,3. O pH de cada fração foi ajustado para acima de pH 5,0 com 4 pl de Tris 2M a pH 8,0. As frações foram
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411/474 reunidas e quantificadas utilizando 280 nm de absorvância medidos por instrumento Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, EUA), e a pureza da proteína foi avaliada carregando-se 5 pg de proteína não reduzida nem géis Stain-free TGX Mini-Protean. As proteínas foram então visualizadas em um gerador de imagens em gel Bio Rad Chemi Doc XRS.
EXEMPLO 6
Avaliação da Ligação de Moléculas Contendo Domínio IgSF Amadurecido por Afinidade [00617] Este Exemplo descreve estudos de ligação de fusão de Fc de proteínas purificadas dos Exemplos anteriores para contraestruturas de CTLA4, PD-L1 e CD28 expressas em células para avaliar a especificidade e afinidade de proteínas imunomoduladoras variantes do domínio CD80. Os construtos de expressão de superfície de mamífero de comprimento total para cada um de CTLA4, PD-L1 e CD28 humanos, foram desenhados em vetor de expressão pcDNA3.1 (Life Technologies) e originadas de Genscript, EUA. Os estudos de ligação foram realizados em células HEK293 transfectadas geradas para expressar os ligandos de superfície de mamífero de comprimento total utilizando o sistema de transfecção transitória Expi293F (Life Technologies, EUA). Como controle, a ligação a células falsas (não transfectadas) foi também avaliada. Determinou-se o número de células necessárias para a experiência e realizou-se a escala apropriada de transfecção de 30 ml utilizando o protocolo sugerido pelo fabricante. Para cada transfecção de CTLA4, PD-L1, CD-28 ou 30 ml de modelo (mock), incubaram-se 75 milhões de células Expi293F com 30 de DNA de construto de expressão e 1,5 ml de reagente ExpiFectamine 293 diluído durante 48 horas, no momento em que as células foram recolhidas para coloração.
[00618] Para coloração e análise por citometria de fluxo, foram pla
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412/474 queadas 100.000 células de transfecção transiente ou controle negativo (simulado) em placas de fundo redondo de 96 poços. As células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de coloração (PBS (solução salina tamponada com fosfato), 1% de BSA (albumina de soro bovino) e 0,1% de azida de sódio) durante 20 minutos para bloquear a ligação não específica. Em seguida, as células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de coloração contendo 200 nM a 91 pM de cada uma das variantes candidatas de CD80 Fc, dependendo da experiência de cada uma das variantes candidatas da proteína CD80 Fc em 50. Como controles, as atividades de ligação do CD80-ECD-Fc de tipo selvagem (R&D Systems), CD80-ECD-Fc do tipo selvagem (inerte), IgV-Fc do tipo selvagem (inerte) e/ou IgG humana (Sigma) foram também avaliadas. A coloração primária foi realizada em gelo durante 45 minutos, antes de lavar as células em tampão de coloração duas vezes. Fc anti-humano conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch, EUA) foi diluído 1:150 em 50 ml de tampão de coloração e adicionado às células e incubado por mais 30 minutos em gelo. O anticorpo secundário foi lavado duas vezes, as células foram fixadas em formaldeído a 4%/PBS e as amostras foram analisadas no citômetro de fluxo Intellicyt (Intellicyt Corp, EUA). A Intensidade de Fluorescência Média (MFI) foi calculada para cada transfectante e HEK293 transfectado simulado com o software FlowJo Versão 10 (FlowJo LLC, EUA).
[00619] Os resultados para dois estudos de ligação para variantes CD80 exemplificativas são apresentados nas Tabelas 10 e 11. As substituições de aminoácidos exemplificativas são designadas pelo número de posição de aminoácido correspondente à numeração da respectiva sequência de ECD de referência não modificada. Por exemplo, a sequência de ECD de referência não modificada é a sequência de ECD de CD80 não modificada apresentada na SEQ ID NO: 2. A posição de aminoácido está indicada no meio, com o aminoácido
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413/474 correspondente não modificado (por exemplo, tipo selvagem) antes do número e a substituição de aminoácidos variante identificada listada após o número. A segunda coluna apresenta o identificador de SEQ ID NO para a IgV variante para cada variante da molécula de fusão IgVFc.
[00620] Também é mostrada a atividade de ligação medida pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para a ligação de cada molécula de fusão CD80 Fc às células manipuladas para expressar o ligante de contraestrutura cognata indicado (isto é, CTLA-4, PDL1 ou CD28) e a razão do MFI do CD80 variante IgV-Fc, comparada com a ligação da correspondente molécula de fusão CD80 IgV-Fc não modificada que não contém a substituição (substituições) de aminoácidos, à mesma contraestrutura expressa na célula de ligando. A razão da ligação do CD80 variante IgV-Fc ao ligando de contraestrutura CTLA-4 em comparação com a ligação do CD80 variantelgV-Fc ao ligando de contraestrutura CD28 também é mostrada na última coluna das Tabelas.
[00621] Como mostrado nas Tabelas 10 e 11, as seleções resultaram na identificação de um número de variantes do domínio CD80 IgV que foram modificadas por afinidade para exibir ligação aumentada para o ligando (ou ligandos) de contraestrutura CTLA-4 e/ou PD-L1. Adicionalmente, os resultados indicam que foram selecionadas várias variantes que exibem uma ligação reduzida ao CD28, incluindo várias variantes do domínio CD80 IgV que exibem ligação aumentada ao ligando de contraestrutura CTLA-4 em comparação com o ligando de contraestrutura CD28 (Razão de CTLA4: CD28).
TABELA 10: Ligação de CD80 Variante a Células HEK293 Transfectadas com CTLA4, CD28 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) CTLA4 CD28 PD-L1
MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 22,2 nM Alteração de dobra para WT Razão de CTLA4: CD28
L70P 151 Não testado
I30F/L70P 152 Não testado
Q27H/T41S/A71D 153 368176 2,3 25051 1,01 24181 N/A 14,7
I30T/L70R 154 2234 0,0 2596 0,10 5163 N/A 0,9
T13R/C16R/L70Q/A 71D 155 197357 1,2 16082 0,65 9516 N/A 12,3
T57I 156 393810 2,4 23569 0,95 3375 N/A 16,7
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TABELA 10: Ligação de CD80 Variante a Células HEK293 Transfectadas com CTLA4, CD28 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) CTLA4 CD28 PD-L1
MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 22,2 nM Alteração de dobra para WT Razão de CTLA4: CD28
M43I/C82R 157 3638 0,0 3078 0,12 7405 N/A 1,2
V22L/M38V/M47T/A 71D/L85M 158 175235 1,1 3027 0,12 6144 N/A 57,9
I30V/T57I/L70P/A71 D/A91T 159 116085 0,7 10129 0,41 5886 N/A 11,5
V22I/L70M/A71D 160 163825 1,0 22843 0,92 33404 N/A 7,2
N55D/L70P/E77G 161 Não testado
T57A/I69T 162 Não testado
N55D/K86M 163 3539 0,0 3119 0,13 5091 N/A 1,1
L72P/T79I 164 50176 0,3 3397 0,14 6023 N/A 14,8
L70P/F92S 165 4035 0,0 2948 0,12 6173 N/A 1,4
T79P 166 2005 0,0 2665 0,11 4412 N/A 0,8
E35D/M47I/L65P/D 90N 167 4411 0,0 2526 0,10 4034 N/A 1,7
L25S/E35D/M47I/D 90N 168 61265 0,4 4845 0,20 20902 N/A 12,6
A71D 170 220090 1,4 16785 0,68 29642 N/A 13,1
E81K/A91S 172 98467 0,6 3309 0,13 44557 N/A 29,8
A12V/M47V/L70M 173 81616 0,5 7400 0,30 31077 N/A 11,0
K34E/T41A/L72V 174 88982 0,6 3755 0,15 35293 N/A 23,7
T41S/A71D/V84A 175 103010 0,6 5573 0,22 83541 N/A 18,5
E35D/A71D 176 106069 0,7 18206 0,73 40151 N/A 5,8
E35D/M47I 177 353590 2,2 14350 0,58 149916 N/A 24,6
K36R/G78A 178 11937 0,1 2611 0,11 5715 N/A 4,6
Q33E/T41A 179 8292 0,1 2442 0,10 3958 N/A 3,4
M47V/N48H 180 207012 1,3 14623 0,59 145529 N/A 14,2
M47L/V68A 181 74238 0,5 13259 0,53 11223 N/A 5,6
S44P/A71D 182 8839 0,1 2744 0,11 6309 N/A 3,2
Q27H/M43I/A71D/R 73S 183 136251 0,8 12391 0,50 8242 N/A 11,0
E35D/T57I/L70Q/A7 1D 185 121901 0,8 21284 0,86 2419 N/A 5,7
M47I/E88D 186 105192 0,7 7337 0,30 97695 N/A 14,3
M42I/I61V/A71D 187 54478 0,3 6074 0,24 4226 N/A 9,0
P51A/A71D 188 67256 0,4 4262 0,17 5532 N/A 15,8
H18Y/M47I/T57I/A7 1G 189 136455 0,8 20081 0,81 13749 N/A 6,8
V20I/M47V/T57I/V8 4I 190 183516 1,1 26922 1,08 3583 N/A 6,8
WTCD80ECD-FC 2 161423 1,0 24836 1,00 Não testado N/A 6,5
Fc apenas 5962 2592 4740
TABELA 11: Ligação de CD80 Variante a Células HEK293 Transfectadas com CTLA4, CD28 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTLA4 CD28 PD-L1
MFI a 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFI a 22,2 nM Alteração de dobra para WT Razão de CTLA4: CD28
V20I/M47V/A71D 191 149937 7,23 15090 9,33 9710 5,48 9,9
A71D/L72V/E95K 192 140306 6,77 6314 3,90 8417 4,75 22,2
V22L/E35G/A71 D/ L72P 193 152588 7,36 8150 5,04 1403 0,79 18,7
E35D/A71D 194 150330 7,25 14982 9,26 13781 7,77 10,0
E35D/I67L/A71D 195 146087 7,04 11175 6,91 9354 5,28 13,1
T13R/M42V/M47I/ A71D 197 108900 5,25 16713 10,33 1869 1,05 6,5
E35D 198 116494 5,62 3453 2,13 25492 14,38 33,7
E35D/M47I/L70M 199 116531 5,62 14395 8,90 49131 27,71 8,1
E35D/A71/L72V 200 134252 6,47 11634 7,19 13125 7,40 11,5
E35D/M43L/L70M 201 102499 4,94 3112 1,92 40632 22,92 32,9
A26P/E35D/M43I/L 85Q/ E88D 202 83139 4,01 5406 3,34 9506 5,36 15,4
E35D/D46V/L85Q 203 85989 4,15 7510 4,64 38133 21,51 11,4
Q27L/E35D/M47I/ T57I/ L70Q/E88D 204 59793 2,88 14011 8,66 1050 0,59 4,3
Q27H/E35G/A71 D/ L72P/T79I 196 85117 4,10 10317 6,38 1452 0,82 8,3
M47V/I69F/A71 D/ V83I 205 76944 3,71 15906 9,83 3399 1,92 4,8
E35D/T57A/A71 D/ L85Q 206 85724 4,13 3383 2,09 1764 0,99 25,3
H18Y/A26T/E35D/ A71D/L85Q 207 70878 3,42 6487 4,01 8026 4,53 10,9
E35D/M47L 208 82410 3,97 11508 7,11 58645 33,08 7,2
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TABELA 11: Ligação de CD80 Variante a Células HEK293 Transfectadas com CTLA4, CD28 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTLA4 CD28 PD-L1
MFI a 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFIa 66,6 nM Alteração de dobra para WT MFI a 22,2 nM Alteração de dobra para WT Razão de CTLA4: CD28
E23D/M42V/M43I/I 58V/ L70R 209 37331 1,80 10910 6,74 2251 1,27 3,4
V68M/L70M/A71D/ E95K 210 56479 2,72 10541 6,51 38182 21,53 5,4
N55I/T571/I69F 211 2855 0,14 1901 1,17 14759 8,32 1,5
E35D/M43I/A71D 212 63789 3,08 6369 3,94 27290 15,39 10,0
T41S/T57I/L70R 213 59844 2,89 4902 3,03 19527 11,01 12,2
H18Y/A71D/L72P/ E88V 214 68391 3,30 8862 5,48 1085 0,61 7,7
V20I/A71D 215 60323 2,91 10500 6,49 3551 2,00 5,7
E23G/A26S/E35D/ T62N/ A71D/L72V/L85M 216 59025 2,85 5484 3,39 10662 6,01 10,8
A12T/E24D/E35D/ D46V/ 161V/L72P/E95V 217 63738 3,07 7411 4,58 1221 0,69 8,6
V22L/E35D/M43L/ A71G/D76H 218 2970 0,14 1498 0,93 1851 1,04 2,0
E35G/K54E/A71 D/ L72P 219 71899 3,47 3697 2,29 1575 0,89 19,4
L70Q/A71D 220 45012 2,17 18615 11,50 1692 0,95 2,4
A26E/E35D/M47L/ L85Q 221 40325 1,94 2266 1,40 55548 31,33 17,8
D46E/A71D 222 69674 3,36 16770 10,36 22777 12,85 4,2
Y31H/E35D/T41S/ V68L/ K93R/R94W 223 3379 0,16 2446 1,51 18863 10,64 1,4
WT CD80 IgV-Fc (inerte) 3031 20739 1,00 1618 1,00 1773 1,00 12,8
WT CD80 ECD-Fc (inerte) 2 72506 3,50 3072 1,90 4418 2,49 23,6
EXEMPLO 7
Seleção de Domínios CD80 IgV Variantes Adicionais e Avaliação da Atividade de Ligação [00622] De modo a refinar a afinidade e potência funcional das interações do CD80 variante IgV com contraestruturas CTLA4, CD28 e PDL1, a segunda e terceira gerações (Gen) de mutagênese aleatória e seleção foram realizadas utilizando procedimentos substancialmente descritos nos Exemplos 1 a 3. Resumidamente, o DNA de plasmídeo de levedura foi isolado a partir de seleção de levedura após FACS e usado como molde para PCR mutagênica. Para maximizar a diversidade, ambas as variantes individuais caracterizadas e um conjunto de variantes selecionadas por FACS foram utilizadas como modelo. A biblioteca resultante foi submetida a ciclos iterativos de seleção e crescimento de FACS. Para aumentar a afinidade de PDL1 enquanto se mantinha a afinidade de CD28, foram tomadas múltiplas vias de progressão de classificação FASC. A biblioteca mutagênica de segunda
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416/474 geração foi submetida a quatro seleções FACS alternadas entre as seleções CD28 e CTLA4+, gerando saídas que, quando tituladas contra as contraestruturas, foram escolhidas para serem reformatadas em vetores Fc. A biblioteca mutagênica de terceira geração utilizou os seguintes percursos de seleção FACS para obter resultados de levedura que, quando titulados contra as contraestruturas, foram escolhidos para serem reformatados em vetores Fc: 1. 50 nM PDL1+, 2a. 1 nM CTLA4+, 2b. 20 nM CTLA4-, 2a3. 10 nM PDL1+, 2b3. 10 nM PDL1+, 2b34. 25 nM CD28+. Após seleção de variantes modificadas por afinidade de CD80 que expressam levedura, as variantes selecionadas foram reformatadas como fusão Fc para a geração de proteínas de fusão Fc adicionais contendo variantes de lg80 CD80. Após a análise da sequência, as variantes individuais foram escolhidas para produção de proteína, ligação e ensaio funcional. As variantes da mutagênese da geração 1 são mostradas na Tabela 10, geração 2 mostrada na Tabela 11, geração 3 mostrada nas Tabelas 12 e 13.
[00623] A ligação de proteínas de fusão imunomoduladoras selecionadas para cognatar parceiros de ligação foi avaliada. Para produzir células que expressam os parceiros de ligação cognatos CD80, huCTLA4 e huPD-L1, construtos de expressão de superfície de comprimento total de mamífero foram gerados, incorporados em lentivírus e transduzidos em células CHO. As células foram separadas em um Classificador de Células Bio-Rad S3 (Bio-Rad Corp., EUA) a >98% de pureza. As células repórter Jurkat/IL2, que expressam endogenamente CD28 foram utilizadas para detectar ligação a CD28.
[00624] Para coloração e análise por citometria de fluxo, foram plaqueadas 100.000 células de células transfectadas apropriadas em placas de fundo redondo de 96 poços. As células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de coloração (solução salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro bovino a 1% (BSA) e azida de
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417/474 sódio a 0,1%) durante 20 minutos para bloquear a ligação não específica. Posteriormente, as células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de coloração contendo uma diluição em série de seis pontos (concentrações variando de 100 nM a 41 pM) de cada proteína CD80-Fc variante candidata em 50 μΙ. A coloração primária foi realizada em gelo durante 45 minutos, antes de lavar as células em tampão de coloração duas vezes. Fc anti-humano conjugado com ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch, EUA) foi diluído 1:150, adicionado às células e incubado por mais 30 minutos em gelo. As células foram então lavadas duas vezes com 150 μΙ/poço de tampão de coloração, fixadas em formaldeído a 2%/PBS e analisadas no citômetro de fluxo Intellicyt (Intellicyt Corp., EUA). O PE Mean Fluorescence Intensity (MFI) foi calculado para cada tipo de célula com o software FlowJo Versão 10 (FlowJo LLC, EUA).
[00625] Os resultados para dois estudos de ligação para variantes exemplificativas de CD80 são mostrados nas Tabelas 12 e 13. Nas Tabelas, as substituições de aminoácidos exemplificativas são designadas pelo número de posição de aminoácidos correspondente à numeração da respectiva sequência de IgV não modificada de referência. Por exemplo, a sequência de ECD de referência não modificada é a sequência de ECD de CD80 não modificada apresentada na SEQ ID NO: 2. A posição de aminoácido está indicada no meio, com o correspondente aminoácido não modificado (por exemplo, tipo selvagem) antes do número e a substituição de aminoácidos variante identificada listada após o número. A segunda coluna apresenta o identificador de SEQ ID NO para a IgV variante para cada variante da molécula de fusão IgV-Fc.
[00626] Também é mostrada a atividade de ligação medida pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para a ligação de 33 nM de cada molécula de fusão CD80 Fc às células manipuladas
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418/474 para expressar o ligando de contraestrutura cognato indicado (isto é, CTLA-4, PD-L1, ou CD28) e a razão do MFI do CD80 variante IgV-Fc, comparada com a ligação da molécula de fusão CD80-ECD-Fc não modificada (R&D Systems, EUA) que não contém a substituição (ou substituições) de aminoácidos para o mesmo ligando de contraestrutura expresso na célula. A relação entre a ligação da variante lgM-CD80Fc e a contraestrutura PD-L1 em comparação com a ligação do CD80 variante IgV-Fc à estrutura do CD28 também é mostrada na última coluna das Tabelas.
[00627] Como mostrado, as seleções resultaram na identificação de várias variantes do domínio CD80 IgV que foram modificadas por afinidade para exibir maior ligação para as estruturas contrárias PD-L1 e/ou CD28. Diversas variantes também retiveram ou exibiram maior ligação ao CTLA-4, enquanto outros exibiram diminuição da ligação ao CTLA-4. Adicionalmente, os resultados indicam que foram selecionadas várias variantes que exibem uma ligação reduzida ao CD28, incluindo várias variantes do domínio CD80 IgV que exibem uma ligação aumentada ao ligando de contraestrutura PD-L1 em comparação com o ligando de contraestrutura CD28 (Razão de PD- L1:CD28). Assim, as variantes têm perfis únicos para ligar CTLA4, CD28 e PD-L1 à superfície celular, conforme medido por citometria de fluxo.
TABELA 12: Fluxo de CD80 Variante que se Liga a Células Jurkat (CD28) e Células CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PDL1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1 :CD 28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT
A26E/Q33R/E35D/M47L/ L85Q/K86E 2201 1275 0,01 275 0,04 75974 9,56 276
A26E/Q33R/E35D/M47L/ L85Q 2202 1280 0,01 264 0,03 81533 10,26 309
E35D/M47L/L85Q 2203 336179 1,88 646 0,08 33200 4,18 51
A26E/Q33L/E35D/M47L/ L85Q 2204 1172 0,01 274 0,04 62680 7,89 229
A26E/Q33L/E35D/M47L 2205 1316 0,01 271 0,04 60903 7,67 225
H18Y/A26E/Q33L/E35D/ M47L/L85Q 2206 2088 0,01 272 0,04 76591 9,64 282
Q33L/E35D/M47I 2207 15919 0,09 282 0,04 37353 4,70 132
H18Y/Q33L/E35D/M47I 2208 5539 0,03 295 0,04 47793 6,02 162
Q33L/E35D/D46E/M47I 2209 23328 0,13 281 0,04 42137 5,30 150
Q33R/E35D/D46E/M47I 2210 3562 0,02 303 0,04 53345 6,72 176
H18Y/E35D/M47L 2211 284445 1,59 5068 0,66 44161 5,56 9
Q33L/E35D/M47V 2212 47648 0,27 281 0,04 47911 6,03 170
Q33L/E35D/M47V/T79A 2213 28899 0,16 285 0,04 62078 7,82 218
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TABELA 12: Fluxo de CD80 Variante que se Liga a Células Jurkat (CD28) e Células CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PDL1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTIA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1 :CD 28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT
Q33L/E35D/T41S/M47V 2214 14515 0,08 287 0,04 43850 5,52 153
Q33L/E35D/M47I/L85Q 2215 20548 0,11 287 0,04 63930 8,05 222
Q33L/E35D/M47I/T62N/ L85Q 2216 1658 0,01 284 0,04 72578 9,14 256
Q33L/E35D/M47V/L85Q 2217 75368 0,42 268 0,04 47438 5,97 177
A26E/E35D/M43T/M47L/ L85Q/R94Q 2218 278021 1,56 260 0,03 68089 8,57 262
Q33R/E35D/K37E/M47V /L85Q 2219 22701 0,13 258 0,03 44438 5,59 172
V22A/E23D/Q33L/E35D/ M47V 2220 3636 0,02 274 0,04 75513 9,51 275
E24D/Q33L/E35D/M47V/ K54R/L85Q 2221 310964 1,74 3180 0,42 67066 8,44 21
S15P/Q33L/E35D/M47L/ L85Q 2222 22377 0,13 266 0,03 51558 6,49 194
E7D/E35D/M47I/L97Q 2223 270798 1,52 273 0,04 14643 1,84 54
Q33L/E35D/T41S/M43I 2224 6388 0,04 433 0,06 44935 5,66 104
E35D/M47I/K54R/L85E 2225 8665 0,05 285 0,04 36917 4,65 130
Q33K/E35D/D46V/L85Q 2226 8507 0,05 257 0,03 26676 3,36 104
Y31S/E35D/M47L/T79L/ E88G 2227 1095 0,01 278 0,04 38909 4,90 140
H18L/V22A/E35D/M47L/ N48T/L85Q 2228 373548 2,09 434 0,06 98110 12,35 226
Q27H/E35D/M47L/L85Q/ R94Q/E95K 2229 288596 1,61 282 0,04 36055 4,54 128
Q33K/E35D/M47V/K89E /K93R 2230 1752 0,01 276 0,04 39061 4,92 142
E35D/M47I/E77A/L85Q/ R94W 2231 247334 1,38 272 0,04 64521 8,12 238
A26E/E35D/M43I/M47L/ L85Q/K86E/R94W 2232 2947 0,02 314 0,04 49440 6,22 157
Q27H/Q33L/E35D/M47V /N55D/L85Q/K89N 2233 56061 0,31 269 0,04 14802 1,86 55
H18Y/V20A/Q33L/E35D/ M47V/Y53F 2234 2878 0,02 260 0,03 120517 15,17 463
V22A/E35D/V68E/A71D 2235 437038 2,45 13987 1,83 1350 0,17 0
Q33L/E35D/M47L/A71G/ F92S 2236 2107 0,01 366 0,05 28041 3,53 77
V22A/R29H/E35D/D46E/ M47I 2237 77423 0,43 323 0,04 25407 3,20 79
Q33L/E35D/M43I/L85Q/ R94W 2238 1083 0,01 272 0,04 29001 3,65 107
H18Y/E35D/V68M/L97Q 2239 172538 0,97 299 0,04 121591 15,31 407
Q33L/E35D/M47L/V68M/ L85Q/E88D 2240 3526 0,02 264 0,03 125741 15,83 476
Q33L/E35D/M43V/M47I/ A71G 2241 13964 0,08 284 0,04 78029 9,82 275
E35D/M47L/A71G/L97Q 2242 225591 1,26 300 0,04 65944 8,30 220
E35D/M47V/A71G/L85M /L97Q 2243 239089 1,34 339 0,04 61708 7,77 182
H18Y/Y31H/E35D/M47V /A71G/L85Q 2244 3835 0,02 268 0,04 76364 9,61 285
E35D/D46E/M47V/L97Q 2245 305331 1,71 371 0,05 19484 2,45 52
E35D/D46V/M47I/A71G/ F92V 2246 287194 1,61 7543 0,99 45755 5,76 6
E35D/M47V/T62A/A71G/ V83A/Y87H/L97M 2247 18113 0,10 305 0,04 77547 9,76 255
Q33L/E35D/N48K/L85Q/ L97Q 2248 1183 0,01 279 0,04 45185 5,69 162
T CD80 ECD-Fc (R&D) 2 178708 1,00 7627 1,00 7943 1,00 1
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3553/3680
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TABELA 13: Fluxo de CD80 Variante que se Liga a Células Jurkat (CD28) e Células CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1:CD28
MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80
E35D/L85Q/K93T/E95V/L9 7Q 2249 246401 1,57 400 0,02 19880 1,67 50
E35D/M47V/N48K/V68M/K 89N 2250 807 0,01 11736 0,65 89775 7,56 8
Q33L/E35D/M47I/N48D/A7 1G 2251 116798 0,74 644 0,04 31151 2,62 48
R29H/E35D/M43V/M47I/I4 9V 2252 4694 0,03 336 0,02 1590 0,13 5
Q27H/E35D/M47I/L85Q/D9 0G 2253 257734 1,64 3513 0,19 30667 2,58 9
E35D/M47I/L85Q/D90G 2254 247703 1,57 4095 0,23 35710 3,01 9
E35D/M47I/T62S/L85Q 2255 300845 1,91 1758 0,10 44975 3,79 26
A26E/E35D/M47L/A71G 2256 341248 2,17 2161 0,12 53352 4,49 25
E35D/M47I/Y87Q/K89E 2257 110177 0,70 15452 0,86 29803 2,51 2
V22A/E35D/M47I/Y87N 2258 245711 1,56 15299 0,85 35251 2,97 2
H18Y/A26E/E35D/M47L/L8 5Q/D90G 2259 230588 1,47 3540 0,20 52390 4,41 15
E35D/M47L/A71G/L85Q 2260 156254 0,99 1436 0,08 50474 4,25 35
E35D/M47V/A71G/E88D 2261 211831 1,35 6237 0,35 37146 3,13 6
E35D/A71G 2262 184204 1,17 4299 0,24 34149 2,88 8
E35D/M47V/A71G 2263 226532 1,44 6360 0,35 36216 3,05 6
I30V/E35D/M47V/A71G/A9 1V 2264 204756 1,30 5779 0,32 43877 3,70 8
V22D/E35D/M47L/L85Q 2266 256426 1,63 542 0,03 34908 2,94 64
H18Y/E35D/N48K 2267 260795 1,66 4189 0,23 45849 3,86 11
E35D/T41S/M47V/A71G/K 89N 2268 251238 1,60 5314 0,29 45436 3,83 9
E35D/M47V/N48T/L85Q 2269 281417 1,79 692 0,04 35491 2,99 51
E35D/D46E/M47V/A71D/D 90G 2270 274661 1,75 6169 0,34 32371 2,73 5
E35D/D46E/M47V/A71D 2271 174016 1,11 5949 0,33 549 0,05 0
E35D/T41S/M43I/A71G/D9 0G 2272 208017 1,32 9249 0,51 56172 4,73 6
E35D/T41S/M43I/M47V/A7 1G 2273 243502 1,55 2845 0,16 44419 3,74 16
E35D/T41S/M43I/M47L/A7 1G 2274 209034 1,33 3104 0,17 59613 5,02 19
H18Y/V22A/E35D/M47V/T 62S/A71G 2275 219782 1,40 4214 0,23 87702 7,39 21
H18Y/A26E/E35D/M47L/V 68M/A71G/D90G 2276 253787 1,61 14934 0,83 170935 14,40 11
E35D/K37E/M47V/N48D/L 85Q/D90N 2277 243506 1,55 1589 0,09 26542 2,24 17
Q27H/E35D/D46V/M47L/A 71G 2278 157358 1,00 10412 0,58 60139 5,07 6
V22L/Q27H/E35D/M47I/A7 1G 2279 151600 0,96 7269 0,40 43797 3,69 6
E35D/D46V/M47L/V68M/L 85Q/E88D 2280 224734 1,43 5027 0,28 137368 11,57 27
E35D/T41S/M43V/M471/L7 0M/A71G 2281 249456 1,59 2698 0,15 12978 1,09 5
E35D/D46E/M47V/N63D/L 85Q 2282 274320 1,74 1331 0,07 69780 5,88 52
E35D/M47V/T62A/A71D/K 93E 2283 225737 1,44 12030 0,67 693 0,06 0
E35D/D46E/M47V/V68M/D 90G/K93E 2284 273157 1,74 27080 1,50 71903 6,06 3
E35D/M43I/M47V/K89N 2285 278391 1,77 6752 0,37 19250 1,62 3
E35D/M47L/A71G/L85M/F 92Y 2286 215998 1,37 2459 0,14 46684 3,93 19
E35D/M42V/M47V/E52D/L 85Q 2287 225986 1,44 1291 0,07 11897 1,00 9
V22D/E35D/M47L/L70M/L9 7Q 2288 127835 0,81 527 0,03 17670 1,49 34
E35D/T41S/M47V/L97Q 2289 262204 1,67 290 0,02 13591 1,14 47
E35D/Y53H/A71G/D90G/L 97R 2290 182701 1,16 1547 0,09 57455 4,84 37
E35D/A71D/L72V/R73H/E8 1K 2291 186582 1,19 3365 0,19 503 0,04 0
Q33L/E35D/M43I/Y53F/T6 2S/L85Q 2292 3985 0,03 1024 0,06 72065 6,07 70
E35D/M38T/D46E/M47V/N 48S 2293 175387 1,11 587 0,03 19393 1,63 33
Q33R/E35D/M47V/N48K/L 2294 2680 0,02 265 0,01 21425 1,80 81
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TABELA 13: Fluxo de CD80 Variante que se Liga a Células Jurkat (CD28) e Células CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1:CD28
MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80
85M/F92L
E35D/M38T/M43V/M47V/N 48R/L85Q 2295 203938 1,30 285 0,02 21795 1,84 76
T28Y/Q33H/E35D/D46V/M 47I/A71G 2296 156810 1,00 298 0,02 46038 3,88 154
WT CD80 ECD-Fc (R&D) 2 157306 1,00 18035 1,00 11871 1,00 1
[00628] Para comparar ainda mais a ligação, avaliaram-se várias concentrações de variantes exemplificativas de moléculas CD80 IgVFc e compararam-se com CD80 IgV-Fc de tipo selvagem para ligação a PD-L1, CD28 e CTLA-4 expressos na superfície celular. O exemplar testado variante CD80 IgV-Fc incluiu: E35D/D46V/M47L/V68M/ L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280), H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276), H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G (SEQ ID NO: 2275) e E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250). A ligação ao CD28 foi avaliada utilizando células repórter Jurkat/IL2 expressando CD28 e a ligação a CTLA-4 e PD-L1 foi avaliada utilizando células CHO estavelmente transfectadas para expressar huCTLA-4 ou huPD-L1 como descrito acima. Os transfectantes indicados ou de linhagem celular foram plaqueados e corados com quantidades tituladas de CD80 vlgD-Fc ou de tipo selvagem CD80 IgV-Fc. A proteína ligada foi detectada com anti-huFc conjugado com fluorocromo e Intensidade de Fluorescência Média (MFI) medida por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 9A, alguns testaram CD80 vlgD-Fc ligado a PD-L1 humano, CTLA-4 humano e CD28 humano com afinidade mais elevada do que o CD80 de tipo selvagem.
EXEMPLO 8
Avaliação da Bioatividade de Moléculas Contendo o Domínio CD80 IgSF Amadurecido por Afinidade Utilizando um Ensaio de Repórter Jurkat/IL2 [00629] Este Exemplo descreve um ensaio repórter Jurkat/IL2 para avaliar a bioatividade de proteínas imunomoduladoras variantes do
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422/474 domínio CD80 para o bloqueio da coestimulação de CD28.
[00630] No dia anterior ao ensaio, a placa de ensaio foi preparada. Para preparar a placa de ensaio, 10 anticorpos anti-CD3 nM (clone OKT3; BioLegend, n° de catálogo 317315) e CD86-Fc 20 nM (R&D Systems, n° de catálogo 141 a B2) em PBS foram aliquotados em 100 μΙ/poço em uma placa branca de fundo plano de 96 poços (Costar). A placa foi incubada durante a noite a 4 °C para permitir que o anticorpo e a proteína CD86-Fc aderissem a superfície da placa. No dia seguinte, os poços da placa de ensaio foram lavados duas vezes com 150 μΙ de PBS antes do ensaio.
[00631] No dia do ensaio, foram diluídos 60 μΙ de moléculas de fusão variantes de CD80 IgV-Fc exemplificativas e de controle, moléculas de tipo selvagem CD80 IgV-Fc ou CD80 de tipo selvagem (ECD) Fc, ou apenas Fc de controle negativo, a uma concentração de 40 nM em tampão de ensaio (RPMI1640 + soro bovino fetal a 5% (FBS)), ou tampão sozinho, e foram adicionados aos poços de uma placa de polipropileno de 96 poços fresca. Células efetoras Jurkat que expressam IL-2 repórter luciferase foram contadas e ressuspensas em tampão de ensaio para uma concentração de 2x106 células/ml. Adicionaram-se então 60 μΙ da suspensão de células de Jurkat aos poços contendo as moléculas de fusão CD80-Fc ou controles. As células e as proteínas CD80 foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois 100 μΙ da mistura de proteína de célula/CD80 foram transferidos/poço da placa de ensaio anti-CD3/CD86-Fc preparada.
[00632] A placa de ensaio foi brevemente centrifugada (10 segundos a 1.200 rpm) e incubada a 37 °C durante 5 horas. Após as 5 horas de incubação, a placa foi removida e equilibrada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foram adicionados 100 μΙ de Bio-GIo (Promega)/poço da placa de ensaio, que foi então colocada em um agitador orbital durante 10 minutos. A luminescência foi medida com um
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423/474 tempo de integração de 1 segundo por poço utilizando um luminômetro BioTek Cytation 3.
[00633] Determinou-se um valor médio de luminescência relativa para cada CD80 variante IgV Fc e calculou-se um aumento de vezes no sinal repórter de IL-2 para cada variante em comparação com a proteína CD80 IgV-Fc de tipo selvagem. Os resultados são fornecidos na Tabela 14 abaixo.
[00634] Tal como mostrado na Tabela 14, cocultivar a maioria das variantes exemplificativas de moléculas CD80 IgV-Fc com células efetoras Jurkat expressando o repórter IL-2-luciferase, resultou em uma redução da coestimulação de CD28 (isto é, bloqueio) em comparação apenas com tampão ou apenas Fc de controle negativo. Em contraste, várias das variantes das moléculas de CD80 IgV-Fc pareceram aumentar o sinal coestimulatório de CD28 em comparação com a molécula de CD80 IgV-Fc de tipo selvagem, sugerindo uma possível ativi dade agonista.
TABELA 14. Ensaio de Repórter Jurkat/IL2: Bloqueio de Coestimulação de CD28
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Unidades de Lumines cência Média Relativa Dobra aumenta em sinal repórter de IL2
Q27H/T41S/A71D 153 1301 0,32
I30T/L70R 154 3236 0,79
T13R/C16R/L70Q/A71D 155 3204 0,78
T57I 156 1463 0,36
M43I/C82R 157 1326 0,32
V22L/M38V/M47T/A71D/L85M 158 1770 0,43
I30V/T57I/L70P/A71D/A91T 159 1731 0,42
V22I/L70M/A71D 160 253 0,06
N55D/K86M 163 4277 1,04
L72P/T79I 164 4157 1,01
L70P/F92S 165 5035 1,22
T79P 166 4397 1,07
E35D/M47I/L65P/D90N 167 2377 0,58
L25S/E35D/M47I/D90N 168 2567 0,62
A71D 170 999 0,24
E81K/A91S 172 4038 0,98
A12V/M47V/L70M 173 4999 1,22
K34E/T41A/L72V 174 4225 1,03
T41S/A71D/V84A 175 2685 0,65
E35D/A71D 176 1461 0,36
E35D/M47I 177 1444 0,35
K36R/G78A 178 2597 0,63
Q33E/T41A 179 4220 1,03
M47V/N48H 180 2656 0,65
M47L/V68A 181 5445 1,32
S44P/A71D 182 2848 0,69
Q27H/M43I/A71D/R73S 183 1891 0,46
E35D/T57I/L70Q/A71D 185 280 0,07
M47I/E88D 186 2178 0,53
M42I/I61V/A71D 187 2549 0,62
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TABELA 14. Ensaio de Repórter Jurkat/IL2: Bloqueio de Coestimulação de CD28
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Unidades de Lumines cência Média Relativa Dobra aumenta em sinal repórter de IL2
P51A/A71D 188 4690 1,14
H18Y/M47I/T57I/A71G 189 924 0,22
V20I/M47V/T57I/V84I 190 1870 0,45
V20I/M47V/A71D 191 360 0,09
A71D/L72V/E95K 192 2939 0,71
V22L/E35G/A71D/L72P 193 2334 0,57
E35D/A71D 194 812 0,20
E35D/I67L/A71D 195 1223 0,30
T13R/M42V/M47I/A71D 197 759 0,18
E35D 198 1981 0,48
E35D/M47I/L70M 199 1077 0,26
E35D/A71/L72V 200 1152 0,28
E35D/M43L/L70M 201 3640 0,88
A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D 202 4078 0,99
E35D/D46V/L85Q 203 3230 0,79
Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D 204 1180 0,29
Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I 196 2000 0,49
M47V/I69F/A71D/V83I 205 290 0,07
E35D/T57A/A71D/L85Q 206 3213 0,78
H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q 207 2773 0,67
E35D/M47L 208 1110 0,27
E23D/M42V/M43 l/l 58 V/L70R 209 4460 1,08
V68M/L70M/A71D/E95K 210 2067 0,50
N55I/T57I/I69F 211 1915 0,47
E35D/M43I/A71D 212 3019 0,73
T41S/T57I/L70R 213 3641 0,89
H18Y/A71D/L72P/E88V 214 1354 0,33
V20I/A71D 215 2165 0,53
E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M 216 2067 0,50
A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V 217 2408 0,59
V22L/E35D/M43L/A71G/D76H 218 2004 0,49
E35G/K54E/A71D/L72P 219 3618 0,88
L70Q/A71D 220 1036 0,25
A26E/E35D/M47L/L85Q 221 4111 1,00
D46E/A71D 222 490 0,12
Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W 223 3678 0,89
WT CD80 IgV-Fc 3031 4113 1,00
WT CD80 ECD-Fc 2 3816 0,93
Controle apenas de Fc - 4107 1,00
Tampão apenas - 4173,25 1,01
EXEMPLO 9
Avaliação da Bioatividade de Moléculas Contendo o Domínio IgSF CD80 Maduro e Afinidade na Presença e Ausência de PD-L1 Utilizando um Ensaio de Repórter Jurkat/IL2 [00635] Este Exemplo descreve um ensaio repórter Jurkat/IL2 para avaliar a capacidade de proteínas imunomoduladoras variantes do domínio CD80 fundidas com uma molécula Fc inerte (por exemplo SEQ ID NO: 1714) ou uma molécula Fc capaz de mediar atividade efetora (SEQ ID NO: 1429) para modular o sinal de coestimulação de CD28 na presença ou ausência de células apresentadoras de antígeno que expressam PD-L1.
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A. Coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 [00636] As células efetoras Jurkat que expressam um repórter de IL-2-luciferase (adquirido a Promega Corp., EUA) foram suspensas a 2x106 células/ml em tampão de ensaio de Jurkat (RPMI1640 + 5% de FBS). As células Jurkat foram então plaqueadas a 50 μΙ/poço para urn total de 100.000 células por poço.
[00637] A cada poço, adicionaram-se 25 μΙ de proteína de teste às células Jurkat. As proteínas de teste incluíam variantes de moléculas de fusão CD80 IgV-Fc (inertes) ou CD80-ECD-Fc completo (R&D Systems, EUA) ou CD80-lgV-Fc de tipo selvagem (inerte). Todas as proteínas foram adicionadas a: 200 nM, 66,7 nM e 22,2 nM (sem PD-L1) ou 200 nM, 66,7 nM, 22,2 nM, 7,4 nM e 2,5 nM (+PD-L1). As células Jurkat com proteínas de teste ou de controle foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Células apresentadoras de antígeno artificial derivadas de CHO (aAPC) exibindo Fv de cadeia iônica simples anti-CD3 transduzida na superfície celular (isto é, sem PD-L1), ou OKT3 e PD-L1 (isto é, +PD-L1), foram trazidas para 0,8x106 células/ml, e 25 ul de células foram adicionados a cada poço, elevando o volume final de cada poço a 100 ul. Cada poço tinha uma relação final de 5:1 de células Jurkat: CHO e uma concentração de proteína de teste de 50, 16,7 ou 5,6 nM (sem PD-L1), ou 50, 16,7, 5,6, 1,9 e 0,6 nM (+ PD-L1). As células de Jurkat e células CHO foram incubadas durante 5 horas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada de incubação com 5% de CO2. As placas foram então removidas da incubadora e aclimatadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionaramse 100 μΙ de uma solução de lise celular e substrato de luciferase (reagente de luciferase BioGIo, Promega) a cada poço e as placas foram incubadas em um agitador orbital durante 10 minutos. A luminescência foi medida com um tempo de integração de 1 segundo por poço usando um luminômetro BioTek Cytation, e um valor de luminescência rela
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426/474 tiva (RLU) foi determinado para cada amostra de teste. Os resultados são fornecidos na Tabela 15.
[00638] Na ausência de PD-L1 no aAPC, foi observado pouco ou nenhum sinal coestimulador consistente com a observação de que moléculas CD80 variantes fundidas a um Fc inerte não foram capazes de induzir um sinal coestimulatório via CD28. Na presença de PD-L1, contudo, várias das variantes das moléculas CD80-lgV-Fc (inertes) testadas exibiram coestimulação de CD28 dependente da concentração que estava correlacionada com a afinidade de ligação a CD28 e/ou PD-L1 das moléculas variantes. Este resultado indica que moléculas CD80 variantes com afinidade aumentada para PD-L1 são capazes de mediar a coestimulação dependente de PD-L1 de CD28.
TABELA 15. Coestiumulaçâo de CD28 Dependente de PD-L1
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (igv) No PD-L1 + PD-L1
5,6 nM 16,7 nM 50 nM 0,6 nM 1,9 nM 5,6 nM 16,7 nM 50 nM
E35D/M47I 177 637 710 894 1047 1732 2794 3672 3778
A71D/L72V/E95K 192 466 547 644 524 530 617 641 755
E35D 198 412 480 448 456 465 625 995 1606
E35D/M47I/L70M 199 549 544 600 1004 1640 2348 2629 2629
E35D/M43L/L70M 201 396 439 515 479 525 683 1066 1809
E35D/D46V/L85Q 203 511 554 720 611 1001 1486 1814 2224
H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q 207 638 660 926 628 621 795 974 1156
E35D/M47L 208 633 731 817 1041 1730 2580 3069 2906
E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L 85M 216 566 560 606 524 604 659 689 695
E35G/K54E/A71D/L72P 219 417 475 440 529 489 554 504 476
A26E/E35D/M47L/L85Q 221 458 415 432 509 618 886 1385 1998
WT CD80 IgV-Fc (inerte) 3031 450 444 479 458 486 511 523 483
WT CD80 ECD-Fc (inerte) 2 436 412 420 518 474 505 462 449
Controle apenas de Fc - 419 406 395 501 457 438 451 440
[00639] Em um experimento adicional, outras variantes de proteínas de fusão CD80 IgV-Fc (inerte) foram testadas para estimulação com CD28 na ausência de aAPCs +/-PD-L1 como descrito acima, exceto que as concentrações finais de cada proteína de teste foram de 50 nM e 5 nM. Determinou-se um valor de luminescência relativa (RLU) para cada amostra de teste e calculou-se um aumento (ou diminuição) no sinal repórter de IL-2 para cada molécula CD80-lgV variante e comparou com CD80-ECD-Fc de tipo selvagem (inerte) e CD80-lgV-Fc (inertes) proteínas.
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427/474 [00640] Tal como apresentado nas Tabelas 16 e 17, a atividade luciferase das células efetoras Jurkat cocultivadas com as moléculas K562/OKT3/PD-L1 aAPC e 50 nM CD80-lgV-Fc (inerte) foi alterada (aumentada ou diminuída) durante várias das moléculas testadas. A ligação simultânea de PD-L1 ao aAPC e CD28 na célula Jurkat resultou no aumento da coestimulação com CD28 e transdução do sinal de IL-2 a jusante. O aumento da dobra (ou diminuição) na luminescência em relação ao CD80-lgV-Fc de tipo selvagem (inerte) também é mostrado. Na Tabela, a primeira coluna apresenta a mutação(ções) e a segunda coluna apresenta o identificador da SEQ ID NO para cada
CD80-lgV de uma variante Fc (inerte) de CD80-lgV testada.
TABELA 16: Ensaio de Repórter Jurkat/IL2 + K562/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone, de CD80Fc 50nM Aumento da dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E 2201 569 1,0
A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q 2202 500 0,9
E35D/M47L/L85Q 2203 2852 5,0
A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2204 416 0,7
A26E/Q33L/E35D/M47L 2205 476 0,8
H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2206 408 0,7
Q33L/E35D/M47I 2207 423 0,7
H18Y/Q33L/E35D/M47I 2208 486 0,9
Q33L/E35D/D46E/M47I 2209 554 1,0
Q33R/E35D/D46E/M47I 2210 522 0,9
H18Y/E35D/M47L 2211 2976 5,3
Q33L/E35D/M47V 2212 393 0,7
Q33L/E35D/M47V/T79A 2213 527 0,9
Q33L/E35D/T41S/M47V 2214 481 0,8
Q33L/E35D/M47I/L85Q 2215 432 0,8
Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q 2216 463 0,8
Q33L/E35D/M47V/L85Q 2217 556 1,0
A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q 2218 526 0,9
Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q 2219 464 0,8
V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V 2220 390 0,7
E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q 2221 3235 5,7
S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q 2222 468 0,8
E7D/E35D/M47I/L97Q 2223 1243 2,2
Q33L/E35D/T41S/M43I 2224 533 0,9
E35D/M47I/K54R/L85E 2225 602 1,1
Q33K/E35D/D46V/L85Q 2226 504 0,9
Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G 2227 496 0,9
H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q 2228 2652 4,7
Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K 2229 513 0,9
Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R 2230 415 0,7
E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W 2231 473 0,8
A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W 2232 498 0,9
Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N 2233 551 1,0
H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F 2234 566 1,0
V22A/E35D/V68E/A71D 2235 538 1,0
Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S 2236 394 0,7
V22A/R29H/E35D/D46E/M47I 2237 3314 5,9
Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W 2238 553 1,0
H18Y/E35D/V68M/L97Q 2239 4336 7,7
Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D 2240 572 1,0
Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G 2241 473 0,8
E35D/M47L/A71G/L97Q 2242 2156 3,8
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TABELA 16: Ensaio de Repórter Jurkat/IL2 + K562/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone, de CD80Fc 50nM Aumento da dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q 2243 576 1,0
H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q 2244 455 0,8
E35D/D46E/M47V/L97Q 2245 1087 1,9
E35D/D46V/M47I/A71G/F92V 2246 2254 4,0
E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M 2247 438 0,8
Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q 2248 358 0,6
WT CD80-ECD-Fc (efetor) 2 3045 5,4
WTCD80 IgV-Fc (inerte) 3031 566 1
TABELA 17: Ensaio de Repórter Jurkat/IL2 + K562/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone, de CD80-Fc 50nM Aumento da dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q 2249 315 1,5
E35D/M47V/N48K/V68M/K89N 2250 1439 7,0
Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G 2251 213 1,0
R29H/E35D/M43V/M47I/I49V 2252 227 1,1
Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G 2253 1313 6,4
E35D/M47I/L85Q/D90G 2254 1438 7,0
E35D/M47I/T62S/L85Q 2255 1571 7,6
A26E/E35D/M47L/A71G 2256 1748 8,5
E35D/M47I/Y87Q/K89E 2257 1581 7,7
V22A/E35D/M47I/Y87N 2258 1388 6,7
H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G 2259 1506 7,3
E35D/M47L/A71G/L85Q 2260 1256 6,1
E35D/M47V/A71G/E88D 2261 1216 5,9
E35D/A71G 2262 1190 5,8
E35D/M47V/A71G 2263 1190 5,8
I30V/E35D/M47V/A71G/A91V V22D/E35D/M47L/L85Q 2264 1503 7,3 5,5
2266 1142
H18Y/E35D/N48K 2267 1230 6,0
E35D/T41S/M47V/A71G/K89N 2268 1023 5,0
E35D/M47V/N48T/L85Q 2269 897 4,4
E35D/D46E/M47V/A71D/D90G 2270 1042 5,1
E35D/D46E/M47V/A71D 2271 683 3,3
E35D/T41S/M43I/A71G/D90G 2272 1122 5,4
E35D/T41S/M43I/M47V/A71G 2273 1273 6,2
E35D/T41S/M43I/M47L/A71G 2274 1535 7,5
H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G 2275 1379 6,7
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2276 1116 5,4
E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N 2277 851 4,1
Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G 2278 978 4,7
V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G 2279 1123 5,5
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D 2280 1464 7,1
E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G 2281 1672 8,1
E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q 2282 1381 6,7
E35D/M47V/T62A/A71D/K93E 2283 1056 5,1
E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E 2284 1261 6,1
E35D/M43I/M47V/K89N 2285 1094 5,3
E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y 2286 1322 6,4
E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q 2287 1260 6,1
V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q 2288 1542 7,5
E35D/T41S/M47V/L97Q 2289 594 2,9
E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R 2290 1723 8,4
E35D/A71D/L72V/R73H/E81K 2291 282 1,4
Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q 2292 168 0,8
E35D/M38T/D46E/M47V/N48S 2293 1315 6,4
Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L 2294 215 1,0
E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q 2295 680 3,3
T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G 2296 580 2,8
WT CD80 ECD-Fc (efetor) 2 1786 8,7
WT CD80-lgV-Fc (inerte) 3031 206 1,0
[00641] Para comparar ainda mais a atividade, foram avaliadas vá
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429/474 rias concentrações da variante exemplificativa CD80 IgV-Fc (inerte) para indução da atividade da luciferase em células repórter Jurkat/IL2 utilizando a linha celular K562/OKT3/PDL1 aAPC descrita acima e a atividade foi comparada com CD80 IgV-Fc de tipo selvagem (inerte). As variantes exemplificativas de moléculas CD80 IgV que foram testadas continham E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G (SEQ ID NO: 2275), H18Y/A26E/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276) e E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280). Como mostrado na Figura 9B, as moléculas contendo o domínio CD80 IgV variante exemplificador testado induzem coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 de um modo dependente da dose. Não foi observada coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 pelo CD80 IgV-Fc de tipo selvagem em qualquer das concentrações avaliadas.
B. Produção de citocinas após coestimulação dependente de PDL1 [00642] As células aAPC de K562/OKT3/PDL1 descritas acima foram tratadas com mitomicina-c e cocultivadas com células pant-T humanas primárias na presença de concentrações crescentes tituladas de CD80 IgV-Fc (inerte) ou CD80 IgV-Fc de tipo selvagem (inerte). A variante exemplificativa CD80-Fcs testada continha E35D/M47V/ N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276), E35D/D46V/M47L/V68M/ L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280), E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E (SEQ ID NO: 2284). Como controle adicional, as células pant-T humanas primárias também foram cultivadas com o durvalumab anti-PD-L1 exemplificador ou um controle apenas de Fc (inerte). Os resultados, apresentados na Figura 9C, mostraram que as variáveis testadas das moléculas CD80-lgV-Fc resultaram na secreção de IL-2 em sobrenadantes de cultura, consistente com uma observação de que a coesti
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430/474 mulação dependente de PD-L1 foi induzida pelas variantes CD80-lgVFc exemplificativas testadas. A produção de IL-2 não foi observada em culturas de células T quando incubadas com Fc de CD80-lgV de tipo selvagem ou outros controles testados.
C. Coestimulação de +/- PD-L1 de CD28 dependente de Fc [00643] Em um experimento adicional, a coestimulação de CD28 foi avaliada para as proteínas de fusão variantes CD80-lgV-Fc, onde o Fc era um lgG1 Fc (por exemplo SEQ ID NO: 1429) capaz de mediar atividade efetora via ligação a receptores Fc (FcR). O experimento foi realizado como descrito na parte A acima, exceto que as células K562 expressando CD32 estavelmente transduzidas com OKT3 (K562/OKT3) ou OKT3 e PD-L1 (K562/OKT3/PD-L1) foram utilizadas em vez das células CHO/OKT3 e CHO/OKT3/PD-L1 e os resultados são apresentados na Tabela 18.
TABELA 18. Coestimulação de CD28 via Receptor de Fc ou Ligação Cruzada Dependente de PD-L1
K562/OKT3 aAPC K562/OKT3/PD-L1 aAPC
Mutação(ões) de CD80 SEQID NO (IgV) Ligação cruzada dependente de FcR (Sem PD-L1) Combinação de FcR e/ou Ligação cruzada dependente de PD-L1
0,6 nM 1,9 nM 5,6 nM 16,7 nM 50 nM 0,6 nM 1,9 nM 5,6 nM 16,7 nM 50 nM
E35D/M47I 177 1777 2133 3651 5792 7144 2832 3604 4702 5321 5704
A71D/L72V/E95K 192 1821 2588 4127 5553 7109 1060 1537 2517 3642 4031
E35D 198 1402 1328 1300 1318 1203 920 1113 1397 1765 2270
E35D/M47I/L70M 199 1609 2520 4231 5370 5780 2238 2689 3654 3907 3870
E35D/M43L/L70M 201 1349 1336 1404 1345 1573 1022 1250 1616 2046 2780
E35D/D46V/L85Q 203 1880 2721 4396 6023 7015 1418 2432 3306 3645 4126
H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q 207 2081 2808 4550 6958 8747 1156 1825 3121 4329 5215
E35D/M47L 208 2119 3042 5615 7736 8685 2783 3846 4726 5406 5036
E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72 V/L85M 216 2022 3300 5052 7011 7855 1153 1949 3219 4042 4138
E35G/K54E/A71D/L72P 219 1337 1367 1380 1430 1510 689 732 735 701 805
A26E/E35D/M47L/L85Q 221 1350 1382 1416 1371 1327 1228 1586 2004 2504 2640
WT CD80 IgV-Fc 3031 1410 1349 1309 1208 1246 662 674 697 673 663
WT CD80 ECD-Fc (inerte) 2 (ECD) 1344 1270 1481 1727 2202 692 705 847 875 1519
Controle apenas de Fc 1714 1404 1390 1390 1370 1373 689 675 666 694 679
[00644] Algumas das proteínas imunomoduladoras CD80-lgV Fc (efetoras) avaliadas exemplificativamente, incluindo E35D, E35D/M43L/L70M e A26E/E35D/M47L/L85Q, n afectaram a coestimulação de CD28 quando reticuladas por ligação ao FcR. No entanto, os resultados indicaram que várias variantes avaliadas exemplificativas com um Fc capaz de se ligar a FcR (efetor) poderíam fornecer coestimulação de CD28 em trans com reticulação de FcR. Entre estes, algumas das proteínas imunomoduladoras CD80-lgV Fc (efetoras) avaliadas exemplificadamente, tais como E35D/M47I, aumentaram a coestimulação de CD28 através da reticulao de PD-L1 e FcR. Em alguns
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431/474 casos, os resultados indicaram uma coestimulação aumentada de CD28 por reticulação de FcR e PD-L1 foi mais potente do que a reticulação de PD-L1 sozinho.
EXEMPLO 10
Avaliação da Bioatividade de Moléculas Contendo o Domínio IgSF CD80, Amadurecido por Afinidade, Utilizando um Ensaio de Estimulação de Células T [00645] As moléculas CD80-lgV-Fc, contendo Fc inerte ou Fc efetor, foram testadas em 3 concentrações, 1 nM, 10 nM e 100 nM, por sua capacidade de estimular células T na presença de células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs), K562/OKT3 +/- PD-L1, determinado por liberação de citocinas (IFN-gama e IL-2) e proliferação de células T.
[00646] 100.000 células pan-T isoladas foram incubadas com 8.000 células K562/OKT3 ou K562/OTK3/PD-L1 (razãpo 12,5:1) e 1 nM, 10 nM ou 100 nM de CD80-lgV-Fc (efetor) ou CD80-lgV- Fc (inerte). A mistura de células também foi incubada com um anticorpo anti-PD-L1, lgG1 humana de tipo selvagem, lgG1 Fc humano (inerte), CD80 IgV-Fc de tipo selvagem (efetor), CD80 IgV-Fc de tipo selvagem (inerte), ECD-Fc CD80 de tipo selvagem (inerte), ECD-Fc CD80 de tipo selvagem (efetor), ou nenhum tratamento como controles. O IFN-gama, a IL-2 e a proliferação foram determinados após 72 horas de incubação.
[00647] Os resultados para a liberação de IL-2 são apresentados na Tabela 19. No primeiro expperimento, a cocultura de células T e K562/OKT3 aAPC (não expressando PD-L1), na presença de certas moléculas variantes de IgV-Fc CD80 variante avaliadas, resultou no aumento da produção de IL-
2. Em um segundo experimento, a coestimulação de CD28 foi aumentada na presença de certas moléculas variante de CD80 IgV-Fc (inerte) após a cocultura de células T com aAPCs K562/OKT3/PD-L1, consistente com a atividade de coestimulação de CD28 dependente de PD-L1 para essas variantes. As moléculas de CD80 IgV-Fc que se ligam fracamente a PD-L1 (isto é, E35G/K54E/A71D/L72P) não geraram coestimulação significativa e produção de IL-2. Em alguns casos, certas variantes de moléculas CD80 IgV-Fc (efetoras), como E35D, foram capazes de efetuar a coestimulação de CD28
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432/474 apenas na presença de APC expressando PD-L1. Os resultados de IFNgama e proliferação foram semelhantes aos observados para a liberação de IL-2.
TABELA 19. Coestimulação de CD28 de Célula T Primária via Ligação Cruzada Mediada por PD-L1 ou Receptor de Fede Moléculas CD80-lgC-Fc
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) K562/OKT3 (No PD-L1) K562/OKT3/PD-L1
CD80-lgV Fc (efetor) CD80-lgV Fc (inerte)
1 nM 10 nM 100 nM 1 nM 10 nM 100 nM
E35D/M47I 177 11140 21590 27162 244 3432 8313
A71D/L72V/E95K 192 10593 15145 21314 <LOD <LOD <LOD
E35D 198 7598 7988 8380 <LOD 210 2739
E35D/M47I/L70M 199 15695 25997 25294 311 6982 8393
E35D/M43L/L70M 201 8025 7712 10496 <LOD 52 1204
E35D/D46V/L85Q 203 14329 21462 25421 <LOD 102 1429
H18Y/A26T/E35D/A71D/L85 Q 207 11960 20452 20581 <LOD <LOD <LOD
E35D/M47L 208 14571 23581 26827 268 2695 7533
E23G/A26S/E35D/T62N/A7 1D/L72V/L85M 216 15377 23462 27028 <LOD <LOD 102
E35G/K54E/A71D/L72P 219 7032 7902 8886 <LOD <LOD 59
A26E/E35D/M47L/L85Q 221 6847 8318 10113 72 268 1455
WT CD80 IgV-Fc (efetor) 3031 7167 7123 6203 Não Testado Não Testado Não Testado
WT CD80 IgV-Fc (inerte) 3031 Não Testado Não Testado Não Testado <LOD 7 52
WT CD80 ECD-Fc (inerte) 2 (ECD) 8046 7022 6481 Não Testado Não Testado Não Testado
WT CD80 ECD-Fc (efetor) 2 (ECD) 11434 20185 23118 507 3114 8393
Anti-PD-L1 mAb 8220 8621 6903 461 821 1045
Controle de Fc Inerte 7040 6335 5512 <LOD 143 <LOD
Controle de Fc de WT IgG1 - 7077 6916 6258 Não Testado Não Testado Não Testado
EXEMPLO 11
Avaliação de Polipeptídeos CD80 Variantes Bloqueando Interação PDL1/PD-1 ou Coestimulação Dependente de PD-L1
A. Ligação e Bloqueio de PD-L1/PD-1 [00648] A ligação de proteínas de fusão imunomoduladoras selecionadas a células que expressam PD-L1 foi avaliada para testar o bloqueio da interação PD-L1/PD-1. As células CHO/PD-L1 foram coradas com uma titulação de moléculas contendo o domínio CD80 de IgV-Fc variantes, lavadas e depois incubadas com PD-1 a Fc conjugado com fluorescência. As moléculas variantes contendo o domínio CD80 IgV exemplificative testadas continham E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/V22A/ E35D/M47V/T62S/A71G (SEQ ID NO: 2275), H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276) e E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/ E88D (SEQ ID NO: 2280). Como controle, foi também avaliado um anticorpo anti-PD-L1 e um CD80 IgV-Fc de tipo selvagem. As amostras foram adquiri
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433/474 das em um citômetro de fluxo e as MFIs da PD-1 fluorescentemente marcadas foram determinadas por análise de software Flowjo. Como mostrado na Figura 9D, mostrou-se que as variantes exemplificativas das moléculas CD80 IgV-Fc testadas antagonizaram ou bloquearam a ligação de PD-1 a PD-L1.
B. Atividade [00649] Os polipeptídeos variantes CD80-Fc exemplificativos foram avaliados quanto à sua capacidade de distribuir coestimulação dependente de PD-L1 utilizando células repórter Jurkat/IL-2, expressando PD-1, como descrito acima. As células repórter de Jurkat/IL-2 foram incubadas com células apresentadoras de antígenos artificiais K562/OKT3/PD-L1 (aAPCs), descritas acima, na presença de quantidades tituladas (variando de 40 pM a 100 nM) de polipeptídeos CD80 IgV-Fc variantes exemplificativos. Entre os polipeptídeos variantes CD80 IgV-Fc exemplificativos estavam moléculas contendo uma variante IgV, quer E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G (SEQ ID NO: 2275), H18Y/ A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276) ou E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280), fundidos ao Fc exemplificativo (C220S/L234A/L235E/G237A por numeração EU; SEQ ID NO: 1714). Outros polipeptídeos variantes CD80 IgV-Fc testados continham uma IgV variante, quer E35D/M47I/L70M, SEQ ID NO: 199; ou E35D/M47L, SEQ ID NO: 208) fundidos com lgG1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1429). Como controle, as células que expressam PD-L1 foram também incubadas com IgV-Fc CD80 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 3031) ou com um anticorpo anti-PDL1 (BioLegend EUA).
[00650] As células repórter Jurkat/IL-2/PD-1 foram plaqueadas a 100.000 células por poço em tampão de ensaio Jurkat (RPMI1640 + 5% FBS). As células Jurkat foram então incubadas com proteínas de teste ou de controle durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células K562/OKT3/PD-L1 foram então adicionadas de tal modo que cada poço teve uma razão final de 5:1 de células Jurkat: K562. As células Jurkat, K562, células e proteínas de teste ou de controle foram incubadas durante 5 horas a 37 graus Celsius em uma câmara de incubação umidificada com 5% de
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C02. As placas foram então removidas da incubadora e aclimatadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionaram-se 100 pl de uma solução de lise celular e substrato de luciferase (reagente de luciferase BioGIo, Promega) a cada poço e as placas foram incubadas em um agitador orbital durante 10 minutos. A luminescência foi medida com um tempo de integração de 1 segundo por poço utilizando um luminômetro BioTek Cytation e foi determinado um aumento da dobra no valor de luminescência (RLU) para cada amostra de teste.
[00651] Como mostrado na Figura 9E, a adição do CD80 IgV-Fc variante exemplificador avaliado, bloqueou a supressão mediada por PD-L1 da ativação de TCR e/ou CD28 agonizado, resultando em um aumento da luminescência. As moléculas variantes identificadas para maior afinidade de ligação a PD-L1 exibiram maior atividade na ativação de células T agonizantes.
EXEMPLO 12
Atividade Antitumoral In Vivo de Polipeptídeos CD80 Variantes
Atividade antitumoral de CD80 variante [00652] As células de tumor MC38 de camundongo foram estavelmente transfectadas com PD-L1 humano (MC38 hPD-L1) e implantadas subcutaneamente em camundongos C57BL/6. Um controle Fc inerte ou variantes exemplificativas de moléculas de CD80 IgV-Fc contendo uma variante de IgV (E35D/M47I/L70M, SEQ ID NO: 199; ou E35D/M47L, SEQ ID NO: 208) fundida a uma molécula Fc inerte (por exemplo SEQ ID NO: 1714) ou uma molécula de Fc capaz de mediar a atividade efetora (SEQ ID NO: 1429), foram injectadas ip, 100 pg/camundongo, nos dias 8, 10, 13, 15 e 17 após a implantação. O volume do tumor foi rastreado ao longo do tempo.
[00653] Como mostrado na Figura 10, a supressão do crescimento do tumor foi observada em todos os camundongos tratados com CD80-lgV em comparação com o controle de Fc, demonstrando que as moléculas de CDV IgV-Fc variantes eram funcionalmente ativas in vivo.
B. Dependência de Dose da Atividade Antitumoral
Volume do tumor (doses de 50 uq, 100 uq e 500 uq) [00654] 70 camundongos C57CL/6 do sexo feminino, que contêm os
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435/474 volumes tumorais semelhantes de aproximadamente 50 a 51 mm3, após a implantação de células tumorais MC38 HPD-L1, foram organizados e divididos em 5 grupos de tratamento contendo 14 camundongos cada. O grupo 1 (isotipo de controle) recebeu apenas 75 pg de Fc (SEQ ID NO: 1714); os grupos 2, 3 e 4 receberam 50, 100, e 500, respectivamente, de CD80 variante E35D/M47L (SEQ ID NO: 208), fundido com um inerte Fc humano (SEQ ID NO: 1714) através de um S ligante GSG4 (SEQ ID NO: 1716); e o grupo 5 recebeu 100 pg de mAb anti-PD-L1 humano (durvalumab), nos dias 8, 10 e
12. Os volumes tumorais foram medidos nos dias 7, 10 e 12. No dia 13, 5 animais foram sacrificados para análise como descrito nas seções abaixo. As medições do tumor foram retomadas para os restantes 9 camundongos para cada grupo nos dias 17, 20 e 27. Nos dias 26, 28 e 31, os animais do grupo 1 (controle do isotipo Fc) receberam uma injeção intratumoral de 100 pg de E35D/M47L CD80-lgV-Fc.
[00655] Os volumes médios e medianos dos tumores estão representados na Figura 11. Como mostrado, uma diminuição dependente da dose nos volumes do tumor foi observada em tratados com CD80-lgV-Fc em comparação com o controle de Fc. Neste estudo, o volume mediano do tumor observado em camundongos tratados com os 100 pg a 500 pg de CD80-lgV-Fc foi semelhante aos camundongos tratados com o controle do anticorpo antiPD-Ll.
Análise de citocinas [00656] Após a digestão enzimática dos tumores MC38, a solução de lisado foi centrifugada e os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 °C até estarem prontos para o ensaio. A concentração de IFNy de camundongo em cada amostra foi então medida usando um kit de ELISA comercial (R&D Systems, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante, e as concentrações foram normalizadas com base em ambos o peso do tumor ou o número total de células isoladas a partir de tumor. Os resultados, apresentados na Figura 12, indicaram que a dose mais elevada (500 pg) de E35D/M47L CD80-lgV-Fc resultou nas concentrações mais elevadas de IFNy nos lisados tumorais, sugerindo que o CD80-lgV-Fc está a produzir IFNy em resultado do seu tratamento, um mecanismo que é conhecido por
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436/474 promover imunidade antitumoral.
C. Atividade de Retomada e Antitumoral e das Variantes Selecionadas do CD80 [00657] 95 camundongos C57BL/6 fêmeas foram implantados com células tumorais MC38 hPD-L1. Os tumores foram organizados no dia 7, e 77 camundongos com volumes tumorais semelhantes de cerca de 60 mm3 foram divididos em 7 grupos de tratamento contendo 11 camundongos cada. O Grupo 1 (Isotipo de controle) recebeu apenas 75 pg de Fc inerte (SEQ ID NO: 1714); o Grupo 2 recebeu 100 pg de variante CD80 E35D/M47V/ Ν48ΚΛ/68Μ/Κ89Ν IgV-Fc (SEQ ID NO: 2250) (inerte); o grupo 3 recebeu 100 pg de CD80 variante H18Y/A26E/E35D/M47LA/68M/A71G/D90G IgV-Fc (SEQ ID NO: 2276) (inerte); o grupo 4 recebeu 100 pg de CD80 variante E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV-Fc (SEQ ID NO: 2280) (inerte); o grupo 5 recebeu 100 pg de CD80 variante E35D/D46E/M47V/lgM V68M/ D90G/K93E (SEQ ID NO: 2284)-Fc (inerte); o grupo 6 recebeu 100 pg de CD80 variante E35D/M47L (SEQ ID NO: 208)-Fc (inerte); e o Grupo 7 recebeu 100 pg de mAb anti-PD-L1 humano (durvalumab), nos dias 7, 9 e 11. Para as moléculas de CD80-lgV-Fc variante, os domínios CD80lgV foram fundidos com Fc inerte humano, apresentados na SEQ ID NO: 1714, através de um ligante GSG4S (SEQ ID NO: 1716). Os volumes tumorais foram medidos nos dias 14, 17, 21, 24, 28, 31 e 37. Os animais que receberam o controle do isotipo Fc faleceram no dia 28 devido ao excesso de carga tumoral.
[00658] Os volumes médios e medianos dos tumores estão representados na Figura 13, que mostra que todas as moléculas CD80-lgV-Fc testadas exibiram atividade semelhante ou, em alguns casos, substancialmente melhorada, em comparação com o controle anti-PD-L1. Após a conclusão do estudo, 8 camundongos do Grupo 3, 2 camundongos do Grupo 4, 1 camundongo do Grupo 6 e 2 camundongos do Grupo 7 já não tinham tumores detectáveis e foram designados isentos de tumor.
[00659] No dia 49, camundongos isentos de tumor, dos Grupos 3, 4, 6 e 7, e 2 camundongos C57CL/6 naive foram re-desafiados com uma injeção adicional de células hPD-L1 MC38. Os volumes tumorais foram medidos nos dias 56, 59 e 63. Os resultados estão representados na Figura 14. Os ca
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437/474 mundongos naive exibiram rápido crescimento tumoral, como esperado. No dia 59, 8/8 camundongos do Grupo 3, 1/2 camundongos do Grupo 4, 1/1 camundongo do Grupo 6 e 2/2 camundongos do Grupo 7 estavam isentos de tumor e, ao dia 63, todos os camundongos do Grupo 3, Grupo 4, Grupo 6 e Grupo 7 estavam livres de tumor. Este resultado é consistente com a observação de que os agentes testados, incluindo as moléculas de CD80-lgVFc, foram capazes de fornecer efeitos antitumorais de imunidade durável e duradoura.
[00660] Os tumores de camundongos sacrificados 3 dias após a segunda dose foram digeridos e analisaram-se células tumorais CD45 vivas quanto à presença de anticorpo Fc, variante CD80-Fc ligado e anticorpo antiPD-Ll ligado por citometria de fluxo. Os resultados para os Grupos 1, 3, 6 e 7 são fornecidos na Figura 15. Semelhante ao estudo descrito acima, os resultados mostraram que as moléculas de CD80-lgV-Fc exibiram menos ligação ao tumor em comparação com o controle do anticorpo anti-PD-L1. Apesar disto, uma atividade superior por CD80-lgV-Fc, tal como mostrado por camundongos tratados com o CD80-lgV-Fc exemplificativo apresentado na SEQ ID NO: 2276 (H18Y/A26E/E35D/M47LA/68M/A71G/D90G), pode ser conseguido consistente com o fator de diferenciação na atividade sendo devido a agonismo de CD28 (coestimulação de CD28 dependente de PD-L1) e/ou antagonismo de CTLA-4.
D. Atividade Antitumoral do CD80 variante e do anticorpo anti-PD-L1 [00661] 75 animais foram organizados em 3 grupos de tratamento 7 dias após a implantação com células tumorais hPD-L1 MC38.O Grupo 1 recebeu 3 injeções de 75 pg de Fc inerte (SEQ ID NO: 1714), o Grupo 2 recebeu 3 injeções de 100 pg de variante de CD80 H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G IgV (SEQ ID NO: 2276)-Fc (inerte) e o Grupo 3 recebeu 3 injeções de 100 pg de mAb anti-PD-L1 humano (durvalumab), com as injeções ocorrendo nos dias 8, 10 e 12 após a implantação. Os volumes dos tumores foram medidos a cada 3 a 4 dias, desde o dia 11 até o dia 35. 3 dias depois da 1a dose, 2a dose e 3a dose, 4 camundongos de cada grupo foram sacrificados para análise do tumor e de LN, deixando 13 camundongos para medições do volume tumoral ao longo do período do estu
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438/474 do.
[00662] A Figura 16 mostra uma diminuição maior nos volumes tumorais medianos e médios de camundongos tratados neste estudo com o CD80-lgV-Fc exemplificative em comparação com o controle anti-PD-L1. No dia 18, 0/13 camundongos do Grupo 1 (tratados com o controle de Fc) estava isento de tumor, 6/13 camundongos do Grupo 2 (tratados com IgV-Fc variante de CD80) estavam isentos de tumor e 3/13 camundongos de Grupo 3 (tratado com durvalumab) foram isentos de tumor. No dia 35, 1/13 camundongos, 6/13 camundongos e 3/13 camundongos estavam livres de tumor nos Grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Os camundongos tratados com o CD80 variante-lgV-Fc exibiram tumores que, em média, foram reduzidos em tamanho em comparação com tumores de camundongos tratados com o anticorpo anti-hPD-L1 ou o controle Fc inerte.
Caracterização Celular Tumoral [00663] Três dias após a 2a dose do controle Fc, o anticorpo IgV-Fc CD80 variante e o anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab), tumores e nódulos linfáticos de drenagem (LN) foram recolhidos de 3-4 camundongos de cada grupo de tratamento. Os tecidos foram processados para suspensões de células individuais (tumores foram enzimaticamente digeridos como parte do processamento, enquanto que aqueles drenados de LN não foram), e submetidos à análise de citometria de fluxo multicor de células T CD8+ no subgrupo de células CD45+ (células imunes no LN ou tumor), bem como a coloração com % de hlgG+ no subconjunto de células CD45 (células tumorais) para detectar moléculas (CD80-lgV-Fc ou anti-PD-L1) ligadas às células tumorais. Os resultados são fornecidos nas Figuras 17A-C.
[00664] As porcentagens de células T CD8+ foram significativamente maiores ( p <0,05 ou p <0,01) tanto no TIL quanto no LN para camundongos tratados com CD80-lgV-Fc de H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G o controle Fc ou os tratamentos com anticorpo anti-PD-L1 (Figura 17A (LN) e 17B (tumor). Isto indica que o tratamento com CD80-lgV-Fc de H18Y/A26E/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G pode promover a expansão das células T CD8+ in vivo, um importante contribuinte para a imunidade antitumoral. Além disso, detectou-se H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-lgV-Fc
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439/474 no tumor (ex vivo através da coloração de hlgG+ em células CD45), embora a níveis reduzidos, em comparação com os níveis de anticorpo anti-PD- L1 (Figura 17C). Apesar de reduzir a presença de E35D/M47L CD80-Fc no tumor, comparado com o anti-PD-L1 detectado, a atividade antitumoral foi superior para o CD80-Fc em comparação com o anticorpo anti-PD-L1 (ver seção B1 acima da seção). Estes resultados são consistentes com a observação de que a atividade de CD80-lgV-Fc pode não ser apenas para o antagonismo de PD-L1/PD-1, mas que o fator de diferenciação pode estar relacionado ao agonismo de CD28 (coestimulação de CD28 dependente de PD-L1) e/ou atividades de antagonismo de CTLA4.
EXEMPLO 13
Geração de Domínios IgV de CD80 Variante Adicionais
Domínios de Ligação CD80 IgV Adicionais e Avaliação de Ligação [00665] As variantes CD80 adicionais foram geradas e expressas como proteínas de fusão Fc essencialmente como descrito nos Exemplos 2-5. As variantes foram testadas quanto à ligação, substancialmente como descrito no Exemplo 7, e bioatividade, substancialmente descrita no Exemplo 9. Os resultados dos estudos de ligação e atividade são fornecidos nas Tabelas 20-23.
1. Avaliação de Ligação
Tabela 20. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO: CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80
E35D/N48K/L72V 2719 32731 17,1 582 8,8 3031 43,1 5
E35D/T41S/N48T 2720 30262 15,8 72,4 1,1 2191 31,2 30
D46V/M47I/A71G 2721 28420 14,8 1325 20,1 7328 104,2 6
M47I/A71G 2722 27768 14,5 823 12,5 5097 72,5 6
E35D/M43I/M47L/L85M 2723 24584 12,8 265 4,0 4878 69,4 18
E35D/M43I/D46E/A71G/ L85M 2724 26878 14,0 200 3,0 7138 101,5 36
H18Y/E35D/M47L/A71G/ A91S 2725 24218 12,6 528 8,0 7582 107,9 14
E35D/M47I/N48K/I61F 2726 25859 13,5 816 12,4 5627 80,0 7
E35D/M47V/T62S/L85Q 2727 31230 16,3 99,4 1,5 6653 94,6 67
M43I/M47L/A71G 2728 23292 12,2 1000 15,2 7763 110,4 8
E35D/M47V 2729 20893 10,9 461 7,0 2935 41,7 6
E35D/M47L/A71G/L85M 2730 16609 8,7 199 3,0 8312 118,2 42
V22A/E35D/M47L/A71G 2731 21855 11,4 990 15,0 8168 116,2 8
E35D/M47L/A71G 2732 20576 10,7 626 9,5 6635 94,4 11
E35D/D46E/M47I 2733 21394 11,2 1001 15,2 3789 53,9 4
Q27H/E35D/M47I 2734 27530 14,4 756 11,5 3424 48,7 5
E35D/D46E/L85M 2735 30289 15,8 164 2,5 2880 41,0 18
E35D/D46E/A91G 2736 32189 16,8 3450 52,3 2818 40,1 1
E35D/D46E 2737 27921 14,6 779 11,8 3757 53,4 5
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Tabela 20. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO: CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80
E35D/L97R 2738 22803 11,9 44,6 0,7 2614 37,2 59
H18Y/E35D 2739 26258 13,7 479 7,3 3526 50,2 7
Q27L/E35D/M47V/I61V/ L85M 2740 27881 14,6 230 3,5 2705 38,5 12
E35D/M47V/I61V/L85M 2741 28848 15,1 274 4,2 3054 43,4 11
E35D/M47V/L85M/R94Q 2742 23334 12,2 23,7 0,4 3039 43,2 128
E35D/M47V/N48K/L85M 2743 11792 11,5 413 10,0 5660 67,9 14
H18Y/E35D/M47V/N48K 2744 11747 11,4 841 20,4 6462 77,5 8
WT CD80 ECD-Fc H22.6 2 31563 16,5 43 0,7 46,3 0,7 1
CD80 WTIgV-Fc 3031 1916 1,0 66 1,0 70,3 1,0 1
Fc inerte 1714 65,7 0,0 23 0,4 41 0,6 2
Tabela 21. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80
E24D/E35D/M47L/V68M/ E95V/L97Q 2765 15505 8,8 15 0,5 18649 362,1 1268,6
E35D/D46E/M47I/T62A/ V68M/L85M/Y87C 2766 16987 9,7 486 15,5 18734 363,8 38,5
E35D/D46E/M47I/V68M/ L85M 2767 14036 8,0 353 11,2 16341 317,3 46,3
E35D/D46E/M47L/V68M/ A71G/Y87C/K93R 2768 15098 8,6 425 13,5 24297 471,8 57,2
E35D/D46E/M47L/V68M/ T79M/L85M 2769 15049 8,6 403 12,8 8641 167,8 21,4
E35D/D46E/M47L/V68M/ T79M/L85M/L97Q 2770 96 0,1 14 0,5 4617 89,7 325,1
E35D/D46E/M47V/V68M/ L85Q 2771 15533 8,9 1740 55,4 1723 33,5 1,0
E35D/M43I/M47L/V68M 2772 16243 9,3 1517 48,3 16912 328,4 11,1
E35D/M47I/V68M/Y87N 2773 17860 10,2 3553 113,2 13145 255,2 3,7
E35D/M47L/V68M/E95V/ L97Q 2774 14955 8,5 14 0,5 18600 361,2 1300,7
E35D/M47L/Y53F/V68M/ A71G/K93R/E95V 2775 16013 9,1 383 12,2 25024 485,9 65,3
E35D/M47V/N48K/V68M/ A71G/L85M 2776 16604 9,5 302 9,6 22770 442,1 75,4
E35D/M47V/N48K/V68M/ L85M 2777 15581 8,9 245 7,8 7618 147,9 31,1
E35D/M47V/V68M/L85M 2778 15997 9,1 201 6,4 9177 178,2 45,7
E35D/M47V/V68M/L85M/ Y87D 2779 13936 7,9 509 16,2 1721 33,4 3,4
E35D/T41S/D46E/M47I/ V68M/K93R/E95V 2780 18369 10,5 476 15,2 14790 287,2 31,1
H18Y/E35D/D46E/M47I/ V68M/R94L 2781 23300 13,3 244 7,8 18806 365,2 77,1
H18Y/E35D/M38I/M47L/ V68M/L85M 2782 139 0,1 16,7 0,5 3589 69,7 214,9
H18Y/E35D/M47I/V68M/ Y87N 2783 18626 10,6 4038 128,6 14988 291,0 3,7
H18Y/E35D/M47L/V68M/ A71G/L85M 2784 19541 11,1 437 13,9 18669 362,5 42,7
H18Y/E35D/M47L/V68M/ E95V/L97Q 2785 20475 11,7 14,5 0,5 14750 286,4 1017,2
H18Y/E35D/M47L/Y53F/ V68M/A71G 2786 146 0,1 15,7 0,5 5105 99,1 325,2
H18Y/E35D/M47L/Y53F/ V68M/A71G/K93R/E95V 2787 18356 10,5 334 10,6 23390 454,2 70,0
H18Y/E35D/M47V/V68M/ L85M 2788 18367 10,5 373 11,9 16774 325,7 45,0
H18Y/E35D/V68M/A71G/ R94Q/E95V 2789 18281 10,4 16 0,5 14990 291,1 954,8
H18Y/E35D/V68M/L85M/ R94Q 2790 19766 11,3 14 0,4 14410 279,8 1036,7
H18Y/E35D/V68M/T79M/ L85M 2791 16287 9,3 1041 33,2 14907 289,5 14,3
H18Y/V22D/E35D/M47V/ N48K/V68M 2792 15798 9,0 257 8,2 12867 249,8 50,1
Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48 K/V68M/L85M 2793 178 0,1 15 0,5 16492 320,2 1129,6
Q33L/E35D/M47V/T62S/ V68M/L85M 2794 86 0,0 15 0,5 16838 327,0 1107,8
Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M 2795 107 0,1 15 0,5 16502 320,4 1107,5
R29C/E35D/M47L/V68M/ A71G/L85M 2796 91 0,1 16 0,5 16251 315,6 997,0
S21P/E35D/K37E/D46E/ M47I/V68M 2797 20616 11,8 540 17,2 17833 346,3 33,0
S21P/E35D/K37E/D46E/ M47I/V68M/R94L 2798 20142 11,5 284 9,0 17789 345,4 62,6
T13R/E35D/M47L/V68M 2799 21255 12,1 15,6 0,5 19969 387,7 1280,1
T13R/Q27L/Q33L/E35D/ T41S/M47V/N48K/V68M/ L85M 2801 109 0,1 14,6 0,5 3272 63,5 224,1
T13R/Q33L/E35D/M47L/ V68M/L85M 2802 141 0,1 15,7 0,5 3228 62,7 205,6
T13R/Q33L/E35D/M47V/ T62S/V68M/L85M 2803 105 0,1 16 0,5 3968 77,0 248,0
T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M 2804 193 0,1 13,8 0,4 4482 87,0 324,8
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Tabela 21. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3nM Alteração de dobra para WT CD80
T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M/E95V/L97Q 2805 20652 11,8 1111 35,4 19157 372,0 17,2
T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M/L85M 2806 22011 12,6 14,2 0,5 1106 21,5 77,9
T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M/L85M/R94Q 2807 19105 10,9 15,2 0,5 20366 395,5 1339,9
T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M 2808 20738 11,8 14,1 0,4 14680 285,0 1041,1
T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M/L85M 2809 13438 7,7 112 3,6 18938 367,7 169,1
V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M 2810 19403 11,1 1254 39,9 15418 299,4 12,3
V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M/L85M/D90G 2811 14574 8,3 1183 37,7 19047 369,8 16,1
V22D/E24D/E35D/M47V/ V68M 2812 16899 9,6 191 6,1 17793 345,5 93,2
WT CD80 ECD-Fc 2 1753 1,0 31 1,0 52 1,0 1,6
CD80 WTIgV-Fc 3031 26392 15,1 95 3,0 44 0,9 0,5
2. Avaliação de Bioatividade
Tabela 22. Ensaio de repórter Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO: Cone de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/N48K/L72V 2719 1731 4,3
E35D/T41S/N48T 2720 1136 2,8
D46V/M47I/A71G 2721 1601 4,0
M47I/A71G 2722 1762 4,4
E35D/M43I/M47L/L85M 2723 1427 3,6
E35D/M43I/D46E/A71G/L85M 2724 1475 3,7
H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S 2725 1898 4,7
E35D/M47I/N48K/I61F 2726 2078 5,2
E35D/M47V/T62S/L85Q 2727 1402 3,5
M43I/M47L/A71G 2728 1641 4,1
E35D/M47V 2729 1353 3,4
E35D/M47L/A71G/L85M 2730 1513 3,8
V22A/E35D/M47L/A71G 2731 2583 6,5
E35D/M47L/A71G 2732 1954 4,9
E35D/D46E/M47I 2733 1915 4,8
Q27H/E35D/M47I 2734 1829 4,6
E35D/D46E/L85M 2735 1413 3,5
E35D/D46E/A91G 2736 395 1,0
E35D/D46E 2737 1961 4,9
E35D/L97R 2738 914 2,3
H18Y/E35D 2739 1990 5,0
Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M 2740 1166 2,9
E35D/M47V/I61V/L85M 2741 1176 2,9
E35D/M47V/L85M/R94Q 2742 466 1,2
E35D/M47V/N48K/L85M 2743 2116 5,3
H18Y/E35D/M47V/N48K 2744 2146 5,4
CD80 WT IgV-Fc 3031 400 1,0
CD80 ECD-Fc 2 521 1,3
Tabela 23: Ensaio repórter Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone de CD80 5,0nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2765 1087 2,7
E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C 2766 1104 2,8
E35D/D46E/M47I/V68M/L85M 2767 1230 3,1
E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R 2768 1198 3,0
E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M 2769 1137 2,8
E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q 2770 160 0,4
E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q 2771 1006 2,5
E35D/M43I/M47L/V68M 2772 1072 2,7
E35D/M47I/V68M/Y87N 2773 958 2,4
E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2774 1086 2,7
E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V 2775 1546 3,9
E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M 2776 1422 3,6
E35D/M47V/N48K/V68M/L85M 2777 1203 3,0
E35D/M47V/V68M/L85M 2778 1167 2,9
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Tabela 23: Ensaio repórter Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone de CD80 5,0nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D 2779 1181 3,0
E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V 2780 1165 2,9
H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L 2781 1425 3,6
H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M 2782 198 0,5
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N 2783 1117 2,8
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2784 1219 3,0
H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2785 225 0,6
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G 2786 120 0,3
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V 2787 1190 3,0
H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M 2788 1013 2,5
H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V 2789 183 0,5
H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q 2790 195 0,5
H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M 2791 1161 2,9
H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M 2792 1072 2,7
Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M 2793 170 0,4
Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M 2794 158 0,4
Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M 2795 147 0,4
R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2796 155 0,4
S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M 2797 1064 2,7
S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L 2798 1205 3,0
T13R/E35D/M47L/V68M 2799 1021 2,6
T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48KA/68M/L85M 2801 170 0,4
T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M 2802 153 0,4
T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M 2803 136 0,3
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M 2804 152 0,4
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q 2805 993 2,5
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M 2806 153 0,4
T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q 2807 580 1,5
T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M 2808 399 1,0
T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M 2809 1160 2,9
V22D/E24D/E35D/M47L/V68M 2810 974 2,4
V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G 2811 963 2,4
V22D/E24D/E35D/M47V/V68M 2812 1023 2,6
CD80 WT IgV-Fc 3031 400 1,0
WT CD80 ECD-Fc H22.6 2 521 1,3
B. Geração de Domínios de Ligação de CD80 IgV Variante e Seleção de Alta Produtividade [00666] Variantes adicionais de CD80 IgV foram selecionadas após gerar 300 construtos de CD80 IgV-Fc a partir das saídas de levedura descritas no Exemplo 7. Os sobrenadantes contendo as proteínas CD80 IgV-Fc, em seguida, foram rastreados quanto a ligação PD-L1 em um formato de placa de 96 poços utilizando um Sistema Octet®. As variantes que exibiram ligação elevada a PD-L1 foram selecionadas e novamente rastreadas quanto à ligação, como descrito no Exemplo 7 acima, e foram selecionadas variantes que exibiram ligação elevada para PD-L1. Variantes exemplificativas e os dados de ligação FACS são fornecidos na Tabela 24. As variantes selecionadas também foram avaliadas quanto à bioatividade utilizando os métodos coPetição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3576/3680
443/474 mo substancialmente descritos no Exemplo 9, e os resultados são mostrados na Tabela 25.
Tabela 24. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO (IgV) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT
A26E/Q27R/E35D/M47L/ N48Y/L85Q 2323 10848 10,6 78 1,9 9315 111,7 119
E35D/D46E/M47L/V68M/ L85Q/F92L 2324 214 0,2 15 0,4 13200 158,3 863
E35D/M47I/T62S/L85Q/ E88D 2325 8913 8,7 111 2,7 8417 100,9 76
E24D/Q27R/E35D/T41S M47V/L85Q 2326 13867 13,5 66 1,6 2858 34,3 44
S15T/H18Y/E35D/M47V/ T62A/N64S/A71G/L85Q/ D90N 2327 10994 10,7 1068 25,9 13883 166,5 13
E35D/M47L/V68M/A71G/ L85Q/D90G 2328 10332 10,1 1400 33,9 16832 201,8 12
H18Y/E35D/M47I/V68M/ A71G/R94L 2329 10036 9,8 1905 46,1 14487 173,7 8
deltaE10-A98 2330 125 0,1 15 0,4 45 0,5 3
Q33R/M47V/T62N/A71G 2331 308 0,3 17 0,4 12216 146,5 719
H18Y/V22A/E35D/T41S/ M47V/T62N/A71G/A91G 2332 10290 10,0 1591 38,5 8459 101,4 5
CD80 WTIgV-Fc 3031 1026 1,0 41 1,0 83 1,0 2
CD80 ECD-Fc 2 31725 30,9 30 0,7 68 0,8 2
Tabela 25. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutações de CD80 SEQ ID NO (IgV) Cone. De CD80-Fc 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q 2323 433 1,1
E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L 2324 2551 6,4
E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D 2325 605 1,5
E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q 2326 147 0,4
S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N 2327 872 2,2
E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G 2328 936 2,3
H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L 2329 879 2,2
deltaE10-A98 2330 137 0,3
Q33R/M47V/T62N/A71G 2331 149 0,4
H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G 2332 1045 2,6
CD80 WT IgV-Fc 3031 400 1,o
CD80 ECD-Fc 2 521 1,3
C. Geração de variantes de consenso CD80 IgV [00667] Variantes de consenso das variantes de CD80 IgV foram manipuladas com base nos alinhamentos das saídas de todas as seleções de levedura descritas acima. As sequências de consenso foram então usadas para gerar proteínas CD80 IgV-Fc que foram então testadas quanto à ligação e bioatividade como descrito acima. Os resultados de ligação e bioatividade são fornecidos nas Tabelas 26 e 27, respectivamente.
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3577/3680
444/474
Tabela 26. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLJX4 ou PD-L1
Mutações de CD80 SEQID NO (IgV) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1:CD 28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80
H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L 2781 19236 18,4 1006 24,4 2082 29,4 2,1
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N 2783 19722 18,9 1429 34,7 9299 131,2 6,5
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2784 20660 19,8 2848 69,1 9894 139,5 3,5
H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2785 18022 17,2 2602 63,2 9629 135,8 3,7
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G 2786 19528 18,7 478 11,6 9576 135,1 20,0
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93 R/E95V 2787 19754 18,9 2194 53,3 9339 131,7 4,3
H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M 2788 19306 18,5 1387 33,7 3094 43,6 2,2
H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V 2789 19396 18,6 455 11,0 1836 25,9 4,0
H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q 2790 21955 21,0 962 23,3 9283 130,9 9,6
CD80WTIgV-Fc 3031 1045 1,0 41,2 1,0 70,9 1,0 1,7
CD80 ECD-Fc 2 46137 44,2 46 1,1 58 0,8 1,3
Tabela 27. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutações de CD80 SEQ ID NO: Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L 2781 2850 7,1
H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N 2783 2196 5,5
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M 2784 2193 5,5
H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q 2785 2052 5,1
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G 2786 2277 5,7
H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95 V 2787 2212 5,5
H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M 2788 2575 6,4
H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V 2789 1968 4,9
H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q 2790 2215 5,5
CD80 WT IgV-Fc 3031 400 1,0
CD80 ECD-Fc 2 521 1,3
EXEMPLO 14
Avaliação da atividade de ligação de um painel de variantes CD80 IgV [00668] Para identificar resíduos envolvidos na ligação e atividade com referência a um conjunto selecionado de variantes expostas nas SEQ ID NOs: 2250, 2276 e 2280, desenhou-se um painel de mutações de reversão (de retorno) e expressas como proteínas de fusão Fc substancialmente como descrito nos Exemplos 4 e 5. As variantes geradas continham entre 1 e 6 mutações encontradas em SEQ ID NOS: 2250, 2276 e 2280 em várias combinações conforme apresentado na Tabela 28.
Tabela 28. Variantes CD80 Adicionais
Mutação SEQ ID NO:
E35D 198
D46V 2813
M47L 2814
V68M 2815
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Tabela 28. Variantes CD80 Adicionais
Mutação SEQ ID NO:
L85Q 2816
E35D/D46V 2817
E35D/M47L 208
E35D/L85Q 2819
D46V/M47L 2820
D46V/V68M 2821
D46V/L85Q 2822
M47L/V68M 2823
M47L/L85Q 2824
V68M/L85Q 2825
E35D/D46V/M47L 2826
E35D/D46V/V68M 2827
E35D/D46V/L85Q 2828
E35D/M47L/V68M 2756
E35D/M47L/L85Q 2203
E35D/V68M/L85Q 2829
D46V/M47L/V68M 2830
D46V/M47L/L85Q 2831
D46V/V68M/L85Q 2832
M47L/V68M/L85Q 2833
E35D/D46V/M47L/V68M 2761
E35D/D46V/M47L/L85Q 2834
E35D/D46V/V68M/L85Q 2835
E35D/M47L/V68M/L85Q 2836
D46V/M47L/V68M/L85Q 2837
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q 2760
M47V 2838
N48K 2839
K89N 2840
E35D/M47V 2729
E35D/N48K 2841
E35D/K89N 2842
M47V/N48K 2843
M47V/V68M 2844
M47V/K89N 2845
Ν48ΚΛ/68Μ 2846
N48K/K89N 2847
V68M/K89N 2848
E35D/M47V/N48K 2849
E35D/M47V/V68M 2850
E35D/M47V/K89N 2851
E35D/N48KA/68M 2852
E35D/N48K/K89N 2853
E35D/V68M/K89N 2854
M47V/N48K/V68M 2855
M47V/N48K/K89N 2856
M47V/V68M/K89N 2857
Ν48ΚΛ/68Μ/Κ89Ν 2858
E35D/M47V/N48KA/68M 2764
E35D/M47V/N48K/K89N 2859
E35D/M47V/V68M/K89N 2860
E35D/N48KA/68M/K89N 2861
M47V/N48K/V68M/K89N 2862
E35D/D46V/M47V/N48K/V68M 2863
E35D/D46V/M47V/V68M/L85Q 2864
E35D/D46V/M47V/V68M/K89N 2865
E35D/M47V/N48KA/68M/L85Q 2866
E35D/M47V/N48KA/68M/K89N 2250
E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N 2867
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2868
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2869
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3579/3680
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Tabela 28. Variantes CD80 Adicionais
Mutação SEQ ID NO:
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D90G 2870
H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D90G 2871
H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G 2872
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2873
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2874
E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2875
H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G 2876
H18Y/A26E/V68M/A71G/D90G 2877
H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G 2878
H18Y/A26E/E35D/M47L/D90G 2879
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M 2880
A26E/M47L/V68M/A71G/D90G 2881
A26E/E35D/V68M/A71G/D90G 2882
A26E/E35D/M47L/A71G/D90G 2883
A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2884
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2885
H18Y/E35D/V68M/A71G/D90G 2886
H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G 2887
H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G 2888
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G 2889
H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G 2890
H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G 2891
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G 2892
H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G 2893
H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G 2894
H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G 2895
M47L/V68M/A71G/D90G 2896
H18Y/V68M/A71G/D90G 2897
H18Y/A26E/A71G/D90G 2898
H18Y/A26E/E35D/D90G 2899
H18Y/A26E/E35D/M47L 2900
E35D/V68M/A71G/D90G 2901
E35D/M47L/A71G/D90G 2902
E35D/M47L/V68M/D90G 2903
E35D/M47L/V68M/A71G 2904
A26E/V68M/A71G/D90G 2905
A26E/M47L/A71G/D90G 2906
A26E/M47L/V68M/D90G 2907
A26E/M47L/V68M/A71G 2908
A26E/E35D/V68M/D90G 2910
A26E/E35D/V68M/A71G 2911
A26E/E35D/M47L/D90G 2912
A26E/E35D/M47L/A71G 2913
H18Y/M47L/A71G/D90G 2914
H18Y/M47L/V68M/D90G 2915
H18Y/M47L/V68M/A71G 2916
H18Y/E35D/A71G/D90G 2917
H18Y/E35D/M47L/A71G 2921
H18Y/A26E/V68M/D90G 2923
H18Y/A26E/V68M/A71G 2924
H18Y/A26E/M47L/D90G 2925
H18Y/A26E/M47L/A71G 2926
H18Y/A26E/E35D/V68M 2929
[00669] As variantes foram testadas quanto à ligação e à bioatividade como descrito acima. Os resultados da ligação são apresentados nas Tabelas 29 e 30, e os resultados da bioatividade são apresenta
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3580/3680
447/474 dos nas Tabelas 31 e 32.
Tabela 29. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) SEQ ID NO (IgV) CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80
E35D 198 42923 1,1 134 0,2 2584 20,2 19,3
M47L 2814 30774 0,8 309 0,4 1895 14,8 6,1
V68M 2815 568 0,0 37,9 0,1 118 0,9 3,1
L85Q 2816 3002 0,1 35 0,0 97 0,8 2,8
E35D/D46V 2817 50112 1,2 880 1,2 3971 31,0 4,5
E35D/M47L 208 48010 1,2 411 0,6 7529 58,8 18,3
D46V/M47L 2820 49711 1,2 918 1,3 3905 30,5 4,3
D46VA/68M 2821 5334 0,1 556 0,8 2271 17,7 4,1
D46V/L85Q 2822 41896 1,0 131 0,2 2197 17,2 16,8
M47L/L85Q 2824 31671 0,8 88,1 0,1 5801 45,3 65,8
W8M/L85Q 2825 3288 0,1 91,7 0,1 347 2,7 3,8
E35D/D46V/M47L 2826 44977 1,1 1165 1,6 7988 62,4 6,9
E35D/D46VA/68M 2827 31195 0,8 1820 2,6 26114 204,0 14,3
E35D/D46V/L85Q 2828 48005 1,2 196 0,3 4039 31,6 20,6
E35D/M47LA/68M 2756 28603 0,7 1243 1,8 27896 217,9 22,4
E35D/M47L/L85Q 2203 12909 0,3 46,3 0,1 6097 47,6 131,7
E35D/V68M/L85Q 2829 42761 1,1 76,2 0,1 5971 46,6 78,4
D46V/M47LA/68M 2830 34688 0,9 2183 3,1 28020 218,9 12,8
D46V/M47L/L85Q 2831 40153 1,0 567 0,8 5976 46,7 10,5
D46VA/68M/L85Q 2832 7567 0,2 104 0,1 4170 32,6 40,1
M47L/V68M/L85Q 2833 11134 0,3 60,9 0,1 4039 31,6 66,3
E35D/D46V/M47LA/68M 2761 34319 0,8 1808 2,6 29266 228,6 16,2
E35D/D46V/M47UL85Q 2834 38150 0,9 268 0,4 7523 58,8 28,1
E35D/D46VA/68M/L85Q 2835 32176 0,8 261 0,4 23637 184,7 90,6
E35D/M47LA/68M/L85Q 2836 28106 0,7 159 0,2 15307 119,6 96,3
D46V/M47LA/68M/L85Q 2837 32521 0,8 660 0,9 29743 232,4 45,1
E35D/D46V/M47LA/68M/L85Q 2760 26207 0,6 464 0,7 28418 222,0 61,2
M47V 2838 33341 0,8 68,7 0,1 2317 18,1 33,7
N48K 2839 4952 0,1 60,1 0,1 481 3,8 8,0
K89N 2840 944 0,0 56,3 0,1 52,8 0,4 0,9
E35D/M47V 2729 44569 1,1 501 0,7 6796 53,1 13,6
E35D/N48K 2841 41325 1,0 194 0,3 6545 51,1 33,7
E35D/K89N 2842 21755 0,5 236 0,3 757 5,9 3,2
M47V/N48K 2843 44640 1,1 413 0,6 3083 24,1 7,5
M47VA/68M 2844 7282 0,2 328 0,5 4294 33,5 13,1
M47V/K89N 2845 32381 0,8 197 0,3 622 4,9 3,2
Ν48ΚΛ/68Μ 2846 2341 0,1 118 0,2 754 5,9 6,4
N48K/K89N 2847 4370 0,1 170 0,2 186 1,5 1,1
W8M/K89N 2848 2330 0,1 210 0,3 538 4,2 2,6
E35D/M47V/N48K 2849 47430 1,2 771 1,1 4852 37,9 6,3
E35D/M47V/V68M 2850 26988 0,7 791 1,1 16645 130,0 21,0
E35D/M47V/K89N 2851 39282 1,0 507 0,7 4336 33,9 8,6
E35D/N48K/V68M 2852 33583 0,8 642 0,9 17733 138,5 27,6
E35D/N48K/K89N 2853 34727 0,9 411 0,6 5766 45,0 14,0
E35D/V68M/K89N 2854 24838 0,6 1191 1,7 10422 81,4 8,8
M47V/N48K/V68M 2855 34612 0,9 641 0,9 14464 113,0 22,6
M47V/N48K/K89N 2856 42071 1,0 366 0,5 2366 18,5 6,5
M47VA/68M/K89N 2857 24787 0,6 1324 1,9 11806 92,2 8,9
Ν48ΚΛ/68Μ/Κ89Ν 2858 19129 0,5 1176 1,7 11464 89,6 9,7
E35D/M47V/N48K/V68M 2764 32913 0,8 789 1,1 23479 183,4 29,8
E35D/M47V/N48K/K89N 2859 43756 1,1 701 1,0 6669 52,1 9,5
E35D/M47V/V68M/K89N 2860 29493 0,7 1610 2,3 21827 170,5 13,6
E35D/N48K/V68M/K89N 2861 29772 0,7 1534 2,2 17425 136,1 11,4
M47V/N48K/V68M/K89N 2862 29777 0,7 1597 2,3 23666 184,9 14,8
E35D/D46V/M47V/N48K/ V68M 2863 23880 0,6 1085 1,5 25940 202,7 23,9
E35D/D46V/M47VA/68M/ L85Q 2864 36463 0,9 331 0,5 26290 205,4 79,4
E35D/D46V/M47VA/68M/ K89N 2865 15124 0,4 2119 3,0 21603 168,8 10,2
E35D/M47V/N48K/V68M/ L85Q 2866 26104 0,6 118 0,2 10479 81,9 88,8
E35D/M47V/N48K/V68M/ K89N 2250 20884 0,5 1348 1,9 14800 115,6 11,0
E35D/M47V/V68M/L85Q/ K89N 2867 30276 0,7 246 0,3 12085 94,4 49,1
WT CD80 ECD-Fc (Abeam) 40376 1,0 709 1,0 128 1,0 0,2
Controle Fc1.1 N10118 1714 52 0,0 12,7 0,0 44 0,3 3,5
Tabela 30. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) SEQ ID NO CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1:CD28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2868 21749 16,0 2211 50,4 30232 693,4 13,7
H18Y/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G 2869 19892 14,6 2793 63,6 29944 686,8 10,7
H18Y/A26E/M47LA/68M/A71G/D90G 2870 121 0,1 2556 58,2 31716 727,4 12,4
H18Y/A26E/E35DA/68M/A71G/D90G 2871 23386 17,2 1757 40,0 28683 657,9 16,3
H18Y/A26E/E35D/M47U A71G/D90G 2872 21215 15,6 1099 25,0 16926 388,2 15,4
H18Y/A26E/E35D/M47U V68M/D90G 2873 24855 18,3 2675 60,9 25217 578,4 9,4
H18Y/A26E/E35D/M47U V68M/A71G 2874 25404 18,7 526 12,0 28546 654,7 54,3
E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G 2875 26007 19,1 3072 70,0 29377 673,8 9,6
H18Y/M47L/V68M/A71G/ D90G 2876 22235 16,4 3184 72,5 29517 677,0 9,3
H18Y/A26E/V68M/A71G/ D90G 2877 18305 13,5 2683 61,1 27872 639,3 10,4
H18Y/A26E/E35D/A71G/ D90G 2878 100 0,1 1075 24,5 14822 340,0 13,8
H18Y/A26E/E35D/M47L /D90G 2879 19736 14,5 1379 31,4 12698 291,2 9,2
H18Y/A26E/E35D/M47U V68M 2880 20015 14,7 626 14,3 24683 566,1 39,4
A26E/M47LA/68M/A71G/ D90G 2881 21807 16,0 2790 63,6 28139 645,4 10,1
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3581/3680
448/474
Tabela 30. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTUX4 ou PD-L1
Mutação(ções) SEQ ID NO CTUX4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1:CD28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80
A26E/E35DA/68M/A71G/ D90G 2882 23286 17,1 2102 47,9 26510 608,0 12,6
A26E/E35D/M47L/A71G/ D90G 2883 22127 16,3 1272 29,0 14550 333,7 11,4
A26E/E35D/M47LA/68M/ D90G 2884 26698 19,6 2908 66,2 24978 572,9 8,6
A26E/E35D/M47LA/68M/A71G 2885 24587 18,1 417 9,5 27806 637,8 66,7
H18Y/E35DA/68M/A71G/ D90G 2886 24335 17,9 2724 62,1 30088 690,1 11,0
H18Y/E35D/M47L/A71G/ D90G 2887 22983 16,9 1273 29,0 13327 305,7 10,5
H18Y/E35D/M47LA/68M/ D90G 2888 22834 16,8 3389 77,2 27410 628,7 8,1
H18Y/E35D/M47LA/68M/ A71G 2889 23667 17,4 928 21,1 30377 696,7 32,7
H18Y/A26E/M47L/A71G/ D90G 2890 25420 18,7 2047 46,6 17737 406,8 8,7
H18Y/A26E/M47LA/68M/ D90G 2891 28649 21,1 32 0,7 23594 541,1 737,3
H18Y/A26E/M47LA/68M/A71G 2892 21742 16,0 544 12,4 29730 681,9 54,7
H18Y/A26E/E35DA/68M/ D90G 2893 19331 14,2 2584 58,9 23206 532,2 9,0
H18Y/A26E/E35DA/68M/A71G 2894 19394 14,3 394 9,0 27476 630,2 69,7
H18Y/A26E/E35D/M47U A71G 2895 19353 14,2 379 8,6 16887 387,3 44,6
M47LA/68M/A71G/D90G 2896 17418 12,8 3610 82,2 31114 713,6 8,6
H18ΥΛ/68Μ/Α71G/D90G 2897 22321 16,4 3414 77,8 30670 703,4 9,0
H18Y/A26E/A71G/D90G 2898 19878 14,6 2001 45,6 15491 355,3 7,7
H18Y/A26E/E35D/D90G 2899 22813 16,8 46,5 1,1 10019 229,8 215,5
H18Y/A26E/E35D/M47L 2900 23990 17,7 324 7,4 9951 228,2 30,7
E35DA/68M/A71G/D90G 2901 23290 17,1 2843 64,8 28005 642,3 9,9
E35D/M47L/A71G/D90G 2902 20921 15,4 1331 30,3 12073 276,9 9,1
E35D/M47LA/68M/D90G 2903 27607 20,3 3414 77,8 23482 538,6 6,9
E35D/M47LA/68M/A71G 2904 24656 18,1 806 18,4 27872 639,3 34,6
Α26ΕΛ/68Μ/Α71G/D90G 2905 8666 6,4 1194 27,2 3195 73,3 2,7
A26E/M47L/A71G/D90G 2906 21955 16,2 1955 44,5 13204 302,8 6,8
A26E/M47LA/68M/D90G 2907 21900 16,1 2583 58,8 10626 243,7 4,1
A26E/M47LA/68M/A71G 2908 3227 2,4 98,7 2,2 1667 38,2 16,9
A26E/E35DA/68M/D90G 2910 13879 10,2 1683 38,3 6987 160,3 4,2
A26E/E35DA/68M/A71G 2911 11791 8,7 135 3,1 12611 289,2 93,4
A26E/E35D/M47L/D90G 2912 18167 13,4 1550 35,3 9577 219,7 6,2
A26E/E35D/M47L/A71G 2256 20645 15,2 236 5,4 11666 267,6 49,4
H18Y/M47L/A71G/D90G 2914 18162 13,4 1601 36,5 10796 247,6 6,7
H18Y/M47LA/68M/D90G 2915 19006 14,0 3795 86,4 21768 499,3 5,7
H18Y/M47LA/68M/A71G 2916 21298 15,7 1192 27,2 28478 653,2 23,9
H18Y/E35D/A71G/D90G 2917 25886 19,0 1310 29,8 8524 195,5 6,5
H18Y/E35D/M47L/A71G 2921 22368 16,5 604 13,8 11881 272,5 19,7
H18Y/A26EA/68M/D90G 2923 25794 19,0 2394 54,5 12845 294,6 5,4
H18Y/A26EA/68M/A71G 2924 11323 8,3 99,4 2,3 6866 157,5 69,1
H18Y/A26E/M47L/D90G 2925 23485 17,3 2858 65,1 8933 204,9 3,1
H18Y/A26E/M47L/A71G 2926 22108 16,3 611 13,9 15563 356,9 25,5
H18Y/A26E/E35DA/68M 2929 20929 15,4 372 8,5 17904 410,6 48,1
H18Y/A26E/E35D/M47U V68M/A71G/D90G 2276 18244 13,4 1836 41,8 29167 669,0 15,9
CD80 WT IgV-Fc 3031 1359 1,0 43,9 1,0 43,6 1,0 1,0
CD80 ECD-Fc 2 19552 14,4 42,3 1,0 6377 146,3 150,8
Controle Fc1.1 1714 37,9 0,0 15,4 0,4 77,1 1,8 5,0
Tabela 31. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutação(ções) SEQ ID NO Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D 198 368 3,2
M47L 2814 530 4,6
V68M 2815 130 1,1
L85Q 2816 132 1,1
E35D/D46V 2817 609 5,3
E35D/M47L 208 603 5,2
D46V/M47L 2820 773 6,7
D46V/V68M 2821 292 2,5
D46V/L85Q 2822 342 3,0
M47L/L85Q 2824 416 3,6
V68M/L85Q 2825 146 1,3
E35D/D46V/M47L 2826 746 6,5
E35D/D46V/V68M 2827 799 6,9
E35D/D46V/L85Q 2828 410 3,6
E35D/M47L/V68M 2756 749 6,5
E35D/M47L/L85Q 2203 177 1,5
E35D/V68M/L85Q 2829 511 4,4
D46V/M47L/V68M 2830 724 6,3
D46V/M47L/L85Q 2831 598 5,2
D46V/V68M/L85Q 2832 267 2,3
M47L/V68M/L85Q 2833 238 2,1
E35D/D46V/M47L/V68M 2761 681 5,9
E35D/D46V/M47L/L85Q 2834 481 4,2
E35D/D46V/V68M/L85Q 2835 864 7,5
E35D/M47L/V68M/L85Q 2836 890 7,7
D46V/M47L/V68M/L85Q 2837 654 5,7
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3582/3680
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Tabela 31. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) SEQ ID NO Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q 2760 712 6,2
M47V 2838 445 3,9
N48K 2839 160 1,4
K89N 2840 116 1,o
E35D/M47V 2729 543 4,7
E35D/N48K 2841 590 5,1
E35D/K89N 2842 293 2,5
M47V/N48K 2843 490 4,3
M47V/V68M 2844 553 4,8
M47V/K89N 2845 312 2,7
Ν48ΚΛ/68Μ 2846 127 1,1
N48K/K89N 2847 127 1,1
V68M/K89N 2848 100 0,9
E35D/M47V/N48K 2849 561 4,9
E35D/M47V/V68M 2850 841 7,3
E35D/M47V/K89N 2851 668 5,8
E35D/N48K/V68M 2852 721 6,3
E35D/N48K/K89N 2853 719 6,3
E35D/V68M/K89N 2854 537 4,7
M47V/N48K/V68M 2855 664 5,8
M47V/N48K/K89N 2856 472 4,1
M47V/V68M/K89N 2857 862 7,5
Ν48ΚΛ/68Μ/Κ89Ν 2858 614 5,3
E35D/M47V/N48K/V68M 2764 747 6,5
E35D/M47V/N48K/K89N 2859 814 7,1
E35D/M47V/V68M/K89N 2860 779 6,8
E35D/N48K/V68M/K89N 2861 772 6,7
M47V/N48K/V68M/K89N 2862 671 5,8
E35D/D46V/M47V/N48KA/68M 2863 696 6,1
E35D/D46V/M47V/V68M/L85Q 2864 980 8,5
E35D/D46V/M47V/V68M/K89N 2865 817 7,1
E35D/M47V/N48K/V68M/L85Q 2866 907 7,9
E35D/M47V/N48K/V68M/K89N 2250 767 6,7
E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N 2867 854 7,4
CD80 WT IgV-Fc 3031 115 1,0
CD80 ECD-Fc 2 131 1,1
Controle Fc1.1 1714 97 0,8
Tabela 32. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) SEQ ID NO Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2868 1117 2,86
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2869 1028 2,64
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D90G 2870 853 2,19
H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D90G 2871 940 2,41
H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G 2872 1015 2,60
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2873 893 2,29
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2874 976 2,50
E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2875 1041 2,67
H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G 2876 986 2,53
H18Y/A26E/V68M/A71G/D90G 2877 974 2,50
H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G 2878 956 2,45
H18Y/A26E/E35D/M47L/D90G 2879 925 2,37
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M 2880 895 2,29
A26E/M47L/V68M/A71G/D90G 2881 793 2,03
A26E/E35D/V68M/A71G/D90G 2882 912 2,34
A26E/E35D/M47L/A71G/D90G 2883 1132 2,90
A26E/E35D/M47L/V68M/D90G 2884 1091 2,80
A26E/E35D/M47L/V68M/A71G 2885 1010 2,59
H18Y/E35D/V68M/A71G/D90G 2886 815 2,09
H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G 2887 851 2,18
H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G 2888 852 2,18
H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G 2889 853 2,19
H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G 2890 1036 2,66
H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G 2891 1075 2,76
H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G 2892 1160 2,97
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3583/3680
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Tabela 32. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutaçâo(ções) SEQ ID NO Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G 2893 1049 2,69
H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G 2894 961 2,46
H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G 2895 944 2,42
M47L/V68M/A71G/D90G 2896 771 1,98
H18Y/V68M/A71G/D90G 2897 797 2,04
H18Y/A26E/A71G/D90G 2898 933 2,39
H18Y/A26E/E35D/D90G 2899 948 2,43
H18Y/A26E/E35D/M47L 2900 1208 3,10
E35D/V68M/A71G/D90G 2901 990 2,54
E35D/M47L/A71G/D90G 2902 784 2,01
E35D/M47L/V68M/D90G 2903 711 1,82
E35D/M47L/V68M/A71G 2904 745 1,91
A26E/V68M/A71G/D90G 2905 590 1,51
A26E/M47L/A71G/D90G 2906 827 2,12
A26E/M47L/V68M/D90G 2907 821 2,11
A26E/M47L/V68M/A71G 2908 517 1,33
A26E/E35D/V68M/D90G 2910 871 2,23
A26E/E35D/V68M/A71G 2911 839 2,15
A26E/E35D/M47L/D90G 2912 843 2,16
A26E/E35D/M47L/A71G 2256 766 1,96
H18Y/M47L/A71G/D90G 2914 675 1,73
H18Y/M47L/V68M/D90G 2915 834 2,14
H18Y/M47L/V68M/A71G 2916 881 2,26
H18Y/E35D/A71G/D90G 2917 1487 3,81
H18Y/E35D/M47L/A71G 2921 1387 3,56
H18Y/A26E/V68M/D90G 2923 1131 2,90
H18Y/A26E/V68M/A71G 2924 469 1,20
H18Y/A26E/M47L/D90G 2925 1159 2,97
H18Y/A26E/M47L/A71G 2926 1107 2,84
H18Y/A26E/E35D/V68M 2929 1214 3,11
CD80 WT IgV-Fc 3031 390 1,00
EXEMPLO 15
Otimização de Variante por meio da Seleção de Biblioteca NNK [00670] Foram geradas moléculas adicionais contendo o domínio CD80 IgV variante com combinações de mutações nas posições 18, 26, 35, 47, 48, 68, 71, 85, 88, 90 e 93 com referência às posições estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2250, 2276 e 2280. As variantes foram geradas a partir de uma biblioteca NNK nas posições selecionadas, onde N = A, G, C ou T e K = T ou G, de modo que os códons degenerados codificam todos os aminoácidos potenciais, mas impedem a codificação de dois resíduos de parada TAA e TGA. O DNA contendo NNK foi introduzido em levedura substancialmente como descrito no Exemplo 2 para gerar bibliotecas de levedura. As bibliotecas foram utilizadas para selecionar variantes de CD80 modificadas por afinidade que expressam levedura, substancialmente como descrito no Exemplo
3.
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3584/3680
451/474 [00671] As saídas de três ciclos de seleções de FACS com rhPD-L1 a Fc substancialmente como descrito no Exemplo 4 foram ainda formatadas, selecionadas e expressas como proteínas de fusão Fc inertes, substancialmente como descrito no Exemplo 5. As proteínas de fusão Fc foram testadas quanto à ligação, substancialmente como descrito no Exemplo 7, e bioatividade, substancialmente descrita no Exemplo 9. A ligação e bioatividade de CD80 ECD-Fc de tipo selvagem (inerte), CD80 IgV-Fc de tipo selvagem (inerte), H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276) CD80 IgV-Fc (inerte), e Fc inerte sozinho também foram medidas para referência. Os resultados dos estudos de ligação e atividade são forneci dos nas Tabelas 33 e 34, respectivamente.
Tabela 33. Ligação de Fluxo a células Jurkat (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO: CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80 MFIa 33,3 nM Alteração de dobra para WTCD80
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G 2992 23650 17,1 3227 31,6 64919 393,4 20,1
H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 2993 23371 16,9 1906 18,7 67010 406,1 35,2
H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 2994 21923 15,8 2573 25,2 64919 393,4 25,2
H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G 2995 17045 12,3 7253 71,1 67999 412,1 9,4
H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2996 20280 14,7 6349 62,2 64761 392,5 10,2
H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G 2997 20911 15,1 1366 13,4 68498 415,1 50,1
H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G 2998 22932 16,6 3641 35,7 67338 408,1 18,5
H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G 2999 22395 16,2 1297 12,7 68165 413,1 52,6
H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G 3000 13669 9,9 2253 22,1 55417 335,9 24,6
H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 3001 16192 11,7 2452 24,0 52405 317,6 21,4
H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3002 16769 12,1 2115 20,7 43588 264,2 20,6
H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G 3003 12156 8,8 5125 50,2 54482 330,2 10,6
H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 3004 17904 12,9 6911 67,8 51521 312,2 7,5
H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G 3005 16458 11,9 2549 25,0 47905 290,3 18,8
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3006 17165 12,4 6792 66,6 52151 316,1 7,7
A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G 3007 19761 14,3 8189 80,3 54747 331,8 6,7
H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/ D90G 3008 25398 18,4 8189 80,3 66198 401,2 8,1
H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D 90G 3009 24919 18,0 8063 79,0 73884 447,8 9,2
H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G 3010 23151 16,7 9620 94,3 73166 443,4 7,6
H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/ D90G 3011 22132 16,0 6253 61,3 67503 409,1 10,8
H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71 G/D 90G 3012 17654 12,8 3126 30,6 33597 203,6 10,7
H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71 G/D 90G 3013 23763 17,2 4731 46,4 33436 202,6 7,1
H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G 3014 21360 15,4 4913 48,2 36284 219,9 7,4
H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71 G/D 90G 3015 23932 17,3 4801 47,1 32253 195,5 6,7
H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71 G/D 90G 3016 16420 11,9 8392 82,3 20666 125,2 2,5
H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/ D90K 3017 15206 11,0 3170 31,1 22395 135,7 7,1
H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/ D90G 3018 14618 10,6 82,2 0,8 26510 160,7 322,5
H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71 G/D 90G 3019 8281 6,0 1818 17,8 27280 165,3 15,0
H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/ D90G 3020 16652 12,0 6733 66,0 24450 148,2 3,6
H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/ A71G/D90P 3021 17327 12,5 18589 182,2 29306 177,6 1,6
H18F/A26D/E35D/D46E/M47TA/68M/A 71G/D90G 3022 17205 12,4 6028 59,1 27541 166,9 4,6
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71 G/D 90G 2276 21512 15,5 5202 51,0 35251 213,6 6,8
CD80WTIg\AFc 1384 1,0 102 1,0 165 1,0 1,6
CD80WT ECD-Fc 17862 12,9 57,8 0,6 161 1,0 2,8
Fcl.1 Control 194 0,1 81 0,8 185 1,1 2,3
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3585/3680
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Tabela 34. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: (RLU) Unidades de Luciferase Relativas
Mutação(ções) de CD80 SEQ ID NO: Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G 2992 963 5,6
H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 2993 936 5,5
H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 2994 916 5,4
H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G 2995 815 4,8
H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 2996 910 5,3
H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G 2997 1053 6,2
H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G 2998 957 5,6
H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G 2999 985 5,8
H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G 3000 881 5,2
H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G 3001 808 4,7
H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3002 854 5,0
H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G 3003 761 4,5
H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G 3004 821 4,8
H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G 3005 862 5,0
H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3006 825 4,8
A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G 3007 823 4,8
H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3008 907 5,3
H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 3009 883 5,2
H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 3010 738 4,3
H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G 3011 771 4,5
H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G 3012 795 4,6
H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 3013 857 5,0
H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 3014 1054 6,2
H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G 3015 926 5,4
H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 3016 907 5,3
H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K 3017 919 5,4
H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G 3018 911 5,3
H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G 3019 865 5,1
H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G 3020 994 5,8
H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P 3021 972 5,7
H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G 3022 833 4,9
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G 2276 912 5,3
CD80 WT IgV-Fc 3031 171 1,0
CD80 WT ECD-Fc 2 159 0,9
Controle de Fc1.1 1714 129 0,8
EXEMPLO 16
Variantes do ligante CD80 IgV-Fc [00672] Variantes CD80 IgV-Fc foram construídas com diferentes regiões de ligação (ligantes) entre os domínios IgV e Fc e a ligação e/ou bioatividade foi avaliada. As proteínas de fusão contendo proteínas CD80 E35D/M47V/N48K/V68M/K89N IgV-Fc e E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV-Fc, foram geradas contendo EAAAK (SEQ ID NO: 3026), (EAAAK)3 (SEQ ID NO: 3027), GS (G4S)3 (SEQ ID NO: 3028), GS (G4S)5 (SEQ ID NO: 3029) ligantes.
[00673] Também foram geradas proteínas CD80 IgV-Fc que conti
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453/474 nham as modificações E35D/M47V/N48K/V68M/K89N ou E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D em uma sequência de cadeia principal CD80 IgV que foi excluída por três aminoácidos que conectam o IgV para IgC no CD80 de tipo selvagem (sequência de cadeia principal apresentada na SEQ ID NO: 3030). A variante CD80 IgV gerada foi então fundida a um Fc inerte que estava adicionalmente sem 6 aminoácidos da região dobradiça (Fc apresentada na SEQ ID NO: 3025). As moléculas geradas por esta estratégia foram fundidas diretamente ao Fc sem ligante adicional, designado como ligante delta.
[00674] As variantes CD80-lgV-Fc foram então testadas quanto à ligação e bioatividade como descrito nos Exemplos 7 e 9. A ligação e bioatividade de tipo selvagem CD80 IgV (SEQ ID NO: 3031 )-Fc (inerte), CD80 ECD (SEQ ID NO: 2)-Fc (inerte), contendo um ligante GSG4S (SEQ ID NO: 1716) e Fc inerte sozinho também foram medidos para comparação. Os resultados são fornecidos nas Tabelas 34 e 35, respectivamente.
Tabela 34. Ligação de Fluxo a células Jurkats (CD28) e CHO que expressam estavelmente CTLA4 ou PD-L1
Mutação(ções) ligante CTLA4 CD28 PD-L1 Razão de PDL1: CD28
MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80 MFI a 33,3 nM Alteração de dobra para WT CD80
E35D/M47V/N48K/V6 8M/K89N delta 3091 2,6 4678 83,7 20442 438,7 4
EAAAK 27516 23,0 2634 47,1 22862 490,6 9
(EAAAK)3 27132 22,6 1285 23,0 24476 525,2 19
GS(G4S)3 29793 24,9 2109 37,7 24222 519,8 11
GS(G4S)5 26994 22,5 1154 20,6 22707 487,3 20
E35D/D46V/M47L/V6 8M/L85Q/E88D delta 12177 10,2 4173 74,7 22538 483,6 5
EAAAK 28959 24,2 563 10,1 24821 532,6 44
(EAAAK)3 32048 26,8 197 3,5 25461 546,4 129
GS(G4S)3 26961 22,5 267 4,8 22596 484,9 85
GS(G4S)5 26607 22,2 143 2,6 22408 480,9 157
CD80 WT IgV-Fc GSG4S 1198 1,0 56 1,0 47 1,0 1
CD80 ECD-Fc GSG4S 32735 27,3 37 0,7 35 0,7 1
Fc inerte (controle) N/A 40 0,0 20 0,3 58 1,2 3
Tabela 35. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutação(ções) ligante Cone, de CD80 5,0 nM Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc
E35D/M47V/N48K/V68M/K89N delta 1026 2,63
EAAAK 1707 4,38
(EAAAK)3 1761 4,52
GS(G4S)3 1400 3,59
GS(G4S)5 1541 3,95
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D delta 1079 2,77
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Tabela 35. Ensaio repórter de Jurkat/IL2 + CHO/OKT3/PD-L1: Unidades de Luciferase Relativas (RLU)
Mutação(ções) ligante EAAAK Cone, de CD80 5,0 nM 1462 Aumento de dobra sobre WT CD80-lgV-Fc 3,75
(EAAAK)3 2046 5,25
GS(G4S)3 1592 4,08
GS(G4S)5 2053 5,26
CD80 WT IgV-Fc GSG4S 390 1,00
EXEMPLO 17
Domínios IgSF Modificados por Afinidade Adicionais [00675] Este exemplo descreve a concepção, criação e rastreio de proteínas imunomoduladoras CD155, CD112, PD-L1, PD-L2 e CD86 (B7-2) modificadas por afinidade adicionais, que são outros componentes da sinapse imunológica (IS) que têm demonstrado papel duplo na ativação e inibição imune. Variantes NKp30 modificadas por afinidade também foram geradas e rastreadas. Estes exemplos demonstram que a modificação por afinidade dos domínios IgSF origina proteínas que podem atuar para aumentar e diminuir a atividade imunológica. Várias combinações desses domínios fundidos em pares (isto é, empilhados) com um CD80 modificado por afinidade variante para formar uma proteína imunomoduladora do tipo II para alcançar atividade imunomoduladora.
[00676] Os construtos de DNA mutante de codificação de uma variante do domínio IgV de CD155, CD112, CD80, PD-L1 e PD-L2 humano para tradução e expressão como bibliotecas de exibição de levedura foram gerados substancialmente como descrito no Exemplo 1. Para bibliotecas-alvo que visam resíduos específicos para randomização completa ou parcial com códons degenerados e/ou bibliotecas aleatórias foram construídos para identificar variantes da IgV de CD112 (SEQ ID N 829), CD155 (SEQ ID N 421), PD-L1 (SEQ ID NO: 1196), e variantes do IgV de PD-L2 (SEQ ID NO: 1257) substancialmente como descrito no Exemplo 1. Métodos semelhantes também foram utilizados para gerar bibliotecas do domínio do tipo IgC de NKp30 (SEQ ID NO:
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355).
[00677] O DNA da biblioteca degenerada ou aleatória foi introduzido em levedura substancialmente como descrito no Exemplo 2 para gerar bibliotecas de levedura. As bibliotecas foram usadas para selecionar levedura expressando variantes de afinidade modificada de CD155, CD 112, PD-L1, PD-L2, CD86 (B7-2), e NKp30 substancialmente como descrito no Exemplo 3. As células foram processadas para reduzir não ligantes e para enriquecer as variantes CD155, CD112, PD-L1 ou PDL2 com a capacidade de se ligarem às suas proteínas exógenas de contraestrutura recombinante, substancialmente como descrito no Exemplo 3.
[00678] Com as bibliotecas CD80, CD86 e NKp30, as proteínas do ligando-alvo foram obtidas da R&D Systems (EUA) como se segue: rCD28.Fc humano (isto é, proteína de fusão CD28-Fc recombinante), rPDLI.Fc, rCTLA4.Fc e rB7H6.Fc. A citometria de fluxo de duas cores foi realizada substancialmente como descrito no Exemplo 3. As produções de levedura dos tipos citométricos de fluxo foram testadas quanto a maior afinidade de ligação específica. A levedura de saída de ordenação foi expandida e re-induzida para expressar as variantes particulares de domínio modificado por afinidade de IgSF que codificam. Esta população pode, então, ser comparada com a cepa de levedura parental, de tipo selvagem, ou quaisquer outros resultados selecionados, tal como a população de levedura com saída de esfera, por citometria de fluxo.
[00679] No caso das variantes de leveduras NKp30 selecionadas para ligação a B7-H6, as saídas de ordenação F2 deram valores MFI de 533 quando coradas com rB7H6 16,6 nM.Fc, enquanto que a cepa parental NKp30 MFI foi medida a 90 quando corada com a mesma concentração de rB7H6.Fc (melhoria de 6 vezes).
[00680] Entre as variantes de NKp30 que foram identificadas, esta
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456/474 va uma variante que continha as mutações L30V/A60V/S64P/S86G com referência às posições no domínio extracelular de NKp30 correspondentes às posições estabelecidas na SEQ ID NO: 275.
[00681] Para as variantes CD 155 fornecidas na Tabela 20A, as bibliotecas CD155 foram selecionadas contra cada um dos TIGIT, CD96 e CD226, separadamente. Para as variantes CD155 proporcionadas na Tabela 20B-F, a seleção envolveu duas seleções positivas com as contraestruturas desejadas TIGIT e CD96, seguidas de uma seleção negativa com a contraestrutura CD226 para selecionar longe de CD226 e melhorar a especificidade de ligação da variante CD155. A seleção foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 3 acima, exceto que as concentrações das contraestruturas (TlGIT/CD96) e a estringência de seleção das classificaes positivas foram variadas para otimizar a identificação do chumbo. A concentração de CD226 para a seleção negativa foi mantida em 100 nM.
[00682] Para as variantes CD112 fornecidas na Tabela 21A, as bibliotecas CD112 foram selecionadas contra cada um dos TIGIT, CD112R e CD226, separadamente. Para variantes adicionais de CD112 proporcionadas na Tabela 21B-C, a seleção envolveu duas seleções positivas com as contraestruturas desejadas TIGIT e CD112R, seguidas de uma seleção negativa com a contraestrutura CD226 para selecionar longe de CD226 e melhorar a especificidade de ligação da variante CD112. A seleção foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 3 acima exceto as concentrações das contra- estruturas (TIGIT/CD112R) e a estringência de seleção dos tipos positivos foi variada para otimizar a identificação do chumbo. A concentração de CD226 para a seleção negativa foi mantida em 100 nM.
[00683] Para PD-L1 e PD-L2 mostrados nas Tabelas 22A-C ou Tabelas 23A e 23B, respectivamente, as bibliotecas de PD-L1 ou PD-L2 direcionadas para exibição de levedura ou aleatórias foram seleciona
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457/474 das contra PD-1. Isto foi então seguido por dois a três ciclos de triagem de citometria de fluxo utilizando coloração de proteína contraestrutura exógena para enriquecer a fração de células de levedura que apresenta ligantes melhorados. Alternativamente, para PD-L1, foram realizadas seleções com rCD80.Fc humano (isto é, proteína de fusão CD80 Fc humana recombinante da R&D Systems, EUA). As seleções foram realizadas em grande parte como descrito para PD-1 acima. O enriquecimento de esferas magnéticas e seleções por citometria de fluxo são essencialmente como descrito em Miller, KD, et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1 a 4.7.30, julho de 2008. As variantes de PD-L1 na Tabela 22A-B foram avaliadas quanto à ligação a contraestruturas expressas por células. Variantes adicionais de PD-L1 identificadas na tela como descrito acima são apresentadas na Tabela 22C.
[00684] As saídas de seleção exemplificativas foram reformatadas como proteínas imunomoduladoras contendo uma IgV de CD155 modificada por afinidade, IgV variante de CD112, IgV variante de PD-L1, IgV variante de PD-L2, cada uma fundida a uma molécula Fc (fusão IgV-Fc variante) moléculas) substancialmente como descrito no Exemplo 4 e a proteína de fusão Fc foi expressa e purificada substancialmente como descrito no Exemplo 5.
[00685] A ligação de variantes de domínio IgSF exemplificativas a contraestruturas expressas em células foi então avaliada substancialmente como descrito no Exemplo 6. As células que expressam parceiros de ligação cognatos foram produzidas e os estudos de ligação e citometria de fluxo foram realizados substancialmente como descrito no Exemplo 6. Além disso, a bioatividade da proteína variante de fusão de Fc foi caracterizada por ensaio de coimobilização de reação mista de linfócitos (MLR) ou anti-CD3 substancialmente como descrito no Exemplo 6.
[00686] Como acima, para cada Tabela, as substituições de amino
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458/474 ácidos exemplificativas são designadas pelo número de posição de aminoácido correspondente à respectiva sequência de ECD de referência não modificada (Tabela 2). A posição de aminoácido está indicada no meio, com o correspondente aminoácido não modificado (por exemplo, do tipo selvagem) listado antes do número e a substituição de aminoácido variante identificada listada (ou inserida designada por a) após o número.
[00687] Também é mostrada a atividade de ligação medida pelo valor de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para ligação de cada molécula de fusão Fc variante a células manipuladas para expressar o ligante de contraestrutura cognato e a razão da MFI em comparação com a ligação da molécula de fusão de Fc não modificada correspondente que não contém as substituições de aminoácidos no mesmo ligando de contraestrutura expresso na céluIa.A atividade funcional das moléculas de fusão Fc variantes PD-L2 para modular a atividade das células T também é mostrada com base nos níveis calculados de IFN-gama nos sobrenadantes de cultura (pg/ml) gerados com a molécula de fusão Fc indicada em um ensaio de MLR. A Tabela 23B também representa a razão de IFN-gama produzida por cada variante de IgV-Fc em comparação com o IgV-Fc não modificado correspondente em um ensaio de MLR.
[00688] Como mostrado, as seleções resultaram na identificação de um número de variantes do domínio de Ig15 CD155, CD112, PD-L1 e PD-L2 que foram modificadas por afinidade para exibir maior ligação para pelo menos um, e em alguns casos mais de um, ligante cognato de estrutura contrária. Além disso, os resultados mostraram que a modificação de afinidade das moléculas variantes também exibiu atividades melhoradas para aumentar e diminuir a atividade imunológica.
TABELA 20A: CD155 Variante selecionada contra parceiros de ligação cognatos. Sequências de moléculas, dados de ligação e dados de bioatividade coestimulatórios.
Mutações de CD155 CD226 tfxn MFI (razão parental de CD226 MFI) TIGIT tfxn MFI (razão parental de TIGIT MFI) CD96 MFI (razão parental de CD96 MFI) Modelo Expi293 MFI (razão parental de modelo MFI) IFN-gamma Anti-CD3 (pg/ml) (razão parental de IFN-gama Anti-CD3)
P18S/P64S/F91S 497825 (133,7) 247219 (91,1) 140065 (45,4) 3528 (1,2) 270,1 (0,7)
P18S/F91S/L104P 26210 75176 10867 2130 364,2
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TABELA 20A: CD155 Variante selecionada contra parceiros de ligação cognatos. Sequências de moléculas, dados de ligação e dados de bioatividade coestimulatórios.
Mutações de CD155 CD226 tfxn MFI (razão parental de CD226 MFI) TIGIT tfxn MFI (razão parental de TIGIT MFI) CD96 MFI (razão parental de CD96 MFI) Modelo Expi293 MFI (razão parental de modelo MFI) IFN-gamma Anti-CD3 (pg/ml) (razão parental de IFN-gama Anti-CD3)
(7.0) (27,7) (3.5) (0.7) (0.9)
L44P 581289 (156,1) 261931 (96,5) 152252 (49,4) 3414 (1,2) 277,6 (0,7)
A56V 455297 (122,3) 280265 (103,2) 161162 (52,2) 2601 (0,9) 548,2 (1,4)
P18L/L79V/F91S 5135 (1,4) 4073 (1,5) 3279 (1,1) 2719 (0,9) 1241,5 (3,2)
P18S/F91S 408623 (109,8) 284190 (104,7) 147463 (47,8) 3348 (1,1) 760,6 (2,0)
P18T/F91S 401283 (107,8) 223985 (82,5) 157644 (51,1) 3065 (1,1) 814,7 (2,1)
P18T/S42P/F91S 554105 (148,8) 223887 (82,5) 135395 (43,9) 3796 (1,3) 539,7 (1,4)
G7E/P18T/Y30C/F91S 12903 (3,5) 12984 (4,8) 7906 (2,6) 2671 (0,9) 275,9 (0,7)
P18T/F91S/G111D 438327 (117,7) 287315 (105,8) 167583 (54,3) 4012 (1,4) 307,2 (0,8)
P18S/F91P 4154 (Í1) 3220 (1,2) 2678 (0,9) 2816 (1,0) 365,7 (0,9)
P18T/F91S/F108L 394546 (106,0) 298680 (110,0) 193122 (62,6) 2926 (1,0) 775,4 (2,0)
P18T/T45A/F91S 435847 (117,1) 222044 (81,8) 191026 (61,9) 2948 (1,0) 1546,8 (4,0)
P18T/F91S/R94H 3589 (1,0) 2942 (1,1) 2509 (0,8) 2390 (0,8) 1273,2 (3,3)
P18S/Y30C/F91S 382352 (102,7) 276358 (101,8) 56934 (18,5) 3540 (1,2) 426,5 (1,1)
A81V/L83P 4169 (1,1) 2912 (1,1) 2616 (0,8) 2993 (1,0) 339,7 (0,9)
L88P 65120 (17,5) 74845 (27,6) 35280 (11,4) 2140 (0,7) 969,2 (2,5)
Tipo selvagem 3723 (1,0) 2715 (1,0) 3085 (1,0) 2913 (1,0) 389,6 (1,0)
R94H 18905 (5,1) 104013 (38,3) 11727 (3,8) 1663 (0,6) 372,6 (1,0)
A13E/P18S/A56V/F91S 357808 (96,1) 179060 (66,0) 118570 (38,4) 2844 (1,0) 349,2 (0,9)
P18T/F91S/V115A 38487 (10,3) 46313 (17,1) 22718 (7,4) 2070 (0,7) 1574,5 (4,0)
P18T/Q60K 238266 (64,0) 173730 (64,0) 154448 (50,1) 4778 JLÊ) 427,2 _
TABELA 20B: Variantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD155 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI a 100nM f de para ECD dobra WT MFI a 100nM f de para ECD dobra WT MFI a 100nM f de para ECD dobra WT MFI a 100nM f de dobra para WT ECD
S52M 1865,3 0,00 1901,0 0,01 1553,4 0,87 1609,8 0,02
T45Q/S52L/L104E/G111R 2287,0 0,01 2390,4 0,01 1735,1 0,97 1575,1 0,02
S42G 4837,5 0,01 2448,1 0,01 1815,4 1,02 1699,6 0,02
Q62F 2209,5 0,01 2572,1 0,01 2706,5 1,52 2760,7 0,03
S52Q 2288,1 0,01 2022,3 0,01 1790,1 1,00 1822,3 0,02
S42A/L104Q/G111R 1923,7 0,00 1901,7 0,01 1815,1 1,02 1703,8 0,02
S42A/S52Q/L104Q/G111R 1807,5 0,00 2157,2 0,01 1894,4 1,06 1644,0 0,02
S52W/L104E 1938,2 0,00 1905,6 0,01 2070,6 1,16 1629,5 0,02
S42C 1914,0 0,00 2096,1 0,01 1685,0 0,95 1592,4 0,02
S52W 1991,6 0,00 2037,3 0,01 1612,8 0,90 1712,9 0,02
S52M/L104Q 2666,6 0,01 2252,2 0,01 1706,0 0,96 1633,1 0,02
S42L/S52L/Q62F/L104Q 2021,4 0,00 2643,8 0,02 1730,1 0,97 2318,7 0,02
S42W 2434,5 0,01 2133,4 0,01 2325,7 1,30 2555,4 0,03
S42Q 2073,5 0,00 2225,9 0,01 1905,1 1,07 2143,1 0,02
S52L 2224,8 0,01 2676,3 0,02 2038,6 1,14 2043,2 0,02
S52R 4395,4 0,01 3964,4 0,02 2741,7 1,54 4846,9 0,05
L104E 3135,4 0,01 2264,2 0,01 1803,5 1,01 1556,7 0,02
G111R 2082,7 0,00 2791,3 0,02 2470,9 1,39 3317,1 0,03
S52E 2655,4 0,01 2599,8 0,02 1904,9 1,07 1799,0 0,02
Q62Y 2528,6 0,01 2621,4 0,02 1918,4 1,08 1827,5 0,02
T45Q/S52M/L104E 79498,2 0,19 143238,5 0,83 2600,6 1,46 6310,4 0,06
S42N/L104Q/G111R 2432,1 0,01 2311,3 0,01 1847,4 1,04 1958,3 0,02
S52M/V57L 1760,7 0,00 2431,6 0,01 2006,9 1,13 1858,7 0,02
S42N/S52Q/Q62F 2402,7 0,01 2152,0 0,01 1855,0 1,04 1737,6 0,02
S42A/S52L/L104E/G111R 2262,7 0,01 1889,4 0,01 1783,2 1,00 1606,2 0,02
S42W/S52Q/V57L/Q62Y 1961,4 0,00 2138,3 0,01 1844,9 1,03 1699,6 0,02
L104Q 10314,4 0,02 3791,4 0,02 2119,9 1,19 1542,6 0,02
S42L/S52Q/L104E 1946,9 0,00 6474,3 0,04 1749,0 0,98 1702,2 0,02
S42C/S52L 1762,5 0,00 2147,3 0,01 1663,4 0,93 1484,7 0,01
S42W/S52R/Q62Y/L104Q 1918,8 0,00 2300,1 0,01 1824,6 1,02 1756,0 0,02
T45Q/S52R/L104E 121636,9 0,29 142381,2 0,82 2617,9 1,47 3748,2 0,04
S52R/Q62F/L104Q/G111R 2969,2 0,01 3171,6 0,02 1725,4 0,97 2362,3 0,02
T45Q/S52L/V57L/L104E 2857,7 0,01 5943,5 0,03 1496,8 0,84 1533,3 0,02
S52M/Q62Y 1926,6 0,00 2000,3 0,01 1771,6 0,99 1651,1 0,02
Q62F/L104E/G111R 1966,4 0,00 2043,5 0,01 1701,9 0,95 1524,8 0,02
T45Q/S52Q 4812,8 0,01 5787,5 0,03 1765,6 0,99 2451,3 0,02
S52L/L104E 4317,8 0,01 2213,9 0,01 1756,9 0,99 1829,3 0,02
S42V/S52E 2055,0 0,00 2272,6 0,01 1808,0 1,01 2530,2 0,03
T45Q/S52R/G111R 4092,3 0,01 2075,2 0,01 1793,6 1,01 2336,6 0,02
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3593/3680
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TABELA 20B: Variantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD155 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI a 100nM ΐ de para ECD dobra WT MFI a 100nM ΐ de para ECD dobra WT MFI a 100nM T de para ECD dobra WT MFI a 100nM T de dobra para WT ECD
S42G/S52Q/L104E/G111R 2010,1 0,00 2019,2 0,01 1706,4 0,96 1707,6 0,02
S42N/S52E/V57L/L104E 1784,2 0,00 1743,6 0,01 1690,1 0,95 1538,7 0,02
Tipo selvagem 1964,7 0,00 2317,1 0,01 2169,6 1,22 1893,4 0,02
S42C/S52M/Q62F 1861,0 0,00 2084,2 0,01 1592,3 0,89 1481,3 0,01
S42L 1930,4 0,00 2187,2 0,01 1743,2 0,98 1618,4 0,02
Tipo selvagem 2182,6 0,01 2374,5 0,01 1743,1 0,98 1680,4 0,02
S42A 1929,2 0,00 2188,6 0,01 1733,7 0,97 1623,6 0,02
S42G/S52L/Q62F/L104Q 1924,3 0,00 2157,6 0,01 1661,3 0,93 1642,1 0,02
S42N 1817,4 0,00 1910,9 0,01 1699,7 0,95 1691,5 0,02
CD155 IgV Fc 4690 0,01 4690 0,03 2941 1,65 3272 0,03
CD155 ECD-Fc Tipo selvagem 423797 1,00 172839 1,00 1783 1,00 99037 1,00
Fc PE Anti-humano 1506,3 0,00 3774 0,02 1587 0,89 1618 0,02
TABELA 20C: Variantes CD155 Adicionais e Dados de ligação.
Mutação(ções) de CD155 TIGIT CD226 CD96
MFI a 100nM Aumento de dobra para WT ECD MFI a 100nM Aumento de dobra para WT ECD MFI a 100nM Aumento de dobra para WT ECD
P18T/S65A/S67V/F91S 297843 1,99 351195 3,22 128180 1,68
P18T/T45Q/T61R/S65N/S67L 224682 1,50 270175 2,48 22820 0,30
P18F/S65A/S67V/F91S 534106 3,57 350410 3,21 144069 1,89
P18S/L79P/L104M 342549 2,29 320823 2,94 107532 1,41
P18S/L104M 449066 3,00 295126 2,70 121266 1,59
L79P/L104M 3210 0,02 8323 0,08 2894 0,04
P18T/T45Q/L79P 542878 3,63 371498 3,40 193719 2,55
P18T/T45Q/T61R/S65H/S67H 312337 2,09 225439 2,07 152903 2,01
A13R/D23Y/E37P/S42P/Q62Y/A81E 4161 0,03 11673 0,11 5762 0,08
P18L/E37S/Q62M/G80S/A81P/G99Y/S112N 5900 0,04 14642 0,13 3345 0,04
P18S/L104T 321741 2,15 367470 3,37 108569 1,43
P18S/Q62H/L79Q/F91S 283357 1,89 324877 2,98 125541 1,65
P18S/F91S 222780 1,49 300049 2,75 48542 0,64
P18L/V57T/T61S/S65Y/S67A/L104T 278178 1,86 276870 2,54 121499 1,60
P18T/T45Q 326769 2,18 357515 3,28 92389 1,21
T61 M/S65W/S67A/L104T 360915 2,41 417897 3,83 148954 1,96
P18S/V41A/S42G/T45G/L104N 3821 0,03 11449 0,10 3087 0,04
P18H/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59E/T61 S/S65D/E68G/L104N 5066 0,03 177351 1,63 3700 0,05
P18S/S42G/T45V/F58L/S67W/L104N 14137 0,09 15175 0,14 15324 0,20
P18S/T45I/L104N 141745 0,95 298011 2,73 97246 1,28
P18S/S42G/T45G/L104N/V106A 29387 0,20 117965 1,08 15884 0,21
P18H/H40R/S42G/T45I/S52T/G53R/S54H/V57L/H59 E/T61S/S65D/E68G/L104Y/V106L/F108H 12335 0,08 14657 0,13 15779 0,21
P18S/T45Q/L79P/L104T 206674 1,38 285512 2,62 87790 1,15
P18L/Q62R 66939 0,45 25063 0,23 10928 0,14
P18L/H49R/L104T/D116N 167980 1,12 214677 1,97 62451 0,82
S65T/L104T 205942 1,38 187147 1,71 65207 0,86
P18L/A47V/Q62Y/E73D/L104T 146142 0,98 248926 2,28 73956 0,97
P18L/S42P/T45Q/T61G/S65H/S67E/L104T/D116N 153536 1,03 402503 3,69 53044 0,70
T45Q/S52E/Q62F/L104E 132850 0,89 276434 2,53 14558 0,19
CD155 ECD-Fc de Tipo selvagem 149692 1,00 109137 1,00 76083 1,00
Fc PE Anti-humano 2287 0,02 4799 0,04 2061 0,03
TABELA 20D: Variantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutações de CD155 TIGIT CD226 CD96
MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV
P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/F91 S/L104M/G111D 117327 1,2 1613 0,1 1629 0,1
P18S/T45S/T61K/S65W/S67A/F91 S/G111R 124936 1,3 2114 0,1 2223 0,1
P18S/L79P/L104M/T107M 110512 1,1 18337 0,9 22793 1,3
P18S/S65W/S67A/M90V/V95A/L1 04Q/G111R 101726 1,0 1605 0,1 2571 0,1
CD155-ECD de Tipo selvagem 98935 1,0 20029 1,0 17410 1,0
TABELA 20E: Variantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutações de CD155 TIGIT CD226 CD96
MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155ECD MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155ECD MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155-ECD
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3594/3680
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TABELA 20E: Variantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutações de CD155 TIGIT CD226 CD96
MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155ECD MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155ECD MFI a 11,1nM Alteração de dobra de CD155-ECD
P18S/A47G/L79P/F91S/L104M/T107A/R113W 56,409 1,19 1,191 0,08 25,362 1,49
P18T/D23G/S24A/N35D/H49L/L79P/F91S/L104M/G111R 128,536 2,72 987 0,06 3,497 0,20
V9L/P18S/Q60R/V75L/L79P/R89K/F91S/L104E/G111R 125,329 2,65 986 0,06 959 0,06
P18S/H49R/E73D/L79P/N85D/F91S/V95A/L104M/G111R Pouca a nenhuma proteína produzida
V11A/P18S/L79P/F91S/L104M/G111R 48,246 1,02 974 0,06 923 0,05
V11A/P18S/S54R/Q60P/Q62K/L79P/N85D/F91S/T107M 190,392 4,02 1,019 0,07 1,129 0,07
P18T/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/G111R 121,611 2,57 986 0,06 16,507 0,97
P18T/M36T/L79P/F91S/G111R 150,015 3,17 1,029 0,07 2,514 0,15
D8G/P18S/M36I/V38A/H49Q/A76E/F91S/L104M/T107A/R1 13W 79,333 1,68 1,026 0,07 2,313 0,14
P18S/S52P/S65A/S67V/L79P/F91S/L104M/T107S/R113W 23,766 0,50 1,004 0,07 1,080 0,06
T15I/P18T/L79P/F91S/L104M/G111R 55,498 1,17 1,516 0,10 1,030 0,06
P18F/T26M/L44V/Q62K/L79P/E82D/F91S/L104M/G111D 213,640 4,51 991 0,06 1,276 0,07
P18T/E37G/G53R/Q62K/L79P/F91S/E98D/L104M/T107M 251,288 5,31 2,001 0,13 45,878 2,69
P18L/K70E/L79P/F91S/V95A/G111R 62,608 1,32 1,117 0,07 973 0,06
V9I/Q12K/P18F/S65A/S67V/L79P/L104T/G111R/S112I 81,932 1,73 803 0,05 68,295 4,00
P18F/S65A/S67V/F91S/L104M/G111R 30,661 0,65 901 0,06 3,193 0,19
V9I/V10I/P18S/F20S/T45A/L79P/F91S/L104M/F108Y/G111 R/S112V 151,489 3,20 973 0,06 974 0,06
V9L/P18L/L79P/M90I/F91S/T102S/L104M/G111R 155,279 3,28 910 0,06 10,568 0,62
P18C/T26M/L44V/M55I/Q62K/L79P/F91S/L104M/T107M 137,521 2,91 973 0,06 111,085 6,51
V9I/P18T/D23G/L79P/F91S/G111R 151,426 3,20 897 0,06 2,725 0,16
P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R 125,639 2,66 917 0,06 3,939 0,23
P18F/L79P/M90L/F91S/V95A/L104M/G111R 115,156 2,43 1,073 0,07 2,464 0,14
P18T/M36T/S65A/S67E/L79Q/A81T/F91S/G111R 10,616 0,22 1,130 0,07 963 0,06
V9L/P18T/Q62R/L79P/F91S/L104M/G111R 195,111 4,12 835 0,05 1,497 0,09
CD155-ECD-FC 47,319 1,00 15,421 1,00 17,067 1,00
Controle Fc 2,298 0,05 1,133 0,07 996 0,06
TABELA20F: \^riantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutações de CD155 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD
P18T/G19D/M36T/S54N/L79P/L83Q/F 91S/T107M/F108Y 905 0,02 748 0,02 1276 1,56 726 0,01
V9L/P18L/M55V/S69L/L79P/A81E/F91 S/T107M 58656 1,34 11166 0,29 920 1,13 67364 1,39
P18F/H40Q/T61K/Q62K/L79P/F91S/L1 04M/T107V 108441 2,48 853 0,02 918 1,13 8035 0,17
P18S/Q32R/Q62K/R78G/L79P/F91S/T 107A/R113W 5772 0,13 701 0,02 843 1,03 831 0,02
Q12H/P18T/L21S/G22SA/57A/Q62R/L 79P/F91S/T107M 1084 0,02 687 0,02 876 1,07 818 0,02
V9I/P18S/S24P/H49Q/F58Y/Q60R/Q6 2K/L79P/F91S/T107M 69926 1,60 1089 0,03 1026 1,26 43856 0,90
P18T/W46C/H49R/S65A/S67V/A76T/L 79P/S87T7L104M 918 0,02 640 0,02 803 0,98 717 0,01
P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T 107M 12630 0,29 707 0,02 857 1,05 1050 0,02
P18S/S42T/E51G/L79P/F91S/G92W/T 107M 7476 0,17 851 0,02 935 1,15 924 0,02
V10F/T15S/P18L/R48Q/L79P/F91S/T1 07M/V115M 1168 0,03 792 0,02 901 1,10 998 0,02
P18S/L21M/Y30F/N35D/R84W/F91S/T 107M/D116G 1377 0,03 743 0,02 946 1,16 1033 0,02
P18F/E51V/S54G/Q60R/L79Q/E82G/S 87T/M90I/F91S/G92R/T107M 46090 1,05 15701 0,41 1012 1,24 61814 1,27
Q16H/P18F/F91S/T107M Pouca a nenhuma proteína produzida
P18T/D23G/Q60R/S67L/L79P/F91S/T1 07M/V115A 64091 1,47 30931 0,81 874 1,07 10887 5 2,24
D8G/V9I/V11A/P18T/T26M/S52P/L79P /F91S/G92A/T107LA/115A 52508 1,20 9483 0,25 817 1,00 97770 2,01
V9I/P18F/A47E/G50S/E68G/L79P/F91 S/T107M 55167 1,26 54341 1,43 752 0,92 10211 5 2,10
P18S/M55I/Q62K/S69P/L79P/F91S/T1 07M Pouca a nenhuma proteína produzida
P18T/T39S/S52P/S54R/L79P/F91S/T1 07M 45927 1,05 744 0,02 1038 1,27 1225 0,03
P18S/D23N/L79P/F91S/T107M/S114N Pouca a nenhuma proteína produzida
P18S/P34S/E51V/L79P/F91S/G111R 7917 0,18 769 0,02 853 1,04 892 0,02
P18S/H59N/V75A/L79P/A81T/F91S/L1 04M/T107M 800 0,02 676 0,02 915 1,12 759 0,02
P18SM/46R/E68D/L79P/F91S/T107M/ R113G 1359 0,03 717 0,02 798 0,98 737 0,02
V9L/P18F/T45A/S65A/S67V/R78K/L79 V/F91S/T107M/S114T 130274 2,98 153569 4,04 812 1,00 85605 1,76
P18T/M55L/T61R/L79P/F91SA/106Ι/Γ1 07M 133399 3,05 1906 0,05 827 1,01 57927 1,19
T15I/P18S/V33M/N35F/T39S/M55L/R7 8S/L79P/F91S/T107M 7550 0,17 1015 0,03 789 0,97 2709 0,06
P18S/Q62K/K70E/L79P/F91S/G92E/R 113W 11173 0,26 691 0,02 735 0,90 1951 0,04
P18F/F20I/T26M/A47V/E51K/L79P/F91 S 136088 3,11 54026 1,42 1401 1,72 96629 1,99
P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T 43795 1,00 98241 2,58 888 1,09 70891 1,46
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TABELA 20F: \^riantes CD155 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutações de CD155 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD MFIa 25nM Alteração de dobra de CD155-ECD
107M
P18S/D23G/C29R/N35D/E37G/M55I/Q 62K/S65A/S67G/R78G/L79P/F91S/L10 4M/T107M/Q110R 1599 0,04 1030 0,03 1115 1,37 1944 0,04
A13E/P18S/M36R/Q62K/S67T/L79P/N 85D/F91S/T107M Pouca a nenhuma proteína produzida
V9I/P18T/H49R/L79P/N85D/F91S/L10 4T/T107M 46375 1,06 76851 2,02 794 0,97 80210 1,65
V9A/P18F/T61S/Q62UL79P/F91S/G11 1R 26109 0,60 891 0,02 825 1,01 2633 0,05
D8E/P18T/T61A/L79P/F91S/T107M Pouca a nenhuma proteína produzida
P18S/V41A/H49R/S54C/L79S/N85Y/L 88P/F91S/L104M/T107M 1098 0,03 830 0,02 876 1,07 1678 0,03
V11E/P18H/F20Y/V25E/N35S/H49R/L 79P/F91S/T107M/G111R 979 0,02 846 0,02 844 1,03 928 0,02
V11A/P18F/D23A/L79P/G80D/V95AT1 07M 45249 1,04 913 0,02 830 1,02 33883 0,70
P18S/K70R/L79P/F91S/G111R 16180 0,37 793 0,02 854 1,05 1182 0,02
P18T/D23A/Q60H/L79P/M90V/F91S/T 107M 175673 4,02 161958 4,26 879 1,08 50981 1,05
V9L/V11M/P18S/N35S/S54G/Q62K/L7 9P/L104M/T107M/V115M 2999 0,07 2315 0,06 893 1,09 925 0,02
V9L/P18Y/V25A/V38G/M55V/A77T/L7 9P/M90I/F91S/L104M 138011 3,16 26015 0,68 919 1,13 17970 0,37
V10G/P18T/L72Q/L79P/F91S/T107M 4253 0,10 1584 0,04 863 1,06 3643 0,07
P18S/H59R/A76G/R78S/L79P 130622 2,99 79435 2,09 1009 1,24 44493 0,91
V9A/P18S/M36T/S65G/L79P/F91S/L10 4T/G111R/S112I 92503 2,12 989 0,03 886 1,09 7850 0,16
P18T/S52A/V57A/Q60R/Q62K/S65C/L 79P/F91T/N100Y/T107M 187338 4,29 10579 0,28 908 1,11 3791 0,08
V11A/P18F/N35D/A47E/Q62K/L79P/F9 1S/G99D/T107M/S114N Pouca a nenhuma proteína produzida
V11A/P18T/N35S/L79P/S87T/F91S 218660 5,00 273825 7,20 1269 1,56 69871 1,44
V9D/V11M/Q12L/P18S/E37V/M55I/Q6 0R/K70Q/L79P/F91S/L104Μ/Γ107M 8693 0,20 790 0,02 852 1,04 1991 0,04
T15S/P18S/Y30H/Q32L/Q62R/L79P/F 91S/T107M 16213 0,37 2092 0,06 1056 1,29 6994 0,14
CD155-ECD-FC 43704 1,00 38032 1,00 816 1,00 48638 1,00
CD112-lgV 1289 824 17819 1172 0,02
TABELA 21A: Variante CD112 selecionada contra parceiros de ligação cognatos. Seguências de moléculas /dados de ligação/ e dados de bioatividade coestimulatória.
Mutação(ções) de CD112 TIGIT tfxnMFI (razão parental de TIGIT MFI) CD112Rtfxn MFI (razão parental de CD112R MFI) CD226 MFI (razão parental deCD226MFI) Modelo Expi293 MFI (razão parental de modelo MFI) IFN-gama Anti-CD3 (pg/ml) (razão parental de IFN-g ama Anti-CD3)
WTCD112 210829 (1,00) 1452 (1,00) 265392 (1,00) 1112 (1,00) 676,6 (1,00)
Y33H/A112V/G117D 12948 (0,06) 1552 (1,07) 1368 (0,01) 1241 (1,12) 164,8 (0,24)
V19A/Y33H/S64G/S80G/G98S/N 106Y/A112V 48356 (0,23) 1709 (1,18) 2831 (0,01) 1098 (0,99)
L32P/A112V 191432 (0,91) 1557 (1,07) 11095 (0,04) 1259 (1,13) 390,4 (0,58)
A95V/A112I 238418 (1,13) 1706 (1,17) 51944 (0,20) 1215 (1,09) 282,5 (0,42)
P28S/A112V 251116 (1,19) 1985 (1,37) 153382 (0,58) 1189 (1,07) 503,4 (0,74)
P27A/T38N/V101A/A112V 255803 (1,21) 2138 (1,47) 222822 (0,84) 1399 (1,26) 240,7 (0,36)
S118F 11356 (0,05) 5857 (4,03) 6938 (0,03) 1270 (1,14) 271,7 (0,40)
R12W/H48Y/F54S/S118F 10940 (0,05) 3474 (2,39) 5161 (0,02) 1069 (0,96)
R12W/Q79R/S118F 2339 (0,01) 7370 (5,08) 1880 (0,01) 1338 (1,20) 447,4 (0,66)
T113S/S118Y 6212 (0,03) 6823 (4,70) 1554 (0,01) 1214 (1,09) 225,1 (0,33)
S118Y 2921 (0,01) 6535 (4,50) 2003 (0,01) 1463 (1,32) 190,4 (0,28)
N106I/S118Y 2750 (0,01) 7729 (5,32) 1815 (0,01) 1222 (1,10) 265,8 (0,39)
N106I/S118F 1841 (0,01) 9944 (6,85) 1529 (0,01) 1308 (1,18) 437,9 (0,65)
A95T/L96P/S118Y 2352 (0,01) 4493 (3,09) 1412 (0,01) 1329 (1,19) 292,4 (0,43)
Y33H/P67S/N106Y/A112V 225015 (1,07) 3259 (2,24) 204434 (0,77) 1296 (1,17) 618,8 (0,91)
N106Y/A112V 6036 (0,03) 1974 (1,36) 15334 (0,06) 1108 (1,00) 409,9 (0,61)
T18S/Y33H/A112V 252647 1347 183181 1412 601,8
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TABELA 21A: Variante CD112 selecionada contra parceiros de ligação cognatos. Sequências de moléculas /dados de ligação/ e dados de bioatividade coestimulatória.
Mutação(ções) de CD112 TIGITtfxnMFI (razão parental deTIGITMFI) CD112Rtfxn MFI (razão parental de CD112R MFI) CD226 MFI (razão parental deCD226MFI) Modelo Expi293 MFI (razão parental de modelo MFI) IFN-gama Anti-CD3 (pg/ml) (razão parental de IFN-g ama Anti-CD3)
(1,20) (0,93) (0,69) (1,27) (0,89)
P9S/Y33H/N47S/A112V 240467 (1,14) 1418 (0,98) 203608 (0,77) 1361 (1,22) 449,1 (0,66)
P42S/P67H/A112V 204484 (0,97) 1610 (1,11) 188647 (0,71) 1174 (1,06) 530,6 (0,78)
P27L/L32P/P42S/A112V 219883 (1,04) 1963 (1,35) 84319 (0,32) 1900 (1,71) 251,6 (0,37)
G98D/A112V 4879 (0,02) 2369 (1,63) 6100 (0,02) 1729 (1,55) 387,0 (0,57)
Y33H/S35P/N106Y/A112V 250724 (1,19) 1715 (1,18) 94373 (0,36) 1495 (1,34) 516,2 (0,76)
L32P/P42S/T100A/A112V 242675 (1,15) 1742 (1,20) 202567 (0,76) 1748 (1,57) 435,3 (0,64)
P27S/P45S/N106I/A112V 223557 (1,06) 1799 (1,24) 84836 (0,32) 1574 (1,42) 277,5 (0,41)
Y33H/N47K/A112V 251339 (1,19) 1525 (1,05) 199601 (0,75) 1325 (1,19) 483,2 (0,71)
Y33H/N106Y/A112V 297169 (1,41) 1782 (1,23) 258315 (0,97) 1440 (1,30) 485,4 (0,72)
K78R/D84G/A112V/F114S 236662 (1,12) 1638 (1,13) 24850 (0,09) 1345 (1,21) 142,5 (0,21)
Y33H/N47K/F54L/A112V 14483 (0,07) 1617 (1,11) 2371 (0,01) 1353 (1,22) 352,8 (0,52)
Y33H/A112V 98954 (0,47) 1216 (0,84) 1726 (0,01) 1298 (1,17)
A95V/A112V 168521 (0,80) 2021 (1,39) 200789 (0,76) 1459 (1,31) 412,9 (0,61)
R12W/A112V 135635 (0,64) 1582 (1,09) 23378 (0,09) 1412 (1,27) 165,8 (0,24)
A112V 213576 (1,01) 1986 (1,37) 151900 (0,57) 1409 (1,27) 211,4 (0,31)
Y33H/A112V 250667 (1,19) 1628 (1,12) 230578 (0,87) 1216 (1,09) 612,7 (0,91)
R12W/P27S/A112V 3653 (0,02) 1308 (0,90) 9105 (0,03) 1051 (0,94)
Y33H/V51M/A112V 218698 (1,04) 1384 (0,95) 195450 (0,74) 1170 (1,05) 709,4 (1,05)
Y33H/A112V/S118T 219384 (1,04) 1566 (1,08) 192645 (0,73) 1313 (1,18) 396,3 (0,59)
Y33H/V101A/A112V/P115S 5605 (0,03) 1582 (1,09) 5079 (0,02) 1197 (1,08)
H24R/T38N/D43G/A112V 227095 (1,08) 1537 (1,06) 229311 (0,86) 1336 (1,20) 858,6 (1,27)
A112V 4056 (0,02) 1356 (0,93) 10365 (0,04) 986 (0,89)
P27A/A112V 193537 (0,92) 1531 (1,05) 230708 (0,87) 3084 (2,77) 355,1 (0,52)
A112V/S118T 233173 (1,11) 1659 (1,14) 121817 (0,46) 845 (0,76) 533,3 (0,79)
R12W/A112V/M122I 235935 (1,12) 1463 (1,01) 217748 (0,82) 1350 (1,21) 528,0 (0,78)
Q83K/N106Y/A112V 205948 (0,98) 2042 (1,41) 234958 (0,89) 1551 (1,39) 481,4 (0,71)
R12W/P27S/A112V/S118T 11985 (0,06) 2667 (1,84) 12756 (0,05) 1257 (1,13) 334,4 (0,49)
P28S/Y33H/A112V 4711 (0,02) 1412 (0,97) 3968 (0,01) 955 (0,86)
P27S/Q90R/A112V 3295 (0,02) 1338 (0,92) 6755 (0,03) 1048 (0,94)
L15V/P27A/A112V/S118T 209888 (1,00) 1489 (1,03) 84224 (0,32) 1251 (1,13) 512,3 0,76)
Y33H/N106Y/T108I/A112V Não testado
Y33H/P56L/V75M/V101 M/A112V Não testado
TABELA 21B: Variantes CD112 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD112 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV
S118F 1763 0,02 1645 0,08 2974 0,61 1659 0,19
N47K/Q79R/S118F 1738 0,02 1689 0,09 2637 0,54 1647 0,19
Q40R/P60T/A112V/S1 18T 4980 0,06 1608 0,08 2399 0,50 2724 0,32
F114Y/S118F 110506 1,34 7325 0,37 1502 0,31 1553 0,18
N106I/S118Y 1981 0,02 1700 0,09 2394 0,49 1582 0,19
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3597/3680
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TABELA 21B: Variantes CD112 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD112 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV MFI a 100nM Aumento de dobra para WT IgV
S118Y 101296 1,23 9990 0,50 1429 0,30 1551 0,18
Y33H/K78R/S118Y 2276 0,03 2115 0,11 3429 0,71 2082 0,24
N106I/S118F 1875 0,02 1675 0,08 2365 0,49 1662 0,19
R12W/A46T/K66M/Q7 9R/N106I/T113A/S118 F 3357 0,04 1808 0,09 1664 0,34 4057 0,48
Y33H/A112V/S118F 3376 0,04 2886 0,15 3574 0,74 3685 0,43
R12W/Y33H/N106I/S1 18F 100624 1,22 24513 1,24 1490 0,31 2060 0,24
L15V/Q90R/S118F 5791 0,07 4169 0,21 2752 0,57 4458 0,52
N47K/D84G/N106I/S1 18Y 3334 0,04 2819 0,14 2528 0,52 3498 0,41
L32P/S118F 3881 0,05 2506 0,13 2659 0,55 2518 0,29
Y33H/Q79R/A112V/S 118Y Pouca a nenhuma proteína produzida
T18A/N106I/S118T 84035 1,02 10208 0,52 1585 0,33 1590 0,19
L15V/Y33H/N106Y/A1 12V/S118F Pouca a nenhuma proteína produzida
V37M/S118F 96986 1,18 2523 0,13 1985 0,41 1849 0,22
N47K/A112V/S118Y 1980 0,02 1859 0,09 2733 0,56 1825 0,21
A46T/A112V 4224 0,05 4685 0,24 3288 0,68 4273 0,50
P28S/Y33H/N106I/S1 18Y 6094 0,07 2181 0,11 1891 0,39 3021 0,35
P30S/Y33H/N47K/V7 5M/Q79R/N106I/S118 Y 2247 0,03 2044 0,10 1796 0,37 2658 0,31
V19A/N47K/N106Y/K1 16E/S118Y 2504 0,03 2395 0,12 2174 0,45 2852 0,33
Q79R/T85A/A112V/S1 18Y 2192 0,03 1741 0,09 2367 0,49 1620 0,19
Y33H/A112V 20646 0,25 1465 0,07 1794 0,37 2589 0,30
V101M/N106I/S118Y 55274 0,67 6625 0,33 1357 0,28 1494 0,17
Y33H/Q79R/N106I/A1 12V/S118T 6095 0,07 1760 0,09 2393 0,49 3033 0,36
Q79R/A112V 1571 0,02 1490 0,08 2284 0,47 1326 0,16
Y33H/A46T/Q79R/N1 06I/S118F 90813 1,10 15626 0,79 1298 0,27 3571 0,42
A112V/G121S 95674 1,16 19992 1,01 1252 0,26 4005 0,47
Y33H/Q79R/N106I/S1 18Y 36246 0,44 2118 0,11 1970 0,41 3250 0,38
Y33H/N106I/A112V 47352 0,57 4217 0,21 2641 0,55 1488 0,17
Y33H/A46T/V101M/A 112V/S118T 14413 0,17 1596 0,08 2335 0,48 1441 0,17
L32P/L99M/N106I/S1 18F 3056 0,04 1791 0,09 2210 0,46 2000 0,23
L32P/T108A/S118F 104685 1,27 4531 0,23 2308 0,48 1518 0,18
A112V 4937 0,06 1903 0,10 1646 0,34 3011 0,35
R12W/Q79R/A112V 55539 0,67 6918 0,35 1386 0,29 1740 0,20
Y33H/N106Y/E110G/ A112V 2786 0,03 2517 0,13 1787 0,37 2023 0,24
Y33H/N106I/S118Y 1967 0,02 1579 0,08 2601 0,54 1517 0,18
Q79R/S118F 82055 1,00 7582 0,38 1298 0,27 1970 0,23
Y33H/Q79R/G98D/V1 01M/A112V 21940 0,27 1632 0,08 1141 0,24 18423 2,16
N47K/T81S/V101M/A 112V/S118F 6889 0,08 1311 0,07 1303 0,27 1145 0,13
G82S/S118Y 4267 0,05 1938 0,10 2140 0,44 2812 0,33
Y33H/A112V/S118Y 14450 0,18 1532 0,08 2353 0,49 3004 0,35
Y33H/N47K/Q79R/N1 06Y/A112V 70440 0,85 3557 0,18 1447 0,30 1679 0,20
Y33H/S118T 113896 1,38 17724 0,89 1252 0,26 5001 0,59
R12W/Y33H/Q79R/V1 01M/A112V 3376 0,04 2727 0,14 2047 0,42 2339 0,27
S118F 2685 0,03 1864 0,09 2520 0,52 1566 0,18
Tipo selvagem CD112-lgVFc 82414 1,00 19803 1,00 4842 1,00 8541 1,00
CD112 ECD-Fc 29157 0,35 8755 0,44 1107 0,23 1103 0,13
Anti-hFc PE 1383 0,02 1461 0,07 1358 0,28 1468 0,17
TABELA 21C: Variantes CD112 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD112 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFI a 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFI a 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFI a 20nM Aumento de dobra para WTIgV
N106I/S118Y 1288 0,04 1334 0,12 6920 4,16 1102 0,44
Y33H/Q83K/A112V/S118T 115690 3,31 10046 0,93 1128 0,68 2053 0,82
R12W/Q79R/S118F 1436 0,04 1296 0,12 6546 3,93 1046 0,42
V29M/Y33H/N106I/S118F Não testado
Y33H/A46T/A112V 111256 3,18 14974 1,39 1148 0,69 3333 1,34
Y33H/Q79R/S118F 1483 0,04 1326 0,12 7425 4,46 1138 0,46
Y33H/N47K/F74L/S118F 1338 0,04 1159 0,11 1516 0,91 1140 0,46
R12W/V101M/N106I/S118 Y 1378 0,04 1249 0,12 5980 3,59 1182 0,47
A46T/V101A/N106I/S118Y 1359 0,04 1199 0,11 6729 4,04 1173 0,47
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TABELA 21C: Variantes CD112 Adicionais e Dados de Ligação.
Mutação(ções) de CD112 TIGIT CD226 CD112R CD96
MFI 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFIa 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFIa 20nM Aumento de dobra para WTIgV MFIa 20nM Aumento de dobra para WTIgV
Y33H/N106Y/A112V 113580 3,25 17771 1,65 1207 0,72 2476 0,99
N106Y/A112V/S118T Não testado
S76P/T811/V101M/N106Y/ A112V/S118F Não testado
N106Y/A112V 29015 0,83 2760 0,26 1159 0,70 1639 0,66
P9R/L21V/P22L/I34M/S69F /F74L/A87V/A112V/L125A 1920 0,05 1218 0,11 1107 0,66 1074 0,43
Y33H/V101M/A112V 126266 3,61 24408 2,27 1150 0,69 4535 1,82
N106I/S118F 1776 0,05 1385 0,13 9058 5,44 1370 0,55
V29A/L32P/S118F 1265 0,04 1148 0,11 5057 3,04 1194 0,48
A112V 69673 1,99 6387 0,59 1140 0,68 1214 0,49
Y33H/V101M/A112V 133815 3,83 24992 2,32 1184 0,71 6338 2,54
P28S/Y33H/N106I/S118Y 2745 0,08 1689 0,16 6625 3,98 1978 0,79
Y33H/V101M/N106IZA112V 118654 3,40 21828 2,03 1253 0,75 3871 1,55
R12W/Y33H/N47K/Q79R/S 118Y 171390 4,91 5077 0,47 1124 0,68 2636 1,06
A112V/S118T 103203 2,95 15076 1,40 1155 0,69 1426 0,57
Y33H/A46T/A112V/S118T 141859 4,06 29436 2,74 1184 0,71 5760 2,31
Y33H/A112V/F114L/S118T 5161 0,15 1734 0,16 1184 0,71 1249 0,50
A112V 78902 2,26 6224 0,58 1114 0,67 1181 0,47
Y33H/T38A/A46T/V101M/A 112V 111293 3,19 25702 2,39 1192 0,72 99015 39,69
Q79R/A112V 96674 2,77 7264 0,67 1130 0,68 1216 0,49
Y33H/N106I/S118Y 5720 0,16 1453 0,14 6543 3,93 1248 0,50
P28S/Y33H/S69P/N106I/A1 12V/S118Y 22393 0,64 1378 0,13 1550 0,93 19174 7,68
Y33H/P42L/N47K/V101 M/A 112V 214116 6,13 13878 1,29 1315 0,79 4753 1,91
Y33H/N47K/F74S/Q83K/N 106I/F111L/A112V/S118T 6719 0,19 1319 0,12 1305 0,78 1278 0,51
Y33H/A112V/S118T/V119A 184794 5,29 10204 0,95 1269 0,76 4321 1,73
Y33H/N106I/A112V/S118F 6872 0,20 1591 0,15 2308 1,39 2796 1,12
Y33H/K66M/S118FM/124L 1724 0,05 1259 0,12 6782 4,07 1197 0,48
S118F 1325 0,04 1213 0,11 7029 4,22 1135 0,46
N106I/A112V 111342 3,19 4241 0,39 1546 0,93 1178 0,47
Y33H/A112V 177926 5,09 13761 1,28 1152 0,69 3117 1,25
WTCD112lgV 34932 1,00 10762 1,00 1665 1,00 2495 1,00
WTCD112-FC ECD 28277 0,81 8023 0,75 1253 0,75 1064 0,43
Anti-huFc PE 1138 0,03 1006 0,09 1010 0,61 1062 0,43
TABELA 22A: Variantes PD-L1 selecionadas e dados de ligação.
Mutação(ções) de PD-L1 Ligação a células Jurkat/PD-1
MFI a 50nM Aumento de dobra sobre PDL1 IgV-Fc do tipo selvagem
K28N/M41V/N45T/H51N/K57E 12585 2,4
I20L/I36T/N45D/I47T 3119 0,6
I20L/M41K/K44E 9206 1,8
P6S/N45T/N78I/I83T 419 0,1
N78I 2249 0,4
M41K/N78I Pouca a nenhuma proteína produzida
N17D/N45T/V50A/D72G Pouca a nenhuma proteína produzida
I20L/F49S Pouca a nenhuma proteína produzida
N45T/V50A 23887 4,6
I20L/N45T/N78I 29104 5,6
N45T/N78I 24865 4,7
I20L/N45T 24279 4,6
I20L/N45T/V50A 34158 6,5
N45T 6687 1,3
M41K 5079 1,0
M41V/N45T Pouca a nenhuma proteína produzida
M41K/N45T Pouca a nenhuma proteína produzida
A33D/S75P/D85E 685 0,1
M18I/M41K/D43G/H51R/N78I 20731 4,0
V11E/I20L/I36T/N45D/H60R/S75P 3313 0,6
A33D/V50A Pouca a nenhuma proteína produzida
S16G/A33D/K71E/S75P Pouca a nenhuma proteína produzida
E27G/N45T/M97I 881 0,2
E27G/N45T/K57R 5022 1,0
A33D/E53V 650 0,1
D43G/N45D/V58A 63960 12,2
E40G/D43V/N45T/V50A 809 0,2
Y14S/K28E/N45T 16232 3,1
A33D/N78S 1725 0,3
A33D/N78I 8482 1,6
A33D/N45T 17220 3,3
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TABELA 22A: Variantes PD-L1 selecionadas e dados de ligação.
Mutação(ções) de PD-L1 Ligação a células Jurkat/PD-1
MFI a 50nM Aumento de dobra sobre PDL1 IgV-Fc do tipo selvagem
A33D.N45T/N78I Pouca a nenhuma proteína produzida
E27G/N45T/V50A 25267 4,8
N45T/V50A/N78S 28572 5,4
N45T/V50A 18717 3,6
I20L/N45T/V110M 464 0,1
I20L/I36T/N45T/V50A 7658 1,5
N45T/L74P/S75P 5251 1,0
N45T/S75P 12200 2,3
S75P/K106R 388 0,1
S75P 1230 0,2
A33D/S75P 306 0,1
A33D/S75P/D104G 251 0,0
A33D/S75P 1786 0,3
I20L/E27G/N45T/V50A 29843 5,7
I20L/E27G/D43G/N45D/V58A/N78I 69486 13,3
I20L/D43G/N45D/V58A/N78I 72738 13,9
I20L/A33D/D43G/N45D/V58A/N78I 80205 15,3
I20L/D43G/N45D/N78I 67018 12,8
E27G/N45T/V50A/N78I 30677 5,9
N45T/V50A/N78I 32165 6,1
V11A/I20L/E27G/D43G/N45D/H51Y/S99G 73727 14,1
I20L/E27G/D43G/ N45T/V50A 36739 7,0
I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R, 80549 15,4
I20L/I36T/N45D 16870 3,2
I20L/K28E/D43G/N45D/E53G/V58A/N78I 139 0,0
A33D/D43G/N45D/V58A/S75P 58484 11,2
K23R/D43G/N45D 67559 12,9
I20L/D43G/N45D/V58A/N78I/D90G/G101D 259 0,0
D43G/N45D/L56Q/V58A/G101 G-ins 88277 16,8
I20L/K23E/D43G/N45D/V58A/N78I 89608 17,1
I20L/K23E/D43G/N45D/V50A/N78I 88829 16,9
T19I/E27G/N45I/V50A/N78I/M97K 25496 4,9
I20L/M41K/D43G/N45D 599 o,1
K23R/N45T/N78I 84980 16,2
Full length PD-L1 Fc 18465 3,5
Tipo selvagem PD-L1 IgV 5243 1,0
anticorpo monoclonal anti-PD-1 (nivolumab) 79787 15,2
IgG humana 198 0,0
Tabela 22B: Ligação de Fluxo a células que expressam PD-1 ou CD80
Mutação(ções) de PD-L1 PD-1 CD80
MFI a 20nM Alteração de dobra comparadaa WT PD-L1 MFI a 20nM Alteração de dobra comparada a WT PD-L1
K57R/S99G 2953 0,9 16253 121,3
K57R/S99G/F189L 1930 0,6 12906 96,3
M18V/M97L/F193S/R195G/E200K/H202Q 69 0,0 241 1,8
I36S/M41K/M97L/K144Q/R195G/E200K/H202Q/L20 6F 3498 1,1 68715 512,8
C22R/Q65L/L124S/K144Q/R195G/E200N/H202Q/T2 21L Pouca a nenhuma proteína produzida
M18V/I98L/L124S/P198T/L206F 2187 0,7 143 1,1
S99G/N117S/I148V/K171R/R180S Pouca a nenhuma proteína produzida
I36T/M97L/A103V/Q155H 120 0,0 128 1,0
K28I/S99G 830 0,3 693 5,2
R195S 3191 1,0 138 1,0
A79T/S99G/T185A/R195G/E200K/H202Q/L206F 1963 0,6 643 4,8
K57R/S99G/L124S/K144Q 2081 0,7 14106 105,3
K57R/S99G/R195G 2479 0,8 10955 81,8
D55V/M97L/S99G 11907 3,8 71242 531,7
E27G/I36T/D55N/M97L/K111E 1904 0,6 88724 662,1
E54G/M97L/S99G 8414 2,7 51905 387,4
G15A/I36T/M97L/K111E/H202Q 112 0,0 13530 101,0
G15A/I36T/V129D 114 0,0 136 1,0
G15A/I36T/V129D/R195G 125 0,0 134 1,0
G15A/V129D 2075 0,7 128 1,0
I36S/M97L 3459 1,1 44551 332,5
I36T/D55N/M97L/K111E/A204T 265 0,1 62697 467,9
I36T/D55N/M97L/K111E/V129A/F173L 393 0,1 72641 542,1
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3600/3680
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Tabela 22B: Ligação de Fluxo a células que expressam PD-1 ou CD80
Mutação(ções) de PD-L1 PD-1 CD80
MFI a 20nM Alteração de dobra comparadaa WT PD-L1 MFI a 20nM Alteração de dobra comparada a WT PD-L1
I36T/D55S/M97L/K111 E/l 148V/R180S 94 0,0 30704 229,1
I36T/G52R/M97L/V112A/K144E/V175A/P198T 81 0,0 149 1,1
I36T/I46V/D55G/M97L/K106E/K144E/T185A/R195G 69 0,0 190 1,4
I36T/I83T/M97L/K144E/P198T 62 0,0 6216 46,4
I36T/M97L/K111E Pouca a nenhuma proteína produzida
I36T/M97L/K144E/P198T 197 0,1 40989 305,9
I36T/M97L/Q155H/F193S/N201Y 69 0,0 1251 9,3
I36T/M97L/V129D 523 0,2 50905 379,9
L35P/I36S/M97L/K111E 190 0,1 155 1,2
M18I/I36T/E53G/M97L/K144E/E199G/V207A 104 0,0 47358 353,4
M18T/I36T/D55N/M97L/K111E 138 0,0 71440 533,1
M18V/M97L/T176N/R195G 1301 0,4 45300 338,1
M97L/S99G 12906 4,1 81630 609,2
N17D/M97L/S99G 10079 3,2 73249 546,6
S99G/T185A/R195G/P198T 2606 0,8 22062 164,6
V129D/H202Q 2001 0,6 219 1,6
V129D/P198T 3245 1,0 152 1,1
V129D/T150A 1941 0,6 142 1,1
V93E/V129D 1221 0,4 150 1,1
Y10F/M18V/S99G/Q138R/T203A 70 0,0 412 3,1
WTPD-L1 (IgV+lgC) Fc 3121 1,0 134 1,0
CTLA4-FC 59 N/A 199670 N/A
mAb anti-PD1 31482 N/A 134 N/A
Controle Fc 59 N/A 132 N/A
TABELA 22C. Moléculas contendo Domínio IgSF maduro por afinidade Adicional
Mutação(ções) de PD-L1 Mutação(ções) de PD-L1
N45D N45D/G102D/R194W/R195G
K160M/R195G N45D/G52V/Q121L/P198S
N45D/K144E N45D/I148V/R195G/N201D
N45D/P198S N45D/K111T/T183A/I188V
N45D/P198T N45D/Q89R/F189S/P198S
N45D/R195G N45D/S99G/C137R/V207A
N45D/R195S N45D/T163I/K167R/R195G
N45D/S131F N45D/T183A/T192S/R194G
N45D/V58D N45D/V50A/I119T/K144E
V129D/R195S T19A/N45D/K144E/R195G
I98T/F173Y/L196S V11E/N45D/T130A/P198T
N45D/E134G/L213P V26A/N45D/T163I/T185A
N45D/F173I/S177C K23N/N45D/L124S/K167T/R195G
N45D/I148V/R195G K23N/N45D/Q73R/T163I
N45D/K111T/R195G K28E/N45D/W149R/S158G/P198T
N45D/N113Y/R195S K28R/N45D/K57E/I98V/R195S
N45D/N165Y/E170G K28R/N45D/V129D/T163N/R195T
N45D/Q89R/I98V M41K/D43G/N45D/R64S/R195G
N45D/S131F/P198S M41K/D43G/N45D/R64S/S99G
N45D/S75P/P198S N45D/R68L/F173L/D197G/P198S
N45D/V50A/R195T N45D/V50A/I148V/R195G/N201D
E27D/N45D/T183A/I188V M41K/D43G/K44E/N45D/R195G/N201D
F173Y/T183I/L196S/T203A N45D/V50A/L124S/K144E/L179P/R195G
K23N/N45D/S75P/N120S
TABELA 23A: PD-L2 Variante selecionado contra PD-1. Sequência de molécula e dados de ligação.
Mutação(ções) de PD-L2 Ligação a células Jurkat/PD-1 Ligação fortebio a unidades responsivas a PD-1-Fc
MFI a 50nM Aumento de dobra sobre PD-L2 IgV-Fc de tipo selvagem
H15Q 15998 1,63 0,007
N24D 1414 0,14 -0,039
E44D 2928 0,3 -0,006
V89D 3361 0,34 0,005
Q82R.V89D 44977 4,57 1,111
E59G.Q82R 12667 1,29 -0,028
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TABELA 23A: PD-L2 Variante selecionado contra PD-1. Sequência de molécula e dados de ligação.
Mutação(ções) de PD-L2 Ligação a células Jurkat/PD-1 Ligação fortebio a unidades responsivas a PD-1-Fc
MFI a 50nM Aumento de dobra sobre PD-L2 IgV-Fc de tipo selvagem
S39I.V89D 26130 2,65 0,26
S67L.V89D 15991 1,62 0,608
S67L.I85F 529 0,05 -0,005
S67L.I86T 6833 0,69 0,141
H15Q.K65R 13497 1,37 -0,001
H15Q,Q72H,V89D 12629 1,28 0,718
H15Q,S67L,R76G 47201 4,8 0,418
H15Q,R76G,I85F 2941 0,3 -0,038
H15Q,T47A,Q82R 65174 6,62 0,194
H15Q,Q82R,V89D 49652 5,04 1,198
H15Q,C23S,I86T 830 0,08 -0,026
H15Q,S39I,I86T 1027 0,1 0,309
H15Q,R76G,I85F 1894 0,19 -0,006
E44D,V89D,W91R 614 0,06 -0,048
113V,S67L,V89D 26200 2,66 1,42
H15Q,S67L,I86T 15952 1,62 0,988
I13V,H15Q,S67L,I86T 21570 2,19 1,391
I13V,H15Q,E44D,V89D 23958 2,43 1,399
113V,S39I,E44D,Q82R,V89D 71423 7,26 0,697
113V,E44D,Q82R,V89D 45191 4,59 1,283
113V,Q72H,R76G,I86T 10429 1,06 0,733
I13V,H15Q,R76G,I85F 4736 0,48 -0,04
H15Q,S39I,R76G,V89D Pouca a nenhuma proteína produzida
H15Q,S67L,R76G,I85F 2869 0,29 0,025
H15Q,T47A,Q72H,R76G,I86T 32103 3,26 0,512
H15Q,T47A,Q72H,R76G 16500 1,68 0,327
I13V,H15Q,T47A,Q72H,R76G 73412 7,46 0,896
H15Q,E44D,R76G,I85F 2885 0,29 -0,013
H15Q,S39I,S67L,V89D 45502 4,62 1,174
H15Q,N32D,S67L,V89D 25880 2,63 1,407
N32D,S67L,V89D 31753 3,23 1,155
H15Q,S67L,Q72H,R76G,V89D 40180 4,08 1,464
H15Q,Q72H,Q74R,R76G,I86T 4049 0,41 0,093
G28V,Q72H,R76G,I86T 5563 0,57 0,003
I13V,H15Q,S39I,E44D,S67L 63508 6,45 0,889
E44D,S67L,Q72H,Q82R,V89D 51467 5,23 1,061
H15Q.V89D 17672 1,8 0,31
H15Q.T47A 26578 2,7 0,016
I13V,H15Q,Q82R 76146 7,74 0,655
I13V,H15Q,V89D 28745 2,92 1,331
113V,S67L,Q82R,V89D 58992 5,99 1,391
I13V,H15Q,Q82R,V89D 49523 5,03 1,419
H15Q, V31 M,S67L,Q82R, V89D 67401 6,85 1,37
I13V,H15Q,T47A,Q82R 89126 9,05 0,652
I13V,H15Q,V31A,N45S,Q82R,V89D 68016 6,91 1,327
H15Q,T47A,H69L,Q82R,V89D 65598 6,66 1,44
I13V,H15Q,T47A,H69L,R76G,V89D 54340 5,52 1,719
I12V,I13V,H15Q,T47A,Q82R,V89D 61207 6,22 1,453
I13V,H15Q,R76G,D77N,Q82R,V89D 33079 3,36 0,065
I13V,H15Q,T47A,R76G,V89D 53668 5,45 1,596
I13V,H15Q,T47A,Q82R,V89D 63320 6,43 1,418
I13V,H15Q,T47A,Q82R,V89D 60980 6,2 1,448
I13V,H15Q,I36V,T47A,S67L,V89D 52835 5,37 1,627
H15Q,T47A,K65R,S67L,Q82R,V89D 79692 8,1 1,453
H15Q,L33P,T47A,S67L,P71S,V89D 45726 4,65 1,467
I13V,H15Q,Q72H,R76G,I86T 24450 2,48 1,355
H15Q,T47A,S67L,Q82R,V89D 67962 6,9 1,479
F2L.H15Q,D46E,T47A,Q72H,R76G,Q82R,V89D 23039 2,34 1,045
I13V,H15Q,L33F,T47A,Q82R,V89D 62254 6,32 1,379
H15Q,N24S,T47A,Q72H,R76G,V89D 32077 3,26 0,4
I13V,H15Q,E44V,T47A,Q82R,V89D 61005 6,2 1,329
H15Q,N18D,T47A,Q72H,V73A,R76G,I86T,V89D 48317 4,91 0,475
I13V,H15Q,T37A,E44D,S48C,S67L,Q82R,V89D 47605 4,84 1,255
H15Q,L33H,S67L,R76G,Q82R,V89D 62326 6,33 1,507
I13V,H15Q,T47A,Q72H,R76G,I86T 49016 4,98 1,477
Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3602/3680
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TABELA 23A: PD-L2 Variante selecionado contra PD-1. Sequência de molécula e dados de ligação.
Mutaçâo(ções) de PD-L2 Ligação a células Jurkat/PD-1 Ligação fortebio a unidades responsivas a PD-1-Fc
MFI a 50nM Aumento de dobra sobre PD-L2 IgV-Fc de tipo selvagem
H15Q,S39I,E44D,Q72H,V75G,R76G,Q82R,V89D 43713 4,44 0,646
H15Q,T47A,S67L,R76G,Q82R,V89D 71897 7,3 1,539
I13V,H15Q,T47A,S67L,Q72H,R76G,Q82R,V89D 71755 7,29 1,536
PD-L2 IgV de tipo selvagem 9843 1 -0,024
ECD de comprimento total de PD-L2 2145 0,22 0,071
ECD de comprimento total de PD-L1 (R&D Systems) 23769 2,41 1,263
anticorpo monoclonal anti-PD-1 (nivolumab) 87002 8,84 0,899
TABELA 23B: Dados de bioatividade de variantes PD-L2 selecionadas contra PD-1 em MLR.
Mutaçâo(ções) de PD-L2 Níveis de IFN gama pg/ml Aumento de dobra sobre PD-L2 IgV-Fc de tipo selvagem
H15Q 1817,1 1,32
N24D 1976,3 1,44
E44D 1499,4 1,09
V89D 1168,1 0,85
Q82R.V89D 1617 1,17
E59G.Q82R 1511,3 1,1
S39I.V89D 1314,5 0,95
S67L.V89D 1230,1 0,89
S67L.I85F 1281,9 0,93
S67L.I86T 1020,4 0,74
H15Q.K65R 1510,8 1,1
H15Q,Q72H,V89D 1272,2 0,92
H15Q,S67L,R76G 1426,2 1,04
H15Q,R76G,I85F 1725,7 1,25
H15Q,T47A,Q82R 1317,9 0,96
H15Q,Q82R,V89D 1081,2 0,79
H15Q,C23S,I86T 1847,2 1,34
H15Q,S39I,I86T 1415,2 1,03
H15Q,R76G,I85F 1437,8 1,04
E44D.V89D.W91R 1560,1 1,13
I13V,S67L,V89D 867,5 0,63
H15Q,S67L,I86T 1034,2 0,75
I13V,H15Q,S67L,I86T 1014,4 0,74
I13V,H15Q,E44D,V89D 1384,2 1,01
I13V,S39I,E44D,Q82R,V89D 935,6 0,68
I13V,E44D,Q82R,V89D 1009,5 0,73
I13V,Q72H,R76G,I86T 1953 1,42
I13V,H15Q,R76G,I85F 1528,5 1,11
H15Q,S67L,R76G,I85F 1318,7 0,96
H15Q,T47A,Q72H,R76G,I86T 1599,6 1,16
H15Q,T47A,Q72H,R76G 1462,5 1,06
I13V,H15Q,T47A,Q72H,R76G 1469,8 1,07
H15Q,E44D,R76G,I85F 1391,6 1,01
H15Q,S39I,S67L,V89D 1227 0,89
H15Q,N32D,S67L,V89D 1285,7 0,93
N32D.S67L.V89D 1194 0,87
H15Q,S67L,Q72H,R76G,V89D 1061,2 0,77
H15Q,Q72H,Q74R,R76G,I86T 933,8 0,68
G28V,Q72H,R76G,I86T 1781,6 1,29
I13V,H15Q,S39I,E44D,S67L 1256,9 0,91
E44D,S67L,Q72H,Q82R,V89D 1281,4 0,93
H15Q.V89D 1495,4 1,09
H15Q.T47A 1637,2 1,19
I13V,H15Q,Q82R 1432,9 1,04
I13V,H15Q,V89D 1123 0,82
I13V,S67L,Q82R,V89D 1372,8 1
I13V,H15Q,Q82R,V89D 1596,6 1,16
H15Q.V31 M,S67L,Q82R,V89D 1206,5 0,88
I13V,H15Q,T47A,Q82R 1703,3 1,24
I13V.H15Q.V31 A,N45S,Q82R,V89D 1723,1 1,25
H15Q,T47A,H69L,Q82R,V89D 1732,5 1,26
113V.H15Q,T47A,H69L,R76G, V89D 1075,5 0,78
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TABELA 23B: Dados de bioatividade de variantes PD-L2 selecionadas contra PD-1 em MLR.
Mutaçâo(ções) de PD-L2 Níveis de IFN gama pg/ml Aumento de dobra sobre PD-L2 IgV-Fc de tipo selvagem
I12V,I13V,H15Q,T47A,Q82R,V89D 1533,2 1,11
113V,H 15Q,R76G,D77N,Q82R, V89D 1187,9 0,86
113V,H 15Q,T47A,R76G, V89D 1253,7 0,91
113V,H 15Q,T47A,Q82R,V89D 1445,5 1,05
113V,H 15Q,T47A,Q82R,V89D 1737 1,26
I13V,H15Q,I36V,T47A,S67L,V89D 1357,4 0,99
H15Q,T47A,K65R,S67L,Q82R,V89D 1335,3 0,97
H15Q,L33P,T47A,S67L,P71 S.V89D 1289,1 0,94
I13V,H15Q,Q72H,R76G,I86T 1221 0,89
H15Q,T47A,S67L,Q82R,V89D 1197,1 0,87
F2L,H15Q,D46E,T47A,Q72H,R76G,Q82R,V89D 1170,7 0,85
I13V,H15Q,L33F,T47A,Q82R,V89D 1468,4 1,07
113V,H 15Q,T47A,E58G,S67L,Q82R,V89D 836,1 0,61
H15Q,N24S,T47A,Q72H,R76G,V89D 1091,8 0,79
113V,H 15Q,E44V,T47A,Q82R,V89D 1270,5 0,92
H15Q.N18D,T47A,Q72H,V73A,R76G, I86T.V89D 1065,8 0,77
I13V,H15Q,T37A,E44D,S48C,S67L,Q82R,V89D 1751,7 1,27
H15Q,L33H,S67L,R76G,Q82R,V89D 1502 1,09
I13V,H15Q,T47A,Q72H,R76G,I86T 1088,1 0,79
H15Q,S39I,E44D,Q72H,V75G,R76G,Q82R,V89D 940,9 0,68
H15Q,T47A,S67L,R76G,Q82R,V89D 1097,8 0,8
113V,H 15Q,T47A,S67L,Q72H,R76G,Q82R,V89D 1559,6 1,13
PD-L2 IgV de tipo selvagem 1376,8 1
ECD de comprimento total de PD-L2 1173,2 0,85
ECD de comprimento total de PD-L1 2190,9 1,59
Nivolumab (anti-PD-1) 418,9 0,3
EXEMPLO 18
Citotoxicidade para Células Tumorais MC38 Transduzidas em HuPDL1 Comparadas com o Anticorpo Anti-PD-L1 [00689] Este Exemplo descreve a avaliação da citotoxicidade in vitro de células tumorais MC38 transduzidas com huPD-L1. Células tumorais MC38, não transduzidas ou transduzidas com huPD-L1, foram tratadas com Mitomicina-C e plaqueadas com células pan-T humanas marcadas com CFSE em uma razão de 1:5. A variante CD80 IgV-Fc, contendo E35D/M47I/L70M (SEQ ID NO: 125), com Fc lgG1 WT ou Fc inerte foi adicionada a células tumorais MC38 a 100 nM ou 10 nM e cultivadas com células durante 72 horas. Como controle, foi também avaliado um anticorpo anti-PD-1 exemplificativo, nivolumab ou um controle Fc (inerte) apenas. As células foram então colhidas e coradas com corante de viabilidade 7-AAD. Após a aquisição das amostras em um citômetro de fluxo, a porcentagem de células mortas foi calculada usando a análise do Flowjo, controlando as células 7-AAD+ no CFSEgate. Como mostrado na Figura 18, observou-se citotoxicidade aumen
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471/474 tada contra células tumorais MC38 transduzidas com huPD-L1, mas não as células parentais MC38 não transduzidas, por várias moléculas de IgV-Fc CD80 exemplificativas avaliadas. Neste ensaio, a atividade citotóxica não foi observada na presença do anticorpo anti-PD-1 de controle, indicando que as moléculas variantes de CD80 IgV Fc exibem atividade melhorada em comparação com o controle do anticorpo anti-PD-1.
EXEMPLO 19
Ligação de Variante CD80 a Células T Primárias Humanas e Monócitos [00690] Avaliou-se a ligação de variantes exemplificativas de moléculas de Fc CD80-lgV a células CD4 humanas T CD28+ primárias e monócitos PD-L1+ humanos. As variantes exemplificativas das moléculas CD80 IgV-Fc que foram avaliadas continham E35D/M47V/N48K/ V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/ A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276), E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280) e E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E (SEQ ID NO: 2284).
[00691] Incubaram-se células T pan humanas n activadas com vias concentraes do CD80 variante de IgV-Fc e depois coraram-se com anti-CD4, anti-CD8 e anti-lgG humana para detectar a porção Fc do CD80 IgV-Fc. Como um controle, a ligação de tipo selvagem CD80-Fc IgV, um controle Fc único aspecto negativo, e um CD28 - ligação ICOSL vlgD-Fc também foi avaliada. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo e a MFI foi determinada usando o software de análise Flowjo. Como mostrado na Figura 19A, as variantes testadas de moléculas de CD80 IgV-Fc demonstraram ligação diferencial a células T humanas primárias, que, em alguns casos, foi superior ao CD80-lgVFc de tipo selvagem.
[00692] Para ligação a PD-L1 expressa em monócitos humanos, as
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472/474
PBMC humanas foram plaqueadas durante a noite na presença de anti-CD3 e anti-CD28. As células foram colhidas no dia seguinte, incubadas com várias concentrações do CD80 variante IgV-Fc ou um controle do anticorpo anti-PD-L1 (durvalumab) e depois coradas com antiCD14 para identificar monócitos e anti-lgG humana para detectar o Fc porção de moléculas CD80 IgV. A ligação foi realizada por citometria de fluxo e a MFI foi determinada usando o software de análise Flowjo. Como mostrado na Figura 19B, todas as variantes de moléculas de CD80 IgV-Fc demonstraram ligação substancialmente maior a monócitos humanos primários do que o CD80 IgV-Fc de tipo selvagem. EXEMPLO 20
Antagonismo do CD80 IgV-Fc Variante do Recrutamento de PD-1 SHP2 Mediado por PD-L1 [00693] Este Exemplo descreve um Ensaio de sinalização Jurkat/PD-1/SHP2 para avaliar o efeito das variantes das moléculas CD80 IgV-Fc para antagonizar o recrutamento da proteína citoplasmática trosfatase fosfatase SHP-2 para PD-1, bloqueando a interação PDL1/PD-1.Em um ensaio exemplificativo, utilizou-se uma linha de células Jurkat contendo um fragmento de β-Galactosidase (β-Gal) recombinante do receptor PD-1 marcado com Doador de Enzima (ED) e um domínio SHP-2 marcado com Enzima Aceitador (EA) (por exemplo, DiscoverX, EUA ; gato. 93-1106C19). No ensaio, o recrutamento de SHP-2 para PD-1 resulta em EA e ED estando próximo a permitir a complementação dos dois fragmentos de enzima formando uma enzima beta-Gal funcional que hidrolisa um substrato para gerar um sinal quimioluminescente.
[00694] K562/OKT3/PD-L1 aAPC foram pré-incubados com várias concentrações de variantes exemplificativas CD80 IgV-Fc (inerte) durante 30 minutos. As variantes exemplificativas das moléculas CD80 IgV-Fc que foram avaliadas continham H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/
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473/474
A71G/D90G (SEQ ID NO: 2276), E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280) e E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E (SEQ ID NO: 2284). Como controle, foram também avaliados o tipo selvagem CD80 IgV-Fc (inerte), um anticorpo anti-PD-L1 e um controle Fc (inerte). Foram adicionadas células Jurkat/PD-1/SHP2 (linha de Recrutamento de Fragmentos de Complementação de Enzima DiscoverX Pathhunter) e as células foram incubadas durante 2 horas. Adicionou-se o substrato para beta-Gal (reagente DiscoverX Bioassay Detection) aos poços, incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro e mediu-se a luciferase em um leitor de microplacas (BioTek Cytation).
[00695] Como mostrado na Figura 20, as variantes exemplificativas das moléculas CD80 de IgV-Fc diminuíram a atividade da luciferase, consistente com a observação de que as moléculas variantes de CD80 IgV-Fc exibiram atividade potente para antagonizar o recrutamento de PD2 de PDP-1 mediada por PD-L1. A potente atividade antagonista também foi observada pelo controle positivo de anti-PD-L1, mas a molécula CD80 IgV-Fc de tipo selvagem não exibiu atividade antagonista de PD-1/PD-L1 como evidenciado por nenhuma diminuição no sinal de luciferase detectado na presença de uma molécula de CD80 IgV-Fc de tipo selvagem.
EXEMPLO 21
Antagonismo Variante CD80 da Ligação B7/CTLA-4 [00696] Para avaliar a capacidade de CD80 vlgD-Fc antagonizar a interação de ligação de CTLA-4 e B7, plaquearam-se células CHO que expressam CTLA-4 humanas de superfície com uma titulação de E35D/M47V/N48K/V68M/K89N (SEQ ID NO: 2250), H18Y/V22A/E35D/ M47V/T62S/A71G (SEQ ID NO: 2275), E18/D46V/L85Q/E88D (SEQ ID NO: 2280), ou CD80 vlgD-Fc de tipo selvagem, ou um anticorpo anti-CTLA-4 (ipilimumab) como um controle positivo. Após lavagem, as
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474/474 células foram incubadas com CD80- Fc de tipo selvagem conjugado com fluorocromo a 25 nM. A proteína competidora fluorescente ligada foi detectada e medida por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 21, todas as variantes CD80 vlgD-Fc, mas não o CD80-Fc de tipo selvagem, antagonizaram a ligação de CD80 a CTLA-4.
[00697] A presente invenção não pretende limitar-se ao âmbito das modalidades particulares divulgadas, as quais são proporcionadas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações às composições e métodos descritos tornar-se-ão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui apresentados. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro âmbito e espírito da divulgação e destinam-se a se incluir no âmbito da presente divulgação.

Claims (146)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polipeptídeo CD80 variante, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica correspondendo a 35, 46, 71, 7, 23, 26, 30, 34, 51, 55, 57, 58, 65, 73, 78, 79, 82 ou 84 com referência à numeração de posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende até 14 modificações de aminoácidos.
  2. 2. Polipeptídeo CD80 variante, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica correspondendo a 35, 46, 71, 7, 23, 26, 30, 34, 51, 55, 57, 58, 65, 73, 78, 79, 82 ou 84 com referência à numeração de posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2, em que o domínio IgV ou seu fragmento de ligação específica é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
  3. 3. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos correspondentes a uma ou mais posições 26, 35, 46, 57 ou 71 com referência à numeração da SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Polipeptídeo CD80 variante, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica
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    2/40 do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18T, H18V, V20A, V20I, V22D, V22I, V22L, E23D,
    E23G, E24D, L25S, A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P,
    A26Q, A26R, A26S, A26T, Q27H, Q27L, T28Y, I30F, I30T, I30V, Y31C, Y31S, Q33E, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R,
    T41S, M42I, M42V, M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I,
    M47L, M47V, M47Y, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, Y53H, K54E, K54N, K54R, N55D, N55I T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, N63A, N63D, L65P, I67L, I67V, V68E, V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S, D76H, E77A,
    G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A,
    V84I, L85E, L85M, L85Q, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87Q, E88V,
    D90P, F92S, F92V, K93T, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M ou L97Q com referência à numeração das posições apresentadas na SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende até 14 modificações de aminoácidos.
  5. 5. Polipeptídeo CD80 variante, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo correspondente a E7D, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18T,
    H18V, V20A, V20I, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S,
    A26D, A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P, A26Q, A26R, A26S,
    A26T, Q27H, Q27L, T28Y, I30F, I30T, I30V, Y31C, Y31S, Q33E,
    Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, E35G, K36R, T41S, M42I, M42V,
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    3/40
    M43L, M43T, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47V, M47Y, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, Y53H, K54E, K54N, K54R, N55D, N55I, T57A, T57I, I58V, 161F, 161V, T62A, T62N, N63A, N63D, L65P, I67L, I67V, V68E, V68I, V68L, I69F, L70M, A71D, A71G, L72V, R73H, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I,
    T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V84A, V84I, L85E, L85M,
    L85Q, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87Q, E88V, D90P, F92S, F92V,
    K93T, R94Q, R94W, E95D, E95V, L97M ou L97Q com referência à numeração das posições apresentadas na SEQ ID NO: 2, em que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
  6. 6. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende:
    a modificação de aminoácidos A26E;
    a modificação de aminoácidos E35D;
    a modificação de aminoácidos D46E;
    a modificação de aminoácidos D46V; ou a modificação de aminoácidos A71G.
  7. 7. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos CD80 variantes compreendem a modificação de aminoácidos M47L.
  8. 8. Polipeptídeo CD80 variante, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo, um domínio IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou ambos, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos selecionadas de I30F/L70P, Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71 D, T57I, M43I/ C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/L70P/E77G, T57A/I69T, N55D/K86M,
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    4/40
    L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/ M47I/D90N, A71D, E81K/A91S, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/ L72V/E95K, V22L/E35G/A71D/L72P, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/ M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/ L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D, M47V/I69F/A71D/V83I, E35D/T57A/A71D/L85Q, H18Y/A26T/E35D/ A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/ A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, H18Y/A71D/L72P/E88V, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71 D/ L72V/L85M, A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V, V22L/E35D/ M43L/A71G/D76H, E35G/K54E/A71D/L72P, L70Q/A71D, A26E/E35D/ M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W, A26E/ Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, E35D/ M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/ E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/M47I, H18Y/ E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/ T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/ E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/ E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/ M47I/L97Q, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/ E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/ M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/ M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/
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    5/40
    M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F, V22A/E35D/V68E/A71 D, Q33L/ E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/ M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/ L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/ T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/ L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/ M47I/N48D/A71G, R29H/E35D/M43V/M47I/I49V, Q27H/E35D/M47I/ L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/ E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/ M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/ M47V/A71G/A91V, I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M, V22D/E35D/ M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/ M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/D46E/M47V/ A71D, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G,
    H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/ L85Q/D90N, Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/ A71G, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/ L70M/A71G, E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/M47V/T62A/A71 D/ K93E, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y, E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q, V22D/ E35D/M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/ D90G/L97R, E35D/A71D/L72V/R73H/E81K, Q33L/E35D/M43I/Y53F/ T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/ L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, e T28Y/Q33H/ E35D/D46V/M47I/A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/
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    M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/
    D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/ 161F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/ M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/ D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/ L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D,
    E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/ N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/ E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/ E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E35D/M47L/L70M, E35D/M47L/ V68M, E35D/D46V/M47L/V68M/E88D, E35D/D46V/M47L/V68M/D90G, E35D/D46V/M47L/V68M/K89N, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/ D46V/M47L/V68M, E35D/D46V/M47L/V70M, E35D/D46V/M47L/V70M/ L85Q, E35D/M47V/N48K/V68M, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/
    L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/ V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/ D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/ Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/ K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/ V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/
    Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/ M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, H18Y/E35D/ M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/ M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/ E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/ L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/
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    7/40
    R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/
    N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/ E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/ E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/ M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/ Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/ E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/ L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/ V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/ V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, E35D/D46V,
    E35D/ V68M, E35D/L85Q, D46V/M47L, D46V/V68M, D46V/L85Q, M47L/V68M, M47L/L85Q, V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L, E35D/ D46V/V68M, E35D/D46V/L85Q, E35D/V68M/L85Q, D46V/M47L/ V68M, D46V/M47L/L85Q, D46V/V68M/L85Q, M47L/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47L/L85Q, E35D/D46V/V68M/L85Q, E35D/M47L/V68M/ L85Q, D46V/M47L/V68M/L85Q, E35D/N48K, E35D/K89N, M47V/ N48K, M47V/V68M, M47V/K89N, N48K/V68M, N48K/K89N, E35D/ M47V/N48K, E35D/M47V/V68M, E35D/M47V/K89N, E35D/N48K/ V68M, E35D/N48K/K89N, E35D/V68M/K89N, M47V/N48K/V68M, M47V/N48K/K89N, M47V/V68M/K89N, N48K/V68M/K89N, E35D/ M47V/N48K/K89N, E35D/M47V/V68M/K89N, E35D/N48K/V68M/K89N, M47V/N48K/V68M/K89N, E35D/D46V/M47V/N48K/V68M, E35D/D46V/ M47V/V68M/L85Q, E35D/D46V/M47V/V68M/K89N, E35D/M47V/ N48K/V68M/L85Q, E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N, A26E/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/ A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D90G, H18 Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/
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    8/40
    D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G, E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26E/V68M/A71G/
    D90G, H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/D90G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M, A26E/M47L/V68M/A71G/D90G, A26E/ E35D/V68M/A71G/D90G, A26E/E35D/M47L/A71G/D90G, A26E/E35D/ M47L/V68M/D90G, A26E/E35D/M47L/V68M/A71G, H18Y/E35D/V68M/ A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/ D90G, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G, H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G, H18Y/ A26E/E35D/V68M/D90G, H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G, H18Y/A26E/ E35D/M47L/A71G, M47L/V68M/A71G/D90G, H18Y/V68M/A71G/
    D90G, H18Y/A26E/A71G/D90G, H18Y/A26E/E35D/D90G, H18Y/ A26E/E35D/M47L, E35D/V68M/A71G/D90G, E35D/M47L/A71G/D90G, E35D/M47L/V68M/D90G, E35D/M47L/V68M/A71G, A26E/V68M/
    A71G/D90G, A26E/M47L/A71G/D90G, A26E/M47L/V68M/D90G,
    A26E/M47L/V68M/A71G, A26E/E35D/A71G/D90G, A26E/E35D/V68M/ D90G, A26E/E35D/V68M/A71G, A26E/E35D/M47L/D90G, A26E/ E35D/M47L/V68M, H18Y/M47L/A71G/D90G, H18Y/M47L/V68M/ D90G, H18Y/M47L/V68M/A71G, H18Y/E35D/A71G/D90G, H18Y/ E35D/V68M/D90G, H18Y/E35D/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/ D90G, H18Y/E35D/M47L/A71G, H18Y/E35D/M47L/V68M, H18Y/ A26E/V68M/D90G, H18Y/A26E/V68M/A71G, H18Y/A26E/M47L/D90G, H18Y/A26E/M47L/A71G, H18Y/A26E/M47L/V68M, H18Y/A26E/E35D/ A71G, H18Y/A26E/E35D/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G,
    H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/ M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/ E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/ E35D/M47 V/V68 M/A71G/D90G, Η18 Y/A26P/E35D/M471/V68 M/A71G,
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  9. 9/40
    H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/ D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26S/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26Q/
    E35D/ M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/ M47I/ V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K, H18Y/A26N/E35D/M47F/ V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G, H18Y/ A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/ V68M/A71G/D90P, e H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/ D90G, com referência à numeração das posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2.9. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/E35D, E35D/D46E, E35D/D46V, E35D/M47I, E35D/M47L,
    E35D/M47V, E35D/V68M, E35D/L85M, E35D/L85Q, D46E/M47I,
    D46E/M47L, D46E/ M47V, D46V/M47I, D46V/M47L, D46V/M47L,
    D46E/V68M, D46V/V68M, H18Y/M47I, H18Y/M47L, H18Y/M47V,
    M47I/V68M, M47L/V68M ou M47V/V68M, M47I/ E85M, M47L/E85M, M47V/E85M, M47I/ E85Q, M47L/E85Q ou M47V/E85Q.
  10. 10. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/M47I, E35D/M47L, E35D/M47V ou E35D/V68M.
  11. 11. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/M47L/V68M ou E35D/M47V/V68M.
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  12. 12. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio do PDL1 humano em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio do PD-L1 humano.
  13. 13. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a afinidade é aumentada em mais do que 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 80 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 400 vezes, ou 450 vezes em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
  14. 14. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71 D, T57I, M43I/ C82R, V22L/M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/A71 D, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/P74S/ E81G/E95D, A71D, T13A/I61N/A71 D, E81K, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I,
    K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/ I61V/A71D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/ V84I, V20I/M47V/A71 D, A71D/L72V/E95K, E35D/A71D, E35D/ I67L/A71D, T13R/M42V/M47I/A71 D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/ A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/ D46V/L85Q, M47V/I69F/A71D/V83I, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K,
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    N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/A71 D, T41S/T57I/L70R, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M, V22L/E35D/M43L/A71G/
    D76H, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/ K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E, A26E/Q33R/E35D/ M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/ Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/E35D/ M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/E35D/ D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/M47V/ T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/ M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/ L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/ M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/ L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/ K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q, Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/ E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/ N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F, Q33L/E35D/ M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/ L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/
    L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/ T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M, Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/ L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/ M47I/N48D/A71G, Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/ D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/ Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/ D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q’ E35D/M47V/A71G/E88D, E35D/ A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/M47V/A71G/A91V, V22D/E35D/
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    M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/ M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/A71D/D90G, E35D/T41S/M43I/ A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/ A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N, Q27H/
    E35D/ D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G, E35D/D46V/ M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G, E35D/ D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E, E35D/ M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y, V22D/E35D/M47L/ L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/M38T/D46E/M47V/N48S,
    Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/ L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/ T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/ M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/ M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/ A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/E35D/M47I, E35D/D46E/L85M,
    E35D/D46E/A91G, E35D/D46E, E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/ E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/ R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/E35D/M47V/N48K, A26E/ Q27R/ E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N, E35D/M47L/ V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L, Q33R/ M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/
    L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/ A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M, E35D/D46E/ M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q, E35D/
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    M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/ E95V/ L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, E35D/M47V/N48K/ V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/L85M, E35D/M47V/
    V68IW L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/T41S/D46E/M47I/ V68M/K93R/E95V, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/ D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, H18Y/ E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/ M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/ E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/ A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/ M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M, H18Y/ V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/ V68M/L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M, R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, S21P/E35D/K37E/ D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L, T13R/ E35D/M47L/V68M, T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/ V68IW L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47V/ T62S/ V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, T13R/Q33R/ E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68IW L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q, T13R/ Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M, V22D/ E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/ A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/ A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/ A71G/ D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/
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    V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/ M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/E35D/ M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/ A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/ D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26S/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/ A71G/ D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18V/A26Q/ E35D/ M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26P/E35D/ M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K, H18Y/A26N/E35D/M47F/ V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G, H18Y/ A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/ V68M/A71G/D90P, ou H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/ D90G, com referência à numeração das posições definidas em SEQ ID NO: 2.
  15. 15. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9 e 11 a 13, caracterizado pelo fato de que as modificações de aminoácidos compreendem E35D/M47I/L70M.
  16. 16. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que as modificações de aminoácidos incluem E35D/M47V/N48K/V68M/K89N.
  17. 17. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que as modificações de aminoácidos compreendem H18Y/A26E/E35D/M47L/ V68M/A71G/D90G.
  18. 18. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que as modificações de aminoácidos compreendem E35D/D46E/M47V/V68M/
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    D90G/K93E.
  19. 19. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que as modificações de aminoácidos compreendem E35D/D46V/M47L/V68M/ L85Q/E88D.
  20. 20. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o CD80 não modificado compreende (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequências para SEQ ID NO: 2; ou (iii) é uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou fragmentos de ligação específica do mesmo.
  21. 21. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante é ou compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
  22. 22. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é uma única porção CD80 do polipeptídeo CD80 variante.
  23. 23. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 modificações de aminoácidos.
  24. 24. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 2297-2507 ou 2930-2960 ou um fragmento de ligação específica do mesmo, ou uma sequência de aminoá
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    16/40 cidos que exibe pelo menos 95% de sequência identidade com qualquer das SEQ ID NOS: 3-75, 2009-2104, 2297-2507, ou 2930-2960 ou um fragmento de ligação específica do mesmo e que contém uma ou mais das modificações de aminoácidos das mesmas; ou a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOS: 77-149, 151 a 223, 2105-2296, 2508-2929 ou 29613022 ou um fragmento de ligação específica do mesmo, uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 77-149, 151-223, 21052296, 2508-2929, ou 2961-3022 ou um fragmento de ligação específica do mesmo e que contenha uma ou mais das modificações de aminoácidos das mesmas.
  25. 25. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 199, 208, 2250, 2276, 2280 ou 2284.
  26. 26. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que:
    o polipeptídeo CD80 variante não possui o domínio transmembranar CD80 e o domínio de sinalização intracelular; e/ou o polipeptídeo CD80 variante não é capaz de ser expresso na superfície de uma célula.
  27. 27. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante está ligado a uma porção que aumenta a meia-vida biológica do polipeptídeo.
  28. 28. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante está ligado a um domínio de multimerização.
  29. 29. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com a reivindi
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    17/40 cação 28, caracterizado pelo fato de que o domínio de multimerização é um domínio Fc ou é um domínio Fc variante com função efetora reduzida.
  30. 30. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que é uma proteína imunomoduladora transmembranar, em que o polipeptídeo CD80 variante compreende ainda um domínio transmembranar e/ou um domínio de sinalização citoplasmático.
  31. 31. Proteína imunomoduladora, caracterizada pelo fato de que a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreendendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes.
  32. 32. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o multímero é um dímero, opcionalmente um homodímero.
  33. 33. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais.
  34. 34. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizada pelo fato de que o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc de uma imunoglobulina, opcionalmente em que a proteína imunoglobulina é humana e/ou a região Fc é humana.
  35. 35. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a região Fc é de imunoglobu
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    18/40 lina G1 (lgG1) ou uma proteína imunoglobulina G2 (lgG2).
  36. 36. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de que a região Fc apresenta uma ou mais funções efetoras.
  37. 37. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizada pelo fato de que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc.
  38. 38. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc de tipo selvagem, sendo que a dita região Fc variante exibe uma ou mais funções efetoras que são reduzidas em comparação com a região Fc de tipo selvagem, opcionalmente, em que o Fc humano de tipo selvagem é de lgG1 humana.
  39. 39. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a substituição de aminoácidos N297G, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
  40. 40. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos R292C/N297G/V302C, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
  41. 41. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A/L235E/G237A, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
  42. 42. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizada pelo fato de que a regi
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    19/40 ão Fc variante compreende ainda a substituição de aminoácidos C220S, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.
  43. 43. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende K447del, em que o resíduo é numerado de acordo com o índice EU de Kabat.
  44. 44. Proteína imunomoduladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 29.
  45. 45. Proteína imunomoduladora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 44, caracterizada pelo fato de que a proteína imunomoduladora exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1.
  46. 46. Proteína imunomoduladora, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo CD80 variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, ligado, direta ou indiretamente, através de um ligante, a um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio de superfamília de imunoglobulina (IgSF) de um membro da família de IgSF.
  47. 47. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o domínio IgSF é um domínio IgSF modificado por afinidade, sendo que o dito domínio IgSF modificado por afinidade compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em comparação com o domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF.
  48. 48. Proteína imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o domínio IgSF é um domínio IgSF modificado por afinidade que exibe uma ligação aumentada a um
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    20/40 ou mais dos seus parceiros de ligação cognatos em comparação com a ligação do domínio IgSF não modificado ou de tipo selvagem do membro da família IgSF para o mesmo um ou mais parceiros de ligação cognatos.
  49. 49. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, ligado a uma porção de direcionamento que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula.
  50. 50. Conjugado, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imunológica ou é uma célula tumoral.
  51. 51. Conjugado, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que a porção é uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou nanopartícula.
  52. 52. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que a porção é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.
  53. 53. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que é uma proteína de fusão.
  54. 54. Molécula (ou moléculas) de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, uma proteína imunomoduladora, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 48, ou um conjugado que é uma proteína de fusão, como definido em qualquer uma das reivindicações 49 a 53.
  55. 55. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 54.
  56. 56. Vetor, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão.
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  57. 57. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 55 ou 56.
  58. 58. Método para produzir um polipeptídeo CD80 variante ou uma proteína imunomoduladora, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução da molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 54, ou vetor, como definido na reivindicação 55 ou 56, em uma célula hospedeira sob condições para expressar a proteína na célula.
  59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar ou purificar o polipeptídeo CD80 variante ou proteína imunomoduladora da célula.
  60. 60. Método para manipular uma célula que expressa um polipeptídeo variante de CD80 variante, caracterizado pelo fato de que o método compreende introduzir uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 30, em uma célula hospedeira sob condições em que o polipeptídeo é expresso na célula.
  61. 61. Célula modificada, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, uma proteína imunomoduladora, de como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 48, um conjugado que é uma proteína de fusão, como definido qualquer uma das reivindicações 49 a 53, uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 54, ou um vetor, como definido na reivindicação 55 ou 56.
  62. 62. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que:
    o polipeptídeo CD80 variante não compreende um domínio transmembranar e/ou não é expresso na superfície da célula; e/ou o polipeptídeo CD80 variante é capaz de ser secretado a
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    22/40 partir da célula manipulada quando expresso.
  63. 63. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que:
    o polipeptídeo CD80 variante compreende um domínio transmembranar ou é a proteína imunomoduladora transmembranar, como definida na reivindicação 29; e/ou o polipeptídeo CD80 variante é expresso na superfície da célula.
  64. 64. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula imunológica, opcionalmente uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou um linfócito, opcionalmente uma célula T.
  65. 65. Célula manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizada pelo fato de que a célula compreende ainda um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de células T (TCR)modificadas.
  66. 66. Agente infeccioso, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, uma proteína imunomoduladora, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 47, ou um conjugado que é uma proteína de fusão, como definido em qualquer uma das reivindicações 48 a 52.
  67. 67. Agente infeccioso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o agente infeccioso é uma bactéria ou um vírus.
  68. 68. Agente infeccioso, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o agente infeccioso é um vírus e o vírus é um vírus oncológico.
  69. 69. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo CD80 variante, como definido em
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    23/40 qualquer uma das reivindicações 1 a 30, uma proteína imunomoduladora, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 48, um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 49 a 53, uma célula manipulada, como definida em qualquer uma das reivindicações 61 a 65, ou um agente infeccioso, como definido em qualquer uma das reivindicações 66 a 68.
  70. 70. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  71. 71. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é estéril.
  72. 72. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 69 a 71, em um frasco.
  73. 73. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o frasco é selado.
  74. 74. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 69 a 71, ou o artigo de fabricação, como definido na reivindicação 72 ou 73, e instruções para utilização.
  75. 75. Método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 69 a 71.
  76. 76. Método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a proteína imunomoduladora, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 48.
  77. 77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza-
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    24/40 do pelo fato de que a proteína imunomoduladora é a proteína imunomoduladora, como definida na reivindicação 37, que exibe coestimulação de CD28 dependente de Fc.
  78. 78. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é a proteína imunomoduladora, como definida na reivindicação 44, que exibe coestimulação de CD28 dependente de PD-L1, opcionalmente em que a proteína imunomoduladora compreende o polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 29.
  79. 79. Método para modular uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar as células modificadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 61 a 65.
  80. 80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que as células manipuladas são autólogas ao indivíduo.
  81. 81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 80, caracterizado pelo fato de que a modulação da resposta imunológica trata uma doença ou condição no indivíduo.
  82. 82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 81, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica é aumentada.
  83. 83. Método para aumentar uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreende administrar uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, sendo que o dito polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições em um domínio de IgV ou domínio de IgC ou um fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou de um fragmento de ligação específica do mesmo, em que a proteína imunomoduladora
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    25/40 apresenta coestimulação de CD28 dependente de PD-L1.
  84. 84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
  85. 85. Método de mediação do agonismo de CD28 por costimulação de CD28 dependente de PD-L1 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, sendo que o dito polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou domínio IgC ou o fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 comparado com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD -L1
  86. 86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 85, caracterizado pelo fato de que é para utilização no tratamento de uma doença ou condição.
  87. 87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 86, caracterizado pelo fato de que:
    antes da administração, selecionar um indivíduo para tratamento que tem um tumor compreendendo células positivas para a superfície PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positivas para PD-L1, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor.
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    26/40
  88. 88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a seleção de um indivíduo compreende:
    (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de PD-L1;
    (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies de células positivas para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento.
  89. 89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 88, caracterizado pelo fato de que:
    antes da administração, selecionar um indivíduo para tratamento que tem um tumor compreendendo superfícies celulares positivas para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; ou o indivíduo foi selecionado como tendo um tumor compreendendo superfície de células positivas para CD28, opcionalmente em que as células são linfócitos infiltrantes de tumor, opcionalmente em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+.
  90. 90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que selecionar o indivíduo compreende:
    (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente o ectodomínio de CD28;
    (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente, em que as
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    27/40 células são linfócitos de infiltração tumoral, opcionalmente, em que os linfócitos são células T, opcionalmente células T CD8+; e (c) se a amostra de tecido tumoral compreender um nível detectável de superfícies celulares positivas para CD28, selecionar o indivíduo para tratamento.
  91. 91. Método de seleção de um indivíduo para tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) colocar em contato uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um reagente de ligação capaz de ligar especificamente PD-L1; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado ou sobre as células da amostra de tecido tumoral, opcionalmente em que as células são células tumorais ou células imunológicas que se infiltram no tumor; e (c) se a amostra de tumor compreender um nível detectável de superfície de células positivas para PD-L1, selecionar o indivíduo para tratamento com uma proteína imunomoduladora compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, sendo que o dito polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou no fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
  92. 92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da amostra de tecido tumoral com um reagente de ligação capaz de se ligar especificamente a CD28, em que o indivíduo é selecionado se a amostra de tecido tumoral compreender ainda um nível detectável de linfócitos de infiltração
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    28/40 tumoral positivos para CD28, opcionalmente em que os linfócitos são Células T, opcionalmente células T CD8+.
  93. 93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 e 90 a 92, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido tumoral compreende células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estromais ou qualquer combinação destas.
  94. 94. Método, de acordo com a reivindicação 88 e 90 a 93, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, ligante proteico ou parceiro de ligação, um aptâmero, um afímero, um peptídeo ou um hapteno.
  95. 95. Método, de acordo com a reivindicação 88, 91, 93 ou 94, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação é um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antigeno.
  96. 96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 94, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação compreende um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
  97. 97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
  98. 98. Método, de acordo com a reivindicação 96 ou 97, caracterizado pelo fato de que o domínio IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de ligação.
  99. 99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96 a 98, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante exibe afinidade aumentada para ligação a PD-L1 em comparação com o polipeptídeo CD80 de tipo selvagem ou não modificado.
  100. 100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 e 90 a 99, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a uma porção que é uma por
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    29/40 ção detectável ou uma porção capaz de detecção.
  101. 101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que a porção é uma região Fc.
  102. 102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que a região Fc é não humana, opcionalmente é de camundongo ou coelho.
  103. 103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 e 90 a 102, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imuno-histoquímica, pseudo-imuno-histoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
  104. 104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 103, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar a proteína imunomoduladora ao indivíduo.
  105. 105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 104, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é um multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo CD80 variante ligado a um primeiro domínio de multimerização e um segundo polipeptídeo CD80 variante ligado a um segundo domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero compreendendo o primeiro e segundo polipeptídeos CD80 variantes.
  106. 106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que o multímero é um dímero.
  107. 107. Método, de acordo com a reivindicação 105 ou 106, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo CD80 variante e o segundo polipeptídeo CD80 variante são iguais.
  108. 108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105 a 107, caracterizado pelo fato de que o domínio de multimerização é ou compreende uma região Fc.
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  109. 109. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação a uma região Fc de tipo selvagem, em que a região Fc apresenta uma ou mais funções efetoras que são reduzidas em comparação com a região Fc selvagem, opcionalmente onde o Fc de tipo selvagem é lgG1 humana.
  110. 110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 109, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo a 7, 12, 13, 15, 16, 18, 21, 20, 22, 23, 24, 25, 26,
    27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48,51,
    53, 54, 55, 57, 58, 61,62, 63, 64, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,76,
    77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95 e/ou 97, com referência à numeração de posições apresentadas na SEQ ID NO: 2.
  111. 111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 110, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em um CD80 não modificado ou um fragmento de ligação específica do mesmo, correspondendo a E7D, A12V, T13A, T13R, S15P, S15T, C16R, H18A, H18C, H18F, H18I, H18L, H18T, H18V, H18Y, V20A, V20I, S21P, V22A, V22D, V22I, V22L, E23D, E23G, E24D, L25S, A26D,
    A26E, A26G, A26H, A26K, A26N, A26P, A26Q, A26R, A26S, A26T,
    Q27H, Q27L, Q27R, T28Y, R29C, R29H, I30T, I30V, Y31H, Y31S, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, K34E, E35D, K36R, K37E, M38I, M38T, M38V, T41A, T41S, M42I, M42V, M43I, M43L, M43T, M43V,
    S44P, D46E, D46N, D46V, M47F, M47I, M47L, M47T, M47V, M47Y,
    N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, N48Y, P51A, Y53F, Y53H,
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    K54R, N55D, N55I, T57I, I58V, 161F, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, N63D, N64S, L65P, I67L, I67T, V68A, V68I, V68L, V68M, I69F, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, L72P, L72V, R73S, P74S, D76H, E77A, G78A, T79A, T79I, T79L, T79M, T79P, E81G, E81K, C82R, V83A, V83I, V84A, V84I, L85E, L85M, L85Q, K86E, K86M, Y87C, Y87D, Y87H, Y87N, Y87Q, E88D, E88G, K89E, K89N, D90G, D90K, D90N, D90P, A91G, A91S, A91T, A91V, F92L, F92S, F92V, F92Y, K93E, K93R, K93T, R94L, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q, e L97R, com referência à numeração das posições apresentadas na SEQ ID NO: 2.
  112. 112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 110, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos correspondentes a uma ou mais posições 13, 18, 21, 22, 24, 26, 27, 33, 35, 37, 38, 41,43, 46, 47, 48, 53, 61, 62, 68, 70, 71, 79, 85, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 95 ou 97, opcionalmente em que a uma ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas de T13A, T13R, H18L, H18Y, S21P, V22A, V22D, V22I, V22L, E24D, A26E, A26P, A26S, A26T, Q27H, Q33E, Q33H, Q33K, Q33L, Q33R, E35D, K37E, M38T, M38V, T41A, T41S, M43I, M43L, M43T, M43V, D46E, D46V, M47I, M47L, M47T, M47V, N48D, N48H, N48K, N48R, N48S, N48T, Y53F, Y53H, 161N, 161V, T62A, T62N, T62S, V68A, V68L, V68M, L70M, L70P, L70Q, L70R, A71D, A71G, T79A, T79I, T79L, T79P, L85E, L85M, L85Q, Y87H, Y87N, Y87Q, E88D, E88G, D90G, D90N, A91T, A91V, K93E, K93R, K93T, R94Q, R94W, E95D, E95K, E95V, L97M, L97Q, ou L97R, com referência à numeração de SEQ ID NO: 2.
  113. 113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 112, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais das modificações de aminoácidos são selecionadas de Q27H/T41S/A71D, I30T/L70R, T13R/C16R/L70Q/A71D, T57I, M43I/C82R, V22L/
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    M38V/M47T/A71D/L85M, I30V/T57I/L70P/A71D/A91T, V22I/L70M/ A71D, N55D/K86M, L72P/T79I, L70P/F92S, T79P, E35D/M47I/ L65P/D90N, L25S/E35D/M47I/D90N, S44P/I67T/P74S/E81G/E95D, A71D, T13A/I61N/A71D, E81K, A12V/M47V/L70M, K34E/T41A/L72V, T41S/A71D/V84A, E35D/A71D, E35D/M47I, K36R/G78A, Q33E/T41A, M47V/N48H, M47L/V68A, S44P/A71D, Q27H/M43I/A71D/R73S, E35D/T57I/L70Q/A71 D, M47I/E88D, M42I/I61V/A71 D, P51A/A71D, H18Y/M47I/T57I/A71G, V20I/M47V/T57I/V84I, V20I/M47V/A71 D,
    A71D/L72V/E95K, E35D/A71D, E35D/I67L/A71 D, T13R/M42V/ M47I/ A71D, E35D, E35D/M47I/L70M, E35D/A71D/L72V, E35D/M43L/L70M, A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D, E35D/D46V/L85Q, M47V/I69F/A71 D/ V83I, H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q, E35D/M47L, E23D/M42V/M43I/ I58V/L70R, V68M/L70M/A71D/E95K, N55I/T57I/I69F, E35D/M43I/ A71D, T41S/T57I/L70R, V20I/A71D, E23G/A26S/E35D/T62N/A71 D/ L72V/L85M, V22L/E35D/M43L/A71G/D76H, A26E/E35D/M47L/L85Q, D46E/A71D, Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W, A26E/Q33R/E35D/ M47L/ L85Q/K86E, A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q, E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q, A26E/Q33L/E35D/M47L, H18Y/A26E/ Q33L/E35D/M47L/L85Q, Q33L/E35D/M47I, H18Y/Q33L/E35D/M47I, Q33L/E35D/D46E/M47I, Q33R/E35D/D46E/M47I, H18Y/E35D/M47L, Q33L/E35D/M47V, Q33L/E35D/M47V/T79A, Q33L/E35D/T41S/M47V, Q33L/E35D/M47I/L85Q, Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q, Q33L/E35D/ M47V/L85Q, A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q, Q33R/E35D/K37E/ M47V/L85Q, V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V, E24D/Q33L/E35D/M47V/ K54R/L85Q, S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q, E7D/E35D/M47I/L97Q, Q33L/E35D/T41S/M43I, E35D/M47I/K54R/L85E, Q33K/E35D/D46V/ L85Q, Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G, H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/ L85Q, Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K, Q33K/E35D/M47V/K89E/ K93R, E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W, A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/ K86E/R94W, Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N, H18Y/V20A/
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    Q33L/E35D/M47V/Y53F, Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S, V22A/R29H/ E35D/D46E/M47I, Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W, H18Y/E35D/V68M/ L97Q, Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D, Q33L/E35D/M43V/M47I/ A71G, E35D/M47L/A71G/L97Q, E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q, H18Y/ Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q, E35D/D46E/M47V/L97Q, E35D/D46V/ M47I/A71G/F92V, E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M, Q33L/ E35D/N48K/L85Q/L97Q, E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q, E35D/M47V/ N48K/V68M/K89N, Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G, Q27H/E35D/M47I/ L85Q/D90G, E35D/M47I/L85Q/D90G, E35D/M47I/T62S/L85Q, A26E/ E35D/M47L/A71G, E35D/M47I/Y87Q/K89E, V22A/E35D/M47I/Y87N, H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G, E35D/M47L/A71G/L85Q, E35D/ M47V/A71G/E88D, E35D/A71G, E35D/M47V/A71G, I30V/E35D/ M47V/A71G/A91V, V22D/E35D/M47L/L85Q, H18Y/E35D/N48K, E35D/ T41S/M47V/A71G/K89N, E35D/M47V/N48T/L85Q, E35D/D46E/M47V/ A71D/D90G, E35D/T41S/M43I/A71G/D90G, E35D/T41S/M43I/M47V/ A71G, E35D/T41S/M43I/M47L/A71G, H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/ A71G, H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, E35D/K37E/M47V/ N48D/L85Q/D90N, Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G, V22L/Q27H/E35D/ M47I/A71G, E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D, E35D/T41S/M43V/ M47I/L70M/A71G, E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q, E35D/D46E/M47V/ V68IW D90G/K93E, E35D/M43I/M47V/K89N, E35D/M47L/A71G/L85M/ F92Y, V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q, E35D/T41S/M47V/L97Q, E35D/ Y53H/A71G/D90G/L97R, Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q, E35D/ M38T/D46E/M47V/N48S, Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L, e
    E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q, T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/ A71G, E35D/N48K/L72V, E35D/T41S/N48T, D46V/M47I/A71G, M47I/ A71G, E35D/M43I/M47L/L85M, E35D/M43I/D46E/A71G/L85M, H18Y/ E35D/M47L/A71G/A91S, E35D/M47I/N48K/I61F, E35D/M47V/T62S/ L85Q, M43I/M47L/A71G, E35D/M47V, E35D/M47L/A71G/L85M, V22A/ E35D/M47L/A71G, E35D/M47L/A71G, E35D/D46E/M47I, Q27H/
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    E35D/M47I, E35D/D46E/L85M, E35D/D46E/A91G, E35D/D46E,
    E35D/L97R, H18Y/E35D, Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M, E35D/M47V/ I61V/L85M, E35D/M47V/L85M/R94Q, E35D/M47V/N48K/L85M, H18Y/ E35D/ M47V/N48K, A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q, E35D/D46E/ M47L/V68M/L85Q/F92L, E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D, E24D/Q27R/ E35D/T41S/M47V/L85Q, S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/ A71G/ L85Q/D90N, E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G, H18Y/E35D/M47I/ V68M/A71G/R94L, Q33R/M47V/T62N/A71G, H18Y/V22A/E35D/T41S/ M47V/T62N/A71G/A91G, E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/ D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C, E35D/D46E/M47I/V68M/L85M,
    E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R, E35D/D46E/M47L/V68M/ T79IW L85M, E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q, E35D/D46E/ M47V/V68M/L85Q, E35D/M43I/M47L/V68M, E35D/M47I/V68M/Y87N, E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/ E95V, E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M, E35D/M47V/N48K/V68M/ L85M, E35D/M47V/V68M/L85M, E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D, E35D/ T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V, Η18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/ R94L, H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L, H18Y/E35D/M38I/M47L/ V68IW L85M, H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N, H18Y/E35D/M47I/V68M/ Υ87Ν, H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/ A71G/L85M, H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/ V68IW E95V/L97Q, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/ M47L/Y53F/V68M/A71G, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/ K93R/ E95V, H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V, H18Y/E35D/ M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M, H18Y/E35D/
    V68M/A71G/R94Q/E95V, H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V, Η18Υ/ E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q, H18Y/E35D/ V68M/T79M/L85M, H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M, Q27L/Q33L/ E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M, Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/ L85M, Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M, R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/
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    L85M, S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M, S21P/E35D/K37E/D46E/ M47I/ V68M/R94L, T13R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q27L/Q33L/E35D/ T41S/ M47V/N48K/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/ M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q, T13R/ Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M, T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/ V68M/L85M/R94Q, T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M, T13R/Q33R/E35D/ M47L/ V68M/L85M, V22D/E24D/E35D/M47L/V68M, V22D/E24D/ E35D/M47L/V68M/L85M/D90G, V22D/E24D/E35D/M47V/V68M, H18Y/ E35D/M47V/V68M/A71G, H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G, H18I/ A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G, H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/ A71G, H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G, H18V/A26N/E35D/M47V/ V68M/A71G, H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G, H18V/A26P/E35D/ M47L/V68M/A71G, H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/ E35D/M47I/V68M/A71G, H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G, H18Y/ E35D/ M47V/V68L/A71G/D90G, H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/
    D90G, A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18V/A26G/E35D/M47V/ V68M/A71G/D90G, H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/ A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/ A71G/D90G, H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G, H18A/A26P/ E35D/M47L/V68M/A71G/D90G, H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/ D90G, H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G, H18F/A26H/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G, H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K, H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G, H18Y/A26P/E35D/M47Y/ V68I/A71G/D90G, H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G, H18R/ A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P, ou H18F/A26D/E35D/ D46E/M47T/V68M/A71G/D90G, com referência à numeração das posições estabelecidas na SEQ ID NO: 2.
  114. 114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica
    Petição 870190089532, de 10/09/2019, pág. 3643/3680
    36/40 ções 83 a 113, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende:
    a modificação de aminoácidos H18Y;
    a modificação de aminoácidos A26E;
    a modificação de aminoácidos E35D;
    a modificação de aminoácidos D46E;
    a modificação de aminoácidos D46V;
    a modificação de aminoácidos M47I;
    a modificação de aminoácidos M47L;
    a modificação de aminoácidos V68M;
    a modificação de aminoácidos A71G;
    a modificação de aminoácidos L85Q; ou a modificação de aminoácidos D90G.
  115. 115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 114, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos H18Y/E35D, E35D/D46E, E35D/D46V, E35D/M47I, E35D/M47L, E35D/M47V,
    E35D/V68M, E35D/L85M, E35D/L85Q, D46E/M47I, D46E/M47L,
    D46E/ M47V, D46V/M47I, D46V/M47L, D46V/M47L, D46E/V68M,
    D46V/V68M, H18Y/M47I, H18Y/M47L, H18Y/M47V, H18Y/V68M,
    M47I/V68M, M47L/V68M ou M47V/V68M, M47I/ E85M, M47L/E85M, M47V/E85M, M47I/ E85Q, M47L/E85Q ou M47V/E85Q.
  116. 116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 115, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/M47I, E35D/M47L, E35D/M47V ou E35D/V68M.
  117. 117. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 116, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/M47L/V68M ou E35D/M47V/V68M.
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    37/40
  118. 118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 116, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos E35D/M47I/L70M.
  119. 119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende as modificações de aminoácidos E35D/M47V/ N48K/V68M/K89N.
  120. 120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos H18Y/A26E/E35D/ M47L/V68M/A71G/D90G.
  121. 121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/D46E/M47V/ V68M/D90G/K93E.
  122. 122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende modificações de aminoácidos E35D/D46V/M47L/ V68M/L85Q/E88D.
  123. 123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 122, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é solúvel, opcionalmente, em que o polipeptídeo CD80 variante não possui um domínio de sinalização transmembranar e intracelular de CD80.
  124. 124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 123, caracterizado pelo fato de que o CD80 não modificado compreende (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, (ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ. ID NO: 2; ou (iii) é uma porção de (i) ou (ii) compreendendo um domínio IgV ou fragmentos de ligação
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    38/40 específica dos mesmos.
  125. 125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 124, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante é ou compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
  126. 126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 125, caracterizado pelo fato de que o domínio IgV ou o fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 da proteína imunomoduladora.
  127. 127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 126, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 modificações de aminoácidos.
  128. 128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 127, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é uma proteína de fusão Fc.
  129. 129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 81, 82 e 86 a 128, caracterizado pelo fato de que a doença ou estado é um tumor ou câncer.
  130. 130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 129, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofreu recaída após a remissão, tornou-se refratário ou é um não responsive, após o tratamento com um antagonista de PD-1/PD-L1 ou PD-1/PD-L2.
  131. 131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que o antagonista é um anticorpo anti-PD-1, opcionalmente nivolumab ou pembrolizumab.
  132. 132. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 81, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica é diminuída.
  133. 133. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica
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    39/40 ções 75 a 81 e 132, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença ou condição inflamatória ou autoimune.
  134. 134. Método para detectar um parceiro de ligação a CD80 em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    (a) colocar em contato uma amostra biológica com um reagente de ligação compreendendo um polipeptídeo CD80 variante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30; e (b) detectar a presença do reagente de ligação ligado nas células da amostra biológica.
  135. 135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o parceiro de ligação é PD-L1, CD28, CTLA-4 ou suas combinações.
  136. 136. Método, de acordo com a reivindicação 134 ou 135, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD80 variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos em uma ou mais posições no domínio IgV ou no domínio IgC ou o fragmento de ligação específica do mesmo de um CD80 não modificado ou fragmento de ligação específica do mesmo, em que o polipeptídeo CD80 variante exibe uma afinidade de ligação aumentada ao ectodomínio de PD-L1 em comparação com a afinidade de ligação do CD80 não modificado para o ectodomínio de PD-L1.
  137. 137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 134 a 136, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é ou compreende uma amostra de fluido corporal, célula ou tecido.
  138. 138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é soro, plasma ou urina.
  139. 139. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de tecido tumoral.
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    40/40
  140. 140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido tumoral compreende células imunológicas que se infiltram no tumor, células tumorais, células estremais ou qualquer combinação destas.
  141. 141. Polipeptídeo CD80 variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 134 a 140, em que o polipeptídeo CD80 variante é caracterizado pelo fato de que compreende o domínio IgV ou um fragmento de ligação específica do mesmo.
  142. 142. Método, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que o domínio de IgV ou fragmento de ligação específica do mesmo é a única porção CD80 do reagente de ligação.
  143. 143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 134 a 142, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação está ligado, direta ou indiretamente, a um marcador que é uma porção detectável ou a uma porção capaz de detecção.
  144. 144. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que a porção é uma região Fc.
  145. 145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que a região Fc é não humana, opcionalmente é de camundongo ou coelho.
  146. 146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 134 a 145, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença de reagente de ligação ligado é por imuno-histoquímica, pseudoimuno-histoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA ou imunotransferência.
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