CN102822198B - Ctla4蛋白和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CTLA4蛋白，以及所述蛋白的用途，例如治疗与免疫反应调节异常相关的疾病。

Description

CTLA4蛋白和其用途
相关申请案的交叉参考
本申请案要求2010年3月12日提交的美国临时申请案第61/313,516号的权益，所述临时申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请案含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式呈交且因此以全文引用的方式并入本文中。2011年2月11日创建的所述ASCII复本是命名为237US161.txt且大小为498,294个字节。
技术领域
本发明涉及CTLA4蛋白、包含CTLA4蛋白的医药组合物、和所述蛋白的治疗用途。
背景技术
T细胞淋巴细胞通过提供对特定病原体的适应性反应而在细胞介导的免疫中起关键作用。T细胞活化取决于至少两种信号传导途径的活化，其中一种途径为抗原特异性，另一种途径为抗原非特异性。T辅助细胞抗原性反应需要通过T细胞受体与在抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC(主要组织相容性复合体)所结合的抗原结合而活化第一信号传导途径。抗原性反应还需要通过T细胞表面上的CD28蛋白与APC表面上的CD80(B7-1)及CD86(B7-2)结合而活化可产生共刺激信号的第二信号传导途径。因为抗原特异性信号不足以产生完全抗原性反应，所以无共刺激的T细胞受体/抗原-MHC结合可导致克隆失活或无反应性(anergy)。(参看例如坚金斯(Jenkins)等人,1993,免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)5:361)。共刺激途径不仅在T细胞活化和分化中起作用，而且在组织迁移和外周耐受性诱导中起作用。(参看萨洛蒙(Salomon)等人,2001,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)19:225)。
经活化的T细胞还在其细胞表面上表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，CTLA4为以较高亲和力结合CD80和CD86的CD28同系物。CTLA4表达引起竞争性结合CD80和CD86、阻断CD80/86-CD28相互作用以及终止T细胞活化。因为这些信号传导途径决定T细胞对抗原的反应以及对抗原的下游反应的量值，所以例如通过阻断CD80/CD86与CD28和/或CTLA4之间的一种或一种以上相互作用而调节一种或一种以上共刺激信号的药剂可有效治疗由细胞介导的免疫反应调节异常所引起的病症。(参看例如穆勒(Mueller)等人,1989,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)7:445)。
适合破坏CD80/86-CD28相互作用的药剂包括抗体和融合蛋白。举例来说，在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型中，使用抗CD80和抗CD86抗体阻断T细胞。(参看拉克(Racke)等人,1995,临床研究杂志(J.Clin.Invest.)96:2195)。在另一实例中，抗CD80和抗CD86抗体用于阻断2型活体内免疫反应(即由IgG抗体介导且针对细胞表面或基质抗原的免疫反应)和IL-4产生。(格里沃尔德(Greenwald)等人,1997,免疫学杂志(J.Immunol.)158:4088)已证明CD28-Ig融合蛋白与树突状细胞上的CD80和/或CD86相互作用且使其活化，由此导致在活体内产生增强的T细胞介导免疫反应的可溶性CD28的辅助活性。(奥拉博纳(Orabona)等人,2004,自然免疫学(Nature Immunol.)5(11):1134)。或者，CTLA4-Ig融合蛋白已用于破坏CD80/86-CD28相互作用。(参看例如麦肯泰尔(McIntyre)等人,2005,未来药物(Drugs of the Future),30:873)。
对T细胞活化和共刺激途径的新近研究表明CD80和CD86可在免疫反应中，尤其在自身免疫性方面起不同作用。因此，已显示仅阻断CD80或CD86之一与CD28的结合会在活体内产生不同影响，其视所研究的疾病和投药时序而定(参看萨洛蒙(Salomon),2001,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)19:225；库齐罗(Kuchroo)等人,1995,细胞(Cell)80:707；拉克(Racke)等人,1995,临床研究杂志(J.Clin.Invest.)96:2195；兰斯乔(Lenschow)等人,1995,实验医学杂志(J.Exp.Med.)181:1145；和格里沃尔德(Greenwald)等人,免疫学杂志(J.Immunol.),1997,158:4088)。
当前正在开发结合CTLA4且破坏CTLA4对CD28介导的T细胞反应的抑制的抗体以用于治疗各种癌症。人类抗CTLA4 IgG1抗体易普利姆玛(Ipilimumab)正处于黑素瘤的III期试验中以及乳癌和前列腺癌的II期试验中。人类抗CTLA4 IgG2抗体曲美利姆玛(Tremelimumab)正处于前列腺癌、膀胱癌和结肠直肠癌的II期试验中。
结合CD80和/或CD86且破坏与CTLA4和CD28的相互作用的融合蛋白为用于开发免疫调节剂的良好候选者。融合蛋白允许工程改造例如溶解性、稳定性、可传递性和/或活性改进的蛋白质。一种此类免疫调节剂为可溶性融合蛋白阿巴西普(abatacept)其经开发用于治疗类风湿性关节炎(RA)和幼年特发性关节炎，攻击关节、导致最终会引起骨侵蚀和关节变形的疼痛膨胀的自身免疫病症。
阿巴西普为一种CTLA4-Ig融合蛋白，其由人类CTLA4的细胞外域以及人类免疫球蛋白G1(IgG1)的包括铰链、CH2和CH3域的经修饰Fc部分组成。CTLA4域提供结合活性且咸信Fc部分提供稳定性、溶解性和可传递性。阿巴西普抑制T细胞上的CD28与APC细胞上的CD80和/或CD86蛋白的相互作用，由此导致T细胞活化受抑制。(参看例如史瓦兹(Schwartz),1992,细胞(Cell)71:1065)。因此，投与阿巴西普可导致T细胞增殖、活化和信号传导的减少，且减弱类风湿性关节炎中的自身免疫反应。称为贝拉西普(belatacept)的第二代可溶性重组CTLA4-Ig融合蛋白有两个氨基酸与阿巴西普不同且对CD80和CD86具有较大结合亲和力。贝拉西普正处于进行中的用于肾和其它器官移植的III期试验中。(参看林赛(Linsley)等人,2009,免疫学评论(Immunol.Reviews)229:307-321)。第三种融合蛋白MAXY-4，一种来源于阿巴西普但对CTLA4标靶的结合增加的蛋白质，当前正处于由普塞德治疗剂有限责任公司(Perseid Therapeutics,LLC)和阿斯特拉制药公司(Astellas Pharma,Inc.)进行的临床前开发中用于治疗自身免疫疾病和移植排斥反应。
使用阿巴西普的疗法可能导致成本过高。阿巴西普的具有较高亲和力的变体可降低所需的有效治疗剂量且因此降低疗法成本。此外，由于为达成有益结果所需的药剂较少，所以显现对药剂自身的免疫原性反应的风险也可降低。其它副作用也可减少。需要提供与CD80和CD86蛋白的结合有差异的改进的融合蛋白，例如通过产生对一种同功异型物的相对亲和力相对于另一者较高的变体。所述改进的变体可提供对特定病况或病变的靶向免疫调节。在CTLA4-Ig和抗CTLA4抗体疗法的一些情况下观测到的不良反应、或免疫反应的恶化也可降低。
在章节2中或在本申请案的任何其它章节中对任何参考文献的引用或鉴别不应解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。
发明内容
本发明涉及能够结合CD80和/或CD86且序列与SEQ ID NO:1(图1A)相关的包含CTLA4结合域的蛋白质。在某些方面，本发明CTLA4蛋白另外包含为非CTLA4蛋白的融合搭配物，例如免疫球蛋白域。
CTLA4具有3个CDR样环，在本文中称为(以氨基端至羧基端的顺序)CDR样环1、CDR样环2和CDR样环3。CTLA4的CDR样环显示于图1B中。
对CTLA4的CDR样环进行全面诱变以产生具有单一点突变的变体群体。接着基于群体中变体的行为筛选变体群体以鉴别所产生的对CD80或CD86的结合亲和力类似或增加的点突变体。
鉴别在群体中的行为指示相对于野生型CTLA4对CD80或CD86的结合亲和力类似或较高的变体。自群体中分离一些变体且进一步表征其生物性质，例如与CD80和CD86的结合(描述于实例1中)、抑制Jurkat细胞分泌IL-2(描述于实例1中)及抑制T细胞增殖(描述于实例2中)。这些变体中的氨基酸取代列于表2、3、5、7、9、10和12中。其它变体不自群体中分离且其结合特征是基于其在群体中的行为。这些变体中称为“候选”突变的氨基酸取代列于表4、6、8、11、13、14中。
因此，本发明提供包含相较于SEQ ID NO:1的CDR样环具有至少1个氨基酸取代的CDR样环的CTLA4蛋白。CDR样环中的示范性取代见于表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中。可(单独或组合)并入本发明CTLA4蛋白中的较佳氨基酸取代包括(但不限于)CDR样环1中的氨基酸取代K28H和A29H。
在某些方面，本发明提供相较于SEQ ID NO:1在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以高亲和力结合CD80和CD86的CTLA4蛋白。CDR样环中导致与CD80和CD86以高亲和力结合的示范性取代见于表2中以及表15的第1行中。
在其它方面，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以高亲和力结合CD80并以中性亲和力(即与阿巴西普相当)结合CD86的CTLA4蛋白。CDR样环中导致与CD80以高亲和力结合及与CD86以中性亲和力结合的示范性取代见于表3、4中以及表15的第2-5行中。
在其它实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以高亲和力结合CD80并以低亲和力结合CD86的CTLA4蛋白。导致与CD80以高亲和力结合且与CD86以低亲和力结合的示范性取代见于表5、6中以及表15的第6行中。
在一些实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以中性亲和力结合CD80并以高亲和力结合CD86的CTLA4蛋白。导致与CD80以中性亲和力结合且与CD86以高亲和力结合的示范性取代见于表7、8、以及表15的第7-8行中。
在各种实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以低亲和力结合CD80并以高亲和力结合CD86的CTLA4蛋白。导致与CD80以低亲和力结合且与CD86以高亲和力结合的示范性取代见于表9中以及表15的第9行中。
在某些实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以中性亲和力结合CD80和CD86的CTLA4蛋白。导致与CD80和CD86以中性亲和力结合的示范性取代见于表10、11以及表15的第10-22行中。
在各种实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以中性亲和力结合CD80并以低亲和力结合CD86的CTLA4蛋白。以中性亲和力结合CD80且以低亲和力结合CD86的示范性取代见于表12、13以及表15的第23-26行中。
在一些实施例中，本发明提供相较于SEQ ID NO:1的CDR样环在CDR样环中具有至少1个氨基酸取代且相较于野生型CTLA4结合域以低亲和力结合CD80并以中性亲和力结合CD86的CTLA4蛋白。以低亲和力结合CD80且以中性亲和力结合CD86的示范性取代见于表14中以及表15的第27-34行中。
在某些实施例中，本发明提供一种变体CTLA4多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自K28H、K28T、A29H、T51Y、M53F、M53Y、L58G、L61H、L61Y、K93M和K93Q的氨基酸取代。
在其它实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自L58A、L58N、L58Q、L61A、K93V、L104H和L104Y的氨基酸取代。
在其它实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自T30E、M54R、G55P、E57P、L58E、L58P、L58Y、L61F和L104I的氨基酸取代。
在各种实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1包括氨基酸取代K93I。
在其它实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自L58H、L58K和D62H的氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1包括至少1个选自M54W和M54Y的氨基酸取代。
在其它实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自R33D和L61W的氨基酸取代。
在其它实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自A29K、T51N、M53W、L96K和L96R的氨基酸取代。
在各种实施例中，本发明提供一种变体CTLA4多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自G27A、Y52F、N56T和L104M的氨基酸取代。
在某些实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自以下的氨基酸取代：P26I、P26L、P26M、P26Q、P26T、P26V、K28R、A29P、A29S、T30H、T30M、T30S、V32E、R33P、T51A、Y52H、Y52M、Y52W、M53D、M54D、M54G、M54H、M54L、G55D、G55H、G55T、N56A、N56F、N56G、N56H、N56I、N56K、N56L、N56M、N56Q、N56R、N56S、N56V、N56Y、E57A、E57D、E57H、E57K、E57M、E57N、E57Q、E57R、E57S、E57T、E57V、L58I、L58R、L58T、T59I、T59M、T59N、T59Q、T59R、T59S、T59V、L61E、L61I、L61M、L61T、L61V、D62R、D63E、D63G、D63H、D63T、K93G、V94G、V94I、E95W、P99H、P99T、P99L和Y102T。
在各种实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1包括氨基酸取代K28Y。
在某些实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自以下的氨基酸取代：P26N、G27I、G27Q、G27W、K28E、K28I、K28M、K28P、K28Q、K28V、T30I、T30L、M53E、M53L、M53N、M54A、M54Q、M54S、L58D、L58V、T59H、T59K、T59L、T59P、L61D、L61G、L61Q、L61R、D62A、D62E、D62S、D63Q、D63S和K93R。
在一些实施例中，本发明提供一种与SEQ ID NO:1的氨基酸21到112具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的变体CTLA4多肽，其中所述变体多肽相较于SEQ ID NO:1具有至少1个选自以下的氨基酸取代：P26R、G27D、G27P、A29N、T30K、E31D、E31G、E31P、E31R、E31T、V32G、V32H、V32T、R33E、R33G、R33I、R33M、R33N、R33Q、R33W、R33Y、T51E、T51G、T51I、T51V、Y52A、Y52D、Y52I、Y52K、Y52L、Y52Q、Y52R、Y52S、Y52T、M53H、M53P、M53S、G55A、G55I、G55L、G55N、G55Q、G55R、G55Y、E57G、E57I、E57W、E57Y、T59D、T59G、T59Y、F60D、F60G、F60H、F60L、D62G、D62I、D62W、D63A、D63Y、K93D、K93H、K93N、K93P、K93W、V94A、V94D、V94H、V94N、V94P、V94R、V94T、V94W、E95G、E95I、E95K、E95P、E95Q、E95R、E95S、E95T、E95V、E95Y、L96A、L96G、L96H、L96M、L96P、L96Q、M97D、M97G、M97I、M97N、M97S、M97V、P99I、P99M、P99W、P99Y、P100H、P100L、P100T、P100V、P100W、P101L、Y102H、Y103H、Y103L、Y103P、Y103T和L104P。
本发明的变体CTLA4蛋白可包含选自表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以及16-1到16-6中的一者或一者以上的一个或一个以上其它突变或突变的组合。
在某些方面，相较于阿巴西普(SEQ ID NO:6)，本发明的变体CTLA4多肽的CDR样环中的突变不包含(a)A29K；(b)M53E；(c)L61Y；(d)L104M；(e)R33P；(f)T59I；(g)L61F。在其它方面，相较于阿巴西普(SEQ ID NO:6)，本发明的变体CTLA4多肽的CDR样环中的突变不由以下组成：(a)A29K；(b)M53E；(c)L61Y；(d)L104M；(e)R33P；(f)T59I；(g)L61F；(h)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的两者或两者以上的组合；或(i)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的三者或三者以上的组合。举例来说且不加以限制，在特定实施例中，相较于阿巴西普(SEQ ID NO:6)，本发明的变体CTLA4多肽的CDR样环中的突变不包含以下或不由以下组成：(1)A29K和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F；(2)M53E和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F；(3)L61Y和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、M53E、L104M、R33P、T59I和L61F；(4)L104M和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、M53E、L61Y、R33P、T59I和L61F；(5)R33P和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、M53E、L61Y、L104M、T59I和L61F；(6)T59I和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P和L61F；或(7)L61F和任选的1个、2个或2个以上取代，这些取代独立地选自A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P和T59I。
在某些方面，变体CTLA4多肽为融合蛋白。在某些实施例中，融合搭配物为免疫球蛋白恒定域，例如IgG1。
在各种方面，本发明CTLA4蛋白具有与野生型CTLA4结合域的氨基酸序列(SEQ IDNO:1的氨基酸21到112)或与野生型CTLA4细胞外域(SEQ ID NO:1)具有至少75%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在各种方面，相较于SEQ ID NO:1的CDR样环，本发明CTLA4蛋白在CDR样环中具有多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、或多达10个氨基酸取代。
本文提供包含编码本发明CTLA4蛋白的核苷酸序列的核酸，还提供包含核酸的载体。另外，本文提供经包含编码CTLA4蛋白的核苷酸序列的载体转化的原核和真核宿主细胞，以及经工程改造以表达所述核苷酸序列的真核(例如哺乳动物)宿主细胞。还提供通过培养宿主细胞来产生CTLA4蛋白的方法。
本发明CTLA4蛋白适用于治疗癌症、自身免疫疾病和细胞、器官或组织移植物的排斥反应。在某些方面，CTLA4蛋白适用于治疗选自类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎的自身免疫疾病。
应注意，除非本文另外明确规定，否则在本申请案中按照专利申请案中通常所见来使用不定冠词“一个(种)(a)”和“一个(种)(an)”以及定冠词“所述(the)”，意思是一个(种)或一个(种)以上。另外，在本申请案中按照专利申请案中通常所见来使用术语“或(or)”，意思是分离性的“或”或连接性的“和”。
本说明书中提及的所有公开案都以引用的方式并入本文中。本说明书中已包括的对文件、法案、材料、装置、物品等的任何论述仅出于为本发明提供内容的目的。其不应视为承认任何或所有这些要素形成现有技术基础的一部分或为与本发明相关的领域中的普通常识，就如同其在本申请案的优先权日期之前已普遍存在一般。
本发明的特征及优点经由其实施例的以下具体实施方式将变得更明显。
表格和附图说明
表1显示野生型CTLA4-Ig的CDR样环中的氨基酸的编号。
表2显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可增加对CD80和CD86的亲和力。
表3显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可增加对CD80的亲和力但不实质上影响CD86结合。
表4显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD80的亲和力，同时不实质上影响CD86结合的候选突变。
表5显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可增加对CD80的亲和力且减小对CD86的亲和力。
表6显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD80的亲和力且减小对CD86的亲和力的候选突变。
表7显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可增加对CD86的亲和力，同时不实质上影响CD80结合。
表8显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD86的亲和力，同时不实质上影响CD80结合的候选突变。
表9显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可减小对CD80的亲和力且增加对CD86的亲和力。
表10显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示不实质上影响与CD80或CD86结合。
表11显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中且不实质上影响与CD80或CD86结合的候选突变。
表12显示野生型CTLA4 CDR样环中的突变，结合研究指示可减小对CD86的亲和力，同时不实质上影响与CD80结合。
表13显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以减小对CD86的亲和力，同时不实质上影响CD80结合的候选突变。
表14显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以减小对CD80的亲和力，同时不实质上影响CD86结合的候选突变。
表15显示野生型CTLA4 CDR样环中可并入本发明CTLA4蛋白中的已知突变。第1行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD80和CD86的亲和力的已知突变。第2-5行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD80的亲和力，同时不实质上影响CD86结合的已知突变。第6行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD80的亲和力，同时减小对CD86的亲和力的已知突变。第7-8行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD86的亲和力，同时不实质上影响CD80结合的已知突变。第9行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以增加对CD86的亲和力，同时减小对CD80的亲和力的已知突变。第10-22行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中且不实质上影响CD80或CD86结合的已知突变。第23-26行显示可并入野生型CTLA4CDR样环中以减小对CD86的亲和力，同时不实质上影响对CD80的亲和力的已知突变。第27-34行显示可并入野生型CTLA4 CDR样环中以减小对CD80的亲和力，同时不实质上影响对CD86的亲和力的已知突变。
表16-1到16-6显示野生型CTLA4 CDR样环中可并入本发明CTLA4蛋白中的已知突变。
图1A-1C。图1A显示人类CTLA4细胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。通过目视检查报导的CTLA4共晶体结构鉴别CDR样环中的氨基酸(加下划线)。(史瓦兹(Schwartz)等人,2001,自然(Nature)410:604；斯塔皮尔(Stamper)等人,2001,自然(Nature)410:608)。图1B显示野生型CTLA4的CDR样环的序列以及相应序列标识符。图1C显示以下的比对：(i)全长人类CTLA4细胞外域且含有跨膜域(基因库登录号NM_005214；SEQ ID NO:5)，(ii)如美国专利第5,434,131号中所述的阿巴西普(SEQ ID NO:6)；和(iii)人类Fcγ1(SEQ ID NO:7)。野生型CTLA4-Ig的细胞外域包含hCTLA4的氨基酸1-124，其对应于CTLA4细胞外域。CTLA4经由位置120处的半胱氨酸残基二聚化。阿巴西普在位置125处具有谷氨酰胺残基，所述谷氨酰胺残基在hCTLA4细胞外域与人类Fcγ1的接点处。hFcγ1的CH1区在相等位置处含有缬氨酸。具有IgG1m(a)异型的人类Fcγ1区在位置126处起始且为斜体。存在于Fcγ1中且牵涉于二硫桥键中的在位置130、136和139处的半胱氨酸残基在阿巴西普中已突变成丝氨酸。Fcγ1的CH2区中的位置148在阿巴西普中从脯氨酸突变成丝氨酸。(戴维斯(Davis)等人,2007,风湿病学杂志(J.Rheumatol.)34(11):2204)。
图2A-2B显示如通过竞争所测量的新颖CTLA4-Ig变体与CD80和CD86的结合。显示对CD80和CD86中至少一者的结合改进的变体的相对结合活性显示于图2A中。显示对CD80和CD86中至少一者的结合相等的变体的相对结合活性显示于图2B中。空心和实心条分别指示关于CD80和CD86的结合数据。数据用获自野生型CTLA4-Ig的IC50值校正，且显示为来自两组独立实验的平均改进倍数。证实在CH2域中含有突变P148S突变的阿巴西普的结合活性对配体结合的影响可忽略。稀释曲线的各数据点在分析板中一式两份重复。野生型CTLA4-Ig对CD80和CD86的平均IC50值分别测定为0.89nM±0.26和4.26nM±0.76。误差棒表示获自一式两份重复实验的值的范围。
图3显示如通过竞争所测量的已知CTLA4-Ig变体与CD80和CD86的结合活性。
图4A-4C显示野生型和CTLA4-Ig变体抑制Jurkat T细胞在经受刺激时产生IL-2的能力。图4A显示在野生型CTLA4-Ig或对照抗体存在下，Jurkat T细胞在用表达CD80或CD86的CHO-K1细胞刺激时产生的IL-2。图4B显示用滴定量的商业阿巴西普或野生型CTLA4-Ig或自行制得的贝拉西普获得的完全抑制曲线。图4C显示所选本发明CTLA-Ig变体抑制IL-2产生的相对效能，其用获自野生型CTLA4-Ig的IC50值校正。误差棒表示得自一式两份重复实验的值的范围。
图5A-5E显示野生型和CTLA4-Ig变体抑制初级同种异体刺激的T细胞增殖的能力。符号表示一式三份重复测定的平均值。数据代表至少3个独立实验。
图6A-6D显示野生型和CTLA4-Ig变体抑制二级同种异体刺激的T细胞增殖的能力。符号表示一式三份重复测定的平均值。数据代表至少3个独立实验。
具体实施方式
本发明提供抑制或遏制免疫反应的新颖多肽，其包含CTLA4的变异型CD80-和/或CD86结合片段(“CTLA4结合域”)。本发明多肽包含至少1个具有一个或一个以上维持或改变CTLA4与CD80和/或CD86的结合性质的氨基酸取代的CTLA4结合域。任选地，变异型CTLA4结合域融合至不同(非CTLA4)氨基酸序列，例如免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列。这些新颖多肽在本文中统称为“CTLA4蛋白”或“CTLA4多肽”。
1.CTLA4细胞外域
本发明的变体多肽包含序列与CTLA4细胞外域(SEQ ID NO:1)相关的氨基酸序列。CTLA4细胞外域为采用具有3个CDR样环的免疫球蛋白可变折叠的单链多肽。相较于CTLA4，本发明的变体多肽在至少1个CDR样环中含有至少1个维持或改变蛋白质与CD80和/或CD86的结合性质的氨基酸取代。在某些方面，本发明的变体CTLA4多肽结合CD80和/或CD86且阻断其与其各别配体(例如CTLA4或CD28)的相互作用，由此抑制一种或一种以上免疫细胞介导的反应。本发明的变体CTLA4多肽亦可在CTLA4细胞外域的非CDR样环部分中具有氨基酸突变(例如缺失、插入、添加或取代)。CTLA4细胞外域的非CDR样区中的适合突变包括(但不限于)揭示于例如美国专利第5,977,318号；第6,107,056号；第6,750,334号；第7,034,121号；第7,229,962号；第7,432,344号；第7,504,554号；第7,385,045号；第7,105,166号；第6,090,914号；第5,770,197号；和美国专利公开案第2009/0258031号中的突变，以上专利中的每一者均以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本发明的变体CTLA4多肽具有与CTLA4结合域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1的氨基酸21-112)至少75%一致的氨基酸序列。在其它实施例中，本发明的变体CTLA4多肽具有与CTLA4细胞外域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1的氨基酸1-124)至少75%一致的氨基酸序列。在各种实施例中，本发明的变体CTLA4多肽具有与CTLA4结合域的氨基酸序列或与CTLA4细胞外域的氨基酸序列至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，相较于野生型CTLA4细胞外域，本发明的变体CTLA4多肽包含至少1个突变。在其它实施例中，相较于野生型CTLA4结合域，本发明的变体CTLA4多肽包含至少1个突变。在其它实施例中，相较于野生型CTLA4细胞外域或相较于野生型CTLA4结合域，本发明的变体CTLA4多肽包含多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个、多达11个、多达12个、多达13个、多达14个、多达15个、多达16个、多达17个、多达18个、多达19个、或多达20个氨基酸取代。
在某些实施例中，CTLA4细胞外域包括人类CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-124。在各种实施例中，本发明CTLA4多肽为CTLA4细胞外域的CD80-和/或CD86结合片段，其包含与CTLA4的CDR样序列相关的CDR样序列。在某些实施例中，结合片段包含CTLA4细胞外域的一部分，其起始于SEQ ID NO:1的氨基酸1到12之间的任何位置且终止于SEQ IDNO:1的氨基酸112到124之间的任何位置。在某些实施例中，结合片段是来自SEQ ID NO:1的氨基酸12到氨基酸112，来自SEQ ID NO:1的氨基酸10到氨基酸112，来自SEQ ID NO:1的氨基酸8到氨基酸112，来自SEQ ID NO:1的氨基酸6到氨基酸112，来自SEQ ID NO:1的氨基酸4到氨基酸112，来自SEQ ID NO:1的氨基酸1到氨基酸112、氨基酸113、氨基酸114、氨基酸115、氨基酸116、氨基酸117、氨基酸118、氨基酸119、氨基酸120、氨基酸121、氨基酸122或氨基酸123。在其它实施例中，结合部分是来自SEQ ID NO:1的氨基酸12到氨基酸114，来自SEQID NO:1的氨基酸12到氨基酸116，来自SEQ ID NO:1的氨基酸12到氨基酸118，来自SEQ IDNO:1的氨基酸12到氨基酸120，来自SEQ ID NO:1的氨基酸12到氨基酸122，或来自SEQ IDNO:1的氨基酸12、氨基酸11、氨基酸10、氨基酸9、氨基酸8、氨基酸7、氨基酸6、氨基酸5、氨基酸4、氨基酸3或氨基酸2到氨基酸124。
在某些实施例中，CTLA4的CDR样环是移植于非CTLA4蛋白骨架上。非CTLA4蛋白骨架可为所属领域中已知允许CDR样环维持结合CD80和/或CD86的三维结构的任何蛋白质骨架。在某些实施例中，非CTLA4蛋白骨架为骆驼科重链抗体的可变域(VHH)或鲨新抗原受体的可变域(VNAR)(“纳米抗体(nanobody)”)。在其它实施例中，骨架可来自于除免疫球蛋白以外的蛋白质。用于本发明的CTLA4变体蛋白中的所述骨架包括(但不限于)纤维连接蛋白III(fibronectin III)(AdNectin)、β夹心式蛋白(iMAB)、脂质运载蛋白(lipocalin)(抗运载蛋白(Anticalin))、EETI-II/AGRP(微体(Microbody))、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(Kunitz域)、硫氧还蛋白(thioredoxin)(肽适体)、蛋白A(亲和体(Affibody))、锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)(DARPin)、γB-晶状体球蛋白(γB-crystallin)/泛素(ubiquitin)(亲和素(Affilin))、CTLD3(四连接素(Tetranectin))和(LDLR-A模组)3(高亲和性多聚体(Avimer))。
在一些实施例中，本发明的变体CTLA4多肽为单体。在其它实施例中，CTLA4多肽为二聚体。在某些实施例中，CTLA4二聚体为共价二聚体，例如经二硫键连接的二聚体。在其它实施例中，CTLA4二聚体为非共价二聚体。在其它实施例中，CTLA4多肽为多聚体，例如四聚体。
本发明的变体CTLA4多肽对CTLA4配体具有结合亲和力。在某些实施例中，CTLA4多肽对人类CD80的细胞外域或其一部分具有结合亲和力。在各种实施例中，CTLA4多肽对人类CD86的细胞外域或其一部分具有结合亲和力。
在一些实施例中，相较于野生型CTLA4细胞外域(例如在阿巴西普的情形下)的结合亲和力，本发明的变体CTLA4多肽对CD80和/或CD86的结合亲和力增加。如本文所用，对CD80和/或CD86具有“增加的亲和力”的变体(“高亲和力”变体)是指结合亲和力为CTLA4细胞外域对CD80和/或CD86的结合亲和力的至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍或20倍以上的本发明多肽。在其它实施例中，本发明的变体CTLA4多肽对CD80和/或CD86的结合亲和力约等于野生型CTLA4细胞外域(例如在阿巴西普的情形下)对CD80和/或CD86的结合亲和力(“中性亲和力”变体)。如本文所用，“中性亲和力”变体对CD80和/或CD86的结合亲和力介于CTLA4细胞外域对配体的结合亲和力的约0.5倍到约1.5倍之间，例如为CTLA4细胞外域的结合亲和力的约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍、约1倍、约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍或约1.5倍。在某些实施例中，相较于CTLA4细胞外域，本发明的变体多肽对CD80和/或CD86的结合亲和力减小(“低亲和力”变体)。如本文所用，本发明的“低亲和力”变体的结合亲和力小于CTLA4细胞外域的结合亲和力的0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.01倍或0.01倍以下。
在特定实施例中，本发明的变体CTLA4蛋白关于CD80结合与CD86结合两者均为高亲和力变体。在一些实施例中，变体多肽关于CD80为高亲和力变体且关于CD86为中性亲和力变体。在其它实施例中，变体CTLA4多肽关于CD86结合为高亲和力变体且关于CD80结合为中性亲和力变体。在其它实施例中，本发明的变体CTLA4蛋白关于CD80结合为高亲和力变体且关于CD86结合为低亲和力变体。在其它实施例中，变体蛋白关于CD86结合为高亲和力变体且关于CD80结合为低亲和力变体。在其它实施例中，本发明的变体多肽关于CD80结合与CD86结合两者均为中性亲和力变体。在各种实施例中，本发明的变体CTLA4多肽关于CD86结合为低亲和力变体且关于CD80结合为中性亲和力变体。在其它实施例中，本发明的变体CTLA4多肽关于CD86结合为中性亲和力变体且关于CD80结合为低亲和力变体。
在某些实施例中，本发明的CTLA4多肽包含在全长CTLA4(基因库登录号AAL07473.1，其以引用的方式并入本文中)的情形下的变体CTLA4结合域。
2.CTLA4融合搭配物
在某些方面，本发明CTLA4多肽可为融合蛋白，其中变体CTLA4结合域与另一多肽(在本文中称为“融合搭配物”)的氨基酸序列可操作地连接。如本文所用，术语“融合搭配物”是指直接或经由连接子序列与CTLA4多肽变体共价连接的非CTLA4多肽。在各种实施例中，CTLA4结合域的C末端与融合搭配物的N末端连接。在一些实施例中，融合搭配物可包含跨膜域和/或细胞质域。在所述实施例中，CTLA4融合蛋白在细胞表面上表达。在特定实施例中，融合搭配物包含促进CTLA4多肽分泌、表达和/或溶解的多肽。
在一些实施例中，本发明的CTLA4融合蛋白为单体。在其它实施例中，本发明的CTLA4融合蛋白由于两个单体的CTLA4部分之间和/或融合搭配物多肽之间的共价连接(例如由双硫键)或由于单体的CTLA4和/或融合搭配物部分的非共价缔合而为二聚体。
在一些实施例中，融合搭配物为二聚化的蛋白质或蛋白质域，例如λ抑制体、上游结合因子及白氨酸拉链域(例如fos/jun)。在特定实施例中，融合搭配物为免疫球蛋白(Ig)Fc多肽，即Ig多肽的Fc域或其片段。在某些实施例中，Fc多肽或片段可源于各种物种，包括例如人类、小鼠、灵长类动物等，且可源于与其所连接的CTLA4结合域不同的物种。因此，举例来说，在一些实施例中，CTLA4结合域来源于人类蛋白质且融合搭配物来源于小鼠蛋白质。在特定实施例中，CTLA4多肽与融合搭配物均来源于人类蛋白质。
在某些实施例中，Ig Fc多肽包含第一恒定区(CH1)、铰链区、第二恒定区(CH2)以及第三恒定区(CH3)，顺序为(从N末端至C末端)CH1-铰链-CH2-CH3。在一些实施例中，融合搭配物任选包含第四恒定区(CH4)。在一些实施例中，融合搭配物为包含Ig多肽的铰链区、CH2域和CH3域的免疫球蛋白Fc片段。在其它实施例中，Ig Fc片段包含单一恒定域，例如铰链区以及CH1、CH2或CH3域。在某些方面，Ig Fc不具有铰链，例如IgM。在一些实施例中，Ig Fc多肽包含野生型Ig Fc多肽。示范性Fc多肽包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD和IgM。在特定实施例中，Fc多肽为IgG。
或者，免疫球蛋白Fc融合搭配物为经修饰的Ig多肽。在某些实施例中，Fc多肽相较于野生型具有一个或一个以上氨基酸取代。举例来说，在某些实施例中，Fc多肽为一个或一个以上半胱氨酸残基已经另一氨基酸(例如丝氨酸残基)取代以消除在两个Ig链之间形成的一个或一个以上双硫键的突变IgG。在其它实施例中，Fc多肽为一个或一个以上氨基酸残基经另一氨基酸(例如脯氨酸)取代以降低效应功能(Fc受体结合降低)的IgG多肽。参看美国专利公开案第2009/0258031号。
在一些实施例中，Fc融合搭配物或其片段可经修饰以相对于相应野生型序列改变至少一种恒定区介导的生物效应功能。举例来说，在一些实施例中，Fc多肽可经修饰以相对于未经修饰的Fc区降低至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如降低与Fc受体(FcγR)结合。FcγR结合可通过使免疫球蛋白恒定区区段在FcγR相互作用所必需的特定区域处突变而降低(参看例如坎费尔德(Canfield)和莫里森(Morrison),1991,实验医学杂志(J.Exp.Med.)173:1483-1491；和兰德(Lund)等人,1991,免疫学杂志(J.Immunol.)147:2657-2662)。Fc区的FcγR结合能力的降低也可降低依赖于FcγR相互作用的其它效应功能，例如调理作用(opsonization)、吞噬作用(phagocytosis)和抗体依赖性细胞细胞毒性(“ADCC”)。
在其它实施例中，Fc多肽可经修饰以相对于未经修饰的Fc区获得或改进至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如增强FcγR相互作用(参看例如US 2006/0134709)。举例来说，Fc区可经修饰以便以大于相应野生型恒定区的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA。
因此，相较于具有相应野生型Fc区的融合蛋白，本发明的Fc融合蛋白可发生生物活性改变，由此导致调理作用、吞噬作用、或ADCC增加或减小。所述改变在所属领域中为已知的。举例来说，可如修饰抗体一般修饰Fc多肽以降低ADCC活性，例如如美国专利第5,834,597号和第7,083,784号；以及美国专利公开案第2006/0198840号和第2007/0122403号中所述。示范性ADCC降低变体对应于美国专利第5,834,597号的图4中所示的“突变体3”，其中残基236缺失且残基234、235及237(使用EU编号)经丙氨酸取代。
在一些实施例中，用于本发明CTLA4蛋白中的Fc多肽具有低含量岩藻糖或缺乏岩藻糖。Fc区中缺乏岩藻糖的抗体与ADCC活性增强相关，尤其在低剂量抗体的情况下。参看谢尔兹(Shields)等人,2002,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:26733-26740；新川(Shinkawa)等人,2003,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278:3466-73。制备岩藻糖较少的蛋白质的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达低含量的FUT8 mRNA，其编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，一种为多肽的岩藻糖基化所必需的酶。
另一方面，本发明蛋白质或其片段可包括已经修饰以增加或降低对胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的Fc区，其中所述修饰例如通过使免疫球蛋白恒定区区段在FcRn相互作用所涉及的特定区域处突变而达成(参看例如WO 2005/123780)。在特定实施例中，IgG种类的Ig Fc融合搭配物经突变以使重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一者单独或以其任何组合，例如在位置250和428处、或在位置250和314处、或在位置314和428处、或在位置250、314和428处经取代，其中位置250和428为特定组合。对于位置250，取代氨基酸残基可为除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、赖氨酸、白氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代氨基酸残基可为除白氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代氨基酸残基可为除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、赖氨酸、白氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。适合氨基酸取代的特定组合鉴别于美国专利第7,217,797号的表1中，表1以全文引用的方式并入本文中。所述突变增加Fc多肽与FcRn的结合，由此保护蛋白质免遭降解且增加其半衰期。
在某些实施例中，用于本发明的CTLA4融合蛋白中的Fc多肽具有与人类Fcγ1的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)至少75%一致的氨基酸序列。在各种实施例中，Fc多肽具有与人类Fcγ1的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，相较于人类Fcγ1(SEQ ID NO:7)，用于本发明的CTLA4融合蛋白中的Fc多肽包含至少1个突变。在其它实施例中，相较于野生型人类Fcγ1，本发明的变体CTLA4多肽包含多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个、多达11个、多达12个、多达13个、多达14个、多达15个、多达16个、多达17个、多达18个、多达19个、或多达20个或20个以上氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明的变体CTLA4蛋白为融合蛋白，其包含有含约124个氨基酸且在C末端与含有约231个氨基酸的IgG Fc融合搭配物(Fc的铰链、CH2和CH3区)共价连接(直接或间接)的CTLA4结合区。在某些实施例中，CTLA4细胞外域和Ig Fc域经由连接子连接，其中所述连接子包含约1到约10个氨基酸。在特定实施例中，连接子包含1个氨基酸。
在一些实施例中，相较于野生型阿巴西普(SEQ ID NO:5)，本发明的变体融合蛋白包含至少1个氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代位于CTLA4细胞外域中，例如位于CTLA4的CDR样环中。在其它实施例中，相较于野生型阿巴西普(SEQ ID NO:5)，本发明的变体融合蛋白包含CTLA4细胞外域中的至少1个氨基酸取代以及Fc域中的至少1个氨基酸取代。
在某些实施例中，本发明的CTLA4融合蛋白具有与野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)至少75%一致的氨基酸序列。在各种实施例中，融合蛋白具有与野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，相较于野生型阿巴西普(SEQ ID NO:6)，本发明的CTLA4融合蛋白包含至少1个突变。在其它实施例中，相较于野生型阿巴西普，本发明的变体CTLA4多肽包含多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个、多达11个、多达12个、多达13个、多达14个、多达15个、多达16个、多达17个、多达18个、多达19个、或多达20个或20个以上氨基酸取代。
除上述修饰之外，本发明CTLA4蛋白也可在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中进行修饰以包括用于从宿主细胞进行分泌的信号序列、或肽纯化序列，例如抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸序列、或GST融合物。在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白包含一个或一个以上经修饰的氨基酸，例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化(farnesylated)氨基酸、乙酰基化氨基酸、经生物素标记的氨基酸、与脂质部分结合的氨基酸、和/或与有机衍生化试剂结合的氨基酸。在某些实施例中，存在经修饰的氨基酸在例如以下方面有利：(a)增加多肽血清半衰期和/或功能性活体内半衰期，(b)降低多肽抗原性或免疫原性，(c)增加多肽储存稳定性，(d)增加生物可用性，(e)减小效应功能，和/或(f)减小或抑制本发明的两个或两个以上CTLA4蛋白之间不合需要的自缔合(self-association)(例如形成聚集体)。氨基酸可在重组产生期间经例如共翻译或翻译后修饰(例如在哺乳动物细胞中表达期间在N-X-S/T基元处的N连接糖基化)或通过合成手段修饰。
另一方面，本发明CTLA4蛋白可通过在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中的一个或一个以上氨基酸的侧链添加保护基来加以修饰。所述保护基可例如通过降低多肽的亲水性以及增加多肽的亲脂性来促进本发明多肽穿过膜或穿过某些组织进行转运。适合保护基的实例包括所属领域中已知的酯保护基、胺保护基、酰基保护基和羧酸保护基(参看例如美国专利第6,121,236号)。以下章节5.6和5.7中论述本发明CTLA4蛋白的其它修饰，例如通过添加聚乙二醇或可检测标记。
3.CTLA4多肽的稳定性增加
在某些方面，本发明提供相较于野生型CTLA4 Ig，蛋白质稳定性增加的CTLA4多肽。本发明提供的CTLA4多肽相较于野生型CTLA4细胞外域的CDR样环在其CDR样环区中，和/或在CTLA4细胞外域中在CDR样环外部的区域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有单个或多个氨基酸取代，其中至少1个取代使CTLA4多肽的稳定性相较于野生型CTLA4 Ig得以增加。在某些实施例中，CTLA4多肽在储存时的稳定性增加。在其它实施例中，稳定性增加是由于抵抗由蛋白酶等引起的降解。在各种实施例中，稳定性增加是由于构象稳定性增加。在一些实施例中，稳定性增加是由于聚集减少。
在某些实施例中，稳定性增加不影响本发明的变体CTLA4多肽对CD80和/或CD86的结合亲和力。在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白的稳定性可为野生型CTLA4 Ig的稳定性的至少0.1倍、至少0.2倍、至少0.3倍、至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白的稳定性相对于野生型CTLA4 Ig的稳定性增加任何上述值之间的范围，例如0.1倍到2倍、5倍到10倍、0.9倍到6倍等。在某些方面，样品中本发明CTLA4多肽的稳定性大于样品中野生型CTLA4 Ig的稳定性，其中所述样品实质上相同(例如均呈含有相同成分的医药组合物形式)和/或以实质上相同的方式加工或处理(例如在相同的温度和湿度条件下储存相同时期)。
在某些方面，本发明CTLA4多肽的稳定性增加为保存期增加。保存期增加可由于氨基酸氧化减少所致(例如因为相对于野生型CTLA4-Ig，CDR样环中或CTLA4细胞外域的CDR样环外部的区域中易氧化的氨基酸残基，例如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸已经取代)。保存期增加也可由于氨基酸环化减少所致(例如因为相对于野生型CTLA4-Ig，CDR样环中或CTLA4细胞外域的CDR样环外部的区域中易环化的氨基酸残基(例如天冬酰胺或谷氨酸)已经取代)。保存期增加也可由于消除由可能以残余含量存在于蛋白质纯化过程中的蛋白酶识别的氨基酸基元所致。保存期增加还可由于消除会导致蛋白质聚集的氨基酸基元所致。保存期增加还可由于构象稳定性增加所致。相对于野生型CTLA4 Ig，保存期或构象稳定性的增加或氧化、环化、蛋白水解或聚集程度的减小可为至少0.1倍、至少0.2倍、至少0.3倍、至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些实施例中，相对于野生型CTLA4 Ig，保存期或构象稳定性的增加或氧化、环化、蛋白水解或聚集程度的减小是在任何上述值之间的范围内，例如0.1倍到2倍、5倍到10倍、0.9倍到6倍等。
本发明另外提供筛选相对于野生型CTLA4 Ig稳定性增加的CTLA4多肽的方法。在特定实施例中，所述方法包含以下步骤：(a)测定第一样品中全长CTLA4多肽的量；和(b)比较第一样品中全长CTLA4多肽的量与第二样品中全长野生型CTLA4 Ig的量。分析蛋白质稳定性的方法在所属领域中为已知的。
4.CTLA4多肽的免疫原性降低
在某些方面，本发明提供相较于贝拉西普或MAXY-4(Maxygen)免疫原性降低的CTLA4多肽。本发明提供的CTLA4多肽相较于贝拉西普或MAXY-4细胞外域的CDR样环在其CDR样环区中，和/或在CTLA4细胞外域中在CDR样环外部的区域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有单个或多个氨基酸取代，其中至少1个取代使CTLA4多肽的免疫原性相较于贝拉西普或MAXY-4得以降低。在某些实施例中，免疫原性降低是由导致一个或一个以上T细胞抗原决定基消除或减少的一个或一个以上氨基酸取代所致。
在某些方面，免疫原性降低的本发明CTLA4蛋白相较于贝拉西普或MAXY-4具有类似或改变的生物活性，例如对CD80和/或CD86的亲和力。
在某些实施例中，相对于贝拉西普或MAXY-4，本发明CTLA4多肽的免疫原性降低。所述多肽通常具有相对于CTLA4细胞外域和/或(如果存在)融合搭配物的变体序列。在某些实施例中，CTLA4多肽通常将在CTLA4细胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或两者中具有1、2或3个氨基酸取代。在其它实施例中，CTLA4多肽可在CTLA4细胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或两者中具有4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在其它实施例中，CTLA4多肽可在CTLA4细胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或两者中具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
如本发明中所用，具有“降低的免疫原性”的变体是指相较于贝拉西普或MAXY-4CTLA4，包含变体序列的CTLA4多肽，其相较于贝拉西普或MAXY-4，引发的外周血液单核细胞中的增殖反应降低。可用于评估增殖反应的示范性增殖分析阐述于以下章节5.6中。增殖反应降低可以反应者的百分比、刺激指数或两者反映。
在其它实施例中，相较于贝拉西普或MAXY-4中的相应肽，具有变体序列的肽导致反应者减少至少25%、反应者减少至少30%、反应者减少至少35%、反应者减少至少40%、反应者减少至少45%、反应者减少至少50%、反应者减少至少60%、反应者减少至少65%、反应者减少至少70%、反应者减少至少75%、反应者减少至少80%、反应者减少至少85%、反应者减少至少90%、反应者减少至少95%、反应者减少至少100%，或导致反应者减少任何上述值之间的范围，例如反应者减少25%-75%、反应者减少50%-90%、反应者减少60%-100%、反应者减少70%-90%等。在某些方面，通过以下章节5.6中阐述的分析测定贝拉西普或MAXY-4的变体肽分别相较于贝拉西普或MAXY-4的相应野生型肽引发T细胞反应的能力。
在其它实施例中，相较于贝拉西普或MAXY-4中的相应肽，具有变体序列的肽导致刺激指数比由野生型CTLA4 Ig中的相应肽引发的刺激指数减小至少5%、减小至少10%、减小至少15%、减小至少20%、减小至少25%、减小至少30%、减小至少35%、或减小至少40%，或相较于野生型CTLA4 Ig，导致刺激减小任何上述值之间的范围，例如减小5%-20%、减小10%-30%、减小30%-40%等。在某些实施例中，通过以下章节5.6中阐述的分析测定刺激指数。
5.核酸和表达系统
本发明涵盖编码本发明CTLA4多肽的核酸分子以及经工程改造以重组表达多肽的宿主细胞。
本发明CTLA4蛋白可通过在宿主细胞中重组表达编码CTLA4结合部分的核酸或编码CTLA4融合蛋白的核酸制备。为了重组表达CTLA4蛋白，用一种或一种以上携带编码CTLA4蛋白的核酸的重组表达载体转染宿主细胞以使蛋白质在宿主细胞中表达且任选分泌到培养宿主细胞的培养基中，蛋白质可从所述培养基回收。使用标准重组DNA方法获得编码CTLA4蛋白的核酸，将这些核酸并入重组表达载体中且将载体引入宿主细胞中，所述方法例如以下文献中描述的方法：分子克隆实验指南(Molecular Cloning;A LaboratoryManual),第2版(萨姆布鲁克(Sambrook)、福瑞斯(Fritsch)和玛尼蒂斯(Maniatis)(编),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor),纽约(N.Y.),1989)；分子生物学现行规范(CurrentProtocols in Molecular Biology)(奥苏贝尔F.M.(Ausubel,F.M.)等人编,格林出版协会(Greene Publishing Associates),1989)；和美国专利第4,816,397号。
编码本发明的变体CTLA4多肽的核酸可部分或完全合成。或者，首先获得编码CTLA4结合部分的核酸。这些DNA可由对例如H38(HTLV-II相关的白血病)细胞系的总细胞RNA进行PCR来获得。参看美国专利第5,434,131号。此外，如果CTLA4蛋白为融合蛋白，则编码融合搭配物(例如免疫球蛋白恒定区)的核酸可通过例如使用聚合酶链反应(PCR)扩增且修饰编码所要融合蛋白的生殖系DNA或cDNA获得。可合成编码野生型阿巴西普的核酸且将其用作诱变的模板以便使用常规诱变技术来产生如本文所述的变体；或者，可直接合成编码变体的核酸。
一旦获得编码变体CTLA4结合域的核酸，即可通过标准重组DNA技术进一步操作核酸，例如以可操作地连接编码CTLA4结合域的DNA与编码另一蛋白质(例如融合搭配物，例如抗体恒定区和/或可挠性连接子)的另一核酸。如本文中使用的术语“可操作地连接”预期指接合两个核酸以使由这两个核酸编码的氨基酸序列保持同框(in-frame)。
编码CTLA4结合域的分离的DNA可通过可操作地连接编码CTLA4结合域的DNA与编码一个或一个以上重链恒定区(CH1、CH2、CH3和任选CH4)的另一DNA分子而转化成编码融合蛋白的核酸。人类重链恒定区核酸的序列在所属领域中为已知的(参看例如卡巴特E.A.(Kabat,E.A.)等人,1991,具有免疫学重要性的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第5版,美国健康与公众服务部(U.S.Department of Healthand Human Services),NIH公开案第91-3242号)并且涵盖这些区域的核酸可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施例中，为IgG1恒定区。
为了表达本发明的CTLA4蛋白，将如上所述获得的编码部分或全长蛋白质的DNA插入表达载体中以使核酸与转录以及翻译控制序列可操作地连接。在这种情形下，术语“可操作地连接”预期指编码CTLA4蛋白的核酸连接到载体中，以使载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控编码CTLA4蛋白的核酸的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用表达宿主细胞相容。
通过标准方法将编码本发明CTLA4蛋白的核酸插入表达载体中(例如连接CTLA4蛋白基因片段和载体上的互补限制位点，或如果无限制位点存在，则进行钝端连接)。如果CTLA4蛋白为融合蛋白，则在插入编码CTLA4结合域的序列之前，表达载体可能已携带融合搭配物序列，例如抗体恒定区序列。举例来说，一种将仅包含CTLA4结合域的本发明蛋白质转化成CTLA4融合蛋白的方法为将编码CTLA4结合域的核酸插入已编码免疫球蛋白Fc的表达载体中，以使CTLA4编码序列与载体内的Fc编码序列可操作地连接。或者或另外，重组表达载体可编码促进CTLA4蛋白从宿主细胞分泌的信号肽。编码CTLA4蛋白的核酸可克隆到载体中以使信号肽与CTLA4蛋白编码核酸的氨基端同框连接。信号肽可为CTLA4信号肽或异源信号肽，例如免疫球蛋白信号肽。
除编码CTLA4蛋白的核酸之外，本发明的重组表达载体还携带调控序列，所述序列控制编码CTLA4蛋白的核酸在宿主细胞中的表达。术语“调控序列”预期包括启动子、增强子、和控制编码本发明CTLA4蛋白的核酸的转录或翻译的其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。所述调控序列描述于例如戈德尔(Goeddel),基因表达技术：酶学方法(GeneExpression Technology:Methods in Enzymology)185(学术出版社(Academic Press),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚(CA),1990)中。所属领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可视例如欲转型的宿主细胞的选择、所要蛋白质的表达量等因素而定。适用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导蛋白质在哺乳动物细胞中高含量表达的病毒元件，例如来源于细胞巨大病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参看例如施廷斯基(Stinski)的美国专利第5,168,062号、拜耳(Bell)等人的美国专利第4,510,245号和夏弗纳(Schaffner)等人的美国专利第4,968,615号。
除CTLA4蛋白编码核酸和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可携带其它序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和可选标记基因。可选标记基因有助于已引入有载体的宿主细胞的选择(参看例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号，均属于阿克赛尔(Axel)等人)。举例来说，通常，可选标记基因赋予已引入有载体的宿主细胞对药物(例如G418、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate))的抗性。适合的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于DHFR-宿主细胞中甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。对于CTLA4蛋白的表达，通过标准技术将编码CTLA4蛋白的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式应涵盖常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沈淀、DEAE-葡聚糖转染等。
可在原核或真核宿主细胞中表达本发明CTLA4蛋白。在某些实施例中，在真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞或酵母宿主细胞)中进行CTLA4蛋白表达以使经适当折叠、经翻译后修饰且具有免疫活性的抗体的分泌最佳。用于表达本发明的重组蛋白的示范性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括沃劳(Urlaub)和岑森(Chasin)1980年在《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》77:4216-4220中描述的DHFR-CHO细胞，与DHFR可选标记一起使用，例如考夫曼(Kaufman)和夏普(Sharp)1982年在《分子生物学(Mol.Biol.)》159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。当将编码CTLA4蛋白的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞持续一段足以使所述蛋白质在宿主细胞中表达或使所述蛋白质分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时期来产生所述蛋白质。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收CTLA4蛋白。
重组DNA技术也可用于去除一些或所有非与CTLA4配体结合所必需的编码CTLA4蛋白的DNA。本发明的蛋白质还涵盖由所述截短的DNA分子表达的分子。
一旦产生编码野生型阿巴西普或CDR样序列与阿巴西普的CDR样序列相关的CTLA4蛋白的一个或一个以上部分的核酸，即可将进一步改变或突变引入编码序列中，例如以产生编码具有不同CDR样序列的CTLA4蛋白或对Fc受体的亲和力降低的蛋白质的核酸。
也可通过化学合成(例如通过描述于固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis),第2版,1984皮尔斯化学公司(The Pierce Chemical Co.),罗克福德(Rockford),伊里诺斯州(Ill.)中的方法)产生本发明CTLA4蛋白。变体蛋白质也可使用无细胞平台产生(参看例如楚(Chu)等人,生物化学第2期(Biochemia No.2),2001(罗氏分子生物制品公司(Roche Molecular Biologicals)))。
一旦已通过重组表达产生本发明CTLA4蛋白，即可通过所属领域中已知用于纯化蛋白质的任何方法对其进行纯化，所述方法例如使用可与本发明蛋白质的CTLA4结合域反应的抗体；或色谱法(例如离子交换色谱法、亲和力(例如对CD80和/或CD86的亲和力)色谱法和筛分柱色谱法(sizing column chromatography))；离心法；差异溶解度；或通过任何其它标准技术。另外，本发明CTLA4蛋白可与本文所述或另外为所属领域中已知的异源多肽序列融合以便于纯化。
一旦经分离，必要时可例如通过高效液相色谱法(参看例如费希尔(Fisher),生物化学和分子生物学的实验室技术(Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology)(沃克(Work)和伯登(Burdon)编,爱思唯尔公司(Elsevier),1980))或通过凝胶过滤色谱法在SuperdexTM 75柱(医药和生物技术有限公司(Pharmacia BiotechAB),乌普萨拉(Uppsala),瑞典(Sweden))上进一步纯化CTLA4蛋白。
6.CTLA4蛋白的生物活性
在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白具有某些生物活性，例如与阿巴西普竞争结合CD80和/或CD86，或阻断T细胞反应。
因此，在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白与阿巴西普竞争结合CD80或CD86。竞争结合CD80或CD86的能力可使用竞争分析加以测试。在竞争分析的一个实例中，(放大发光亲近性均相(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous))或分析可用作ELISA的非洗涤替代分析。在分析中，融合有标签(例如Cλ-HA)的配体CD80或CD86与结合有抗标签抗体(例如山羊抗人类Cλ)的受体珠粒结合且经生物素标记的阿巴西普与抗生蛋白链菌素(strepavidin)涂覆的供体珠粒(珀金埃尔默公司(PerkinElmer),沃尔瑟姆(Waltham),马萨诸塞州(MA))结合。在不存在竞争性CTLA4变体的情况下，阿巴西普与CD80或CD86相互作用且产生615nm下的信号。添加的未标记的CTLA4变体与阿巴西普/CD80或CD86相互作用竞争，从而在数量上减少荧光以使得能够测定相对结合亲和力。可使用标准方法用硫基-NHS-生物素对阿巴西普进行生物素标记且在PBS中透析。受体珠粒的结合是通过根据“分析开发指南”(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))进行。在384孔AlphaPlate(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中在分析缓冲液(例如含1%BSA、0.01%吐温20(Tween 20)的PBS(pH 7.1))中进行结合。各孔含有0.5nM经生物素标记的阿巴西普、从40nM起始以1:4连续稀释的CTLA4竞争剂、0.078μg/ml CD80和5μg/ml结合山羊抗人类Cλ的受体珠粒。在室温下在黑暗中将板培育1小时。接着以5μg/ml添加抗生蛋白链菌素供体珠粒到各孔中。在室温下在黑暗中将板再培育30分钟，此后在En Vision读取器(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上进行读取。利用软件GRAPHPAD PRISM(GraphPad,圣地亚哥(San Diego))使用非线性回归拟合数据。
对于CD86结合，首先培育8nM经生物素标记的阿巴西普、从100nM起始以1:4连续稀释的竞争剂、0.1μg/ml CD86和10μg/ml结合山羊抗人类Cλ的受体珠粒，接着添加10μg/ml抗生蛋白链菌素供体珠粒。这种竞争分析的变化形式也可用于测试本发明CTLA4蛋白与阿巴西普之间的竞争。举例来说，在某些方面，CTLA4蛋白用作参照物且阿巴西普用作测试分子。另外，可使用在所培养的细胞(例如哺乳动物细胞，例如CHO)的表面上表达的膜结合配体来代替可溶性CD80或CD86。所属领域中已知并且可使用其它形式的竞争分析。
在各种实施例中，当本发明CTLA4蛋白以0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.075μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的浓度或以介于任何上述值之间的范围内的浓度(例如以介于0.1μg/ml到2μg/ml的范围内的浓度)使用时，CTLA4蛋白使经标记的阿巴西普的结合减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、或介于任何上述值之间的范围内的百分比(例如本发明CTLA4蛋白使经标记的阿巴西普的结合减少10%到40%、50%到70%、40%到60%、或80%到99%)。
在某些方面，测试本发明CTLA4变体引发T细胞反应的能力。具体说来，使用多中心(multi-pin)形式由模拟表位(Mimotope)(阿德雷德(Adelaide),澳大利亚(Australia))合成CTLA4肽。可合成CTLA4多肽序列，例如呈有12个氨基酸重叠的15聚体肽形式。将肽以约1-2mg/ml再悬浮于DMSO(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。保持储备肽冷冻在-20℃下。为了分离外周血液单核细胞，可从史丹福血液中心(Stanford Blood Center),帕洛阿尔托(Palo Alto),加利福尼亚(CA)购得社区供体白细胞层产物。用不含钙或镁的DPBS按1:1 v:v稀释白细胞层物质。用12.5ml FicollPaque-PLUS(通用电气医疗集团(GEHealthcare))使经稀释的白细胞层物质(25-35ml)处于50ml锥形离心管(萨斯特公司(Sarsted)或考斯塔公司(Costar))下层。在室温下以900g将样品离心30分钟。从界面收集外周血液单核细胞(PBMC)。添加DPBS以使最终体积达到50ml且以350g将细胞离心5分钟。将集结成粒的细胞再悬浮于DPBS中且计数。为了分离树突状细胞，将含108个新鲜分离的PBMC的AIM V培养基(英杰公司(Invitrogen))(总体积为30ml)接种于T75培养瓶(考斯塔公司(Costar))中。将过量PBMC于90%胎牛血清(FCS)、10%DMSO中以5×107个细胞/毫升冷冻于-80℃下。在37℃下于5%CO2中培育T75培养瓶2小时。去除非粘着细胞，且用DPBS洗涤粘着单层细胞。为了区分树突状细胞与单核细胞，添加30ml含有800个单位/毫升GM-CSF(R和D系统(R and D Systems))和500个单位/毫升IL-4(R和D系统(R and D Systems))的AIM V培养基。将培养瓶培育5天。在第5天添加IL-1α(音杰公司(Endogen))和TNFα(音杰公司(Endogen))分别达到50pg/ml和0.2ng/ml。将培养瓶再培育两天。在第7天，通过添加3ml含有0.5到1.0mg丝裂霉素C(Mitomycin C)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的100mMEDTA达到最终浓度为10mM EDTA和16.5到33μg/ml丝裂霉素C来收集树突状细胞。在37℃和5%CO2下再培育培养瓶1小时。收集树突状细胞，且在AIM V培养基中洗涤2-3次。对于细胞培养，在第7天，在37℃水浴中迅速解冻先前冷冻的自体PBMC。立即将细胞稀释于DPBS或AIM V培养基中且以350g离心5分钟。通过阴性选择使用磁珠(Easy-Sep CD4+试剂盒，干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))来增浓CD4+细胞。在96孔圆底板(考斯塔(Costar)9077)中以每孔每2×104个树突状细胞对应2×105个CD4+T细胞来共培养自体CD4+T细胞和树突状细胞。以约5μg/ml添加肽。对照孔仅含有0.25%v:v的DMSO(西格玛(Sigma))媒剂。阳性对照孔含有0.25%的DMSO和1μg/ml的破伤风类毒素(tetanus toxoid)(李斯特生物公司(ListBiologicals)或卡尔生物化学公司(CalBioChem))。将培养物培育5天。在第5天，每孔添加0.25μCi的氚化胸苷(安玛西亚公司(Amersham)或通用电气医疗集团(GE Healthcare))。在第6天，使用Packard Filtermate细胞收集器将培养物收集到过滤垫。使用WallacMicroBeta 1450闪烁计数器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))进行闪烁计数。通过对6到12个重复实验的个别结果求平均值来计算平均背景CPM值。对四个阳性对照孔的CPM值求平均值。对各肽的重复实验孔或一式三份孔求平均值。
通过用平均实验CPM值除以平均对照值来计算阳性对照孔和肽孔的刺激指数值。为了纳入数据集之中，需要破伤风类毒素阳性对照孔中大于3.0的刺激指数。记录产生2.95或2.95以上的刺激指数的任何肽的反应。使用来自一组100个供体的外周血液样品对肽进行测试。汇集对所有肽的反应。对于所测试的各肽，计算在2.95或2.95以上的刺激指数下起反应的供体组(donor set)的百分比。此外，还计算所有供体的平均刺激指数。通过分析在100个供体的组内对肽的反应百分比来鉴别CD4+T细胞抗原决定基肽。对所测试的说明CTLA4多肽的所有肽计算平均反应百分比和标准偏差。大于或等于平均背景反应加上3个标准偏差的反应率被视为潜在CD4+T细胞抗原决定基。
在其它方面，本发明CTLA4多肽抑制在一系列活体外分析中抑制CD80和/或CD86的活性，例如细胞增殖、细胞激素(例如IL-2)产生和细胞粘着。
在一些实施例中，所分析的活性为本发明CTLA4多肽的免疫抑制活性。具体说来，从供体新鲜收集的人类血液用等体积PBS稀释且根据制造商说明书使用Histopaque(西格玛(Sigma))Ficoll梯度部分分离以分离PMBC。PMBC在补充有10%FBS(海科隆公司(Hyclone))和1×PSG(青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)和谷氨酰胺)(英杰公司(Invitrogen))的RPMI培养基(西格玛(Sigma))中稀释且以1×105个细胞/孔的密度添加到96孔培养板(BD生物科学公司(BD Biosciences))中。待测试的CTLA4蛋白在相同培养基中连续稀释且一式四份添加到各孔中。通过添加PPD抗原(来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mycos)的经纯化蛋白质衍生物)达到5μl/ml的最终浓度来引发细胞增殖。在37℃下培育5天之后，以每孔1μCi添加3H胸苷(通用电气医疗集团(GEHealthcare))且在37℃下将板再培育18小时。使用制造商推荐的条件用细胞收集器(FilterMate Omnifilter-96收集器，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))收集细胞且使用闪烁计数器(沃拉克特里克斯(Wallac Trilux))测量3H胸苷并入量。利用GraphPad Prism 5软件使用非线性回归曲线拟合模型(S形剂量-反应，可变斜率)和最小平方拟合法分析细胞增殖数据。测定各变体的IC50参数和其相关95%置信区间。
在某些实施例中，分析的活性为抑制初级和二级同种异体刺激(allo-stimulated)的T细胞的增殖。具体说来，所述活性可通过人类外周血液CD4+T细胞的增殖来测量，例如如由拉森(Larsen)等人,2005,美国移植杂志(Am.J.Transplant.)5:443-453所述。在初级同种异体反应(allo-response)分析中，分离人类CD4+T细胞(每孔3-10×104个)且与表达等量CD80和CD86的经照射的人类B类淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell line)(例如PM细胞，每孔8.0×103个)，以及不同浓度的野生型CTLA4-Ig或本发明CTLA4蛋白一起培育。初级同种异体刺激分析进行6天，随后对于培养的最后7小时，添加每孔0.5μCi[3H]-胸苷。对于二级同种异体刺激分析，通过差异密度离心分离来自7天初级同种异体刺激的T细胞的活细胞且静息24小时。接着通过在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本发明CTLA4蛋白存在下以与上文相同的比率添加PM细胞来再刺激(二级刺激)T细胞。刺激T细胞3天，对于培养的最后7小时，脉冲添加[3H]-胸苷，且如上进行收集。或者，可如下文实例2中所述分析初级和二级同种异体刺激的T细胞的增殖。
在各种实施例中，本发明CTLA4变体的活性可通过抑制细胞激素产生来测量。举例来说，在特定实施例中，细胞激素为由Jurkat T细胞产生的IL-2(考克斯(Cox)等人,1999,蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)17(1):26-32)。在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本发明CTLA4蛋白存在下用10μg/mL PHA-L和表达重组CD80或CD86的细胞(例如CHO-K1，每孔2.5×104个)刺激Jurkat细胞(每孔1.0×105个)。在培养24小时之后，使用例如人类IL-2试剂盒(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量培养上清液中的IL-2浓度。或者，可通过所属领域中已知的其它方法(例如ELISA)测量IL-2浓度。
或者，在另一实施例中，可在二级同种异体刺激的T细胞的培养基中测量对细胞激素产生的抑制作用(拉森(Larsen)等人,2005,美国移植杂志(Am.J.Transplant.)5:443-453)。去除来自如以上二级同种异体刺激分析中所述经同种异体刺激3天的T细胞的培养上清液的等分试样，随后添加[3H]-胸苷。使用基于珠粒的分析(例如(英杰公司(Invitrogen)))或所属领域中已知的其它方法(例如ELISA)测量细胞激素产生(例如IFNγ、IL-2、IL-4)的程度。
在某些实施例中，分析的活性为细胞粘着。具体说来，将在细胞表面上重组表达CD80或CD86的细胞(例如CHO细胞)在培养基(例如含10%FBS的RPMI)中稀释，接种于96孔板中并生长至汇合。当汇合时，将细胞与本发明CTLA4蛋白或阿巴西普一起培育或用作阴性对照。通过用温热培养基洗涤而从细胞去除未结合蛋白质。纯化的T细胞未经刺激，或经1μg/ml抗CD3单株抗体预刺激(在37℃下30分钟)。将T细胞(1×105个细胞/孔，在100μl培养基中)接种于CD80或CD86表达细胞上且使其在37℃下粘着30分钟。通过用温热培养基洗涤各孔3次来去除非粘着细胞且一式三份进行计数(例如通过台盼蓝拒染(trypan blueexclusion))。按(非粘着细胞的数目/输入细胞的总数)×100%计算与CHO细胞的细胞粘着。或者，T细胞可根据制造商说明书与荧光染料，例如钙黄绿素(calcein)AM(分子探针公司(Molecular Probes),尤金(Eugene)俄勒冈州(OR))一起培育，随后接种到孔中。在与T细胞一起培育、去除含有非粘着T细胞的培养基并洗涤之后，通过荧光多孔板读取器对板进行读取。T细胞粘着的百分比由下式获得：(在测试融合蛋白存在下的特异性粘着-背景粘着)/(在阿巴西普存在下的特异性粘着-背景粘着)。
7.CTLA4-Ig融合蛋白的动力学性质
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80和CD86具有高亲和力。如本文所用，相较于阿巴西普，对CD80和/或CD86具有“高亲和力”的变体蛋白质的结合亲和力改进至少1.5倍。在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80具有高亲和力且对CD86具有中性亲和力。在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80具有高亲和力且对CD86具有低亲和力。在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD86具有高亲和力且对CD80具有中性亲和力。如本文所用，相较于阿巴西普，对CD80和/或CD86具有“中性亲和力”的变体蛋白质的结合亲和力改进至少0.5倍但小于1.5倍。在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80具有低亲和力且对CD86具有高亲和力。在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80与CD86两者均具有中性亲和力。在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80具有中性亲和力且对CD86具有低亲和力。在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白对CD80具有低亲和力且对CD86具有中性亲和力。如本文所用，相较于阿巴西普，对CD80和/或CD86具有“低亲和力”的变体的结合亲和力改进小于0.5倍。
在特定实施例中，本发明CTLA4蛋白具有特定缔合速率常数(kon或ka值)、解离速率常数(koff或kd值)、亲和力常数(KA值)、解离常数(KD值)和/或IC50值。在各种实施例中，可根据卡尔森(Karlsson)等人,1991,免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)145:229-240中揭示的方法使用表面等离子体共振测定CTLA4蛋白与CD80或CD86细胞外域的相互作用的结合常数。在某些方面，所述值是选自以下实施例。
在特定实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80结合的kon为至少102M-1s-1、至少5×102M-1s-1、至少103M-1s-1、至少5×103M-1s-1、至少104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、至少5×108M-1s-1、至少109M-1s-1、至少5×109M-1s-1，或kon在任何一对上述值之间的任何范围内(例如5×104M-1s-1到106M-1s-1或102M-1s-1到5×105M-1s-1)。
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD86结合的kon为至少102M-1s-1、至少5×102M-1s-1、至少103M-1s-1、至少5×103M-1s-1、至少104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、至少5×108M-1s-1、至少109M-1s-1、至少5×109M-1s-1，或kon在任何一对上述值之间的任何范围内(例如5×104M-1s-1到106M-1s-1或103M-1s-1到5×105M-1s-1)。
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80结合的koff为2s-1或2s-1以下、1.5s-1或1.5s-1以下、1s-1或1s-1以下、0.5s-1或0.5s-1以下、0.1s-1或0.1s-1以下、5×10-2s-1或5×10- 2s-1以下、10-2s-1或10-2s-1以下、5×10-3s-1或5×10-3s-1以下、10-3s-1或10-3s-1以下、5×10-4s-1或5×10-4s-1以下、10-4s-1或10-4s-1以下、5×10-5s-1或5×10-5s-1以下、10-5s-1或10-5s-1以下、5×10-6s-1或5×10-6s-1以下、10-6s-1或10-6s-1以下、5×10-7s-1或5×10-7s-1以下、10-7s-1或10-7s-1以下、5×10-8s-1或5×10-8s-1以下、10-8s-1或10-8s-1以下，或koff速率在任何一对上述值之间的任何范围内(例如1s-1到5×10-3s-1、或5×10-5s-1到10-8s-1)。
在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD86结合的koff为10s-1或10s-1以下、5s-1或5s-1以下、1s-1或1s-1以下、0.5s-1或0.5s-1以下、0.1s-1或0.1s-1以下、5×10-2s-1或5×10-2s-1以下、10-2s-1或10-2s-1以下、5×10-3s-1或5×10-3s-1以下、10-3s-1或10-3s-1以下、5×10-4s-1或5×10-4s-1以下、10-4s-1或10-4s-1以下、5×10-5s-1或5×10-5s-1以下、10-5s-1或10-5s-1以下、5×10-6s-1或5×10-6s-1以下、10-6s-1或10-6s-1以下、5×10-7s-1或5×10-7s-1以下、10-7s-1或10- 7s-1以下、5×10-8s-1或5×10-8s-1以下、10-8s-1或10-8s-1以下，或koff速率在任何一对上述值之间的任何范围内(例如1s-1到5×10-3s-1、或5×10-5s-1到10-8s-1)。
在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80结合的KA(kon/koff)为至少至少5×105M-1、至少105M-1、至少5×106M-1、至少106M-1、至少5×107M-1、至少107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少5×1010M-1、至少1010M-1、至少5×1011M-1、至少1011M-1、至少5×1012M-1、至少1012M-1、至少5×1013M-1、至少1013M-1、至少5×1014M-1、至少1014M-1、至少5×1015M-1、至少1015M-1，或KA在任何一对上述值之间的任何范围内(例如5×105M-1到5×1013M-1或5×108M-1到5×1015M-1)。
在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD86结合的KA(kon/koff)为至少5×104M-1、至少104M-1、至少5×105M-1、至少105M-1、至少5×106M-1、至少106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少5×109M-1、至少109M-1、至少5×1010M-1、至少1010M-1、至少5×1011M-1、至少1011M-1、至少5×1012M-1至少1012M-1、至少5×1013M-1、至少1013M-1、至少5×1014M-1、至少1014M-1，或KA在任何一对上述值之间的任何范围内(例如5×104M-1到1013M-1或5×107M-1到5×1013M-1)。
在各种实施例中，本发明CTLA4与CD80结合的KD(koff/kon)为5×10-6M或5×10-6M以下、10-6M或10-6M以下、5×10-7M或5×10-7M以下、10-7M或10-7M以下、5×10-8M或5×10-8M以下、10-8M或10-8M以下、5×10-9M或5×10-9M以下、10-9M或10-9M以下、5×10-10M或5×10-10M以下、10-10M或10-10M以下、5×10-11M或5×10-11M以下、10-11M或10-11M以下、5×10-12M或5×10- 12M以下、10-12M或10-12M以下、5×10-13M或5×10-13M以下、10-13M或10-13M以下、5×10-14M或5×10-14M以下、10-14M或10-14M以下、5×10-15M或5×10-15M以下、10-15M或10-15M以下，或KD在任何一对上述值之间的任何范围内(例如10-7M到5×10-13M、或5×10-9M到10-15M)。
在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD86结合的KD(koff/kon)为10-5M或10-5M以下、5×10-6M或5×10-6M以下、10-6M或10-6M以下、5×10-7M或5×10-7M以下、10-7M或10-7M以下、5×10-8M或5×10-8M以下、10-8M或10-8M以下、5×10-9M或5×10-9M以下、10-9M或10-9M以下、5×10-10M或5×10-10M以下、10-10M或10-10M以下、5×10-11M或5×10-11M以下、10-11M或10- 11M以下、5×10-12M或5×10-12M以下、10-12M或10-12M以下、5×10-13M或5×10-13M以下、10-13M或10-13M以下、5×10-14M或5×10-14M以下、10-14M或10-14M以下、5×10-15M或5×10-15M以下、10- 15M或10-15M以下，或KD在任何一对上述值之间的任何范围内(例如10-6M到5×10-10M、或5×10-9M到10-15M)。
在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白结合CD80且在结合分析(例如竞争分析)中抑制CD80与阿巴西普结合，IC50值为小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.75nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于5×10-2nM、小于10-2nM、小于5×10-3nM、小于10-3nM、小于5×10-4nM或小于10- 4nM，或IC50在任何一对上述值之间的任何范围内(例如100nM到5×10-2nM或0.5nM与5×10- 4nM)。
在一些实施例中，本发明CTLA4蛋白结合CD86且在结合分析(例如竞争分析)中抑制CD86与阿巴西普结合，IC50值为小于1000nM、小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.75nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于5×10-2nM、小于10-2nM、小于5×10-3nM、小于10-3nM、小于5×10-4nM或小于10-4nM，或IC50在任何一对上述值之间的任何范围内(例如100nM到5×10-2nM或0.5nM与5×10-4nM)。
在某些实施例中，在比较分析中，本发明融合蛋白的动力学性质与阿巴西普类似或相对于阿巴西普得以改进。举例来说，在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80和/或CD86结合的kon速率在阿巴西普的kon的约0.05倍到1000倍的范围内，例如kon为阿巴西普的kon的0.06倍、kon为阿巴西普的kon的0.08倍、kon为阿巴西普的kon的0.1倍、kon为阿巴西普的kon的0.5倍、kon为阿巴西普的kon的1倍、kon为阿巴西普的kon的1.1倍、kon为阿巴西普的kon的1.2倍、kon为阿巴西普的kon的1.3倍、kon为阿巴西普的kon的1.4倍、kon为阿巴西普的kon的1.5倍、kon为阿巴西普的kon的1.6倍、kon为阿巴西普的kon的1.6倍、kon为阿巴西普的kon的1.7倍、kon为阿巴西普的kon的1.8倍、kon为阿巴西普的kon的1.9倍、kon为阿巴西普的kon的2倍、kon为阿巴西普的kon的2.25倍、kon为阿巴西普的kon的2.5倍、kon为曲妥珠单抗(traztuzumab)的kon的2.75倍、kon为阿巴西普的kon的3倍、kon为阿巴西普的kon的4倍、kon为阿巴西普的kon的5倍、kon为阿巴西普的kon的6倍、kon为阿巴西普的kon的7倍、kon为阿巴西普的kon的8倍、kon为阿巴西普的kon的9倍、kon为阿巴西普的kon的10倍、kon为阿巴西普的kon的15倍、kon为阿巴西普的kon的20倍、kon为阿巴西普的kon的50倍、kon为阿巴西普的kon的75倍、kon为阿巴西普的kon的100倍、kon为阿巴西普的kon的150倍、kon为阿巴西普的kon的200倍，或kon在任何一对上述值之间的范围内，例如kon为阿巴西普的kon的0.1倍-75倍、kon为阿巴西普的kon的5倍-100倍、kon为阿巴西普的kon的0.05倍-1000倍、kon为阿巴西普的kon的0.75倍-250倍等。
在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80和/或CD86结合的koff速率在阿巴西普的koff的约0.001倍到约3倍的范围内，例如koff为阿巴西普的koff的0.002倍、koff为阿巴西普的koff的0.003倍、koff为阿巴西普的koff的0.004倍、koff为阿巴西普的koff的0.005倍、koff为阿巴西普的koff的0.006倍、koff为阿巴西普的koff的0.0075倍、koff为阿巴西普的koff的0.01倍、koff为阿巴西普的koff的0.025倍、koff为阿巴西普的koff的0.05倍、koff为阿巴西普的koff的0.075倍、koff为阿巴西普的koff的0.1倍、koff为阿巴西普的koff的0.25倍、koff为阿巴西普的koff的0.5倍、koff为阿巴西普的koff的0.75倍、koff为阿巴西普的koff的1倍、koff为阿巴西普的koff的1.25倍、koff为阿巴西普的koff的1.5倍、koff为阿巴西普的koff的1.75倍、koff为阿巴西普的koff的2倍、koff为阿巴西普的koff的2.25倍、koff为阿巴西普的koff的2.5倍、koff为阿巴西普的koff的3倍、koff为阿巴西普的koff的4倍、koff为阿巴西普的koff的5倍，或koff在任何一对上述值之间的范围内，例如koff为阿巴西普的koff的0.01倍到1.25倍、koff为阿巴西普的koff的0.05倍到2.5倍、或koff为阿巴西普的koff的0.006倍到0.1倍等。
在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80和/或CD86结合的KA(kon/koff)在阿巴西普的KA的约0.1倍到约1000倍的范围内，例如KA为阿巴西普的KA的0.2倍、KA为阿巴西普的KA的0.25倍、KA为阿巴西普的KA的0.5倍、KA为阿巴西普的KA的0.75倍、KA为阿巴西普的KA的1倍、KA为阿巴西普的KA的2倍、KA为阿巴西普的KA的3倍、KA为阿巴西普的KA的4倍、KA为阿巴西普的KA的5倍、KA为阿巴西普的KA的10倍、KA为阿巴西普的KA的15倍、KA为阿巴西普的KA的20倍、KA为阿巴西普的KA的30倍、KA为阿巴西普的KA的40倍、KA为阿巴西普的KA的50倍、KA为阿巴西普的KA的75倍、KA为阿巴西普的KA的100倍、KA为阿巴西普的KA的200倍、KA为阿巴西普的KA的250倍、KA为阿巴西普的KA的300倍、KA为阿巴西普的KA的350倍、KA为阿巴西普的KA的400倍、KA为阿巴西普的KA的500倍、KA为阿巴西普的KA的750倍、KA为阿巴西普的KA的1000倍，或KA在任何一对上述值之间的范围内，例如KA为阿巴西普的KA的0.1倍到100倍、KA为阿巴西普的KA的10倍到50倍、或KA为阿巴西普的KA的5倍到50倍等。
在其它实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80和/或CD86结合的KD(koff/kon)在阿巴西普的KD的约0.001倍到10倍的范围内，例如KD为阿巴西普的KD的0.001倍、KD为阿巴西普的KD的0.002倍、KD为阿巴西普的KD的0.003倍、KD为阿巴西普的KD的0.004倍、KD为阿巴西普的KD的0.005倍、KD为阿巴西普的KD的0.0075倍、KD为阿巴西普的KD的0.01倍、KD为阿巴西普的KD的0.025倍、KD为阿巴西普的KD的0.05倍、KD为阿巴西普的KD的0.075倍、KD为阿巴西普的KD的0.1倍、KD为阿巴西普的KD的0.2倍、KD为阿巴西普的KD的0.3倍、KD为阿巴西普的KD的0.4倍、KD为阿巴西普的KD的0.5倍、KD为阿巴西普的KD的0.75倍、KD为阿巴西普的KD的1倍、KD为阿巴西普的KD的1.5倍、KD为阿巴西普的KD的2倍、KD为阿巴西普的KD的3倍、KD为阿巴西普的KD的4倍、KD为阿巴西普的KD的5倍、KD为阿巴西普的KD的6倍、KD为阿巴西普的KD的7倍、KD为阿巴西普的KD的8倍、KD为阿巴西普的KD的9倍、KD为阿巴西普的KD的10倍，或KD在任何一对上述值之间的范围内，例如KD为阿巴西普的KD的0.001倍到0.5倍、KD为阿巴西普的KD的0.1倍到4倍、KD为阿巴西普的KD的0.05倍到1倍等。
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白与CD80和/或CD86结合且抑制细胞生长或IL2产生，IC50值在阿巴西普的IC50的约0.001倍到10倍的范围内，例如IC50为阿巴西普的IC50的0.005倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.01倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.05倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.1倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.2倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.3倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.4倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.5倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.6倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.7倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.8倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.9倍、IC50为阿巴西普的IC50的1倍、IC50为阿巴西普的IC50的1.5倍、IC50为阿巴西普的IC50的2倍、IC50为阿巴西普的IC50的3倍、IC50为阿巴西普的IC50的4倍、IC50为阿巴西普的IC50的5倍、IC50为阿巴西普的IC50的6倍、IC50为阿巴西普的IC50的7倍、IC50为阿巴西普的IC50的8倍、IC50为阿巴西普的IC50的9倍、IC50为阿巴西普的IC50的10倍、IC50为阿巴西普的IC50的100倍、IC50为阿巴西普的IC50的500倍、IC50为阿巴西普的IC50的1000倍，或IC50在任何一对上述值之间的范围内，例如IC50为阿巴西普的IC50的0.005倍到0.2倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.1倍到1.5倍、IC50为阿巴西普的IC50的0.2倍到2倍等。在某些实施例中，CDR样环中的单一取代可导致上述相较于阿巴西普的IC50差异，其中本发明CTLA4-Ig融合蛋白相较于阿巴西普可在CDR样环中包含所述取代和多达5个其它取代、多达10个其它取代、多达15个其它取代或多达20个其它取代。
8.CTLA4蛋白结合物
本发明CTLA4蛋白包括例如通过使任何类型的分子与蛋白质共价连接以使得所述共价连接不干扰与CD80或CD86结合而经修饰的结合物。
在某些方面，本发明CTLA4蛋白可与效应部分或标记结合。如本文所用的术语“效应部分”包括例如抗赘生性药剂、药物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(尤其放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报告基团(例如荧光化合物或可用NMR或ESR光谱法检测的化合物)。
在一个实例中，CTLA4蛋白可与效应部分(例如细胞毒性剂、放射性核素或药物部分)结合以改变给定生物反应。效应部分可为蛋白质或多肽，例如而不限于毒素(例如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(Diphtheria toxin))、信号传导分子(例如α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator))、免疫抑制剂(例如环孢素A(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)、卡普司-1H(Campath-1H)或糖皮质激素(glucocorticoid))或消炎剂(例如阿司匹林(aspirin)或萘普生(naproxen))或生物反应调节剂，例如抗体、抗淋巴细胞球蛋白(anti-lymphocyteglobulin)、蛋白质或细胞激素(例如抗TNFα抗体或影响细胞迁移的抗体，例如那他珠单抗(natalizumab))。
在另一实例中，效应部分可为细胞毒素或细胞毒性剂。细胞毒素和细胞毒性剂的实例包括紫杉醇(taxol)、细胞迟缓素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、特诺波赛(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorabicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoid)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、和嘌呤霉素、以及其类似物或同系物。
效应部分还包括(但不限于)抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(dacarbazine))、烷基化剂(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannitol)、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C5(mitomycin C5)和顺二氯二胺铂(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II))(DDP)顺铂(cisplatin))、蒽环霉素(anthracycline)(例如道诺霉素(daunorubicin，先前为daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin，先前为actinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin)(AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其它效应部分可包括放射性核素，例如(但不限于)111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨18s/铼188；和药物，例如(但不限于)烷基磷酸胆碱(alkylphosphocholine)、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷(taxoid)和苏拉明(suramin)。
使所述效应部分与蛋白质结合的技术在所属领域中为众所周知的(参看例如赫斯多姆(Hellstrom)等人,控制药物递送(Controlled Drug Delivery),第2版,第623-53页(罗滨逊(Robinson)等人编,1987))；索普(Thorpe)等人,1982,免疫学评论(Immunol.Rev.)62:119-58和杜波夫基克(Dubowchik)等人,1999,药理学与治疗学(Pharmacology andTherapeutics)83:67-123)。
在某些方面，CTLA4蛋白与小分子毒素结合。在某些示范性实施例中，本发明CTLA4蛋白与海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素的肽类似物或衍生物，例如奥瑞他汀(auristatin)(美国专利第5,635,483号和第5,780,588号)结合。海兔毒素或奥瑞他汀药物部分可经由其N(氨基)末端、C(羧基)末端或在内部与抗体连接(WO 02/088172)。示范性奥瑞他汀实施例包括N末端经连接的单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF，如美国专利第7,498,298号中所揭示，所述专利因此以全文引用的方式并入本文中(揭示例如连接子和制备与连接子结合的单甲基缬氨酸化合物(例如MMAE和MMAF)的方法)。
在其它示范性实施例中，小分子毒素包括(但不限于)卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利第5,208,020号)、新月毒素(trichothene)和CC1065。在本发明的一个实施例中，CTLA4蛋白与一个或一个以上美登素分子(例如每个蛋白质分子约1到约10个美登素分子)结合。美登素可例如转化成May-SS-Me，May-SS-Me可还原成May-SH3且与蛋白质反应(查理(Chari)等人,1992,癌症研究(Cancer Research)52:127-131)以产生类美登素-蛋白质(maytansinoid-protein)或类美登素-Fc融合结合物。也可使用的卡奇霉素的结构类似物包括(但不限于)γ11、γ31、γ31、N-乙酰基-γ11、PSAG和θ11(希曼(Hinman)等人,1993,癌症研究(Cancer Research)53:3336-3342；洛德(Lode)等人,1998,癌症研究(Cancer Research)58:2925-2928；美国专利第5,714,586号；美国专利第5,712,374号；美国专利第5,264,586号；美国专利第5,773,001号)。
在某些方面，本发明CTLA4蛋白可与免疫抑制剂连接。所述药剂包括糖皮质激素、细胞生长抑制剂、抗体、作用于免疫亲和素(immunophilins)的药物、士他汀类(statins)，和其它药剂，例如干扰素(例如INF-β和INF-γ)、类鸦片(opioids)、TNF结合剂(例如英利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、姜黄素(curcumin)和儿茶素(catechins))、霉酚酸酯(mycophenolate)、IL-1受体拮抗剂，和其它小分子药剂(例如芬戈莫德(fingolimod)、多球壳菌素(myriocin))。示范性糖皮质激素包括(但不限于)氢皮质酮(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、泼尼龙(prednisolone)、甲泼尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、乙酸氟氢皮质酮(fludrocortisoneacetate)、乙酸脱氧皮质酮(deoxycorticosterone acetate)和醛固酮(aldosterone)。示范性细胞生长抑制剂包括(但不限于)环磷酰胺、亚硝基脲(nitrosoureas)、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯基嘌呤、嘧啶类似物、蛋白质合成抑制剂，和抗生素，例如放线菌素D、蒽环霉素、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。示范性免疫抑制抗体包括(但不限于)抗CD20抗体、抗IL2受体抗体(达利珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab))、卡普司-1H、抗α4β1整合素抗体、抗IL-15抗体、抗IL-6受体抗体和抗CD3抗体(莫罗单抗(muromonab))。作用于免疫亲和素的示范性药剂包括(但不限于)环孢素、他克莫司和西罗莫司(sirolimus)。
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白可与消炎剂连接。示范性消炎剂包括(但不限于)非类固醇消炎剂，例如布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林、萘普生、二氟尼柳(diflunisal)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、依托度酸(etodolac)、酮洛酸(ketorolac)、噁丙嗪(oxaprozin)和塞来昔布(celecoxib)，和糖皮质激素，其也具有免疫抑制活性。
在一个实例中，本发明CTLA4蛋白可与聚(乙二醇)(PEG)部分连接。在一个特定实例中，PEG部分可经由位于蛋白质中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇基、羟基或羧基)连接。所述氨基酸可天然存在于蛋白质中或可使用重组DNA方法工程改造到蛋白质中。参看例如美国专利第5,219,996号。多个位点可用于连接两个或两个以上PEG分子。PEG部分可通过位于CTLA4蛋白中的至少1个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。当硫醇基用作连接点时，可使用适当活化的效应部分，例如硫醇选择性衍生物，例如顺丁烯二酰亚胺和半胱氨酸衍生物。CTLA4蛋白可使用所属领域中众所周知的技术，例如美国专利第4,179,337号、第4,301,144号、第4,496,689号、第4,640,835号、第4,670,417号和第4,791,192号中所述的技术与PEG或其它亲水性合成聚合物(例如聚丙二醇或聚氧化烯)连接，或与例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等聚合物连接。
“标记”一词在本文中使用时是指可直接或间接与本发明CTLA4蛋白结合的可检测化合物或组合物。标记本身可为可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记情形下，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。适用荧光部分包括(但不限于)荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素(phycoerythrin)等。适用酶标记包括(但不限于)碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。
尤其适用于诊断目的的其它CTLA4蛋白结合物描述于以下章节5.7中。
9.CTLA4蛋白的诊断用途
本发明CTLA4蛋白，包括已例如通过生物素化、辣根过氧化物酶或任何其它可检测部分(包括描述于章节5.6中的部分)修饰的蛋白质，可有利地用于诊断目的。
具体说来，CTLA4蛋白可用于例如(但不限于)与CD80和/或CD86结合以达成：体外白血球分型(typing)，从而确定B细胞成熟阶段；检测与B细胞相关的疾病；分离CD80和/或CD86阳性细胞；以及体外和体内诊断方法。(参看例如橫地(Yokochi)等人,1982,免疫学杂志(J.Immunol.)128(2):823-27)。举例来说，所述蛋白质可在免疫分析中用以定性和定量地测量生物样品中CD80和/或CD86阳性细胞的含量。用于执行所述诊断技术的通用指导见于例如哈露(Harlow)等人,抗体技术实验指南(Antibodies:A Laboratory Manual),第2版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1988)和汉普顿R(Hampton R)等人,血清学方法实验指南(Serological Methods A Laboratory Manual)(APS出版社(APS Press),1990)中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本发明CTLA4蛋白可在分析中用以鉴别能够调控T细胞/B细胞相互作用的其它药剂，例如抗CTLA4抗体或其片段。具体说来，所述分析鉴别能够抑制本发明蛋白质与CD80和/或CD86的结合的药剂。适用于筛选调控T细胞/B细胞相互作用的药剂的分析在所属领域中为已知的且包括(但不限于)竞争ELISA分析。
本发明另外涵盖与诊断剂结合的CTLA4蛋白或其片段。所述蛋白质可在诊断上用以例如检测相关标靶在特定细胞、组织或血清中的表达；或监测免疫反应的发展或进展作为临床测试程序的一部分，以例如确定给定治疗方案的功效。通过使蛋白质与可检测物质偶合可便于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属(使用各种正电子发射断层摄影法)和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可直接地或使用所属领域中已知的技术经由中间物(例如所属领域中已知的连接子)间接地与蛋白质(或其片段)偶合或结合。酶标记的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4,737,456号)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、溶菌酶、糖类氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)、微过氧化物酶(microperoxidase)等。适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生蛋白(avidin)/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯(dansyl chloride)或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白(aequorin)；且适合放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
本发明提供CD80和/或CD86表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明CTLA4蛋白(任选与可检测部分结合)接触生物样品(例如细胞、组织或体液)，和检测样品对于CD80-和/或CD86表达细胞是否为阳性，或样品相较于对照样品，是否已改变(例如减小或增加)表达CD80和/或CD86的细胞的数目。
可使用本发明方法诊断的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些实施例中，组织或体液为外周血液、外周血液白血球、活检组织(例如乳房或淋巴结活检体)和组织。
10.使用CTLA4蛋白的治疗方法
10.1 临床益处
本发明CTLA4蛋白与抗原呈递细胞上的CD80和/或CD86相互作用且调控T细胞与CD80/CD86阳性细胞的相互作用。因此，本发明蛋白质适用于治疗涉及T细胞与CD80/CD86阳性细胞(包括抗原呈递细胞)的相互作用调节异常的病理学病况。
如以上章节5.1中所述，在某些实施例中，本发明的变体CTLA4多肽对CD80和CD86具有不同结合亲和力。在其它实施例中，本发明的变体CTLA4多肽对CD80与CD86两者具有类似结合亲和力。CD80和CD86与T细胞表面蛋白质(例如CD28和CTLA4)结合且引发不同生物效应。举例来说，CD86与天然T细胞上的CD28结合可引发T细胞反应。因此，例如通过投与对CD86具有高或中性结合亲和力的本发明的变体CTLA4多肽抑制或减少CD86与CD28的结合可抑制T细胞反应的起始且导致T细胞无反应性。此外，CD80与CTLA4的结合可终止T细胞反应。因此，例如通过投与对CD80具有高或中性结合亲和力的本发明的变体CTLA4多肽抑制或减少CD80与T细胞上的CTLA4的结合可阻断反应的终止且延长T细胞反应。
因此，在某些实施例中，对CD80具有高结合亲和力且对CD86具有低结合亲和力的变体CTLA4多肽，或对CD80具有中性结合亲和力且对CD86具有低结合亲和力的变体CTLA4多肽适用于治疗要求T细胞介导的细胞杀灭增强的病况，例如癌症。在其它实施例中，对CD86具有高亲和力或中性结合亲和力且对CD80具有低亲和力的变体CTLA4蛋白，或对CD80与CD86两者均具有高结合亲和力的变体CTLA4蛋白适用于治疗由T细胞介导的细胞杀灭增强所引起的病况，例如自身免疫疾病、或组织、器官或细胞移植排斥反应。
在某些实施例中，本发明蛋白质适用于治疗赘生物。本发明蛋白质适用于治疗肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。本文中待治疗的癌症的实例包括(但不限于)黑素瘤、乳癌、前列腺癌、膀胱癌和结肠直肠癌。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)和各种类型的头颈部癌，以及多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；重度免疫母细胞性NHL；重度淋巴母细胞性NHL；重度小无裂细胞NHL；巨瘤症性NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病(Hairy cellleukemia)、慢性骨髓母细胞白血病、和移植后淋巴组织增生病症(PTLD)、以及与母斑病(phakomatosis)、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合症(Meigs'syndrome)相关的异常血管增生。
更具体说来，可用本发明CTLA4蛋白治疗的癌症包括CD80和/或CD86阳性癌症。在一些实施例中，适用于癌症治疗的本发明变体蛋白质对CD80具有高亲和力且对CD86具有低亲和力。在其它实施例中，适用于癌症治疗的本发明变体蛋白质对CD80具有中性亲和力且对CD86具有低亲和力。
在某些方面，癌症治疗方法包括在向患者投与本发明CTLA4蛋白的步骤之前，检测癌细胞上的CD80和/或CD86的步骤。所述检测步骤可通过所属领域中已知的用于测量癌细胞上的CD80和/或CD86蛋白质含量的任何方法(包括(但不限于)免疫组织化学分析)来达成。在某些实施例中，可使用经标记的抗CD80和/或抗CD86抗体进行免疫组织化学分析。
在各种实施例中，本发明蛋白质适用于治疗自身免疫疾病。在一些实施例中，本发明蛋白质适用治疗患有自身免疫疾病的患者，其先前尚未针对所述疾病进行治疗。在其它实施例中，本发明蛋白质适用于治疗患有自身免疫疾病且对用甲氨蝶呤、疾病改善抗风湿病药物或抗TNFα拮抗剂的治疗反应不充分的患者。在各种实施例中，本发明CTLA4蛋白适用于治疗选自类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎的自身免疫疾病。在一些实施例中，本发明蛋白质适用于治疗选自强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化症和全身性红斑狼疮症的自身免疫疾病。
更具体说来，本发明CTLA4蛋白适用于治疗选自以下的自身免疫疾病：急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis，ADEM)、急性坏死性出血脑白质炎、艾迪森氏病(Addison's disease)、无γ球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑形脱发、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合症(APS)、自身免疫再生不能性贫血、自身免疫自主神经障碍、自身免疫肝炎、自身免疫高脂质血症、自身免疫免疫缺乏、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫视网膜病、自身免疫血小板减少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura，ATP)、自身免疫甲状腺病、轴索和神经元神经病(axonal & neuronal neuropathies)、巴洛病(Balo disease)、白塞氏病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯曼病(Castleman disease)、口炎性腹泻(非热带性)、却格司氏病(Chagas disease)、与慢性疲劳综合症或肌肉纤维疼痛相关的自身免疫病况、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy，CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、谢格-司托司综合症(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮(cicatricial pemphigoid)/良性粘膜性类天疱疮、克罗恩氏病(Crohn's disease)、科根氏综合症(Cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、科沙奇病毒心肌炎(coxsackie myocarditis)、CREST病、原发性混合冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合症(Dressler's syndrome)、子宫内膜组织异位症、嗜伊红血球筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏脑脊随炎、埃文斯综合症(Evans syndrome)、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古巴士德氏综合症(Goodpasture's syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、古立安-白瑞综合症(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto's encephalitis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、低γ-球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病变、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病(第1型)、间质性膀胱炎、幼年性关节炎、幼年性糖尿病、川崎综合症(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eaton syndrome)、溶白血球血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(lyme disease)、美尼尔氏病(Meniere's disease)、显微多血管炎、混合结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren'sulcer)、姆查-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(参看德维克氏病)、嗜中性球减少症、眼瘢痕类天疱疮、视神经炎、反复性风湿病、PANDAS(与链球菌(Streptococcus)相关的婴儿自身免疫神经精神病症)、副肿瘤性小脑退化、阵发性夜间血红素尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)、帕里罗伯格综合症(Parry Romberg syndrome)、帕森那-特纳综合症(Parsonnage-Turnersyndrome)、睫状体平坦部炎(外周性眼色素层炎)、天疱疮(pemphigus)、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合症、多发性结节性动脉炎、第I型、第II型和第III型自身免疫多腺体综合症、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合症、心包切开后综合症、孕酮性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红血球形成不全、雷诺氏综合症(Raynauds phenomenon)、反射交感性营养不良、莱特氏综合症(Reiter's syndrome)、复发性多软骨炎、腿不宁综合症、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、史密德综合症(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、休格连氏综合症(Sjogren's syndrome)、精子和睾丸自身免疫性、僵人综合症、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合症(Tolosa-Huntsyndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、大疱性皮肤病、白斑症和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。
在某些实施例中，适用于治疗自身免疫疾病的本发明变体蛋白质对CD86具有高亲和力且对CD80具有低亲和力。在其它实施例中，适用于治疗自身免疫疾病的本发明变体蛋白质对CD86具有中性亲和力且对CD80具有低亲和力。在其它实施例中，本发明变体蛋白质对CD86与CD80两者均具有高亲和力。
在各种实施例中，本发明CLTA4蛋白质适用于治疗细胞、器官和组织移植物的排斥反应、移植物抗宿主疾病和/或适用于诱导患有第1型糖尿病的患者的异种移植耐受性，例如胰岛异种移植耐受性。在一些实施例中，本发明变体蛋白质对CD86具有高亲和力且对CD80具有低亲和力。在其它实施例中，本发明变体蛋白质对CD86具有中性亲和力且对CD80具有低亲和力。在其它实施例中，本发明变体蛋白质对CD86与CD80两者均具有高亲和力。
在一些实施例中，本发明蛋白质适用于治疗由依赖于T细胞活化的病毒增殖引起的感染。所述病毒包括(但不限于)HTLV-1、HIV-1和HIV2病毒。
因此，本发明提供治疗有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含：向所述患者投与本发明CTLA4蛋白。任选地，例如在以下时间之后重复所述投药：1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月或3个月。可以相同剂量或不同剂量重复投药。可重复投药1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。举例来说，根据某些给药方案，患者接受CTLA4疗法持续一段较长时期，例如6个月、1年或1年以上。在各种实施例中，CTLA4疗法的时期与无CTLA4疗法的时期交替。在某些实施例中，向患者投与的蛋白质的量为治疗有效量。如本文所用，“治疗有效”量的CTLA4蛋白可以单次剂量投与或历经治疗方案的过程投与，例如历经1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月、1年或1年以上的过程。示范性治疗方案描述于以下章节5.8.4中。
在某些实施例中，CTLA4疗法在疾病发作时或接近疾病发作时开始，例如在疾病发作之后1天到6个月开始。在一些实施例中，CTLA4疗法在疾病已进展之后开始，例如在疾病发作之后6个月到1年、2年、或3年开始。在其它实施例中，CTLA4疗法在疾病缓解期内投与。在其它实施例中，CTLA4疗法在疾病活动期内投与。投与CTLA4疗法的时序将视所属领域技术人员已知的因素而定，例如疾病性质和CD28-CD80/CD86共刺激途径在所治疗疾病中的作用。
根据本发明，治疗疾病涵盖治疗已经诊断为患有任何形式的处于任何临床阶段或表现形式的疾病的患者；延迟疾病症状或征象的发作或发展或加重或恶化；和/或防止和/或减轻疾病的严重性。
本发明CTLA4蛋白所投与的“个体”或“患者”较佳为哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴或人类)。在某些实施例中，个体或患者为人类。在某些方面，人类为成人患者。在其它方面，人类为婴儿患者。
10.2 医药组合物和投药途径
本文提供包含本发明CTLA4蛋白、任选的一种或一种以上其它治疗剂(例如以下章节5.8.3中所述的组合治疗剂)的组合物。组合物通常将作为一般将包括医药学上可接受的载剂的无菌医药组合物的一部分来提供。这种组合物可呈任何适合形式(视将其投与患者的所要方法而定)。
本发明CTLA4蛋白可通过多种途径投与患者，所述途径例如经口、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、局部、鞘内和脑室内。在任何给定情况下，最适合的投药途径均将视特定蛋白质、个体、和疾病的性质和严重性以及个体的身体状况而定。
对于治疗本文所述的适应症，本发明CTLA4蛋白的有效剂量经单次(例如推注)投药、多次投药或连续投药可在约0.1mg/kg到约75mg/kg的范围内，或经单次(例如推注)投药、多次投药或连续投药达到0.01μg/ml到5000μg/ml血清浓度的血清浓度，或其中任何有效范围或值，视所治疗的病况、投药途径以及个体的年龄、重量和状况而定。在某些实施例中，例如对于治疗类风湿性关节炎，各剂量可在每公斤体重约0.2mg到约50mg，例如每公斤体重约0.5mg到约20mg的范围内。CTLA4蛋白可调配成水溶液且通过输注投与。
医药组合物宜呈每剂量含有预定量的本发明CTLA4蛋白的单位剂型。这种单位可含有例如(但不限于)0.1mg到5g，例如1mg到1g、100mg到500mg、或10mg到50mg。用于本发明中的医药学上可接受的载剂可呈现多种形式，视例如待治疗的病况或投药途径而定。
可通过混合具有所要纯度的蛋白质与所属领域中常用的任选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(其在本文中皆称为“载剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂、非离子清洁剂、抗氧化剂和其它杂项添加剂，将本发明CTLA4蛋白的治疗调配物制备成冻干调配物或水溶液以供储存。参看雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences),第16版(奥斯陆(Osol)编1980)。所述添加剂在所用剂量和浓度下对接受者必须无毒。
缓冲剂有助于维持pH值在接近生理条件的范围内。其可以约2mM到约50mM范围内的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸与无机酸和其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、丁二酸盐缓冲液(例如丁二酸-丁二酸单钠混合物、丁二酸-氢氧化钠混合物、丁二酸-丁二酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、反丁烯二酸盐缓冲液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸单钠混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二钠混合物、反丁烯二酸单钠-反丁烯二酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐(例如Tris)。
可添加防腐剂以阻止微生物生长，且其添加量可在0.2%-1%(w/v)范围内。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苯甲基铵、苄烷铵(benzalconium)卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六羟季铵(hexamethonium chloride)，和对羟基苯甲酸烷酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加等张剂(有时称为“稳定剂”)以确保本发明的液体组合物的等张性，且等张剂包括多元糖醇，例如三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围可为膨胀剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘着于容器壁的添加剂。典型稳定剂可为多元糖醇(以上列举)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-白氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、岩藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇(cyclitols)，例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫甘油、α-单硫甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或10个以下残基的肽)；蛋白质，例如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，例如棉子糖；和多糖，例如葡聚糖。稳定剂可以每重量份活性蛋白质0.1到10,000重量的范围内存在。
可添加非离子表面活性剂或清洁剂(也称为“湿润剂”)以有助于使治疗剂溶解以及保护治疗蛋白质以免发生搅拌引起的聚集，其也允许调配物暴露于承受应力的剪切面而不导致蛋白质变性。适合的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamers)(184、188等)、氧化异丙烯多元醇(Pluronic polyols)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚(-20、-80等)。非离子表面活性剂可以约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml到约0.2mg/ml的范围存在。
其它杂项赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
本文调配物除本发明CTLA4蛋白外还可含有组合治疗剂。适合的组合治疗剂的实例提供于以下章节5.8.3中。
通过输注投药的给药时程可在每6个月1次到每日1次之间变化，视许多临床因素而定，包括疾病类型、疾病严重性和患者对CTLA4蛋白的敏感性。
待投与的本发明CTLA4蛋白的剂量将根据以下而变化：特定抗体、疾病类型、个体、和疾病严重性、个体的身体状况、治疗方案(例如是否使用组合治疗剂)和所选投药途径；所属领域技术人员可容易地确定适当剂量。
所属领域技术人员应了解，本发明CTLA4蛋白的最佳量、和个别剂量的间隔将由所治疗病况的性质和程度、投药形式、途径和部位、以及所治疗特定个体的年龄和状况决定，且医师将最终确定待使用的适当剂量。可适当地多次重复这个剂量。如果显现副作用，则可根据正常临床实践来改变或降低给药的量和/或频率。
10.3 组合疗法
以下描述可利用本发明CTLA4蛋白的组合方法。本发明的组合方法涉及向患者投与至少两种药剂，第一药剂为本发明CTLA4蛋白，且第二药剂为组合治疗剂。CTLA4蛋白与组合治疗剂可同时、依序或分别投与。
本发明的组合治疗方法可产生比累加效应大的效应，从而提供治疗益处，其中CTLA4蛋白或组合治疗剂均不以单独治疗有效的量投与。
在本发明方法中，本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂可并行(同时或依次)投与。如本文所用，如果本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂在同一天(例如在相同患者就诊期间)投与患者，则认为其为依次投与。依次投药可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小时进行。相比之下，如果本发明CTLA4抗体和组合治疗剂在不同天投与患者，例如本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂可以1天、2天或3天、1周、2周或1个月时间间隔投与，则认为其为分别投与。在本发明的方法中，投与本发明CTLA4蛋白可在投与组合治疗剂之前或之后进行。
作为非限制性实例，本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂可并行投与一段时期，随后的第二时期中交替投与本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂。
由于投与本发明CTLA4蛋白和组合治疗剂具有潜在协同效应，所以所述药剂可以在单独投与所述药剂中的一或两者时不具治疗有效性的量投与。
在某些方面，组合治疗剂为化学治疗剂、抗风湿病药物、消炎剂、放射线治疗剂、免疫抑制剂或细胞毒性药物。
用于本文所述的组合疗法中的抗风湿病药物包括(但不限于)阿那白滞素(anakinra)、金诺芬(auranofin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎(chloroquine)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、硫代苯酸金钠(Myocrisin)、柳氮磺胺吡啶甲氨蝶呤(sulfasalazine methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、来氟米特(leflunomide)和二甲胺四环素(minocycline)。
在某些实施例中，抗风湿病药物为TNF-α拮抗剂，包括(但不限于)以下药剂：例如英利昔单抗(infliximab)(森特考公司(Centocor))或其衍生物、类似物或抗原结合片段；阿达木单抗(adalimumab)(雅培公司(Abbott))或其衍生物、类似物或抗原结合片段；戈利木单抗(golimumab)(SIMPONITM；森特考公司(Centocor))或其衍生物、类似物或抗原结合片段；塞妥珠单抗(certolizumab pegol)(UCB)或其衍生物、类似物或抗原结合片段；依那西普(etanercept)(安进公司(Amgen))或其片段、衍生物或类似物；IL-10；沙立度胺(thalidomide)；黄嘌呤衍生物，例如配妥西菲林(pentoxifylline)；和安非他酮(Bupropion)(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))。
对于治疗癌症，癌症疫苗可与本发明CTLA4蛋白组合使用。适合的癌症疫苗包括靶向导致癌症的病毒的癌症疫苗，例如用于肝癌的B型肝炎疫苗和用于子宫颈癌的人类乳头状瘤病毒疫苗(和)。可与本发明方法组合使用的其它癌症疫苗包括(但不限于)用于前列腺癌的(登来隆公司(Dendreon),华盛顿西雅图(Seattle WA))和用于黑素瘤的OncoVexGM-CSF(BioVex生物公司(BioVex),马萨诸塞州沃本(Woburn MA))、用于非小细胞肺癌的LucanixTM、用于乳癌的和用于肾癌的(安进克斯公司(Antigenics),马萨诸塞州莱克星顿(Lexington MA))。在某些实施例中，癌症疫苗在投与本发明CTLA4多肽之前投与。
对于治疗癌症、自身免疫疾病或移植物排斥反应，消炎剂可与本发明CTLA4蛋白组合使用。适用于本文所述的方法中的消炎剂包括(但不限于)布洛芬、阿司匹林、萘普生、二氟尼柳、酮洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、双氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、依托度酸、酮洛酸、噁丙嗪、塞来昔布、乙酰胺苯酚、苯海拉明(diphenhydramine)、哌替啶(meperidine)、地塞米松、颇得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、安肠克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、贝诺酯(benorylate)和芬布芬(fenbufen)。
对于治疗自身免疫疾病或移植物排斥反应，免疫抑制剂可与本发明CTLA4蛋白组合使用。适用于本文所述的方法中的免疫抑制剂包括(但不限于)氢皮质酮；泼尼松；泼尼龙；甲泼尼龙；地塞米松；倍他米松；曲安西龙；倍氯米松；乙酸氟氢皮质酮；乙酸脱氧皮质酮；醛固酮；环磷酰胺；亚硝基脲；铂化合物；甲氨蝶呤；硫唑嘌呤；巯基嘌呤；嘧啶类似物；蛋白质合成抑制剂；放线菌素D；蒽环霉素；丝裂霉素C；博莱霉素；光神霉素；雷帕霉素；环孢素；他克莫司；西罗莫司；霉酚酸；咪唑立宾(mizoribine)；15-去氧斯匹胍素(15-deoxyspergualin)；霉酚酸吗啉乙酯(MMF)；抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyteglobulin)；抗CD20抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗IL2受体抗体(达利珠单抗、巴利昔单抗)或其衍生物、类似物或抗原结合片段；卡普司-IH；抗α4β1整合素抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗IL-15抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗IL-6受体抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD3抗体(莫罗单抗)或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗MHC抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD2抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD4抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD11a/CD18抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD7抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD27抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD80和/或抗CD86抗体(例如ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341等)或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD40抗体(例如ATCC HB-9110)或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD45抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD58抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD137抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗ICOS抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗CD150抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗OX40抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；抗4-1BB抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段；和低分子量粘着拮抗剂，例如LFA-1拮抗剂、选择素拮抗剂和VLA-4拮抗剂。
用于本文所述的组合方法中的其它免疫调节化合物包括(但不限于)可溶性gp39(也称为CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例如ATCC 68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、可与gp39反应的抗体(例如ATCC HB-10916、ATCC HB-12055和ATCC HB-12056)、可与CD28反应的抗体(例如ATCC HB-11944或mAb 9.3，如由马丁(Martin)等人(临床免疫学杂志(J.Clin.Immun.)4(1):18-22,1980)所述、可与LFA-1反应的抗体(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)、可与LFA-2反应的抗体、可与IL-12反应的抗体、可与IFN-γ反应的抗体、可与CD48反应的抗体、可与任何ICAM反应的抗体(例如ICAM-1(ATCC CRL-2252)、ICAM-2和ICAM-3)、可与CTLA4反应的抗体(例如ATCC HB-304)、可与Thy-1反应的抗体、可与CD56反应的抗体、可与CD29反应的抗体、可与TCR反应的抗体、可与VLA-4反应的抗体、可与VCAM-1反应的抗体、可与LECAM-1反应的抗体、可与ELAM-1反应的抗体、可与CD44反应的抗体。
对于治疗癌症，化学治疗剂可适合与本发明CTLA4蛋白组合使用。化学治疗剂包括(但不限于)：放射性分子；毒素，也称为细胞毒素或细胞毒性剂，其包括任何对细胞活力有害的药剂；含有化学治疗化合物的药剂和脂质体或其它微脂粒。适合的化学治疗剂的实例包括(但不限于)：1-去氢睾酮、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、阿德力霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整合素抗体、烷基化剂、别嘌呤醇钠(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、安美达锭(anastrozole)、氨茴霉素(AMC))、抗有丝分裂剂、顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、二氨基二氯铂(diamino dichloro platinum)、蒽环霉素(anthracycline)、抗生素、抗代谢物、天冬酰胺酶(asparaginase)、BCG活体(膀胱内)、倍他米松磷酸钠(betamethasone sodiumphosphate)和乙酸倍他米松(betamethasone acetate)、比卡鲁胺(bicalutamide)、硫酸博莱霉素(bleomycin sulfate)、白消安、甲酰四氢叶酸钙(calcium leucouorin)、卡奇霉素、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨(Cladribine)、秋水仙碱、结合雌激素、环磷酰胺、环磷酰胺(Cyclothosphamide)、阿糖胞苷、阿糖胞苷、细胞迟缓素B、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin，先前为actinomycin)、盐酸道诺霉素、柠檬酸道诺霉素、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、多西他赛(Docetaxel)、甲磺酸多拉司琼(dolasetronmesylate)、盐酸阿霉素、屈大麻酚(dronabinol)、大肠杆菌L-天冬酰胺酶(E.coli L-asparaginase)、伊洛昔单抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-α(epoetin-α)、伊文氏杆菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、溴化乙锭、乙烯雌二醇(ethinyl estradiol)、依替膦酸盐(etidronate)、依托泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟达拉宾(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、醛叶酸(folinic acid)、盐酸吉西他滨、糖皮质激素、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短杆菌肽D、盐酸格拉司琼(granisetron HCL)、羟基脲、盐酸黄胆素(idarubicin HCL)、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α-2b、盐酸伊立替康(irinotecan HCL)、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium)、乙酸亮丙立德(leuprolideacetate)、盐酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫司汀、类美登素(maytansinoid)、盐酸二氯甲基二乙胺(mechlorethamine HCL)、乙酸甲羟助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、盐酸美法仑(melphalan HCL)、硫醇嘌呤(mercaptipurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睪固酮、光神霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特(nilutamide)、乙酸奥曲肽(octreotideacetate)、盐酸昂丹司琼(ondansetron HCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二钠(pamidronate disodium)、喷司他丁(pentostatin)、盐酸毛果芸香素(pilocarpine HCL)、吡利霉素(plimycin)、以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入剂(polifeprosan 20 withcarmustine implant)、卟非姆钠(porfimer sodium)、普鲁卡因、盐酸丙卡巴肼(procarbazine HCL)、普萘洛尔(propranolol)、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、链佐霉素(streptozotocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、替尼泊甙(teniposide)、特诺波赛(tenoposide)、睾内酯(testolactone)、四卡因(tetracaine)、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、硫鸟嘌呤、噻替哌、盐酸拓朴替康(topotecan HCL)、柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、维甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)和酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)。
有时，对于治疗癌症，也向患者投与一种或一种以上细胞激素可为有益的。在一较佳实施例中，CTLA4蛋白与生长抑制剂共投与。生长抑制剂的适合剂量为目前所用的剂量且可由于生长抑制剂与CTLA4蛋白的组合作用(协同作用)而减小。
10.4 治疗方案
本发明提供涉及投与本发明CTLA4-Ig融合蛋白的治疗方案。治疗方案将视患者的年龄、重量和疾病病况而变化。治疗方案可持续2周到无限期。在具体实施例中，治疗方案持续2周到6个月、3个月到5年、6个月到1或2年、8个月到18个月等。治疗方案可为不变剂量方案或多变剂量方案。
对于下述剂量示范性方案，CTLA4-Ig融合蛋白可以用于静脉内输注的不含防腐剂的无菌溶液的形式投与。
对于治疗重量小于60kg的成人的类风湿性关节炎，本发明CTLA4-Ig融合蛋白以50mg到750mg的初始剂量静脉内投与。在具体实施例中，初始剂量为100-600mg、250-500mg、300-550mg、350-500mg、50-250mg、或400-600mg。在初始剂量之后，本发明CTLA4-Ig融合蛋白在首次输注后2周和4周静脉内投与且此后每4周静脉内投与，剂量为50-750mg，例如100-600mg，例如250-500mg，例如300-550mg，例如50-250mg，或剂量为400-600mg。
对于治疗重量介于60kg与100kg之间的成人的类风湿性关节炎，本发明CTLA4-Ig融合蛋白以75mg到1000mg的初始剂量静脉内投与。在具体实施例中，初始剂量为100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或600-800mg。在初始剂量之后，本发明CTLA4-Ig融合蛋白在首次输注后2周和4周静脉内投与且此后每4周静脉内投与，剂量为75-900mg，例如100-850mg，例如250-800mg，例如300-750mg，例如400-700mg，例如75-500mg，例如500-1000mg，或例如600-800mg。
对于治疗重量大于100kg的成人的类风湿性关节炎，本发明CTLA4-Ig融合蛋白以100mg到1500mg的初始剂量静脉内投与。在具体实施例中，初始剂量为250-1250mg、500-1100mg、750-1000mg、100-800mg、250-900mg、或700-1200mg。在初始剂量之后，本发明CTLA4-Ig融合蛋白在首次输注后2周和4周静脉内投与且此后每4周静脉内投与，剂量为100mg到1500mg，例如250-1250mg，例如500-1100mg，例如750-1000mg，例如100-800mg，例如250-900mg，或例如700-1200mg。
对于治疗年龄介于6岁与17岁之间且重量小于75kg的患者的幼年特发性关节炎，本发明CTLA4-Ig融合蛋白以0.1到15mg/kg的初始剂量静脉内投与。在具体实施例中，初始剂量为0.2-12.5mg/kg、0.5-12mg/kg、1-10.5mg/kg、2-10mg/kg、3-9mg/kg、或4-8.5mg/kg。在初始剂量之后，本发明CTLA4-Ig融合蛋白在首次输注后2周和4周静脉内投与且此后每4周静脉内投与，剂量为0.1到15mg/kg，例如0.2-12.5mg/kg、0.5-12mg/kg、1-10.5mg/kg、2-10mg/kg、3-9mg/kg、或4-8.5mg/kg。
对于治疗年龄为6岁到17岁且重量大于75kg的患者的幼年特发性关节炎，本发明CTLA4-Ig融合蛋白以75mg到1000mg的初始剂量静脉内投与。在具体实施例中，初始剂量为100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或600-800mg。在初始剂量之后，本发明CTLA4-Ig融合蛋白在首次输注后2周和4周静脉内投与且此后每4周静脉内投与，剂量为75-900mg，例如100-850mg，例如250-800mg，例如300-750mg，例如400-700mg，例如75-500mg，例如500-1000mg，或例如600-800mg。在这些实施例中，最大剂量不应超过1000mg。
在某些实施例中，本发明CTLA4-Ig融合蛋白用于治疗对甲氨蝶呤疗法或对使用抗TNFα药剂(例如依那西普英利昔单抗阿达木单抗塞妥珠单抗或sTNFR-IgG(来那西普(lenercept)))的疗法反应不充分的类风湿性关节炎患者。
10.5 诊断和医药试剂盒
本发明涵盖含有本发明CTLA4蛋白(包括CTLA4蛋白的结合物)的医药试剂盒。医药试剂盒为包含本发明CTLA4蛋白(例如呈冻干形式或呈水溶液形式)和一种或一种以上以下物质的包装：
·组合治疗剂，例如如以上章节5.8.3中所述；
·用于投与CTLA4蛋白的装置，例如笔、针和/或注射器；和
·如果蛋白质呈冻干形式，则用于再悬浮抗体的医药级水或缓冲液。
在某些方面，分别包装各单位剂量的CTLA4蛋白，且试剂盒可含有一个或一个以上单位剂量(例如2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量或10个以上单位剂量)。在一具体实施例中，所述一个或一个以上单位剂量各自收纳于注射器或笔中。
本文还涵盖含有本发明CTLA4蛋白(包括蛋白质结合物)的诊断试剂盒。诊断试剂盒为包含本发明CTLA4蛋白(例如呈冻干形式抑或呈水溶液形式)和一种或一种以上适用于执行诊断分析的试剂的包装。当CTLA4蛋白用酶标记时，试剂盒可包括为所述酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或溶解缓冲液)等。在某些实施例中，包括于诊断试剂盒中的CTLA4蛋白是固定于固体表面上，或在试剂盒中包括上面可固定蛋白质的固体表面(例如载片)。可大幅改变各种试剂的相对量以提供溶液中实质上使分析敏感度最佳化的试剂浓度。在一具体实施例中，蛋白质和一种或一种以上试剂可以干粉(通常经冻干)的形式提供(个别地或组合)，所述干粉包括溶解后将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
实例1：鉴别对CD80和CD86具有亲和力的CTLA4-IG变体
1.材料和方法
1.1.产生CD80和CD86蛋白
CD80和CD86蛋白表达为单体分泌的融合蛋白。使CD80或CD86的细胞外域与含有Cys到Ser突变以破坏分子间双硫键的人类λ恒定区融合(赤松(Akamatsu)等人,2007,免疫方法杂志(J Immunol.Methods)327:40)。使CD80-Cλ或CD86-Cλ融合蛋白在293T细胞的培养上清液中短暂表达。通过ELISA，使用山羊抗人类λ轻链抗体(生物资源公司(Biosource),卡马里奥(Camarillo),加利福尼亚(CA))进行捕捉并使用结合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人类λ链抗体(南方生物技术公司(Southern Biotech),伯明翰(Birmingham),亚拉巴马州(AL))进行检测，来估计这些融合蛋白的产生量。
1.2.CTLA4-Ig变体与CD80和CD86的结合
使融合有Cλ-HA标签的CD80或CD86与结合有山羊抗人类Cλ抗体的受体珠粒结合，且使经生物素标记的阿巴西普与抗生蛋白链菌素涂覆的供体珠粒(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer),沃尔瑟姆(Waltham),马萨诸塞州(MA))结合。使用标准方法用硫基-NHS-生物素对阿巴西普进行生物素标记且在PBS中透析。通过遵循制造商的说明书(“分析开发指南”，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))，执行受体珠粒的结合。在384孔AlphaPlate(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))中在分析缓冲液(含1%BSA、0.01%吐温20的PBS(pH 7.1))中执行结合分析。各孔含有0.5nM经生物素标记的阿巴西普、从40nM起始以1:4连续稀释的未标记CTLA4-Ig变体蛋白质、0.078μg/ml CD80和5μg/ml结合山羊抗人类Cλ的受体珠粒。在室温下在黑暗中培育板1小时。随后以5μg/ml添加抗生蛋白链菌素供体珠粒到各孔中。在室温下在黑暗中将板再培育30分钟，此后在EnVision读取器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上进行读取。利用软件GRAPHPADPRISM(GraphPad,圣地亚哥(San Diego))使用非线性回归拟合数据。对于CD86结合分析，如上所述在AlphaPlate中培育8nM经生物素标记的阿巴西普、从100nM起始以1:4连续稀释的未标记CTLA4-Ig变体蛋白质、0.1μg/ml CD86和10μg/ml结合山羊抗人类Cλ的受体珠粒，随后添加10μg/ml抗生蛋白链菌素供体珠粒。
1.3.产生表达细胞表面CD80或CD86的细胞系
将编码全长人类CD80和CD86的基因亚克隆到适当哺乳动物表达载体中。用脂染胺(Lipofectamine)2000(英杰公司(Invitrogen))将含有CD80或CD86的cDNA的各质粒转染到CHO-K1(ATCC)细胞中且针对在含有0.5mg/ml G418的F12K培养基(45%DMEM，45%F12K，10%FBS)中的稳定转染进行选择。通过FACS拣选CD80或CD86在细胞表面上的表达最高的1%单一克隆且进行培养以产生稳定细胞系。证实两个细胞系之间的表达量大致彼此相等。
1.4.CTLA4-Ig变体抑制Jurkat T细胞的IL-2产生的效能
在10μg/ml PHA-P和滴定量的阿巴西普或本发明CTLA4蛋白存在下培育Jurkat细胞(每孔3.0×105个)和稳定表达CD80或CD86的CHO-K1(每孔1.0×104个)。24小时后，使用人类IL-2试剂盒分析上清液以测量分泌的IL-2的量。
2.结果
利用证实关于CD80或CD86的结合的总计27个高亲和力变体和4个中性亲和力变体。在19个对CD80具有高亲和力的CTLA4-Ig变体中，具有突变K28H的CTLA4-Ig变体显示最高亲和力，其结合亲和力是野生型CTLA4-Ig对CD80的结合亲和力的11.9倍(图2A)。在18个对CD86具有高亲和力的CTLA4-Ig变体中，具有突变A29H的CTLA4-Ig变体显示最高亲和力，其结合亲和力是野生型CTLA4-Ig对CD86的结合亲和力的14.2倍(图2A)。
突变A29Y和L104E为并入贝拉西普(LEA29，百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb))中的突变且在本分析中被再鉴别为高亲和力变体(图3)。在分析中，贝拉西普显示相较于野生型CTLA4-Ig，与CD80和CD86的结合分别改进22倍和32倍(数据未图示)。
在无阻断剂的典型24小时分析中，在由PMA和稳定表达CD80或CD86的CHO-K1细胞刺激的Jurkat T细胞的培养上清液中产生2.1-3.5ng/ml IL-2。在例如CTLA4-Ig蛋白或抗CD80或抗CD86抗体等阻断剂存在下，通过阻断共刺激信号而抑制IL-2产生。在不存在PHA-P或对于CD80或CD86表达呈阴性的CHO-K1的情况下，Jurkat细胞不产生IL-2。类似地，在不存在Jurkat细胞的情况下，在培养的CHO-K1的培养上清液中未检测到IL-2(图4A)。
发现当Jurkat T细胞由PMA和表达CD80或CD86的CHO-K1细胞刺激时，野生型CTLA4-Ig与阿巴西普的抑制曲线实质上重叠(图4B)。这一结果指示野生型CTLA4-Ig和阿巴西普抑制Jurkat细胞产生IL-2的程度相同(即具有类似效能)。野生型CTLA4-Ig对CD80和CD86的平均IC50值分别测定为1.2nM和17.2nM。尽管相较于野生型CTLA4-Ig，贝拉西普中的两个氨基酸突变使对CD80的结合改进22倍，但相较于野生型CTLA4-Ig或阿巴西普，贝拉西普关于抑制CD80介导的T细胞活化的效能仅显示2.0倍的改进。相比之下，贝拉西普中所产生的CD86结合的32倍改进使得抑制CD86介导的T细胞活化的效能改进11.5倍。
本发明CTLA4变体对CD80的亲和力改进7.2倍到11.9倍使得抑制CD80介导的T细胞活化的效能改进1.1倍到2.2倍。相比之下，本发明CTLA4变体对CD86的亲和力改进7.0倍到14.2倍使得抑制CD86介导的T细胞活化的效能改进2.4倍到6.2倍。K28H和A29H CTLA4-Ig变体分别显示对CD80和CD86的最高亲和力以及抑制T细胞活化的最高效能。因此，赋予与配体结合的较高亲和力的突变通常使抑制T细胞活化的效能改进。同样，具有中性亲和力的变体使生物活性无显著差异(Y52F)。
这些结果指示相较于野生型蛋白质，对CD86具有较高结合亲和力的变体相较于对CD80具有较高结合亲和力的变体显示较佳效能，这类似于关于贝拉西普获得的结果。这一点可通过当基线结合亲和力较低时对生物活性具有较大影响的亲合力效应来说明。野生型CTLA4-Ig对CD80的结合亲和力可能过高以致于不能通过亲合力获得进一步改进。相比之下，野生型CTLA4-Ig对CD86的亲和力比对CD80的亲和力低13倍(克林斯(Collins)等人,2002,免疫学(Immunity)17:201-210)，意味着CTLA4-Ig变体对CD86的亲和力可得到改进。亲合力效应可见于关于具有突变L96K的CTLA4-Ig变体获得的结果(图4C)。尽管这种变体显示CD80结合亲和力显著降低(相较于野生型CTLA4-Ig，低10倍)，但这种变体的效能仅比野生型CTLA4-Ig的效能低2.4倍，这是由于亲合力对这种低亲和力变体的生物活性的影响增加之故。
实例2：评估CTLA4-IG变体抑制T细胞增殖的效能
1.材料和方法：CTLA4-Ig变体体外抑制T细胞增殖反应的效能
人类弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-6(ATCC CRL-2959)在细胞表面上表达CD80与CD86两者。将SU-DHL-6细胞维持于含有10%FBS的RPMI 1640中。通过如德国葛莱娜第一生化股份有限公司Leucosep(Leucosep Greiner Bio-One,Germany))的使用手册中所述的Ficoll-Paque Plus(通用电气医疗集团(GE Healthcare),皮斯卡塔市(Piscataway),新泽西州(NJ))密度梯度离心，从人类全血或白细胞层分离外周血液单核细胞(PBMC)。使用EasySep阴性选择人类CD4+T细胞增浓试剂盒(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies),加拿大(Canada))从PBMC分离人类外周CD4+T细胞。将T细胞培养于含有10%热失活FBS、β-巯基乙醇和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。所得培养物含有纯度在90%以上的CD4+。
为了建立分析，将在50μL培养基中稀释的不同浓度的CTLA4-Ig或其变体添加到圆底96孔微量滴定板的各孔中，一式三份。接着在150μL培养基中以5:1反应者-刺激物比率混合CD4+T细胞(1×105个)与新鲜照射(10,000拉德(rad))的B淋巴瘤细胞系(2×104个)。添加细胞到含有CTLA4-Ig或变体的孔中，使得最终体积为每孔200μL。在37℃下在5%CO2中培育初级同种异体刺激分析物5天，以0.5μCi/孔添加氚化胸苷，再培养18小时。使用制造商推荐的条件用细胞收集器(Filtermate Omnifilter-96收集器,珀金埃尔默公司(PerkinElmer))收集细胞且使用闪烁计数器(沃拉克特里克斯(Wallac Trilux))测量[3H]胸苷并入量。对于二级同种异体刺激分析，收集6天初级同种异体刺激的T细胞，通过Ficoll-PaquePlus密度梯度离心进行分离且在完全培养基中静息24小时。接着在CTLA4-Ig和其突变体存在下以如上的相同比率用新鲜照射的B淋巴瘤细胞再刺激T细胞3天。在37℃下培育二级刺激分析物2天，随后添加0.5μCi/孔的[3H]-胸苷，最后培养18小时。如上文所指示执行细胞收集。利用GraphPad Prism 5软件，使用非线性回归曲线拟合方法分析细胞增殖数据。
为了评估CTLA4-Ig变体抑制经同种异体抗原刺激的T细胞增殖的效能，用同种异体B细胞系SU-DHL-6(对CD80与CD86均呈阳性)(通过FACS证实，数据未显示)刺激经纯化的CD4+T细胞。野生型CTLA4-Ig与商业阿巴西普的抑制曲线彼此紧密重叠，从而指示抑制CD4+T细胞中的增殖反应的效能相等。对CD80和/或CD86的结合改进的所有变体在初级和二级反应中均显示较大的CD4+T细胞增殖反应抑制。对于初级和二级反应，观测到IC50的改进分别在1.5到20倍和1.5到10倍的范围内(图5和图6)。总之，对CD80和/或CD86的亲和力改进对CD4+T细胞的初级增殖反应的抑制作用大于二级反应，反映了记忆T细胞对二级反应的共刺激分子的依赖性降低(克洛夫特(Croft)等人,1997,重症免疫学评论(Crit.Rev.Immunol.)17:89)。
在测试的8个变体中，A29H突变引起的抑制初级与二级增殖反应两者的效能最大，分别约20倍和10倍。K28H突变次佳，其抑制初级和二级反应的效能分别改进约12倍和8倍(图5和6。A29H突变显示对CD86的结合活性改进14倍，但与CD80的结合仅改进3.0倍。另一方面，K28H突变体显示对两种配体的改进较为平衡，对CD80和CD86分别为12倍和9.5倍(图2A)。假定A29H和K28H突变的结合动力学和蛋白质稳定性相等，因为A29H突变引起的抑制初级与二级增殖反应两者的改进最佳，所以增加对CD86的亲和力可对效能具有更大影响。
L96K突变使CD80结合降低约11倍而使CD86结合改进约11倍。对CD86的结合较高同时对CD80的结合降低的另一实例为T51N(对CD86为10倍而对CD80为0.25倍)。因为两种变体均未显示抑制初级或二级反应的效能降低，所以对CD80的结合丧失至少多达11倍似乎可由对CD86的结合改进来补偿。另一种可能的解释是，因为已知CD80形成二聚体(池水(Ikemuzu)等人,2000,免疫学(Immunity)12:51)，所以亲和力丧失至少多达11倍可能对由CD80提供的亲合力具有最小影响。
总之，对任一配体的亲和力较高皆使抑制同种异体抗原刺激中的增殖反应的效能改进，与使用Jurkat和表达CD80或CD86的CHO细胞系的24小时分析的结果一致(图4)。CD80与CD86两者均可促进初级和二级同种异体反应，但在涉及配体表达和其它共刺激/粘着分子的差异含量下有可能促进程度不同。
具体实施例、参考文献的引用
本申请案中引用的所有公开案、专利、专利申请案和其它文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度就如同已个别地将各个别公开案、专利、专利申请案或其它文献出于所有目的以引用的方式并入一般。
尽管已说明且描述各种具体实施例，但应了解可在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出各种变化。

Claims (18)

1.一种变体CTLA4多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸21到112的氨基酸序列组成，其中所述变体CTLA4多肽与SEQ ID NO:1的区别在于氨基酸取代K28H。
2.一种变体CTLA4多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸21到112的氨基酸序列组成，其中所述变体CTLA4多肽与SEQ ID NO:1的区别在于氨基酸取代K28H和T51Y。
3.一种融合蛋白，其包括根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与免疫球蛋白恒定区和信号序列可操作地连接的变体CTLA4多肽。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其具有除了所述氨基酸取代之外的阿巴西普(SEQID NO:6)的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述变体CTLA4多肽和所述免疫球蛋白恒定区是经由铰链区连接。
7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区是选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区为IgG1。
9.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区中的至少一个半胱氨酸残基已被丝氨酸所取代以消除形成于两个Ig链之间的一个或多个二硫键。
10.一种变体CTLA4多肽-药物结合物，其包含根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽或根据权利要求3-9中任一权利要求所述的融合蛋白。
11.一种医药组合物，其包含根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽、根据权利要求3-9中任一权利要求所述的融合蛋白或根据权利要求10所述的变体CTLA4多肽-药物结合物以及医药学上可接受的载剂。
12.一种根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽、根据权利要求3-9中任一权利要求所述的融合蛋白、根据权利要求10所述的变体CTLA4多肽-药物结合物或根据权利要求11所述的医药组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中在所述药物施用之前，在受所述癌症影响的组织中检验CTLA4表达。
14.一种根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽、根据权利要求3-9中任一权利要求所述的融合蛋白、根据权利要求10所述的变体CTLA4多肽-药物结合物、或根据权利要求11所述的医药组合物在制备治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中在所述药物施用之前，在受所述自身免疫疾病影响的组织中检验CTLA4表达。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述自身免疫疾病是选自类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎。
17.一种根据权利要求1或2所述的变体CTLA4多肽、根据权利要求3-9中任一权利要求所述的融合蛋白、根据权利要求10所述的变体CTLA4多肽-药物结合物、或根据权利要求11所述的医药组合物在制备治疗或预防细胞、器官或组织移植物的排斥反应的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中在所述药物施用之前，在受所述排斥反应影响的组织中检验CTLA4表达。
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