CN105121470A - 抗cd25抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及针对CD25的抗体和这类抗体的用途，例如抑制器官移植排斥或治疗多发性硬化。

Description

抗CD25抗体及其用途
1.对相关申请的交叉引用
本申请要求35U.S.C.§119(e)下2013年3月15日提交且通过提述完整并入本文的临时申请no.61/798,547的权益。
2.序列表
本申请含有序列表，其已以ASCII形式电子提交且通过提述完整并入本文。所述ASCII拷贝创建于2014年3月13日，名称为381493-883WO(118138)_SL.txt且大小为63,669个字节。
3.发明领域
本发明涉及抗CD25抗体、包含抗CD25抗体的药物组合物和这类抗体的治疗性用途。
4.发明背景
高亲和力白介素-2受体(IL2-R)是一种异三聚体细胞表面受体，由α,β和γc多肽链构成(KD10-11M)。55kDa的α链，亦称为IL2-Rα,CD25,p55，和Tac(T细胞活化)抗原，是IL2-R独特性的。β(CD122；P75)和γc(CD132)链是细胞因子受体超家族(促红细胞生成素受体)的一部分且是其他细胞因子受体如IL-15R的功能性组分(Waldmann,1993,Immunol.Today14(6):264-70；Ellery等,2002,CytokineGrowthFactorRev.13(1):27-40)。中等亲和力受体是由β和γc链构成的二聚体(KD10-9M)，而低亲和力受体由无信号转导能力的单体α亚基组成(KD10-8M)(Waldmann,1993,Immunol.Today14(6):264-70)。
静息T细胞,B细胞和单核细胞表达极少的CD25分子。然而，当活化时，该受体快速转录和表达(Ellery等,2002,CytokineGrowthFactorRev.13(1):27-40；Morris等,2000,Ann.Rheum.Dis.59(Suppl.1):1109-14)。表达高亲和力IL2-R的细胞过量表达CD25(CD25亚基)，这导致高和低亲和力IL2结合概况(profile)两者(Waldmann等,1993,Blood82(6):1701-12；deJong等,1996,J.Immunol.156(4):1339-48)。抗CD25抗体达克珠单抗(daclizumab)，一种之前以商标名ZENAPAX上市的人源化抗CD25抗体，显示在涉及免疫系统的多种这类状况中的临床功效，如器官移植排斥(综述见Pascual等,2001,J.HeartLungTransplant.20(12):1282-90)，哮喘(参见例如Busse等,2008,Am.J.Respir.Crit.CareMed.178(10):1002-1008)，多发性硬化症(参见例如Bielekova等,2009,ArchNeurol.66(4):483-9)，葡萄膜炎(Nussenblatt,1999,Proc.Nat’l.Acad.USA96:7462-7466)，眼部炎症(Bhat等,2009,GraefesArch.Clin.Exp.Ophthalmol.247:687–692)和人T细胞白血病病毒1有关的T细胞白血病(Berkowitz等,2010,JournalofClinicalOncology,2010ASCOAnnualMeetingProceedings28(5月20日增刊):8043)。
第二部分或本申请任何其他部分中对任意参考文献的引用或鉴定不应理解为承认这类参考文献可作为相对于本公开的现有技术而获得。
5.发明概述
本公开涉及抗CD25抗体，其在序列上与抗CD25抗体达克珠单抗(daclizumab)有关但特征为改进的特性，如增加的对CD25的亲和力，增加的对IL2活性的抑制(如抑制IL2诱导的T细胞增殖的能力)，或降低的免疫原性。有意思的是，发明人发现抑制IL2活性的能力不总是与对CD25的亲和力相关。而且，发明人鉴定出降低达克珠单抗的免疫原性和改进其对IL2活性的抑制的某些氨基酸取代。
达克珠单抗重链(SEQIDNO:1)具有可变区，其含有4个框架区(FR)，称为(从氨基末端至羧基末端的次序)FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4，由3个本文中称为(从氨基末端至羧基末端的次序)CDR-H1,CDR-H2和CDR-H3的重链互补决定区(CDR)分隔开来。达克珠单抗的重链CDR序列指派为SEQIDNO:4(CDR-H1)；SEQIDNO:6(CDR-H2)；和SEQIDNO:8(CDR-H3)。达克珠单抗的重链FR序列指派为SEQIDNO:3(FR-H1)；SEQIDNO:5(FR-H2)；SEQIDNO:7(FR-H3)；和SEQIDNO:9(FR-H4)。
类似地，达克珠单抗轻链(SEQIDNO:2)具有可变区，其含有4个框架区(FR)，称为(从氨基末端至羧基末端的次序)FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4，由3个本文中称为(从氨基末端至羧基末端的次序)CDR-L1,CDR-L2和CDR-L3的轻链CDR分隔开来。达克珠单抗的轻链CDR序列指派为SEQIDNO:11(CDR-L1)；SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)。达克珠单抗的轻链FR序列指派为SEQIDNO:10(FR-L1)；SEQIDNO:12(FR-L2)；SEQIDNO:14(FR-L3)；和SEQIDNO:16(FR-L4)。
本公开提供抗体和结合片段，其在CDR序列上与达克珠单抗的CDR有关。所述抗体和结合片段还可具有与达克珠单抗的FR序列有关的FR序列。因此，在一些方面，本公开的抗体和片段包含在序列上与达克珠单抗的VH和VL区有关的VH和VL序列。达克珠单抗可变区的序列显示于图1A和1B，而CDR和框架区的编号在表1(重链)和2(轻链)列出。
在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体或抗CD25结合片段(统称为“抗CD25抗体”)特征为以下特性(a)(i)至(a)(v)的1、2、3、4或所有5个和(b)(i)至(b)(ii的1或2个特性：
(a)(i)所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的VH和VL序列可变区总共包含至少2,至少3,至少4或至少5个氨基酸取代；
(ii)所述抗CD25抗体的6个CDR相比于SEQIDNO:4,6,8,11,13，和15的CDR序列总共具有多达8,多达7,多达6,多达5,或多达4个氨基酸取代；
(iii)任一个个别的CDR相比于具有SEQIDNO:4,6,8,11,13，和15的CDR的抗体的相应CDR序列具有不超过3个氨基酸取代，或除CDR-H2以外的任一个个别的CDR相比于具有SEQIDNO:4,6,8,11,13，和15的CDR的抗体的相应CDR序列具有不超过2个氨基酸取代；
(iv)各个框架区相比于具有SEQIDNO:3,5,7,9,10,12,14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过1,2,3,4,或5个氨基酸取代；和/或
(v)本公开抗体的VH和VL序列具有与达克珠单抗的VH和VL序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)的至少75％序列同一性(且在某些实施方案中，至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％,或至少99％序列同一性)，和
(b)(i)所述抗CD25抗体相比于达克珠单抗在至少一个CDR中包含至少一个氨基酸取代；和/或
(ii)所述抗CD25抗体相比于达克珠单抗在至少一个框架区中包含至少一个氨基酸取代。
可单独或组合掺入本公开的抗CD25抗体中的例示性的各个CDR和FR取代列于表6-8和11-21中。
优选地，本公开的抗CD25抗体包含列于表6A中的至少一个氨基酸取代和/或表7A-7C中的至少一个取代组合。如此，在具体的实施方案中，本公开的抗CD25抗体包含来自S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7,S8,S9,S10,S11,S12,S13,S14,S15,S16,S17,S18,S19,S20,S21,S22,S23,S24,S25,S26,S27,S28,S29,S30,S31,S32,S33,S34,S35,S36,S37,S38,S39,S40,S41,S42,S43,S44,S45,S46,S47,S48,S49,S50,S51,S52,S53,S54,S55,S56,S57,S58,S59,S60,S61,S62,S63,S64,S65,S66,S67,S68,S69,S70,S71,S72,S73,S74,S75,S76,S77,S78和S79(见表6A)的至少一个取代和/或来自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C15,C16,C17,C18,C19,C20,C21,C22,C23,C24,C25,C26,C27,C28,C29,C30,C31,C32,C33,C34,C35,C36,C37,C38,C39,C40,C41,C42,C43,C44,C45,C46,C47,C48,C49,C50,C51,C52,C53,C54,C55,C56,C57,C58,C59,C60,C61,C62，和C63(见表7A-7C)的至少一个取代组合。任选地，本公开的抗体还包含表8,11-21和22-1至22-9中列出的一个或多个取代或取代组合。
在特定的实施方案中，重链和轻链相比于达克珠单抗的VH和VL序列的百分比序列同一性独立地选自至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％序列同一性,或至少99％序列同一性。在某些方面，本公开的抗体具有与达克珠单抗的VH和/或VL序列至少95％,至少98％或至少99％序列相同的VH和/或VL序列。
在多个方面，本公开的抗体(a)在其CDR中相比于达克珠单抗具有多达17个氨基酸取代和/或(b)在其框架区中相比于达克珠单抗具有多达20个氨基酸取代。在(a)的特定实施方案中，本公开的抗体在其CDR中相比于达克珠单抗具有多达2,多达3,多达4,多达5,多达6,多达7,多达8,多达9,多达10,多达11,多达12,多达13,多达14,多达15,多达16,或多达17个氨基酸取代。在(b)的特定实施方案中，本公开的抗体在其CDR中相比于达克珠单抗具有具有多达1,多达2,多达3,多达4,多达5,多达6,多达7,多达8,多达9,多达10,多达11,多达12,多达13,多达14,多达15,多达16,多达17,多达18,多达19或多达氨基酸取代。
本公开的抗体的活性可通过在IL2依赖性T细胞增殖测定法中测量IC50来测定，其在第5.4部分中进一步描述。IC50测量允许在多种抗体中的比较。因此，在一个方面，本公开提供单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：(a)结合人CD25；(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1),SEQIDNO:6(CDR-H2),SEQIDNO:8(CDR-H3),SEQIDNO:11(CDR-L1),SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多至8,多至7,多至6,多至5,多至4,多至3或多至2个氨基酸取代的CDR；和(c)在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有SEQIDNO:4,6,8,11,13，和15的CDR的相应抗体的IC50的多至50％。
在典型的实施方案中，所述IC50可以在IL2依赖性T细胞增殖测定法中为具有SEQIDNO:4,6,8,11,13，和15的CDR的相应抗体的多达50％,多达40％,或多达30％。
在某些方面，本公开的抗CD25抗体可包含发明人已显示降低达克珠单抗的免疫原性和/或改进其对IL2活性的抑制的各个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52K和T54R。在一些实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含氨基酸取代N53E。在一些实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52S,S53R和T54K，相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含N53E。
抗CD25抗体还可在其框架区内包含取代。在一些实施方案中，所述抗CD25抗体含有相比于SEQIDNO:3(FR-H1),SEQIDNO:5(FR-H2),SEQIDNO:7(FR-H3),SEQIDNO:9(FR-H4),SEQIDNO:10(FR-L1),SEQIDNO:12(FR-L2),SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代的框架区。在一些这类实施方案中，所述抗CD25抗体相比于包含分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。在特定的实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:5的FR-H2在FR-H2中包含氨基酸取代I48M。在其他特定的实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:5的FR-H2在FR-H2中不包含氨基酸取代I48。
在另一个方面，所述抗CD25抗体可相比于达克珠单抗表征。如此，本公开提供以下抗CD25抗体，其(a)结合人CD25；(b)包含相比于分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代的重链和轻链可变区；和(c)在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体的IC50的多达50％。
在典型的实施方案中，在IL2依赖性T细胞增殖测定法中所述IC50可以是具有分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体的IC50的多达50％,多达40％,或多达30％。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体包含一个或多个特定取代，包括相比于SEQIDNO:5的FR-H2在FR-H2中包含氨基酸取代I48M；相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52K和T54R和相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中包含S29K和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含N53D；相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52K和T54R和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含N53E；相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52S,S53R和T54K；相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代T54；相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中包含氨基酸取代S29K和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含N53D；相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代S53R和T54K；相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中包含氨基酸取代S29K和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中包含N53D；及其组合。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V和(ii)T54R，T54S或T54K，和任选地包含以下一个或多个：(iii)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的S53R，S53K或S53N，(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E58Q，(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E73K，(vii)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(viii)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V，(ii)S53K，S53R或S53N，和(iii)T54R，T54S或T54K，(iv)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(v)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E，和任选地进一步包含氨基酸取代(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，(ii)S53R或S53K，(iii)T54S或T54K，和(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(vi)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V和(ii)T54R，T54S或T54K，且任选地包含以下一个或多个(iii)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的S53R，S53K或S53N，(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E58Q，(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E73K，(vii)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(viii)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E。在一些这类实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:3(FR-H1)，SEQIDNO:5(FR-H2)，SEQIDNO:7(FR-H3)，SEQIDNO:9(FR-H4)，SEQIDNO:10(FR-L1)，SEQIDNO:12(FR-L2)，SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2包含FR-H2中的氨基酸取代I48M。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2不包含FR-H2中I48处的取代。在具体的实施方案中，本公开的抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段相比于包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V，(ii)S53K，S53R或S53N，和(iii)T54R，T54S或T54K，(iv)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(v)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E，和任选地进一步包含氨基酸取代(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R。在一些这类实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:3(FR-H1)，SEQIDNO:5(FR-H2)，SEQIDNO:7(FR-H3)，SEQIDNO:9(FR-H4)，SEQIDNO:10(FR-L1)，SEQIDNO:12(FR-L2)，SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2包含FR-H2中的氨基酸取代I48M。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2不包含FR-H2中I48处的取代。在具体的实施方案中，本公开的抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段相比于包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，(ii)S53R或S53K，(iii)T54S或T54K，和(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(vi)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。在一些这类实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:3(FR-H1)，SEQIDNO:5(FR-H2)，SEQIDNO:7(FR-H3)，SEQIDNO:9(FR-H4)，SEQIDNO:10(FR-L1)，SEQIDNO:12(FR-L2)，SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2包含FR-H2中的氨基酸取代I48M。在特定的实施方案中，框架区相比于SEQIDNO:5的FR-H2不包含FR-H2中I48处的取代。在具体的实施方案中，本公开的抗CD25抗体或抗CD25抗体结合片段相比于包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。
抗CD25抗体可包含表20(重链取代)和/或表21(轻链取代)中显示的一个或多个单或双氨基酸取代。表20和21中的单氨基酸取代已至少显示为在初步结合测定法中对CD25结合没有有害效果，且在一些情况中具有有益效果。如此，在一个方面，本公开提供单克隆抗CD25抗体，其(a)结合人CD25；(b)包含相比于EQIDNO:4(CDR-H1),SEQIDNO:6(CDR-H2),SEQIDNO:8(CDR-H3),SEQIDNO:11(CDR-L1),SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多达8,多达7,多达6,多达5,多达4,多达3或多达2个氨基酸取代的CDR；和(c)相比于具有SEQIDNO:4(CDR-H1),SEQIDNO:6(CDR-H2),SEQIDNO:8(CDR-H3),SEQIDNO:11(CDR-L1),SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR的抗体，具有(i)重链CDR，其包含存在于如表20中所示的CDR变体H1-H354的任一个中的至少一个取代；和/或(ii)轻链CDR，其包含存在于如表21中所示的CDR变体L1-L288和L649的任一个中的至少一个取代。
在一些实施方案中，所述抗CD25抗体包含以下任一个CDR变体中存在的至少两个取代：如表20中显示的H361-H369,H405-H443,H449-H487；H493-H531；H537-H572；H578-H613；H619-H654；H660-H690；H696-H726；H732-H762；H768-H798；H804-H834；H840-H865；H871-H896；H902-H927；H933-H958；H964-H989；H995-H1015；H1021-H1041；H107-H1067；H1073-H1093；H1099-H1119；H1125-H1141；H1147-H1163；H1169-H1185；H1191-H1207；H1213-H1226；H1232-H1245；H1251-H1264；H1270-H1280；H1286-H1296；H1302-H1312；H1316-H1327；H1333-H1341；H1347-H1351；H1357-H1361；H1367-H1371；H1377-H1381；H1387-H1391；H1425-H1476；H1478-H1517；和H1519-H1558和/或如表21中显示的任一个CDR变体L289-L648和L650-L679中存在的至少两个取代。
还提供在其重链中相比于SEQIDNO:1的重链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代的抗CD25抗体。在一些实施方案中，这些抗CD25抗体在其重链中相比于SEQIDNO:1的重链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代，与降低免疫原性的特定重链取代组合，如I48M；I48V；I51L；T54S；I48M和I51L；I48V和T54S；I48M和T54S。在其他实施方案中，所述抗CD25抗体相比于SEQIDNO:2的轻链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代。
在一个方面，本公开提供单克隆抗CD25抗体，其：(a)结合人CD25；(b)具有重链可变区，其相比于SEQIDNO:1的重链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代，所述重链相比于SEQIDNO:1的重链包含选自以下的至少一个取代或取代组合：(i)I48M；(ii)I48V；(iii)I51L；(iv)T54S；(v)I48M和I51L；(vi)I48V和T54S；和(vii)I48M和T54S；(c)具有轻链可变区，其相比于SEQIDNO:2的重链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代。
在另一个方面，本公开提供单克隆抗CD25抗体，其：(a)结合人CD25；(b)包含相比于分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区具有多达12,多达11,多达10,多达9,多达8,多达7,多达6,多达5或多达4个氨基酸取代的重链和轻链可变区；和(c)包含存在于如表7A-7C中所示的任一个组合变体例如变体C1-C19,C21和C24-C63中的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗CD25抗体包含来自表8A的至少一个轻链CDR取代和/或来自表8B的至少一个重链CDR取代。在特定的实施方案中，所述来自表8A的至少一个轻链CDR取代包括以下一种或多种：(a)CDR-L1中的S24V；(b)CDR-L1中的A25I,A25T或A25M；(c)CDR-L1中的S26L；(d)CDR-L1中的S27K,S27R,S27A,或S27N；(e)CDR-L1中的S29A,S29K或S29R；(f)CDR-L1中的M33G；(g)CDR-L2中的T50A；(h)CDR-L2中的S52A,S52V,S52D,S52E或S52M；(i)CDR-L2中的N53A,N53D,N53E,N53F或N53Y；(j)CDR-L2中的L54H；(k)CDR-L2中的S56A；(l)CDR-L3中的T93Q,T93R,T93M；和(m)CDR-L3中的T97S。
在特定的实施方案中，所述来自表8B的至少一个重链CDR取代包括以下一种或多种：(a)CDR-H1中的S31F,S31K,S31R或S31W；(b)CDR-H1中的Y32S,Y32T或Y32V；(c)CDR-H1中的M34A,M34T或M34V；(d)CDR-H2中的I51W,I51L,I51A,I51K或I51V；(e)CDR-H2中的N52A,N52K,N52R,N52S或N52V；(f)CDR-H2中的S53K,S53T,S53P或S53A；(g)CDR-H2中的T54A,T54K,T54S或T54V；(h)CDR-H2中的Y56K,Y56R或Y56A；(i)CDR-H2中的T57A,T57D或T57G；(j)CDR-H2中的Y59E；(k)F63S；(l)CDR-H2中的K64A,K64D,K64V或K64G；(m)CDR-H3中的D101G；和/或(n)CDR-H3中的Y102D,Y102K,Y102Q或Y102T。
在某些实施方案中，所述抗CD25抗体包含其中野生型非组氨酸残基被组氨酸取代的来自表8A的至少一个轻链CDR取代和/或来自表8B的至少一个重链CDR取代。
在某些特定的实施方案中，本公开的抗CD25抗体特征在于不存在特定氨基酸取代。例如，在某些实施方案中，本公开的抗CD25抗体特征在于以下特征之一或任意两个、三个、四个、五个或所有六个的组合：
(a)VH序列不由如表22-1至22-3中所示的任一个变体XH1至XH16的VH序列组成；
(b)VL序列不由如表22-4至22-8中所示的任一个变体XL1至XL25的VL序列组成；
(c)VH和VL序列不由如表22-9中所示的抗体XF1至XF15的VH和VL序列组成；
(d)VH序列不包含取代E73K；
(e)本公开的抗CD25抗体的VH不包含以下取代的一种、两种、三种或所有四种：(i)CDR-L1中的S31K；(ii)CDR-L1中的S31R；(iii)CDR-L3中的S92K和(iv)CDR-L3中的S92R，或者若存在这类取代，则抗CD25抗体包含选自表6-8,20和21的一个或多个其他取代；和
(e)本公开的抗CD25抗体的VL不包含以下取代的一种、两种、三种或所有四种：(i)CDR-H2中的N52K；(ii)CDR-H2中的N52R；(iii)CDR-H2中的S53R，和(iv)CDR-H2中的T54R，或者若存在这类取代，则抗CD25抗体包含选自表6-8,20和21的一个或多个其他取代。
本公开的抗体可以是人或人源化抗体或其抗CD25结合片段。在一些实施方案中，所述抗体是IgG，包括IgG1,IgG2,IgG2M3，和IgG4。抗体可以是同种型IgG1fa，但在特定的实施方案中，抗体不是同种型IgG1fa。所公开的抗体可以具有Fc域，其包含取代M428L和任选地进一步包含取代T250Q。
本领域技术人员将领会抗CD25抗体关于其Fc区可具有修饰。因此，一些公开的抗CD25抗体包括Fc区中增加ADCC活性的一个或多个突变。在其他实施方案中，所述抗CD25抗体包含Fc区中降低ADCC活性的一个或多个突变。本公开的抗体可以是非岩藻糖基化的，且可以包含在Fc区中增加对FcγR的结合、降低对FcγR的结合或增加对FcRn的结合的一个或多个突变。
在一个方面，本公开的抗CD25抗体相比于达克珠单抗展现对CD25的改进亲和力。因此，所述抗CD25抗体具有的对CD25的亲和力为具有对应于SEQIDNO:1的VH序列和对应于SEQIDNO:2的VL序列的相应抗体对CD25的亲和力的2至100倍。在一些实施方案中，本公开的抗体展现比具有对应于SEQIDNO:1的VH序列和对应于SEQIDNO:2的VL序列的相应抗体将对CD25的亲和力改进了至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍(exhibitimprovedaffinitytoCD25byatleast1.2-fold,atleast1.5-fold,atleast2-fold,atleast3-fold,atleast4-fold,atleast5-fold,atleast10-fold,atleast15-fold,atleast20-fold,atleast30-fold,atleast50-fold,atleast60-fold,atleast70-fold,atleast80-foldoratleast90-foldofacorrespondingantibodyhavingVHsequencecorrespondingtoSEQIDNO:1andaVLsequencecorrespondingtoSEQIDNO:2)，或展现在前述任意一对改进值之间的亲和力范围(例如3倍至15倍、5倍至10倍、2倍至30倍、10倍至50倍或5倍至70倍)。
抗CD25抗体可以是纯化的，且在一些实施方案中，可以纯化至至少85％,至少90％,至少95％或至少98％同质性。
本公开提供包含本公开的变体抗CD25抗体的药物组合物，以及包含本公开的抗CD25抗体的抗体-药物缀合物。
本文中提供包含编码本公开的抗CD25抗体的核苷酸序列的核酸，以及包含核酸的载体。另外，本文中提供用包含编码抗CD25抗体的核苷酸序列的载体转化的原核和真核宿主细胞，以及工程化为表达所述核苷酸序列的真核(如哺乳动物)宿主细胞。还提供通过培养宿主细胞来产生抗CD25抗体的方法。
本公开的抗CD25抗体可用于治疗多种免疫疾患和癌症，如器官移植排斥、哮喘、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症和人T细胞白血病病毒1有关的T细胞白血病。
应注意本申请中使用不定冠词“一个”和“一种”和定冠词“该/所述”，如同专利申请中常见的，意为一种或多种，除非上下文清楚地指示另外的含义。此外，本申请中使用术语“或”，如同专利申请中常见的，意为转折性“或”或者连词“和”。
本说明书中提供的所有公开出版物均通过提述并入本文。纳入说明书中的任何文件、法令、材料、装置(device)、制品(article)等的论述仅用于提供本公开的背景的目的。不应视为承认这些事物中的任意或所有形成现有技术基础的一部分或是如其在本申请的优先权日之前存在于任一处的本领域中关于本公开的一般普通知识。
本公开的特征和优点将从其以下实施方案的详细描述变得进一步明显的。
6.对表和图的简述
本申请在5个分开的部分包含表和图：一部分含有所有图；一部分含有表1-19；一部分含有表20；一部分含有表21；和一部分含有表22-1至22-9。所有部分通过提述并入本文。
表1显示达克珠单抗的重链可变区中氨基酸的编号。
表2显示达克珠单抗的轻链可变区中氨基酸的编号。
表3显示纳入达克珠单抗组合文库的氨基酸列表。VL和VH文库的氨基酸复杂性分别为69,984和34,848。每列顶部的粗体氨基酸指示野生型。在最终富集后比理论百分比富集超过3倍或超过2倍但低于3倍的氨基酸分别加双下划线或单下划线。富集后降低至理论百分比的不到0.5的氨基酸以斜体显示。
表4显示达克珠单抗变体的结合动力学和生物学功能。对于高亲和力达克珠单抗变体，显示VH位置#52,53,54和VL#29,53的氨基酸组合。突变体氨基酸以粗体字母指示。亲本VH-VL(用作转染对照)称为NST-SN。VH位置#56和58未显示，因为它们在富集后高度偏向亲本氨基酸。对于丙氨酸突变，显示了野生型氨基酸和取代为丙氨酸的位置(例如丝氨酸#31变为丙氨酸称为S31A)。结合(kon)和解离(koff)速率常数使用表面等离振子共振在BIAcore中测定。显示了至少3份分别的测定的平均数值。解离常数(KD)从kon/koff计算。通过对Kit225/K6细胞(n＝2-3)增殖的抑制来测量功能改进。功能测定法中亲本达克珠单抗的IC50值对于每组实验在0.12-0.23nM的范围中。将达克珠单抗变体的KD和IC50值用获自野生型达克珠单抗的那些标准化以分别计算亲和力和功能中的改进。n.d.：未测定。
表5显示对达克珠单抗变体的剖析。结合(kon)和解离(koff)速率常数使用表面等离振子共振在BIAcore中测定。显示了至少3份分别的测定的平均数值。解离常数(KD)从kon/koff计算。n.d.：未测定。所有变体和NST-SN(对照)抗体均通过亚克隆后共转染一对重链和轻链表达载体来表达。(倍数改进/突变)。通过对Kit225/K6细胞增殖的抑制来测量功能改进。FACS结合、ELISA竞争和增殖抑制测定法分别基于2、3和3-5个独立实验的平均值。
表6A-6B.表6A汇总了具有引起有益特性的单个CDR或框架氨基酸取代的达克珠单抗变体的属性。*＝类似于WT。表6B汇总了通过ELISA直接结合板包被的CD25在重链中测试另外的单氨基酸取代的测试结果。
表7A-7D.表7A-7C描述了具有CDR和框架取代组合的达克珠单抗的63个变体(变体C1至C63)。变体被嫁接到不同的恒定区上，其反映在“同种型”列。表7D提供选择的组合变体的动力学和生物学活性。“ELISA”意指ELISA竞争测定法中改进的结合。“FACS”意指如通过FACS测量的对Hut/Kit225细胞的相对结合。“Kit225”意指对IL2诱导的Kit225细胞增殖的抑制中的改进。“CD56NK扩增”意指在将人PBMC与rhIL2和指定的抗CD25抗体变体培养后CD56brightNK细胞数目中的倍数增加。“倍数效力MLR”意指对基于人细胞的混合的淋巴细胞应答的抑制中的倍数改进。ELISA,KIT225,MLR和CD56测定的图代表相对于组合变体C27(具有取代I48M(在达克珠单抗重链的框架2中)和T54S(在达克珠单抗重链的CDR2中))的改进。
表8A-8B显示达克珠单抗CDR中的突变，其在群体测定法的背景中评估时不显著影响结合。表8A：达克珠单抗重链CDR中不实质性影响CD25结合且可以掺入本公开的抗体中的突变。表8A按出现次序分别公开了SEQIDNO186、13和15。表8B：达克珠单抗轻链CDR中不实质性影响CD25结合且可以掺入本公开的抗体中的突变。表8B按出现次序分别公开了SEQIDNO6和184。
表9显示了如I-muneAssayTM中测试的达克珠单抗VH(按出现次序分别为SEQIDNO92-127)和VL肽(按出现次序分别为SEQIDNO60-91)。每种肽长为15个氨基酸，偏移3个氨基酸。CDR氨基酸加下划线。
表10显示了E.HAT-VH合成的寡核苷酸的序列(按照出现次序，分别地，SEQIDNO:128-131)。
表11显示了选择用于I-muneAssay中测试的VH表位区氨基酸变体。“百分比”指具有等于或大于2.95的刺激指数(indexes)的测试的总供体(n＝78)的百分比。“AveSI”是对所有测试供体的平均刺激指数。S.e.m.是平均刺激指数的均值的标准误。按照出现次序，分别地，表11公开了SEQIDNO132-178和132。
表12显示了对于达克珠单抗VH表位区的单氨基酸变体汇编的增殖应答数据。“P”指亲本表位肽序列。大于2.95的数值指示以2.95或更大的刺激指数(SI)增殖的测试的供体样品总数。应答者的百分比指示其CD4+T细胞以2.95或更大的刺激指数应答的供体百分比。平均SI是所有测试供体的平均刺激指数。t检验是对I48M变体的刺激指数结果相比于亲本肽的应答的比较。
表13显示了对于达克珠单抗VH表位区的双氨基酸变体汇编的增殖应答数据。“P”指亲本表位肽序列。大于2.95的数值指示以2.95或更大的刺激指数(SI)增殖的测试的供体样品总数。应答者的百分比指示其CD4+T细胞以2.95或更大的刺激指数应答的供体百分比。平均SI是所有测试供体的平均刺激指数。t检验是对指定变体的刺激指数结果相比于亲本肽的应答的比较。
表14显示了对于4个选定的达克珠单抗表位区变体汇编的应答数据。上面的图是从所有78个测试的供体汇编的数目。下面的图是来自显示对亲本肽的2.95或更大的应答的供体的数据(n＝18)。大于2.95的数值指示以2.95或更大的刺激指数(SI)增殖的测试的供体样品总数。应答者的百分比指示其CD4+T细胞以2.95或更大的刺激指数应答的供体百分比。平均SI是所有测试供体的平均刺激指数。t检验是对指定变体的刺激指数结果相比于亲本肽的应答的比较。按照出现次序，分别地，表14公开了SEQIDNO132,135,149,154,160,132和179-183。
表15显示了达克珠单抗HYP(通过高产量过程(highyieldprocess)制备的达克珠单抗)、E.HAT和单氨基酸变体的IL2-Rα(CD25)结合效力。结合在ELISA形式中测量。
表16显示了达克珠单抗HYP、E.HAT和双氨基酸变体的IL2-Rα结合效力。结合在ELISA形式中测量。
表17显示了单氨基酸变体抗体分子的亲和力测量，如通过表面等离振子共振测量的。
表18显示了双氨基酸变体抗体分子对人CD25的亲和力测量，如通过表面等离振子共振测量的。
表19显示了双氨基酸变体抗体分子对猕猴CD25的亲和力测量，如通过表面等离振子共振测量的。
表20显示了达克珠单抗的重链CDR和FR变体的序列例示性种类。表20公开了野生型序列为SEQIDNO6和184。
表21显示了达克珠单抗的轻链CDR变体的序列例示性种类。表21公开了野生型序列SEQIDNO11,13和185。
表22-1至22-9显示了通过提述完整并入本文的美国专利No.8,314,213中披露的抗CD25抗体的序列。美国专利No.8,314,213的16个VH变体序列复制于表22-1至22-3并命名为XH1至XH16。美国专利No.8,314,213的24个VL序列复制于表22-4至22-8并命名为XL1至XL25。美国专利No.8,314,213中通过组合不同变体VH和VL序列生成的25个变体抗体分子列于表22-9，其命名为组合XF1至XF25。
图1A-1B分别显示达克珠单抗重链和轻链可变区的氨基酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，CDR区为有划线的文本。按照出现次序，分别地，表22-1公开了野生型序列为SEQIDNO4-5,表22-2公开了野生型序列为SEQIDNO:6,表22-3公开了野生型序列为SEQIDNO:7,表22-4公开了野生型序列为SEQIDNO:10,表22-5公开了野生型序列为SEQIDNO11-12,表22-6公开了野生型序列为SEQIDNO:13,表22-7公开了野生型序列为SEQIDNO:14和表22-8公开了野生型序列为SEQIDNO15-16。
图2A-2D.图2A-2B显示了达克珠单抗的再人源化中利用的氨基酸序列(见实施例1)。(均按照出现次序，分别地，图2A公开了SEQIDNO1和52-55，和图2B公开了SEQIDNO2和56-59)。图2C显示了再人源化对于达克珠单抗对CD25亲和力的影响。图2D显示了重链取代对CD25亲和力的影响。
图3A-3C显示了结合动力学和生物学功能之间的关系。所有达克珠单抗变体(包括丙氨酸取代)的IL2阻断活性中的倍数改进绘成亲和力KD(图3A)、解离速率常数koff(图3B)和结合速率常数kon(图3C)的函数。
图4A-4B显示VKR-SN,VKR-KD,KSR-SN,KSR-SE在Fab中的功能性比较。图4A：竞争ELISA以比较Fab对CD25的亲和力。在存在滴定量的竞争物Fab(从野生型或变体达克珠单抗生成)的情况下分析生物素化野生型达克珠单抗IgG对CD25的结合。图4B：使用纯化的Fab的IL2-R阻断活性。通过IL2依赖性细胞系Kit225/K6的增殖测量受体阻断。数据用获自达克珠单抗Fab的IC50值标准化，显示为生物功能中的倍数改进。
图5显示在I-mune测定法中测试的来自表9的达克珠单抗轻链V区肽的结果。显示了115份供体样品中的百分比应答。
图6显示在I-mune测定法中测试的来自表9的达克珠单抗重链V区肽的结果。显示了115份供体样品中的百分比应答。
图7显示了人PBMC对E.HATFab和4种变体的平均增殖性应答。将来自E.HAT和4种变体抗体的热失活Fab片段与人PBMC共培养6天。对于每个供体在每个浓度计算刺激指数，并将结果平均。数据显示为平均SI±sem。
图8显示了平均刺激指数对以SI>1.99应答的供体百分比。选择25μg/ml浓度的数据，并对其增殖性应答达到1.99或更高值的供体的百分比作图。
图9显示了对于所有测试的变体，来自图6中以高于1.99的SI对E.HATFab应答的供体的平均刺激指数。将来自在25μg/ml浓度其应答大于1.99的所有供体的增殖性应答平均。数据显示为平均SI+sem。
图10显示了平均刺激指数对以SI>1.99应答的供体百分比。选择25μg/ml浓度的数据，并对其增殖性应答达到1.99或更高值的供体的百分比作图。
7.发明详述
7.1抗CD25抗体
本公开提供抗CD25抗体。除非另外指示，术语“抗体”(Ab)指特异性结合特定抗原或与之免疫学反应的免疫球蛋白分子，且包括多克隆抗体、单克隆抗体、遗传工程化抗体和抗体的其它修饰形式，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异缀合抗体(例如双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)和四抗体(trtrabody))，以及抗体的抗原结合片段，包括例如Fab',F(ab')2,Fab,Fv,rIgG，和scFv片段。而且，除非另外指示，术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括完整分子以及能特异性结合蛋白质的抗体片段(如例如Fab和F(ab')2片段)两者。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物的循环中更快速地清除，且可能具有比完整抗体少的非特异性组织结合(Wahl等,1983,J.Nucl.Med.24:316)。
术语“scFv”指单链Fv抗体，其中来自传统抗体的重链和轻链的可变域已连接为形成一条链。
对“VH”的提述指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv,scFv,或Fab的重链)的可变区。对“VL”的提述指免疫球蛋白轻链(包括Fv,scFv,dsFv或Fab的轻链)的可变区。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体展现对特定靶物的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其他缺少靶物特异性的抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条重链在氨基末端具有可变域(VH)之后是一些恒定域。每条轻链在氨基末端具有可变域(VL)和在羧基末端的恒定域。
本公开的抗CD25抗体结合人CD25并抑制其在细胞中的活性。
本公开的抗CD25抗体含有在序列上与抗体达克珠单抗的CDR有关的互补决定区(CDR)。
CDR也称为轻链和重链可变域两者中的高可变区。可变域的更高度保守的部分称为框架(FR)。如本领域中已知的，对抗体的高可变区划界(delineate)的氨基酸位置/边界可以随着上下文和本领域中已知的多种定义而变化。可变域内的一些位置可视为杂合的高可变位置，原因是这些位置可视为在一组标准下在高可变区内，而在不同的一组标准下视为在高可变区之外。一个或多个的这些位置还可以见于延伸的高可变区。本公开提供在这些杂合高可变位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变域各包含4个FR区，大部分通过采用β层构象，由3个CDR连接，其形成连接β层结构的环(且在一些情况中形成β层结构的部分)。每条链中的CDR由FR区按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的次序紧密保持在一起，并与来自另一链的CDR一起，协助形成抗体的靶物结合位点(见Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.1987))。如本文中使用的，除非另外指示，免疫球蛋白氨基酸残基的编号依照Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统完成。
达克珠单抗的重链和轻链可变区的序列分别由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2表示。重链和轻链可变区的序列也绘于图1A。达克珠单抗的CDR序列及其相应标识在图1B中呈现。任意编码SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核苷酸序列可用于本公开的组合物和方法中。
本公开还提供抗CD25抗体片段，其包含涉及达克珠单抗的CDR序列的CDR序列。术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是靶物结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段。“Fv”片段是最小抗体片段，其含有完整的靶物识别和结合位点。该区由处于紧密、非共价联合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成(VH-VL二聚体)。通过这种构象，每个可变域的3个CDR相互作用以限定VH–VL二聚体表面上的靶物结合位点。经常地，6个CDR赋予抗体的靶物结合特异性。然而，在一些情况中，甚至单个可变域(或Fv的一半，包含特异于靶物的仅3个CDR)可具有识别和结合靶物的能力。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含在单个多肽链中的抗体的VH和VL域。Fv多肽通常还包含在VH和VL域之间的多肽接头，其使得scFv形成期望的结构用于靶物结合。“单域抗体”由展现对靶物的充分亲和力的单个VH或VL域构成。在一个特定的实施方案中，所述单域抗体是骆驼类抗体(参见例如Riechmann,1999,JournalofImmunologicalMethods231:25–38)。
Fab片段含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的差别是在重链CHl域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')片段通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生。抗体片段的别的化学偶联是本领域普通技术人员已知的。
在某些实施方案中，本公开的抗CD25抗体是单克隆抗体。术语“单克隆抗体”用于本文不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指源自单一克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是产生其的方法。关于本公开可用的单克隆抗体可使用很多种本领域中已知的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。本公开的抗CD25抗体包括嵌合、灵长类化(primatized)、人源化或人的抗体。
本公开的抗CD25抗体可以是嵌合抗体。术语“嵌合”抗体如用于本文指以下抗体，其具有源自非人免疫球蛋白(如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和典型地选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison,1985,Science229(4719):1202-7；Oi等,1986,BioTechniques4:214-221；Gillies等,1985,J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利Nos.5,807,715；4,816,567；和4,816397，其通过提述完整并入本文。
本公开的抗CD25抗体可以是人源化的。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是以下嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或抗体的其他靶物结合子域)，其含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白通用序列的恒定区。抗体人源化的方法是本领域中已知的。参见例如Riechmann等,1988,Nature332:323-7；美国专利Nos:5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370至Queen等；EP239400；PCT公开文本WO91/09967；美国专利No.5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；和美国专利No.5,565,332，其全部通过提述完整并入本文。
本公开的抗CD25抗体可以是人抗体。完全的“人”抗CD25抗体可能是治疗性处理人患者所期望的。如本文中使用的，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体且包括从人免疫球蛋白文库或从对于一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示方法，其使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库。参见美国专利Nos.4,444,887和4,716,111；和PCT公开文本WO98/46645；WO98/50433；WO98/24893；WO98/16654；WO96/34096；WO96/33735；和WO91/10741，其各自通过提述完整并入本文。人抗体还可以使用转基因小鼠产生，该小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。参见例如PCT公开文本WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；美国专利Nos.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，其通过提述完整并入本文。另外，可雇佣公司如Medarex(Princeton,NJ),AstellasPharma(Deerfield,IL),Amgen(ThousandOaks,CA)和Regeneron(Tarrytown,NY)来提供针对选定抗原的人抗体，其使用类似于上文所述的那些的技术。识别选定表位的完全的人抗体可使用称为“指引选择(guidedselection)”的技术生成。在该办法中，选定的非人单克隆抗体例如小鼠抗体被用来指引识别相同表位的完全的人抗体的选择(Jespers等,1988,Biotechnology12:899-903)。
本公开的抗CD25抗体可以是灵长类化的。术语“灵长类化的抗体”指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类化的抗体的方法是本领域中已知的。参见例如美国专利Nos.5,658,570；5,681,722；和5,693,780，其通过提述完整并入本文。
本公开的抗CD25抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆的抗体(经常是人或人源化的)，其对至少两种不同的抗原具有结合特异性。在本公开中，一种结合特异性可针对CD25，另一种可针对任意其他抗原，例如针对细胞表面蛋白质、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源的蛋白或细菌表面蛋白等。
本公开的抗CD25抗体包括衍生化的抗体。例如，但不限制地，衍生化的抗体通常由糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭性基团的衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其他蛋白(见第5.8部分中抗体缀合物的论述)等来修饰。可通过已知的技术来实施任意数量的化学修饰，包括但不限于，特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一个或多个非天然氨基酸，例如使用ambrx技术(参见例如Wolfson,2006,Chem.Biol.13(10):1011-2)。
本公开的抗CD25抗体的恒定域可就抗体的提议的功能，特别是关于可能要求的效应器功能进行选择。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体的恒定域是人IgA,IgE,IgG或IgM域。在一个特定的实施方案中，使用人IgG恒定域(尤其是IgG1和IgG3同种型的)，特别是当本公开的抗CD25抗体意图用于治疗用途且需要抗体效应器功能，例如在治疗表达CD25的癌症时。在备选的实施方案中，当本公开的抗CD25抗体意图用于治疗用途且不需要或甚至不想要抗体效应器功能时，使用IgG2和IgG4同种型，例如用于治疗多发性硬化症或葡萄膜炎。本公开的抗CD25抗体的恒定域可甚至是来自相同物种的不同同种型或来自不同物种的相同或不同同种型的杂合。例如，可以使用ABT700(抗cMet)的恒定区，其含有在人IgG1背景中的鼠铰链。
恒定区还可以经修饰以相对于相应野生型序列改变至少一种恒定区介导的生物学效应器功能。
例如，在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物学效应器功能，例如降低的对Fc受体(FcγR)的结合。FcγR结合可通过在FcγR相互作用所需的特定区突变抗体的免疫球蛋白恒定区区段来降低(见例如和Morrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lund等,1991,J.Immunol.147:2657-2662)。抗体的FcγR结合能力中的降低还可降低依赖于FcγR相互作用的其他效应器功能，如调理作用(opsonization)、吞噬作用和抗原依赖性细胞的细胞毒性(“ADCC”)。
在其他实施方案中，本公开的抗CD25抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改进至少一种恒定区介导的生物学效应器功能，例如增强FcγR相互作用(参见例如US2006/0134709)。例如，本公开的抗CD25抗体可具有以比相应野生型恒定区更高的亲和力结合FcγRIIA,FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区。
如此，本公开的抗体可在生物活性中具有改变，其导致增加或降低的调理作用、吞噬作用和ADCC。这类改变是本领域中已知的。例如，降低ADCC活性的抗体中的修饰记载于美国专利No.5,834,597。例示性的降低ADCC的变体对应于美国专利No.5,834,597图4中显示的“突变体3”(或“M3”)，其中残基236缺失且残基234,235和237(使用EU编号)用丙氨酸取代。
在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体具有较低的岩藻糖水平或缺少岩藻糖。缺少岩藻糖的抗体与增强的ADCC活性关联，特别是在低剂量抗体时。参见Shields等,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等,2003,J.Biol.Chem.278:3466-73。制备较少岩藻糖的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCCCRL1662)中生长。YB2/0细胞表达较低水平的FUT8mRNA，其编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，一种多肽岩藻糖基化所需的酶。
在再一个方面，所述抗CD25抗体或其片段可以是经修饰以增加或降低其对胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的抗体或抗体片段，例如通过突变涉及FcRn相互作用的特定区域处的免疫球蛋白恒定区区段(见例如WO2005/123780)。在具体的实施方案中，突变IgG类的抗CD25抗体从而使得重链恒定区的氨基酸残基250，314和428的至少一个单独地或以其任意组合取代，如在位置250和428，或在位置250和314，或在位置314和428，或在位置250，314和428，其中位置250和428为一个特定的组合。对于位置250，取代的氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任意氨基酸，包括但不限于，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代的氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任意氨基酸，包括但不限于，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代的氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任意氨基酸，包括但不限于，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。在在一些实施方案中，变体Fc域具有增强对FcRn亲和力的至少一个或多个修饰，例如氨基酸残基251-256,285-290,308-314,385-389，和428-436(例如M428L)中一个或多个的修饰，或在位置250和428(例如T250Q/M428L)的修饰，参见例如Hinton等,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6；PCT公开文本No.WO97/34631；和WO02/060919，其全部通过提述完整并入本文。这类修饰增加抗体对FcRn的结合，其保护抗体免于降解并延长其半衰期。
仍在其他方面，抗CD25抗体具有插入其一个或多个高可变区中的一个或多个氨基酸，例如如记载于S.Jung和A.Plückthun,1997,ProteinEngineering10:959–966；Yazaki等,2004,ProteinEngDesSel.17(5):481–9的。
在多个实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段可以是已经过修饰用于在异源宿主中提高的表达的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段可以是已经过修饰用于在异源宿主细胞中增加的表达和/或从中分泌的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段经修饰用于增加的细菌(如大肠杆菌)中的表达。在其他实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段经修饰用于酵母中增加的表达。(Kieke等,1999,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA96:5651-5656)。仍在其他实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段经修饰用于在昆虫细胞中增加的表达。在另外的实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段经修饰用于在哺乳动物细胞，如CHO细胞中增加的表达。
在某些实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段可以是经过修饰以增加生产期间抗体的稳定性的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可修饰为将易受非酶性脱酰胺作用的一个或多个氨基酸如天冬酰胺或谷氨酰胺替换为不经历脱酰胺作用的氨基酸。(Huang等,2005,Anal.Chem.77:1432-1439)。在其他实施方案中，所述抗体或其片段可修饰为将易受氧化作用的一个或多个氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸替换为不容易经历氧化作用的氨基酸。仍在其他实施方案中，所述抗体或其片段可修饰为将易受环化作用的一个或多个氨基酸如天冬酰胺或谷氨酸替换为不容易经历环化作用的氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体或片段工程化为包含以下一个或多个氨基酸取代，其增加对pH敏感的抗原释放的易感性以允许在内体中从CD25快速解离。该快速解离能改进抗体药代动力学，其通过从细胞内将游离抗体释放到循环中。参见Chaparro-Riggers等,2012,J.Biol.Chem.287(14):11090–11097和Igawa等,2010,NatureBiotechnology28(11):1203-1208。增加对pH敏感的抗原释放的易感性氨基酸残基包括组氨酸。例示性的组氨酸取代可选自表8。
7.2核酸和表达系统
本公开涵盖编码本公开的抗CD25抗体的核酸分子和宿主细胞。
本公开的抗CD25抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，将宿主细胞用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染，从而使得轻链和重链在宿主细胞中表达和任选地分泌到培养宿主细胞的培养基中，可从该培养基回收所述抗体。标准的重组DNA方法学被用来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体和将载体引入宿主细胞，如记载于MolecularCloning；ALaboratoryManual,SecondEdition(Sambrook,Fritsch和Maniatis(eds),ColdSpringHarbor,N.Y.,1989),CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel,F.M.等,编,GreenePublishingAssociates,1989)和美国专利No.4,816,397的那些。
在一个实施方案中，所述抗CD25抗体类似于达克珠单抗，但是在一个或多个CDR中有变化(本文中称为具有“达克珠单抗有关的”序列)。在另一个实施方案中，所述抗CD25抗体类似于达克珠单抗，但是在一个或多个框架区中有变化。在再一个实施方案中，所述抗CD25抗体类似于达克珠单抗，但是在一个或多个CDR和一个或多个框架区中有变化。为了生成编码这类抗CD25抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的种系DNA或cDNA获得，例如使用聚合酶链式反应(PCR)。用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域中已知的(参见例如“VBASE”人种系序列数据库；亦参见Kabat,E.A.等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH公开文本No.91-3242；Tomlinson等,1992,J.Mol.Biol.22T:116-198；和Cox等,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836；其各自内容通过提述并入本文)。编码达克珠单抗重链或轻链可变区的DNA片段可以合成并用作模板以使用常规诱变技术诱变生成如本文中描述的变体；或者可以直接合成编码变体的DNA片段。
一旦获得编码达克珠单抗或达克珠单抗有关的VH和VL区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接于编码另一种蛋白质的另一种DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。术语“可操作地连接”如此背景中使用的意图指两个DNA片段连接为使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
编码VH区的分离的DNA可转化为全长重链基因，其通过将编码VH的DNA可操作地连接于编码重链恒定区(CHl,CH2,CH3和任选地CH4)的另一DNA分子。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(见例如Kabat,E.A.,等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH公开文本No.91-3242)且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE,IgM或IgD恒定区，但在某些实施方案中是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以可操作地连接于仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
编码VL区的分离的DNA可转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)，其通过将编码VL的DNA可操作地连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子。人轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(见例如Kabat,E.A.,等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH公开文本No.91-3242)且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区的DNA片段。轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区，但在某些实施方案中是kappa恒定区。为了创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接于编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4～Ser)3,(SEQIDNO:18)的另一片段，从而使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白质，其中VL和VH区由柔性接头连接(见例如Bird等,1988,Science242:423-426；Huston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty等,1990,Nature348:552-554)。
为了表达本公开的抗CD25抗体，将如上文所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得基因可操作地连接于转录和翻译调控序列。在该背景中，术语“可操作地连接”意图指抗体编码序列以如下方式连接到载体中，使得载体中的转录和翻译调控序列发挥其意图的功能，即调控抗体基因的转录和翻译。表达载体和表达调控序列选择为与使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入分别的载体中，或更典型地，两种基因均插入同一表达载体中。
通过标准方法将抗体基因插入表达载体中(例如抗体基因片段和载体上互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点为平端连接)。在插入达克珠单抗或达克珠单抗有关的轻链或重链序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，一种将达克珠单抗或达克珠单抗有关的VH和VL序列转化为全长抗体基因的办法是分别将其插入已经编码重链恒定和轻链恒定区的表达载体中，从而使得VH区段可操作地连接于载体中的CH区段且VL区段可操作地连接于载体中的CL区段。另外/或者，重组表达载体可编码信号肽，其促进抗体链从宿主细胞的分泌。抗体链基因可以克隆到载体中，使得信号肽符合阅读框地连接于抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因以外，本公开的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意图包括启动子、增强器和其他控制抗体链基因的转录和翻译的表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。这类调控序列记载于例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185(AcademicPress,SanDiego,CA,1990)中。本领域技术人员将领会表达载体的设计(包括调控序列的选择)可能依赖于这类因素如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。适用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，如源自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要后期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。对于病毒调控元件及其序列的进一步描述，见例如Stinski的美国专利No.5,168,062，Bell等的美国专利No.4,510,245和Schaffner等的美国专利No.4,968,615。
除了抗体链基因和调控序列以外，本公开的重组表达载体可携带别的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和可选择标志基因。可选择标志基因协助对其中引入载体的宿主细胞的选择(见例如U.S.专利Nos.4,399,216,4,634,665和5,179,017，均为Axel等人的)。例如，通常可选择标志基因赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。适合的可选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，将编码重链和轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意图涵盖常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的很多种技术，例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
可以在原核或真核宿主细胞中表达本公开的抗体。在某些实施方案中，抗体的表达在真核细胞，例如哺乳动物宿主细胞中进行，用于适宜折叠且免疫学活性的抗体的最优分泌。例示性的用于表达本公开的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞，记载于Urlaub和Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，与DHFR可选择标志一起使用，例如如记载于Kaufman和Sharp,1982,Mol.Biol.159:601-621)、NS0骨髓瘤细胞,COS细胞,293细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞达足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到生长宿主细胞的培养基中的一段时间来产生抗体。可使用标准蛋白纯化方法从培养基回收抗体。宿主细胞也可以用于产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。理解对上述规程的变化在本公开的范围内。例如，可以期望用编码本公开抗CD25抗体的轻链或重链(而并非两者)的DNA转染宿主细胞。
重组DNA技术还可以用于除去编码轻链和重链任一或两者、对于结合CD25不是必要的一些或所有DNA。从这类截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本公开的抗体中。
另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本公开的抗CD25抗体，而其他重链和轻链特异于除CD25以外的抗原，例如通过标准的化学交联方法将本公开的抗体交联至第二抗体。双功能抗体也可通过表达工程化为编码双功能抗体的核酸来制备。可用于生成双功能抗体的例示性的双功能抗体技术由Kontermann,2012,mAbs4(2):182-197，特别是在图2中描述。
在具体的方面，所述双功能抗体是双可变域(“DVD”)免疫球蛋白(“DVD-Ig”)(参见Gu&Ghayur,2012,MethodsinEnzymology502:25-41,通过提述完整并入本文)。DVD-Ig经由接头组合两种单克隆抗体的靶物结合可变域以创建四价、双靶向性单一药剂。适用于本公开的DVD的轻链中的接头包括Gu&Ghayur,2012,MethodsinEnzymology502:25-41，通过提述并入本文的第30页上表2.1鉴定的那些：短κ链接头ADAAP(SEQIDNO:19)(鼠)和TVAAP(SEQIDNO:20)(人)；长κ链接头ADAAPTVSIFP(SEQIDNO:21)(鼠)和TVAAPSVFIFPP(SEQIDNO:22)(人)；短λ链接头QPKAAP(SEQIDNO:23)(人)；长λ链接头QPKAAPSVTLFPP(SEQIDNO:24)(人)；GS短接头GGSGG(SEQIDNO:25)，GS中等接头GGSGGGGSG(SEQIDNO:26)和GS长接头GGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:27)(所有GS接头是鼠和人的)。适用于本公开的DVD的重链中的接头包括Gu&Ghayur,2012,MethodsinEnzymology502:25-41，通过提述并入本文的第30页上表2.1鉴定的那些：短接头AKTTAP(SEQIDNO:28)(鼠)和ASTKGP(SEQIDNO:29)(人)；长接头AKTTAPSVYPLAP(SEQIDNO:30)(鼠)和ASTKGPSVFPLAP(SEQIDNO:31)(人)；GS短接头GGGGSG(SEQIDNO:32)，GS中等接头GGGGSGGGGS(SEQIDNO:33)和GS长接头GGGGSGGGGSGGGG(SEQIDNO:34)(所有GS接头是鼠和人的)。优选地，人接头用于人或人源化的DVD-Ig。DVD免疫球蛋白的靶物结合域通常串联排放，一个可变域堆积在另一个的顶部以形成内部和外部Fv域。抗CD25可变域可以是DVD的内部或外部Fv域。
在某些实施方案中，双重特异性抗体，即使用相同结合位点结合CD25和不相关抗原的抗体，可通过突变轻链和/或重链CDRs中的氨基酸残基来产生。在多个实施方案中，结合两种抗原如CD25和VEGF的双重特异性抗体可通过突变抗原结合位点周围的氨基酸残基来产生(Bostrom等,2009,Science323:1610-1614)。双功能抗体可通过表达工程化为编码双重特异性抗体的核酸来制备。
为了重组表达本公开的抗CD25抗体，可将诉诸细胞用本公开的两种表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽而第二载体编码轻链衍生的多肽。典型地，两种载体各含有分别的可选择标志。或者，可使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。
一旦生成编码达克珠单抗或具有与达克珠单抗的CDR序列有关的CDR序列的抗CD25抗体的一个或多个部分的核酸，可将进一步的改变或突变引入编码序列中，例如以生成编码具有不同CDR序列的抗体、具有对Fc受体的降低的亲和力的抗体、或不同亚类的抗体的核酸。
本公开的抗CD25抗体还可通过化学合成产生(例如通过SolidPhasePeptideSynthesis,2nded.,1984ThePierceChemicalCo.,Rockford,Ill.中描述的方法)。还可以使用无细胞平台来生成变体抗体(参见例如Chu等,BiochemiaNo.2,2001(RocheMolecularBiologicals))。
一旦已通过重组表达产生本公开的抗CD25抗体，可通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任意方法来对其纯化，例如通过层析(例如离子交换，亲和层析，特别是通过在蛋白A或蛋白G选择后对CD25的亲和力，和大小分级柱层析)、离心、差异溶解度、或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。另外，本公开的抗CD25抗体或其片段可融合至本文中描述的或本文中另外已知的异源多肽序列以协助纯化。
一旦分离，抗CD25抗体在期望时可进一步纯化，例如通过高效液相色谱(参见例如Fisher,LaboratoryTechniquesInBiochemistryAndMolecularBiology(Work和Burdon,编,Elsevier,1980))，或通过在SuperdexTM75柱上的凝胶过滤层析(PharmaciaBiotechAB,Uppsala,Sweden)。
7.3抗CD25抗体的生物学活性
在某些实施方案中，本公开的抗CD25抗体具有特定的生物学活性，如与达克珠单抗竞争对CD25结合或中和CD25活性。
因此，在某些实施方案中，本公开的抗CD25抗体与达克珠单抗竞争对CD25结合。可使用竞争测定法来测试竞争对CD25的结合的能力，如8.3.1.1部分中描述的。用于竞争测定法的其他形式是本领域中已知的且可以采用。
在其他方面，本公开的抗CD25抗体在一系列体外测定法如细胞增殖中抑制(或中和)CD25活性。例如，在一个实施方案中，测定所述抗CD25抗体抑制T细胞增殖测定法的能力。这类测定法可使用已知的技术实施。在一种技术中，将人PBMC在适合的培养基中稀释，然后用例如CD3抗体刺激，接着添加多种浓度的抗CD25抗体来测定其对T细胞增殖的影响。PBMC增殖测定法可如下文8.4.1.1部分中描述的进行。纯化的T细胞的T细胞增殖还可以在存在抗CD3和抗CD28单克隆抗体的情况下评估。在另一种技术中，可以测量本公开的抗CD25抗体抑制IL2依赖性的Kit225/K6细胞增殖的能力，如下文8.3.1.3部分中描述的。可使用的另一种测定法是混合的淋巴细胞反应，其显示抗CD25结合对抗原特异性T细胞增殖应答的影响。例示性的混合淋巴细胞反应可如下文6.4.1.6部分中描述的实施。抗CD25抗体阻断细胞因子从抗原和促分裂原活化的PBMC分泌。可测试来自用例如PHA活化的培养物的上清液中多种细胞因子和趋化因子的存在，其使用已知技术如ELISA测定法、基于Luminex的多重测定法和细胞因子依赖性细胞增殖测定法作为读出。在又一种测定法中，可以如下文6.4.1.7部分中描述的实施CD56brightNK细胞的扩增，其通过在人PBMC和重组人IL2的培养物中纳入抗CD25。
用于CD25中和测定法的其他形式是本领域中已知且可以采用的。
在多个实施方案中，本公开的抗CD25抗体将经标记的达克珠单抗的结合降低了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、或范围在前述任意值之间的百分比(例如本公开的抗CD25抗体将经标记的达克珠单抗的结合降低了50％至70％)，当以0.08μg/ml,0.4μg/ml,2μg/ml,10μg/ml,50μg/ml,100μg/ml的浓度或范围在前述任意值之间的浓度使用该抗CD25抗体时(例如浓度范围为2μg/ml至10μg/ml)。
在多个实施方案中，本公开的抗CD25抗体将CD25中和了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或范围在前述任意值之间的百分比(例如本公开的抗CD25抗体将CD25活性中和了50％至70％)，当以2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,0.1μg/ml,0.2μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml的浓度或范围在前述任意值之间的浓度使用该抗CD25抗体时(例如浓度范围为1μg/ml至5μg/ml)。
在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体在中和CD25时有效性如同达克珠单抗有效性的至少0.7倍、0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍，或在中和CD25时相对于达克珠单抗具有范围在前述任意一对值之间的有效性(例如在中和CD25时如同达克珠单抗有效性的0.9倍至5倍，如同达克珠单抗有效性的1倍至3倍，或如同达克珠单抗有效性的2倍至50倍)。
在一些实施方案中，在全长免疫球蛋白分子(其可以是任意类型的免疫球蛋白例如IgG,IgM,IgD,IgA,或IgE，但优选以免疫球蛋白二聚体的形式)的背景中评估本公开的抗CD25抗体相比于达克珠单抗的生物学特性。在其他实施方案中，在Fab片段的背景中评估本公开的抗CD25抗体相比于达克珠单抗的生物学特性。如此，本公开的抗CD25抗体在全长免疫球蛋白形式、在Fab形式或两者中可相比于达克珠单抗具有改进的亲和力和/或改进的IL2阻断活性。
7.4抗CD25抗体的动力学特性
本公开的抗CD25抗体通常相比于达克珠单抗具有改进的对CD25的结合亲和力。
在某些实施方案中，当在全长免疫球蛋白分子(其可以是任意类型的免疫球蛋白例如IgG,IgM,IgD,IgA,或IgE，但优选以免疫球蛋白二聚体的形式)的背景中评估时，本公开的抗CD25抗体以低于500pM的KD(koff/kon)结合CD25。在特定的实施方案中，本公开的抗CD25抗体具有480pM或更低、450pM或更低、400pM或更低、350pM或更低、300pM或更低、200pM或更低、150pM或更低、100pM或更低、50pM或更低、或25pM或更低的KD。在再其他实施方案中，所述KD为至少1pM,至少3pM,至少5pM,至少10pM,至少15pM,或至少20pM。本公开的抗CD25抗体的KD可以在范围中限定，上限和下限选自前述任意一对值(例如3pM至50pM、5pM至200pM、10pM至100pM、50pM至350pM、15pM至150pM、20pM至450pM、10pM至200pM，等等，依此类推)。
仍在其他实施方案中，本公开的抗CD25抗体以范围为达克珠单抗的KD的约0.005倍至1倍的KD结合CD25，例如达克珠单抗的KD的0.005倍、达克珠单抗的KD的0.0075倍、达克珠单抗的KD的0.01倍、达克珠单抗的KD的0.03倍、达克珠单抗的KD的0.05倍、达克珠单抗的KD的0.1倍、达克珠单抗的KD的0.2倍、达克珠单抗的KD的0.3倍、达克珠单抗的KD的0.4倍、达克珠单抗的KD的0.5倍、达克珠单抗的KD的0.75倍的KD，或范围在前述任意一对值之间的KD，例如达克珠单抗的KD的0.005倍至0.1倍、达克珠单抗的KD的0.0075倍至0.3倍、达克珠单抗的KD的0.1倍至0.4倍、达克珠单抗的KD的0.05至1倍等的KD。本公开的抗体相比于达克珠单抗的相对亲和力可在全长免疫球蛋白分子(其可以是任意类型的免疫球蛋白例如IgG,IgM,IgD,IgA,或IgE，但优选以免疫球蛋白二聚体的形式)的背景中或Fab片段的背景中评估。
可以通过本领域中公知的测定法来测定KD(koff/kon)值，例如ELISA,FACS、等温滴定量热学(ITC)、荧光极化测定法或任何其他生物传感器如BIAcore。在多个实施方案中，可使用如8.3.1.2和8.3.1.4部分中分别描述的BIAcore或FACS结合测定法测定抗CD25抗体与CD25受体胞外域的相互作用的结合常数。
在一些实施方案中，当在全长免疫球蛋白分子(其可以是任意类型的免疫球蛋白例如IgG,IgM,IgD,IgA,或IgE，但优选以免疫球蛋白二聚体的形式)的背景中评估时，本公开的抗CD25抗体结合CD25并抑制细胞生长(例如在8.3.1.3部分中描述的Kit225增殖测定法中)，IC50为0.2nM或更低、0.15nM或更低、低于0.12nM或更低、0.1nM或更低、0.075nM或更低、0.05nM或更低、0.025nM或更低、0.01nM或更低、0.005nM或更低、0.0025nM或更低、或0.001nM或更低。本公开的抗CD25抗体的IC50可以在范围中限定，上限和下限选自前述任意一对值(例如0.001nM至0.2nM、0.005nM至0.025nM、0.001nM至0.1nM、0.025nM至0.15nM，等等，依此类推)。
在一些实施方案中，本公开的抗CD25抗体结合CD25并抑制细胞生长(例如在8.3.1.3部分中描述的Kit225增殖测定法中)，IC50范围为达克珠单抗IC50的约0.02倍至1倍，达克珠单抗IC50的0.05倍、达克珠单抗IC50的0.1倍、达克珠单抗IC50的0.2倍、达克珠单抗IC50的0.3倍、达克珠单抗IC50的0.4倍、达克珠单抗IC50的0.5倍、达克珠单抗IC50的0.75倍的IC50，或范围在前述任意一对值之间的IC50，例如达克珠单抗IC50的0.1倍至0.4倍、达克珠单抗IC50的0.05至1倍等。本公开的抗体相比于达克珠单抗的相对IC50可在全长免疫球蛋白分子(其可以是任意类型的免疫球蛋白例如IgG,IgM,IgD,IgA,或IgE，但优选以免疫球蛋白二聚体的形式)的背景中或Fab片段的背景中评估。
7.5抗CD25抗体的降低的免疫原性
在某些方面，本公开提供相比于达克珠单抗具有降低的免疫原性的抗CD25抗体。本公开提供相比于达克珠单抗的CDR和/或框架区在其CDR和/或框架区中具有单个或多个氨基酸取代的抗CD25抗体，其中至少一个取代相比于达克珠单抗降低抗体的免疫原性。在某些实施方案中，所述降低的免疫原性来自一个或多个氨基酸取代，其导致消除或减少一个或多个T细胞表位。
在某些方面，本公开的具有降低的免疫原性对抗CD25抗体相比于达克珠单抗具有可比或改进的生物学活性，例如对CD25的亲和力或对CD25活性的中和。这类特性可通过例如上5.3文部分中描述的方法来测试。
在某些实施方案中，本公开的抗CD25抗体的免疫原性相比于达克珠单抗降低。在某些实施方案中，具有“降低的免疫原性”的变体指相比于如表9中所列的肽PH16或肽PH17，在外周血单核细胞中引发降低的增殖应答的抗CD25抗体。可用于评估增殖应答的例示性增殖测定法在下文6.5.2部分中说明。降低的增殖应答可反映在应答者百分比、刺激指数或两者中。
在某些实施方案中，具有降低的免疫原性的抗CD25抗体将具有重链CDR2中的取代T54S和/或重链框架2中的I48M。所述抗体还可具有一个或多个另外的取代，例如增加对CD25的亲和力的取代。源自完整抗体的含有所述取代的Fab片段将诱导降低的增殖。可用于测定fab片段的相对免疫原性的例示性增殖测定法在下文6.5.2部分中说明。
在其他实施方案中，相比于如表9中所列的肽PH16或肽PH17，变体序列产生至少少25％的应答者、至少少30％的应答者、至少少35％的应答者、至少少40％的应答者、至少少45％的应答者、至少少50％的应答者、至少少60％的应答者、至少少65％的应答者、至少少70％的应答者、至少少75％的应答者、至少少80％的应答者、至少少85％的应答者、至少少90％的应答者、至少少95％的应答者、至少少100％的应答者，或范围在前述任意值之间的应答者的降低，例如少25％-75％的应答者、少50％-90％的应答者、少0％-100％的应答者、少70％-90％的应答者等。
在其他实施方案中，所述变体序列产生比如表9中所列的肽PH16或肽PH17引发的刺激指数至少少5％、至少少10％、至少少15％、至少少20％、至少少25％、至少少30％、至少少35％、或至少少40％的刺激指数，或相比于PH16或PH17的肽产生范围在前述任意值之间的刺激指数的降低，例如少5％-20％、少10％-30％、少30％-40％等。
相比于达克珠单抗具有降低的免疫原性的候选抗CD25抗体的别的例示性实施方案包含表11-19中所列的一个或多个CDR和/或框架取代或取代组合。任选地，相比于达克珠单抗具有降低的免疫原性的抗CD25抗体包含一个或多个另外的取代，如表6-8,20和21任一个中的一个或多个CDR突变。
7.6抗体缀合物
本公开的抗CD25抗体包括修饰的抗体缀合物，例如通过将任意类型的分子共价附接于抗体从而使得共价附接不干扰对CD25的结合。
在某些方面，本公开的抗CD25抗体可以缀合于效应器模块或标记物。术语“效应器模块”如本文使用的包括，例如抗肿瘤剂(antineoplasticagent)、药物、毒素、生物活性蛋白质例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(特别是放射性碘化物、放射性同位素)、螯合金属、纳米颗粒和报道基团如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱检测的化合物。
在一个例子中，抗CD25抗体可以缀合于效应器模块，如细胞毒剂、放射性核素或药物模块，以修改给定的生物学应答。效应器模块可以是蛋白质或多肽，如例如且不限于，毒素(如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)、信号传导分子(如α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板来源的生长因子或组织血纤维蛋白溶酶原活化剂)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管他丁(angiostatin)或内皮他丁(endostatin))或生物学应答修饰物如细胞因子或生长因子(例如白介素-1(IL-I)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、或神经生长因子(NGF))。
在另一个例子中，效应器模块可以是细胞毒素或细胞毒剂。细胞毒素或细胞毒剂的例子包括紫杉醇(taxol)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、tenoposide、长春新碱、长春碱、colchicin、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorabicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素、放射菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
效应器模块可包括但不限于，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)氯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C5和顺铂(cis-dichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(anthracyclines)(例如柔红霉素(之前称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(之前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(anthramycin)(AMC)、calicheamicin或duocarmycin)、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其他效应器模块可包括放射性核素如但不限于，111In和90Y,Lu177,铋213,锎252,铱192和钨18s/铼188，和药物如但不限于，烷基胆碱磷酸、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和苏拉明(suramin)。
用于缀合这类效应器模块至抗体的技术是本领域中公知的(参见例如Hellstrom等,ControlledDrugDelivery,2ndEd.,atpp.623-53(Robinson等,编,1987))；Thorpe等,1982,Immunol.Rev.62:119-58和Dubowchik等,1999,PharmacologyandTherapeutics83:67-123)。
在一个例子中，所述抗CD25抗体或其片段经由共价键(例如肽键)，经由抗体的N末端或C末端或内部融合于另一蛋白质(或其部分，例如蛋白质的至少10,20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列。所述抗体或其片段可在抗体恒定区的N末端连接于其他蛋白质。重组DNA规程可用于创建这类融合，例如如记载于WO86/01533和EP0392745的。在另一个例子中，效应器分子能增加体内半衰期，和/或增强抗体穿过上皮屏障到达免疫系统的投递。适宜的这类效应器分子的例子包括聚合物、清蛋白、清蛋白结合蛋白或清蛋白结合化合物如WO2005/117984中描述的那些。
在某些方面，抗CD25抗体缀合于小分子毒素。在某些例示性实施方案中，本公开的抗CD25抗体缀合于多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物或衍生物，例如阿里他汀(auristatin)(美国专利Nos.5,635,483和5,780,588)。多拉司他汀或阿里他汀药物模块可经由抗体的N(氨基)末端、C(羧基)末端或内部附接于抗体(WO02/088172)。例示性阿里他汀实施方案包括N末端连接的单甲基阿里他汀(monomethylauristatin)药物模块DE和DF，如通过提述完整并入本文的美国专利No.7,498,298中披露的(披露了例如接头和制备缀合于接头的单甲基缬氨酸化合物如MMAE和MMAF的方法)。
在其他例示性实施方案中，小分子毒素包括但不限于加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利No.5,208,020),trichothene，和CC1065。在本公开的一个实施方案中，抗体缀合于一个或多个美登素分子(例如约1至约10个美登素分子每抗体分子)。美登素可以例如转化为May-SS-Me，其可以还原成May-SH3并与抗体反应(Chari等,1992,CancerResearch52:127-131)以生成美登素样(maytansinoid)-抗体或美登素样-Fc融合缀合物。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 1,γ3 1,γ3 1,N-乙酰-γ1 1,PSAG，和θ1 1,(Hinman等,1993,CancerResearch53:3336-3342；Lode等,1998,CancerResearch58:2925-2928；美国专利No.5,714,586；美国专利No.5,712,374；美国专利No.5,264,586；美国专利No.5,773,001)。
本公开的抗体还可以缀合于脂质体用于靶向投递(参见例如Park等,1997,Adv.Pharmacol.40:399–435；Marty&Schwendener,2004,MethodsinMolecularMedicine109:389-401)。
在一个例子中，本公开的抗体可附接于聚(乙二醇)(PEG)模块。在一个具体的例子中，抗体是抗体片段且PEG模块可经由抗体片段中任何可用的侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基基团附接。这类氨基酸可天然存在于抗体片段中或者可使用重组DNA方法工程化到片段中。参见例如美国专利No.5,219,996。多为点可用于附接两个或更多个PEG分子。PEG模块可经由位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基基团共价连接。当巯基基团被用作附接点时，可以使用适宜活化的效应器模块，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。
在一个特定的例子中，抗CD25抗体缀合物是经修饰的Fab'片段，其为PEG化的，即具有与其共价附接的PEG(聚乙二醇)，例如根据EP0948544中披露的方法。亦参见Poly(ethyleneglycol)Chemistry,BiotechnicalandBiomedicalApplications,(J.MiltonHarris(ed.),PlenumPress,NewYork,1992)；Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications,(J.MiltonHarris和S.Zalipsky,编,AmericanChemicalSociety,WashingtonD.C.,1997)；和BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedicalSciences,(M.Aslam和A.Dent,编,GrovePublishers,NewYork,1998)；和Chapman,2002,AdvancedDrugDeliveryReviews54:531-545。PEG可以附接于铰链区中的半胱氨酸。在一个例子中，PEG修饰的Fab'片段具有共价连接于经修饰的铰链区中单个巯基基团的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以共价连接于马来酰亚胺基团且对赖氨酸残基上的每个胺基团可以附接具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚乙二醇聚合物。附接于Fab'片段的PEG的总分子量因此可以是约40,000Da。
词语“标记物”在用于本文时指可检测的化合物或组合物，其可直接或间接缀合于本公开的抗CD25抗体。标记物本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)或者，在酶标记物的情况中，可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。可用的荧光模块包括但不限于，荧光素、荧光素硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯(naphthalenesulfonylchloride)、藻红蛋白等。可用的酶标记物包括但不限于，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。
可用于诊断目的等的其他抗CD25抗体缀合物在下文5.9部分中描述。
7.7抗CD25抗体的诊断用途
本公开的抗CD25抗体，包括已经过修饰的那些抗体(例如通过生物素化、辣根过氧化物酶、或任何其他可检测模块)可有利地用于诊断目的。
具体地，所述抗CD25抗体可用于例如但不限于，纯化或检测CD25，包括在体外和体内诊断方法中。例如，所述抗体可用于免疫测定法来定性和定量测量生物样品中的CD25水平。参见例如Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual,SecondEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988)，其通过提述完整并入本文。在一个特定的实施方案中，所述抗CD25抗体可用于检测和量化血清中CD25的水平，即已从细胞表面脱落的CD25胞外域的水平。
本公开进一步涵盖缀合于诊断剂的抗体或其片段。抗体可以诊断使用，例如以检测特定细胞、组织或血清中目标靶物的表达；或以监测免疫应答的形成或进展作为临床测试规程的一部分来，例如测定给定治疗方案的功效。检测可通过将抗体偶联于可检测物质来协助。可检测物质的例子包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属(使用正电子发射层析术)和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可以直接偶联或缀合于抗体(或其片段)，或使用本领域中已知的技术经由中间物(如例如本领域中已知的接头)间接偶联或缀合于抗体(或其片段)。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)、微过氧化物酶(microperoxidase)等。适合的辅基复合物的例子包括链霉亲合素/生物素和亲合素/生物素；适宜的荧光材料的例子包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素、荧光素硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素、和aequorin；且适宜的放射性材料的例子包括125I,131I,111In或99Tc。
本公开提供对CD25表达的检测，包括使用本公开的一种或多种抗CD25抗体(任选地缀合于可检测模块)使生物样品(个体的细胞、组织或体液)接触，并检测所述样品对于CD25表达是否为阳性的，或者所述样品相比于对照样品是否改变了(例如降低或增加)表达。
7.8使用抗CD25抗体的治疗方法
7.8.1临床益处
本公开的抗CD25抗体可用于治疗多种免疫疾患和癌症，如器官移植排斥、哮喘、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症或人T细胞白血病病毒1有关的T细胞白血病。
因此，本公开提供杂有此需要的患者中治疗任一种前述疾病的方法，包括：对患者施用本公开的抗CD25抗体。任选地，所述施用可以在例如1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月或3个月后重复。重复施用可以以相同剂量或不同剂量。施用可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。例如，依照某些剂量方案，患者接受抗CD25疗法达延长的时间段，例如6个月、1年、2年或更长，在一些情况下当治疗慢性疾病如多发性硬化症时是不定的。在特定的实施方案中，治疗持续2周至6个月，3个月至5年，6个月至1或2年，8个月至18个月等。治疗方案可以是不变剂量方案或多个可变剂量方案。
对患者施用的抗CD25抗体量在某些实施方案中是治疗有效的量。如本文中使用的，CD25抗体的“治疗有效的”量可作为单个剂量施用或在治疗方案的过程中，例如在1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月、1年或更长的过程中施用。
依照本公开，疾病的治疗涵盖对已经诊断为患有处于任何临床阶段或表现的任何形式的疾病的患者的治疗；延迟疾病的症状或病征的发作或进化或加重或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重性。
施用本公开的抗CD25抗体的“受试者”或“患者”优选为哺乳动物如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、犬、大鼠等)或灵长类(例如猴或人)。在某些实施方案中，受试者或患者是人。在某些方面，所述人是成年患者。在其他方面，所述人是儿童患者。
在一些实施方案中，本发明的人源化的抗体的恒定域是人IgA,IgE,IgG或IgM域。在一个特定的实施方案中，使用人IgG恒定域，特别是IgG1和IgG3同种型，特别是当本发明的人源化的抗体意图用于治疗用途且需要抗体效应器功能时。
7.9药物组合物和施用路径
本文中提供包含本公开的抗CD25抗体和任选地一种或多种别的治疗剂(如下文7.10部分中描述的组合治疗剂)的组合物。所述组合物将通常作为无菌药物组合物的部分供应，该药物组合物将通常包含药学可接受的载体。该组合物可以为任何适宜的形式(根据将其施用给患者的期望的方法)。
本公开的抗CD25抗体可通过多种路径对患者施用如口服、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、眼内、局部、鞘内和脑室内。在任何给定情况中最适合施用的路径将取决于受试者、和疾病的性质和严重性以及受试者的身体状况。
为了治疗本文中描述的适应证，本公开的抗CD25抗体的有效剂量范围为约0.1至约5mg/kg每单次(例如推注)施用、多次施用或连续施用，或其中任何有效范围或值，取决于要治疗的疾患、施用路径和受试者的年龄、重量和状况。在某些实施方案中，每个剂量范围为约0.5mg至约2mg每千克体重。在其他实施方案中，每个剂量范围可为约50mg至500mg，且在例示性实施方案中为约50mg,75mg,100mg,150mg,200mg,250mg,300mg,350mg或400mg。抗体可配制为水溶液并通过皮下注射施用。在特定的实施方案中，所述水溶液pH范围为约pH5.5至约pH6.5，且包含约20-60mM琥珀酸盐缓冲液，约0.01％至约0.1％(或约0.02％-0.04％)]聚山梨醇酯，约75-150mM氯化钠，和至少约100mg/ml(例如125mg/ml或150mg/ml)的抗CD25抗体。
药物组合物可方便地以单位剂量形式呈现，其每剂含有预确定量的本公开的抗CD25抗体。这类单位可含有例如但不限于0.1mg至0.5g,例如20mg至500mg,50mg至250mgot100mg至300mg。在特定的实施方案中，单位剂量包含约100mg,150mg,200mg,250mg或300mg的抗CD25抗体。用于本公开的药学可接受的载体可采用很多种形式，其根据例如要治疗的疾患或施用路径。
本公开的抗CD25抗体的治疗性制剂可配制用于以冻干的制剂或水溶液存储，其通过将具有期望的纯度程度的抗体与任选的本领域中通常采用的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(本文中均称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他混杂性添加剂混合。参见Remington’sPharmaceuticalSciences,16thedition(Osol,ed.1980)。这类添加剂必须是在采用的剂量和浓度处对接受者无毒性的。
缓冲剂帮助将pH维持在接近生理学状况的范围内。它们可以以范围为约2mM至约50mM的浓度存在。适用于本公开的缓冲液包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸双钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和醋酸盐缓冲液(例如醋酸-醋酸钠混合物、醋酸-氢氧化钠混合物等)。另外，还可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。
可添加防腐剂以阻止微生物生长，且可以以范围从0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本公开的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间-甲酚(m-cresol)、对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、benzalconium卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵(hexamethoniumchloride)和烷基对羟基苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加等渗剂(有时称为“稳定剂”)以确保本公开的液体组合物的等渗性且包含多羟基糖醇，例如三羟基或更高级糖醇，如丙三醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。稳定剂指广泛范围的赋形剂，其功能的范围可以从膨胀剂到溶解治疗剂或帮助预防变性或对容器壁的粘附的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上文枚举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以0.1至10,000重量每份重量活性蛋白质的范围存在。
可以添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)来帮助治疗剂的溶解以及保护治疗性蛋白质免于搅动诱发的聚集，这还允许制剂暴露于受应力的剪切表面而不导致蛋白质的变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20,80等)、polyoxamers(184,188等)、pluronic多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml,例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
其他混杂性赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
本公开的抗CD25抗体可配制到稳定的药物组合物中，如美国专利公开文本2011/0318343中所述。在一个例示性实施方案中，药物组合物具有pH5.5至pH6.5的pH且包含20-60mM缓坡酸盐缓冲液、0.02％-0.04％聚山梨醇酯，75-150mM氯化钠，和浓度为50mg/ml或更高的抗CD25抗体。
除了本公开的抗CD25抗体以外，本文中制剂还可含有组合治疗剂。
用于皮下施用的给药时间安排可根据许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重性和患者对抗CD25抗体的敏感性从每6个月一次到每日施用而变化。在特定的实施方案中，施用为每周、每月、或每两个月的。
要施用的本公开的抗CD25抗体的剂量将根据具体的抗体、疾病的类型(例如免疫病症或癌症)、受试者、和疾病的严重性、受试者的身体状况、治疗方案(例如是否使用组合治疗剂)和选择的施用路径而变化；适宜的剂量是本领域技术人员可容易确定的。
本领域技术人员将认可本公开的抗CD25抗体的各个剂量的最佳量和间隔将由以下因素而决定：要治疗的疾患的性质和程度，施用的形式、路径和部位，和要治疗的具体受试者的年龄和状况，且医师将最终决定要使用的适宜剂量。该剂量可按频率适宜地进行重复。如果形成副作用，则可以根据正常临床实践改变或降低剂量的量和/或频率。
7.10组合疗法
下文描述了其中可使用本公开的抗CD25抗体的组合方法。本公开的组合方法牵涉对患者施用至少两种药剂，其中第一种是本公开的抗CD25抗体，其中第二种是一种组合治疗剂。所述抗CD25抗体和组合治疗剂可同时、序贯或分开施用。
本公开的组合治疗方法可引起大于加和的效果，提供治疗益处，其中抗CD25抗体或组合治疗剂所单独施用的量均不是治疗有效的。
在本方法中，本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂可以协同(同时或连续地)施用。如本文中使用的，本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂被认为连续施用，如果它们在同一天施用给患者的话，例如在同一次患者访问期间。连续施用可相隔1,2,3,4,5,6,7或8小时进行。相比之下，本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂被视为分开施用，如果它们在不同日施用给患者的话，例如本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂可以以1天、2天或3天、1周、2周或月间隔进行施用。在本公开的方法中，本公开的抗CD25抗体的施用可以在组合治疗剂的施用之前或之后。
作为一个非限制性例子，本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂可协同施用达一段时间，接着在第二段时间交替施用本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂。
由于施用本公开的抗CD25抗体和组合治疗剂的潜在的协同性效果，这类药剂可以以若单独施用时所述药剂之一或两者不是治疗有效的量来施用。
涵盖当用于治疗各种疾病时，本公开的抗CD25抗体可以与其他适用于相同或类似疾病的治疗剂组合。另外，由于抗CD25抗体靶向炎性途径，它们可与抗炎剂如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)、甲基哌啶(meperidine)、地塞米松(dexamethasone)、颇得斯安(pentasa)、美沙拉秦(mesalazine)、安萨科(asacol)、可待因磷酸盐(codeinephosphate)、贝诺酯(benorylate)、芬布芬(fenbufen)、萘普辛(naprosyn)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)和茚甲新(indomethacin)、阿斯匹林(aspirin)和布洛芬(ibuprofen组合。
当用于治疗癌症时，本公开的抗体可与常规癌症疗法组合，如手术、放疗、化疗、抗血管生成剂或其组合。
适合的化疗物包括但不限于，放射性分子、毒素(亦称为细胞毒素或细胞毒剂，其包括对细胞活力有害的任何试剂)、药剂、和脂质体或含有化疗化合物的其他泡状体(vesicles)。适合的化疗剂的例子包括但不限于，1-去氢睾酮(dehydrotestosterone)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(fluorouracildecarbazine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(thioguanine)、放线菌素D、阿霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整联蛋白抗体、烷化剂、别嘌吟醇钠(allopurinolsodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、anthramycin(AMC))、抗有丝分裂剂、顺式二氯二胺铂(cisdichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)顺铂)、二氨基二氯铂(diaminodichloroplatinum)、蒽环类抗生素(anthracyclines)、抗生素、抗代谢物、天冬酰胺酶、BCGlive(intravesical)、倍他米松磷酸钠(betamethasonesodiumphosphate)和倍他米松乙酸盐、比卡米特(bicalutamide)、博来霉素硫酸盐(bleomycinsulfate)、白消安(busulfan)、calciumleucouorin、加利车霉素(calicheamicin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、colchicin、缀合的雌激素类、环磷酰胺、cyclothosphamide、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷、松胞菌素B、cytoxan、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、更生霉素(之前称放线菌素)、daunirubicinHCL、daunorucbicin柠檬酸盐、地尼白介素-毒素连接物(denileukindiftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、dibromomannitol、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、多西他赛(docetaxel)、dolasetronmesylate、多柔比星(doxorubicin)HCL、屈大麻酚(dronabinol)、大肠杆菌L-天冬酰胺酶、eolociximab、emetine、阿法依伯汀(epoetin-α)、Erwinia天冬酰胺酶、酯化雌激素类、estradiol、雌莫司汀(estramustine)磷酸钠、溴化乙锭、乙炔基雌二醇、etidronate、依托泊苷(etoposide)citrororum因子、依托泊苷磷酸盐、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟康唑(fluconazole)、氟达拉滨(fludarabine)磷酸盐、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、亚叶酸(folinicacid)、吉西他滨(gemcitabine)HCL、糖皮质激素类、戈舍瑞林(goserelin)乙酸盐、短杆菌肽D、格拉司琼(granisetron)HCL、羟基脲、伊达比星(idarubicin)HCL、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α-2b、伊立替康(irinotecan)HCL、来曲唑(letrozole)、亚叶酸钙(leucovorincalcium)、亮丙瑞林(leuprolide)乙酸盐、左旋咪唑(levamisole)HCL、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(lomustine)、美登木素生物碱(maytansinoid)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)HCL、甲孕酮(medroxyprogesterone)乙酸盐、甲地孕酮(megestrol)乙酸盐、美法仑(melphalan)HCL、mercaptipurine、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睾酮、光神霉素、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼鲁米特(nilutamide)、奥曲肽(octreotide)乙酸盐、昂丹司琼(ondansetron)HCL、帕西他赛(paclitaxel)、氨羟二磷酸二钠(pamidronatedisodium)、喷司他丁(pentostatin)、匹鲁卡品(pilocarpine)HCL、plimycin、有卡莫司汀植入的聚苯丙生(polifeprosan)20、卟菲尔钠(porfimersodium)、普鲁卡因(procaine)、丙卡巴肼(procarbazine)HCL、普萘洛尔(propranolol)、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰素(taxol)、替尼泊苷(teniposide)、tenoposide、睾内酯(testolactone)、丁卡因(tetracaine)、thioepa苯丁酸氮芥(chlorambucil)、硫鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、托泊替康(topotecan)HCL、托瑞米芬(toremifene)柠檬酸盐、维A酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(vinblastine)硫酸盐、长春新碱(vincristine)硫酸盐、和长春瑞滨(vinorelbine)酒石酸盐。
任何抗血管生成剂均可连同本公开的抗CD25抗体一起用于治疗癌症，包括Carmeliet和Jain,2000,Nature407:249-257列出的那些。在某些实施方案中，抗血管生成剂是VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂如VEGF变体，可溶性VEGF受体片段，能够阻断VEGF或VEGFR、中和抗VEGFR抗体的适体，VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂及其任意组合。或者/另外地，抗VEGF抗体可以共施用给患者。
当用于治疗多发性硬化症时，本公开的抗体可与其他可用于治疗多发性硬化症的靶向性药剂组合使用，所述靶向性药剂例如干扰素β如干扰素β-1a(例如或)或干扰素β-1b(例如或)；格拉默(glatirameracetate)(例如)；fingolimod(例如)；米托蒽醌(例如)；那他珠单抗(natalizumab)(例如)；ocrelizumab(人源化的抗CD20单克隆抗体)；聚乙二醇化的干扰素β-1a；二甲基延胡索酸盐(tecfidera)；氨吡啶(fampridine)(例如fampyra(延长释放的氨吡啶片剂，在美国以Ampyra上市)；阿仑单抗(alemtuzumab)(例如)；laquinimod；和特立氟胺(teriflunomide)(例如)。
当用于抑制器官移植排斥时，本公开的抗体可与免疫抑制剂如皮质甾类；环孢菌素A；他克莫司(tacrolimus)；雷帕霉素(rapamycin)；麦考酚酸莫酯(mycophenolatemofetil)；和硫唑嘌呤(azathioprine)组合。
7.11诊断和药物试剂盒
本公开涵盖药物试剂盒，其含有本公开的抗CD25抗体(包括抗体缀合物)。药物试剂盒是包含本公开的抗CD25抗体(例如以冻干形式或作为水溶液)和以下一种或多种的包装物：
组合治疗剂，例如如上文5.10部分描述的；
用于施用抗CD25抗体的设备，例如笔、针和/或注射器；和
制药级水或缓冲液以将抗体重悬(若抗体为冻干形式的话)。
在某些方面，抗CD25抗体的每个单位剂量分开包装，且试剂盒可含有一个或多个单位剂量(例如2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量、或更多)。在一个特定的实施方案中，所述一个或多个单位剂量各自放置在注射器或笔中。
本文中还涵盖含有本公开的抗CD25抗体(包括抗体缀合物)的诊断试剂盒。诊断试剂盒是包含本公开的抗CD25抗体(例如以冻干形式或作为水溶液)和一种或多种可用于实施诊断测定的试剂的包装物。当抗CD25抗体用酶标记时，试剂盒可包含该酶所需要的底物和辅因子(例如底物前体，其提供可检测的生色团或荧光团)。另外，可包含其他添加剂如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。在某些实施方案中，诊断试剂盒中包含的抗CD25抗体固定化于固体表面上，或可固定化该抗体的固体表面(例如载玻片)包含在试剂盒中。各种试剂的相对量可大幅变化以提供实质性优化测定的灵敏性的试剂溶液中的浓度。在一个特定的实施方案中，所述抗体和一种或多种试剂可以干粉提供(分别或组合的)，通常是冻干的，包含在溶解时将提供具有适宜浓度的试剂溶液的赋形剂。
8.实施例
8.1概述
对达克珠单抗，一种人源化的IgG1抗CD25单克隆抗体，进行大量突变分析以鉴定具有有益特性的变体。达克珠单抗的生成是通过Queen方法进行的最早抗体人源化之一(Queen等,1989,Proc.Nat’lAcad.Sci.U.S.A.86:10029-33)。尽管人源化的抗体保留了鼠亲本抗体的功能(抗Tac)且批准用于预防肾移植排斥，但在人源化后在基于细胞的结合测定法中有3倍的亲和力丧失(见Queen等，见上文)。鉴于自达克珠单抗生成起另外可获的人框架序列的可用性和计算机建模中的改进，将抗Tac再人源化以评估是否存在改进的人源化设计，其保留对CD25的亲和力和鼠亲本抗体的功能性(见实施例1)。进一步的突变分析包括亲和力成熟和筛选达克珠单抗的CDR突变体的组合文库以及表征个体克隆(见实施例2，下文)，丙氨酸扫描CDR残基以鉴定对结合重要的残基(见实施例2)，对CDR位置的全面诱变和分析群体中的变体行为以鉴定显示出对CD25的可比或增加的亲和力的变体，之后确认代表性个体变体的结合和生物学特性(见实施例3)，和分析牵涉达克珠单抗的T细胞免疫原性的氨基酸并鉴定维持对CD25结合的“去免疫的”变体(见实施例4)。这些研究的结果汇总在表6-8中。表6A汇总了各个CDR或框架氨基酸取代，其确认为在个体克隆水平引起有益特性。表6B显示了HCCDR内的别的单氨基酸取代，其仅通过对板包被的CD25的ELISA直接结合测定法测试。表7A-7C汇总了具有多个CDR取代的达克珠单抗变体的动力学和生物学特性，如在单个克隆水平上测试的。表8A-8B鉴定了各个CDR取代，其在变体群体背景中的行为表明具有与达克珠单抗相比可比或改进的对CD25的结合。在一些情况中，变体被嫁接到不同于达克珠单抗IgG1的恒定区上。非IgG1抗体的同种型反映在表中。
8.2实施例1：小鼠抗TAC单克隆抗体的再人源化
为了再人源化小鼠抗Tac的VH，亚组I中的R3.5H5G(Manheimer-Lory等,1992,J.Exp.Med.174:1639-1652)被用作人框架(图2A)。预测9个氨基酸是结构上关键的，且其中8个(除了位置69)在NuhuTac中被取代为相应的小鼠残基(图2A中加下划线)。在初始人源化中，其中Eu(Kabat等,1987,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,4thedit.,PublicHealthService,N.I.H.Washington,DC)被用作人框架，12个残基被取代为小鼠残基。除了在NuhuTac中的人源化取代外，将Glu选作N末端氨基酸以避免由于N末端Gln的焦谷氨酸形成所致的异质性(Chelius等,2006,Anal.Chem.78:2370–2376)。
为了再人源化小鼠抗TacMab的VL，将亚组III中的ka3d1(Qlee等,1992,J.Exp.Med.175:831-842)用作人框架。预测1个氨基酸是结构上关键的且如此在NuhuTac中取代为相应的小鼠残基(图2B中加下划线)。在初始人源化中(其中Eu被用作人框架)，3个残基被取代为相应的小鼠残基。如此，再人源化抗体比达克珠单抗具有更少的鼠残基且预测为免疫原性更小。另外，由于N末端Gln-到-Glu取代，预测再人源化的抗Tac比初始人源化的抗Tac具有更少的异质性。
图2C显示达克珠单抗和NuhuTac重链和轻链的4种组合的测试结果。在再源化的抗体(NuhuTac)中通过ELISA竞争测定法观察到结合中约2倍的改进。
组合抗体通过组合(a)NuhuTacVH和达克珠单抗VL和(b)达克珠单抗VH和NuhuTacVL生成。NuhuTacVH与达克珠单抗VL的组合保留NuhuTac的更高亲和力而达克珠单抗VH与NuhuTacVL组合具有比NuhuTac低的亲和力。如此，重链取代可能引起NuhuTac的增加的亲和力。
接着，鉴定VH中引起改进的亲和力的关键取代。在达克珠单抗和NuhuTa的VH之前的6个差异中(在图2A的达克珠单抗VH序列中加下划线)，假定位置69和73(图2A的达克珠单抗VH序列中加双下划线)为特别重要的，因为预测它们与CDR环接触(Foote和Winter,1992,J.Mol.Bio.224:487-499)。因此，在达克珠单抗的背景中测试取代I69M,I69L和E73K。如图2D中显示的，E73K而非I69M或I69L被证明为对于NuhuTac相对于达克珠单抗的增加的亲和力是重要的。
8.3实施例2：使用基于哺乳动物细胞的全IgG展示文库对人源化的抗CD25抗体的亲和力成熟
将达克珠单抗亲和力成熟用于在其生物功能，抑制IL2结合IL2受体α链中的进一步改进。使用基于EBV的附加体载体，展示抗体文库为哺乳动物细胞表面上的全IgG分子并通过组合磁珠和荧光活化的细胞分选来筛选特异性抗原结合(Akamatsu等,2007,J.Immunol.Methods327:40-52)。分别筛选具有组合突变的VH和VL文库以鉴定有益突变。这些突变随后被组合以生成迷你文库来鉴定VH和VL的组合以实现最高的结合亲和力。结果，成功地鉴定了高亲和力变体，最高在亲和力中为14pM，这是对亲本达克珠单抗的28倍改进。观察到IL2受体阻断活性中多达3.9倍的改进，其通过引入仅3个氨基酸取代。更高的亲和力(更低的KD)一般与阻断IL2受体中改进的功能相关。进一步分解KD指示更快的kon值和更慢的koff值两者对于功能施加正面影响，然而，更快的kon值比更慢的koff值显示与改进功能的更强的相关性。当变体以Fab片段测试时，功能活性更强烈地与KD相关。
8.3.1材料和方法
8.3.1.1ELISA竞争测定法
达克珠单抗使用NHS-LC-LCBiotin试剂盒(Pierce,#21338)生物素化。将96孔ELISA板(Nunc-ImmunoMaxiSorpplates,NalgeNunc,Rochester,NY)的孔用100μL在0.2M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.4,Pierce,Rockford,IL)中的0.2μg/mLCD25(PeproTechInc.,RockyHill,NewJersey)在4℃过夜包被。在用清洗缓冲液清洗后，将孔用200μLSuperblockBlockingBuffer(Pierce,Rockford,IL)封闭30min然后清洗。对孔施加亚饱和量的生物素化的达克珠单抗(80ng/mL)和ELISABuffer中系列稀释的竞争物抗体的混合物，终体积为100μL，在37℃振荡器上温育1小时。然后将板用清洗缓冲液清洗3次。清洗后，对每个孔添加在ELISA缓冲液中稀释的100μL1μg/mL缀合HRP的链霉亲合素(Pierce)。在室温温育30分钟后，清洗板并通过添加ABTS底物检测结合的抗体(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)。反应通过添加100μL/孔的2％草酸终止并使用VERSAmax微板阅读器测量415nm处的吸光度(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)。使用软件GRAPHPADPRISM(GraphPad,SanDiego)的非线性回归来拟合结合抑制曲线并报告为IC50野生型/IC50突变体(相对于野生型对照的倍数改进)。
8.3.1.2BIAcore测定法
通过使用BIAcore2000和3000表面等离振子共振系统(BIAcore,Neuchatel,Switzerland)来测量达克珠单抗变体的结合亲和力。将多克隆山羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch)根据制造商说明书固定化于芯片上。以30μL/min的流速在室温实施结合测定法来研究达克珠单抗和CD25的结合。将1-128nM之间的8个不同浓度的CD25(PeproTechInc.)注射到表面，在该处捕捉达克珠单抗及其变体，有3分钟结合期，之后是15分钟解离期。将结合数据拟合于1:1Langmuir模型以从BIAevaluate软件提取结合常数。所有结合动力学数据均通过至少3次分别的测定分析。
8.3.1.3IL2依赖性Kit225/K6增殖测定法
Kit225/K6是IL2依赖性T细胞系，其源自患有T细胞慢性白血病的患者(Hori,1987,Blood70:1069-1672)。该细胞通常维持于生长培养基中(RPMI-1640,10％HI(热灭活)-FBS,50μg/ml艮他霉素(gentamicin)(Sigma)和5ng/mL重组人IL2(“rhIL2”)(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)。在测定当天，将细胞用RPMI-1640清洗3次并重悬于无IL2培养基(RPMI1640培养基，含有10％热灭活的FBS和50μg/mL艮他霉素)，细胞密度为50,000细胞/mL。在含rhIL2的测定培养基(RPMI-1640,10％热灭活的FBS,50μg/ml艮他霉素和0.2ng/ml的rhIL2)中制备系列稀释的抗体。之后，将100μL稀释的抗体与100μL先前准备的细胞在96孔无菌组织培养板中混合。在37℃在CO2培养箱中温育54+/-2小时后，向每个孔添加20μL的AlamarBlue(BiosourceInternational,Camarillo,CA)并在37℃在CO2培养箱中过夜温育以定量测量细胞增殖的水平。在温育18+/-1小时后，使用SPECTRAmaxGEMINISX微板读数器(MolecularDevices)光谱荧光计量性读出信号(在544nM激发，在590nM发射)。使用ANOVA(方差分析)来分析统计学差异。
8.3.1.4FACS结合测定
将2x105个表达高亲和力IL2-R的Kit225/K6或HuT102(Gazdar,1980,Blood55:409-17)等分到96孔块(Corning,2ml容量测定块)的每个孔中。将细胞用600μL的FACS缓冲液(PBS+1％BSA)清洗2次。达克珠单抗及其突变体以5μg/mL制备并以1:3或1:5在FACS缓冲液中系列稀释。然后，将100μL(在一些情况中25μL)稀释的抗体与之前清洗的细胞在每个孔中混合并在冰上孵育1小时。然后再次清洗细胞。向每个孔添加以1:250稀释的25μL的山羊抗HuIgG-FITC缀合的抗体(SouthernBiotech)并在冰上在黑暗中孵育30分钟。清洗后，将细胞悬于400μLFACS缓冲液中。结合细胞表面抗原的抗体量通过流式细胞术Cyan(Dako)测量。
8.3.2VH和VL文库的构建和富集
达克珠单抗的重链可变域(VH)的CDR1和CDR3和轻链可变域(VL)的CDR3被视为对CD25结合关键性的，而剩下的3个CDR被认为贡献程度较小(Glaser,1992,JournalofImmunol.149:2607-2614)。由于达克珠单抗的亲和力在亚纳摩尔水平，结合中心经由自然选择可能为近乎最优的。为了精调结合表面的外围，诱变被视为对结合不太关键的CDR。以在感兴趣位置处的氨基酸中的有限选择来分别构建VL和VH文库。选择被认为高度可变且在结合表面的外围处的VL中的6个位置和VH中的5个位置(Wu和Kabat,1970,J.Exp.Med.132:211-250)进行诱变。包括保守改变、极性到非极性改变和一些带电荷的氨基酸以产生多达105个氨基酸变体的组合。
对于VL文库，选择来自CDR1的2个位置(29和31)和来自CDR2的4个位置(50,51,52和53)进行诱变。对于VH文库，选择仅在CDR2中的5个位置(52,53,54,56和58)。VL和VH中每个感兴趣位置处的氨基酸变化列于表3。
通过PCR使用含有简并密码子的引物引入在每个位置处的突变。将文库片段亚克隆到基于EBV的附加体载体从而以IgG1/κ的形式展现抗体变体。为了评估文库的质量，将源自每个文库的20-96个克隆的微量制备DNA测序并确认突变如在其设计的位置处引入(未显示)。
将VL和VH文库DNA以及对照载体分别转染到293c18中用于IgG展示。结果，获得分别包含约2.9x107和3.3x106个独立克隆的VL和VH文库。
VL文库转染物经历3轮FACS富集以选择表达以更高亲和力结合人CD25的达克珠单抗变体的克隆。在每轮，首先将细胞与融合于lambda轻链恒定区的CD25的胞外域(CD25-Cλ)温育。清洗后，将细胞用PE标记的山羊抗人lambda轻链抗体(以检测结合抗原融合蛋白的细胞)和PECy5标记的抗人gamma链抗体(以监测表面IgG的水平)双染色。滴定抗原浓度来测定分选前每轮的最佳结合条件。为了富集展示亲和力比亲本抗体高的抗体的克隆，基于展示达克珠单抗的细胞的染色，分选设门被设定为高于对角线的双阳性。典型地，在本研究中描述的所有文库的每轮分选出1-3％的总细胞，除非另外说明。在每轮选择和培养后，将细胞用CD25-Cλ染色来监测CD25结合剂的富集水平。在第一轮分选中，使用两个不同的抗原浓度3nM和1nM。所得群体在生长培养基中分别培养用于第二轮分选，其使用0.5nM的CD25-Cλ。由于这两个群体在FACS染色中看上去相似(分别为10％和7％阳性结合(数据未显示))，将它们混合进行第三轮富集，其使用0.3nM的CD25-Cλ。用无插入的展示载体转染的细胞没有表面Ig且在5nMCD25-Cλ显示极小的非特异性结合。当以3nM抗原浓度染色未分选的VL文库时，4.4％的细胞在结合和表面Ig表达中是双重阳性的。在第三轮富集后，其变为72％阳性，超过了转染以展示亲本抗体的阳性细胞的百分比(27％)。
VH文库经历3轮FACS富集和针对结合不相关抗原的一次阴性选择。在第一轮分选中，将5nMCD25-Cλ与文库细胞以两个不同条件1小时或2分钟温育。在2分钟温育时，野生型达克珠单抗的结合尚未饱和，如此短温育时间意图富集高亲和力抗体，一定程度上强调更快的结合速率。培养从这些条件收获的所得细胞群体并用于第二轮分选，其分别使用0.5nMCD25-Cλ温育1小时，或3nM温育2分钟。在分选群体的扩增后，如材料和方法中描述的使用磁珠，细胞要吸收非特异性结合物，然后进行第三轮富集，其分别使用0.1nMCD25-Cλ温育1小时或0.5nM温育2分钟。当未分选的VH文库在5nM抗原浓度的条件染色时，3.5％的细胞显示开始阳性结合。在第三轮富集后，其变为在抗原结合中在任一分选条件中为79％阳性的，超过了转染以展示亲本抗体的阳性细胞的百分比(50％，数据未显示)。
在对VL变体的表征期间，我们经历了一些似乎得到非特异性特征(由于氨基酸取代)的变体的富集。这类克隆可存活到富集结束，但难以纯化，原因是对蛋白A柱的非特异性结合。从这一经历出发，引入了对VH文库富集的阴性选择，其使用缀合有不相关蛋白的磁珠来从群体中排除非特异性结合物。结果，没有从VH文库鉴定出得到非特异性特征的克隆。
8.3.3鉴定具有对CD25的更高亲和力的VL和VH变体
在最终富集后，扩增细胞并拯救质粒DNA，如描述的。电穿孔后获得几百个独立的菌落。制备为混合物的质粒转化为产生可溶IgG1的形式，其通过用限制酶消化除去编码膜栓系域的区。然后将经消化的载体重连接并转化到细菌中。以96孔形式个别培养培养菌落并分离质粒DNA用于测序分析。
对于VL富集，从每轮拯救质粒DNA并比较特定突变的富集进展。分别从第1、2和3轮富集获得总计86、89和41条序列。随着它富集，独立序列的数目减少52、40和16(60％、45％和39％)，指示群体随着富集进行而偏向特定组合。观察到CDR1中R29S31或R29T31的频率在第1、2、和3轮富集后分别一致性增加，分别增加2％、8％和10％，以及7％、9％和10％。类似地，CDR2中T50T51S52D53(SEQIDNO:17)的频率以2％、8％和12％增加。除了一个显示非特异性结合特性的之外，在最终富集时没有任何其他组合以超过5％的频率富集。含有这些突变的质粒(为分泌形式)被瞬时转染用于抗体表达，并通过ELISA竞争比较纯化抗体的结合亲和力作为初始表征。所有3种变体均显示结合中的约2倍改进。由于CDR1中的S29R和S29R-S31T在结合中未显示显著差异，将S31T从进一步分析排除。由于两个位置29和53均从中性变为带电荷的残基，我们决定测试具有类似属性的另一种残基来着手解决这些电荷是否造成抗原结合中的改进。对于CDR1中的位置29，测试了另一个带正电荷的氨基酸Lys以及Arg。对于CDR2中的位置53，测试另一个带负电荷的氨基酸Glu以及Asp。从瞬时表达的培养上清纯化抗体并测试用于竞争性ELISA。达克珠单抗及其变体与生物素化的达克珠单抗以浓度依赖性方式竞争对CD25的结合。两种突变均显示结合中的改进(对于N53E和S29K在IC50中分别为约3和5倍改进)，甚至比那些从文库初始鉴定的还要好(对于N53D和S29R在IC50中分别为约1.5-和2倍改进)。未从文库鉴定出S29K，因为它未作为位置29处的一种选择纳入。在另一方面，N53E未鉴定为富集的突变，即使其被作为位置53处的选择纳入(表3，左)。这最可能是由于所有可能的氨基酸取代的组合在转染水平的不完全覆盖。该位置处的Glu取代在富集结束时以低频率(5％)存在，表明表达具有适宜组合的突变体的细胞在初始群体中不可获。对文库群体的不充分覆盖可能部分是因为VL文库中存在的亲本序列的高背景。VL文库中亲本序列的百分比在富集之前和之后分别为18％和31％。由于同一原因，当通过逐个位置分析富集时，在每个位置野生型残基看上去富集得最多。
由于并未鉴定出来自VL文库的这些有益突变的所有组合，在轻链表达载体中分别生成总计8种变体来评估组合突变的效果。将这些质粒与表达亲本重链的表达载体一起共转染到293T中以用于产生分泌形式的抗体。从培养上清纯化抗体并通过BIAcore分析其结合动力学。
在位置53，Glu显示比Asp稍好的亲和力(NST-SE和NST-SD；分别为190pM和204pM)。在位置29，Lys显示比Arg更好的亲和力(NST-KN和NST-RN；分别为227pM和262pM)。然而，S29K和N53E的组合未产生最佳VL变体(见NST-KE)。尽管N53E在具有单氨基酸取代的鉴定的VL变体中是亲和力(KD)最高的，但其似乎不与位置29处的突变完全组合。相反，N53D与位置53的任一突变加性组合(S29R-N53D:2.5x1.9＝约4.9倍；S29K-N53D:2.5x2.2＝约5.1倍)。结论是，最佳的VL变体鉴定为S29K-N53D，亲和力为98pM，相对于亲本抗体在KD中有多达5.1倍改进。
对于VH富集，从最终富集轮数拯救质粒DNA并比较每个位置的特定突变的富集。由于在从以不同染色条件分选的两个池(pool)中获得的序列中没有显著差异，组合结果来分析。不同于其中最终群体严重偏向于某些组合且具有显著量的亲本序列的VL文库，VH文库在第三轮富集后仍然趋异，因为从82种序列获得了67种独立序列(82％)。在富集之前和之后未从获得的序列数(分别为64和82)观察到亲本序列。最频繁的VH突变的组合为出现6次的VRKYQ(当亲本VH位置N52,S53,T54,Y56,E58表示为NSTYE)，继之以RRGFE(4次)和出现2次的RKGFE,RRGYE,RKGFN,SNKYL,QRKFH,RRKFE,VKRFQ。为了确认这些突变体的亲和力，从含有每种突变的质粒除去膜栓系，从瞬时转染表达可溶性形式并通过竞争性ELISA分析蛋白质。结果，它们全部证明是高亲和力变体，相对于亲本抗体为约10倍。尽管由于较大的文库大小而难以从该数量的序列数据鉴定出最富集的组合，但在位置52,53和54处优选带正电荷的序列。当分析每个个别位置处的富集比时，Arg,Ser和Val均一致地在位置52富集，是理论百分比的至少2倍。在另一方面，除Lys和Gln外的大多数其他选择从群体中排除，富集比低于0.3。在位置53，Arg和Lys被富集了超过3倍，而排除了Glu,Ile，和Thr。在位置54，富集了Gly,Lys和Arg，然而除Asp和Val外排除了大多数其他选择。位置56未显示对任一选择的任何偏好，因为回收了几乎相等数目的每种氨基酸(在从第三轮选择分离的82条序列中39个具有Phe，43个具有Tyr)。在位置58，Glu和Gln分别富集了7和4倍，而消除了除Asn,His和Gly外的其他选择。有意思的是，甚至在一些情况中亲本残基也被消除了，如N52或T54，表明一些位置在体内亲和力成熟过程期间未完全优化。
为了测试在52,53和54的每一个位置富集的那些氨基酸是否造成改进的亲和力，将未鉴定的4种氨基酸组合作为单一克隆，RKR,RRK,SRK和RKK(当亲本抗体在位置52,53和54指示为NST时)，亚克隆到载体中以将其表达为分泌的蛋白质。位置56和58如其在野生型中的那样保留(Y和E)。可溶性形式的IgG在293T中瞬时表达，并在BIAcore分析上测试纯化的抗体。所有这些变体均显示两位数KD，相对于亲本抗体在亲和力中有7-23倍改进。它们均显示出比鉴定的具有S29K-N53D突变的最佳VL变体更好的亲和力，后者是98nM(对达克珠单抗的5.1倍改进)，这表明这三个位置的每一个可能造成亲和力改进。与ELISA结果结合，几种氨基酸组合能产生比达克珠单抗至少高10倍的亲和力。
8.3.4构建和富集迷你文库以组合VH和VL突变
为了分离VL和VH的组合以实现最高亲和力，在VL和VH文库中富集的突变以及被分别确认为有益的那些被组合到一个小文库中。由于并非所有突变在它们被组合时可以具有加和或协同效果，在每个位置纳入野生型氨基酸以实现最高亲和力及最小突变数目。VH-VL迷你文库在氨基酸水平上的文库复杂性为2,160(在核苷酸水平为2,592)。
含有迷你文库的293c18稳定转染物经历3轮基于FACS的富集以获得具有对人CD25的最高结合亲和力的VH-VL组合变体。将迷你组合文库染色并以两种不同的办法分选：一种使用递增严格性的简单FACS结合，而另一种采用竞争性结合进行FACS染色。在前一种办法中，将1nM,0.07nM和0.02nMCD25-Cλ分别用于初始、第2轮和最终轮分选。对于后一种办法，如通常那样分选细胞，没有1nM的竞争物用于第1轮分选。然后，将扩增的细胞与0.1nMCD25-Cλ在存在亲本达克珠单抗的情况下温育用于第2轮富集。竞争抗体的浓度已优化从而能竞争掉在细胞表面上展示的90％的达克珠单抗。分选后，将细胞在1nMCD25-Cλ染色并通过FACS分析以比较富集水平。在3轮富集后观察到对IL13Rα1-Cλ的极少的结合，指示大多数表达特异于CD25的胞外域的IgG的细胞。在竞争性FACS富集后没有实施第3轮富集，因为竞争性分选后的结合百分比看起来与在无竞争的第3轮富集后观察到的可比。从常规三轮FACS富集方法(FS3)，从66个克隆获得了34种独立的抗体序列。从有竞争的富集方法(FS2C)，从89个克隆获得了67种独立抗体序列。从FS3最常观察到的VH-VL组合是RKTE-SE(7次)，接着是VKRE-RE(5次)(亲本VH-VL组合N52S53T54E58-S29N53在此表示为NSTE-SN)。对于FS3，两种最频繁的VH变体是RNRE(8次)和RKTE(7次)，而对于FS2C，其为VSRE(12次)和KSRE(6次)。从FS2C最常观察到的VH-VL组合是VRRE-SE(4次)和VSRE-KD(4次)。对于VL，对任一种条件的最优选的组合是SE(FS3中52次；FS2C中24次)，接着是RE(FS3中18次；FS2C中20次)。在位置29，亲本残基Ser似乎在任一种条件中富集而Lys在FS3中排除。在VL的位置53，任一种条件中更偏好Glu而非亲本Asp残基。在VH的位置52，Arg和Ver分别在FS3和FS2C中最多富集。在另一方面，清楚地排除Asp,Glu,Gly，主要复制了VH文库的结果(表1，右)。在位置54，Lys和Arg均比亲本残基Thr更受偏好，在FS2C中更偏好Arg。尽管位置53似乎在选择中没有偏好，但位置58在任一种条件中重度偏向于Glu。基于这些结果，选择含有富集的氨基酸组合的6种变体，和在VH文库中鉴定的最高亲和力VH(S52R53K54)与迷你文库中最富集VL(S29E53)的组合来表征。瞬时表达文库成员并经由蛋白A柱纯化。这些变体的结合亲和力的KD在14-40pM的范围内，这是从亲本抗体的13-36倍改进。还测试成员以用于功能性测定，通过对IL2依赖性细胞系Kit225/K6增殖的抑制来比较阻断IL2-R结合其配体IL2的能力测量。具有改进的IL2-R阻断的变体应需要更少量的抗体来抑制增殖。将变体的IC50值用亲本抗体的该值标准化并显示为功能改进。有意思的是，虽然所有7种变体亲和力均较高，并非其所有均在功能中改进，表明在亲和力到生物学功能的转化效率中还涉及其他的因子。
8.3.5结合动力学和生物学功能之间的相关
为了更好地理解亲和力和生物学功能之间的关系，我们接着尝试鉴定一些降低达克珠单抗亲和力的突变。为了鉴定出可能适度降低而非完全敲低抗原结合的突变，在预测为溶液中暴露的VLCDR1和CDR2中的8个位置上构建丙氨酸取代(S27A,S29A,S31A,Y32A,T50A,T51A,S52A和N53A)。在ELISA竞争测定法中预筛选后，4种抗体显示结合中的降低，IC50增加了至少2倍(S31A,Y32A,T50A和T51A，数据未显示)。进一步测试这些以测量结合动力学和抑制Kit225/K6细胞增殖的能力。大多数测试的丙氨酸取代物显示功能中的显著降低，除了T50A，其显示等同于亲本抗体的结合亲和力。总之，亲和力的降低似乎引起生物学功能的降低，至少对于那些测试的是这样。
所有数据均绘制在图中，其含有在本研究中获得的生物学功能和结合动力学(图3A-3C)。受体阻断活性中的改进与更小的KD值相关(p＝0.0261)，指示具有更高的亲和力通常有助于达克珠单抗的生物学功能(图3A)。即使将亲和力数据分解为kon和koff，该相关也仍然真实(图3B和3C)。kon的更大值(p＝0.0008)比更小的koff(p＝0.0416)与生物学功能更强烈相关，表明在改进达克珠单抗的功效时更快的结合比更慢的解离是优选的。
8.3.6具有最快的结合速率和最慢的解离速率的两种变体的剖析
尽管更高的亲和力一般与更好的生物学功能相关，但单独的亲和力不对生物学活性中的改进负责。例如，V52S53R53-K29D53(VSR-KD)由于其最慢的koff显示所有里面最高的亲和力，然而该变体不产生生物学活性的最大改进。在另一方面，K52S53R53-S29E53(KSR-SE)显示功能的最佳改进，可能是由于其最快的kon，即使它并不显示亲和力中的最佳改进。
为了更好地理解涉及决定达克珠单抗功能的因素，选择这两种变体进一步分析。将编码重链和轻链的DNA片段分别亚克隆到载体中以评估VH和VL突变的贡献。不同VH和VL突变的组合通过将其共转染容易地解决。表达了有和无VL突变的6种组合的变体抗体，并将纯化的抗体进行竞争性ELISA。有意思的是，含有KSRVH的抗体显示比含有VSRVH的那些更好的结合。尽管VL突变的贡献在ELISA中看来较小，但其有助于通过BIAcore测量的结合亲和力(表5)。事实上，对于两种抗体，VL突变的贡献是对VH突变加和性的(对于VSR-KD:6.4x4.6＝约28；对于KSR-SE:3.9x2.6＝约14)。BIAcore和ELISA数据之间的这种差异可能是由于VSRVH的解离速率太慢而不能使结合在ELISA中采用的结合条件下(37℃1hr)达到平衡。
为了基于纯亲和力比较活性，从全抗体生成Fab片段并通过竞争性ELISA和增殖抑制测定法比较其功能(图4)。竞争性ELISA中达克珠单抗Fab的IC50值比IgG中的高约2个级别，指示结合中通过为二价的显著亲合力效果。不同于IgG形式中的ELISA，变体中的次序与其内在亲和力一致，显示VSR-KD中的最佳结合(图4A)。类似地，使用Fab的增殖抑制活性与其内在亲和力相关(图4B)。如此，在本实验背景中，抗CD25抗体阻断IL2-R的能力与IL2抑制相关。
8.4实施例3：鉴定和表征达克珠单抗的其他变体
在另一项研究中，在达克珠单抗的CDR中进行全面诱变以产生具有单点突变的变体群体。然后基于抗体在群体中的行为筛选该变体群体以鉴定出产生对CD25的增加的结合亲和力的点突变体。
鉴定出53种变体，其在群体中的行为指示比达克珠单抗更高的对CD25的结合亲和力，包括实施例2中鉴定的那些。诱变还鉴定出其在群体中行为在对CD25的结合中未与达克珠单抗有显著变化的变体。为了确认在群体背景中变体的行为反映了其对CD25的实际亲和力，进一步通过FACS和/或ELISA竞争分析一些变体。另外，在Kit225增殖测定法和/或PBMC增殖测定法中进一步分析一些变体的活性。
8.4.1材料和方法
8.4.1.1IL2诱导的PHA胚细胞增殖抑制测定法
通过Ficoll-PaquePlus(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)密度梯度离心按照制造商对Leucosep(GreinerBio-One,Germany)的用法说明从人全血分离PBMC，并以106/mL重悬于用1mMNaPyrubate(Invitrogen),10mMHEPES(HyClone,Utah),1x非必需氨基酸(HyClone),0.055mM2-巯基乙醇(Invitrogen),1xL-谷氨酰胺(HyClone),100U/ml青霉素-链霉素(HyClone)和10％热灭活的FBS补充的RPMI1640中。以10μg/mL添加PHA(Sigma)并在37℃在5％CO2中培养72小时。将收获的PBMC胚细胞用普通RPMI1640清洗3次并以106/mL重悬于完全RPMI中。为了设置侧顶板，在含有2倍终浓度IL2(1ng/mL，终浓度为0.5ng/mL)的完全RPMI1640中制备3倍稀释的抗体并以100μL每孔一式两份地分配到96孔圆底板中。稀释开始于40μg/mL，终浓度为20μg/mL(200μL/孔)。添加100μL的每种细胞并温育总计72小时。在收获前16小时，将板用0.5μCi/孔的[3H]-胸苷脉冲，使用制造商推荐的条件用细胞收获仪(FiltermateOmnifilter-96Harvester,PerkinElmer)收获细胞，并使用闪烁计数器(WallacTrilux)测量来自胸苷掺入的beta颗粒发射。数据分析为[3H]-胸苷有关的发射的总计数每分钟和相对于仅IL2刺激的对照的百分比抑制。使用软件GRAPHPADPRISM(GraphPad,SanDiego)用非线性回归拟合抑制曲线并报告为IC50野生型/IC50突变体(相对于野生型对照的倍数改进)。
8.4.1.2竞争ELISA
竞争ELISA如6.2.1部分中描述的进行。
8.4.1.3KIT225测定
KIT225测定如6.2.3部分中描述的进行。
8.4.1.4BIAcore
在BIAcore2000或T100型(Biacore,GEHealthcare)上在25℃使用含0.1mg/mlBSA的HBS-EP+作为运行缓冲液实施亲和力测量。在所有4个流动池中将CM5传感器芯片以约10,000RU用多克隆山羊抗人Fc抗体(Pierce)胺偶联从而通过注射5uL的1ug/mL抗体以10mL/min(约60RU)捕获达克珠单抗或其变体。对抗原的结合通过以50μL/min的流速注射0.195-25nMCD25(R&Dsystems)来进行。监测结合5分钟，接着是15分钟的解离阶段。通过以100mL/min的50uL10mM甘氨酸(pH1.5)的两个连续脉冲来再生表面。通过使用1:1模型同时拟合传感器的结合和解离阶段来从BIAevaluate软件提取结合常数来完成动力学分析。
8.4.1.5FACS结合
FACS结合如6.2.4部分中描述的进行。
8.4.1.6混合淋巴细胞反应
使用体外衍生的moDC和来自人PBMC供体的同种异源CD4+T细胞来实施混合淋巴细胞反应(MLR)。简言之，使树突细胞如6.5.1.4部分中描述的从人PBMC成熟。如6.5.1.5部分中描述的从同种异源供体的冷冻等分试样分离CD4+T细胞。将纯化的CD4T细胞和树突细胞以10:1比率共培养于具有滴定浓度的抗CD25抗体的无血清AIMV培养基中。在第5天，将培养物用含氚胸苷脉冲处理。将培养物收获至滤层并使用闪烁计数器(WallacBetamax1450；WallacTriLux系统(Uppsala,Finland))检测含氚胸苷掺入。计算抑制的EC50。用每种变体测试多个供体并计算平均EC50。将每种变体的汇编的EC50对亲本抗体的参数数据校准(benchmark)以提供倍效力值。
8.4.1.7NK细胞扩增
CD56brightNK细胞在存在rhIL2和抗CD25抗体的情况下特定地扩增(Martin等,2010,J.Immunol.185:1311-1320；Sheridan等,2011,MultipleSclerosisJ.17:1441-1448)。将来自人供体的PBMC与10ngrhIL2(Prometheus)和2.5μg/ml的抗CD25抗体在含有10％超低Ig胎牛血清(HyClone)并用L-谷氨酰胺(HyClone)、碳酸氢钠(BioWhittaker)、丙酮酸钠(GIBCO)、非必需氨基酸(HyClone)、青霉素和链霉素(BioWhittaker)及beta-巯基乙醇(GIBCO)补充的RPMI1640(Invitrogen)中共培养10天。以4x10^6个细胞每孔在24孔板中测定PMBC。每两至三天将1mL培养基用含新鲜IL2和抗体的完全培养基替换。在第10天，收获、清洗细胞培养物并进行流式细胞术以计算存在的CD56brightNK细胞的数目。用于鉴定CD56brightNK细胞的标志物是荧光标记的抗CD3,抗CD16，和抗CD56(所有来自BDBiosciences)。CD56bright细胞鉴定为CD3阴性、CD16低、CD56亮。第10天结果与在培养起始日(dD＝0)时存在的CD56bright细胞的百分比比较。结果从25位供体获得并对来自含有亲本抗CD25的培养物的结果校准。仅变体C54显示对体外CD56brightNK细胞诱导的统计学显著的增强。
8.4.2结果
通过亲和力对VH和VL的总计580(29位置x20a.a.)和520(26位置x20a.a.)种单一氨基酸取代的分别排序。580个VH突变中有33种(5.7％)和520个VL突变中有20种(3.8％)证明显示改进的亲和力，在BIAcore或ELISA的结合中有至少1.2倍改进。在CDR上的总计53个点突变中，最佳突变为VH中的Y56R，其显示基于BIAcore在亲和力中的13.6倍改进。
8.5实施例4：鉴定达克珠单抗的去免疫变体
8.5.1材料和方法
8.5.1.1肽
使用多针(multi-pin)形式通过PepScan(Lelystad,theNetherlands)或Mimotopes(Adelaide,Australia)合成肽。达克珠单抗轻链和重链V区的序列合称为有12个氨基酸重叠的15聚体肽(表9)。重链肽集合中的第一个肽包含3个另外的氨基酸(VHS)，已知由于不正确的信号肽切割而以较小的频率发生。肽PH2代表正确切割的VH蛋白的头15个氨基酸(表9)。表位区肽变体以18聚体合成以涵盖两种鉴定的感兴趣的肽。肽在到达时是冻干的，并以约1-2mg/ml重悬于DMSO(Sigma-Aldrich)中。储存肽于–20℃保持冷冻。
8.5.1.2人外周血单核细胞
团体供体(Communitydonor)血沉棕黄层产品购自StanfordBloodCenter,PaloAlto,Calif。血沉棕黄层材料用不含钙或镁的DPBS以1:1v:v稀释。将稀释的血沉棕黄层(25-35ml)在50ml锥形离心管(Sarsted或Costar)中用12.5ml的FicollPaque-PLUS(GEHealthcare)铺在下方。将样品在室温以900g离心30分钟。外周血单核细胞(PBMC)从界面处收获。添加DPBS以使终体积为50ml并以350g离心细胞达5分钟。将成团粒的细胞在DPBS中重悬并计数。
8.5.1.3HLA分析
使用商品化的试剂盒(Qiagen)自人PBMC的冷冻等分试样分离DNA。按照制造商的推荐方案(Invitrogen:DynalRELISSOtypingsystem)进行基于PCR的对HLA-DRβ1和HLA-DQβ等位基因的SSO分型。手动实施HLA等位型分配。
8.5.1.4树突细胞
对于树突细胞的分离，将T75培养烧瓶(Costar)用108个新鲜分离的PBMC在总体积30mlAIMV培养基(Invitrogen)中接种。将过量的PBMC在-80℃以5X107细胞/ml在90％胎牛血清(FCS)、10％DMSO中冷冻。将T75瓶在37℃在5％CO2中温育2小时。除去不粘附的细胞，并将粘附的单层用DPBS清洗。为了将树突细胞与单核细胞区分，添加30mlAIMV培养基，其含有800个单位/ml的GM-CSF(RandDSystems)和500个单位/ml的IL-4(RandDSystems)。将烧瓶温育5天。在第5天，添加IL-1α(Endogen)和TNF-α(Endogen)至50pg/ml和0.2ng/ml。将烧瓶再温育2天。在第7天，通过添加3ml的100mMEDTA(含有0.5至1.0mg丝裂霉素C(Sigma-Aldrich))以达到终浓度10mMEDTA和16.5至33μg/ml丝裂霉素C来收获树突细胞。或者，树突细胞可用4,000拉德(rads)照射用于固定。将烧瓶在37℃和5％CO2中再温育1小时。收获树突细胞，并在AIMV培养基中清洗2-3次。
8.5.1.5细胞培养
在第7天，将先前冷冻的自体同源PBMC在37℃水浴快速融化。将细胞立即稀释到DPBS或AIMV培养基中并在350g离心5分钟。通过阴性选择使用磁珠(Easy-SepCD4+试剂盒，StemCellTechnologies)富集CD4+细胞。自体同源CD4+T细胞和树突细胞以2X105个CD4+T细胞每2X104个树突细胞每孔共培养于96孔圆底板(Costar9077)中。以约5mg/ml添加肽。对照孔含有0.25％v:v的单独的DMSO(Sigma)媒介物。阳性对照孔含有0.25％的DMSO和1mg/ml的破伤风类毒素(ListBiologicals或CalBioChem)。将培养物温育5天。在第5天，添加0.25μCi每孔的含氚胸苷(Amersham或GEHealthcare)。在第6天时使用PackardFiltermate细胞收获仪获培养物至滤层。使用WallacMicroBeta1450闪烁计数器(PerkinElmer)实施闪烁计数。
8.5.1.6数据分析
通过对来自6至12个重复的阴性对照孔结果取平均值来计算平均背景CPM值。对4个阳性对照孔的CPM值取平均值。将每种肽的一式两份或一式三份孔取平均值。阳性对照和肽孔的刺激指数值通过将平均实验CPM值除以平均阴性对照值来计算。为了包括在数据集中，需要破伤风类毒素阳性对照孔中约3的刺激指数。对于产生2.95或更大刺激指数的任意肽记录应答。使用来自115位供体的组的外周血样品测试肽。汇编对所有肽的应答。对于测试的每种肽，计算以2.95或更大的刺激指数应答的供体集的百分比。另外，还计算所有供体的平均刺激指数。
8.5.1.7抗体变体的生成
将Queen等(Queen等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033)描述的人源化的抗Tac(HAT)轻链V区基因以XbaI-XbaI片段亚克隆到pVk.rg(Cole等,1997,J.Immunol.159:3613-3621)中。通过将细菌复制起点用来自pUC18的高拷贝数细菌复制起点替换来进一步修饰该表达载体(Yanisch-Perron等,1985,Gene33:103-119)。
Queen等，见上文描述的HAT重链V区基因通过将信号肽用来自EP-5C7(He等,1998,J.Immunol.160:1029-1035)的小鼠重链V区基因的信号肽替换来修饰。按照He等的方法构建和扩增包含HAT-VH基因的经修饰的信号肽和N末端半部分的MluI-SalI限制片段，其使用长为约75个碱基的4种重叠性合成寡核苷酸(表10)。使寡核苷酸成对退火并用DNA聚合酶I(NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)的Klenow片段在室温延伸15min，得到两种双链片段。将所得片段变性，成对退火并用Klenow延伸，得到全长片段。所得产物通过聚合酶链式反应(PCR)使用外部引物E.HAT-5(5’–TATAACGCGTCCACCATGGACTCG–3’)(SEQIDNO:35)和E.HAT-6(5’–TATAGTCGACGGATTAATATATCC–3’)(SEQIDNO:36)扩增，其使用ExpandHighFidelityPCR系统(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)通过以下进行：在94℃温育2min，接着是94℃达10秒，56℃达10秒和72℃达1min的35个循环，继之以在72℃温育10min。将PCR扩增的片段凝胶纯化，用MluI和SalI消化，与包含HAT-VH基因的C端半部分的SalI-XbaI限制片段组合，并插入到pVg1.D.Tt中(Cole等，见上文)。所得的称为E.HAT-VH的V区基因编码与Queen等，见上文描述的相同的成熟重链V区序列。通过核苷酸测序验证经修饰的重链V区基因序列。
为了协助DNA测序，使用重叠-延伸PCR方法(Higuchi,于“PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification”,StocktonPress,NewYork(1989),pp.61-70)来修饰E.HAT-VH基因的核苷酸序列，其使用诱变引物JXG1-4(5’–GTGCAAGAGGAGGAGGAGTCTTGAC–3’)(SEQIDNO:37)和JXG1-5(5’–GTCAAAGACTCCTCCTCCTCTTGCAC–3’)(SEQIDNO:38)。第一轮PCR使用外部引物MBR3(5’–CCATAGAAGACACCGGGACC–3’)(SEQIDNO:39)和JXG1-5(用于左手片段)，外部引物MD8(5’–TCACCTTAGCCCCCTCCCTG–3’)(SEQIDNO:40)和JXG1-4(用于右手片段)。使用HighFidelityPCR系统(RocheMolecularBiochemicals)完成PCR，其通过在95℃温育5min，接着是95℃30秒，60℃30秒和72℃1min的35个循环，继之以在72℃温育10min。将PCR产物凝胶纯化，然后如上文描述的那样使用引物MBR3和MD8完成第二轮PCR以组合左手和右手片段。将PCR扩增的片段用MluI和XbaI消化，然后亚克隆到pVg1.D.Tt(Cole等，见上文)中。所得的称为E.HAT(GGA)-VH的V区基因编码与由Queen等，见上文描述的相同的成熟重链V区序列。经修饰的重链V区基因序列通过核苷酸测序验证。通过将细菌复制起点用来自pUC18(Yanisch-Perron等，见上文)的高拷贝数细菌复制起点替换来进一步修饰该表达载体。
使用重叠-延伸PCR方法(Higuchi，如上)完成对E.HAT-VH基因的定点诱变。为了生成I48L,I48M，和I48V突变，使用诱变引物DAC-48F(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGNTGGGATATATTAATCCGTCGACTGGGTATACTGAATAC-3’)(SEQIDNO:41)和DAC-N186-R(5’–CCATTCCAGACCCTGTCCAGGG–3’)(SEQIDNO:42)，其中N＝A,C,G,或T。为了生成I51A,I51L，和I51V突变，使用诱变引物DAC-51F(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATATSYCAATCCGTCGACTGGGTATACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:43)和DAC-N186-R，其中S＝C或G，和Y＝C或T。为了生成T54A,T54V，和T54S突变，使用诱变引物DAC-54F(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATATATTAATCCGTCGKYCGGGTATACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:44)和DAC-N186-R，其中K＝G或T。为了生成Y56A突变，使用诱变引物DAC-56F(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATATATTAATCCGTCGACTGGGGCCACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:45)和DAC-N186-R。第一轮PCR使用外部引物DAC-5END-F(5’–GTCAACGCGTCCACCATGGACTCGAG–3’)(SEQIDNO:46)和DAC-N186-R用于左手片段，和外部引物DAC-3END-R1(5’–GTACTCTAGAGGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGAC–3’)(SEQIDNO:47)或DAC-3END-R2(5’–GTACTCTAGAGGTTTTAAGGACTCACCTGA–3’)(SEQIDNO:48)和DAC-48F,DAC-51F,DAC-54F,或DAC-56F用于右手片段。使用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)完成PCR，其通过在94℃温育5min，接着是94℃20秒，56℃30秒和72℃1min的30个循环，继之以在72℃温育10min。将PCR产物凝胶纯化，然后如上文描述的完成第二轮PCR以组合左手和右手片段，其使用引物DAC-5END-F和DAC-3END-R1或DAC-3END-R2。将全长PCR产物凝胶纯化，用MluI和XbaI消化，并亚克隆到pVg1.D.Tt(Cole等，如上)中。通过核苷酸测序验证突变。
使用重叠-延伸PCR方法(Higuchi，见上文)完成对E.HAT(GGA)-VH基因的定点诱变。为了生成I48M/I51L双重突变，使用诱变引物DAC48M51L(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATGGGATATCTGAATCCGTCGACTGGGTATACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:49)和DAC-N186-R。为了生成I48M/T54S双重突变，使用诱变引物DAC48M54S(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATGGGATATATTAATCCGTCGTCCGGGTATACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:50)和DAC-N186-R。为了生成I48V/T54S双重突变，使用诱变引物DAC48V54S(5’–CCCTGGACAGGGTCTGGAATGGGTGGGATATATTAATCCGTCGTCCGGGTATACTGAATAC–3’)(SEQIDNO:51)和DAC-N186-R。如上文描述的完成第一轮PCR，其使用外部引物DAC-5END-F和DAC-N186-R用于左手片段，和外部引物DAC-3END-R1或DAC-3END-R2和DAC48M51L,DAC48M54S,或DAC48V54S用于右手片段。如上文描述的完成第二轮PCR以组合左手和右手片段，其使用外部引物DAC-5ENDF和DAC-3END-R2。将所得的全长PCR产物凝胶纯化，用MluI和XbaI消化，并亚克隆到含有来自pUC18(Yanisch-Perron等，见上文)的高拷贝数细菌复制起点的pVg1.D.Tt(Cole等，见上文)的经修饰形式中。通过核苷酸测序验证突变。
8.5.1.8瞬时转染
在37℃在7.5％CO2培养箱中在含有10％胎牛血清(FBS)(HyClone,Logan,UT),0.1mMMEM非必需氨基酸(InvitrogenCorporation)和2mML-谷氨酰胺(InvitrogenCorporation)的DMEM(BioWhittaker,Walkersville,MD)(下文称为293培养基)中维持人肾细胞系293T/17(美国典型培养物保藏中心，Manassus，VA)。为了在瞬时转染后表达和纯化单克隆抗体，在含有2％超低IgGFCS(HyClone),0.1mMMEM必需氨基酸和2mML-谷氨酰胺的DMEM(下文称为低-IgG293培养基)中温育293T/17细胞。
使用Lipofectamine2000(InvitrogenCorporation)按照制造商的推荐实施293T/17细胞的瞬时转染。将每次转染的约2x107个细胞铺板于T-175烧瓶中的50ml293培养基中并过夜生长至汇合。次日，将35μg的轻链质粒和35μg的重链质粒与3.75ml杂交瘤-SFM(HSFM)(LifeTechnologies,Rockville,MD)组合。在分开的管中，将175μl的Lipofectamine2000试剂和3.75ml的HSFM组合并在室温温育5min。将3.75mlLipofectamine2000-HSFM混合物与3.75mlDNA-HSFM混合物轻柔混合并在室温温育20min。在转染前1小时，吸出覆盖293T/17细胞的培养基并用低-IgG293培养基替换，然后向细胞逐滴添加lipofectamine-DNA复合物，通过涡旋轻柔混合，并将细胞在37℃在7.5％CO2培养箱中温育5天，之后收获上清液。
8.5.1.9通过ELISA测量抗体表达
通过夹心ELISA测量抗体的表达。将MaxiSorpELISA板(NuncNalgeInternational,Rochester,NY)在4℃用100μl/孔的在0.2M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.4中的AffiniPure山羊抗人IgGFcγ链特异性多克隆抗体(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA)的1:1000稀释物过夜包被，用清洗缓冲液(含0.1％Tween20的PBS)清洗，并在室温用300μl/孔的在TBS中的SuperBlockBlockingBuffer(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)封闭1hr。在用清洗缓冲液清洗后，将上清液在ELISA缓冲液(含有1％BSA和0.1％Tween20的PBS)中适宜地稀释并对ELISA板施加100μl/孔。作为标准品，使用人源化的IgG1/κ抗体达克珠单抗(PDLBioPharma,Inc.)。在将板在室温温育1hr并用清洗缓冲液清洗后，使用100μl/孔的缀合HRP的山羊抗人kappa轻链特异性多克隆抗体(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL)的1:1000稀释物检测结合的抗体。在室温温育1hr并用清洗缓冲液清洗后，通过添加100μl/孔的ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)实施显色。在室温温育7min后，通过添加100μl/孔的2％草酸终止显色。使用VersaMax微板阅读器(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)读出在415nm处的吸光度。
8.5.1.10抗体的纯化
通过离心收获来自瞬时转染的培养物上清并无菌过滤。通过添加1/50体积的1M柠檬酸钠，pH7.0来调整过滤的上清液的pH。在1mlHiTrap蛋白AHP柱(GEHealthcareBio-SciencesCorporation,Piscataway,NJ)上运行上清液，该柱用20mM柠檬酸钠，150mMNaCl，pH7.0预平衡。将柱用相同的缓冲液清洗，并用20mM柠檬酸钠，pH3.5洗脱结合的抗体。在通过添加1/50体积的1.5M柠檬酸钠，pH6.5中和后，使用15mlAmiconUltra-15离心过滤装置(30,000道尔顿MWCO)(MilliporeCorporation,Bedford,MA)将合并的抗体级分浓缩至约0.5-1.0mg/ml。然后使用具有HTTuffryn膜的0.2μmAcrodisc注射器过滤器(PallCorporation,EastHills,NY)无菌过滤样品。通过UV光谱学通过测量280nm处的吸光度测定纯化的抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
在还原或非还原条件下在NuPAGENovex4-12％Bis-Tris凝胶(InvitrogenCorporation)上运行5μg的纯化抗体的样品并使用SimplyBlueSafeStain试剂盒(InvitrogenCorporation)按照制造商推荐进行染色。
通过在PBS中以1.5ml/min在使用7.8mmx30cmToso-HaasTSKG3000SWXL柱(TosoHaas,Montgomeryville,PA)的Beckman-CoulterHPLC(BeckmanCoulter,Inc.,Fullerton,CA)上进行凝胶过滤层析分析50μg的纯化抗体的样品。
8.5.1.11抗原结合ELISA
将MaxiSorpELISA板(NuncNalgeInternational)用100μl/孔的在DPBS(InvitrogenCorporation)中的50ng/ml重组人IL2-Rα(R&DSystems或PeproTech,Inc.,RockyHill,NJ)的溶液在4℃过夜包被，用清洗缓冲液(含0.1％Tween20的PBS)清洗，并在室温用200μl/孔的在TBS中的SuperBlockBlockingBuffer(PierceChemicalCompany)封闭30min。在用清洗缓冲液清洗后，一式两份地加入在100μl/孔的ELISA缓冲液(含％BSA和0.1％Tween20的PBS)中的测试抗体(开始于4μg/ml，并系列稀释3倍)。在室温温育板1hr并用清洗缓冲液清洗后，使用100μl/孔的在ELISA缓冲液中的缀合HRP的山羊抗人IgG(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.)的1:20,000稀释物来检测结合的抗体。在室温温育1hr并用清洗缓冲液清洗后，通过添加150μl/孔的TMB过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(KPL,Inc.)实施显色。在室温温育8min后，通过添加50μl/孔的2N硫酸终止显色。读出450nm处的吸光度。
8.5.1.12抗体变体的BIAcore分析
使用BIAcore2000和3000仪器(BIAcoreInternationalAB,Uppsala,Sweden)实施对达克珠单抗野生型(HYP和E.HAT)和突变体抗体针对人CD25(R&DSystems)和猕猴CD25-HA(PDLBioPharma,Inc.)的动力学测量。用山羊抗人Fcγ(GAHFc)试剂(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc)捕捉达克珠单抗抗体
在动力学实验之前，对该实验系列测定达克珠单抗的捕捉体积和浓度。选择80个共振单位(RU)的理论Rmax用于该动力学研究，其基于期望捕捉信号的公式RL＝Rmax/化学计量学*MW配体/MW分析物，其中化学计量学＝2,MW配 体＝150kDa,MW分析物＝22kDa。在本研究中使用对人CD25的预测的22kDaMW，其与用于之前通过BIAcore的研究的一致。该值接近27kDa的质谱测定。从Western印迹实验测定猕猴CD25的MW为32kDa。通过将50μl的每种抗体加载到注射环中并以5μl/min的缓慢流速注射5μl以1.5μg/mlDac的增量测定实现期望的RL所需的体积来测定捕捉体积。对于研究的达克珠单抗抗体使用0.76-0.96μg/ml的终浓度和5μl/min的流速以及5μl的注射体积。
对于动力学测量，将GAHFc直接固定化于传感器芯片表面上以捕捉个别流动池上的达克珠单抗抗体，接着注射人或猕猴CD25来观察其与缓冲液流中的达克珠单抗的相互作用。对于此捕捉办法，将30μg/ml的GAHFc固定化以实现研究级CM5传感器芯片上每个流动池上的高应答单位(20,000RU)，其使用BIAcore胺偶联试剂(N-乙基-N'-二甲基氨基-丙基碳二亚胺，EDC；N-羟基琥珀酰亚胺，NHS；和乙醇胺HCl，pH8.5)。使用上文提到的说明捕捉达克珠单抗抗体。以30μl/min的流速在室温(25℃受控内部温度)运行结合测定法来研究达克珠单抗与CD25的结合。CD25的3min结合期之后是HBS-P运行缓冲液(10mMHEPES,150mM氯化钠，0.005％P-20表面活性剂，pH7.4)的15min注射以监测每个结合循环的解离，每个循环具有不同的CD25浓度。在每个循环结束时使用20mMHCl以100μl/min流速将表面再生。每种CD25和达克珠单抗抗体对的结合动力学使用BIAevaluate程序从对传感图数据的全局分析计算，该数据从8种不同的CD25浓度(128,64,32,16,8,4,2，和1nM)收集。在每次分析中应用双参照以消除来自参照表面和仅缓冲液对照(0nM)的背景应答。获得源自每种分析物(人或猕猴CD25)对每种达克珠单抗抗体的结合(ka)和解离(kd)的亲和力(KD)，其通过使用来自BIAevaluate软件的1:1Langmuir模型同时拟合来自分析物浓度系列的传感图的结合和解离期。每组实验实施3次以评估数据的标准偏差。
8.5.1.13Fab片段的制备
在293T/17细胞中瞬时表达亲本抗体E.HAT和4种变体蛋白。使用Lipofectamine(Invitrogen)按照制造商的指导用抗体构建体转染293T/17细胞。在第7天收获上清液，并通过蛋白A柱亲和力纯化抗体。将纯化的抗体用固定化的木瓜蛋白酶(Pierce)按照制造商的指导处理。通过HPLC评估蛋白水解直至完成，此时通过蛋白A柱亲和力分离消化的蛋白以除去Fc片段。通过SDS-PAGE电泳，接着是抗人Fc(gamma链特异；JacksonImmunoresearch)western印迹评估Fab制备物的纯度。在使用前，将Fab制备物在95℃热灭活15分钟。由于Fab蛋白的显著抗增殖活性，这是必要的。
8.5.1.14Fab蛋白增殖测定法
将细胞培养基中的人PBMC以2x105每孔分配到平底96孔板中。添加无内毒素的热灭活Fab蛋白并将培养物在37℃温育5天。在第5天，向每个孔添加0.25uCi的含氚的胸苷(GEHealthcare)。20-24小时后使用PackardCellHarvester收获培养物。使用WallacTriLux系统(Uppsala,Finland)实施闪烁计数。将每个供体的数据转化为刺激指数并汇编。
8.5.2结果
8.5.2.1鉴定达克珠单抗VH区中的CD4+T细胞表位
通过分析百分比应答来鉴定CD4+T细胞表位肽。对于测试的所有肽计算平均百分比应答和标准偏差，描述达克珠单抗重链和轻链。大于或等于平均背景应答加3个标准偏差的应答率被视为潜在的CD4+T细胞表位。对于达克珠单抗轻链V区，测试32种肽(表9)，其产生2.12±1.39％的平均背景百分比应答(图5)。背景之上3个标准偏差测定为6.3％。在达克珠单抗轻链肽数据集中没有肽展现该应答水平。对于达克珠单抗重链V区，测试36种肽(表9，右栏和图6)。平均背景百分比应答为1.83±2.12％。背景之上3个标准偏差测定为8.18％。达克珠单抗重链数据集内的1种肽PH17实现10.3％的百分比应答。紧邻于该肽的肽PH16达到7.8％的百分比应答。对于数据集中的所有肽计算平均刺激指数。重链肽PH17具有1.66±0.18s.e.m的平均刺激指数值。重链肽PH16具有1.55±0.11s.e.m.的平均刺激指数。这两个值均显著高于两个数据集中所有肽的平均刺激指数(对于所有68种重链和轻链肽为1.02±0.02)。由于临近的肽(PH16)与表位肽(PH17)共享12个氨基酸，将两种肽都选择用于进一步研究。
对于数据集中的所有供体测定HLAII类类型。在任何相对富集的存在上检查对肽PH16和PH17的应答者的HLAII类类型。发现对肽PH16的增殖性应答与HLA-DQ6的存在有关(p<0.04)。HLA类型与对肽PH17的应答没有明显关联。
8.5.2.2鉴定降低的免疫原性的变体
表位肽区(重链肽PH16和PH17,见表9)位于框架2/CDR2接合处。注意已知对CD25特异性有贡献的残基，选择氨基酸序列变体。当用丙氨酸残基取代时已知影响达克珠单抗亲和力的任意CDR2残基不考虑进行修饰。选择3个残基I51,T54和Y56(Kabat编号)进行修饰。另外，选择框架2区内的位置48处的异亮氨酸进行修饰，因为其为框架区中在分子的初始人源化期间已被回复突变的取代。在位置I51处，用亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸取代。在位置T54处，用丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸取代。对于Y56，仅测试丙氨酸取代。在位置I48处，用缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸取代。这些修饰产生总共10种单氨基酸变体。还考虑选择的修饰的组合。重测试涵盖所有可能的单一和双重突变的肽集合在CD4+T细胞测定法中的功能活性(表11)。在一组78位团体供体(communitydonor)细胞衍生的测定法中，相比于由未经修饰的肽序列(盒序列)诱导的应答，4种肽序列变体在其诱导增值性应答的能力中显著降低。在78位供体变体肽数据集中将亲本肽PH17(表11中的“P”)测试两次。对亲本肽的百分比应答为23.1％和19.2％，刺激指数为2.25±0.21和2.03±0.21。通过双侧成对T检验分析，刺激指数值没有差异。显著降低增值性和百分比应答两者的4种修饰为I48M(表12),I48MI51L,I48MT54S和I48VT54S(表13和表14)。最优选的变体为I48MI51L，因为其在测试的任意变体中诱导最低的百分比应答，且没有“非应答者”供体(即对未经修饰的亲本肽不引发2.95或更大的增值性应答的供体)应答该经修饰的肽。
8.5.2.3变体抗体分子的CD25结合活性
将通过功能测试选择的序列修饰掺入达克珠单抗重链V区序列中。从瞬时转染的293T/17细胞的上清液纯化变体抗体蛋白和未经修饰的达克珠单抗蛋白(E.HAT)。为了创建可比的抗体批次，并行地转染293T/17细胞并从上清液纯化抗体。典型地，观察到约30-50μg/ml的表达水平。将纯化的抗体通过在非还原和还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征。在非还原条件下的SDS-PAGE分析指示纯化的抗体具有约150-160kDa的分子量，而在还原条件下的分析指示纯化的抗体由具有约50kDa分子量的重链和具有约25kDa分子量的轻链构成。凝胶过滤层析指示纯化的抗体为>97％单体IgG。
测试克珠单抗高产量过程(HYP)(PDLBioPharma,Inc.)的E.HAT蛋白、E.HAT变体和阳性对照批次在直接结合重组人CD25ELISA测定法中的结合效力。显示的数据代表使用不同批次的抗体实施的类似的分析。抗体的EC50值在3个分别的实验中计算，并对达克珠单抗HYP材料校准。对来自3个实验的效力值取平均值并显示于表15和表16中。值范围从I48M变体的低值94％(表16)至在使用另一批次的纯化抗体的第二轮测试中的同一I48M变体的高值136％(表15)。所有值(除I48M材料的测试以外)均落入达克珠单抗HYP材料规格的70-130％内，指示该测定法形式中的等同效力。
8.5.2.4变体抗体分子的亲和力测试
使用在BIAcore装置中的表面等离振子共振测定形式测试经修饰的抗体蛋白的结合亲和力。使用抗人重链抗体，将达克珠单抗HYP、E.HAT抗体和E.HAT变体抗体固定化于传感器芯片上。重组可溶性人CD25流过传感器芯片并检测质量(mass)中的变化。解译数据以得到测试的所有蛋白质的ka,kd和KD值。结合亲和力相对于达克珠单抗HYP结合亲和力校准。表17显示了所有10种单氨基酸突变体蛋白的相对亲和力值。在3个分开的实验中测量亲和力，相对于达克珠单抗HYP的值校准，并取平均值。抗体的相对KD值范围从对于变体I51A的80％至对于变体Y56A的250％。使用相同的方案对双重突变体蛋白分别实施亲和力测试。结合亲和力相对于达克珠单抗HYP的值校准。如表18中显示的，双重突变体蛋白的亲和力类似于未经修饰的亲本抗体。作为针对抗原特异性的保持和以实践进展为目的的最终测试，测试E.HAT变体抗体对猕猴CD25的结合。使用BIAcore测试结合亲和力并相对于达克珠单抗HYP校准。如表19中显示的，所有变体抗体对猕猴CD25的亲和力类似于未经修饰的亲本抗体。
8.5.2.5验证降低的免疫原性：Fab增殖测试
用E.HAT,48M,48M54S,48M51L，和48T54SFab片段在参数上测试总计31位供体。汇编数据并对所有供体取平均值(图7)。并非所有供体均用所有Fab测试；对48MFab的应答与对亲本E.HATFab的应答率无差异，因此在汇编16位供体后并未对其测试。另外，由于有限量的蛋白质，并非所有供体均在完整浓度范围内测试。
对48M54S,48M51L和48V54S的平均增殖性应答是可比的，且低于对E.HAT和48MFab片段的平均增殖性应答。在25μg/ml，对48V54S和48M54S的增殖性应答显著低于对E.HAT的应答(双侧非参数性t检验，p<0.01)。对48M51L的增殖性应答为p＝0.06。
重分析数据以说明测试的供体中的应答率。在25μg/ml剂量，将大于SI＝1.99的任意增殖性应答汇编为阳性应答。图8在x轴上展示了应答率，在y轴上为对每种Fab蛋白的相应的平均刺激指数。该分析揭示了更少的供体样品对双重修饰的Fab蛋白引发增殖性应答，且总体应答率更低。最后，分析对每种Fab蛋白的应答者的平均增殖性应答的幅度且显示于图9。该数据排除了来自增殖性应答低于1.99的所有供体的刺激指数。对E.HAT和48MFab的应答分别为4.0和4.09。双重突变体诱导更少的应答且对于48M54S和48V54S变体，平均增殖性应答更低。对48M51L的平均增殖性应答高于对照，但这是由于具有非常高SI(SI＝10)的个体供体。对48M54S的增殖性应答与E.HAT有显著差异(在双侧不等方差T检验中p<0.02)而对48V54S的增殖性应答没有显著差异(p＝0.06)。结论是，突变体蛋白48M54S和48V54S比亲本蛋白E.HAT诱导更少、更弱的增殖性应答。
最后，测试作为单点突变的T54S变体且数据显示于图10。该结果显示I48M和T54S的组合产生最低的总体体外免疫原性应答。
9.具体实施方案、参考文献的引用
本申请中引用的所有公开出版物、专利、专利申请和其他文件通过提述完整并入本文用于所有目的，其程度如同每个公开出版物、专利、专利申请或其他文件单独指示为通过提述引入用于所有目的的。
尽管已例示和描述了多个具体的实施方案，但应领会可进行多种改变而不背离本发明的精神和范围。

Claims (97)

1.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多至8，多至7，多至6，多至5，多至4，多至3或多至2个氨基酸取代的CDR；和
(c)在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR的相应抗体的IC50的多至50％。
2.权利要求1的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR的相应抗体的IC50的多至40％。
3.权利要求2的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR的相应抗体的IC50的多至30％。
4.权利要求1至3中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含：相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V和(ii)T54R，T54S或T54K，和任选地包含以下一个或多个：(iii)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的S53R，S53K或S53N，(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E58Q，(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E73K，(vii)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(viii)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E。
5.权利要求1至3中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V，(ii)S53K，S53R或S53N和(iii)T54R，T54S或T54K，(iv)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K和(v)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E，和任选地，进一步包含以下氨基酸取代(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R。
6.权利要求1至3中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，(ii)S53R或S53K，(iii)T54S或T54K，和(iv)Y56R，(v)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K和(vi)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
7.权利要求1至3中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代N52K和T54R。
8.权利要求7的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中进一步包含氨基酸取代N53E。
9.权利要求1至3中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代N52S，S53R和T54K和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53E。
10.权利要求1至9中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含相比于SEQIDNO:3(FR-H1)，SEQIDNO:5(FR-H2)，SEQIDNO:7(FR-H3)，SEQIDNO:9(FR-H4)，SEQIDNO:10(FR-L1)，SEQIDNO:12(FR-L2)，SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代的框架区。
11.权利要求1至10中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。
12.权利要求10或11的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:5的FR-H2包含FR-H2中的氨基酸取代I48M。
13.权利要求10或11的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:5的FR-H2不包含FR-H2中I48处的取代。
14.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代的重链和轻链可变区；和
(c)在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体的IC50的多达50％。
15.权利要求14的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体的IC50的多达40％。
16.权利要求15的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在IL2依赖性T细胞增殖测定法中具有的IC50为具有分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体的IC50的多达30％。
17.权利要求14至16中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于包含分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的相应抗体具有降低的免疫原性。
18.权利要求17的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:5的FR-H2在FR-H2中包含氨基酸取代I48M。
19.权利要求18的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其进一步包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代N52K和T54R，和相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，以及相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
20.权利要求18的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其进一步包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代N52K和T54R，和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53E。
21.权利要求18的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中进一步包含氨基酸取代N52S，S53R和T54K。
22.权利要求17的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中包含氨基酸取代T54S。
23.权利要求18的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中进一步包含氨基酸取代T54S。
24.权利要求23的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其进一步包含相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的氨基酸取代S29K，和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
25.权利要求23的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中进一步包含氨基酸取代N53E。
26.权利要求23的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中进一步包含氨基酸取代S53R和T54K。
27.权利要求26的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其进一步包含相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的氨基酸取代S29K，和相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
28.权利要求26的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中进一步包含氨基酸取代N53E。
29.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多达8，多达7，多达6，多达5，多达4，多达3或多达2个氨基酸取代的CDR；和
(c)包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V和(ii)T54R，T54S或T54K，且任选地包含以下一个或多个：(iii)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的S53R，S53K或S53N，(iv)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R，(v)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E58Q，(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的E73K，(vii)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(viii)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E。
30.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多达8，多达7，多达6，多达5，多达4，多达3或多达2个氨基酸取代的CDR；和
(c)包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，N52K，N52R或N52V，(ii)S53K，S53R或S53N，和(iii)T54R，T54S或T54K，(iv)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(v)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D或N53E，和任选地进一步包含氨基酸取代(vi)相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的Y56R。
31.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多达8，多达7，多达6，多达5，多达4，多达3或多达2个氨基酸取代的CDR；和
(c)包含相比于SEQIDNO:6的CDR-H2在CDR-H2中的氨基酸取代(i)N52S，(ii)S53R或S53K，(iii)T54S或T54K，和(iv)Y56R，(v)相比于SEQIDNO:11的CDR-L1在CDR-L1中的S29K，和(vi)相比于SEQIDNO:13的CDR-L2在CDR-L2中的N53D。
32.权利要求29至31中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含相比于SEQIDNO:3(FR-H1)，SEQIDNO:5(FR-H2)，SEQIDNO:7(FR-H3)，SEQIDNO:9(FR-H4)，SEQIDNO:10(FR-L1)，SEQIDNO:12(FR-L2)，SEQIDNO:14(FR-L3)和SEQIDNO:16(FR-L4)的框架具有多达4个氨基酸取代的框架区。
33.权利要求32的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区的抗CD25抗体或抗CD25结合片段具有降低的T细胞免疫原性。
34.权利要求32或33的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:5的FR-H2包含FR-H2中的氨基酸取代I48M。
35.权利要求32或33的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其相比于SEQIDNO:5的FR-H2不包含FR-H2中I48处的取代。
36.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR具有多达8，多达7，多达6，多达5，多达4，多达3或多达2个氨基酸取代的CDR；和
(c)相比于具有SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR的抗体，具有以下：
(i)重链CDR，其包含存在于如表20中所示的CDR变体H1-H354的任一个中的至少一个取代；和/或
(ii)轻链CDR，其包含存在于如表21中所示的CDR变体L1-L288和L649的任一个中的至少一个取代。
37.权利要求36的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于具有SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR的抗体，其具有包含存在于如表20中所示的以下任一个CDR变体中的至少两个取代的重链CDR：H361-H369，H405-H443，H449-H487；H493-H531；H537-H572；H578-H613；H619-H654；H660-H690；H696-H726；H732-H762；H768-H798；H804-H834；H840-H865；H871-H896；H902-H927；H933-H958；H964-H989；H995-H1015；H1021-H1041；H107-H1067；H1073-H1093；H1099-H1119；H1125-H1141；H1147-H1163；H1169-H1185；H1191-H1207；H1213-H1226；H1232-H1245；H1251-H1264；H1270-H1280；H1286-H1296；H1302-H1312；H1316-H1327；H1333-H1341；H1347-H1351；H1357-H1361；H1367-H1371；H1377-H1381；H1387-H1391；H1425-H1476；H1478-H1517；和H1519-H1558。
38.权利要求36或37的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于具有SEQIDNO:4(CDR-H1)，SEQIDNO:6(CDR-H2)，SEQIDNO:8(CDR-H3)，SEQIDNO:11(CDR-L1)，SEQIDNO:13(CDR-L2)和SEQIDNO:15(CDR-L3)的CDR的抗体，其具有包含存在于如表21中所示的CDR变体L289-L648和L650-L679的任一个中的至少两个取代的轻链CDR。
39.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I48M。
40.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I48V。
41.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I51L。
42.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代T54S。
43.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I48M和I51L。
44.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I48V和T54S。
45.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，且其相比于SEQIDNO:1的重链可变区包含重链取代I48M和T54S。
46.权利要求36至38中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:1的重链可变区，其重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代。
47.权利要求36至46中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，相比于SEQIDNO:2的轻链可变区，其轻链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代。
48.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)具有重链可变区，其相比于SEQIDNO:1的重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代，所述重链相比于SEQIDNO:1的重链包含选自以下的至少一个取代或取代的组合：
(i)I48M；
(ii)I48V；
(iii)I51L；
(iv)T54S；
(v)I48M和I51L；
(vi)I48V和T54S；和
(vii)I48M和T54S；
(c)具有轻链可变区，其相比于SEQIDNO:2的重链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个基酸取代。
49.一种单克隆抗CD25抗体或单克隆抗体的抗CD25结合片段，其：
(a)结合人CD25；
(b)包含相比于分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区具有多达12，多达11，多达10，多达9，多达8，多达7，多达6，多达5或多达4个氨基酸取代的重链和轻链可变区；和
(c)包含存在于如表7A-7C中所示的组合变体C1-C19，C21和C24-C63的任一个中的氨基酸取代。
50.权利要求1至49中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含来自表8A的至少一个轻链CDR取代和/或来自表8B的至少一个重链CDR取代。
51.权利要求50的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中来自表8A的至少一个轻链CDR取代包括以下一个或多个：
(a)CDR-L1中的S24V；
(b)CDR-L1中的A25I，A25T或A25M；
(c)CDR-L1中的S26L；
(d)CDR-L1中的S27K，S27R，S27A，或S27N；
(e)CDR-L1中的S29A，S29K或S29R；
(f)CDR-L1中的M33G；
(g)CDR-L2中的T50A；
(h)CDR-L2中的S52A，S52V，S52D，S52E或S52M；
(i)CDR-L2中的N53A，N53D，N53E，N53F或N53Y；
(j)CDR-L2中的L54H；
(k)CDR-L2中的S56A；
(l)CDR-L3中的T93Q，T93R，T93M；和
(m)CDR-L3中的T97S。
52.权利要求50或51的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中来自表8B的至少一个重链CDR取代包括以下一个或多个：
(a)CDR-H1中的S31F，S31K，S31R或S31W；
(b)CDR-H1中的Y32S，Y32T或Y32V；
(c)CDR-H1中的M34A，M34T或M34V；
(d)CDR-H2中的I51W，I51L，I51A，I51K或I51V；
(e)CDR-H2中的N52A，N52K，N52R，N52S或N52V；
(f)CDR-H2中的S53K，S53T，S53P或S53A；
(g)CDR-H2中的T54A，T54K，T54S或T54V；
(h)CDR-H2中的Y56K，Y56R或Y56A；
(i)CDR-H2中的T57A，T57D或T57G；
(j)CDR-H2中的Y59E；
(k)F63S；
(l)CDR-H2中的K64A，K64D，K64V或K64G；
(m)CDR-H3中的D101G；和/或
(n)CDR-H3中的Y102D，Y102K，Y102Q或Y102T。
53.权利要求1至52中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其包含其中野生型非组氨酸残基被组氨酸取代的来自表8A的至少一个轻链CDR取代和/或来自表8B的至少一个重链CDR取代。
54.权利要求1至53中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其重链和轻链可变区相比于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的重链和轻链可变区总共包含至少2，至少3，至少4或至少5个氨基酸取代。
55.权利要求1至50中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其6个CDR相比于SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR序列总共具有多达8，多达7，多达6，多达5，或多达4个氨基酸取代。
56.权利要求50的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的CDR相比于具有SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR的抗体的相应CDR序列具有不超过3个氨基酸取代。
57.权利要求50或56的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中除CDR-H2以外的任一个个别的CDR相比于具有SEQIDNO:4，6，8，11，13，和15的CDR的抗体的相应CDR序列具有不超过2个氨基酸取代。
58.权利要求1至57中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的框架区相比于具有SEQIDNO:3，5，7，9，10，12，14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过5个氨基酸取代。
59.权利要求1至58中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的框架区相比于具有SEQIDNO:3，5，7，9，10，12，14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过4个氨基酸取代。
60.权利要求1至59中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的框架区相比于具有SEQIDNO:3，5，7，9，10，12，14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过3个氨基酸取代。
61.权利要求1至60中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的框架区相比于具有SEQIDNO:3，5，7，9，10，12，14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过2个氨基酸取代。
62.权利要求1至61中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其中任一个个别的框架区相比于具有SEQIDNO:3，5，7，9，10，12，14和16的框架序列的抗体的相应框架序列具有不超过1个氨基酸取代。
63.权利要求1至62中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其VH序列不由如表22-1至22-3中所示的变体XH1至XH16中的任一个的VH序列组成。
64.权利要求1至63中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其Vl序列不由如表22-4至22-8中所示的变体XL1至XL25中的任一个的VL序列组成。
65.权利要求1至62中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其VH和VL序列不由如表22-9中所示的抗体XF1至XF15的VH和VL序列组成。
66.权利要求1至65中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其分别为人或人源化抗体、或人或人源化抗体的抗CD25结合片段。
67.权利要求1至66中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为IgG。
68.权利要求67的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为IgG1。
69.权利要求68的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为同种型IgG1fa。
70.权利要求68的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其不是同种型IgG1fa。
71.权利要求67的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为IgG2。
72.权利要求71的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为IgG2M3。
73.权利要求67的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为IgG4。
74.权利要求68至73中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其Fc域包含取代M428L。
75.权利要求74的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其Fc域还包含取代T250Q。
76.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在Fc区中包含增加ADCC活性的一个或多个突变。
77.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在Fc区中包含降低ADCC活性的一个或多个突变。
78.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其是非岩藻糖基化的。
79.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在Fc区中包含增加对FcγR结合的一个或多个突变。
80.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在Fc区中包含降低对FcγR结合的一个或多个突变。
81.权利要求1至75中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其在Fc区中包含增加对FcRn结合的一个或多个突变。
82.权利要求1至81中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其对CD25的亲和力比具有对应于SEQIDNO:1的VH序列和对应于SEQIDNO:2的VL序列的相应抗体对CD25的亲和力大至少1.2倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍或至少5倍(atleast1.2-fold,atleast1.5fold,atleast2-fold,atleast3-fold,atleast4-foldoratleast5-foldgreaterthan)。
83.权利要求1至82中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其对CD25的亲和力比具有对应于SEQIDNO:1的VH序列和对应于SEQIDNO:2的VL序列的相应抗体对CD25的亲和力大多达10倍，多达15倍，多达20倍或多达30倍(upto10-fold,upto15-fold,upto20-foldorupto30-foldgreaterthan)。
84.权利要求1至83中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其对CD25的亲和力比具有对应于SEQIDNO:1的VH序列和对应于SEQIDNO:2的VL序列的相应抗体对CD25的亲和力大3至15倍，5至10倍，或2至30倍(3-to15-fold,5-to10-fold,or2-to30-foldgreaterthan)。
85.权利要求1至84中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其为纯化的。
86.权利要求85的抗CD25抗体或抗CD25结合片段，其纯化至至少85％，至少90％，至少95％或至少98％同质性。
87.包含根据权利要求1至84中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段的抗体-药物缀合物。
88.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至84中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段或根据权利要求87的抗体-药物缀合物。
89.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至84中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段的核苷酸序列。
90.包含权利要求89的核酸的载体。
91.一种用根据权利要求90的载体转化的原核宿主细胞。
92.一种用根据权利要求90的载体转化的真核宿主细胞。
93.一种工程化为表达权利要求89的核苷酸序列的真核宿主细胞。
94.权利要求93的真核宿主细胞，其为哺乳动物宿主细胞。
95.一种产生抗CD25抗体或抗CD25结合片段的方法，包括：
(a)培养权利要求93或权利要求94的真核宿主细胞；和
(b)回收所述抗CD25抗体或抗CD25结合片段抗体。
96.一种预防器官移植排斥的方法，包括对有此需要的人施用治疗有效量的根据权利要求1至86中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段、根据权利要求87的抗体-药物缀合物、或根据权利要求88的药物组合物。
97.一种治疗哮喘、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症或人T细胞白血病病毒1有关的T细胞白血病的方法，包括对有此需要的人施用治疗有效量的根据权利要求1至86中任一项的抗CD25抗体或抗CD25结合片段、根据权利要求87的抗体-药物缀合物、或根据权利要求88的药物组合物。
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