CN101544695A - 人源化抗cd25单链抗体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于人源化抗CD25单克隆抗体daclizumab构建的单链抗体，本发明还提供了编码所述单链抗体的核苷酸分子以及制备所述单链抗体的方法。本发明所提供的制备方法可获得易于大量生产和纯化的可溶性活性蛋白。

Description

人源化抗CD25单链抗体及制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体，尤其涉及一种单链抗体。

本发明还涉及表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞。

本发明还涉及该单链抗体的制备方法。

背景技术

CD25是IL-2受体的α亚基，在静息T细胞上不表达或只有很低水平的表达，在活化后的T细胞上高表达，成为活化T细胞的标志之一，因此又称作Tac抗原(T细胞活化抗原)[Robb RJ，Kutny RM.Structure-function relationships for theIL-2 receptor system.J Immunol 1987；139：855-62]。抗CD25抗体可以通过封闭CD25，阻断IL-2的信号传递，抑制T细胞活化，例如抗CD25单抗anti-Tac可显著降低移植排斥发生率[Kirkman RL，Saqiro ME.Carpcer CB.Transplantation.1991；51：107～13]。此外，CD25在一些恶性血液疾病细胞上组成型高表达，包括皮肤T淋巴细胞瘤、毛细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、成人T细胞性白血病等。在许多自身免疫性疾病中，CD25在T细胞上也过量表达。因此，抗CD25抗体及免疫毒素对这些肿瘤及自身免疫性疾病也可能提供有效治疗[Waldmann TA.Daclizumab(anti-Tac，Zenapax)in the treatment ofleukemia/lymphoma.Oncogene.2007，26，3699-3703]。

最早用于制备单抗的方法为杂交瘤法，所获抗体为鼠源性，但临床研究发现其鼠源性会诱导产生中和抗体(人抗鼠抗体，HAMA)[LoBuglio AF，WheelerRH，Trang J，Haynes A，Rogers K，Harvey EB，et al.Mouse/human chimericmonoclonal antibodies in man：kinetics and immune response.Proc Natl Acad SciUSA 1989；86：4220-4.]。为克服这一缺点，人们对anti-Tac进行了人源化改造。1997年，美国罗氏公司生产的人源化抗CD25单克隆抗体daclizumab成为第一个被FDA批准上市的人源化抗体，用于防治移植排斥[Tsurushita N，Hinton PR，Kumar S.Design of humanized antibodies From anti-Tac to Zenapax.Methods.2005；36：69-83]。

Daclizumab由90％的人源抗体序列和10％的鼠源抗体序列构成，人源序列源自人IgG1恒定区和Eu骨髓瘤抗体的可变框架区，鼠源序列源自鼠抗-Tac抗体的互补决定区，从DNA序列估计其分子量为144kDa。人源化改造后的抗体具备了以下优点：引起HAMA的几率低，在血浆中的半衰期由鼠源抗体的40小时延长到20天，而且通过其人源的Fc段可介导抗体依赖的细胞毒(ADCC)反应[Morris JC，Waldmann TA.Advances in interleukin 2 receptor targetedtreatment.Ann Rheum Dis.2000，59(suppl I)：i109-i114]。

单链抗体(single chain fragment variable antibody，scFv)是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)通过一段连接短肽(linker)首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。

在国内外研究中，已有基于鼠源性抗CD25单抗的scFv构建和生产报道，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍可能会有HAMA产生。目前，尚没有相关文献涉及用人源化抗CD25抗体daclizumab构建的scFv。

另外，单链抗体的表达可使用多种表达系统。其中大肠杆菌表达系统最常用，其表达抗体的产量高，但表达产物多为没有活性的不可溶的包涵体状态，因此在后续的工艺中需要进行复性，导致制备的单链抗体收率低，成本高。近年来发展建立的毕赤酵母表达系统得到了日益广泛的应用，其主要优点为：1)表达产物多为可溶性活性蛋白；2)易于高密度发酵；3)具有甲醇严格调控的强启动子；4)能分泌表达，利于纯化。然而，毕赤酵母表达系统不一定适合所有蛋白质表达，而且有的蛋白虽然表达成功但产量很低或者没有活性[Hackel BJ，Huang D，Bubolz JC，Wang XX，Shusta EV.Production of solubleand active transfer rinreceptor-targeting single-chain antibody usingSaccharomyces cerevisiae.Pharm Res.2006 Apr；23(4)：790-7.]。

发明内容

本发明提供了一种人源化抗CD25单链抗体Dmab(scFv)，所述的单链抗体是基于人源化抗CD25抗体daclizumab构建的单链抗体，其至少具有轻链可变区、重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，其中所述的轻链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述的重链可变区具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，所述的中间连接肽为(GGGGS)_3-5。

上述单链抗体具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码上述单链抗体的核苷酸分子，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步设计酶切位点和识别序列，一个优选的含有酶切位点和6His-Tag序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种含有编码上述单链抗体的核苷酸分子的表达载体。所述的表达载体为酵母表达载体。

本发明还提供了一种制备上述人源化抗CD25单链抗体的方法，所述方法包括：

1)构建基于daclizumab的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，如SEQID No.3所示；

2)将所述核苷酸序列可操作地插入毕赤酵母pPIC9K，构建毕赤酵母表达载体，表达载体结构如图2所示；

3)将步骤2)所述的毕赤酵母载体转化入毕赤酵母菌株；

4)在适宜条件下培养步骤3)所得的转化毕赤酵母菌株，诱导单链抗体的表达；

5)分离纯化步骤4)所得培养产物即可获得所述人源化抗CD25单链抗体。

本发明成功地构建了基于Daclizumab单抗的单链抗体，并在酵母表达系统成功表达。采用毕赤酵母分泌表达上述人源化抗CD25单链抗体，与大肠杆菌表达载体相比较，其可获得易于大量生产和纯化的可溶性活性蛋白。

附图说明

图1是实施例1的人工合成的Dmab(scFv)核苷酸及其氨基酸序列；

图2是pPIC9K-Dmab(scFv)重组载体的结构图；

图3是基因拷贝数对Dmab(scFv)表达量影响的SDS-PAGE分析图；

图中分析的蛋白来自转化子诱导后的培养上清，其中：lane 1、含空载体pPIC9K的转化子；lane 2-8、含pPIC9K-Dmab(scFv)的转化子，G418抗性浓度分别为0.25mg/ml(lane 2，3)、0.5mg/ml(lane 4，5)、1.0mg/ml(lane 6，7)、2.0mg/ml(lane 8)；M、蛋白marker；

图4是诱导培养基pH对scFv表达量影响的SDS-PAGE分析图和对酵母生长状况影响的活细胞数量分析图；

图5是诱导物甲醇浓度对scFv表达量影响的SDS-PAGE分析图和对酵母生长状况的影响的活细胞数量分析图；

图6是诱导起始浓度对scFv表达量影响的SDS-PAGE分析图和对酵母生长状况的影响的活细胞数量分析图；

图7是诱导时间对scFv表达量影响的SDS-PAGE分析图和对酵母生长状况的影响的活细胞数量分析图；

图8是Dmab(scFv)纯化的SDS-PAGE和Western印迹分析图；

图中：M、蛋白marker；lane 1，3、纯化前的诱导培养上清中总蛋白；lane2，4、经Ni-agarose亲和层析纯化后蛋白；

图9是Dmab(scFv)对CD25阳性和阴性的人肿瘤细胞株结合能力比较；

图10是Dmab(scFv)对活化和未活化人淋巴细胞结合能力比较；

图11是Dmab(scFv)对活化和未活化大鼠淋巴细胞结合能力比较。

具体实施方式

【实施例1】人源化抗CD25单链抗体Dmab(scFv)的获得

1.基因的设计和合成

Dmab(scFv)的基因是基于daclizumab的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)氨基酸序列(Naoya Tsurushita，Paul R.Hinton，Shankar Kumar Design ofhumanized antibodies：From anti-Tac to Zenapax.Methods，2005，36：69-83)，以V_H-(Gly₄Ser)₃-V_L的模式设计的。6His-Tag被引入合成基因的3’端以便检测和纯化。同时，为便于克隆到酵母表达载体，合成时在5’和3’端分别加上EcoRI和NotI酶切位点。设计的Dmab(scFv)核苷酸及其氨基酸序列如图1所示，由invitrogen公司进行基因全合成。

2.酵母表达质粒的构建

按照常规分子克隆方法，用EcoRI和NotI酶切合成的Dmab(scFv)基因，经胶回收后，连接到经同样酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K(invitrogen公司)，产生pPIC9K-Dmab(scFv)重组子(图2)。

3.酵母转化和转化子筛选

按照invitrogen公司pPIC9K操作手册所述方法，将5-20μg的pPIC9K-Dmab(scFv)用SacI线性化，通过电转化法(Bio-Rad Gene Pulser：1.5kV，200Ω，25μF)使其转入毕赤酵母菌株GS115(invitrogen公司)感受态中，以表达Dmab(scFv)蛋白。将转化产物涂布在组氨酸缺乏的MD平板上，培养48h后可获得His⁺转化子。由于插入基因拷贝数和G418抗性基本呈正相关，而且多拷贝可能提高目的蛋白表达水平[the manual of Pichia Expression Kit，invitrogen公司]，因此通过不同G418浓度平板：0.25，0.5，1，2mg/ml，在His⁺转化子中筛选出多拷贝转化子。

4.小量表达和表达优化

为比较不同G418抗性水平转化子表达量的差异，我们用小量表达获取表达产物分析。挑取单克隆，接种于100ml BMGY培养基，在250ml三角瓶中以280rpm转速于28℃培养，直到OD600＝2。为诱导目标蛋白的表达，3000g离心5min收集酵母细胞，以10ml BMMY培养基重悬，转到100ml三角瓶中，280rpm于28℃培养96h，每24h加甲醇至终浓度0.5％。诱导完成后，4℃20kg离心10min，收集培养上清。SDS-PAGE分析结果如图3所示，不同G418抗性浓度转化子经甲醇诱导后，均在目标蛋白预期分子量处获得了较高水平表达，表达量约占培养基上清蛋白的50％(通过Quantity One软件分析)，相互间没有显著差异。

为进一步提高目标蛋白表达量，我们选取最高G418抗性浓度的转化子，检测了诱导培养基pH(pH5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)，诱导物(甲醇)浓度(0.1，0.5，1.0，3.0，5.0％)，诱导起始浓度(OD₆₀₀＝1，10，20，40，60，80，100)，诱导时间(24，48，72，96，120，144h)对酵母细胞生长和蛋白表达的影响，优化最佳诱导条件。SDS-PAGE分析结果如图4-7所示。结果显示，在诱导96h，3.0％甲醇浓度，pH6.0，诱导起始浓度为OD₆₀₀＝60时，最利于酵母细胞生长，其获得的蛋白表达量也最大。

5.大量表达和纯化

为获取后续功能分析的表达产物，我们用以上获得的最佳诱导条件大量表达。挑取单克隆，接种于25ml BMGY培养基，在250ml三角瓶中以280rpm转速于28℃培养24h，然后全部转入1L BMGY，用3L三角瓶以280rpm转速于28℃培养24h。3000g离心5min收集酵母细胞，以BMMY培养基(pH6.0，3％甲醇)重悬，调整诱导起始浓度为OD₆₀₀＝60，诱导物在十倍体积三角瓶中以280rpm转速于28℃培养96h，每24小时加甲醇至终浓度3％。

诱导完成后，4℃20kg离心10min，收集培养上清，对结合缓冲液(50mMTris-HCl，0.5mol/L NaCl，10mmol/L Imidazole，pH8.0)透析。透析后，4℃20kg离心10min，除去可能沉淀的无活性蛋白，上清加到结合缓冲液平衡后的5mlNi-NTA柱(QIAGEN)。然后用10倍柱体积结合缓冲液清洗去除非特异性结合的蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，0.3mol/LImidazole，pH8.0)洗脱并收集洗脱峰。洗脱产物用SDS-PAGE和western分析，结果如图8，可见经纯化后，蛋白纯度达到90％以上。用抗6His-Tag抗体进行的western分析结果表明，纯化的蛋白确为带6His-Tag的目标蛋白。

将纯化的目标蛋白，对PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM KH₂PO₄，8mM Na₂HPO₄，pH7.4)透析过夜。透析后，4℃20kg离心10min，除去可能沉淀的无活性蛋白，上清用DC Protein Assay Kit(Bio-Rad)，以BSA作为标准，测定蛋白浓度。

【实施例2】人源化抗CD25单链抗体Dmab(scFv)结合功能检测

1.蛋白的FITC标记

为鉴定生产的Dmab(scFv)结合活性，我们先用FITC标记纯化蛋白。参照Pierce公司EZ-Label^TM FITC Protein Labeling Kit的方法，将溶于PBS的目标蛋白用1M Na₂CO₃调节pH至8.5，然后加入10mg/ml FITC(溶于二甲基甲酰胺)，使蛋白和FITC摩尔比为1:24。混匀后，于室温避光孵育1h。对PBS透析去除多余的FITC后，4℃20kg离心10min，除去可能沉淀的无活性蛋白，上清即为标记好的Dmab(scFv)-FITC。

2.结合能力和特异性分析

对Dmab(scFv)对CD25抗原的结合能力及特异性，我们使用CD25阳性和阴性细胞株或表达水平不同的细胞进行分析。

2.1对CD25阳性人肿瘤细胞株的特异性结合

据报道，SNT-8是CD25阳性的人T细胞淋巴瘤细胞株。Raji是一种人Burkitt′s淋巴瘤细胞株。

细胞收集后用PBS洗两次，重悬至终浓度为1×10⁷/ml，每管100μl分装，与下列抗体4℃避光孵育30min：人IgG1-FITC同型对照(按说明书推荐一次使用量0.7μg)(Beckman Coulter)，人CD25单克隆抗体-FITC(按说明书推荐一次使用量62.5ng)(Beckman Coulter)，Dmab(scFv)-FITC(1μg)。用1mlPBS洗两次后，重悬于0.5ml PBS中，用流式细胞仪(Beckman Coulter)检测阳性细胞百分率。与Dmab(scFv)-FITC孵育的细胞还可用荧光显微镜观测scFv在细胞中的分布。

如图9所示，人CD25单克隆抗体与SNT-8结合后阳性率达95％以上，与Raji结合阳性率仅5％以下，证实了SNT-8为CD25阳性细胞而Raji为CD25阴性细胞。Dmab(scFv)与这两个细胞株结合也得到了相同结果，说明Dmab(scFv)可以特异地结合于SNT-8而不结合Raji。免疫荧光结果也显示，Dmab(scFv)不结合Raji，特异地结合于SNT-8细胞膜上。

2.2对活化人淋巴细胞的特异性结合

未活化的淋巴细胞膜上CD25表达量很低，活化后CD25表达量可明显提高。

取健康志愿者新鲜肝素抗凝外周血5ml。取少许按每管40μl分装，与下列抗体4℃避光孵育30min：人IgG1k-FITC同型对照(0.7μg)(BeckmanCoulter)，人CD25单克隆抗体-FITC(62.5ng)(Beckman Coulter)，Dmab(scFv)-FITC(1μg)。裂解红细胞后，用流式细胞仪(Beckman Coulter)检测的未经活化的淋巴细胞阳性细胞含量。剩余外周血用密度梯度离心法分离获得人外周单个核细胞(hPBMC)，与ConA共培养48h后收集细胞，用PBS洗两次，重悬至终浓度为1×10⁷/ml，每管100μl分装，与下列抗体4℃避光孵育30min：人IgG1k-FITC同型对照(0.7μg)(Beckman Coulter)，人CD25单克隆抗体-FITC(62.5ng)(Beckman Coulter)，Dmab(scFv)-FITC(1μg)。用1ml PBS洗两次后，重悬于0.5ml PBS中，用流式细胞仪(BeckmanCoulter)检测活化后淋巴细胞中阳性细胞百分率。

未活化和活化的PBMC还可与Dmab(scFv)-FITC孵育后用荧光显微镜观察，以检测scFv在细胞中的分布和特异性。

如图10所示，人CD25单克隆抗体与未活化的人淋巴细胞孵育后，阳性细胞率仅为3.4％，活化后阳性细胞率增加到约30％，证实了淋巴细胞活化对CD25表达的影响。对同样样本，Dmab(scFv)也仅和不到5％未活化人淋巴细胞结合，与活化细胞孵育后阳性率达到26.5％。免疫荧光结果显示，Dmab(scFv)可结合活化人淋巴细胞，几乎不结合未活化人淋巴细胞。

2.3对活化大鼠淋巴细胞的特异性结合

在一些体内模型中，例如器官移植模型，大鼠是很重要的模型动物。因此，有必要检测我们生产的Dmab(scFv)是否能与大鼠的CD25阳性细胞特异性结合。我们从大鼠脾脏中分离得到淋巴细胞作为测试对象。

活化前取部分细胞用PBS洗两次，重悬至终浓度为1×10⁷/ml，每管100μl分装，与下列抗体4℃避光孵育30min：人IgG1k-FITC同型对照(0.7μg)(Beckman Coulter)，Dmab(scFv)-FITC(1μg)。用1ml PBS洗两次后，重悬于0.5ml PBS中，用流式细胞仪(Beckman Coulter)检测阳性细胞百分率。与Dmab(scFv)-FITC孵育的细胞可用荧光显微镜观测scFv在细胞中的分布。还可裂解与scFv孵育的细胞，用western分析具有6His-Tag的scFv是否结合到大鼠细胞上。

与ConA共培养48h后的细胞按上述同样方法处理。

结果如图11所示，Dmab(scFv)与未活化大鼠淋巴细胞孵育阳性细胞率为9.2％，与活化细胞孵育后阳性率显著提高，达到63.4％。免疫荧光结果表明，Dmab(scFv)可结合活化大鼠淋巴细胞，几乎不结合未活化大鼠淋巴细胞。Western分析也显示了同样结果。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西医院

<120>人源化抗CD25单链抗体及制备方法

<130>08P103359

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>106

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(106)

<223>ScFv轻链可变区氨基酸序列

<400>1

<210>2

<211>116

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(116)

<223>ScFv重链可变区氨基酸序列

<400>2

<210>3

<211>746

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(746)

<223>ScFv核苷酸分子核苷酸序列

<400>3

<210>4

<211>711

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(711)

<223>ScFv核苷酸分子核苷酸序列

<400>4

<210>5

<211>237

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<400>5

Claims (10)

1、一种人源化抗CD25单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。

2、如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于其具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

3、编码权利要求1所述单链抗体的核苷酸分子。

4、如权利要求3所述的核苷酸分子，其特征在于其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

5、如权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点和6His-Tag序列，如SEQ ID No.3所示。

6、含有权利要求3、4或5所述的核苷酸分子的表达载体。

7、权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述载体为酵母表达载体。

8、权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述载体为毕赤酵母pPIC9K，表达载体具有如图2所示的结构。

9、由权利要求6所述的表达载体转化的宿主细胞。

10、一种制备权利要求1所述的人源化抗CD25单链抗体的方法，包括下述步骤：

1)构建基于daclizumab的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，如SEQID No.4所示；

2)将所述核苷酸序列可操作地插入毕赤酵母pPIC9K，构建毕赤酵母表达载体，表达载体结构如图2所示；

3)将步骤2)所述的毕赤酵母载体转化入毕赤酵母菌株；

4)在适宜条件下培养步骤3)所得的转化毕赤酵母菌株，诱导单链抗体的表达；

5)分离纯化步骤4)所得培养产物即获得所述人源化抗CD25单链抗体。

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