CN116685604A - 抗人msln的抗体及其用途 - Google Patents
抗人msln的抗体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116685604A CN116685604A CN202180082087.XA CN202180082087A CN116685604A CN 116685604 A CN116685604 A CN 116685604A CN 202180082087 A CN202180082087 A CN 202180082087A CN 116685604 A CN116685604 A CN 116685604A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- antigen
- nos
- binding fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 153
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 title claims 10
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 title claims 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 160
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 154
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 153
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 114
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 114
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 105
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 97
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 95
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 claims description 24
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims description 24
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 20
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 7
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 7
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005282 malignant pleural mesothelioma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 6
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000003437 pleural cancer Diseases 0.000 claims description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 claims description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 claims description 3
- FJHBVJOVLFPMQE-QFIPXVFZSA-N 7-Ethyl-10-Hydroxy-Camptothecin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CC)=C(CN3C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=C33)=O)C3=NC2=C1 FJHBVJOVLFPMQE-QFIPXVFZSA-N 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 claims description 3
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 claims description 3
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 claims description 3
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229960005501 duocarmycin Drugs 0.000 claims description 3
- VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N duocarmycin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=C2NC(C(=O)N3C4=CC(=O)C5=C([C@@]64C[C@@H]6C3)C=C(N5)C(=O)OC)=CC2=C1 VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N 0.000 claims description 3
- 229930184221 duocarmycin Natural products 0.000 claims description 3
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N mertansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCS)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- JFCFGYGEYRIEBE-YVLHJLIDSA-N wob38vs2ni Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCC(C)(C)S)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 JFCFGYGEYRIEBE-YVLHJLIDSA-N 0.000 claims description 3
- 101150075175 Asgr1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024151 Cadherin-16 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000229 Claudin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000762246 Homo sapiens Cadherin-16 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100334515 Homo sapiens FCGR3A gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 2
- 101001005719 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 210000003515 double negative t cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 2
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 abstract description 123
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 abstract description 123
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 59
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 54
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 40
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 14
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 10
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 229950001537 amatuximab Drugs 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101150064776 Msln gene Proteins 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 3
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 3
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 description 2
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 2-deoxypentose Chemical compound OCC(O)C(O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000912781 Carcharhinus galapagensis Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 102400001111 Nociceptin Human genes 0.000 description 1
- 108090000622 Nociceptin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003452 antibody preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- PULGYDLMFSFVBL-SMFNREODSA-N nociceptin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 PULGYDLMFSFVBL-SMFNREODSA-N 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000134 pericardial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003245 peritoneal mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 210000000414 pleural mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种MSLN(Mesothelin，间皮素)的单域抗体及其制备方法和应用。所述MSLN抗体与MSLN蛋白具有高度亲和力，因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。
Description
本公开要求于2020年12月9日提交中国专利局、申请号为202011424591.7、发明名称为“抗人MSLN的抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
本发明属于生物工程、生物医药领域，涉及人MSLN抗体，编码其的核酸，抗体制备方法，含有所述抗体的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。
间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种存在于正常间皮细胞上的分化抗原，可表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。在正常组织中表达有限，但MSLN被发现表达在90％的上皮样恶性胸膜间皮瘤细胞、69％的肺腺癌细胞、60％的乳腺癌细胞、46％的食管癌细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞(Morello A等，Cancer Discov.2016；6(2):133-146；Baldo P等，Onco Targets Ther.2017；10:5337-5353；Argani P等，Clin Cancer Res.2001；7(12):3862-3868；Hassan R等，Clin Cancer Res.2004；10(12Pt 1):3937-3942)。因此MSLN有可能成为癌症治疗的重要靶点。
MSLN基因位于染色体16p13.3，其基因全长8kb，cDNA大小为2138bp，含有1884bp的开放阅读框，17个外显子，编码628个氨基酸。MSLN基因编码一个71kDa的前体蛋白。MSLN前体蛋白由糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上，可被弗林蛋白酶(furin)水解为两个部分：分子量为31kDa的N端可溶性蛋白，被称为巨核细胞增强因子(megakaryocyte-potentiating factor，MPF)和分子量为40kDa的细胞表面糖蛋白，即为成熟的MSLN(Chang K等，Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(1):136-140；Manzanares
等，Hepatol Commun.2017；2(2):155-172)。
间皮素的生物学功能尚未完全阐明。研究人员曾对敲除MSLN基因的小鼠进行研究，发现小鼠在发育、繁殖和血细胞计数方面均未表现出异常，表明其不影响小鼠正常的生长发育。(Bera TK等，Mol Cell Biol.2000；20(8):2902-2906)。
MSLN的异常表达在肿瘤细胞的增殖分化、黏附及耐药性方面起着重要作用。MSLN的过表达可激活NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，MAPK(mitogen-activated protein kinase)和PI3K(Phosphoinositide 3-kinases)多条信号通路，从而诱导细胞凋亡或者通过诱导MMP7(matrix metalloproteinase 7，基质金属蛋白酶-7)和MMP9(matrix metalloproteinase 9，基质金属蛋白酶-9)的激活和表达促进细胞增殖，迁移和转移。研究表明MSLN通过同时激活PI3K/AKT(Protein Kinase B，PKB)和MAPK/ERK(extracellular regulated protein kinases)信号通路可以阻断紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡，增加癌细胞对药物的耐受性(Bharadwaj U等，Mol Cancer.2011；10:106；Cheng WF等，Br J Cancer.2009；100(7):1144-1153)。
传统的单克隆抗体分子量大，组织渗透性差，治疗效果有限；鼠源单克隆抗体具有很高 的免疫原性，而改造后的嵌合抗体和人源化抗体的亲和力成熟更具挑战性；全人源单克隆抗体的制备成本高、开发周期长、产出低等因素也限制了研发和推广。
1993年比利时科学家首次发现在骆驼血液中有一类缺失轻链的重链抗体，该类抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2和CH3区，但其具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，克隆其可变区可以得到只由重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)或纳米抗体(nanobody)。单域抗体的分子量只有普通抗体的1/10，是最小的功能性抗原结合片段，其化学性质灵活、易表达、可溶性好、渗透性强、免疫原性弱、人源化简单、容易耦联其他分子等，弥补了传统抗体缺陷的同时增加了药物开发的多样性。
发明内容
本发明提供抗人MSLN抗体，编码其的核酸，抗体制备方法，含有所述抗体的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。
在第一个方面，本发明提供了一种特异性结合MSLN的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合，所述CDR1、CDR2和CDR3根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码：
(1)所述CDR1可选自SEQ ID NO：35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140；
(2)所述CDR2可选自SEQ ID NO：36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141；
(3)所述CDR3可选自SEQ ID NO：37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段分别包含选自SEQ ID NO:23～34任一项所示VHH结构域中的CDR1、CDR2和CDR3，根据KABAT、Chothia或IMGT编号系统，所述CDR1、CDR2和CDR3选自：
(1)所述CDR1选自SEQ ID NO：35、71、107，所述CDR2选自SEQ ID NO：36、72、108，所述CDR3选自SEQ ID NO：37、73、109；
(2)所述CDR1选自SEQ ID NO：38、74、110，所述CDR2选自SEQ ID NO：39、75、111，所述CDR3选自SEQ ID NO：40、76、112；
(3)所述CDR1选自SEQ ID NO：41、77、113，所述CDR2选自SEQ ID NO：42、78、114，所述CDR3选自SEQ ID NO：43、79、115；
(4)所述CDR1选自SEQ ID NO：44、80、116，所述CDR2选自SEQ ID NO：45、81、 117，所述CDR3选自SEQ ID NO：46、82、118；
(5)所述CDR1选自SEQ ID NO：47、83、119，所述CDR2选自SEQ ID NO：48、84、120，所述CDR3选自SEQ ID NO：49、85、121；
(6)所述CDR1选自SEQ ID NO：50、86、122，所述CDR2选自SEQ ID NO：51、87、123，所述CDR3选自SEQ ID NO：52、88、124；
(7)所述CDR1选自SEQ ID NO：53、89、125，所述CDR2选自SEQ ID NO：54、90、126，所述CDR3选自SEQ ID NO：55、91、127；
(8)所述CDR1选自SEQ ID NO：56、92、128，所述CDR2选自SEQ ID NO：57、93、129，所述CDR3选自SEQ ID NO：58、94、130；
(9)所述CDR1选自SEQ ID NO：59、95、131，所述CDR2选自SEQ ID NO：60、96、132，所述CDR3选自SEQ ID NO：61、97、133；
(10)所述CDR1选自SEQ ID NO：62、98、134，所述CDR2选自SEQ ID NO：63、99、135，所述CDR3选自SEQ ID NO：64、100、136；
(11)所述CDR1选自SEQ ID NO：65、101、137，所述CDR2选自SEQ ID NO：66、102、138，所述CDR3选自SEQ ID NO：67、103、139；
(12)所述CDR1选自SEQ ID NO：68、104、140，所述CDR2选自SEQ ID NO：69、105、141，所述CDR3选自SEQ ID NO：70、106、142；或，
(13)与上述(1)～(12)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:23～34中的CDR1、CDR2和CDR3序列组合；或，其包含与上述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：23～34任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：23～34任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：23～34任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：23～34任一项所示序列；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：23～34任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：23～34任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段其与人MSLN结合的解离常数(KD)不大于20nM。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为单域抗体或重链抗体。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或，(3)全人源抗体或其片段。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物；所述毒素化合物优选DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin或DX8951。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、或细胞因子；优选地，所述细胞因子可选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
在第二个方面，本发明提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合MSLN以外的抗原或结合与第一方面所述抗体或抗原结合片段不同的MSLN表位的抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，优选地，所述MSLN以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CD32B；PD-1；PD-2；PD-L1；VEGF；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；CD33；HER2；HER3；HAS；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
在一些实施例中，优选地，所述多特异性抗体可为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
在第三个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含任选自第一方面所述抗体或抗原结合片段。
在第四个方面，本发明提供一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体，或包含编码第三方面所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效 应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第五个方面，本发明提供能够编码上述第一方面抗体或抗原结合片段，第二方面所述多特异性抗体，或第三方面所述的嵌合抗原受体的分离的核酸片段。
在第六个方面，本发明提供包含第五方面所述分离的核酸片段的载体。
在第七个方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述第六方面所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第八个方面，本发明还提供一种抗体或抗原结合片段、或多特异性抗体的制备方法，所述方法包括培养上述第七方面所述细胞，以及在适合的条件下分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
在第九个方面，本发明还提供一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码第三方面所述CAR的核酸片段导入免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达第三方面所述CAR。
在第十个方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第十一个方面，本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物。所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
在第十二个方面，本发明提供一种任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
在第十三个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品。
在第十四个方面，本发明提供一种体外抑制表达MSLN细胞增殖或迁移的方法，在任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段接触。
在第十五个方面，本发明提供一种检测MSLN表达的方法，在任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与任选自第一方面所 述的抗体或抗原结合片段接触。
术语和定义：
除非另外说明，本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语，则该术语的含义以所述定义为准。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
如本文所用，术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必然发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着抗体重链可变区可以但不必须存在；存在时，可以是1个，2个或3个。
如本文所用，术语“MSLN”是指间皮素(Mesothelin，MSLN)，是一种存在于正常间皮细胞上的分化抗原，可表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。在正常组织中表达有限，但MSLN被发现高表达在上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺肿瘤和卵巢癌等细胞上。术语“MSLN”包括任何人类和非人类动物物种的MSLN蛋白，并且具体地包括人类MSLN以及非人类哺乳动物的MSLN。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10-7M或更低、约10-8M或更低、约1×10-9M或更低、约1×10-10M或更低、1×10-11M或更低或1×10-12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体)，抗体缀合物)以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、 重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)或VHH；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；(ix)由VHH和CH2、CH3组成的重链抗体片段；以及(x)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用，术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
如本文所用，术语“纳米抗体”是指骆驼体内存在天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原结合片段。
如本文所用，术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用，是指克隆重链抗体的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变 区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见：Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8；Muyldermans的综述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74：277-302，2001)；以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用，术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
如本文所用，术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985 J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
如本文所用，术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或 位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
如本文所用，术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
如本文所用，术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
如本文所用，术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传 学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
如本文所用，术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
如本文所用，术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
如本文所用，术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地，人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此,通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域，可选地，在此基础上还可包含完整或部分铰链区，但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”，knob)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”，hole)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的，此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
如本文所用，术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
(1)酸性氨基酸：Asp(D)和Glu(E)；
(2)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)和His(H)；
(3)亲水性不带电荷氨基酸：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；
(4)脂肪族不带电荷氨基酸：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；
(5)非极性不带电荷的氨基酸：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；
(6)芳香族氨基酸：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”与“百分比(％)同一性”可以互换使用，是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC)，其中药物分子就是所述的另一个分子。其中所述“另一个分子”可选自治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes)；更优选地，所述细胞毒性剂优选DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin、DX8951。
如本文所用，术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天 然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，以及表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。宿主细胞在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
如本文所用，术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、牛、绵羊、马和野牛等。
如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括 已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
如本文所用，术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
如本文所用，术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。如本文所用，术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案。
图1.SDS-PAGE测定人MSLN蛋白的纯度情况：M.Marker；1.MSLN-R1-his 4％非还原；2.MSLN-R1-his 8％非还原；3.MSLN-R1-his 16％非还原；4.MSLN-R2-his 8％非还原；5.MSLN-R2-his 16％非还原；6.MSLN-R2-his 50％非还原；7.MSLN-R3-his 16％非还原；8.MSLN-R3-his 50％非还原；9.MSLN-FL-his非还原；10.MSLN-R3-rFc非还原；11.MSLN-FL-his还原；12.MSLN-R3-rFc还原。Fc标签的分子量约50KD，泳道10是R3-rFc在非还原条件下的表现，表示蛋白+标签的总分子量；泳道12是其在还原条件下的表现，还原剂会使蛋白分子内的二硫键打开并解聚成多肽链，因此还原分子量为非还原分子量的一半。
图2.A为ELISA检测人MSLN-R3-rFc蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性；
B为ELISA检测人MSLN-FL-his蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性；
C为ELISA检测人MSLN-R1-his蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性；
D为ELISA检测人MSLN-R2-his蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性；
E为ELISA检测人MSLN-R3-his蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性。
图3.ELISA检测对照抗体与MSLN蛋白的结合活性。
图4.A为对照抗体Tab106检测Hela细胞MSLN表达量的FACS结果；
B为对照抗体Tab131检测Hela细胞MSLN表达量的FACS结果；
C为对照抗体Tab142检测Hela细胞MSLN表达量的FACS结果。
图5.A为对照抗体Tab106检测OVCAR3细胞MSLN表达量的FACS结果；
B为对照抗体Tab131检测OVCAR3细胞MSLN表达量的FACS结果；
C为对照抗体Tab142检测OVCAR3细胞MSLN表达量的FACS结果。
图6.人MSLN蛋白转染的CHO-K1细胞株FACS筛选结果。
图7.NB149抗血清检测猴MSLN蛋白转染的HEK293T细胞表达量的FACS结果。
图8.人MSLN蛋白转染的HEK293T细胞株FACS筛选结果。
图9.人MSLN-R3/鸡MSLN-R1～2蛋白转染的HEK293T细胞株FACS筛选结果。
图10.人MSLN-R3蛋白转染的HEK293T细胞株FACS筛选结果。
图11.A为FACS检测对照抗体与人肿瘤细胞OVCAR3的结合反应；
B为FACS检测对照抗体与CHO-K1-人MSLN-2C8细胞的结合反应；
C为FACS检测对照抗体与HEK293T-猴MSLN细胞的结合反应。
图12.A为人MSLN全长蛋白检测人MSLN全长蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；
B为人MSLN-R3-his蛋白检测人MSLN全长蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；
C为人MSLN-R3-3多肽检测人MSLN全长蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；
D为Hela检测人MSLN蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况。
图13A.ELISA检测20nM VHH-hFc与人MSLN蛋白的结合反应；
图13B.ELISA检测0.2nM VHH-hFc与人MSLN蛋白的结合反应。
图14.A为ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合反应；
B为ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R1-his蛋白的结合反应；
C为ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R2-his蛋白的结合反应；
D为ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R3-his蛋白的结合反应。
图15A.FACS检测VHH-hFc与CHO-K1-人MSLN-2C8细胞的结合反应；
图15B.FACS检测VHH-hFc与肿瘤细胞Hela的结合反应。
图16.A为FACS检测VHH-hFc与肿瘤细胞OVCAR3的结合反应；
B为FACS检测VHH-hFc与HEK293T-人MSLN-B8细胞的结合反应；
C为FACS检测VHH-hFc与HEK293T-人MSLN-R3/鸡MSLN-R1～2-A5细胞的结合反应。
图17.FACS检测20nM VHH-hFc与HEK293T-人MSLN-B8、HEK293T-人MSLN-R3/鸡MSLN-R1～2-A5细胞的结合反应。
图18.FACS检测VHH-hFc与肿瘤细胞的特异性结合反应。
图19.FACS检测VHH-hFc与HEK293T-猴MSLN细胞的结合反应。
图20.SPR检测VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的亲和力。
图21.竞争性ELISA方法检测VHH-hFc之间的抑制率。
图22A.VHH-hFc与Biotin-Tab142之间的竞争活性；
图22B.VHH-hFc与Biotin-Tab131之间的竞争活性。
图23.VHH-hFc的抗原表位分类。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案或看作对本发明范围的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：对照抗体制备、内源细胞鉴定和过表达细胞株的制备
(A)、对照抗体的制备
YP218、YP3和YP223序列来自专利US2015252118A1，m912序列来自专利WO2009120769A1，Amatuximab(识别人MSLN R1表位)序列来自专利US20140127237A1。将识别人MSLN R3表位的克隆YP218和识别人MSLN构象表位的克隆YP3的VH和VL序列重组到人IgG1CH和CL表达载体；识别人MSLN R2表位的克隆YP223的VH和VL序列重组到兔IgG1CH和CL表达载体；识别人MSLN R3表位的克隆m912和YP218的VH和VL通过3个GGGGS连接子连接后重组到人IgG1Fc的表达载体中，得重组质粒。质粒构建及抗体的表达纯化工作均由泰州市百英生物科技有限公司完成。
将Amatuximab、YP218人IgG1形式的抗体、YP223兔IgG1形式的抗体、YP3人IgG1形式的抗体、YP218scFv-人IgG1Fc(hFc)形式的抗体、和m912scFv-人IgG1Fc(hFc)形式的抗体分别命名为Tab142(Amatuximab)，Tab106(YP218，hIgG1形式)，Tab020(YP223，rabbitIgG1形式)，Tab107(YP3，hIgG1形式)、Tab108(YP218，scFv-hIgG1Fc形式)和Tab131(m912，scFv-hIgG1Fc形式)
表1.对照抗体序列信息
(B)、人MSLN-R3-rFc，MSLN-FL-his，MSLN-R1-his，MSLN-R2-his，MSLN-R3-his的制备：
MSLN蛋白胞外具有3个类IgG样结构域，其中Region1(R1)位于最远膜端，Region3(R3)位于最近膜端，Amatuximab的抗原结合表位位于R1，YP218位于R3。将含有编码人MSLN蛋白(NCBI：AAH09272.1，SEQ ID NO:16)胞外区氨基酸序列Glu296-Gly580(MSLN-FL)、Glu296-Thr390(MSLN-R1)、Ser391-Asn486(MSLN-R2)和Met487-Ser598(MSLN-R3)的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成) 并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，rFc表示来自兔抗体的Fc标签，his为组氨酸标签，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)并使用FreeStyle
TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人MSLN蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap
TM Excel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人MSLN蛋白。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl,pH 7.2进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带rabbit Fc(rFc)标签的人MSLN蛋白。用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的人MSLN胞外区蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图1所示。
人MSLN蛋白(NCBI：AAH09272.1，SEQ ID NO：16)：
对制备的上述人MSLN蛋白应用识别不同表位的阳性对照抗体进行ELISA检测，检测结果如图2和表2～表6所示，人MSLN-R3-rFc、MSLN-FL-his、MSLN-R1-his、MSLN-R2-his、MSLN-R3-his蛋白可与抗人MSLN抗体(购自Acro，货号#MSN-M30)或者与对照抗体有结合活性，与产品说明书或者文献报道的Tab142(Amatuximab)、Tab106(YP218)、Tab020(YP223)和Tab107(YP3)的结合表位一致，说明已经制备获得具有结合活性的上述蛋白。
表2.ELISA检测人MSLN-R3-rFc蛋白与抗体的结合反应
表3.ELISA检测人MSLN-FL-his蛋白与抗体的结合反应
表4.ELISA检测人MSLN-R1-his蛋白与抗体的结合反应
表5.ELISA检测人MSLN-R2-his蛋白与抗体的结合反应
表6.ELISA检测人MSLN-R3-his蛋白与抗体的结合反应
对照抗体与人MSLN-FL-His蛋白，MSLN-R1-His蛋白，MSLN-R2-His蛋白，MSLN-R3-His蛋白和MSLN-R3-3多肽(购自：吉尔生化，货号：406676)的结合活性如表7和图3所示，结果说明，Tab020(YP223)，Tab142(Amatuximab)，Tab106(YP218)，Tab107(YP3)抗体与人MSLN-FL-his蛋白有很好的结合活性，同等实验条件下Tab131(m912scFv-hFc)几乎与人MSLN-FL-his、MSLN-R3-his蛋白没有结合活性。
表7.ELISA检测对照抗体与人MSLN-FL-his蛋白的结合反应
(C)、内源性表达人MSLN蛋白的细胞株鉴定
将内源性表达人MSLN蛋白的细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用20nM Tab106、Tab131和Tab142抗体作为一抗，FITC标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A18830)经FACS(FACS Canto
TM，购自BD公司)检测和分析。结果如表8，图4以及图5所示，说明内源表达人MSLN蛋白的细胞与Tab106、Tab131和Tab142均有结合活性。
表8.FACS检测肿瘤细胞MSLN表达量
(D)、表达人MSLN全长蛋白的CHO-K1重组细胞株的制备
编码人MSLN全长氨基酸序列(NCBI：AAH09272.1，SEQ ID NO:16)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院上海生命科学研究院)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/mL嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用兔抗人MSLN抗体(Tab020)和山羊抗兔IgG Fab抗体(cell signaling，货号：4414S)在流式细胞仪FACSAriaII(购自BD Biosciences) 上分选阳性单克隆细胞到96孔板，置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表9和图6所示，仅孵育二抗的作为对照。表9说明，已经制得一系列人MSLN阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图6中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。结果说明，2C8、2D11、2C5为高水平表达人MSLN蛋白的重组CHO-K1细胞株。
表9.表达人MSLN全长蛋白的CHO-K1重组细胞系FACS检测结果
(E)、表达猴MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码猴MSLN全长氨基酸序列(NCBI：XP_028696439.1，SEQ ID NO：17)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用NB149抗血清(抗血清制备请见实施例2)经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表10和图7，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-猴-MSLN具有相对单一的阳性峰，可用于FACS检测抗体与猴MSLN蛋白的交叉活性。
猴MSLN全长氨基酸序列(NCBI：XP_028696439.1，SEQ ID NO：17)：
表10.表达猴MSLN全长蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
(F)、表达人MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码人MSLN全长氨基酸序列(NCBI：AAH09272.1，SEQ ID NO:16)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染 (
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含5μg/mL嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用兔抗人MSLN抗体(Tab020)和山羊抗兔IgG Fab抗体(cell signaling，货号：4414S)在流式细胞仪FACSAriaII(购自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆用Tab020抗体经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表11和图8，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-人MSLN具有单一的阳性峰，B8、2A4、2A7为高水平表达人MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株，可用于FACS检测抗体与人MSLN蛋白的结合活性。
表11.表达人MSLN全长蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
(G)、表达嵌合人MSLN-R3蛋白和鸡MSLN-R1～2的重组HEK293T细胞株制备
为了保证蛋白空间构象，同时只保留人MSLN-R3蛋白结合区域，故将人MSLN-R1～R2替换成与人同源性较远的鸡MSLN-R1～R2。编码人MSLN-R3氨基酸序列(NCBI：AAH09272.1(SEQ ID NO:16)的Met487-Ser606)的核苷酸序列和编码鸡MSLN-R1～2氨基酸序列(XP_004945280.1的Gln327-Asp514)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含5μg/mL嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用抗人MSLN-R3抗体(Tab106)和山羊抗人IgG(H+L)抗体(Jackson，货号：109605088)在流式细胞仪FACSAriaII(购自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆用Tab106抗体经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表12和图9，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-人MSLN R3/鸡R1～2具有单一的阳性峰，A5、B1、A8为高水平表达人MSLN R3/鸡R1～2蛋白的重组HEK293T细胞株，可用于FACS检测抗体与人MSLN-R3蛋白的结合活性。
表12.表达人MSLN R3/鸡R1～2蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
(H)、表达人MSLN-R3蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码人MSLN-R3氨基酸序列(NCBI：AAH09272.1(SEQ ID NO:16)的Met487-Ser606)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含5μg/mL嘌呤霉素含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用抗人MSLN-R3抗体(Tab106)和山羊抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)在流式细胞仪FACSAriaII(购自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆用Tab106抗体经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表13和图10，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-人MSLN-R3具有相对单一的阳性峰，可用于FACS检测抗体与人MSLN-R3蛋白的结合活性。
表13.表达人MSLN-R3蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
(I)、重组细胞系与对照抗体的结合实验
对照抗体与表达人MSLN或者猴MSLN的细胞结合活性如表14～16和图11所示，IgG亚型对照为人IgG1。Tab142、Tab020、Tab106、Tab107与表达人MSLN蛋白的OVCAR3肿瘤细胞和CHO-K1-hMSLN-2C8重组细胞有很好的结合活性，Tab131的结合活性相对较弱。Tab142、Tab106、Tab107与HEK293T-猴-MSLN重组细胞有结合活性，Tab020和Tab131在同等实验条件下几乎未检测出与猴MSLN的交叉结合活性。
表14.FACS检测对照抗体与OVCAR3肿瘤细胞的结合反应
表15.FACS检测对照抗体与CHO-K1-hMSLN-2C8重组细胞的结合反应
表16.FACS检测对照抗体与HEK293T-猴-MSLN重组细胞的结合反应
实施例2 针对MSLN的单域抗体VHH的制备
(A)、羊驼免疫及血清效价检测
采用人MSLN(Glu296-Gly580)-Fc蛋白(购自Acro，货号：MSN-H5253)免疫两只羊驼(Alpaca，编号为NB148和NB149)。初次免疫时，人MSLN-Fc蛋白用弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射，即每只羊驼注射500μg人MSLN-Fc蛋白。加强免疫时，人MSLN-Fc蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射，即每只羊驼注射250μg人MSLN-Fc蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔3周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中人MSLN-Fc的抗体效价和特异性，结果如图12和表17-20所示。说明经人MSLN-Fc蛋白免疫后的羊驼的血清对hMSLN-FL-his蛋白、hMSLN-R3-his蛋白、hMSLN-R3-3(购自：吉尔生化，货号：406676，Val539-Val588)多肽和Hela细胞均有结合活性，其中ELISA针对hMSLN-FL-his蛋白的最高稀释度在8100～24300。其中空白对照为1％(w/w)BSA(图12横坐标0)，其中批次指第三次(TB2)和第四次(TB3)加强免疫后第七天的羊驼血清，表中的数据为OD450nm值。
表17.ELISA检测羊驼血清针对hMSLN-FL-his蛋白的效价
表18.ELISA检测羊驼血清针对hMSLN-R3-his蛋白的效价
表19.ELISA检测羊驼血清针对hMSLN-R3-3多肽的效价
表20.FACS检测人MSLN-Fc蛋白免疫后的羊驼血清对Hela细胞的效价
(B)、噬菌体文库构建及针对MSLN纳米抗体淘选
四次蛋白免疫后一周，采集100mL羊驼外周血，使用淋巴分离液分离PBMC，并使用RNAiso Plus试剂提取总RNA。使用PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(购自Takara，货号：6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区核酸片段：
第一轮PCR：
上游引物(SEQ ID NO：18)：CTTGGTGGTCCTGGCTGC；
下游引物(SEQ ID NO：19)：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作为模板，
上游引物(SEQ ID NO：20)：
下游引物-1(SEQ ID NO：21)：
下游引物-2(SEQ ID NO：22)：
回收目标单域抗体核酸片段，并使用限制性内切酶SfiI(NEB，货号：R0123S)将其克隆进入噬菌体展示用载体pcomb3XSS(来自四川阿帕克生物科技有限公司)中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中，构建针对MSLN的单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为3.08×10
9。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR。结果显示插入率达到100％。
(C)、针对MSLN的单域抗体筛选
将人MSLN-FL-His蛋白用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个蛋白包被8孔，4℃包被过夜；弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1小时；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1小时；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8分钟，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用10μL Tris-HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，可用于下一轮亲和淘选。
从第一轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签随机挑取192个单克隆接种于1mL 2×YT-AK中，37℃，220rpm振荡培养8小时。取100μL上述培养物，按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15min，220rpm振荡培养45分钟。补加300μL体积的2×YT-AK，30℃，剧烈振荡培养过夜。第二天12000rpm离心2分钟，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。
将人MSLN-FL-his蛋白用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按100μL孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1小时；PBST洗涤3次，每孔加入50μL噬菌体培养菌液上清和50μL 5％脱脂牛奶，37℃，孵育1小时；PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1:10000稀释)，100μL/孔，37℃作用1小时；PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7分钟，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm波长下测光密度。挑选人MSLN-FL-his阳性克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。对测序结果进行分析，根据VHH编码蛋白序列构建进化树，根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列，筛选获得12个克隆，其序列的CDRs分别用KABAT、Chothia或IMGT软件分析，对应的序 列信息如下表21所示。随后进行VHH-hFc生产鉴定。
表21.VHH序列信息
实施例3 VHH-hFc生产
将目标的VHH序列重组到人IgG1Fc的表达载体中，得重组质粒。具体的质粒构建、转染以及纯化流程参照实施例1(A),人IgG1Fc的序列如SEQ ID NO:11。
将纯化的VHH-hFc进行蛋白浓度、纯度、内毒素(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表22所示，结果显示，抗体的纯度较高，内毒素浓度在1.0EU/mg以内。
表22.VHH-hFc的质量控制情况
实施例4 VHH-hFc抗体的鉴定
(A)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-hFc与人MSLN蛋白/多肽的结合
人MSLN-FL-his、人MSLN-R1-his、人MSLN-R2-his、人MSLN-R3-his蛋白和人MSLN-R3-3多肽用PBS稀释到终浓度2μg/mL，然后以50μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入100nM为起始浓度，10倍梯度稀释的VHH-hFc或阴性对照抗体50μl每孔。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma，货号：A0170)，37℃孵育1小时后，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μl每孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，VHH-hFc与人 MSLN蛋白/多肽的结合活性结果如图13A～13B，图14和表23～27所示，说明纯化后的VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白均有结合，与人MSLN-R3-his蛋白均无结合，NB148-27、NB148-46、NB149-31、NB149-34、NB149-70、NB149-95与MSLN-R1-his蛋白有结合，NB148-13、NB148-25、NB148-35、NB148-88与MSLN-R2-his蛋白有结合，其中IgG对照为hIgG1，表中的数据为OD450nm值。
表23.ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合反应
表24.ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R1-his蛋白的结合反应
表25.ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R2-his蛋白的结合反应
表26.ELISA检测VHH-hFc与人MSLN-R3-his蛋白的结合反应
表27.ELISA检测VHH-hFc与人MSLN蛋白的结合反应(图13A、13B)
(B)、流式细胞实验(FACS)检测VHH-hFc与表达人MSLN蛋白的重组细胞的结合
将所需细胞在T-175细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，用胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化，并吹打细胞至单细胞悬液。细胞计数后，离心，将细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)重悬至2x10
6细胞每毫升，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，加入VHH-hFc待测样品(200nM为起始浓度，5倍梯度稀释)每孔50μl，与细胞悬液混匀，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl FITC标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A18830)，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl PBS重悬后用FACS(FACS Canto
TM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(FlowJo)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50。分析结果如表28-31以及图15A-15B，图16-18所示，表明VHH-hFc均可特异性结合表达人MSLN蛋白的重组细胞和肿瘤细胞，与表达人MSLN-R3蛋白的重组细胞均无结合活性。
表28.FACS检测VHH-hFc与表达人MSLN蛋白的细胞以及阴性细胞的结合反应
表29.FACS检测VHH-hFc与表达人MSLN蛋白的细胞结合反应(图16)
表30.FACS检测VHH-hFc与表达人MSLN蛋白的重组细胞的结合反应
表31.FACS检测VHH-hFc与表达人MSLN蛋白的肿瘤细胞的结合反应
实施例5 VHH-hFc的交叉结合活性检测
将HEK293T-猴MSLN重组细胞按照实施例4(B)的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表32-33以及图19所示，VHH-hFc抗体NB148-27、NB148-46、NB149-31、NB149-34、NB149-70、NB149-95与HEK293T-猴MSLN细胞有较好的特异性结合活性，NB149-81、NB149-97与HEK293T-猴MSLN细胞有较弱的结合活性，在本次实验条件下NB148-13、NB148-25、NB148-35、NB148-88与HEK293T-猴-MSLN细胞无结合活性。
表32.FACS检测VHH-hFc与表达猴MSLN蛋白的细胞结合反应
表33.FACS检测VHH-hFc与表达猴MSLN蛋白的细胞结合反应
实施例6 VHH-hFc的亲和力检测
(A)、VHH-hFc与人MSLN蛋白亲和力检测
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人MSLN VHH-hFc。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的人MSLN-FL-his蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的人MSLN-FL-his持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kd)及结合亲和力(KD)如表34以及图20所示，其中抗体Tab108、Tab142作为对照。结果表明，VHH-hFc与人MSLN蛋白的亲和力不低于1.08E-08M。
表34.VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合亲和力
| 抗体名称 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| NB148-13 | 4.46E+05 | 4.81E-03 | 1.08E-08 |
| NB148-25 | 2.24E+05 | 3.58E-04 | 1.59E-09 |
| NB148-27 | 1.44E+05 | 1.36E-03 | 9.39E-09 |
| NB148-35 | 2.47E+05 | 1.31E-03 | 5.31E-09 |
| NB148-46 | 9.02E+05 | 3.00E-03 | 3.33E-09 |
| NB148-88 | 4.99E+05 | 1.23E-03 | 2.45E-09 |
| NB149-31 | 1.30E+06 | 1.12E-03 | 8.61E-10 |
| NB149-34 | 2.18E+06 | 4.71E-04 | 2.16E-10 |
| NB149-70 | 1.46E+06 | 1.16E-03 | 7.95E-10 |
| NB149-81 | 1.09E+06 | 5.79E-04 | 5.33E-10 |
| 抗体名称 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| NB149-95 | 1.39E+06 | 3.24E-05 | 2.34E-11 |
| NB149-97 | 9.45E+05 | 1.74E-04 | 1.84E-10 |
| Tab108 | 4.71E+05 | 1.21E-04 | 2.57E-10 |
| Tab142 | 1.03E+06 | 1.96E-04 | 1.90E-10 |
实施例7 抗体抗原结合表位竞争实验(epitope binning)
(A)ELISA竞争法
为了鉴定抗体对抗原的结合位点，采用竞争ELISA的方法对MSLN VHH-hFc进行分组。参照实施例4(A)的方法使用2μg/mL VHH-hFc包被ELISA板，人MSLN蛋白从30μg/mL开始进行梯度稀释，计算出EC80作为竞争性ELISA中的浓度。
用PBS稀释VHH-hFc至2μg/mL，以50μL/孔包被96孔高吸附酶标板，4℃过夜包被后用250μL封闭液(含有2％(w/w)BSA的PBS)进行室温两小时封闭，加入40μg/mL待检测的抗体后，再加入每个待检测抗体对应的EC80浓度的人MSLN-FL-his蛋白，孵育2小时，用PBS洗5次后加入HRP标记的anti-His二抗(购自Genescript，货号：A00612)，孵育1小时，洗板5次。加入TMB底物50μL每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μL每孔。用ELISA读板机(Insight，购自PerkinElmer)读取OD450nm数值，根据OD450nm数值，利用公式计算出抗体相互之间的竞争率，结果如图21所示，竞争率的数值越高，表示两个抗体结合的抗原表位越是接近。
(B)FACS竞争法
为了验证抗体对抗原的结合位点，采用FACS竞争的方法对MSLN VHH-hFc进行分组。参照实施例4(B)细胞处理和种板方法，先摸索出Biotin-Tab142和Biotin-Tab131与CHO-K1-人MSLN-2C8细胞的结合情况，计算出EC80作为FACS竞争实验中的浓度。
配制VHH-hFc待测样品(200nM或者400nM为起始浓度，5倍梯度稀释)，每孔加入50μl，配制20nM或者10nM Biotin-Tab142和20nM Biotin-Tab131，每孔50μl，迅速混匀细胞，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl Alexa 488标记的二抗(购自Invitrogen，货号：S11223)，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl PBS重选后用FACS(FACS Canto
TM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(FlowJo)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，绘制曲线。结果如表35-37和图22A-22B所示。
根据以上两种方法的结果将VHH-hFc进行分类，结果如图23所示，NB148-13、NB148-25、NB148-35、NB148-88、Tab020与Tab131有竞争关系；NB148-46、NB149-27、NB149-31、NB149-34、NB149-70、NB149-81、NB149-95、NB149-97与Tab142(Amatuximab，R1表位)相互竞争。
表35.VHH-hFc与Biotin-Tab142的竞争结果
表36.VHH-hFc与Biotin-Tab142的竞争结果
表37.VHH-hFc与Biotin-Tab131的竞争结果
Claims (28)
- 特异性结合MSLN的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：(1)所述CDR1可选自SEQ ID NO：35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、或140；(2)所述CDR2可选自SEQ ID NO：36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、或141；(3)所述CDR3可选自SEQ ID NO：37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、或142；所述CDR1、CDR2和CDR3根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
- 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，根据KABAT、Chothia或IMGT编号系统：(1)所述CDR1选自SEQ ID NO：35、71、107，所述CDR2选自SEQ ID NO：36、72、108，所述CDR3选自SEQ ID NO：37、73、109；(2)所述CDR1选自SEQ ID NO：38、74、110，所述CDR2选自SEQ ID NO：39、75、111，所述CDR3选自SEQ ID NO：40、76、112；(3)所述CDR1选自SEQ ID NO：41、77、113，所述CDR2选自SEQ ID NO：42、78、114，所述CDR3选自SEQ ID NO：43、79、115；(4)所述CDR1选自SEQ ID NO：44、80、116，所述CDR2选自SEQ ID NO：45、81、117，所述CDR3选自SEQ ID NO：46、82、118；(5)所述CDR1选自SEQ ID NO：47、83、119，所述CDR2选自SEQ ID NO：48、84、120，所述CDR3选自SEQ ID NO：49、85、121；(6)所述CDR1选自SEQ ID NO：50、86、122，所述CDR2选自SEQ ID NO：51、87、123，所述CDR3选自SEQ ID NO：52、88、124；(7)所述CDR1选自SEQ ID NO：53、89、125，所述CDR2选自SEQ ID NO：54、90、126，所述CDR3选自SEQ ID NO：55、91、127；(8)所述CDR1选自SEQ ID NO：56、92、128，所述CDR2选自SEQ ID NO：57、93、129，所述CDR3选自SEQ ID NO：58、94、130；(9)所述CDR1选自SEQ ID NO：59、95、131，所述CDR2选自SEQ ID NO：60、 96、132，所述CDR3选自SEQ ID NO：61、97、133；(10)所述CDR1选自SEQ ID NO：62、98、134，所述CDR2选自SEQ ID NO：63、99、135，所述CDR3选自SEQ ID NO：64、100、136；(11)所述CDR1选自SEQ ID NO：65、101、137，所述CDR2选自SEQ ID NO：66、102、138，所述CDR3选自SEQ ID NO：67、103、139；(12)所述CDR1选自SEQ ID NO：68、104、140，所述CDR2选自SEQ ID NO：69、105、141，所述CDR3选自SEQ ID NO：70、106、142；或，(13)与上述(1)～(12)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
- 权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:23～34中的CDR1、CDR2和CDR3序列组合。
- 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
- 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:23～34任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:23～34任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:23～34任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:23～34任一项所示序列；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:23～34任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:23～34任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其与人MSLN结合的解离常数(KD)不大于20nM。
- 根据权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为单域抗体或重链抗体。
- 根据权利要求1～8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或，(3)全人源抗体或其片段。
- 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物；所述毒素化合物优选DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin或DX8951。
- 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、或细胞因子；优选地，所述细胞因子可选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
- 一种多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合MSLN以外的抗原或结合与权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段不同的MSLN表位的抗体或抗原结合片段。
- 根据权利要求12的多特异性抗体，其特征在于，所述MSLN以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CD32B；PD-1；PD-2；PD-L1；VEGF；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；CD33；HER2；HER3；HAS；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
- 根据权利要求12或13的多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体可为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
- 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段。
- 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达权利要求15所述的嵌合抗原受体，或包含编码权利要求15所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
- 一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述多特异性抗体，或权利要求15所述的嵌合抗原受体。
- 一种载体(vector)，其特征在于，所述载体包含权利要求17所述的核酸片段。
- 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求18所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
- 一种制备权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求12～14任一项所述多特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求19所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
- 一种制备权利要求16所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求15所述CAR的核酸片段导入免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求15所述CAR。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体；或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
- 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体；或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品；或权利要求22所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
- 一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
- 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物，其特征在于，用于预防和/或治疗肿瘤；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
- 一种试剂盒，其包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物。
- 一种检测MSLN表达的方法，其特征在于，在权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使待检测样品与权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
- 一种体外抑制表达MSLN细胞增殖或迁移的方法，其特征在于，在权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020114245917 | 2020-12-09 | ||
| CN202011424591 | 2020-12-09 | ||
| PCT/CN2021/136419 WO2022121941A1 (zh) | 2020-12-09 | 2021-12-08 | 抗人msln的抗体及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116685604A true CN116685604A (zh) | 2023-09-01 |
Family
ID=81973080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180082087.XA Pending CN116685604A (zh) | 2020-12-09 | 2021-12-08 | 抗人msln的抗体及其用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240124563A1 (zh) |
| CN (1) | CN116685604A (zh) |
| WO (1) | WO2022121941A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202321296A (zh) | 2021-10-06 | 2023-06-01 | 美商鏈接免疫療法公司 | 抗間皮素抗原結合分子及其用途 |
| CN117659194A (zh) * | 2023-11-30 | 2024-03-08 | 科弈(浙江)药业科技有限公司 | 靶向egfr的纳米抗体、药物偶联物及其用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103819559B (zh) * | 2013-12-10 | 2016-02-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种抗间皮素纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途 |
| US20170267755A1 (en) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Sri International | Isolated anti-mesothelin antibodies, conjugates and uses thereof |
| US20180002439A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Anti-mesothelin antibodies and uses thereof |
| CN107840891A (zh) * | 2016-09-19 | 2018-03-27 | 上海吉倍生物技术有限公司 | 高亲和力的抗msln抗体及其应用 |
| CN106543288A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-29 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种间皮素嵌合抗原受体修饰的t细胞制备及胰腺癌治疗上的应用 |
| WO2020146182A1 (en) * | 2019-01-08 | 2020-07-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cross-species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors |
| CN110698562B (zh) * | 2019-10-31 | 2022-10-25 | 浙江蓝盾药业有限公司 | 抗人msln单克隆抗体 |
-
2021
- 2021-12-08 WO PCT/CN2021/136419 patent/WO2022121941A1/zh active Application Filing
- 2021-12-08 CN CN202180082087.XA patent/CN116685604A/zh active Pending
- 2021-12-08 US US18/265,591 patent/US20240124563A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240124563A1 (en) | 2024-04-18 |
| WO2022121941A1 (zh) | 2022-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3744734A1 (en) | Anti-4-1bb antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof | |
| CN111744013A (zh) | 抗tigit抗体联合pd-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合 | |
| WO2022121928A1 (zh) | 抗egfr的纳米抗体及其用途 | |
| WO2022262859A1 (zh) | 抗人msln人源化抗体及其应用 | |
| WO2022121941A1 (zh) | 抗人msln的抗体及其用途 | |
| WO2022242703A1 (zh) | 抗msln抗体及其应用 | |
| WO2022127844A1 (zh) | Cd5抗体及其应用 | |
| WO2022127889A1 (zh) | Her2抗体及其应用 | |
| WO2022135536A1 (zh) | Cd3人源化抗体及其应用 | |
| WO2022105914A1 (zh) | Cd70抗体及其应用 | |
| WO2022105811A1 (zh) | Cd19人源化抗体及其应用 | |
| TW202304997A (zh) | 新型抗ｃｄ４抗體 | |
| WO2023274183A1 (zh) | Cd16抗体及其应用 | |
| WO2022148413A1 (zh) | 特异性结合4-1bb的抗体及其抗原结合片段 | |
| WO2022121969A1 (zh) | Gpc3抗体及其应用 | |
| WO2022171113A1 (zh) | 人cd33抗体及其用途 | |
| WO2023186100A1 (zh) | 抗ror1的抗体及其用途 | |
| WO2023011431A1 (zh) | 一种cd16抗体及其应用 | |
| WO2024017326A1 (zh) | 抗gprc5d纳米抗体及其应用 | |
| WO2022117032A1 (zh) | 抗cd22的纳米抗体及其用途 | |
| WO2023025194A1 (zh) | Fap/cd40结合分子及其医药用途 | |
| WO2022152282A1 (zh) | 抗人cd22的单克隆抗体及其用途 | |
| TW202340240A (zh) | 多特異性抗體及其藥物用途 | |
| CN116813786A (zh) | 抗cd73抗体及其应用 | |
| CN115667316A (zh) | Fab-HCAb结构的结合蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |