WO2022152282A1 - 抗人cd22的单克隆抗体及其用途 - Google Patents
抗人cd22的单克隆抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
一种CD22的抗体及其制备方法和应用。所述的CD22抗体与CD22蛋白具有高度亲和力，因此能够运用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病等药物的制备中。
Description
本申请要求于2021年1月18日提交中国专利局、申请号为202110060035.4、发明名称为“抗人CD22的单克隆抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
本发明涉及生物工程、生物医药领域，主要涉及一种靶向人CD22的单克隆抗体或其抗原结合片段，其编码核酸、表达载体和表达细胞、制备方法、药物组合物、以及它们用于治疗疾病的用途，例如治疗肿瘤和自身免疫病的用途。
CD22是一个I型跨膜糖蛋白，属于唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(Siglec,sialic acid-binding immunoglobulinlike lectins)家族中的一员，作为一种B系分化抗原，特异性表达于B细胞，从前B细胞(pre-B cell)时期开始表达，至B细胞分化为浆细胞后不再表达CD22。CD22在B细胞发育中的广谱表达，使其成为一个极具吸引力的靶向B细胞的分子。
CD22胞外区由7个免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain)和12个预测的N-连接的糖基化位点组成，其N端(即远膜端)结构域domain 1是V型Ig-like domain，作为配体结合位点能够识别α2,6-偶联唾液酸。CD22胞内区具有酪氨酸免疫受体依赖的抑制结构(ITIMs，immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs)，当ITIMs上的酪氨酸被Src家族蛋白激酶磷酸化后，会产生含有SH2(Src homology2)结构域分子的结合位点，随后招募SHP-1(Src homology region 2domain-containing phosphatase-1)从而抑制正常B细胞的BCR(B细胞受体，B-cell receptor)信号通路。
在造血细胞，某些内皮细胞以及T细胞和B细胞中都存在α2,6-偶联唾液酸糖蛋白，且CD22蛋白本身也会产生α2,6-偶联唾液酸，因此CD22能够与自身以及B细胞表面其它唾液酸糖蛋白之间形成顺式相互作用，与其它细胞类型细胞表面的唾液酸糖蛋白之间形成反式相互作用。在静息B细胞中，CD22之间的顺式相互作用使得CD22的配体结合位点被遮蔽，但是一旦临近细胞呈现出配体，被遮蔽的CD22配体结合位点便被暴露出来而与临近细胞配体形成反式相互作用。CD22之间的顺式相互作用会在B细胞表面形成同源寡聚体，这些同源寡聚体可以形成一个动态的纳米簇并产生B细胞激活之前必须达到的一个抗原结合信号阈值，从而调节B细胞信号通路。
CD22在60％～90％的B细胞恶性肿瘤中表达，在造血干细胞中不表达。在早期的一项急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的临床研究中，60％到85％的ALL均表达CD22；另一项研究中B-lineage ALL病人的CD22阳性率达93％。在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCLs)中85％以上的病人表达CD22。有许多临床试验研究了靶向CD22药物的有效性。依帕珠单抗(Epratuzumab)是一种CD22单克隆抗体，在成人和儿童B-ALL中具有一定的效果；CD22抗体偶联药物对B-ALL有一定的治疗作用。
单克隆抗体由于具有靶向性、特异性、专一性、高亲和力等优势，正发展成为新型治疗药物。然而，早期的临床试验揭示，在人体中使用非人源单克隆抗体，常常因为人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗大鼠抗体(HARA)应答，导致严重的免疫反应，抗体被快速清除。随后开发 出免疫原性较小的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。根据人源化程度不同,治疗性单克隆抗体药物可分为4种：鼠源性抗体(无人源氨基酸序列)、嵌合抗体(60％～70％人源化氨基酸序列)、CDR移植抗体(90％～95％人源化氨基酸序列)以及全人源抗体(100％人源氨基酸序列)。随着人源化程度增加，非鼠源单克隆抗体可以减轻人体治疗过程中人抗鼠抗体反应(HAMA和HARA反应)，逐步消除异源性抗体的免疫原性问题，在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药代动力学，临床上已大量使用这些抗体药物进行靶向治疗。
发明内容
本发明提供特异性结合人CD22的抗体或抗原结合片段，编码这些抗体及抗原结合片段的核酸，包含所述抗体及抗原结合片段的药物组合物和试剂盒，以及它能够用于治疗肿瘤等药物的制备。
在一些实施方案中，特异性结合人CD22的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含CDRs组合，所述CDRs组合包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
和，
(2)所述轻链CDRs组合包含：CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL，所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有选自以下任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
各个CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码。
特别地，例如本发明的抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链CDRs和轻链CDRs组合：VH1+VL1、VH2+VL2、VH3+VL3、VH4+VL4、VH5+VL5、VH6+VL6、VH7+VL7、VH8+VL8、VH9+VL9、VH10+VL10、VH11+VL11、VH12+VL12、VH13+VL13、VH14+VL14、VH15+VL15、VH16+VL16、VH17+VL17、VH18+VL18、VH19+VL19、VH20+VL20、VH21+VL21、VH22+VL22、VH23+VL23、VH24+VL24、VH25+VL25、VH26+VL26、VH27+VL27、VH28+VL28、VH29+VL29、VH30+VL30、VH31+VL31、VH32+VL32、VH33+VL33、VH34+VL34、VH35+VL35、VH36+VL36、VH37+VL37、VH38+VL38、VH39+VL39、VH40+VL40、VH41+VL41、VH42+VL42、VH43+VL43、VH44+VL44、VH45+VL45、VH46+VL46、VH47+VL47、VH48+VL48、VH49+VL49、VH50+VL50、VH51+VL51、VH52+VL52、VH53+VL53、VH54+VL54、VH55+VL55、VH56+VL56、VH57+VL57、VH58+VL58、VH59+VL59、VH60+VL60、VH61+VL61、VH62+VL62、VH63+VL63、VH64+VL64、VH65+VL65、VH66+VL66、VH67+VL67、VH68+VL68、VH69+VL69、VH70+VL70、VH71+VL71、VH72+VL72、VH73+VL73、VH74+VL74、VH75+VL75、VH76+VL76、VH77+VL77、VH78+VL78、VH79+VL79、VH80+VL80、VH81+VL81、VH82+VL82、VH83+VL83、VH84+VL84、VH85+VL85、VH86+VL86、VH87+VL87、VH88+VL88、VH89+VL89、VH90+VL90、VH91+VL91、VH92+VL92、VH93+VL93、VH94+VL94、VH95+VL95、VH96+VL96、VH97+VL97、VH98+VL98、VH99+VL99、VH100+VL100、VH101+VL101、VH102+VL102、VH103+VL103、VH104+VL104、或VH105+VL105，以及与所述重链和轻链CDRs组合之序列相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的CDRs组合。
在一个具体实施方案中，本发明提供这样的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)重链可变区具有SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、或81所示序列；轻链可变区具有SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82所示序列；
(2)与上述(1)所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；或，
(3)所述抗体或抗原结合片段的框架区与上述(1)所示氨基酸序列的框架区具有至少90％同一性，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段与人CD22结合的解离常数(KD)不大于10
-6M，与恒河猴CD22结合的解离常数(KD)不大于10
-8M。
或，可选地，所述抗体或抗原结合片段与猴CD22结合或不结合；
可选地，所述抗体或抗原结合片段与鼠CD22结合或不结合。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是嵌合的或人源化的或全人源的；优选地，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段，包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列；优选包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列；或携带突变的人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
在一个优选实施方案中，本发明所述抗原结合片段选自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
在一个优选实施方案中，本发明还提供一种多特异性抗原结合分子；优选地，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合CD22以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的CD22抗原表位；
优选地，所述其他抗原选自CD3、CD16、CD16A、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a-d)、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因产物、IL-2、IL-6、TRAIL-R1或TRAIL-R2；
优选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)；优选地，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含上述任一项所述CD22抗体或抗原结合片段。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞；优选地，所述免疫效应细胞包含上述所述嵌合抗原受体或包含上述所述嵌合抗原受体的核酸片段；
优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；
优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明上述任一项所述的纳米抗体、抗原结合片段、或其任意组合，上述所述的多特异性抗原结合分子或上述所述的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含本发明上述所述分离的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明上述所述分离的核酸分子或表达载体。
在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌；更优选，所述宿主细胞选自HEK293E或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的制备方法，培养或在适当的条件下培养本发明上述所述的宿主细胞，并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在一些实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞的制备方法，将上述所述CAR的核酸片段导入免疫效应细胞，优选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达上述所述的CAR。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，组合物包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞，或本发明上述所述方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)，以及药学上可接受的载体。
在一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；更优选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在一些实施方案中，本发明提供一种预防和/或治疗B细胞疾病的方法，包含向有此需要的患者施用本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品、或本发明上述所述的药物组合物；所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；
优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血 病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；
优选地，所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
在一些实施方案中，本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物在在制备预防和/或治疗B细胞疾病的药物中的用途，所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；
优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；
优选地，所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
在一些实施方案中，本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物用于预防和/或治疗B细胞疾病；所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；
优选，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；
优选地，所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、或本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述的药物组合物，以及使用说明。
术语定义和说明
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体，抗体缀合物)以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够特异性结合靶蛋白的完整抗体分子以及不完整的抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段，它们缺少完整抗体的Fc片段(从动物循环中更快地清除)，因此缺乏Fc介导的效应功能(effector function)(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；其内容援引加入本文)。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“天然抗体”是指通过多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。本文术语“工程化抗体”的抗体是指通过基因工程、抗体工程等技术获得的非天然抗体，示例性地，“工程化抗体”包括人源化抗体、小分子抗体(例如scFv等)、双特异性抗体等等。
本文术语“单特异性”是指具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”可互换使用，是指其具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接 的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用，术语“CD22”是指属于SIGLEC凝集素家族的分子Siglec-2，其存在于成熟B细胞的表面上，并且在某些未成熟的B细胞上存在程度较低。术语“CD22”包括任何人类和非人类动物物种的CD22蛋白，并且具体地包括人类CD22以及非人类哺乳动物的CD22。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体，其通常是人或人源化的抗体。在本发明中，结合特异性之一可以针对CD22的抗原表位而被检测，另一个可以针对CD22的另一个抗原表位或除CD22外的任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
如本文所用，术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
如本文所用，术语“纳米抗体”是指骆驼体内存在天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原结合片段。关于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(2001，Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302)，以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请：布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO03/050531；加拿大国家研究理事会的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(＝EP 1433793)； 以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，和Ablynx N.V.的进一步公开的专利申请。还参考了这些申请中提及的另外的现有技术，特别是国际申请WO 06/040153第41-43页上提及的参考文献列表，所述列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)尤其可以通过在一个或更多个框架序列中存在一个或更多个“特征残基”来表征。可在例如WO 08/101985和WO 08/142164中发现纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他的修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体及其制剂的半衰期的不同修饰。对于纳米抗体的进一步的一般描述，参考本文引用的现有技术，例如WO 08/020079(第16页)中所述。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的，表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的高变区之内，而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区，其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接，这三个CDR形成连接片层结构的环，并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含以下之一：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不意图包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“裸抗体”是指不与另一种作用剂或分子(例如标记或药物)、肽或多肽连接、融合或缀合的抗体。在具体的实施方案中，由哺乳动物宿主细胞表达的裸抗体可被宿主细胞的糖基化机器(例如糖基化酶)糖基化。在某些实施方案，当通过不具有其自身糖基化机器(例如糖基化酶)的宿主细胞表达时，裸抗体不被糖基化。在某些实施方案中，裸抗体是完整抗体，而在其它实施方案中，裸抗体是完整抗体的抗原结合片段，例如Fab抗体。
本文术语“缀合抗体”是指可与药学上可接受的载体或稀释剂缔合的抗体，其可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本文术语“双抗体”是指二价的双特异性抗体，可以与相同或不同抗原上的不同表位结合。
如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸彼此属于保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
(1)酸性氨基酸：Asp(D)和Glu(E)；
(2)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)和His(H)；
(3)亲水性不带电荷氨基酸：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；
(4)脂肪族不带电荷氨基酸：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；
(5)非极性不带电荷的氨基酸：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；
(6)芳香族氨基酸：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
如本文所用，术语“特异性结合”是指一种结合反应，其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况，所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD与抗原结合。例如，与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nM(例如，1pM至100nM之间)的KD与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nM(例如，大于500nM、1μM、100μΜ、500μΜ或1mM)的KD。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见，Harlow&Lane，Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow&Lane,Using Antibodies，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999)，其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC)，其中药物分子就是所述的另一个分子。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指这样的重组蛋白，其包含至少(1)细胞外抗原结 合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包含scFv。scFv可以源自融合抗体的可变重和轻区。替代地或另外，scFv可以衍生自Fab’s(而不是抗体，例如获自Fab文库)。在某些实施方式中，将scFv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、绵羊和马等。
如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“适当的条件”指适合培养各种宿主细胞的条件，其中宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。
本文术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“抗肿瘤剂”指抗肿瘤药物，其为治疗肿瘤疾病的一类药物，例如化疗药物、生物制剂等。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
图1为CD22-ECD-His、CD22domain1-4-His和CD22domain5-7-His蛋白样品SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测结果。泳道1为非还原条件下hCD22-ECD-His的蛋白条带，泳道2为非还原条件下hCD22domain5-7-His的蛋白条带，泳道3为还原条件下hCD22domain5-7-His的蛋白条带，泳道4为还原条件下hCD22-ECD-His的蛋白条带，泳道5为非还原条件下hCD22 domain1-4-His的蛋白条带，泳道6为还原条件下hCD22domain1-4-His的蛋白条带，泳道M为蛋白marker条带。
图2A为HA22抗体检测Raji细胞CD22表达量的FACS结果；图2B为m971抗体检测Raji细胞CD22表达量的FACS结果。
图3A为人CD22蛋白转染的CHO-K1-人CD22 2C4细胞FACS筛选检测结果；图3B为人CD22蛋白转染的CHO-K1-人CD22 1G5细胞FACS筛选检测结果；图3C为人CD22蛋白转染的CHO-K1-人CD22 1D9细胞FACS筛选检测结果。
图4为hL22抗体检测猴CD22蛋白转染的HEK293T细胞的FACS结果。
图5为ELISA检测嵌合抗体与人CD22-ECD-His蛋白的结合反应。抗CD22阳性对照抗体为：HA22和m971，阴性对照为hIgG1。
图6A为FACS检测本发明嵌合抗体与Raji的结合反应；图6B为FACS检测本发明嵌合抗体与CHO-K1-人CD22的结合反应；抗CD22阳性对照抗体为：HA22和m971，阴性对照为hIgG1；图6C为FACS检测1nM和10nM本发明的嵌合抗体与Raji细胞和MOLT4细胞的结合反应；图6D为FACS检测1nM和10nM本发明的嵌合抗体与CHO-K1细胞和CHO-K1-人CD22细胞的结合反应。
图7为ELISA检测本发明嵌合抗体与鼠CD22-ECD-His蛋白的结合反应；阳性对照为983；阴性对照为hIgG1。
图8为ELISA检测本发明嵌合抗体与猴CD22-ECD-His蛋白的结合反应；阳性对照为HA22；阴性对照为hIgG1。
图9A为FACS检测本发明嵌合抗体与HEK293T-猴CD22的结合反应；抗CD22阳性对照抗体为：HA22，阴性对照为hIgG1；图9B为FACS检测1nM和10nM本发明的嵌合抗体与HEK293T细胞和HEK293T-猴CD22的结合反应。
图10A-10B为FACS检测CD20抗体和1nM本发明的嵌合抗体双染色食蟹猴外周血单核细胞散点图，CD20为B细胞标记物，图中所示比例为嵌合抗体阳性细胞占CD20阳性细胞比例，抗CD22阳性对照抗体为：HA22和hL22，阴性对照为hIgG1。
图11A为ELISA检测本发明嵌合抗体与人CD22domain1-4-His蛋白的结合反应；图11B为ELISA检测本发明嵌合与人CD22domain5-7-His蛋白的结合反应。抗CD22domain1-4阳性对照抗体为HA22，抗CD22domain5-7阳性对照抗体为m971，阴性对照为hIgG1。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1.1人CD22-His标签蛋白的制备
CD22蛋白胞外具有7个类IgG样结构域，其中domain1位于最远膜端，domain7位于最近膜端。将含有编码人CD22蛋白的氨基酸序列(NCBI：NP_001762.2,SEQ ID NO:1)、胞外区(ECD，extra-cellular domain)氨基酸序列Asp 20-Arg 687(SEQ ID NO：2)、结构域(domain)1-4 Asp 20-Val 425氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和结构域(domain)5-7 Asp414-Arg 687氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，对应的氨基酸序列信息如下表1所示。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人CD22蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap
TMExcel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人CD22蛋白，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的人CD22蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图1所示。
表1.人CD22蛋白及胞外区氨基酸序列
1.2人CD22对照抗体的制备
HA22和m971克隆是识别人CD22的抗体，其中HA22克隆的抗原结合表位位于domain 2-3，m971克隆的抗原结合表位位于domain5-7。HA22克隆的重链可变区和轻链可变区序列根据专利US9580461B(其通过援引加入并入本文)获得，m971克隆的重链可变区和轻链可变区序列根据专利US8591889B(其通过援引加入并入本文)获得。由泰州市百英生物科技有限公司将HA22和m971克隆的轻链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗IgG1的轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HH1(泰州市百英生物科技有限公司自有载体)中，重链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HLK(泰州市百英生物科技有限公司自有载体)中，获得m971-hIgG1和HA22-hIgG1的序列，如无特殊说明则后文中HA22和m971均分别指m971-hIgG1和HA22-hIgG1。并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成 分，获得含抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl(pH 7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。
表2.抗人CD22的抗体HA22-hIgG1和m971-hIgG1的重链和轻链序列信息
实施例2过表达人CD22和猴CD22的细胞株构建和鉴定
2.1内源性表达CD22细胞株的鉴定
将Raji细胞(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，货号：TCHu 44)在T-25细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用HA22和m971抗体作为一抗，APC标记的二抗(购自Biolegend，货号：409306)，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。分析结果如表3以及图2A-2B所示，Raji细胞均可与HA22和m971结合。
表3.内源细胞系Raji细胞的FACS检测结果
2.2人CD22稳转CHO-K1单克隆细胞株的制备
编码人CD22全长氨基酸序列(NCBI：NP_001762.2，SEQ ID NO：1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院上海生命科学研究院，货号：SCSP-507)进行质粒转染(
3000Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用FITC标记的抗CD22抗体(Thermofisher scientific，货号：11-0229-42)在流式细胞仪FACS AriaII(BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2细胞培养箱中培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高的单克隆细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表4和图3A-图3C所示，IgG亚型对照为人IgG1对照。表4说明，已经制得一系列CD22阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图3A-图3C中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。图3A-图3C的结果说明，CHO-K1-人CD22 2C4、CHO-K1-人CD22 1G5以及CHO-K1-人CD22 1D9为CD22高水平表达细胞株，最终选择CHO-K1-人2C4细胞株用于后续实施例。
表4.人CD22蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
2.3猴CD22稳转HEK293T细胞株的制备
编码猴CD22全长氨基酸序列(NCBI：XP_014979161.2,SEQ ID NO:9)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific，货号：V79020)并制备质粒。对HEK293T细胞系用
(Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养箱中培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用具有猴交叉活性的CD22抗体hL22(购自Enzo Life Sciences；货号：ENZ-ABS619-0200)经流式细胞分析法进行筛选，选择长势较好、荧光强度较高的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，图4为hL22抗体检测HEK293T细胞株的流式分析结果，结果显示经过嘌呤霉素筛选后呈现过表达猴CD22的单一阳性细胞峰，可用于检测抗体的交叉活性。
猴CD22全长氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
实施例3、抗人CD22杂交瘤单克隆抗体的制备
3.1动物免疫
抗人CD22单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用6～8周龄BALB/c AnNCrl小鼠和SJL/JorllcoCrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，雌性。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为人CD22(Asp20-Arg687)-His蛋白(购自ACRO Biosystems，货号：CD2-H52H8)。初次免疫时，免疫原用TiterMax(购自Sigma，货号：T2684)乳化后皮下与腹腔分别注射0.1毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。加强免疫时，免疫原用Imject Alum Adjuvant(购自Thermo fisher scientific，货号：77161)皮下与腹腔分别注射0.1毫升，即每只小鼠注射25微克免疫原。免疫频次每周一次，于第4，18，46，70天取血，用ELISA和FACS方法检测小鼠血清中的抗体滴度。结果如表5-8所示，经人CD22-his蛋白免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在六百万左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第7次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm和MFI值。
表5.ELISA检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
表6.ELISA检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价
表7.FACS检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
表8.FACS检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价
在第7-8次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，皮下、腹膜内(IP)注射生理盐水配制的抗原溶液50μg/只。
3.2脾细胞融合和杂交瘤筛选
加入ACK Lysing Buffer(购自Gibco，货号：A1049201)，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM(购自Gibco，货号：11995081)基础培养基1000转/分钟离心清洗细胞3次，然后按照活细胞数目2:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC，货号：CRL-1581)混合，采用BTX ECM2001+高效电融合方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清(ExCell Bio，货号：FSD500)、1×HAT(购自Sigma，货号：H0262)的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按2×10
4/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO
2、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA筛选细胞融合板上清，将ELISA阳性克隆扩增到24孔板，用含10％(w/w)HT(购自Sigma，货号：H0137)和胎牛血清的DMEM(购自Gibco，货号：11995081)培养基，在37℃，5％(v/v)CO
2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用ELISA、FACS确定对人CD22蛋白和人CD22阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例5.1和实施例5.2)。
根据24孔板筛选结果，挑选ELISA和FACS实验中阳性的杂交瘤细胞作为符合条件的阳性克隆，用有限稀释法在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基(购自Gibco，货号：11995081)的96孔板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO
2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和FACS进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并将该最优的克隆于含10％(w/w)FBS的DMEM培养基(购自Gibco，货号：11995081)中在37℃，5％(v/v)CO
2条件下进行扩大培养，液氮冻存即得本发明的杂交瘤细胞。
实施例4杂交瘤阳性克隆轻重链可变区氨基酸序列测定
收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)充分裂解细胞后于-80℃保存待测。委托苏州金唯智生物科技有限公司完成杂交瘤阳性克隆轻重链可变区氨基酸序列的测定，对测序结果使用MOE软件进行分析，根据可变区编码蛋白氨基酸序列并构建进化树，根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列后，筛选获得35个克隆，其中F1系列23个F1.236.15，F1.214.8，F1.273.12，F1.231.15，F1.11.7，F1.77.9，F1.105.11，F1.267.9，F1.7.6，F1.224.1，F1.250.16，F1.120.15，F1.216.2，F1.280.1，F1.200.11，F1.192.1，F1.245.2，F1.60.9，F1.172.13，F1.17.1，F1.161.7，F1.257.3，F1.62.10，F2系列12个F2.70.2，F2.104.10，F2.180.16，F2.121.9，F2.173.9，F2.343.16，F2.205.9，F2.99.1，F2.127.11，F2.55.1，F2.42.9，F2.151.13。
由泰州市百英生物科技有限公司将35个克隆的重链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的重链恒定区(SEQ ID NO：10)的表达载体pcDNA3.4-B1HH1(泰州市百英生物科技有限公司自有载体)中，F1系列克隆的轻链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：11)的表达载体pcDNA3.4-B1HLK(泰州市百英生物 科技有限公司自有载体)中，F2系列克隆的轻链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的Lambda轻链恒定区(SEQ ID NO：12)的表达载体pcDNA3.4-BIHL5(泰州市百英生物科技有限公司自有载体)中，获得人鼠嵌合抗体的表达载体并按照实施例1.2的方法制备抗体。其序列的CDRs分别用KABAT、Chothia或IMGT软件分析，对应的序列信息如下表9-10所示，其中表9示出35个嵌合抗体分子重轻链可变区氨基酸表示的抗体序列，表10示出35个嵌合抗体分子CDRs的IMGT、Kabat和Chothia分析结果。
表9.抗CD22抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸具体序列信息
表10.IMGT、KABAT和Chothia软件分析CD22抗体的CDRs具体序列信息
包含信号肽和鼠源抗体IgG1的重链恒定区(SEQ ID NO：10)
包含信号肽和人源抗体IgG1的Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：11)
包含信号肽和人源抗体IgG1的Lambda轻链恒定区(SEQ ID NO：12)
实施例5 CD22人鼠嵌合抗体的鉴定
5.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测嵌合抗体与CD22蛋白的结合
为了检测CD22人鼠嵌合抗体与CD22蛋白的结合活性，将实施例2获得的纯化的人CD22-ECD-His蛋白用PBS稀释到终浓度2μg/mL，然后以100μl/孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，以50μl/孔加入100nM梯度稀释的嵌合抗体或阴性对照抗体。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma，货号：A0170)，37℃孵育2小时后，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl/孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)50μl/孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，嵌合抗体与人CD22-ECD蛋白的ELISA结果如图5和表11所示，表11说明，纯化后的抗体均能与人CD22-ECD在ELISA水平结合。其中阴性对照抗体hIgG1为针对鸡卵溶菌酶的抗体anti-hel-hIgG1(购自百英，货号：B117901)，表中的数据为OD450nm值。
表11.ELISA检测嵌合抗体与人CD22蛋白的结合反应
5.2流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与不同CD22表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，对于贴壁细胞CHO-K1吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用胰酶消化细胞，终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次；对于悬浮细胞Raji直接离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。对上一步的细胞进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2％(w/w)BSA]封闭液重悬至2x10
6个细胞/毫升，按50μl/孔加入到96孔FACS反应板中，加入嵌合抗体待测样品50μl/孔，冰上孵育2小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入50μl/孔Alexa Flour 488标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A-11013)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50值。分析结果如表12-13以及图6A-6B所示，嵌合抗体均可结合Raji细胞和CHO-K1-人CD22 2C4细胞表面的人CD22蛋白(图6A-6B)。使用同样的方法同时检测了嵌合抗体与内源CD22阴性的细胞MoLT4细胞(购自ATCC，CRL-1582)以及CHO-K1细胞的结合，结果如图6C-6D所示：图6C-6D中未显示与MoLT4细胞以及CHO-K1细胞结合的柱状图，可见，所有嵌合抗体均不结合MoLT4细胞以及CHO-K1细胞，，具有很好的特异性。
表12.FACS检测嵌合抗体与Raji和CHO-K1-人CD22 2C4细胞的结合反应
表13.FACS检测嵌合抗体与Raji和CHO-K1-人CD22 2C4细胞的结合反应
实施例6嵌合抗体的种属交叉结合活性检测
6.1ELISA检测嵌合抗体与不同种属CD22蛋白的结合
为检测嵌合抗体的种属交叉活性，将商品化的鼠CD22蛋白(ACROBiosystems，货号：SI2-M52Ha)和猴CD22蛋白(ACROBiosystems，货号：SI2-R52Ha)分别包被ELISA板，按照实施例5.1的方法进行ELISA检测。嵌合抗体与鼠CD22-ECD的ELISA结果如图7和表14所示，表14说明，纯化后的嵌合抗体与鼠CD22-ECD在ELISA水平均无结合。其中阴性对照为hIgG1，983为人CD22-ECD-His免疫小鼠后的血清作为阳性对照，表中的数据为OD450nm 值。
表14.ELISA检测嵌合抗体与鼠CD22蛋白的结合反应
*：983血清从1：100开始进行5倍浓度梯度稀释。
嵌合抗体与猴CD22-ECD的ELISA结果如图8和表15所示，表15说明，F1.236.15、F1.11.7、F1.105.11、F1.267.9、F1.224.1、F1.250.16、F1.120.15、F1.216.2、F1.200.11、F1.192.1、F1.172.13、F1.17.1、F2.121.9、F2.173.9、F1.205.9、F2.99.1、F2.55.1、F2.42.9和F2.151.13与猴CD22-ECD蛋白有结合活性。
表15.ELISA检测嵌合抗体与猴CD22蛋白的结合反应
6.2FACS检测嵌合抗体与猴CD22表达细胞的结合
将HEK293T-猴CD22细胞按照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表16-17以及图9A所示，除了F1.280.1，F1.245.2，F1.60.9，F1.257.3，F2.70.2，F2.104.10，F2.180.16，F2.343.16，F2.99.1，F2.127.11和F2.42.9外，其余嵌合抗体与过表达猴CD22的HEK293T细胞均有结合活性，EC50显示结合活性最高达到0.26nM。使用同样的方法同时检测了1nm和10nm嵌合抗体与HEK293T细胞的结合，结果如图9B所示：图9B中未显示与HEK293T细胞结合的柱状图，可见，所有嵌合抗体均不结合HEK293T细胞，，具有很好的特异性。
表16.FACS检测嵌合抗体与HEK293T-猴CD22细胞的结合反应
表17.FACS检测嵌合抗体与HEK293T-猴CD22细胞的结合反应
6.3 FACS检测嵌合抗体与食蟹猴(拉丁名：Macaca fascicularis)外周血B细胞的结合
从新鲜食蟹猴外周血(购自上海美迪西生物医药股份有限公司)中按照Ficoll-Paque Plus(购自GE Healthcae，货号:171440-02)说明书提取猴外周血单核细胞，细胞悬液离心后以含1％BSA的PBS重悬细胞后计数，同时加入有猴CD20交叉结合活性的鼠源抗体Brilliant Violet 605 anti-human CD20(货号:302334，购自Biolegend)和待测嵌合抗体(1nM、10nM和100nM)，室温孵育1小时。清洗细胞三次后加入APC标记的二抗anti-human IgG Fc(货号：409306，购自Biolegend)，避光室温孵育30分钟后清洗细胞5次，用含1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析，其中CD20作为B细胞的标记物，对CD20阳性的B细胞群进行圈门，分析其中嵌合抗体阳性细胞所占比例，分别计算100nM，10nM和1nM浓度下的嵌合抗体处理的嵌合抗体阳性细胞群占B细胞群的比例，结果如表18所示。Brilliant Violet 605标记CD20和APC二抗间接标记嵌合抗体的双染细胞散点图见图10A-图10B(1nM嵌合抗体浓度条件下)。由结果可知，F1.11.7、F1.77.9、F1.105.11、F1.267.9、F1.224.1、F1.250.16、F1.120.15、F1.17.1、F2.121.9和F2.151.13即使在1nM低浓度条件下依然与食蟹猴B细胞有较高比例的结合，且相比于阳性抗体HA22和hL22有相当或者更好的结合活性。
表18.FACS检测嵌合抗体与食蟹猴B细胞的结合反应
实施例7 CD22抗体亲和力测定
7.1嵌合抗体与人CD22-ECD-His蛋白亲和力测定
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人CD22嵌合抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的CD22抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的重组人CD22-ECD His蛋白持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。 通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。嵌合抗体与人CD22-His蛋白的结合速率(ka)、解离速率(kd)及结合亲和力(KD)如表19所示，其中抗体HA22、m971作为阳性对照。表19所示，嵌合抗体与人CD22的亲和力最高可达到2.54E-10M。
表19.SPR(biacore)检测嵌合抗体与人CD22的亲和力
7.2嵌合抗体与恒河猴CD22-ECD-His蛋白亲和力测定
按照实施例7.1的方法对嵌合抗体与恒河猴CD22(ACROBiosystems，货号：SI2-R52Ha)蛋白进行亲和力测定，结果如表20所示，嵌合抗体与恒河猴CD22的亲和力最高可达到2.04E-09M。
表20.SPR(biacore)检测嵌合抗体与恒河猴CD22的亲和力
备注：“拟合差”表示无法计算出EC50值。
实施例8抗体抗原结合区域的鉴定
CD22蛋白胞外具有7个类IgG样结构域，其中domain1位于最远膜端，domain7位于最近膜端，HA22和hL22的抗原结合表位位于domain 2-3，m971的抗原结合表位位于domain5-7。为了鉴定嵌合抗体的抗原结合表位分布，按照实施例5.1中的ELISA方法，分别包被人CD22-domain1-4-His(远膜端)和人CD22domain5-7-His(近膜端)，并对嵌合抗体进行远膜端和近膜端分类，如图11A-11B和表21所示，可以将抗体分为三类：第一类与CD22domain5-7不结合，与CD22domain1-4的结合活性和CD22全长ECD的结合活性相当，结合表位位于domian1-4，如F1.231.15；第二类与CD22domain1-4不结合，与CD22domain5-7的结合活性和CD22全长ECD的结合活性相当，结合表位位于domian5-7，如F1.236.15；第三类与CD22domain5-7不结合，与CD22domain1-4的结合活性相比CD22全长ECD的结合活性减弱，如F1.250.16、F1.172.13和F1.62.10。
表21.ELISA方法对嵌合抗体进行远膜端和近膜端表位分类
| 抗体名称 | 结合区域 |
| domain1-4 | domain5-7 | |
| F1.236.15 | — | + |
| F1.214.8 | — | + |
| F1.273.12 | — | + |
| F1.231.15 | + | — |
| F1.11.7 | — | + |
| F1.77.9 | — | + |
| F1.105.11 | — | + |
| F1.267.9 | + | — |
| F1.7.6 | + | — |
| F1.224.1 | + | — |
| F1.250.16 | 弱结合 | — |
| F1.120.15 | + | — |
| F1.216.2 | + | — |
| F1.280.1 | + | — |
| F1.200.11 | — | + |
| F1.192.1 | — | + |
| F1.245.2 | + | — |
| F1.60.9 | — | + |
| F1.172.13 | 弱结合 | — |
| F1.17.1 | + | — |
| F1.161.7 | + | — |
| F1.257.3 | + | — |
| F1.62.10 | 弱结合 | — |
| F2.70.2 | + | — |
| F2.104.10 | + | — |
| F2.180.16 | — | + |
| F2.121.9 | + | — |
| F2.173.9 | + | — |
| F2.343.16 | + | — |
| F2.205.9 | + | — |
| F2.99.1 | + | — |
| F2.127.11 | + | — |
| F2.55.1 | + | — |
| F2.42.9 | + | — |
| F2.151.13 | — | + |
| HA22 | + | — |
| m971 | — | + |
“+”：代表在该区域有结合。
“—”：代表在该区域无结合。
Claims (21)
- 特异性结合人CD22的分离的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链CDRs组合和轻链CDRs组合：(1)所述重链CDRs组合包含：CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH；所述CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
和，(2)所述轻链CDRs组合包含：CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL，所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有选自以下任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
各个CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码。 - 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含选自以下的重链CDRs和轻链CDRs组合：VH1+VL1、VH2+VL2、VH3+VL3、VH4+VL4、VH5+VL5、VH6+VL6、VH7+VL7、VH8+VL8、VH9+VL9、VH10+VL10、VH11+VL11、VH12+VL12、VH13+VL13、VH14+VL14、VH15+VL15、VH16+VL16、VH17+VL17、VH18+VL18、VH19+VL19、VH20+VL20、VH21+VL21、VH22+VL22、VH23+VL23、VH24+VL24、VH25+VL25、VH26+VL26、VH27+VL27、VH28+VL28、VH29+VL29、VH30+VL30、VH31+VL31、VH32+VL32、VH33+VL33、VH34+VL34、VH35+VL35、VH36+VL36、VH37+VL37、VH38+VL38、VH39+VL39、VH40+VL40、VH41+VL41、VH42+VL42、VH43+VL43、VH44+VL44、VH45+VL45、VH46+VL46、VH47+VL47、VH48+VL48、VH49+VL49、VH50+VL50、VH51+VL51、VH52+VL52、VH53+VL53、VH54+VL54、VH55+VL55、VH56+VL56、VH57+VL57、VH58+VL58、VH59+VL59、VH60+VL60、VH61+VL61、VH62+VL62、VH63+VL63、VH64+VL64、VH65+VL65、VH66+VL66、VH67+VL67、VH68+VL68、VH69+VL69、VH70+VL70、VH71+VL71、VH72+VL72、VH73+VL73、 VH74+VL74、VH75+VL75、VH76+VL76、VH77+VL77、VH78+VL78、VH79+VL79、VH80+VL80、VH81+VL81、VH82+VL82、VH83+VL83、VH84+VL84、VH85+VL85、VH86+VL86、VH87+VL87、VH88+VL88、VH89+VL89、VH90+VL90、VH91+VL91、VH92+VL92、VH93+VL93、VH94+VL94、VH95+VL95、VH96+VL96、VH97+VL97、VH98+VL98、VH99+VL99、VH100+VL100、VH101+VL101、VH102+VL102、VH103+VL103、VH104+VL104、或VH105+VL105，以及与所述重链和轻链CDRs组合之序列相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的CDRs组合。
- 根据权利要求1-2任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或抗原结合片段包含：(1)重链可变区具有SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、或81所示序列；轻链可变区具有SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82所示序列；(2)与上述(1)所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；或，(3)所述抗体或抗原结合片段的框架区与上述(1)所示氨基酸序列的框架区具有至少90％同一性，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
- 根据权利要求1-3任一项的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其与人CD22结合的解离常数(KD)不大于10 -6M，与恒河猴CD22结合的解离常数(KD)不大于10 -8M。或，可选地，所述抗体或抗原结合片段与猴CD22结合或不结合；可选地，所述抗体或抗原结合片段与鼠CD22结合或不结合。
- 根据权利要求1-4任一项的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；(3)全人源抗体或其片段；优选的，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、 Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
- 根据权利要求1-5任一项的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列；优选包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
- 根据权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
- 根据权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段进一步还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
- 一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合CD22以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的CD22抗原表位；优选地，所述其他抗原选自CD3、CD16、CD16A、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a-d)、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC、Ia、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因产物、IL-2、IL-6、TRAIL-R1或TRAIL-R2；优选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
- 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1-8任一项所述CD22抗体或抗原结合片段。
- 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包含权利要求10所述嵌合抗原受体或包含编码权利要求10所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
- 一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-8任一项所述的 抗体、抗原结合片段、或其任意组合，权利要求9所述的多特异性抗原结合分子或权利要求10所述的嵌合抗原受体。
- 包含权利要求12所述分离的核酸分子的表达载体。
- 包含权利要求12所述的分离的核酸分子、或权利要求13所述的表达载体的分离的宿主细胞；优选，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌；更优选，所述宿主细胞选自HEK293E或CHO细胞。
- 一种制备权利要求1-8任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求9所述多特异性抗原结合分子的方法，其特征在于，培养或在适当的条件下培养权利要求14所述的宿主细胞，并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
- 一种制备权利要求11所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求10所述CAR的核酸片段导入免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求10所述CAR。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9所述的多特异性抗原结合分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫效应细胞、权利要求12的分离的核酸分子、权利要求13的表达载体、权利要求14的细胞，或权利要求15或16所述方法制备的产品；优选，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；优选，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
- 权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9所述的多特异性抗原结合分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫效应细胞、权利要求12的分离的核酸分子、权利要求13的表达载体、权利要求14的细胞，或权利要求15或16所述方法制备的产品、或权利要求17所述的药物组合物在制备预防和/或治疗B细胞疾病的药物中的用途，所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；优选，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，更优选，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；优选，其中所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血- 肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
- 一种预防和/或治疗B细胞疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9所述的多特异性抗原结合分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫效应细胞、权利要求12的分离的核酸分子、权利要求13的表达载体、权利要求14的细胞，或权利要求15或16所述方法制备的产品、或权利要求17所述的药物组合物；所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；优选，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，更优选，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；优选，其中所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
- 权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9所述的多特异性抗原结合分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫效应细胞、权利要求12的分离的核酸分子、权利要求13的表达载体、权利要求14的细胞，或权利要求15或16所述方法制备的产品、或权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，用于和/或治疗B细胞疾病；所述B细胞疾病优选肿瘤或自身免疫病；优选，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，更优选，所述淋巴瘤或白血病可选自B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；优选，其中所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、大血管血管炎、中血管血管炎、结节性多动脉炎、天疱疮、硬皮病、肺出血-肾炎综合征、肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、格雷夫斯氏病、膜性肾病、自身免疫性肝 炎、口炎性腹泻、阿狄森氏病、多发性肌炎/皮肌炎、单克隆丙种球蛋白病、因子VIII缺乏、冷球蛋白血症、周围神经病变、IgM多神经病、慢性神经病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
- 一种试剂盒，其包含权利要求1-8任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的多特异性抗原结合分子、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的免疫效应细胞、权利要求12的分离的核酸分子、权利要求13的表达载体、权利要求14的细胞，或权利要求15或16所述方法制备的产品、或权利要求17所述的药物组合物；任选地，还包含使用说明。
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