CN113045661A - 新型抗cd4抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开在本文中提供了抗CD4抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸和包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物，及其用途。

Description

新型抗CD4抗体
发明领域
本公开大体上涉及与人CD4结合的抗体及其抗原结合片段，以及使用这些抗体和抗原结合片段的方法。
背景技术
CD4是一种单体I型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超基因家族的成员，它包含四个胞外Ig样域、一个疏水跨膜域和一个高度碱性胞质尾区(Glatzova D等人,(2019)《免疫学前沿》(Front Immunol)10:618)。CD4的N端Ig样域与MHC II类分子的α2和β2域相互作用，以组装TCR-pMHC-CD4三元复合物，由此产生的TCR与CD4之间的紧密接近使得与CD4胞质尾区结合的酪氨酸激酶Lck能够将CD3胞质域上免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的酪氨酸残基磷酸化，从而放大TCR产生的信号(Rudd CE等人,(1988)《美国国家科学院院刊》(Proc NatlAcad Sci USA)85:5190；Barber EK等人,(1989)《美国国家科学院院刊》86:3277和Li QJ等人,(2004)《自然·免疫学》(Nat Immunol)5:791)。
CD4在大部分胸腺细胞(80-90％)和50％以上的外周血T细胞中表达(Nakamura K等人,(2003)《分子免疫学》(Mol Immunol)39:909)。CD4在巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell)上也有少量表达。CD4不仅在胸腺细胞的分化和T淋巴细胞/B淋巴细胞粘附的调控中发挥重要作用，而且在MHC II类限制性T细胞激活中也发挥重要作用(Gaubin M等人,(1996)《欧洲临床化学和临床生物化学杂志》(Eur J Clin ChemClin Biochem)34:723；Artyomov MN等人,(2010)《美国国家科学院院刊》107:16916；YiliL等人,(2013)《免疫学前沿》4:206)。
更重要的是，CD4表达细胞，如调节性T细胞(Treg)已被证明抑制肿瘤诱导的免疫，从而损害各种癌症疗法的疗效(Baba J等人,(2012)《血液》(Blood)120:2417；Togashi Y等人,(2019)《自然评论临床肿瘤学》(Nature Reviews Clinical Oncology)16:356)。因此，需要可以有效地靶向和消除CD4表达细胞，特别是Treg的新型抗CD4抗体。
发明内容
在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“抗体”是指一种抗体或多于一种抗体。
本公开尤其提供了一种针对人CD4(hCD4)的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，其中所述重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31和41，
b)HCDR2，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:2、12、22和42，以及
c)HCDR3，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33和43，和/或
其中所述轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:4、14、24和34，
e)LCDR2，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:5、15和25，以及
f)LCDR3，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:6、16、26和46。
在某些实施方式中，重链可变区选自由以下组成的组：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；以及
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3。
在某些实施方式中，轻链可变区选自由以下组成的组：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；以及
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；或
e)重链可变区包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，重链可变区包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含SEQ ID NO:7的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的序列的轻链可变区；或
b)包含SEQ ID NO:17的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的序列的轻链可变区；或
c)包含SEQ ID NO:27的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区；或
d)包含SEQ ID NO:37的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:38的序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:47的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的序列的轻链可变区；或
f)包含SEQ ID NO:61的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:62的序列的轻链可变区；或
g)包含SEQ ID NO:63的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:64的序列的轻链可变区。
在另一方面，本公开提供了一种针对人CD4(hCD4)的分离抗体或其抗原结合片段，其包括：包含SEQ ID NO:65的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:66的序列的轻链可变区，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力。
在某些实施方式中，取代或修饰中的至少一个在VH或VL序列的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR区中。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区，任选地人Ig的恒定区，或任选地人IgG的恒定区。
在某些实施方式中，恒定区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
在某些实施方式中，恒定区包含人IgG1的恒定区。
在某些实施方式中，IgG1包含一个或多个突变，所述突变可以赋予相对于野生型恒定区增加的CDC或ADCC。
在某些实施方式中，一个或多个突变选自由以下组成的组：S239D、I332E、H268F、S324T S236A、G236A、P247I、A339(D/Q)、D280H、K290S、S298(D/V)、F243L、R292P、Y300L、P396L、V305I、K290(E/N)、S298G、T299A、K326E、E382V、M428I、S298A、K326A、E333A、K334A、S298A、E333A和K334A，所述突变位点根据EU序列编号。
在某些实施方式中，一个或多个突变包含S298A、E333A和K334A的组合，所述突变位点根据EU序列编号。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合hCD4的第一和第二表位，或能够特异性结合hCD4和第二抗原。
在某些实施方式中，第二抗原包含免疫相关靶标。
在某些实施方式中，第二抗原包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
在某些实施方式中，第二抗原包括肿瘤抗原。
在某些实施方式中，肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，肿瘤抗原包括前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、Claudin 18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与一个或多个缀合物部分连接。
在某些实施方式中，缀合物部分包括清除修饰剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物如雄激素受体抑制剂。
在另一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与本文提供的抗体或其抗原结合片段竞争与hCD4结合。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物或试剂盒，其包含本文提供的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，本文提供的药物组合物或试剂盒还包含第二治疗剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂包括抗癌剂，如mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂和T细胞募集抗体。
在某些实施方式中，mTOR抑制剂是坦罗莫司(Temsirolimus)、依维莫司(Evirolimus)或雷帕霉素(Rapamycin)。
在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自PD-1抗体、PD-L1抗体、PD-L2抗体、LAG-3抗体、TIM-1抗体、CTLA-4抗体、VISTA抗体、B7-H2抗体、B7-H3抗体、B7-H4抗体、B7-H抗体6、ICOS抗体、HVEM抗体、CD160抗体、gp49B抗体、PIR-B抗体、KIR家族受体抗体、TIM-1抗体、TIM-4抗体、BTLA抗体、SIRPα(CD47)抗体、CD4抗体8、284(CD244)抗体、B7.1抗体、B7.2抗体、ILT-2抗体、ILT-4抗体、TIGIT抗体和A2aR抗体。
在某些实施方式中，T细胞募集抗体包括CD19/CD3双特异性抗体。
在另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，其编码本文提供的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本公开提供了一种载体，其包含本文提供的分离的多核苷酸。
在另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文提供的载体。
在另一方面，本公开提供了一种表达本文提供的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达载体的条件下培养宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在某些实施方式中，CD4相关疾病或病况是癌症、适应性免疫疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、复发性或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞性白血病)、骨髓瘤和淋巴瘤。
在另一方面，本公开提供了一种检测样品中CD4的存在或量的方法，其包括使所述样品与本文提供的抗体或其抗原结合片段接触，并确定所述样品中CD4的存在或量。
在另一方面，本公开提供了一种诊断受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括：a)从所述受试者获得样品；b)使从所述受试者获得的样品与本文提供的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定所述样品中CD4的存在或量；以及d)将所述CD4的存在或量与所述受试者的CD4相关疾病或病况的存在或状态相关联。
在另一方面，本公开提供了一种消除有需要的受试者体内CD4表达细胞的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在某些实施方式中，CD4表达细胞是调节性T细胞(Treg)。
在另一方面，本公开提供了一种增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种提高免疫疗法在有需要的受试者体内的疗效的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在某些实施方式中，本文提供的方法还包括施用第二治疗剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂包括抗癌剂，如mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂和T细胞募集抗体。
在某些实施方式中，T细胞募集抗体包括CD19/CD3双特异性抗体。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的CD4相关疾病或病况的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于提高免疫疗法在有需要的受试者体内的疗效的药物中的用途。
附图简要说明
图1显示了鼠杂交瘤抗CD4抗体对293T-CD16-NFκB基因报告分析的影响。
图2显示了通过ELISA测量的鼠杂交瘤抗CD4抗体与人CD4的结合EC50。mIgG1的结合显示为阴性对照。
图3显示了通过ELISA测量的嵌合抗CD4抗体与人CD4的结合EC50。
图4显示了通过FACS测量的嵌合抗CD4抗体与293T-CD4细胞上的人CD4的结合EC50。
图5显示了嵌合抗CD4抗体对NK细胞靶向的CD4+细胞的ADCC的影响。
图6显示了通过ELISA测量的人源化抗CD4抗体与人CD4的结合EC50。
图7显示了通过FACS测量的人源化抗CD4抗体与293T-CD4细胞上的人CD4的结合EC50。
图8显示了人源化抗CD4抗体对PBMC中CD4+细胞的ADCC的影响。
具体实施方式
以下对本公开的描述仅旨在说明本公开的各种实施方式。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本公开范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，这些等效实施方式将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文所用，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明上下文中(特别是在权利要求上下文中)使用的术语“一(a/an)”、“所述”和类似术语应解释为涵盖单数和复数。
如本文所用，术语“抗体”包括任何与特异性抗原结合的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。原生完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一个可变区(VH)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合域的CDR边界可由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani的约定来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.),273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；N.R.Whitelegg等人,《蛋白质工程》(ProteinEngineering),v13(12),819-824(2000)；Chothia,C.等人,《自然》(Nature).12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,美国国家卫生研究院(National Institutesof Health),马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发展与比较免疫学》(Developmental and Comparative Immunology),27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组学研究》(Immunome Research),1(3),(2005)；Marie-PauleLefranc,《B细胞分子生物学(第二版)》(Molecular Biology of B cells(secondedition)),第26章,481-514,(2015))。三个CDR插入在称为框架区(FR)的侧翼片段之间，框架区比CDR更高度保守，并形成一个支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。将数种主要抗体类别划分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施方式中，本文提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个CDR的抗体片段，或任何其它与抗原结合但不包含完整的原生抗体结构的抗体部分形成的抗体片段。抗原结合片段的实施例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链可变片段(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包含来自特定亲本抗体的一个或多个CDR。
关于抗体的“Fab”或“F(ab)”是指抗体的单价抗原结合片段，其由单一轻链(可变区和恒定区)通过二硫键与单一重链的可变区和第一恒定区结合而成。Fab可以通过木瓜蛋白酶消化抗体在铰链区重链之间的二硫键的N端近端残基处获得。
“F(ab')”是指包括一部分铰链区的Fab片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体在铰链区重链之间的二硫键的C端近端残基处获得，因此在铰链区的少量残基(包括一个或多个半胱氨酸)上与Fab不同。
“F(ab')2”是指F(ab')的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
关于抗体(例如IgG、IgA或IgD同种型)的“Fc”是指抗体中由第一重链的第二和第三恒定域通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定域结合组成的部分。关于IgM和IgE同种型的抗体的Fc还包含第四恒定域。抗体的Fc部分负责各种效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但不具有抗原结合的功能。
关于抗体的“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由单条轻链的可变区与单条重链的可变区结合组成。“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其中单条轻链的可变区和单条重链的可变区之间的连接是二硫键。
“单链可变片段”或“单链Fv抗体”或“scFv”是指由一个轻链可变区和一个重链可变区直接或通过肽连接子序列相互连接组成的工程化抗体(Huston JS等人.《美国国家科学院院刊》,85:5879(1988))。“scFv二聚体”是指通过连接子包含两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体或二价scFv(BsFv)，其包含VH-VL(由肽连接子连接)与另一个VH-VL部分二聚，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配位并形成可靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包含VH1-VL2(由肽连接子连接)与VL1-VH2(也由肽连接子连接)缔合，使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接至抗体Fc区的scFv组成的工程化抗体。
“骆驼化单域抗体”、“重链抗体”、“纳米抗体”或“HCAb”是指含有两个VH域且不含轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods.)12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志》(J Biotechnol.)6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初是从骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)获得的。虽然不含轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱系(Hamers-Casterman C.等人,《自然》6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人,“骆驼科重链抗体：进化创新案例(Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation),”《免疫遗传学》(Immunogenetics.)4月；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等人,《免疫学》(Immunology.)5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变域(VHH域)代表由适应性免疫反应产生的已知最小的抗原结合单元(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学学会联合会杂志》(FASEB J.)11月；21(13):3490-8.电子版2007年6月15日(2007))。“双功能抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在单一多肽链中连接到VL域的VH域(VH-VL或VL-VH)(参见例如Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。同一条链上的两个域无法配对，因为连接子太短，因此，迫使所述域与另一条链的互补域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原(或表位)。
“域抗体”是指仅含重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些实施方式中，两个或更多个VH域用肽连接子共价连接以形成二价或多价域抗体。二价域抗体的两个VH域可以靶向相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsFv)2”包含三条肽链：两个VH部分由肽连接子连接，并通过二硫桥与两个VL部分结合。
在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”包含VH1-VL2(由肽连接子连接)，其与VL1-VH2(也由肽连接子连接)通过VH1与VL1之间的二硫桥结合。
在某些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv'”包含三条肽链：VH1-VH2部分，其中重链由肽连接子(例如长柔性连接子)结合，并通过二硫桥分别与VL1和VL2部分配对。每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如本文所用，术语“人源化”是指抗体或抗原结合片段包含来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及当适用时，来源于人的恒定区。在某些实施方式中，人源化CD4抗体的可变区框架的氨基酸残基被替换以进行序列优化。在某些实施方式中，人源化CD4抗体链的可变区框架序列与相应的人类可变区框架序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同。
如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的一部分来源于一个物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的物种。在一个说明性实施例中，嵌合抗体可以包含来源于人类的恒定区和来源于非人类物种(如小鼠)的可变区。
术语“生殖系序列”是指编码与所有其它已知的由生殖系免疫球蛋白可变区序列编码的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定的氨基酸序列同一性的可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列。生殖系序列也可以指与所有其它评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的可变区氨基酸序列或子序列。生殖系序列可以是仅框架区、仅互补决定区、框架和互补决定区、可变区段(如上文所定义)或包含可变区的序列或子序列的其它组合。序列同一性可以使用本文所述的方法确定，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域中已知的另一种比对算法比对两个序列。生殖系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。例如，可以通过可公开获得的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)和V-base确定生殖系序列。
如本文所用，术语“抗人CD4抗体”是指能够以足够的特异性和/或亲和力与人CD4(hCD4)或其变体特异性结合的抗体或其抗原结合片段，例如以提供治疗用途。如本文所用，关于参考蛋白或肽(例如hCD4)的术语“变体”是指参考蛋白或肽的修饰版本，例如功能等效物、片段、融合物、衍生物、模拟物或其任何组合，其氨基酸序列与参考蛋白或肽的序列具有至少70％(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并保留了蛋白或肽(例如野生型蛋白或肽)的生物活性或结合活性的至少25％(例如35％、50％、75％、90％、95％或99％)。所述变体可以是参考蛋白或肽的片段、突变体、融合体、截短体或其任何组合。
如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即抗体)或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。
如本文所用，术语“特异性结合(specific binding/specifically binds)”是指两个分子之间，例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段与人和/或非人抗原特异性结合，其结合亲和力(KD)≤10-6M(例如，≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤4×10-9M、≤3×10-9M、≤2×10-9M或≤10-9M。本文使用的KD是指解离速率与缔合速率之比(koff/kon)，其可通过使用本领域中已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体共振法、微尺度热泳法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)法。在某些实施方式中，KD值可以通过使用流式细胞术法适当地确定。可以使用各种免疫分析格式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可用于确定特异性免疫反应的免疫分析格式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,《使用抗体，实验室手册》(Using Antibodies,A Laboratory Manual)(1998))。通常，特异性或选择性结合反应将产生至少两倍于背景信号，更通常是至少10至100倍于背景信号的信号。
如本文所用，术语“氨基酸”是指含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每个氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸的名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，其概述如下。
名称 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
蛋氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有相似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。例如，可以在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)中，在具有中性亲水性侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)中，在具有酸性侧链的残基(例如Asp、Glu)中，在具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)中，或在具有芳香族侧链的残基(例如Trp、Tyr和Phe)中进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，因此可以保留蛋白质的生物活性。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入间隙以达到最大对应性之后，候选序列中的氨基酸(或核酸)残基与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可以例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得，另参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究》(Nucleic Acids Res.),25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站上获得，另参见Higgins D.G.等人,《酶学方法》(Methods in Enzymology),266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(英格兰牛津)》(Bioinformatics(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域的技术人员可以使用所述工具提供的默认参数，或者可以自定义适合于比对的参数，例如通过选择合适的算法。在某些实施方式中，不相同的残基位置可以通过保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可将相似性的百分比或程度向上调整，以校正取代的保守性。进行这种调整的手段是本领域的技术人员所熟知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法》(Methods Mol.Biol.)24:307-331，以引用的方式并入本文中。
如本文所用，“同源序列”是指与另一序列任选比对时具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的多核苷酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
“分离的”物质已经被人为地改变了自然状态。如果“分离的”成分或物质出现在自然界中，则它已经被改变或从原来的环境中移除，或两者兼而有之。例如，天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽并不是“分离的”，但同样的多核苷酸或多肽如果已经与其天然状态的共存物质充分分离，从而以基本上纯净的状态存在，则是“分离的”。分离的“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，指的是分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指如通过电泳法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)所测定，纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除注明外，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用的病况的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或消除与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病状或其某种组合。
如本文所用，术语“载体”是指一种媒介物，可将遗传元件可操作地插入其中，以实现所述遗传元件的表达，例如产生由所述遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA，或复制所述遗传元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实施例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供了含有本文提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个与所述核酸序列可操作地连接的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记的载体(例如表达载体)。
如本文所用，“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。
如本文所用，术语“CD4”，即术语“分化簇4”的首字母缩写，是指在免疫细胞如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表面上发现的一种糖蛋白，并涵盖CD4的所有同工型。如本文所用，“CD4相关的”疾病或病况是指与CD4和/或CD4表达细胞，例如CD4+T细胞，特别是Treg相关的任何疾病或病况。在一些实施方式中，CD4相关的疾病或病况是例如自身免疫疾病、癌症、适应性免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
如本文所用，“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学病况，可以是良性的或恶性的，并包括实体肿瘤和非实体癌症(例如血液恶性肿瘤)，如白血病。如本文所用，“实体肿瘤”是指赘生性和/或恶性细胞的实体块。
术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成制剂的其它成分在化学上和/或物理上相容，并与接受者在生理上相容。
在本文中提及“约”一个值或参数包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义所述范围的数字。一般来说，术语“约”是指变量的指示值和变量的所有值，所述值在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内，以较大者为准。当在一个时间段(年、月、周、日等)的上下文内使用术语“约”时，术语“约”是指该时间段加上或减去下一个下级时间段的一个量(例如，约1年是指11-13个月；约6个月是指6个月加上或减去1周；约1周是指6-8天等)，或在指示值的10％以内，以较大者为准。
抗人CD4抗体
在一个方面，本公开提供了抗人CD4(hCD4)抗体及其抗原结合片段。
结合亲和力
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体能够与hCD4结合，通过Biacore所测量的Kd不超过5nM、不超过4.5nM、不超过4nM、不超过3.5nM、不超过3nM、不超过2.5nM、不超过2nM、不超过1.5nM、不超过1nM或不超过0.5nM。在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体能够与hCD4结合，通过Biacore所测量的Kd不超过0.5nM、不超过0.45nM、不超过0.4nM、不超过0.35nM、不超过0.3nM、不超过0.25nM、不超过0.2nM、不超过0.15nM、不超过0.1nM或不超过0.05nM。本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由KD值表示，KD值表示抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时，解离速率与缔合速率之比(koff/kon)。抗原结合亲和力(例如KD)可以使用本领域中已知的任何合适的方法适当地确定，包括例如动力学排除分析(KinExA)、Biacore、Fortebio或流式细胞术。
一般来说，Biacore的工作原理是将恒定量的一种结合伴侣(CBP)与不同浓度的另一种结合伴侣(滴定剂)进行平衡，然后在较短的接触时间内通过荧光标记的二级抗体捕获一部分游离CBP，所述接触时间小于预先形成的CBP-滴定剂复合物解离所需的时间。从捕获的CBP产生的荧光信号与平衡样品中游离CBP的浓度成正比，并用于生成一系列测量时的结合曲线(游离CBP百分比与滴定剂总浓度)。更多详情可从Schreiber,G.,Fersht,A.R.《自然·结构生物学》(Nature Structural Biology.)1996,3(5),427-431获得。当抗CD4抗体以恒定量用作CBP时，则CD4蛋白可用作滴定剂，反之亦然。
在某些实施方式中，本文提供的抗CD4抗体的KD根据本公开中实施例4所述的方法测定。
在适用的情况下，也可以使用其它适合于测量KD的方法，例如放射性标记的抗原结合分析法(参见例如Chen等人,(1999)《分子生物学杂志》293:865-881)，或Biacore以外的表面等离子体共振分析法。
或者，本文提供的抗CD4抗体和抗原结合片段与人CD4的结合亲和力也可以由“半数最大有效浓度”(EC50)值来表示，所述值是指观察到其最大作用(例如结合)的50％的抗体的浓度。EC50值可以通过本领域中已知的方法来测量，例如夹心分析法如ELISA、蛋白质印迹法、流式细胞术分析法和其它结合分析法。在某些实施方式中，本文提供的抗CD4抗体及其片段与人CD4(例如表达人CD4的细胞)特异性结合，通过FACS测量的EC50值不超过700ng/ml(或不超过680、660、640、620、600、580、560、540、520、500、480、460、440、420、400、380、360、340、320、300、280、260、240、220、200、180、160、140、120、100、80、60、40、20、13.5、13、12.5、12、11.5、11、10.5、10、9、8、7、6、5.5、5、4.5、4、3、2或1ng/ml)。在某些实施方式中，本文提供的抗CD4抗体及其片段与人CD4(例如表达人CD4的细胞)特异性结合，通过ELISA测量的EC50值不超过40ng/ml(或不超过38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、16、14、12、10、8、6、4、2或1ng/ml)。
抗体序列
在一个方面，本公开提供了本文提供的抗CD4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，其中所述重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31和41，
b)HCDR2，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:2、12、22和42，
c)HCDR3，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33和43，和/或
其中所述轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:4、14、24和34，
e)LCDR2，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:5、15和25，以及
f)LCDR3，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:6、16、26和46。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；或
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；或
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；或
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；或
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；或
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；或
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；或
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；或
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；或
e)重链可变区包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含抗hCD4抗体2B6、29B7、33E12、11E12、10C2、MT412的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。
如本文所用，“2B6”是指具有SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“29B7”是指具有SEQ ID NO:17的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“33E12”是指具有SEQ ID NO:27的重链可变区和SEQ ID NO:28的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“11E12”是指具有SEQ ID NO:37的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“10C2”是指具有SEQ ID NO:47的重链可变区和SEQ ID NO:48的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“MT412”是指具有SEQ ID NO:57的重链可变区和SEQ ID NO:58的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“2B6人源化”是指具有SEQ ID NO:61的重链可变区和SEQ ID NO:62的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“29B7人源化”是指具有SEQ ID NO:63的重链可变区和SEQ ID NO:64的轻链可变区的抗体。
如本文所用，“MT412人源化”是指具有SEQ ID NO:65的重链可变区和SEQ ID NO:66的轻链可变区的抗体。
表1示出了这些抗hCD4抗体的CDR序列。重链和轻链可变区序列也在下表2和表3中提供。
表1.抗hCD4抗体的CDR区的序列
Figure BDA0003010329740000211
表2.抗hCD4抗体的VH/VL序列
Figure BDA0003010329740000212
Figure BDA0003010329740000221
本文提供的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而不是在动物体内制备的抗体。
已知CDR负责抗原结合，然而，已发现6个CDR不一定都是不可缺少或不可改变的。换句话说，可以替换或改变或修饰抗hCD4抗体2B6、29B7、33E12、11E12、10C2或MT412中的1、2、3个CDR，但实质上保留与hCD4的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段包含抗hCD4抗体2B6、29B7、33E12、11E12、10C2或MT412之一的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段包含SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，因此被认为与抗原接触最多，并为抗体与抗原的亲和力提供了最多的自由能。也有人认为重链CDR3是迄今为止抗原结合位点中在长度、氨基酸组成和构象等方面最具多样性的CDR，是通过多种多样化机制实现的(Tonegawa S.《自然》302:575-81)。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.《免疫》(Immunity.)13:37-45)以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等,《分子生物学杂志》263:551-67)。
在一些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段包含重链可变域的全部或一部分和/或轻链可变域的全部或一部分。在一个实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段是单域抗体，其由本文提供的重链可变域的全部或一部分组成。这种单域抗体的更多信息可在本领域中获得(参见例如美国专利第6,248,516号)。
在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含合适的框架区(FR)序列，只要抗体及其抗原结合片段可以与CD4特异性结合即可。表1中提供的CDR序列是从小鼠抗体获得的，但它们可以使用本领域中已知的合适方法如重组技术，移植到任何合适的物种如小鼠、人、大鼠、兔等的任何合适的FR序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在其降低人的免疫原性方面是合乎需要的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人CDR序列移植到人或基本上是人的FR序列上。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过将人免疫球蛋白基因中相应的人CDR基因替换为非人(如鼠)CDR基因来实现(参见例如Jones等人(1986)《自然》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学》(Science)239:1534-1536)。在这之前或之后可以对亲本非人抗体的可变区或域的三维结构进行模拟。
可以使用本领域中已知的方法选择合适的人重链和轻链可变域以实现CDR移植。在一个说明性实施例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知的人可变域生殖系序列的数据库(例如蛋白质数据库，http://www.rcsb.org/)筛选或BLAST化非人(例如啮齿动物)抗体可变域序列，确定最接近非人查询序列的人序列，并将其用作移植非人CDR序列的人支架(参见例如Sims等人,(1993)《免疫学杂志》(J.Immunol.)151:2296；Chothia等人(1987)《分子生物学杂志》196:901)。或者，从所有人抗体的共有序列衍生出的框架可用于非人CDR的移植(参见例如Carter等人(1992)《美国国家科学院院刊》,89:4285；Presta等人(1993)《免疫学杂志》,151:2623)。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段除CDR序列为非人序列外，基本上全部由人序列构成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以来源于不同的人免疫球蛋白基因，例如FR序列来源于一种人抗体，恒定区来源于另一种人抗体。
在一些实施方式中，来源于人的FR区可以包含与来源于其的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人抗体的相应残基取代。在某些实施方式中，可能需要使人源化抗体或其片段紧密地接近非人亲本抗体结构，以减少或避免免疫原性和/或改善或保留结合活性或结合亲和力。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段在每个人FR序列中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重链或轻链可变域的所有FR中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可以仅存在于重链FR区，仅存在于轻链FR区，或存在于两条链中。在某些实施方式中，一个或多个氨基酸残基突变，例如复原突变为CDR序列所源自的非人亲本抗体(例如，在小鼠框架区)中发现的相应残基。合适的突变位置可由技术人员按照本领域中已知的原则选择。例如，可以选择以下突变位置：其中1)所述位置的残基在人类生殖系序列的框架中是罕见的(例如在人类可变区序列中少于20％或少于10％)；2)所述位置紧邻人类生殖系链一级序列中的3个CDR中的一个或多个，因为它有可能与CDR中的残基相互作用；或3)所述位置在3维模型中接近CDR，因此可以有很大的概率与CDR中的氨基酸相互作用。所选位置的残基可以突变回亲本抗体中的相应残基，或者突变为既不是人类生殖系序列中的相应残基，也不是亲本抗体中的相应残基，而是人类序列的典型残基，即在与人类生殖系序列属于同一亚组的已知人类序列中该位置出现频率较高的残基(参见美国专利第5,693,762号)。
在某些实施方式中，本公开的人源化轻链和重链在人类中基本上是非免疫原性的，并且保留与亲本抗体对hCD4的亲和力基本上相同的亲和力或甚至更高的亲和力。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段还包含轻链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列；和轻链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列；和轻链可变区，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66及其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体或其抗原结合片段还包含一对重链可变区和轻链可变区序列，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:61/62、63/64、65/66或其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力的一对序列。
表3.人源化抗体VH/VL的序列
Figure BDA0003010329740000251
Figure BDA0003010329740000261
本文提供的人源化抗hCD4抗体保留了对hCD4的特异性结合亲和力，并且在该方面至少与亲本抗体相当或甚至优于亲本抗体。在某些实施方式中，在该方面与亲本抗体相比，本文提供的人源化抗hCD4抗体表现出对hCD4的明显更高的特异性结合亲和力。
抗体变体
本文提供的抗hCD4抗体及其抗原结合片段还涵盖本文提供的抗体序列的各种类型的变体。
在某些实施方式中，变体包含表1中提供的1、2或3个CDR序列、一个或多个FR序列、本文提供的重链或轻链可变区序列和/或恒定区(例如Fc区)中的一个或多个修饰或取代。这样的抗体变体保留了其亲本抗体对hCD4的特异性结合亲和力，但具有由修饰或取代所赋予的一种或多种期望的特性。例如，抗体变体可能具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基、增加的效应功能、改进的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合的相容性(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)等等。
可以使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085)筛选亲本抗体序列，以确定合适的或优选的残基进行修饰或取代。简而言之，可以确定目标残基(例如带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)置换，生产修饰的抗体并针对感兴趣的特性进行筛选。如果在特定氨基酸位置的取代显示出感兴趣的功能变化，则所述位置可以被确定为用于修饰或取代的潜在残基。潜在残基可以通过用不同类型的残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估。
恒定区及其变体
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体及其片段还包含免疫球蛋白恒定区。在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体及其片段还包含人Ig，如人IgG的恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
在某些实施方式中，本文提供的人源化抗体可以包含与人IgG1同种型的恒定区融合的重链可变区和与人κ链的恒定区融合的轻链可变区。在某些实施方式中，κ链包含SEQID NO:68的氨基酸序列。
不同Ig同种型的Fc区具有不同的诱导效应功能的能力。例如，已经认识到IgG1和IgG3的Fc区比IgG2和IgG4的Fc区更有效地诱导ADCC和CDC。在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含IgG1或IgG3同种型的Fc区，其可诱导ADCC或CDC；或者，IgG4或IgG2同种型的恒定区，其具有降低或耗竭的效应功能。在一些实施方式中，Fc区来源于具有增加的效应功能(例如ADCC)的人IgG1。在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含野生型人IgG1 Fc区或其它野生型人IgG1等位基因。在一些实施方式中，来源于人IgG1的Fc区包含具有SEQ ID NO:69的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，来源于人IgG1的Fc区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包括包含一个或多个突变的人IgG1 Fc区，所述突变可赋予相对于野生型恒定区增加的CDC或ADCC。
在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包括包含S298A突变、E333A突变和/或K334A突变的人IgG1 Fc区，所述突变赋予相对于野生型恒定区增加的ADCC。增加ADCC的其它此类突变包括但不限于S239D、I332E、H268F、S324T、S236A、G236A、P247I、A339(D/Q)、D280H、K290S、S298(D/V)、F243L、R292P、Y300L、P396L、V305I、K290(E/N)、S298G、T299A、K326E、E382V、M428I、S298A、K326A、E333A、K334A及其任何组合，其中Fc区中残基的编号是根据EU编号(Edelman,G.M.等人,《美国国家科学院院刊》,63,78-85(1969).)。在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包括包含S298A突变、E333A突变和K334A突变，即如本文所用分“3A突变”的人IgG1 Fc区，所述突变赋予相对于野生型恒定区增加的ADCC。
亲和力变体
亲和力变体保留了亲本抗体对hCD4的特异性结合亲和力，或甚至具有优于亲本抗体的改进的hCD4特异性结合亲和力。可以使用本领域中已知的各种方法来实现这一目的。例如，可以用噬菌体展示技术生成并表达抗体变体(如Fab或scFv变体)库，然后针对于对人CD4的结合亲和力进行筛选。再例如，可以使用计算机软件虚拟模拟抗体与人CD4的结合，并确定抗体上形成结合界面的氨基酸残基。这样的残基可以在取代中避免，以防止结合亲和力降低，或者靶向取代以提供更强的结合。
在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体或抗原结合片段包含一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体包含在一个或多个CDR序列和/或FR序列中总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施方式中，抗hCD4抗体及其抗原结合片段包含与表1中所列的(或那些)序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的1、2或3个CDR序列，同时保留与其亲本抗体类似或甚至更高水平的对hCD4的结合亲和力。
糖基化变体
本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变体，其可以被获得以增加或降低抗体或抗原结合片段的糖基化程度。如本文所用，术语“糖基化”是指将聚糖如岩藻糖、木糖、甘露糖或GlcNAc磷酸丝氨酸聚糖连接到蛋白质、脂质或其它有机分子上的酶促过程。根据与聚糖连接的碳，糖基化可分为五类，包括：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、磷酸糖基化、C-连接的糖基化和糖基磷脂酰肌醇化。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基)的侧链的连接，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见地与丝氨酸或苏氨酸的连接。
经典的ADCC反应是由自然杀伤(NK)细胞在FcγRIIIa与抗体分子的Fc区结合后介导的。这种结合触发NK细胞释放细胞因子和细胞溶解剂，最终杀死目标细胞。在不希望受任何理论束缚的情况下，认为FcγRIII通过与铰链区和CH2域相互作用来结合IgG1抗体的Fc区，并且这种相互作用可以受到存在于每个CH2域中的保守N-糖基化位点Asn297(N297)的聚糖的显著影响(Krapp S等人,《分子生物学杂志》2003；325:979-89.)。等温滴定量热法显示，IgG1-FcgRIIIa结合由有利的结合焓(ΔH)驱动，但受到不利的结合熵变化(ΔS)对抗。岩藻糖的去除增强了有利的ΔH，导致IgG1对受体的结合常数增加了20-30倍(Okazaki A等人,《分子生物学杂志》2004；336:1239-49.)。因此，对Fc N-聚糖进行糖工程化以减少核心岩藻糖可以增加抗体与FcγRIII之间的亲和力，从而增强ADCC活性。例如，无岩藻糖基化的IgG1与其岩藻糖基化的对应物相比，可以显著提高体外使用外周血单核细胞(PBMC)或NK细胞的ADCC活性(Iida S等人,《临床癌症研究》(Clin Cancer Res.)2006；12:2879-87；Shields RL等人,《生物化学杂志》(J Biol Chem.)2002；277:26733-40；Shinkawa T等人,《生物化学杂志》2003；278:3466-73)。
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段包含糖工程化Fc区，其中所述Fc区包含的核心岩藻糖减少。在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段包含来源于无岩藻糖基化IgG1的Fc区。
半胱氨酸工程化变体
本文提供的抗hCD4抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不作为二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基在工程化半胱氨酸的位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标记或放射性同种型等缀合。用于工程化抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域中已知的，例如参见WO2006/034488。
抗原结合片段
本文还提供了抗hCD4抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是本领域中已知的，并且可以基于本文提供的抗hCD4抗体进行开发，例如包括CDR序列如表1所示的示例性抗体及其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化变体等)。
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体或二价域抗体。
可以使用各种技术来生产此类抗原结合片段。示例性的方法包括完整抗体的酶促消化(参见例如Morimoto等人,《生物化学与生物物理学方法杂志》(Journal ofBiochemical and Biophysical Methods)24:107-117(1992)；和Brennan等人,《科学》,229:81(1985))、由宿主细胞如大肠杆菌重组表达(例如对于Fab、Fv和scFv抗体片段)、如上所述从噬菌体展示库筛选(例如对于scFv)以及将两个Fab'-SH片段化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物技术》(Bio/Technology)10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对熟练的从业者来说将是显而易见的。
在某些实施方式中，抗原结合片段是scFv。scFv的生成描述于例如WO 93/16185；美国专利第5,571,894号和第5,587,458号中。scFv可以在氨基或羧基端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如《抗体工程》(Antibody Engineering),Borrebaeck编)。
在某些实施方式中，本文提供的抗hCD4抗体及其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。如本文所用，术语“价”是指在给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。任何大于二价的分子都被认为是多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点都对与相同抗原或相同表位的结合具有特异性，则二价分子可以是单特异性的。在某些实施方式中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可以是单特异性的。在某些实施方式中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上是相同的(即具有相同的序列)，或在结构上是不同的(即具有不同的序列，尽管具有相同的特异性)。
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，则二价也可以是双特异性的。这也适用于多价分子。例如，当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性的，而第三结合位点对第二抗原(或表位)具有特异性时，则三价分子可以是双特异性的。
表位竞争性抗体
在另一方面，本公开提供了与本文提供的抗体或其抗原结合片段所结合的相同表位结合的抗体。在另一方面，本公开提供了与本文提供的抗体或其抗原结合片段竞争与hCD4结合的抗体。
如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的抗原上的原子或氨基酸的特定基团。表位可以包括直接接触抗体的特定氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。本领域的技术人员应认识到，有可能在无过度实验的情况下，通过确定抗体与本公开的抗体(例如杂交瘤/嵌合或人源化抗体2B6、29B7、33E12、11E12、10C2、MT412及其本文提供的任何嵌合和人源化变体)是否竞争与CD4抗原多肽结合，来确定二者是否结合相同或重叠或相邻的表位。
如本文所用，关于两种抗原结合蛋白(例如抗体)的术语“结合竞争”是指一种抗原结合蛋白阻断或减少另一种与抗原(例如人/小鼠CD4)的结合，如通过竞争性结合分析法所确定。竞争性结合分析法是本领域中众所周知的，包括例如直接或间接放射免疫分析法(RIA)、直接或间接酶免疫分析法(EIA)、Fortebio、竞争性ELISA分析法和夹心竞争分析法(参见例如Stahli等人,1983,《酶学方法》9:242-253)。通常，这种分析法涉及使用与固体表面或带有抗原的细胞结合的纯化抗原、未标记的测试抗体和标记的参考抗体。竞争性抑制是通过测定在测试抗体存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试抗体过量存在。如果两种抗体竞争与hCD4结合，则两种抗体与相同或重叠的表位结合，或者与另一种抗体结合的表位足够近的相邻表位结合，从而发生位阻。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将抑制(例如降低)测试抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或更多。
双特异性抗体
在某些实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。如本文所用，术语“双特异性”涵盖具有多于两个特异性的分子和具有多于两个特异性的分子，即多特异性。在某些实施方式中，本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段能够特异性结合hCD4的第一和第二表位，或者能够特异性结合hCD4和第二抗原。在某些实施方式中，hCD4的第一表位和第二表位彼此不同或不重叠。在某些实施方式中，双特异性抗体及其抗原结合片段可以同时与第一表位和第二表位结合。在某些实施方式中，第二抗原与hCD4不同。
在某些实施方式中，第二抗原是免疫相关靶标。如本文所用，免疫相关靶标涵盖参与免疫反应(任选地，细胞免疫反应)的产生、抑制或调节的生物分子。免疫相关靶标的一个实施例是在肿瘤细胞上表达的免疫检查点分子。
免疫检查点分子可以介导共刺激信号以增强免疫反应，或者可以介导共抑制信号以抑制免疫反应。免疫检查点分子的实施例包括例如PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83。在某些实施方式中，第二抗原包括PD-1、PD-L1、CTLA-4或LAG-3。
在某些实施方式中，第二抗原包括肿瘤抗原。如本文所用，“肿瘤抗原”是指肿瘤特异性抗原(例如，肿瘤细胞特有的抗原，通常在非肿瘤细胞上不存在)，以及肿瘤相关抗原(例如，在肿瘤和非肿瘤细胞中都存在，但在肿瘤细胞中表达方式不同，或在肿瘤微环境中发现)。肿瘤特异性抗原还可以包括肿瘤新抗原(例如，由于改变蛋白序列或在两个不相关序列之间产生融合蛋白的体细胞突变而在癌细胞中表达的抗原)。
肿瘤抗原的实施例包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、Claudin 18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
本文提供的双特异性抗体及其抗原结合片段可以是本领域中已知的合适格式。例如，示例性双特异性形式可以是双特异性双功能抗体、基于scFv的双特异性格式、IgG-scFv融合物、双可变域(DVD)-Ig、四源杂交瘤、杵臼、共同轻链(例如具有杵臼的共同轻链等)、BiTE、CrossMab、CrossFab、Duobody、SEEDbody、亮氨酸拉链、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(参见例如Brinkmann等人2017,《单抗》(Mabs),9(2):182-212)。双特异性分子可以是对称或不对称的架构。
本文提供的双特异性抗体和抗原结合片段可以用本领域中已知的任何合适的方法制备。
在一个实施方式中，将两个具有不同抗原特异性的免疫球蛋白重链-轻链对在宿主细胞中共表达，以重组的方式产生双特异性抗体(参见例如Milstein和Cuello,《自然》,305:537(1983))，然后通过亲和色谱法纯化。
缀合物
在一些实施方式中，抗hCD4抗体及其抗原结合片段连接至一个或多个缀合物部分。缀合物是可以连接至抗体或其抗原结合片段的部分。据设想，多种缀合物可以连接至本文提供的抗体或抗原结合片段(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《微生物学和免疫学的贡献》(Contributions to Microbiology and Immunology),J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编),Carger Press,New York,(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、缔合、掺合或添加等方法与抗体或抗原结合片段连接。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段通过连接子与一个或多个缀合物连接。在某些实施方式中，连接剂是腙连接子、二硫连接子、双官能连接子、二肽连接子、葡萄糖苷酸连接子、硫醚连接子。
在某些实施方式中，本文所公开的抗hCD4抗体和抗原结合片段可以被工程化以在表位结合部分之外含有特异性位点，所述位点可用于与一个或多个缀合物结合。例如，这样的位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与缀合物的共价连接。
缀合物可以是清除调节剂、治疗剂(例如化疗剂)、毒素、放射性同位素、可检测标记(例如镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)、药代动力学调节部分、DNA-烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、其它抗癌药物，如雄激素受体抑制剂。
可检测标记的实施例可以包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明(rhodamine)、丹酰(dansyl)、藻红蛋白(phycoerythrin)或德克萨斯红(Texas Red))、酶-底物标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同种型、其它镧系元素、发光标记、发色部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/亲和素、DNA分子或检测用金。
放射性同位素的实施例可包括123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P。放射性同位素标记的抗体可用于受体靶向成像实验。
在某些实施方式中，缀合物可以是药代动力学调节部分，如PEG，其有助于增加抗体的半衰期。其它合适的聚合物包括如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。
在某些实施方式中，缀合物可以是纯化部分，如磁珠或纳米颗粒。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文提供的抗hCD4抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。
用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分或其各种组合。
合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在包含如本文所提供的抗体或抗原结合片段和缀合物的组合物中包含一种或多种抗氧化剂如蛋氨酸，可以降低抗体或抗原结合片段的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而提高了抗体的稳定性并最大限度地延长了保存期。因此，在某些实施方式中，提供了包含一种或多种如本文所公开的抗体或抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如蛋氨酸的组合物。还提供了通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如蛋氨酸混合来防止如本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长其保存期和/或提高其功效的方法。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可包括例如水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride)；悬浮剂和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可添加至多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。合适的赋形剂可包括例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精等药剂。
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释制剂或粉末。口服制剂可包括标准载体，如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合生成液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括准备用于注射的无菌和/或无热原质溶液；准备在临使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉，包括皮下片剂；准备用于注射的无菌悬浮液；准备在临使用前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；以及无菌和/或无热原质乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。
在某些实施方式中，无菌冻干粉是通过将如本文所公开的抗体或抗原结合片段溶解于合适的溶剂中来制备。溶剂可含有改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂可含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，pH值约为中性。随后在本领域技术人员已知的标准条件下对溶液进行无菌过滤，然后进行冻干，得到所需制剂。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗hCD4抗体或其抗原结合片段或其组合物。用高于一个剂量或一组剂量所需的少量(例如约10％)过量填充小瓶是可以接受的，以便于准确地抽取样品和准确地给药。冻干粉可以在适当的条件下储存，例如在约4℃至室温下储存。
用注射用水重构冻干粉提供了用于肠胃外施用的制剂。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原质水或其它合适的液体载体添加至冻干粉中。精确的量取决于给定的所选治疗方法，并且可以凭经验确定。
在某些实施方式中，药物组合物还包含第二治疗剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂可以是治疗癌症的药剂(即抗癌剂)，例如化学治疗剂、抗癌药物(例如mTOR抑制剂)、放射疗法、免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)、抗血管生成剂(例如VEGFR的拮抗剂，如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)、靶向疗法(例如T细胞募集抗体)、细胞疗法、基因治疗剂、激素治疗剂、细胞因子、姑息治疗、治疗癌症的手术(例如肿瘤切除术)、或一种或多种止吐药或针对化学疗法引起的并发症的其它治疗剂。抗血管生成剂可以阻断支持肿瘤生长的血管的生长。一些抗血管生成剂靶向VEGF或其受体VEGFR。抗血管生成剂的实施例包括但不限于阿西替尼(Axitinib)、贝伐单抗(Bevacizumab)、卡博替尼(Cabozantinib)、依维莫司、来那度胺(Lenalidomide)、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinibmesylate)、帕唑帕尼(Pazopanib)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、瑞格非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、沙利度胺(Thalidomide)、凡德他尼(Vandetanib)和阿柏西普(Ziv-aflibercept)。
在某些实施方式中，第二治疗剂包括T细胞募集抗体，例如CD19/CD3双特异性抗体。CD19/CD3双特异性抗体可以本领域中已知的任何格式设计，如双特异性T细胞衔接子(BiTE)格式(Nicola等人,《血液》2018年4月5日；131(14):1522-1531)和单链Fv-Fc格式(Hannah等人,《血液》.2018年8月2日；132(5):521-532)。示例性CD19/CD3双特异性抗体包括但不限于博纳吐单抗(Blinatumomab)(Nicola等人,《血液》2018年4月5日；131(14):1522-1531)和AFM11(Uwe等人,《单抗》2015；7(3):584-604.)。
在某些实施方式中，第二治疗剂包含免疫检查点抑制剂，其选自由以下组成的组：PD-1抗体、PD-L1抗体、PD-L2抗体、LAG-3抗体、TIM-1抗体、CTLA-4抗体、VISTA抗体、B7-H2抗体、B7-H3抗体、B7-H4抗体、B7-H抗体、ICOS抗体、HVEM抗体、CD160抗体、gp49B抗体、PIR-B抗体、KIR家族受体抗体、TIM-1抗体、TIM-4抗体、BTLA抗体、SIRPα(CD47)抗体、CD4抗体、284(CD244)抗体、B7.1抗体、B7.2抗体、ILT-2抗体、ILT-4抗体、TIGIT抗体和A2aR抗体。在某些实施方式中，第二治疗剂包含mTOR抑制剂，其选自由以下组成的组：坦罗莫司(CCI-779)或其药物等效物、类似物、衍生物或盐，依维莫司(RAD001)或其药物等效物、类似物、衍生物或盐，以及雷帕霉素或其药物等效物、类似物、衍生物或盐。
在某些实施方式中，第二治疗剂管理或治疗至少一种与癌症相关的并发症。
多核苷酸和重组方法
在另一方面，本公开提供了编码抗hCD4抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸。如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志》260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,《分子细胞探针》(Mol.Cell.Probes)8:91-98(1994))。
在某些实施方式中，分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO:9、10、19、20、29、30、39、40、49、50、59和60中所示的一个或多个核苷酸序列，和/或其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列，和/或其仅具有简并取代的变体，并编码本文提供的示例性抗体的可变区。
编码单克隆抗体的DNA使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地与编码抗体的重链和轻链的基因结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码DNA也可以通过合成方法获得。
本公开提供了包含本文提供的分离的多核苷酸的载体(例如表达载体)。在某些实施方式中，本文提供的表达载体包含编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、至少一个与多核苷酸序列可操作地连接的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记。载体的实施例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入宿主细胞中进行克隆或基因表达。用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌；和链霉菌属(Streptomyces)。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗hCD4抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是最常用的。然而，多种其它属、种和菌株在本文中是常用且有用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁维雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
本文提供的用于表达糖基化抗体或抗原片段的合适的宿主细胞来源于多细胞生物，如无脊椎动物细胞，例如植物和昆虫细胞。已经鉴定出多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的相应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且此类病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，人们对脊椎动物细胞的兴趣最大，脊椎动物细胞的培养繁殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实施例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞；Graham等人,《普通病毒学杂志》(J.Gen Virol.)36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学》(Biol.Reprod.)23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬科动物肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报》(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。在一些优选实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养的细胞系，如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。
用上述抗hCD4抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在经适当改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一个实施方式中，抗体可通过本领域中已知的同源重组产生。
用于产生本文提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等人,《酶学方法》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学》(Anal.Biochem.)102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再颁专利30,985中所述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充剂。培养条件，如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对普通技术人员来说将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌至培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等人,《生物技术》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简而言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下，在约30分钟内将细胞糊解冻。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，来自此类表达系统的上清液一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置进行浓缩。蛋白酶抑制剂如PMSF可以包括在任何前述步骤中，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗hCD4抗体和抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白质A用于抗体及其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。蛋白质G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学杂志》(EMBO J.)5:1567 1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质，如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，比琼脂糖可以实现更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3域时，BakerbondABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱焦聚、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回收的抗体。
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH值在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH值疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度下进行(例如约0-0.25M盐)。
使用方法
在一个方面，本公开提供了本文提供的抗体的治疗用途。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗有需要的受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括：施用治疗有效量的本文提供的抗体或抗原结合片段和/或本文提供的药物组合物，从而治疗CD4相关疾病或病况。
CD4相关疾病或病况可以是将受益于对CD4表达细胞(如CD4+T细胞，尤其Treg)的CDC和/或ADCC活性的疾病或病况。CD4相关疾病或病况可以是癌症、适应性免疫疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、复发性或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞性白血病)、骨髓瘤和淋巴瘤。
本公开还提供了一种检测样品中CD4的存在或量的方法，其包括使所述样品与本文提供的抗体或其抗原结合片段接触，并确定所述样品中CD4的存在或量。
本文还提供了一种诊断受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括：a)从所述受试者获得样品；b)使从所述受试者获得的样品与本文提供的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定所述样品中CD4的存在或量；以及d)将所述CD4的存在或量与所述受试者的CD4相关疾病或病况的存在或状态相关联。
在另一方面，本公开还提供了一种消除有需要的受试者体内CD4表达细胞的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在某些实施方式中，CD4表达细胞是CD4+T细胞，任选地是调节性T细胞(Treg)。
如本文所用，术语“CD4+T细胞”被定义为表面表达CD4的胸腺源性淋巴细胞，其参与多种细胞介导的免疫反应。
CD4+T细胞在实现对病原体的经调节的有效免疫反应中至关重要。幼稚CD4+T细胞被激活并分化成特定的亚型，这主要取决于微环境的细胞因子环境。已经鉴定出CD4+T细胞的几个子集，包括T辅助细胞1和T辅助细胞2、T辅助细胞9、T辅助细胞17、滤泡性辅助T细胞(Tfh)和调节性T细胞(Treg)，这些子集中的每一个都表达细胞表面受体、转录因子和分泌的细胞因子的独特组合(Luckheeram RV等人,(2012)《临床与发育免疫学》(Clin DevImmunol)2012:925135)。Th1细胞负责控制细胞内病原体，如病毒和一些细菌(Prete GD等人,(1992)《过敏》(Allergy)47:450)。Th2细胞是消除大型细胞外生物的关键(Prete GD等人,(1992)《过敏》47:450)。Th9细胞参与防御寄生虫蠕虫感染(Rajamanickam A等人,(2016)《公共科学图书馆·被忽视的热带病》(PLoS Neglected Tropical Diseases)10:e0004317；Hosseini MAS等人,(2015)《国际流行病学研究杂志》(International Journalof Epidemiologic Research)2:233)。Th17对于针对细胞外细菌和真菌的免疫反应是重要的(Annunziato F等人,(2007)《实验医学杂志》(J Exp Med),204:1849；Weaver CT,(2006)《免疫》24:677)。Tfh细胞是促进生发中心B细胞的存活和增殖以及支持生发中心发育所必需的(Ise W等人,(2018)《免疫》48:702；Mints MA等人,(2020)《免疫学评论》(Immunological Reviews)296:48)。
上述效应T细胞子集的活性可以部分地由称为调节性T细胞(Treg)的CD4+T细胞的独特亚群来平衡。Treg专门维持稳态和自我耐受，限制免疫反应的发展和进展(Vignali DA等人,(2008)《自然综述免疫学》(Nature Reviews Immunology)8:523)。在某些实施方式中，CD4表达细胞是Treg。
如本文所用，术语“调节性T细胞”或可互换使用的术语“Treg”是指以表达CD4、CD25和/或叉头家族转录因子FoxP3为特征的独特的T淋巴细胞群。它是组成性表达CD25和FoxP3转录因子的CD4+T细胞的少数亚群。Treg具有通过抑制如CD8+T细胞、NK和NKT细胞、B细胞和抗原呈递细胞(APC)等多种免疫细胞的活化、增殖和效应功能所赋予的免疫抑制特性。关于具体的实施例，Treg抑制卵巢癌中的肿瘤特异性T细胞，并且肿瘤相关的Treg数目的增加通常与存活时间的缩短有关(Curiel等人,2003,《自然·医学》(Nat.Med.)9:562-567；Wolf等人,2005,《临床癌症研究》11:8326-8331和Curiel等人,2006,会议摘要,Can.Immunity 6增刊1,第20页)。对结肠直肠癌(Pages等人,2005,《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)353:2654-2666)、肺癌(Woo等人,2002,《免疫学杂志》168:4272-4276)和多形性神经胶母细胞瘤(Andaloussi等人,2006,《神经肿瘤学》(Neuro-oncol.)8:234-243)也进行了类似观察。
Treg还对某些病毒和寄生虫感染的受试者的免疫力产生负面影响。例如，在逆转录病毒感染的受试者、利什曼原虫(Leishmania)和疟疾小鼠模型以及丝虫感染小鼠模型中已经检测到Treg的积累和由此产生的免疫抑制(Iwashiro等人,2001,《美国国家科学院院刊》98:9226-9230；Belkaid等人,《自然》420:502；Hisaeda等人,2004,《自然·医学》10:29和Taylor等人,2005,《免疫学杂志》174:4924-4933)。研究进一步表明，通过抗体疗法减少Treg的数目导致寄生虫数目急剧减少(Taylor等人,2005,《免疫学杂志》174:4924-4933)。
如本文所用，关于Treg的术语“消除(eliminating/eliminates/eliminated/elimination)”是指降低或减少Treg的量或百分比，或完全耗尽Treg，或抑制/减少Treg的产生或功能。Treg的百分比可以通过本领域中已知的任何方法，如流式细胞术来测定。Treg的功能可以通过本领域中已知的任何方法测量，例如通过测量Treg表达的免疫抑制性细胞因子和分子的水平，例如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡1配体1(PD-L1)、转化生长因子β(TGF-β)、核因子κΒ配体的受体激活剂(RANKL)、LAG-3、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR；TNFRSF18糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR；TNFRSF18)和/或IL-10。这些分子协同作用以诱导免疫耐受并促进肿瘤进展和转移(参见例如WO2011109789A2)。Treg的功能也可以通过分析其对例如CD8淋巴细胞增殖的抑制作用来测量。
在另一方面，本公开还提供了一种增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。如本文所用，术语“肿瘤微环境”是指围绕肿瘤细胞的组织、细胞和环境(例如细胞外环境)。肿瘤微环境可以包含基质细胞，如成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、脂肪细胞和骨髓间充质基质细胞(MSC)。在某些实施方式中，肿瘤微环境还包含多种免疫细胞，如效应T细胞(例如CD8+效应T细胞)和Treg。
在恶性肿瘤的环境中，Treg细胞可以抑制抗癌免疫力，从而阻碍瘤形成的保护性免疫监视，阻碍有效的抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤的发展和进展(Baba J等人,(2012)《血液》120:2417；Togashi Y等人,(2019)《自然评论临床肿瘤学》16:356)。肿瘤微环境中Treg的增加与多种癌症的更差预后相关(Shang B等人,(2015)《科学报告》(Scientific Rep)5:15179；Saleh R等人,(2020)《癌症通讯》(Cancer Letters)490:174)。已经证明靶向Treg的治疗有效增强肿瘤微环境的免疫原性(Togashi Y等人,(2019)《自然评论临床肿瘤学》16:356；Onizuka S等人,(1999)《癌症研究》59:3128；Rech AJ等人,(2012)《科学·转化医学》(Sci.Transl Med)4:134；Sugiyama D等人,(2013)《美国国家科学院院刊》110:17945；Kurose K等人,(2015)《临床癌症研究》21:4327)。
研究表明，基于CD4抗体的Treg细胞耗竭增强了mTOR抑制刺激的抗肿瘤免疫记忆(Wang Y等人,(2014)《癌症研究》74:2217；Kim HL,(2014)《肿瘤免疫学》(OncoImmunology)3:e29081)，其与CD4或CD4抗体疗法的组合介导了非常有效的CD8依赖性协同作用，导致携带神经母细胞瘤的小鼠的无瘤存活期显著延长(Rego V等人,(2017)《科学报告》7:14049)。在几项针对难治性皮肤T细胞淋巴瘤和类风湿性关节炎的嵌合αCD4抗体试验中，实现了近乎完全的CD4耗竭，并且没有观察到严重的感染或其它剂量相关的毒性(Prinz JC等人,(1996)《美国皮肤病学会杂志》(J Am Acad Dermatol)34:244；Moreland LW等人,(1994)《关节炎与风湿病》(Arthritis&Rheumatism)37:834；Moreland LW等人,(1994)《关节炎与风湿病》38:1581)。因此，通过向受试者施用本文提供的抗CD4抗体或其抗原结合片段来耗竭Treg可以增强受试者的肿瘤微环境的免疫原性。
在另一方面，本公开还提供了一种提高癌症疗法(例如化学疗法、免疫疗法、放射疗法)在有需要的受试者体内的疗效的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。如本文所用，术语“免疫疗法”是指刺激免疫系统对抗疾病如癌症或以一般方式增强免疫系统的一种疗法。免疫疗法包括被动免疫疗法，通过递送具有已建立的肿瘤免疫反应性的药剂(如效应细胞)，可以直接或间接介导抗肿瘤作用，并且不一定依赖于完整的宿主免疫系统(如抗体疗法或CAR-T细胞疗法)。免疫疗法还可以包括主动免疫疗法，其中治疗依赖于体内刺激内源性宿主免疫系统，通过施用免疫反应调节剂对病变细胞作出反应。免疫疗法的实施例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。
检查点调节剂可以干扰癌细胞避免免疫系统攻击的能力，并帮助免疫系统对肿瘤做出更强烈的反应。免疫检查点分子可以介导共刺激信号以增强免疫反应，或者可以介导共抑制信号以抑制免疫反应。检查点调节剂的实施例包括例如PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83的调节剂。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂包括PD-1/PD-L1轴抑制剂。
过继性细胞转移，这是一种试图增强T细胞对抗癌症的天然能力的治疗。在这种治疗中，T细胞取自患者，并在体外扩增和激活。在某些实施方式中，T细胞在体外被修饰为CAR-T细胞。在体外大批量培养抗癌最活跃的T细胞或CAR-T细胞2至8周。在此期间，患者将接受如化学疗法和放射疗法等治疗，以降低身体的免疫力。在这些治疗后，体外培养的T细胞或CAR-T细胞将被回给予患者。在某些实施方式中，免疫疗法是CAR-T疗法。
细胞因子疗法也可以用于增强肿瘤抗原向免疫系统的呈递。用于治疗癌症的两种主要类型的细胞因子是干扰素和白细胞介素。细胞因子疗法的实施例包括但不限于干扰素如干扰素-α、-β和-γ，集落刺激因子如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF，胰岛素生长因子(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12、肿瘤坏死因子如TNF-α和TNF-β或其任何组合。
溶瘤病毒是可以杀死癌细胞的经遗传修饰的病毒。溶瘤病毒可以特异性地感染肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞溶解，随后释放大量的肿瘤抗原，触发免疫系统靶向并消除具有此类肿瘤抗原的癌细胞。溶瘤病毒的实施例包括但不限于塔力拉赫(talimogenelaherparepvec)。
治疗性疫苗通过增强免疫系统对癌细胞的反应来对抗癌症。治疗性疫苗可以包含非致病性微生物(例如，牛分枝杆菌卡介苗，BCG)、靶向肿瘤细胞的经遗传修饰的病毒或一种或多种免疫原性组分。例如，BCG可以用导管直接插入膀胱，并可引起针对膀胱癌细胞的免疫反应。
Bedi等人(参见WO2011109789A2)已经表明，肿瘤促进Treg在其微环境中的积累，这抑制了上述一些免疫疗法(例如疫苗接种、化学疗法)对肿瘤反应性免疫反应的引发。Bedi等人还表明，通过Treg介导的肿瘤诱导性免疫抑制是癌症对化学疗法和肿瘤靶向抗体抗性的关键决定因素。如先前研究所证实，用抗CD4抗体消除CD4表达细胞可以导致Treg消除，从而增强肿瘤特异性免疫力(参见例如US2017/0007698)。因此，施用本文提供的抗CD4抗体或其抗原结合片段可有效地消除CD4表达细胞(包括Treg)，并且能够增强癌症疗法的疗效。
在某些实施方式中，本文提供的方法还包括施用第二治疗剂。第二治疗剂可以包括抗癌剂，如mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂或T细胞募集抗体。
在某些实施方式中，T细胞募集抗体包括CD19/CD3双特异性抗体。
在某些实施方式中，第二治疗剂包括T细胞募集抗体，例如CD19/CD3双特异性抗体。CD19/CD3双特异性抗体可以本领域中已知的任何格式设计，如双特异性T细胞衔接子(BiTE)格式和单链Fv-Fc格式(Hannah等人,《血液》.2018年8月2日；132(5):521-532)。示例性CD19/CD3双特异性抗体包括但不限于博纳吐单抗和AFM11(Uwe等人,《单抗》2015；7(3):584-604.)。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的CD4相关疾病或病况的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于消除有需要的受试者的CD4表达细胞的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于提高免疫疗法在有需要的受试者体内的疗效的药物中的用途。
施用途径和剂量方案
本文提供的抗体或抗原结合片段可以治疗有效剂量施用。本文提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏性、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。本领域普通技术人员(例如医生或兽医)可如这些和其它情况或要求所指示按比例减少或增加剂量。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。在某些实施方式中，施用剂量可在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。
本文所公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域中已知的任何途径施用，如肠胃外(例如皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
在不希望受任何理论束缚的情况下，虽然已证明消除CD4表达细胞(例如Treg)可以增强癌症疗法的疗效(参见例如US 2017/0007698；和WO2011109789A2)，但在刺激由特定肿瘤和/或在特定条件下诱导的免疫力之前消除或耗尽CD4(如由例如IFN-γ水平升高所指示)可能会导致CD8记忆形成不良或甚至被抑制，并加快肿瘤生长(参见例如Fukui等人,《癌症免疫与免疫疗法》(Cancer Immunol Immunother)(2006)55:538-546；和US2017/0007698)。因此，本文提供的抗CD4抗体或其抗原结合片段优选在确认受试者具有肿瘤诱导的免疫力后，向有需要的受试者施用。
受试者的肿瘤诱导的免疫力可以通过本领域中已知的任何方法确定，例如通过将免疫刺激水平(例如，受试者中IFN-γ的血清水平)与免疫刺激的参考水平(例如，IFN-γ的参考血清水平)进行比较。如本文所用，关于免疫刺激的术语“参考水平”是指允许进行比较的基准水平。参考水平可由本领域技术人员根据所需目的来选择。确定合适的参考水平的手段是本领域技术人员已知的，例如，参考水平可以根据经验、现有知识或从临床研究中收集的数据来确定。例如，免疫刺激的参考水平可以是具有相同性别和可比体重的正常健康人的免疫刺激水平，并且任选地具有同样可比的其它因素，如身体状况、药物史、饮食、睡眠等。
组合疗法
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可单独施用或与一种或多种额外的治疗手段或药剂组合施用，所述治疗手段或药剂可基于待治疗的疾病或病况来选择。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可与以下第二抗癌药物组合施用以治疗癌症：例如化疗剂、抗癌药物(例如mTOR抑制剂)、放射疗法、免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因治疗剂、激素治疗剂、细胞因子、姑息治疗、治疗癌症的手术(例如肿瘤切除术)、一种或多种止吐药、针对化学疗法引起的并发症的其它治疗剂或癌症患者的饮食补充剂。
抗血管生成剂可以阻断支持肿瘤生长的血管的生长。一些抗血管生成剂靶向VEGF或其受体VEGFR。抗血管生成剂的实施例包括但不限于阿西替尼、贝伐单抗、卡博替尼、依维莫司、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、帕唑帕尼、雷莫芦单抗、瑞格非尼、索拉非尼、舒尼替尼、沙利度胺、凡德他尼和阿柏西普。
“靶向疗法”是一种作用于与癌症相关的特定分子的疗法，所述特定分子如存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中的特定蛋白质或癌细胞中含量更多的特定蛋白质，或癌症微环境中有助于癌症生长和生存的靶分子。靶向疗法将治疗剂靶向肿瘤，从而使正常组织免受治疗剂的影响。
靶向疗法可以靶向例如酪氨酸激酶受体和核受体。此类受体的实施例包括erbB1(EGFR或HER1)、erbB2(HER2)、erbB3、erbB4、FGFR、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、雌激素受体(ER)、核受体(NR)和PR。
靶向疗法可以靶向酪氨酸激酶或核受体信号级联中的分子，如Erk和PI3K/Akt、AP-2α、AP-2β、AP-2γ、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、PTEN、p53、p19ARF、Rb、Apaf-1、CD-95/Fas、TRAIL-R1/R2、胱天蛋白酶8、叉头盒03A、MDM2、IAPs、NF-kB、Myc、P13K、Ras、FLIP、调节蛋白(HRG)(也称为gp30)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、Bad、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bid和EGL-1。
靶向疗法还可以靶向肿瘤相关的配体，如雌激素、雌二醇(E2)、孕激素、雌激素、雄激素、糖皮质激素、催乳素、甲状腺激素、胰岛素、P70 S6激酶蛋白(PS6)、存活素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、Neu分化因子(NDF)、转化生长因子α(TGF-α)、IL-1A、TGF-β、IGF-1、IGF-II、IGFBP、IGFBP蛋白酶和IL-10。
在另一方面，本公开提供了试剂盒或药物组合物，其包含可以配制在一种组合物中或配制在不同组合物中的本文提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。可以进一步包括使用或适应症的说明书，以提供关于如何进行组合疗法的信息。
实施例
虽然已经参照具体实施方式(其中一些是优选实施方式)特别显示和描述了本公开，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式上和细节上的各种改变。
实施例1：小鼠免疫接种和针对人CD4的小鼠抗体的产生
为了产生针对人CD4的抗体，通过PCR获得编码与组氨酸标签(hCD4-HisTag)、小鼠Fc(hCD4-mFc)和人Fc标签(hCD4-hFc)融合的hCD4胞外域开放阅读框的cDNA，并分别亚克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen目录号：V-790)中。在freestyle 293细胞中瞬时表达后，hCD4-HisTag用NTA柱(GE healthcare)纯化，hCD4-mFc和hCD4-hFc用蛋白质A柱(GEhealthcare)纯化。
用以等体积的弗氏完全/不完全佐剂乳化的重组hCD4-mFc(100μg/小鼠)，每2周对BALB/c小鼠进行皮下免疫，持续6周。融合前三天，小鼠通过静脉内注射不含佐剂的抗原增强免疫。将免疫小鼠的脾细胞(1×108)与SP2/0骨髓瘤细胞(1.5×107)用PEG Hybri-Max(Sigma Inc.，目录号：7181)融合。融合后，将细胞以每孔0.1ml分配至96孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中培育。在第1天，向各孔中添加额外0.1ml含有血清和HAT加2×甲氨蝶呤的培养基。在第3天和第7天，用0.1ml新鲜HT培养基替换各孔中的0.1ml培养基。筛选通常发生在第8-9天之间，并通过ELISA测试各孔的培养上清液的hCD4-hFc结合。进行亚克隆以获得产生单克隆抗体的个别杂交瘤克隆。对每个杂交瘤进行多轮(3-4轮)限制性稀释。对于每一轮亚克隆，通过ELISA结合分析测试克隆。
实施例2：基于结合和基因报告分析选择抗hCD4杂交瘤抗体
通过ELISA测量杂交瘤抗体与人CD4-hFc之间的结合相互作用。将96孔板(Costar，目录号：9018)在4℃下用100μL含2μg/ml CD4-hFc(CrownBio)的PBS缓冲液(Hyclone，目录号：SH30256.01B)涂布过夜。抽吸各孔，通过添加200μL含有1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA，Roche，目录号：738328)的阻断缓冲液并在37℃下培育1小时来阻断非特异性结合位点。在将各板用含有0.05％(v/v)Tween20(Sigma，目录号：P1379)的PBS缓冲液洗涤三次后，向每个孔中添加100μL杂交瘤上清液或在阻断缓冲液中稀释的一系列浓度的纯化抗体(从20μg/mL开始)，并在室温下培育1小时。将各板洗涤并用100μL/孔含山羊抗小鼠IgG(Thermo，目录号：31432)的阻断缓冲液培育60分钟。在洗涤各板后，添加100μL/孔的底物溶液TMB(eBioscience，目录号：00-4201-56)，将各板在室温下培育2分钟，随后添加100μL/孔的2NH2SO4以停止反应。使用SpectraMax Plus微板读取器(Molecular Devices)在450nm处监测比色信号。对于纯化抗体，使用GraphPad Prism5分析数据以计算EC50。
使用稳定表达CD4的293T细胞系(CD4-293T)进行抗CD4抗体的细胞结合分析。将2*10^5个CD4-293T细胞添加至96孔板的各孔中，并在4℃下用指定的杂交瘤上清液或连续浓度的纯化抗体(从20μg/mL开始)培育1小时。在细胞用FACS缓冲液洗涤三次后，将二级抗体(PE山羊抗小鼠：1:200)以100μl/孔添加至细胞，并在4℃下培育40分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞三次并通过FACS阵列分析。用GraphPad Prism 5计算纯化抗体的结合EC50。
将ELISA和FACS测试中CD4结合阳性的杂交瘤克隆用基因报告分析进一步筛选。在96孔板中，以1*10^4/孔的密度接种40μL CD4-293T细胞，并用来自CD4-hFc结合阳性杂交瘤克隆的20μL培养基在37℃、5％CO2下培育30分钟。然后向各孔中添加含1*10^5个Jurkat-CD16a-NFAT-Luc细胞(ADCC报告T细胞系)的40μL培养基，并继续培养4小时，随后添加100μLBright-Glo重构试剂(Promega，目录号：E2620)。用EnVison多标记板读取器(PerkinElmer)监测各孔的发光信号。发现在基因报告分析中杂交瘤克隆2B6、29B7、33E12、11E12和10C2的上清液可以诱导NFAT激活和荧光素酶表达，表明这些杂交瘤克隆可以诱导ADCC效应(图1)。然后使这些杂交瘤克隆适应于无血清培养基，并使用蛋白质A柱(GE healthcare)从上清液中纯化抗体。用ELISA定量这些抗体与人CD4的结合(图2，表4)。
表4.通过ELISA的杂交瘤抗体与hCD4结合的EC50
抗体 33E12 10C2 2B6 11E12 29B7
EC50(ng/ml) 33.95 36.78 26.13 26.98 33.39
实施例3：抗hCD4杂交瘤抗体基因克隆、嵌合抗体的产生和表征
抗hCD4杂交瘤克隆33E12、10C2、2B6、11E12、29B7的总RNA通过RNeasy Mini Kit(Qiagen，目录号：74104)分离，并用作模板以根据制造商的说明，用
Figure BDA0003010329740000501
II逆转录酶(Life Technology，目录号：18064-14)合成第一链cDNA。然后使用简并的小鼠IgG引物在50μl体积的反应混合物中对cDNA产物进行PCR(Kettleborough CA等人,(1993)《欧洲免疫学杂志》(European Journal of Immunology)23:206；Strebe N等人,(2010)《抗体工程》(Antibody Engineering)1:3)。反应在S1000TM热循环仪(Bio-Rad，目录号：184-2000)中进行以下30个循环：94℃，1.5分钟变性；50℃，1分钟退火；72℃，1分钟合成。在第30个循环结束时，将反应混合物在72℃下再培育7分钟以进行延伸。在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖/Tris-硼酸凝胶中对PCR混合物进行电泳。从凝胶切下具有预期大小的DNA片段(重链和轻链约450bp)并纯化。将3μl纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体(Takara，目录号：D101A)中，并转化到One
Figure BDA0003010329740000502
TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen，目录号：C4040-03)中。使用通用的M13正向引物和反向引物通过菌落PCR筛选克隆，从每个反应中选择5个阳性克隆使用M13正向引物和M13反向引物进行双向DNA测序。抗体33E12、10C2、2B6、11E12和29B7的重链和轻链可变区序列列于表2。
由JL3A3.13细胞系(ATCC，目录号：PTA-6196)产生的MT412抗体是一种嵌合抗体，其在临床上对CD4+T细胞耗竭和免疫原性具有强效活性(Prinz JC等人,(1996)《美国皮肤病学会杂志》(J Am Acad Dermatol)34:244；Moreland LW等人,(1994)《关节炎与风湿病》37:834；Moreland LW等人,(1994)《关节炎与风湿病》38:1581)。通过下一代测序确定抗体MT412的重链和轻链可变区序列(表2)。
33E12、10C2、2B6、11E12、29B7和MT412嵌合轻链分别由小鼠VL区的PCR扩增cDNA与人κ链恒定区(SEQ ID NO:62)连接来构建，其嵌合重链由小鼠VH区的cDNA与含有S298A/E333A/K334A突变的人IgG1恒定区连接来构建(Shields RL等人,(2001)《生物化学杂志》276:6591)。使用经设计以在轻链和重链上均添加前导序列的PCR引物修饰小鼠cDNA序列的5′端，将编码各嵌合抗体的轻链和重链的DNA分别亚克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen目录号：V-790)中。
具有3A突变的IgG1(SEQ ID NO:67)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
免疫球蛋白κ链恒定区(SEQ ID NO:68)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
用100μg每种嵌合重链和轻链表达质粒转染Freestyle 293细胞(200mL，1*10^6/mL)，并在37℃下培养6天。然后用蛋白质A柱(GE healthcare)纯化上清液中的嵌合抗体。使用上文实施例2中所述的类似方法，通过ELISA(图3，表5)和FACS(图4，表6)测量嵌合抗体与CD4的结合。
表5.通过ELISA的嵌合抗体与hCD4结合的EC50
Figure BDA0003010329740000511
表6.通过FACS的嵌合抗体与hCD4结合的EC50
Figure BDA0003010329740000521
基于通过乳酸脱氢酶(LDH)测量评估的自然杀伤(NK)细胞对CD4-293T细胞的杀伤作用，评定了CD4抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力(Broussas M等人,(2013)《分子生物学方法》(Methods Mol Biol)988:305)。将悬浮在CTL测试培养基(Cellular Technology Limited)中的CD4-293T(2*10^4个细胞/孔)和人NK细胞(2*10^5个细胞/孔)与连续稀释的CD4抗体(10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL)一起接种在96孔板中。在37℃、5％CO2中培育4小时后，通过使用细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)(RocheApplied Science)测量细胞培养上清液的LDH活性。如制造商的方案中所述，计算细胞毒性百分比。如图5所示，嵌合抗体33E12、10C2、2B6、11E12、29B7和MT412以剂量依赖性方式引起CD4-293T的ADCC。
实施例4：抗体人源化设计、人源化抗体产生和表征
2B6、29B7和MT412抗体使用如美国专利第5,225,539号中所述的CDR移植方法进行人源化。通过搜索NCBI数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi，将鼠抗体2B6、29B7和MT412的轻链和重链可变链序列与结构生物信息学研究协作组(RCSB)蛋白质数据库中可获得的序列进行比较。基于序列同源性最高的VH和VL结构，分别生成抗体2B6、29B7和MT412的模型。
通过检索IMGT/Domain Gap Align 3D结构数据库http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi，获得与2B6、29B7和MT412小鼠抗体具有高序列同源性的人抗体生殖系。人生殖系抗体的框架用作模板，移植小鼠抗体VH和VL的互补决定区(CDR)。对于2B6，选择的模板人VH是IGHV4-59*11和IGHJ4*01的组合，选择的模板人VL是IGKV1-39*01和IGKJ2*01的组合。对于29B7，选择的模板人VH是IGHV1-3*01和IGHJ4*01的组合，选择的模板人VL是IGKV1-16*01和IGKJ2*01的组合。对于MT412，选择的模板人VH是IGHV7-4-1*02和IGHJ4*01的组合，选择的模板人VL是IGKV1-9*01和IGKJ2*01的组合。
前述模板人抗体的CDR氨基酸序列分别被小鼠2B6、29B7和MT412抗体的CDR的氨基酸序列取代。此外，将上述模板人抗体VH和VL的框架移植以小鼠2B6、29B7和MT412抗体的VH和VL的必需氨基酸序列，得到功能性人源化抗体。对于2B6、29B7和MT412的VH和VL，将前述模板人抗体的框架氨基酸的几个位点复原突变为小鼠2B6、29B7和MT412抗体中的相应氨基酸序列。对于人源化2B6抗体的轻链可变区，第4位的氨基酸从Met(M)突变为Leu(L)，第71位的氨基酸从Phe(F)突变为Tyr(Y)；而对于人源化2B6抗体的重链可变区，第27位的氨基酸从Gly(G)突变为Asp(D)，第30位的氨基酸从Ser(S)突变为Thr(T)，第47位的氨基酸从Trp(W)突变为Phe(F)，第48位的氨基酸从Ile(I)突变为Leu(L)，第71位的氨基酸从Val(V)突变为Arg(R)。对于人源化29B7抗体的轻链可变区，第46位的氨基酸从Ser(S)突变为Thr(T)，第47位的氨基酸从Leu(L)突变为Pro(P)，第69位的氨基酸从Thr(T)突变为Gln(Q)，第71位的氨基酸从Phe(F)突变为Tyr(Y)；而对于人源化29B7抗体的重链可变区，第27位的氨基酸从Tyr(Y)突变为Asp(D)，第28位的氨基酸从Thr(T)突变为Ser(S)，第29位的氨基酸从Phe(F)突变为Leu(L)，第30位的氨基酸从Thr(T)突变为Asn(N)，第48位的氨基酸从Met(M)突变为Ile(I)，第68位的氨基酸从Val(V)突变为Ala(A)，第70位的氨基酸从Ile(I)突变为Leu(L)，第72位的氨基酸从Arg(R)突变为Ala(A)，第74位的氨基酸从The(T)突变为Ile(I)。对于人源化MT412抗体的轻链可变区，第4位的氨基酸从Leu(L)突变为Met(M)，第87位的氨基酸从Tyr(Y)突变为Phe(F)；而对于人源化MT412抗体的重链可变区，第2位的氨基酸从Val(V)突变为Ile(I)。
人源化2B6抗体的可变轻链和可变重链的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NO:61和62。人源化29B6抗体的可变轻链和可变重链的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NO:63和64。人源化MT412抗体的可变轻链和可变重链的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NO:65和66。
合成编码人源化2B6、29B7和MT412抗体轻链和重链的DNA，并克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen，目录号：V-790)。用100μg每种人源化重链和轻链表达质粒转染Freestyle 293细胞(200mL，106/mL)，并在37℃下培养6天。然后用蛋白质A柱(GEhealthcare)纯化上清液中的人源化抗体。通过ELISA(图6，表7)和FACS(图7，表8)测量嵌合抗体与CD4的结合，并且所使用的方法与上文实施例2中所述的方法相似。
表7.通过ELISA的人源化抗体与hCD4结合的EC50
Figure BDA0003010329740000541
表8.通过FACS的人源化抗体与hCD4结合的EC50
Figure BDA0003010329740000542
还用PBMC评估了人源化CD4抗体诱导ADCC的能力。在96孔板中，将PBMC(2×10^5个细胞/孔)与一系列浓度的人源化2B6、29B7和MT412抗体(1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL)在37℃、5％CO2下培育4和24小时。然后将AF-488标记的CD4抗体(OKT4-AF488，OKT4抗体的结合表位与人源化2B6、29B7、MT412抗体不重叠)添加至各孔中，在4℃下培育1小时，并用FACS检测各孔中的活CD4+细胞。ADCC效应通过以下公式计算，显示在图8中：
ADCC％＝(1-在抗体存在下活CD4+细胞数/在抗体不存在下活CD4+细胞数)×100％
通过Biacore分析测量CD4和CD4抗体之间的结合动力学，所述分析在25℃下在Biacore T200仪器上进行。将蛋白质A(GE，目录号：29139131-AA)用10mM pH 5.0乙酸钠稀释，并使用胺偶联试剂盒(GE，BR10050)固定在CM5生物传感器芯片的参考和实验流动槽上至约15000RU。在每个循环开始时，将稀释的测试抗体(1.5μg/mL)注射到实验流动槽上1分钟以捕获。CD4-HisTag分析物系列通过用运行缓冲液将储备液稀释至100nM，然后在相同缓冲液中2倍连续稀释至0.78nM来制备。分析物在参考和实验流动槽上以30μL/min的流速连续注射3分钟。使运行缓冲液(具有0.05％P20的PBS)以30μL/min的流速流过10分钟。在每个循环结束时，通过以10μL/min的流速注入10mM pH 2.0甘氨酸-HCl缓冲液3分钟使生物传感器表面再生。对于每次分析物样品注射(即每个循环)，从实验生物传感器表面获得的结合反应通过减去从参考表面同时记录的反应，然后再减去单个参考运行缓冲液样品的反应来进行双参考。通过使用Biaevaluation软件将整个滴定系列的双参考传感图拟合到Langmuir模型(1:1)，同时确定缔合和解离速率常数(ka和kd)。解离常数KD由确定的速率常数通过方程KD＝kd/ka计算。嵌合和人源化抗CD4抗体与人CD4-HisTag的结合亲和力汇总于表9。
表9.嵌合和人源化抗CD4抗体的结合动力学
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
嵌合33E12 1.09E+06 0.004612 4.25E-09
嵌合10C2 1.60E+05 1.90E-04 1.19E-09
嵌合2B6 3.27E+05 1.22E-04 3.73E-10
嵌合11E12 9.87E+05 0.006182 6.26E-09
嵌合29B7 7.09E+05 5.98E-05 8.43E-11
嵌合MT412 5.86E+05 9.41E-04 1.61E-09
人源化2B6 5.20E+05 7.89E-05 1.52E-10
人源化29B7 1.03E+06 4.57E-04 4.44E-10
人源化MT412 1.11E+06 1.99E-03 1.80E-09
表10.本申请中提及或使用的序列
Figure BDA0003010329740000551
Figure BDA0003010329740000561
Figure BDA0003010329740000571
Figure BDA0003010329740000581
Figure BDA0003010329740000591
序列表
<110> 中美冠科生物技术（太仓）有限公司
<120> 新型抗CD4抗体
<130> 056211-8004CN01
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Tyr Ile Ser Phe Ala Asp Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Asp Asp Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly His Lys Leu Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Phe Ala Asp Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Asp Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Asp Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Asp Ile His Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gaagtgcagc ttcaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agcggttact ggaattggat ccggaagttc 120
ccaggacata aacttgagtt tttggggtac ataagtttcg ctgataccac taactacaat 180
ccatctctca aaagtcgagt ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gttcgacctg 240
cagttgaagt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatc actgtgcaag agatgattat 300
ggttattatg caatggacta ctggggtcaa ggaatatcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 10
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
gatatccact tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcatttgta gggcaagtca ggacattgac aattatttga actggtatca gctgaagcca 120
gatggaactc ttaaactcct gatctactac acatcaagac tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagaa tattctctca ccattagcaa cctggaacgt 240
gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacac ttcccacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Thr His Trp Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Gly Glu Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Asp Ser Thr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Arg Ala Asp Arg Ser Val Asp
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Ala Asp Ser Leu Asn Thr His
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Gly Glu Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Asp Ser Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 18
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Pro Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asp Arg Ser Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctgccga cagccttaat acccactgga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatcctt acactggttc tggtgaatac 180
agtcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca tatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga tcagcctgac atctgaggac tcagcagtct attactgtgc ctatgattcg 300
acaggtgcca tggactactg gggtcaggga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagaatcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aggtatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagacccc gatctatcgt gcagacagat cggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaggatatgg gaatttatta ttgtcaacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
Gln His Ser Trp Asp Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Arg Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Asp Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtat cactagctac 180
aacccatctc tcaaaagtcg attctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aaggctagac 300
agctcgggct acggtgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 30
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttacctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaggt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga ctttccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Ser Ser Tyr Trp Asn
1 5
<210> 32
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
000
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Asp Asp Phe Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 35
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
000
<210> 36
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
000
<210> 37
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 37
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly His Lys Leu Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Phe Ala Asp Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Asp Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Asp Phe Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 38
Asp Ile Tyr Val Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 39
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
gaagtacagc tggaggagtc tggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agcagttact ggaattggat ccggaagttc 120
ccaggacata aacttgagtt tttggggtac ataagtttcg ctgataccac taactacaat 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gttcgacctg 240
cagttgaagt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag agatgatttt 300
ggttactatg caatggacta ctggggtcaa gggatatcag tcactgtctc ctca 354
<210> 40
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
gatatttacg tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcatttgta gggcaagtca ggacattaac aattatttga actggtatca gttgaagcca 120
gatggaactc ttaaactcct gatctactac acatcaagac tacactcagg agtcccatca 180
aggttcggtg gcagtgggtc tggaacagaa tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240
gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacac ttcccacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 41
Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 42
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Glu Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 43
Ser Val Ser Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
000
<210> 45
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
000
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 47
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Val Ser Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
gaggtgaagc tgcagcagtc tggaactgag ttgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtggat aaagcagagg 120
cctggacgtg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180
aatgaggagt tcacgggcag ggccacattc actgcagata cattttccaa tacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagatctgtt 300
tcggcttcca actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcgagc 360
<210> 50
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
gacattgtga tgacccaatc tccagcttcc ctagctgtgt ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagtt acagttatat gcactggtac 120
caacagaagc caggacagcc acccaaattc ctcatcaaat atgcatccaa cctggaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccc 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
Asp Tyr Ser Met His
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 52
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 53
Glu Asp Tyr Tyr Gly His Asp Gly Phe Leu Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 54
Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Thr Val Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 55
Trp Ala Ser Leu Arg His Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 56
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 57
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly His Asp Gly Phe Leu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Leu Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Phe
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg atttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180
gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagagaggac 300
tactatggtc acgacgggtt tctttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 60
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtggtt actactgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccctcc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagttt 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Phe Ala Asp Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Asp Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Ser Leu Asn Thr His
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Gly Glu Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Asp Ser Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Pro Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asp Arg Ser Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly His Asp Gly Phe Leu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Leu Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 67
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 68
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (53)

1.一种针对人CD4(hCD4)的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，其中所述重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31和41，
b)HCDR2，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:2、12、22和42，以及
c)HCDR3，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33和43，和/或
其中所述轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:4、14、24和34，
e)LCDR2，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:5、15和25，以及
f)LCDR3，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO:6、16、26和46。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区选自由以下组成的组：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；以及
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区选自由以下组成的组：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；以及
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；或
e)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR1、包含SEQ IDNO:42的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:43的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的序列的LCDR3。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO:7的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的序列的轻链可变区；或
b)包含SEQ ID NO:17的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的序列的轻链可变区；或
c)包含SEQ ID NO:27的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区；或
d)包含SEQ ID NO:37的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:38的序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:47的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的序列的轻链可变区；或
f)包含SEQ ID NO:61的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:62的序列的轻链可变区；或
g)包含SEQ ID NO:63的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:64的序列的轻链可变区。
8.一种针对人CD4(hCD4)的分离抗体或其抗原结合片段，其包括：包含SEQ ID NO:65的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:66的序列的轻链可变区，及其具有至少80％序列同一性但仍保留对CD4的特异性结合特异性或亲和力的同源序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留对hCD4的特异性结合特异性或亲和力。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述取代或修饰中的至少一个在所述VH或VL序列的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR区中。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含免疫球蛋白恒定区，任选地人Ig的恒定区，或任选地人IgG的恒定区。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述恒定区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述恒定区包含人IgG1的恒定区。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG1包含一个或多个突变，所述突变可以赋予相对于野生型恒定区增加的CDC或ADCC。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个突变选自由以下组成的组：S239D、I332E、H268F、S324T S236A、G236A、P247I、A339(D/Q)、D280H、K290S、S298(D/V)、F243L、R292P、Y300L、P396L、V305I、K290(E/N)、S298G、T299A、K326E、E382V、M428I、S298A、K326A、E333A和K334A，所述突变位点根据EU序列编号。
16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个突变包含S298A、E333A和K334A的组合，所述突变位点根据EU序列编号。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是双特异性的。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合hCD4的第一和第二表位，或能够特异性结合hCD4和第二抗原。
21.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包含免疫相关靶标。
22.根据权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
23.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包括肿瘤抗原。
24.根据权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
25.根据权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤抗原包括前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、Claudin18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
26.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与一个或多个缀合物部分连接。
27.根据权利要求26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包括清除修饰剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物如雄激素受体抑制剂。
28.一种抗体或其抗原结合片段，其与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争与hCD4结合。
29.一种药物组合物或试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的药物组合物或试剂盒，其还包含第二治疗剂。
31.根据权利要求30所述的药物组合物或试剂盒，其中所述第二治疗剂包括抗癌剂，如mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂或T细胞募集抗体。
32.根据权利要求31所述的药物组合物或试剂盒，其中所述mTOR抑制剂是坦罗莫司、依维莫司或雷帕霉素。
33.根据权利要求31所述的药物组合物或试剂盒，其中所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抗体、PD-L1抗体、PD-L2抗体、LAG-3抗体、TIM-1抗体、CTLA-4抗体、VISTA抗体、B7-H2抗体、B7-H3抗体、B7-H4抗体、B7-H抗体6、ICOS抗体、HVEM抗体、CD160抗体、gp49B抗体、PIR-B抗体、KIR家族受体抗体、TIM-1抗体、TIM-4抗体、BTLA抗体、SIRPα(CD47)抗体、CD4抗体8、284(CD244)抗体、B7.1抗体、B7.2抗体、ILT-2抗体、ILT-4抗体、TIGIT抗体和A2aR抗体。
34.根据权利要求31所述的药物组合物或试剂盒，其中所述T细胞募集抗体包括CD19/CD3双特异性抗体。
35.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
36.一种载体，其包含根据权利要求35所述的分离的多核苷酸。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求36所述的载体。
38.一种表达根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达根据权利要求36所述的载体的条件下培养根据权利要求37所述的宿主细胞。
39.一种治疗受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求29至30中任一项所述的药物组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述CD4相关疾病或病况是癌症、适应性免疫疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。
42.一种检测样品中CD4的存在或量的方法，其包括使所述样品与根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，并确定所述样品中CD4的存在或量。
43.一种诊断受试者的CD4相关疾病或病况的方法，其包括：a)从所述受试者获得样品；b)使从所述受试者获得的所述样品与根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定所述样品中CD4的存在或量；以及d)将所述CD4的存在或量与所述受试者的所述CD4相关疾病或病况的存在或状态相关联。
44.一种消除有需要的受试者体内CD4表达细胞的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求29至30中任一项所述的药物组合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述CD4表达细胞是调节性T细胞(Treg)。
46.一种增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求29至30中任一项所述的药物组合物。
47.一种提高免疫疗法在有需要的受试者体内的疗效的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求29至30中任一项所述的药物组合物。
48.根据权利要求39至47中任一项所述的方法，其还包括施用第二治疗剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第二治疗剂包括抗癌剂，如mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂和T细胞募集抗体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述T细胞募集抗体包括CD19/CD3双特异性抗体。
51.一种根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的CD4相关疾病或病况的药物中的用途。
52.一种根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于增强有需要的受试者体内肿瘤微环境的免疫原性的药物中的用途。
53.一种根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于提高免疫疗法在有需要的受试者体内的疗效的药物中的用途。
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