CN113490510A - 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单结构域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合人和小鼠间皮素的骆驼单结构域单克隆抗体。本发明还公开了基于间皮素特异性抗体的嵌合抗原受体(CAR)T细胞和抗体结合物。例如，可以在间皮素阳性癌症的诊断或治疗中使用所公开的CAR T细胞、间皮素特异性抗体及其结合物。

Description

用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单结构域抗体
相关领域的交叉申请
本申请要求2019年1月8日申请的美国临时专利申请62/789,650的权益，其通过参考整体并入本文。
技术领域
本发明涉及特异性结合人和小鼠间皮素的骆驼单结构域单克隆抗体。本发明还涉及间皮素特异性抗体的用途，如用于治疗表达间皮素的肿瘤的免疫疗法。
对政府支持的承认
本发明是在国家卫生研究院授予的编号为Z01 BC010891的项目下获得政府支持的。政府对这项发明具有一定的权利。
背景技术
间皮素(MSLN)基因编码～70kDa前驱体蛋白，该前驱体蛋白可加工为～30kDa N末端蛋白和～40kDa C末端膜结合的成熟间皮素(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44：46-53，2008)。健康个体的胸膜、腹膜和心包膜的间皮细胞中的间皮细胞的水平相对较低，但它却能在恶性间皮瘤(Chang等Cancer Res 52：181-186，1992；Chang和Pastan，Proc Natl AcadSci USA 93：136-140，1996)和胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌和卵巢癌等其他实体瘤(Hassan等，Clin.Cancer Res.10：3937-3942，2004；McGuire等，N.Engl.J.Med.334：1-6，1996；Argani等，Clin.Cancer Res.7：3862-3868，2001；Hassan等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.13：243-247，2005；Li等，Mol.Cancer Ther.7：286-296，2008；Yu等，J Cancer 1：141-1749，2010；Tchou等，Breast Cancer Res Treat 133(2)：799-804，2012；美国专利7,081,518)中高度表达。
间皮素是多发性实体瘤中公认的肿瘤靶点。尽管已经开发了许多种间皮素特异性抗体和表达CAR的T细胞，并且正在进行许多评估这些抗体和靶向间皮素的CAR T细胞的临床试验，但是还没有报道抗体是跨物种的，特别是对人和小鼠间皮素阳性细胞具有高结合亲和力。而且，靶向间皮素的CAR T细胞在小鼠和人类中均未显示出有效的抗肿瘤活性。因此，仍然需要结合小鼠和人间皮素的间皮素特异性抗体，以能在动物模型中评估治疗性抗体的安全性和有效性。
发明内容
本发明提供了通过噬菌体展示分离的两种跨物种间皮素特异性骆驼单结构域单克隆抗体。间皮素特异性抗体，又称A101和G8，以高亲和力特异性结合人和小鼠间皮素。由所公开的抗体组成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够在体外和体内有效地杀死间皮素阳性肿瘤细胞。
本文提供了可结合比如特异性结合间皮素的单结构域单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体包括A101或G8的互补决定区(CDR)序列。本文还提供了包括所公开的单克隆抗体的结合物。在一些示例中，提供了包括本文公开的单克隆抗体的CAR(以及表达CAR的T细胞和天然杀伤细胞)、免疫结合物(如免疫毒素)、多特异性抗体、抗体-药物结合物(antibody-drug conjugates，ADC)、抗体-纳米微粒、结合物或融合蛋白。本发明还提供了包括间皮素特异性单克隆抗体的组合物和药学上可接受的载体的组合物。
本文还提供了编码间皮素特异性单克隆抗体、CAR、免疫结合物(如免疫毒素)、多特异性抗体和本文公开的融合蛋白的核酸分子和载体。
进一步提供了既编码间皮素特异性CAR又编码截短人上皮细胞生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。编码的CAR包括与细胞外铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号结构域融合的间皮素特异性单结构域单克隆抗体。huEGFRt包括两个EGFR胞外结构域(结构结构域III和结构结构域IV)和EGFR跨膜结构域，但缺乏两个膜末端胞外结构域和所有的胞内结构域。在一些实施方案中，核酸分子在5’至3’方向上包括编码第一信号序列的核酸；编码间皮素特异性抗体的核酸；编码胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码胞内共刺激结构域的核酸；编码胞内信号结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二信号序列的核酸；以及编码huEGFRt的核酸。还公开了载体，如病毒载体，其包括本文公开的核酸分子。还公开了分离的细胞，如T淋巴细胞，其共表达公开的CARs和huEGFRt。
还提供了治疗受试者中间皮素阳性癌的方法和抑制受试者中间皮素阳性癌的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本文公开的单克隆抗体，或者向受试者施用CAR(或者CAR T细胞或CAR NK细胞)、免疫结合物(如免疫毒素)、ADC、多特异性抗体、抗体-纳米微粒结合物或表达本文公开的单克隆抗体的融合蛋白。
本文进一步提供了检测间皮素在样本中的表达的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使样本与本文公开的单克隆抗体接触以及检测抗体与样本的接触。
还提供了对患有间皮素阳性癌的受试者进行诊断的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使从受试者中获得的样本与本文公开的单克隆抗体接触以及检测抗体与样本的结合。
根据以下通过参考附图进行的详细描述，本发明的前述和其他目的和特征将变得更加显而易见。
附图说明
图1：通过噬菌体展示分离间皮素特异性骆驼单结构域抗体。该图显示了检测每轮淘选的输出噬菌体与小鼠间皮素和人间皮素结合的多克隆噬菌体的ELISA结果。左侧的条表示用于分离A101的淘选。右侧的条表示用于分离G8的淘选。这两者都显示了与人和小鼠间皮素有很强的结合。
图2：SDS凝胶电泳中显示了A101和G8的纯度和分子量。A101为15.16kDa，G8为15.36kDa。
图3：A101和G8抗间皮素VHH抗体对人和小鼠间皮素蛋白的ELISA分析。
图4：A101和G8抗间皮素VHH抗体对确定表位结合的间皮素片段的ELISA分析。两种抗体都结合了间皮素片段I和全长间皮素。
图5A-5C：使用A101抗体对细胞表面间皮素表达进行的流式细胞计数分析。(图6A)M30和H226是人间皮素癌细胞；OVCAR8是人卵巢癌细胞系；以及Panc3.014是人胰腺癌细胞系。(图5B)KLM1和T3M4是人胰腺癌细胞系；以及KMBC和OZ是人胆管癌细胞系。(图5C)PDA95775、CREP133234和CREP133239是小鼠胰腺癌细胞系。标记“1”的峰表示带有亚型对照的细胞表面染色，标记“2”的峰表示间皮素的细胞表面染色。10μg/ml的A101用于染色。
图6A-6C：使用G8抗体对细胞表面间皮素表达进行的流式细胞计数分析。(图6A)M30和H226是人间皮素癌细胞；OVCAR8是人卵巢癌细胞系；以及Panc3.014是人胰腺癌细胞系。(图6B)KLM1和T3M4是人胰腺癌细胞系；以及KMBC和OZ是人胆管癌细胞系。(图6C)PDA95775、CREP133234和CREP133239是小鼠胰腺癌细胞系。标记“1”的峰表示带有同种型对照的细胞表面染色，标记“2”的峰表示间皮素的细胞表面染色。10μg/ml的G8用于染色。
图7A-7B：靶向间皮素的CAR T细胞的生成。(图7A)使用T2A核糖体跳跃序列表达靶向间皮素的CAR以及截短的人EGFR(huEGFRt)的慢病毒构建体的示意图。(图7B)使用huEGFRt表达的流式细胞计数检测来分析靶向间皮素的CAR在转导有慢病毒微粒的人T细胞上的表达。
图8：通过基于A101或G8表达CAR的T细胞杀死间皮素阳性细胞。表达荧光素酶的A431(间皮素阴性)、H9(间皮素过表达)、KLM1(胰腺癌)和H226(间皮瘤)细胞与模拟(灰线)、A101或G8 CAR截短的T细胞(蓝线)以指示的E：T比率共培养20小时，并使用基于发光的细胞溶解分析测定特异性裂解。
图9A-9C：靶向间皮素的CAR-T细胞在携带人间皮素肿瘤的小鼠中表现出很强的活性。(图9A)实验示意图。在肿瘤细胞接种后13天腹膜注射模拟T细胞或20×106CAR T细胞处理携带H226肿瘤的NSG小鼠。通过生物发光成像监控肿瘤负荷。(图9B)A101 CAR T细胞显示了抗肿瘤活性并且显示出根除H226异种移植肿瘤的趋势。(图9C)对图8B中处理小鼠中生物发光进行定量。
图10A-10B：A101和G8骆驼单结构域抗体在人间皮素(SEQ ID NO：12)上的结合表位。(图10A)生产人间皮素片段，包括编码间皮素的氨基酸残基296-390(区域I)、391-486(区域II)和487-581(区结构域III)的构建体以及编码区域I内较小片段的构建体：区域IAB(296-359)、区域IBC(328-405)、区域IA(296-337)、区域IB(328-369)和区域IC(360-405)。还产生了具有E321A、W321A或Y318A取代的区域IAB(269-359)突变体。(图10B)A101和G8骆驼单结构域抗体主要与间皮素N末端区域I(296-390)结合，包括如ELISA测定的IAB结构域(64个残基，296-359)。当酪氨酸残基318突变为丙氨酸(Y318A)时，无A101和G8结合。
图11：A101骆驼抗体不结合间皮素阴性细胞系。在间皮素阴性细胞系上未检测到A101(5)的结合μg/ml)，表明A101特异性结合间皮素。
图12：G8骆驼抗体不结合间皮素阴性细胞系。在间皮素阴性细胞系上未检测到G8(5)的结合μg/ml)，表明G8特异性结合间皮素。
图13A-13B：表达A101和G8抗体的CAR T细胞杀死间皮素阳性细胞系。(图13A)表达A101和G8抗体的CAR T细胞的转导效率。用A101或G8骆驼VHH转导健康供体的外周血单个核细胞(PBNC)。西妥昔单抗用于检测细胞表面的CAR(图13B)CAR T细胞杀伤试验。A101和G8CAR T细胞都能杀死间皮素阳性细胞系(H9、KLM1和H226)，但不能杀死间皮素阴性细胞(A431)。
图14A-14B：测试携带腹膜间皮瘤异种移植物的小鼠中的A101 CAR T细胞。7周龄雌性NSG小鼠接种2mh226-luc细胞。在第3天，用模拟T细胞或A101 CAR T细胞治疗动物。(图14A)模拟处理和A101处理的小鼠的生物发光图像。(图14B)研究示意图(顶部)和显示作为肿瘤大小衡量方式的模拟治疗和A101治疗动物(底部)的辐射率的图。A101-CAR有效地抑制了H226异种移植瘤在小鼠中的生长。
序列表
随附的序列清单中所列的核酸和氨基酸序列使用37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示。仅显示每个核酸序列的一条链，但互补链应理解为包括在对所显示链的任何引用中。序列列表作为ASCII文本文件提交，创建于2019年12月26日，大小14.4KB，通过引用将其并入本文。在随附的序列列表中：
SEQ ID NO：1是A101抗体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是A101抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是G8抗体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是G8抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是示例性GMCSFRss氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是示例性CD8α铰链区氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是示例性CD8α跨膜区氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是示例性4-1BB氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是示例性CD3ζ氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是示例性自切割T2A肽氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是示例性huEGFRt氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是示例性人间皮素氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
ADC 抗体-药物结合物
ADCC 抗体依赖性的细胞介导的细胞毒素
CAR 嵌合抗原受体
CDR 互补决定区
CTL 细胞毒素T淋巴细胞
E:T 效应因子：靶标
EGF 表皮生长因子
EGFR 表皮生长因子受体
ELISA 酶联免疫吸附测定
FACS 荧光活化细胞分选
GMCSFRss 粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子受体信号序列
huEGFRt 人截短的表皮生长因子受体
Ig 免疫球蛋白
NK 天然杀伤
PE 假单胞菌外毒素
PET 正电子放射断层摄影术
II.术语概述
除非另有说明，技术术语按常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义见Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett出版社出版，2009；和Meyers等人(编辑)，《细胞生物学和分子医学百科全书》(The Encyclopedia of Cell Biology and MolecularMedicine)，Wiley VCH出版，2008年，16卷；以及其他类似的参考文献。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”既指单数也指复数。例如，术语“抗原”包括单数个或复数个抗原，并且可被认为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”意指“包括”。应进一步理解，任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值，除非另有说明，否则给出的核酸或多肽都是近似值，并用于描述性目的。尽管可以使用许多与本文所描述的方法和材料相似或等效的方法和材料，但是本文描述了特定的合适方法和材料。如有冲突，以本规范(包括术语解释)为准。此外，所述材料、方法和示例仅是说明性的，并不旨在限制。为了便于审查各种实施例，提供了以下术语解释
4-1BB：一种由T细胞受体(TCR)激活的淋巴细胞以及由包括天然杀伤细胞在内的其他细胞表达的共刺激分子。4-1BB的连接诱导信号级联，该信号级联可产生细胞因子、表达抗凋亡分子和增强免疫应答。4-1BB的示例性氨基酸序列在本文如SEQ ID NO：8所述。
给药：通过任意有效途径向受试者提供或给予药剂，如本文提供的抗间皮素抗体。示例性给药途径包括但不限于口服给药、注射给药(如皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、静脉内注射和肿瘤内注射)、舌下给药、直肠给药、经皮给药、鼻内给药、阴道给药和吸入给药途径。
抗体：一种多肽配体，其包括能识别和结合(如特异性识别和特异性结合)抗原表位的至少一个可变区。哺乳动物免疫球蛋白分子由重(H)链和轻(L)链组成，它们中的每个都具有可变区，分别称为重(VH)链可变区和轻(VL)链可变区。总之，VH区和VL区负责结合由抗体识别的抗原。哺乳动物免疫球蛋白有五种主要的重链类别(或同种型)，它们可确定抗体分子IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的功能活性。哺乳动物中未发现的抗体同种型包括IgX、IgY、IgW和IgNAR。IgY是由鸟类和爬行动物产生的一级抗体，在功能上与哺乳动物IgG和IgE相似。IgW和IgNAR抗体是由软骨鱼产生的，而IgX抗体是在两栖动物中发现的。
抗体可变区包括“框架”区和高变区，称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责与抗原的表位结合。抗体的框架区用于在三维空间中定位和排列CDR。易于使用许多众所周知的编号方案中的任意一种来确定给定CDR的氨基酸序列边界，包括Kabat等人具有免疫学意义的蛋白质序列，美国卫生和公众服务部，1991；“Kabat”编号方案)，Chothia等人(见Chothia和Lesk，分子生物学杂志196：901-9171987；Chothia等人，《自然》342：8771989；和Al-Lazikani等人，JMB 273927-9481997；“Chothia”编号方案)，Kunik等人(见Kunik等人，《公共科学图书馆计算机生物学》8：e1002388，2012；Kunik等人，《核酸研究40》(网络服务器版)：W521-5242012副组CDR)和免疫遗传学(IMGT)数据库(见Lefranc，核酸研究29：207-92001；“IMGT”编号方案)所描述的那些。可以在线维护Kabat、Paratome和IMGT数据库。
“单结构域抗体”是指一种具有单结构域(可变结构域)的抗体，该单结构域能够在不存在另外的抗体结构域的情况下特异性结合抗原或抗原表位。单结构域抗体包括例如VH结构域抗体、VNAR抗体、骆驼VHH抗体和VL结构域抗体。VNAR抗体是由护士鲨、华贝公鲨、带刺狗鱼和竹鲨等软骨鱼类产生的。骆驼VHH抗体是由包括骆驼、骆驼、羊驼、单峰驼和瓜那科在内的若干物种产生的，它们产生天然缺乏轻链的重链抗体。
“单克隆抗体”是一种由淋巴细胞的单个克隆或者由已有单个抗体的编码序列转染其中的细胞产生的抗体。单克隆抗体可通过已知的方法产生。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种(如人类)的框架残基和来自另一个物种的CDRs(通常赋予抗原结合)。
“人源化”抗体是一种免疫球蛋白，其包括人框架区和来自非人(例如小鼠、兔子、大鼠、鲨鱼或者合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。不存在恒定区，但是如果存在，它们则必须与人免疫球蛋白恒定区基本具有同一性，即具有至少大约85-90％，如大约95％或更多的同一性。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR外，基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分具有同一性。人源化抗体与提供CDR的供体抗体与相同的抗原结合。人源化或其他单克隆抗体可具有另外的保守氨基酸取代，该保守氨基酸取代基本上不影响抗原结合功能或其他免疫球蛋白功能。
抗体-药物结合物(ADC)：一种包括与药物缀合(如共价结合)的抗体(或者抗体的抗原结合片段)的分子，如细胞毒素剂。ADC可用于通过抗体与在细胞表面表达的肿瘤抗原的特异性结合使药物特异性靶向到癌细胞上。与ADC一起使用的示例性药物包括抗微管剂(如美登木素生物碱、auristatin E和auristatin F)和键间交联剂(例如，吡咯苯并二氮杂卓；PDBs)。在某些情况下，ADC是双特异性ADC，其由两个单克隆抗体或其抗原-片段组成，分别针对与药物缀合的不同的抗原或表位。
抗微管剂：一类通过阻止有丝分裂来阻断细胞生长的药物。抗微管剂，也称为“抗有丝分裂剂”，可用于治疗癌症。
结合亲和力：抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力由改进由Frankel等人、Mol.Immunol.，16：101-106、1979描述的Scatchard法来计算。在另一个实施方案中，由抗原/抗体解离率来测定结合亲和力。在另一个实施方案中，通过竞争性发射免疫测定来测定高结合亲和力。在另一个实施方案中，通过ELISA来测定结合亲和力。在其他实施方案中，通过流式细胞术或者通过表面等离子参考来测定抗体亲和力。“特异性结合”抗原(如间皮素)的抗体是一种可结合亲和力较高的抗原但不显著结合其他不相关抗原的抗体。
在一些示例中，抗体或其片段(如本文提供的抗间皮素抗体)特异性结合靶标(如间皮素)其结合常数比样本或受试者中的其他分子的结合常数大至少103M-1、104M-1或105M-1。在一些示例中，抗体(例如，单克隆抗体)或其片段的平衡常数(Kd)为1nM或以下。例如，抗体或其片段与间皮素等靶标结合，其结合亲和力为至少大约0.1x10-8M、至少大约0.3x 10- 8M、至少大约0.5x 10-8M、至少大约0.75x 10-8M、至少大约1.0x 10-8M、至少大约1.3x 10-8M、至少大约1.5x 10-8M或至少大约2.0x 10-8M、至少大约2.5x 10-8、至少大约3.0x 10-8、至少大约3.5x 10-8、至少大约4.0x 10-8、至少大约4.5x 10-8或至少大约5.0x 10-8M。在某些实施方案中，与靶标结合的特异性结合剂的解离常数(Kd)为≤104nM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、or≤0.001nM(例如，10-8M或以下、例如10-8M至0-13M、例如10-9M至10- 13M)。在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合分析法(RIA)来测定，该分析法用Fab版本的感兴趣抗体及其抗原进行(参见例如，Chen等人的J.Mol.Biol.293：865-881、1999)。在另一个示例中，Kd通过使用BIACORES-2000或BIACORES-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)的表面等离子共振测定法在25℃下使用固定化抗原CM5芯片以大约10个应答单位(RU)来测定。
双特异性抗体：一种包括两种不同单克隆抗体(如两个单结构域抗体)的抗原结合片段并且因此能够结合两个不同抗原的重组蛋白。在一些实施方案中，双特异性抗体通过同时靶向例如CTL(如CTL受体组分，如CD3)或效应因子天然杀伤(NK)细胞和肿瘤抗原而用于癌症免疫治疗。相似地，多特异性抗体是一种包括至少两种不同单克隆抗体如两个、三个或四个不同单克隆抗体(如单结构域抗体)的抗原结合片段的重组蛋白。
乳腺癌：一种形成在乳腺的组织通常是导管(将乳汁输送到乳头的管子)和小叶(产生乳汁的腺体)中的癌症。三阴性乳腺癌是指一种其中癌细胞不表达雌激素受体、黄体酮受体或高水平HER2/neu蛋白的乳腺癌。三阴性乳腺癌也称为ER阴性PR阴性HER2/neu乳腺癌。
化学治疗剂：在治疗以细胞生长异常为特征的疾病方面具有治疗有效性的任意一种化学药剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物和癌症。在一个实施方案中，化学治疗剂是一种在治疗间皮素阳性肿瘤中使用的药剂。在一个实施方案中，化学治疗剂为放射性化合物。下面的文献公开了可与本文提供的方法一起使用的示例性化学治疗剂：Slapak和Kufe，癌症治疗原理(Principles of Cancer Therapy)，哈里森内科医学原理(Harrison'sPrinciplesof Internal Medicine)第14版第86章；Perry等人的化学疗法(Chemotherapy)，Abeloff的临床肿瘤学(clinical Oncology)第2版第17章，
Figure BDA0003153852250000081
Churchill Livingstone、Inc；Baltzer、L.、Berkery、R.(编辑)：肿瘤袖珍化疗指南(ncology Pocket Guide toChemotherapy)、第2版.St.Louis、Mosby-Year Book、1995；Fischer、D.S.、Knobf、M.F.、Durivage、H.J.(编辑)：癌症化疗手册，第4版.St.Louis、Mosby-Year Book、1993)。联合化学疗法是施用一种以上的药剂来治疗癌症。一个示例为与发射性或化学化合物一起施用结合间皮素的抗体。在一个示例中，化学治疗剂是生物的，如治疗性抗体(例如，治疗性单克隆抗体)，如本文提供的抗间皮素抗体，以及其他抗癌抗体，如抗PD1或抗PDL1(例如，派姆单抗和纳武单抗)、抗EGFR(例如西妥昔单抗)或者抗VEGF(例如，贝伐单抗)。
嵌合抗原受体(CAR)：一种嵌合分子，其包括抗原结合部分(如scFv或单结构域抗体)和信号结构域(如来自T细胞受体(例如，CD3ζ)的信号结构域)。通常，CAR由抗原结合部分、跨膜结构域和内域构成。内域通包括具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号链，如CD3ζ或FcεRIγ。在一些情况下，内域还包括至少一个另外的共刺激结构域的细胞内部分，如CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)、CD27和/或DAP10。在一些示例中，CAR是双特异性的或双顺反子的。双特异性CAR是单CAR分子，其由两个分别结合不同抗原的抗原结合结构域(如两个scFv或两个单结构域抗体)组成。双顺反子CAR是指两个完整的CAR分子，分别含有结合不同抗原的抗原结合部分。在一些情况下，双顺反子CAR构建体表达由切割接头连接的两个完整的CAR分子。表达双特异性或双顺反子CAR的T细胞或NK细胞可结合表达结合部分所针对的两个抗原的细胞(参见，例如，Qin等人，血液，130：810、2017；和WO/2018/213337)。
胆管癌：一种发展于肝脏胆管内衬的细胞中的癌症。
互补决定区(CDR)：一种限定抗体的结合亲和力和特异性的高变氨基酸序列。哺乳动物免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。单结构域抗体包括三个CDR，在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3。
结合物(conjugate)：在本发明的上下文中，“结合物”是一种与效应分子或第二蛋白(如第二抗体)共价连接的抗体或抗体片段(如抗原结合片段)。效应分子可以是例如药物、毒素、治疗剂、可检测标记物、蛋白质、核酸、脂质、纳米微粒、光子吸收剂、碳水化合物或重组病毒。抗体结合物常常称为“免疫结合物”。当结合物包括与药物(如细胞毒素剂)连接的抗体时，结合物常常称为“抗体-药物结合物”或“ADC”。其他抗体结合物包括例如多特异性(如双特异性或三特异性)抗体和嵌合抗原受体(CAR)。
保守性变体：一种含有大体上不影响或减少蛋白(如抗体对间皮素)亲和力的保守氨基酸取代的蛋白质。例如，特异性结合间皮素的单克隆抗体可包括至多大约1个、至少大约2个、至少大约5个并且至多大约10个或者至多大约15个保守取代，并且特异性结合间皮素多肽。术语“保守性变体”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，条件是抗体特异性结合间皮素。非保守取代是降低活性或与间皮素结合的那些。
提供了功能上相似的氨基酸的保守性氨基酸取代表对本领域普通技术人员来说是众所周知的。以下六组是氨基酸的示例，它们被认为彼此是保守取代。
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、吉氨酸(V)；以及
6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
接触：以直接物理连接的方式放置；既包括固相形式也包括液相形式。
细胞毒素剂：杀死细胞的药物或化合物。
细胞毒性：免疫毒素等分子对旨在被靶向的细胞的毒素，与有机体的其余部分的细胞相反。相反地，术语“毒性”是指免疫毒素对除了旨在被免疫毒素的靶向部分靶向的细胞以外的细胞的毒性，术语“动物毒性”是指免疫毒素对动物的毒性，即通过免疫毒素对除了旨在被免疫毒素靶向的那些的细胞的毒性。
诊断的：识别间皮素阳性癌等病理病症存在与否或性质。诊断方法的敏感性和特异性有所不同。诊断分析的“敏感性”是指测试呈阳性的患病个体的百分比(真阳性百分比)。诊断分析的“特异性”是指1减去假阳性率，其中假阳性率定义为未患有测试呈阳性的疾病的那些个体的比例。虽然特定的诊断方法可能无法提供明确的病症诊断，但是如果该方法提供有助于诊断的阳性指示就足够了。“预后”是指发生间皮瘤等病理病症等病理性病症的可能性(如严重程度)。
诊断性肿瘤成像：将抗体及其衍生物与用于正电子发射断层扫描(PET)的正电子发射放射性核素偶联是指一种常常称为免疫PET的过程。虽然全长抗体可用作免疫PET剂，但是其生物半衰期在成像前需要等待几天，从而导致非靶向辐射剂量增加。较小的单结构域抗体具有适用于同一天成像的生物半衰期。
药物：一种用于治疗、减轻或预防受试者中的疾病或病症的任意化合物。在本文的一些实施方案中，药物是抗癌剂，例如细胞毒素剂，如抗有丝分裂剂或抗微管剂。
效应分子：嵌合分子中旨在对嵌合分子所靶向的细胞产生所需效果的部分。效应分子也称为效应部分(EM)、治疗剂、诊断剂或相似的术语。治疗剂(或药物)包括诸如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、光子吸收剂、脂质、碳水化合物或重组病毒等的化合物。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单或双重DNA共价交联的衍生的寡核苷酸和形成三链的寡核苷酸。或者，抗间皮素抗体等与靶向部分连接的分子可以是封装系统，如脂质体或胶束，所述脂质体或胶束含有药物等治疗组合物、核酸(如反义核酸)或者避免直接暴露于血液循环系统的另一治疗部分。制备与抗体或其他治疗剂连接的脂质体的方法是已知的(参见，例如，美国专利4,957,735；和Connor等人的Pharm Ther 28：341-365，1985)。诊断剂或部分包括放射性同位素和其他可检测标记物。用于此目的的可检测标记物包括放射性同位素，如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I、化学发光剂和酶。
表位：一种决定簇。这些是具有抗原性(可引起特异性免疫应答)的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合间皮素等多肽上的特定抗原表位。
框架区：插入在CDR之间的氨基酸序列。免疫球蛋白分子的框架区包括轻链可变框架区和重链可变框架区。
融合蛋白：一种包括两种不同(异源性)蛋白质的至少一部分的蛋白质。
异源性的：起源于不同基因源或物种。
免疫应答：免疫系统细胞如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物的应答。在一个实施方案中，应答对特定抗原(“抗原特异性应答”)具有特异性。在一个实施方案中，应答是B细胞应答，可导致特异性抗体的产生。
免疫结合物：一种效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可以是例如可检测标记物、光子吸收剂(如IR700)或毒素(以形成免疫毒素，如包括假单胞菌外毒素或其变体的免疫毒素)。具体的、非限制性的毒素示例包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE，如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒菌毒素或其经修饰的毒素，或者直接或间接抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒素。例如，PE和DT是高毒性化合物，它们通常通过肝毒性导致死亡。然而，可以通过去除毒素的天然靶向成分(如PE的结构域Ia和DT的B链)并用抗体等不同的靶向部分进行替换，PE和DT可以修饰为用作免疫毒素的形式。在一个实施方案中，抗体与效应分子连接。在另一个实施方案中，与效应分子连接的抗体还进一步与脂质或其他分子连接，以增加其在体内的半衰期。连接可以通过化学方式进行也可以通过重组的方式进行。在一个实施方案中，连接是通过化学方式进行的，其中抗体部分与效应分子之间的反应产生了形成在两个分子之间的二价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可任选地包括在抗体与效应分子之间。因为免疫结合物最初是由带有不同功能性的两个分子如抗体和效应分子制备得到的，所以它们有时也称为“嵌合分子”。本文所使用的术语“嵌合分子”因此称为与效应分子缀合(偶联)的靶向部分，如配体或抗体。术语“缀合的”或“连接的”是指将两个多肽制成一个连续的多肽分子。
免疫脂质体：一种带有与其表面结合的抗体或抗体片段的脂质体。免疫脂质体可将细胞毒素剂或其他药物运载到抗体靶向的细胞中，如肿瘤细胞。
链间交联剂：一种细胞毒素药物，它能够在DNA的两个链之间进行共价结合，从而防止DNA复制和/或转录。
分离的：核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器等“分离的”生物组分已经基本上与环境(如细胞)中的其他生物组分分离或纯化开来，在所述环境中，该组分是天然存在的，例如其他染色体和染色体外DNA和RNA，蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括由在宿主细胞中进行重组表达制备得到的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸和蛋白质。
标记物：一种可检测化合物或组合物，其可直接或间接地与抗体或蛋白质等另一分子缀合以有利于该分子的检出。具体的非限制性的标记物示例包括荧光标签、酶促连接物和放射性同位素。在一个示例中，“标记的抗体”是指在抗体种掺入另一分子。例如，标记物是可检测标志物，如放射性标记的核酸的掺入或者与可由标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标志物或具有可通过光学或比色方法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽的结合。各种标记多肽和糖蛋白的方法在本领域是已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I)、荧光标记物(如荧光异硫氰酸盐(FITC)、罗丹明、镧系元素荧光粉)、酶促标记物(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志物、生物素组、由第二报告子(亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合域、表位标签)识别的预定的多肽表位，或者磁性剂，如钆螯合物。在一些实施方案中，通过各种长度的间隔臂连接标记物以减少可能的空间位阻。
接头：在一些情况下，接头是一种用于间接地将可变重链与可变轻链结合在一起的肽结合片段(如Fv片段)内的肽。“接头”也可是指一种用于将抗体等靶向部分与细胞毒素或可检测标记物等效应分子连接在一起的肽。术语“结合”、“连接”、“接合”或“链接”是指将两个多肽制成一个连续的多肽分子或者将放射性核素或其他分子共价附着到抗体等多肽上。连接可以通过化学方式进行也可以通过重组方式进行。“化学方式”是指在抗体部分与效应分子之间进行反应，从而使在两分子间存在共价键以形成一个分子。
肺癌：形成在肺组织中的癌症，一般是形成在气道内衬的细胞中的癌症。两种主要的类型为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。可使用显微镜检查诊断这些类型。
间皮素：一种40kDa细胞表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的糖蛋白。合成人间皮素蛋白作为70kD前体，该前体然后再进行蛋白水解加工。分泌间皮素的30kD氨基末端，该末端称为巨核细胞增强因子(Yamaguchi等人的J.Biol.Chem.269：805 808,1994)。40kD羧基末端与膜结合作为成熟的间皮素(Chang等人的Natl.Acad.Sci.USA93：136 140,1996)。间皮素的示例性核酸和氨基酸序列在PCT公开文本WO 97/25,068；美国专利6,083,502；Chang和Pastan，Int.J.Cancer 57：90,1994；Chang和Pastan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：136，1996；Brinkmann等人的Int.J.Cancer 71：638,1997；和howdhury等人的Mol.Immunol.34：9，1997中有描述。人间皮素的示例性氨基酸序列在本文如SEQ ID NO：12所述(还参见GenBank Accession No.AAH09272)。间皮素也指保留在细胞内以及分泌和/或分离的胞外间皮素蛋白中的间皮素蛋白或多肽。
间皮瘤：一种衍生自胸膜和腹膜内衬细胞的赘生物，其生长为覆盖内脏的厚片。内衬由可包围骰子形细胞内衬的腺体样空间的梭形细胞或纤维组织。间皮瘤通常来源于肺、心脏或腹部的衬里组织。在一些情况下，间皮瘤是因暴露于石棉中而引起的。
间皮素阳性癌：一种表达或过表达间皮素的癌症。间皮素阳性癌的示例包括但不限于间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)和卵巢癌。
可操作性连接：当第一核酸序与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序与第二核酸序列可操作性连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作性连接。一般地，可操作性连接的DN序列是连续的并且如果有必要，在同一阅读框架内连接两个蛋白编码区。
卵巢癌：形成在卵巢组织(可在其中形成卵子的雌性生殖腺体中的一种)中的癌症。大部分的卵巢癌要么是卵巢上皮癌(始于卵巢表面细胞的癌症)要么是恶性肿瘤(始于卵细胞的癌症)。
胰腺癌：一种在胰腺组织中发现有恶性(癌)细胞的疾病。也称为外分泌癌。
药学上可接受的载体：所用的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition,1975的Remington’s PharmaceuticalSciences中描述了适用于药物递送本文公开的抗体和其他组合物的组合物和制剂。一般地，载体的性质将取决于正在采用的特定的给药模式，例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，该可注射液体包括作为运载体的药学上和生理上可接受的液体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、水溶性丙三醇等。对于固体组合物(如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可包括例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体以外，待施用的药物组合物可含有少量的非毒性辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或山梨糖醇单月桂酸酯。
光免疫疗法：一种利用抗原特异性抗体-光吸收剂结合物(其可被近红外光激活以杀死靶向细胞)的靶向癌症疗法。光子吸收剂通常基于酞菁染料，例如近红外(NIR)酞菁染料(例如，
Figure BDA0003153852250000131
700DX，也称为IR700)。抗体(例如，间皮素特异性抗体)与适当的细胞表面抗原(例如间皮素)结合，并且光激活染料在近红外光照射后可引起对细胞膜的致命损伤。近红外光照射(690nm)在几分钟内就可引起高选择性的坏死癌细胞死亡，单不损害相邻细胞(例如，参见美国申请号2018/0236076)。因此本文提供与IR700缀合的所公开的抗体(例如A101和G8或其片段)。
预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预，例如减少肿瘤负荷或减少转移灶的大小。“改善”是指疾病(例如癌症)的体征或症状的数量或严重程度的减少。
前列腺癌：形成在前列腺组织(男性生殖系统中位于膀胱下方和直肠前方的腺体)中的癌症。前列腺癌通常发生在老年男性身上。
纯化的：术语纯化的不要求绝对纯度；相反，它意指作为一个相对的术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中的肽或蛋白质比肽或蛋白质在其在细胞内的天然环境中更富集的制剂。在一个实施方案中，纯化制剂使得蛋白质或肽占制剂总肽或蛋白质含量的至少50％。基本上纯化表示从其他蛋白质或细胞成分中进行的纯化。基本上纯化的蛋白质的纯度至少为60％、70％、80％、90％、95％或98％。因此，在一个特定的非限制性示例中，抗体或抗体片段等基本上纯化的蛋白质90％不含其他蛋白质或细胞成分。
吡咯并苯二氮卓(PBD)：最初在链霉菌属物种中发现的一类序列选择性DNA小沟结合交联剂。PDBs明显比全身化疗药物更有效。PBD的作用机制与其在DNA小沟中形成加合物的能力有关，从而干扰DNA加工。在本公开的上下文中，PBD包括天然产生的和分离的PBD、化学合成的天然存在的PBD和化学合成的非天然存在的PBD。PBD还包括单体的、二聚体的和混合的PBD(有关评论，请参见Gerratana,Med Res Rev 32(2)：254-293,2012)。
重组的：重组核酸或蛋白质是一种具有非天然存在的序列或者具有由两个原本分开的序列片段人工组合而成的序列的核酸或蛋白质。这种人工组合通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸片段来完成，例如通过基因工程技术。
样本(或生物样本)：从受试者中获得的包含基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物标本。示例包括但不限于外周血、组织、细胞、尿液、唾液、组织活检、细针抽吸物、手术标本和尸检材料。在一个示例中，样本包括肿瘤活检。在一个示例中，样本包括细针抽吸物。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性以序列间的相似性来表示，也称为序列同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽或核酸分子的同源物或变体将具有相对高的序列同一性。
用于比较的序列比对方法在本领域是公知的。各种程序和对齐算法如下所描述：Smith and Waterman,Adv.应用程序数学。2：482,1981；Needleman和Wunsch，J.Mol。生物。48：443,1970；皮尔逊和利普曼，Proc。纳特尔。阿卡德。科学。美国85：2444,1988；希金斯和夏普，基因73：237，1988年；希金斯和夏普，CABIOS 5：151,1989；Corpet等人，核酸研究16：10881，1988年；以及Pearson和Lipman，Proc。纳特尔。阿卡德.科学.美国85：2444，1988年.Altschul等人，Nature Genet.6：119,1994，详细介绍了序列比对方法和同源性计算。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403,1990)可从多个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。如何使用该程序确定序列同一性的说明可从互联网的NCBI网站上获得。
特异性结合间皮素多肽的抗体的VH结构域的同源物和变体的特征通常在于具有至少大约75％，例如至少大约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，在与抗体氨基酸序列的全长比对中使用NCBI Blast 2.0进行计数，间隙blastp设置为默认参数。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，通过使用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵(间隙存在代价为11，每个残基间隙代价为1)来采用Blast 2序列函数。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列函数进行比对，使用PAM30矩阵设置为默认参数(开放间隙9，扩展间隙1惩罚)。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更高相似性的蛋白质将显示百分比同一性增加，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，这取决于它们与参考序列的相似性。在互联网的NCBI网站上可以找到通过这种短窗口确定序列同一性的方法。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能获得超出所提供范围的非常重要的同源物。
小分子：一种通常具有小于约1000道尔顿的分子量或者在一些实施方案中小于约500道尔顿的分子，其中该分子能够在某些可测量的程度上调节靶分子的活性。
鳞状细胞癌：一种源自复层鳞状上皮的恶性肿瘤，但也可能发生在正常存在腺上皮或柱状上皮的支气管粘膜等部位。鳞状细胞癌是最常见的皮肤癌类型。
胃癌：形成在胃壁组织中的癌症。又称胃肠道癌。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，该类别包括人类和兽医受试者，包括人类和非人类哺乳动物。
合成的：在实验室中通过人工方式生产的，例如合成的核酸或蛋白质(例如抗体)可以在实验室中化学合成。
治疗有效量：足以在接受治疗的受试者中实现所需效果的特定物质的量。例如，这可以是抑制或抑制肿瘤生长所需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是消除、减小肿瘤大小或预防肿瘤转移所需的量，例如将肿瘤大小和/或体积减小至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或者甚至100％，和/或将转移瘤的数量和/或大小/体积减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至100％所需的量，例如与处理前的大小/体积/数量相比。当施用于受试者时，一般会使用靶组织浓度(例如在肿瘤中)已经显示出达到所需体外效果的剂量。
毒素：一种对细胞具有细胞毒性的分子。毒素包括相思豆蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素、限制毒素或白树毒素，或其修饰的毒素。例如，PE和DT是剧毒化合物，通常通过肝毒性导致死亡。然而，PE和DT可以通过去除毒素的天然靶向成分(例如PE的结构域Ia或DT的B链)并用不同的靶向部分替换它来修饰成用作免疫毒素的形式，例如作为抗体。
载体：一种引入宿主细胞中进而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一种或多种可选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如慢病毒载体或AAV载体。
III.对间皮素有特异性的单克隆抗体
本文描述了是通过噬菌体展示分离的两种跨物种间皮素特异性骆驼单域单克隆抗体。所公开的间皮素特异性抗体A101和G8以高亲和力特异性结合人和小鼠间皮素。由所公开的抗体组成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够在体外和体内有效地杀死间皮素阳性肿瘤细胞。下面提供了A101和G8的核苷酸和氨基酸序列。表1和2列出了每种抗体的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸位置，如使用Kabat、IMGT或Paratome或所有三者的组合确定的。本领域技术人员可以使用替代编号方案如Chothia编号方案容易地确定CDR边界。
A101 DNA(SEQ ID NO：1)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCACGGTGCAGGCTGGAGGGTCGCTGAAACTCGCCTGCGCAGCCTCTGGATTACCCAGAACGTACAATGTCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAATAATTTATACTACGACTGGAGCAACATACTATCGCGACTCCGTCAAGGGCCGGGCCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAAGTCGGTGTCTCTCCAAATGAACAGCCTGAGGCCTGAGGACACGGCCATCTATTACTGTGTGGCTAGGCAACCCAATAGTGGTCCCTGGGAGTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
A101蛋白质(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003153852250000151
(下划线＝Kabat CDRs；Bold粗体＝IMGT CDRs；斜体＝Paratome CDRs)
表1 CDR在A101氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的位置
编号方案 CDR1 CDR2 CDR3
Kabat 31-35 50-66 99-108
IMGT 26-33 51-58 97-108
Paratome 27-35 47-61 97-108
组合 26-35 47-66 97-108
G8 DNA(SEQ ID NO：3)
CAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAACTTCTGGATACACCAACAGTTACAAGTGGATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGACAAGAGCGCGAGGGGGTCGCAGTTATTTACACCGGTAATGATAGGACATACTATAGTGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAATATGATCTATCTGGACATGACGCGCCTGAGACCTGAGGACAGCGCTGTGTACGAGTGTGCCATCGGACATGATGGCGCATGGCGTTACTGGGGCCAGGGAACGCAGGTCACCGTCTCCTCA
G8蛋白质(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0003153852250000161
(下划线＝Kabat CDRs；Bold粗体＝IMGT CDRs；斜体＝Paratome CDRs)
表2 CDR在G8氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中的位置
编号方案 CDR1 CDR2 CDR3
Kabat 31-35 50-66 99-106
IMGT 26-33 51-58 97-106
Paratome 27-35 47-60 98-106
组合 26-35 47-66 97-106
本文提供了结合(例如，特异性结合)的间皮素(如细胞表面或可溶性间皮素)的单结构域(VHH)单克隆抗体。在一些实施方案中，间皮素是人间皮素、小鼠间皮素或人和小鼠间皮素二者。在一些实施方案中，抗体包括本文中如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的至少一部分，例如来自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一个或多个(如所有三个)CDR序列，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：由任意编号方案比如IMGT、Kabat、Paratome或Chothia来确定。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些示例中，使用IMGT、Kabat、Paratome或Chothia编号方案或其组合确定CDR序列。在特定实例中，CDR序列是使用Kabat、IMGT和Paratome的组合确定的。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些示例中，使用IMGT、Kabat、Paratome或Chothia编号方案或其组合确定CDR序列。在特定的示例中，使用Kabat、IMGT和Paratome的组合确定CDR序列。
在一些实施方案中，单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列包括SEQ ID NO：2的残基31-35、50-66和99-108；SEQ ID NO：2的残基26-33、51-58和97-108；SEQ ID NO：2的残基27-35、47-61和97-108；或SEQ ID NO：2的残基26-35、47-66和97-108。在一些示例中，单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在具体的非限制性示例中，单克隆抗体的序列包括SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成。
在一些实施方案中，单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列包括SEQ ID NO：4的残基31-35、50-66和99-106；SEQ ID NO：4的残基26-33、51-58和97-106；SEQ ID NO：4的残基27-35、47-60和98-106；或SEQ ID NO：4的残基26-35、47-66和97-106。在一些示例中，单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在具体的非限制性实例中，单克隆抗体的序列包括SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成。
在一些实施方案中，单克隆抗体是骆驼抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是嵌合抗体。
本文还提供了包括本文公开的单克隆抗体的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR进一步包括铰链区、跨膜结构域、共刺激信号部分、信号结构域或其任意组合。在具体的非限制性示例中，铰链区包括CD8α铰链区，跨膜域包括CD8α跨膜域，共刺激信号部分包括4-1BB信号部分和/或信号域包括CD3ζ信号域。
进一步提供了表达间皮素特异性CAR的细胞。在一些示例中，细胞是T淋巴细胞，例如CTL。在第IV部分中进一步描述了CAR和表达CAR的T细胞。
本文还提供了包括本文公开的单克隆抗体和效应分子的免疫结合物。在一些实施方案中，效应分子是毒素，例如但不限于假单胞菌外毒素或其变体，如PE38。在其他实施方案中，效应分子是可检测标记物，例如但不限于荧光团、酶或放射性同位素。在其他实施例中，效应分子是光子吸收剂，如IR700。包括光子吸收剂的免疫结合物可用于光免疫疗法。在第V节中进一步描述了免疫结合物。
本文进一步提供了抗体-药物结合物(ADC)，其包括与本文公开的单克隆抗体缀合的药物。在一些实施方案中，药物是小分子，例如抗微管剂、抗有丝分裂剂和/或细胞毒剂。ADC将在第VI部分进一步描述。
本文还提供了多特异性抗体，其包括本文公开的单克隆抗体和至少一种额外的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在其他实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合T细胞受体或天然杀伤(NK)细胞激活受体的组分。在第VII节中进一步描述了多特异性抗体。
本文进一步提供了抗体-纳米微粒结合物，其包括与本文公开的单克隆抗体缀合的纳米微粒。在一些实施方案中，纳米微粒包括聚合物纳米微粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束或泡囊。在一些实施方案中，纳米微粒包括细胞毒剂。第VIII节进一步描述了抗体-纳米微粒结合物。
本文还提供了融合蛋白，其包括本文公开的单克隆抗体和异源蛋白或肽。在一些实施方案中，异源蛋白是Fc蛋白。在一些示例中，Fc蛋白是小鼠Fc或人Fc蛋白。
还提供了编码本文公开的单克隆抗体的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些示例中，核酸分子包括SEQ ID NO：1或SEQID NO：3或其简并变体，或者由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其简并变体组成。进一步提供了编码本文公开的CAR、免疫结合物、多特异性抗体或融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子与启动子可操作连接。本文进一步提供了包括核酸分子的载体。
本文进一步提供了表达CAR和截短的人EGFR(huEGFRt)的核酸构建体。在一些实施方案中，核酸在5’至3’方向上包括：编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；编码本文公开的间皮素特异性单克隆抗体的核酸；编码胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码胞内共刺激结构域的核酸；编码胞内信号结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二GMCSFRss的核酸；和编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸。在一些示例中，核酸进一步包括编码第一GMCSFRss的核酸的人延伸因子1α(EF1α)启动子序列5’。在一些示例中，铰链区包括CD8α铰链区。在一些示例中，跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。在一些示例中，共刺激信号部分包括4-1BB信号部分。在一些示例中，信号结构域包括CD3ζ信号结构域。在一些示例中，间皮素特异性单克隆抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4组成。还提供了包括核酸构建体的载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。
还提供了共表达本文公开的间皮素特异性CAR和huEGFRt的分离的细胞。在一些示例中，细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
包括药学上可接受的载体和单克隆抗体CAR、分离的细胞(如表达CAR的细胞，例如CAR T细胞或CAR NK细胞)、免疫结合物、ADC、多特异性抗体、抗体-纳米微粒结合物的组合物，本发明进一步提供了本文公开的融合蛋白。在第IX节中进一步描述了组合物及其用途。
IV.嵌合抗原受体(CAR)
所公开的单克隆抗体还可用于生产CAR(也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体或嵌合免疫受体)和/或经工程化为表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或天然杀伤(NK)细胞。一般地，CAR包括结合部分、细胞外铰链和间隔元件、跨膜区和执行信号传导功能的内域(Cartellieri等人，J Biomed Biotechnol 2010：956304，2010；Dai等人，J Natl CancerInst 108(7)：djv439,2016)。在许多情况下，结合部分是单克隆抗体的抗原结合片段，如scFv或单结构域抗体的抗原结合片段。间隔区/铰链区通常包括来自IgG亚类的序列，如IgG1、IgG4、IgD和CD8结构域。跨膜结构域可衍生自多种不同的T细胞蛋白，例如CD3ζ、CD4、CD8或CD28。几种不同的内域已被用于生成CAR。例如，内域可以由具有ITAM的信号链组成，例如CD3ζ或FcεRIγ。在一些情况下，内域还包括至少一个另外的共刺激结构域的细胞内部分，例如CD28、4-1BB(CD137、TNFRSF9)、OX-40(CD134)、ICOS、CD27和/或DAP10。
表达CAR的CTL、NK细胞(或其他免疫细胞)可用于靶向特定的细胞类型，如间皮素阳性肿瘤细胞。因此，本文公开的单克隆抗体可用于工程化表达包括间皮素特异性单克隆抗体的CAR的CTL或NK细胞，从而将工程化的CTL或NK细胞靶向表达间皮素的肿瘤细胞。工程化的T细胞先前已用于某些类型癌症的过继疗法(参见，例如，Park等人，Mol Ther 15(4)：825-833,2007)。使用表达CAR的T细胞比标准的基于CTL的免疫疗法更普遍，因为表达CAR的CTL不受HLA限制，因此可用于患有表达靶抗原的肿瘤的任意患者。
本发明还考虑了双特异性或双顺反子CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR包括对间皮素(例如A101或G8)具有特异性的单结构域抗体和对不同抗原具有特异性的单结构域抗体。类似地，双顺反子CAR包括从同一构建体表达的两个CAR分子，其中一个CAR分子是间皮素靶向的CAR，第二个CAR靶向第二抗原。参见，例如，Qin等人，Blood 130：810，2017年；和WO/2018/213337。
因此，本文提供了包括间皮素特异性抗体的CAR。还提供了编码CAR(包括双特异性和双顺反子CAR)的分离的核酸分子和载体，以及表达CAR、双特异性CAR或双顺反子CAR的宿主细胞，如CTL或NK细胞。表达由间皮素特异性单克隆抗体组成的CAR的CTL或NK细胞可用于治疗表达间皮素的癌症。在本文的一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在本文的其他实施方案中，CAR是双顺反子CAR。
在一些实施方案中，CAR包括信号肽序列，例如，抗原结合结构域的N末端。信号肽序列可以是任意合适的信号肽序列，如来自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)、免疫球蛋白轻链κ或IL-2的信号序列。虽然信号肽序列可以促进CAR在细胞表面上的表达，但信号肽序列在表达的CAR中的存在对于CAR发挥功能并不是必需的。在细胞表面表达CAR后，信号肽序列可从CAR上切割下来。因此，在一些实施方案中，CAR缺乏信号肽序列。
在一些实施方案中，本文公开的CAR从也表达截短的人EGFR(huEGFRt)的构建体(例如来自慢病毒载体)中表达。CAR和huEGFRt由自切割肽序列(如T2A)分离，以使得在转导的细胞中表达后，CAR从huEGFRt上切割下来。
在本文公开的一些实施方案中，CAR构建体在N-末端到C-末端的方向上编码以下氨基酸序列：
GMCSFRss：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO：5)
NdeI：HM
抗原结合：间皮素特异性抗体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)
SpeI：TS
CD8α铰链：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：6)
CD8αTM：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：7)
4-1BB：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：8)
CD3ζ：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：9)
T2A：EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：10)
GMCSFRss：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO：5)
huEGFRt：
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM(SEQ ID NO：11)
人表皮生长因子受体由四个胞外结构域、一个跨膜域和三个胞内域组成。EGFR域按以下N末端到C末端的顺序发现：结构域I-结构域II-结构结构域III-结构结构域IV-跨膜(TM)结构域-近膜结构域-酪氨酸激酶结构域-C末端尾部。结构域I和结构结构域III是参与配体结合的富含亮氨酸的结构域。结构域II和结构结构域IV是富含半胱氨酸的结构域，不与EGFR配体接触。结构域II与来自其他EGFR家族成员的类似结构域一起介导同二聚体或异源二聚体的形成，结构结构域IV可以与结构域II形成二硫键。EGFR TM结构域单次穿过细胞膜并可在蛋白质二聚化中起作用。胞内结构域包括近膜结构域、酪氨酸激酶结构域和C末端尾部，它们介导EGFR信号转导(Wee和Wang，Cancers 9(52)，doi：10.3390/cancers9050052；Ferguson,Annu Rev Biophys 37：353-373，2008年；Wang等人，Blood 118(5)：1255-1263,2011)。
人类EGFR的截短形式，在本文中称为“huEGFRt”，仅包括结构域III、结构域IV和TM结构域。因此，huEGFRt缺乏结构域I、结构域II和所有三个胞内结构域。huEGFRt不能够结合EGF并且缺乏信号活性。然而，该分子保留了结合特定EGFR特异性单克隆抗体如FDA核准的西妥昔单抗(PCT公开号WO2011/056894，其通过引用并入本文)的能力。
用编码本文公开的huEGFRt和肿瘤抗原特异性CAR的构建体(例如慢病毒载体)转导T细胞(或NK细胞)允许使用标记的EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(ERBITUXTM)来选择转导的T细胞。例如，西妥昔单抗可以用生物素标记，并且可以使用可商购的(例如来自MiltenyiBiotec)抗生物素磁珠来选择转导的T细胞。huEGFRt的共表达还允许在体内追踪过继转移的表达CAR的T细胞(或NK细胞)。此外，西妥昔单抗与表达huEGFRt的T细胞的结合会诱导ADCC效应细胞的细胞毒性，从而提供一种在体内消除转导的T细胞的机制(Wang等人，Blood118(5)：1255-1263,2011)，例如在治疗的结论。
V.免疫结合物
所公开的单克隆抗体可以与治疗剂或效应分子缀合。免疫结合物包括但不限于其中治疗剂与抗体共价连接的分子。治疗剂是具有针对特定靶分子或者针对带有靶分子的细胞的特定生物活性的药剂。本领域技术人员将理解，治疗剂可包括各种药物如长春碱、道诺霉素等、细胞毒素如天然或修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素，含有药理成分的包封剂(如脂质体)、放射性试剂如125I、32P、14C、3H和35S、光子吸收剂如IR700，以及其他标记物、靶标部分和配体。
特定治疗剂的选择取决于特定的靶分子或细胞，以及所需的生物效应。因此，例如，治疗剂可以是用于导致特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。相反，在需要引起非致死性生物反应(如用于检测)的情况下，治疗剂可以与非致死性药剂或含有非致死性药剂的脂质体缀合。
使用本文所述的治疗剂和抗体，技术人员可以容易地构建多种克隆，所述克隆含有功能上等效的核酸，如序列不同但编码相同效应部分或抗体序列的核酸。因此，本发明提供了编码抗体及其结合物和融合蛋白的核酸。
效应分子可以使用多种方式与感兴趣的抗体连接。可以使用共价和非共价连接这个两种方式。使效应分子与抗体连接的程序根据效应分子的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子的结合。或者，抗体被衍生以暴露或连接另外的反应官能团。衍生化可涉及许多已知接头分子中的任意一种的连接。接头可以是用于将抗体与效应分子连接的任意分子。接头能够与抗体和效应分子形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。如果抗体和效应分子是多肽，则接头可通过它们的侧基(如通过与半胱氨酸的二硫键连接)组成氨基酸连接或者与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。
在某些情况下，当免疫结合物到达其靶位点时，需要从抗体中释放出效应分子。因此，在这些情况下，免疫结合物将包含在靶位点附近可切割的连接。可通过酶活性或免疫结合物在靶细胞内或靶位点附近经受的条件促进接头的切割以从抗体中释放出效应分子。
鉴于已报道的将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标记物(如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他试剂与抗体连接的大量方法，本领域技术人员将能够确定将给定试剂与抗体或其他多肽连接的合适方法。
本文公开的抗体可以衍生化或与另一分子(例如另一肽或蛋白质)连接。一般地，抗体或其部分被衍生化，以使得与靶抗原结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以与一种或多种其他分子实体如另一种抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、光子吸收剂、药剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)的结合的蛋白质或肽进行功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)。
一种类型的衍生化抗体是通过交联两种或多种抗体(相同类型或不同类型，如产生双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括是异双功能的具有由适当的间隔基(如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分离的两种不同反应基团或者是同双功能(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)的那些。这类接头可以商购。
抗体可以与可检测标志物缀合；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)、磁共振断层扫描(MTR)、超声、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测的检测标记物。可检测标志物的具体的非限制性示例包括荧光团、化学发光剂、酶连接物、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI进行检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。还可以使用生物发光标志物，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可以与用于检测的酶如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等缀合。当抗体或抗原结合片段与可检测酶缀合时，其可以通过添加另外的试剂进行检测，酶可以利用这些试剂产生可辨别的反应产物。例如当存在辣根过氧化物酶试剂时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生带颜色的反应产物，该反应产物可目测检测得到。抗体或抗原结合片段也可以与生物素结合，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量来检测。应当注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标记物结合。
抗体可以用钆等磁剂标记。抗体也可以用镧系元素(如铕和镝)和锰标记。也可使用超顺磁性氧化铁等顺磁性微粒作为标记物。抗体也可以用二级报告子(如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)识别的预定多肽表位标记。在一些实施方案中，标记物通过不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
抗体也可以用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记物既可用于诊断目的也可用于治疗目的。例如，放射性标记物可用于通过X射线、发射光谱或其他诊断技术检测靶抗原的表达。多肽标记物的示例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
本文公开的抗体还可以与光子吸收剂缀合。在一些实施方案中，光子吸收剂是酞菁染料，如但不限于
Figure BDA0003153852250000231
700DX(也称为“IR700”)。抗体-光吸收剂结合物可用于光免疫疗法。
抗体也可以用聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团等化学基团进行衍生化。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如以增加血清的半衰期或者增加组织的结合。
毒素可与本文所述的单克隆抗体一起使用以产生免疫毒素。示例性毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆蛋白、白喉毒素及其亚基以及肉毒杆菌毒素A至F。这些毒素可容易地从商业来源(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)获得。预期的毒素还包括本文所述毒素的变体(参见，例如，美国专利号5,079,163和4,689,401)。在一个实施方案中，毒素是假单胞菌外毒素(PE)(美国专利号5,602,095)。如本文所用，“假单胞菌外毒素”是指全长天然(天然存在的)PE或经修饰的PE。此类修饰可包括但不限于消除结构域Ia、结构域Ib、II和III中的各种氨基酸缺失、单个氨基酸取代以及在羧基末端添加一个或多个序列(例如，参见Siegall等人，J.Biol.Chem.264：14256-14261,1989)。
与本文所述的单克隆抗体一起使用的PE可包括天然序列、天然序列的细胞毒性片段和天然PE及其细胞毒性片段的保守性修饰变体。PE的细胞毒性片段包括在靶细胞中存在或者不存在随后的蛋白水解或其其他处理时具有细胞毒性的那些。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。对于PE及其变体的其他描述，参见例如美国专利4,892,827；5,512,658；5,602,095；5,608,039；5,821,238；和5,854,044；美国专利申请公开2015/0099707；PCT公开WO 99/51643和WO 2014/052064；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3358-3362,1991；Kondo等人，J.Biol.Chem.263:9470-9475,1988；Pastan等人，Biochim.Biophys.Acta 1333:C1-C6,1997。
本文还涵盖了蛋白酶抗性PE变体和免疫原性降低的PE变体，例如但不限于PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X(参见，例如，Weldon等人，Blood 113(16)：3792-3800，2009；Onda等人，Proc Natl Acad Sci USA 105(32)：11311-11316，2008年；以及PCT公开WO2007/016150、WO2009/032954和WO2011/032022，通过引用并入本文)。
在一些示例中，PE是对溶酶体降解具有抗性的变体，例如PE-LR(Weldon等人，Blood 113(16)：3792-3800，2009；PCT公开WO2009/032954)。在其他示例中，PE是命名为PE-LR/6X的变体(PCT公开WO 2011/032022)。在其他示例中，PE变体是免疫原性降低的PE。在其他示例中，PE是命名为PE-LR/8M的变体(PCT公开WO 2011/032022)。
修饰PE可以发生在先前描述的PE的细胞毒性片段(例如，PE38、PE-LR和PE-LR/8M)的任意变体中。经修饰的PE可以包括任意取代，如PE的一个或多个T细胞表位和/或B细胞表位内的一个或多个氨基酸残基，或一个或多个T细胞和/或B-细胞表位的缺失。(参见，例如，美国专利申请公开2015/0099707)。
预期的PE形式还包括去免疫形式的PE，例如缺失删结构域II的各种版本(例如，PE24)。例如，在PCT公开WO 2005/052006、WO 2007/016150、WO 2007/014743、WO 2007/031741、WO 2009/32954、WO 2007/016150、WO 2009/32904、WO 21205/3205和WO 2012/170617中描述了去免疫形式的PE。
本文所述的抗体还可用于将任意数量的不同诊断或治疗化合物靶向在其表面表达肿瘤或病毒抗原的细胞上。因此，本发明的抗体可以直接地或者通过接头与预直接递送至表达细胞表面抗原的细胞中的药物连接。这可以用于治疗、诊断或研究目的。治疗剂包括核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、光子吸收剂、脂质、碳水化合物或重组病毒等化合物。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单链或双链DNA共价交联的衍生化寡核苷酸和三链形成寡核苷酸。
或者，与抗体连接的分子可以是包封系统，如纳米微粒、脂质体或胶束，其包含治疗组合物，如药物、核酸(例如，反义核酸)，或者另一种治疗部分优选地避免直接暴露于循环系统。制备与抗体连接的脂质体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利4,957,735；Connor等人，Pharm.Ther.28：341-365,1985)。
本文所述的抗体也可以与可检测标记物共价或非共价连接。适用于此类用途的可检测标记物包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段检测的任意组合物。有用的标记物包括磁珠、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)以及比色标记物，如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
检测此类标记物的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射性标记物可以使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记物可以使用光电检测器进行检测以检测出发射的照明。酶标记物通常通过为酶提供底物并检测酶对底物的作用产生的反应产物来检测，并且比色标记物通过简单地观察带有颜色的标记物来检测。
VI.抗体-药物结合物(ADC)
ADC是由肿瘤抗原特异性抗体(或其抗原结合片段)和药物(通常是细胞毒剂，如抗微管剂或交联剂)组成的化合物。由于ADC能够特异性靶向癌细胞，所以该药物比用于标准化疗的药物更有效。目前与ADC一起使用的最常见的细胞毒性药物的IC50比常规化疗药物的效力高100至1000倍。常见的细胞毒性药物包括抗微管药物，如美登素类和auristatins(如auristatin E和auristatin F)。与ADC一起使用的其他细胞毒素包括吡咯并苯并二氮杂(PDB)，它共价结合DNA的小沟以形成链间交联。在许多情况下，ADC中抗体与药物比为1：2至1：4(Bander，Clinical Advances in Hematology&Oncology 10(8；suppl 10)：3-7,2012)。
抗体和药物可以通过可切割或不可切割的接头连接。然而，在某些情况下，需要具有在循环中稳定的接头以防止可能导致显著脱靶毒性的细胞毒性药物的全身释放。不可切割的接头可在ADC被靶细胞内化之前阻止细胞毒剂的释放。一旦进入溶酶体，溶酶体蛋白酶对抗体的消化导致细胞毒剂的释放(Bander，Clinical Advances in Hematology&Oncology 10(8；增刊10)：3-7，2012)。
将药物与单克隆抗体进行位点特异性和稳定连接的一种方法是通过聚糖工程进行的。单克隆抗体在每条重链(Qasba等，Biotechnol Prog 24：520-526,2008)的CH2结构域中的Asn297残基处具有一条保守的N联寡糖链。通过使用突变的β1,4-半乳糖基转移酶(Y289L-Gal-T1；美国专利申请公开2007/0258986和2006/0084162，通过引用并入本文)，将2-酮-半乳糖转移到抗体重链上的游离GlcNAc残基以为连接提供化学处理。
单克隆抗体连接的寡糖链可根据末端半乳糖残基分为三组—完全半乳糖基化(两个半乳糖残基；IgG-G2)、一个半乳糖残基(IgG-G1)或完全去半乳糖基化(IgG-G0)。用β1,4-半乳糖苷酶处理单克隆抗体会将抗体转化为IgG-G0糖型。突变体β1,4-半乳糖基转移酶能够将2-酮半乳糖或2-叠氮半乳糖从它们各自的UDP衍生物转移到IgG-G1和IgG-G0糖型上的GlcNAc残基上。转移糖上的化学处理能使多种分子通过聚糖残基与单克隆抗体连接(Qasba等，Biotechnol Prog 24：520-526,2008)。
本文提供了ADC，ADC包括与结合间皮素的单克隆抗体结合(如特异性结合)的药物(如细胞毒剂)。在一些实施方案中，药物是小分子。在一些示例中，药物是交联剂、抗微管剂和/或抗有丝分裂剂，或适合介导杀死肿瘤细胞的任意细胞毒剂。示例性细胞毒剂包括但不限于PDB、auristatin、美登木素生物碱、多拉司他丁、加利车霉素、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽环类、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢霉烯、CC1065、喜树碱、组合物、多拉司他汀、双癌霉素、烯二炔、格尔德霉素、吲哚并苯二氮卓二聚体、嘌呤霉素、tubulysin、hemiasterlin、剪接抑制素或pladienolide，及其具有细胞毒性的立体异构体、等排体、类似物和衍生物。
在一些实施按方案中，ADC包括吡咯并苯并二氮杂(PBD)。天然产物蒽霉素(一种PBD)于1965年首次报道(Leimgruber等人，J Am Chem Soc，87：5793-5795，1965；Leimgruber等人，J Am Chem Soc，87：5791-5793，1965)。从那时起，已经报道了许多BD，包括天然存在的和合成的类似物(Gerratana，Med Res Rev 32(2)：254-293,2012；和美国专利6,884,799；7,049,311；7,067,526,57,153；7153；7,528,126；和7,557,099)。作为一个示例，PDB二聚体识别并结合特定的DNA序列，并且已证明可用作细胞毒剂。PBD二聚体已与抗体连接，所得的ADC显示出具有抗癌特性(参见，例如，US 2010/0203007)。PBD二聚体上的示例性连接位点包括五元吡咯环、PBD单元之间的系链和N10-C11亚胺基团(参见WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257/US 36439；US 2011/0256157；和WO 2011/130598)。
在一些实施方案中，ADC包括与一种或多种美登木素生物碱分子连接的抗体。美登木素生物碱是美登素的衍生物，是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首先分离自东非灌木Maytenus serrata(美国专利3,896,111)。随后，发现了某些微生物也产生类美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。合成的美登木素生物碱公开于例如美国专利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。
在一些实施方案中，ADC包括与尾海兔素或auristatin或其类似物或衍生物连接的抗体(参见美国专利5,635,483；5,780,588；5,767,237；和6,124,431)。Auristatin是海洋软体动物化合物尾海兔素-10的衍生物。尾海兔素和auristatin已被证明会干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人，Antimicrob Agents and Chemother 45(12)：3580-3584,2001)并具有抗癌作用(美国专利5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等，Antimicrob Agents Chemother 42：2961-2965,1998)。示例性多拉司他汀和auristatin包括但不限于多拉司他汀10、auristatin E、auristatin F、auristatin EB(AEB)、auristatin EFP(AEFP)、MMAD(单甲基auristatin D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF(单甲基auristatin F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多莱索赖氨酸-多拉丙氨酸-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基奥瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多莱索莱因-多拉丙氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰戊酸-AE酯(AEVB)和其他auristatins(参见例如，美国公开2013/0129753)。
在一些实施方案中，ADC包括与一种或多种加利车霉素分子连接的抗体。加利杀毒素家族的抗生素及其类似物能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂(Hinman等，CancerRes 53：3336-3342,1993；Lode等，Cancer Res 58：2925-2928,1998)。在美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；和5,767,285中描述了用于制备具有加利杀霉素药物部分的ADC的示例性方法。
在一些实施方案中，ADC包括蒽环类药物。蒽环类药物是具有细胞毒活性的抗生素化合物。据信，蒽环类药物可以通过多种不同的机制进行操作以杀死细胞，包括将药物分子嵌入细胞的DNA中，从而抑制DNA依赖性核酸的合成；诱导自由基的产生，然后该自由基与细胞大分子反应以对细胞造成损害；和/或使药物分子与细胞膜的相互作用。非限制性的示例性蒽环类药物包括阿霉素、表阿霉素、伊达柔比星、柔红霉素、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、尼莫霉素、丙柔比星、米托蒽醌及其衍生物。例如，PNU-159682是奈莫比星的有效代谢物(或衍生物)(Quintieri等，Clin Cancer Res 11(4)：1608-1617,2005)。Nemorubicin是多柔比星的半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉代基团(Grandi等人，Cancer Treat Rev 17：133,1990；Ripamonti等人，Br J Cancer 65：703-707,1992).
在一些实施方案中，ADC可进一步包括接头。在一些示例中，接头是双功能或多功能部分，所述双功能或多功能部分可用于将一个或多个药物部分与抗体连接以形成ADC。在一些实施方案中，通过使用具有用于与药物和抗体共价连接的反应性官能团的接头制备ADC。例如，抗体的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制得ADC。
在一些示例中，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。具有此类反应性官能团的示例性接头包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯等激活的酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
在一些示例中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。这种亲电子基团的示例包括但不限于醛和酮羰基团。在一些情况下，接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性示例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。
在一些示例中，接头是可切割接头，其有利于药物的释放。可切割接头的示例包括酸不稳定接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感接头(例如，肽酶敏感)、光不稳定接头和含二硫化物接头(Chari等人，Cancer Res 52：127-131,1992；美国专利5,208,020)。
本文公开的ADC可以单独地或者与另一治疗剂或与用于癌症治疗的任意标准疗法(如肿瘤的手术切除、化学疗法或放射疗法)联合用于治疗间皮素阳性癌。
VII.多特异性抗体
多特异性抗体是由两种或多种单克隆抗体(如单结构域抗体)或两种或多种不同单克隆抗体的抗原结合片段组成的重组蛋白。例如，双特异性抗体由两种不同单克隆抗体(或两种不同的单结构域抗体)的抗原结合片段组成。因此，双特异性抗体结合两种不同的抗原，三特异性抗体结合三种不同的抗原。通过同时靶向例如两种CTL(如CTL受体成分，如CD3)或效应天然杀伤(NK)细胞以及至少一种肿瘤抗原，多特异性抗体可用于癌症免疫疗法。本文公开的间皮素特异性单克隆抗体可用以产生靶向间皮素和CTL二者或者靶向间皮素和NK细胞二者的多特异性(如双特异性或三特异性)抗体，从而为治疗表达间皮素的癌症提供了治疗手段。在一个示例中，本文公开的间皮素特异性单克隆抗体用以产生靶向间皮素和PD1、PDL1、EGFR或VEGF的多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体，从而为治疗表达间皮素的癌症提供了治疗手段。
本文提供了包括间皮素特异性单克隆抗体的多特异性(如三特异性或双特异性)单克隆抗体。在一些实施方案中，多特异性单克隆抗体进一步包括特异性结合T细胞受体的组分如CD3的单克隆抗体。在其他实施方案中，多特异性单克隆抗体进一步包括特异性结合CD16、Ly49或CD94等NK细胞激活受体的单克隆抗体。还提供了编码多特异性抗体的分离的核酸分子和载体，以及包括核酸分子或载体的宿主细胞。包括间皮素特异性抗体的多特异性抗体可用于治疗表达间皮素的癌症。因此，本文提供了通过选择患有表达间皮素的癌症的受试者并向受试者施用治疗有效量的靶向间皮素的多特异性抗体来治疗患有癌症的受试者的方法。
VIII.抗体-纳米微粒结合物
本文公开的单克隆抗体可与多种不同类型的纳米微粒缀合以通过将抗体与表达于肿瘤细胞表面的间皮素结合而将细胞毒剂或其他抗癌剂直接递送至肿瘤细胞。纳米微粒的使用减少了脱靶副作用，并且还可以提高药物的生物利用度并减少达到治疗效果所需的药物剂量。可以定制纳米微粒制剂以适合要携带或封装在纳米微粒内的药物。例如，疏水性分子可以掺入纳米微粒的核内，而亲水性药物可以携带在由聚合物或脂质壳保护的水性核内。纳米微粒的示例包括但不限于纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束、泡囊和聚合物纳米微粒(Fay和Scott,免疫疗法Immunotherapy 3(3)：381-394,2011)。
脂质体是目前用于药物递送的最常见的纳米微粒类型之一。与脂质体缀合的抗体通常被称为“免疫脂质体”。免疫脂质体的脂质体成分通常是一个或多个同心磷脂双层的脂质囊泡。在某些情况下，磷脂由亲水性头部基团和两条疏水链组成，以能够封装疏水性和亲水性药物。常规的脂质体通过网状内皮系统(RES)的巨噬细胞迅速从循环中清除。为了产生长循环脂质体，可以调节脂质体的组成、大小和电荷。脂质体的表面也可以用如糖脂或唾液酸来修饰。例如，包括聚乙二醇(PEG)会显著增加循环半衰期。用作药物递送剂的脂质体，包括用于制备免疫脂质体，在本领域中已有描述(参见，例如，Paszko和Senge，Curr Med Chem19(31)5239-5277，2012；Immordino等人，Int J纳米医学1(3)：297-315，2006年；美国专利申请公开2011/0268655；2010/00329981)。
泡囊(Niosomes)是基于非离子表面活性剂的囊泡，其结构类似于脂质体。泡囊的膜仅由非离子表面活性剂组成，例如聚甘油-烷基醚或N-棕榈酰葡糖胺。泡囊的范围从小的单层颗粒到大的多层颗粒。这些纳米颗粒是单分散的、水溶性的、化学稳定的、毒性低、可生物降解和非免疫原性的，并提高了封装药物的生物利用度。
树枝状聚合物包括一系列支化聚合物复合物。这些纳米颗粒是水溶性的、生物相容性的，并且对于人类使用具有足够的非免疫原性。通常，树枝状聚合物由引发剂核组成，周围是一层选定的聚合物，该聚合物接枝到核上，形成支化的大分子复合物。树枝状聚合物通常使用聚合物如聚(酰氨基胺)或聚(L-赖氨酸)生产。树枝状聚合物已用于多种治疗和诊断应用，包括用于递送DNA、RNA、生物成像造影剂和化学治疗剂。
聚合物胶束由组装成疏水核的两亲性共聚物(由亲水性和疏水性单体单元组成)的聚集体组成，被暴露于水性环境的亲水性聚合物链冠包围。在许多情况下，用于制备聚合物胶束的聚合物是异双功能共聚物，由形成颗粒核心的PEG、聚乙烯吡咯烷酮和疏水性聚(L-丙交酯)或聚(L-赖氨酸)的亲水嵌段组成。聚合物胶束可用于携带溶解度差的药物。这些纳米颗粒已被用于封装多种抗癌药物，包括阿霉素和喜树碱。还开发了阳离子胶束以携带DNA或RNA分子。
聚合物纳米粒子包括纳米球和纳米胶囊。纳米球由聚合物的固体基质组成，而纳米胶囊包括水核。选择的制剂通常取决于要携带/包封的治疗剂的溶解度；水溶性差的药物更容易封装在纳米球中，而水溶性和不稳定的药物，如DNA和蛋白质，更容易封装在纳米胶囊中。用于生产这些纳米颗粒的聚合物包括，例如，聚(丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)。
抗体(或其片段)可以根据本领域已知的标准方法与合适的纳米颗粒缀合。例如，缀合可以是共价的或非共价的。在纳米颗粒是脂质体的一些实施方案中，抗体通过PEG链连接到空间稳定的长循环脂质体。抗体或抗体片段与脂质体的偶联还可涉及硫酯键，例如通过硫醇和马来酰亚胺基团的反应。交联剂可用于产生巯基以将抗体连接到纳米颗粒上(Paszko和Senge，Curr Med Chem 19(31)5239-5277,2012)。
IX.组合物和使用方法
提供的组合物包括一种或多种所公开的单克隆抗体，其结合(例如特异性结合)载体中的间皮素。还提供了包括ADC、CAR(和包括CAR的CTL)、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒结合物、免疫脂质体和免疫结合物的组合物。组合物可以以单位剂型制备用于施用于受试者。给药的量和时间由治疗的临床医生决定以达到期望的结果。抗体、ADC、CAR、CTL、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒结合物、免疫脂质体或免疫结合物可以配制用于全身或局部(例如肿瘤内)给药。在一个示例中，该抗体被配制用于肠胃外给药，例如静脉内给药。
用于给药的组合物可以包括在水性载体等药学上可接受的载体中的抗体、ADC、CAR、CTL、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米微粒结合物、免疫脂质体或免疫结合物的溶液，可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以广泛变化，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等根据所选择的特定给药模式和受试者的需要进行选择。
用于静脉内给药的典型药物组合物包括每个受试者每天大约0.1至10mg抗体(或ADC、CAR、多特异性抗体、抗体-纳米微粒结合物或免疫结合物)。可以使用每名受试者每天0.1至大约100mg的剂量，特别是如果将药剂施用于隐蔽部位而不是进入循环或淋巴系统，例如进入体腔或进入器官的管腔。制备可给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在Remington's Pharmaceutical Science,19th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA(1995)等中有更详细的描述。
本文公开的单结构域抗体也可以通过其他途径进行给药，包括通过吸入、口服、局部或眼内的途径。在一些示例中，单结构域抗体(或其结合物)通过细针施用。
抗体(或其他治疗分子)可以冻干形式提供并且在给药前用无菌水再水化，尽管它们也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将抗体溶液加入含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，并且在某些情况下，以0.5至15mg/kg体重的剂量给药。自1997年RITUXANTM获批以来，抗体药物已在美国上市。抗体、ADC、CAR、多特异性(如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米微粒结合物、免疫脂质体或免疫结合物可以通过缓慢输注而非静脉推注或丸注的方式进行给药。在一个示例中，给予较高的负荷剂量，随后以较低的水平给予维持剂量。例如，4mg/kg的初始负荷剂量可以在大约90分钟的时间内输注完，然后如果之前的剂量是在30分钟内输注2mg/kg的每周维持剂量，则为4-8周。耐受性良好。
控释肠胃外制剂可制成植入物、油性注射剂或微粒系统。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)。微粒系统包括例如微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米微粒。微胶囊含有作为中心核心的治疗性蛋白质，如细胞毒素或药物。在微球中，治疗剂分散在整个微粒中。小于约1μm的微粒、微球和微胶囊一般分别称为纳米微粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5μm，因此只能静脉注射纳米微粒。微粒的直径通常约为100μm，可通过皮下或肌肉注射进行给药。参见，例如，Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi，关于受控药物递送的论文，A.Kydonieus编辑，Marcel Dekker,Inc.纽约，NY，第315-339页，(1992年)。
聚合物可用于本文公开的基于抗体的组合物的离子控制释放。用于受控药物递送的各种可降解和不可降解聚合物基质是本领域已知的(Langer,Accounts Chem.Res.26：537-542,1993)。例如，嵌段共聚物polaxamer 407在低温下以粘稠但可移动的液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。它已被证明是重组白细胞介素2和脲酶的配制和持续递送的有效载体(Johnston等人，Pharm.Res.9：425-434,1992；和Pec等人，J.Parent.Sci.技术44(2)：58-65,1990)。或者，羟基磷灰石已被用作控制蛋白质释放的微载体(Ijntema等人，Int.J.Pharm.112：215-224,1994)。在又一方面，脂质体用于脂质包封药物的控释以及药物靶向(Betageri等人，脂质体药物递送系统Liposome Drug Delivery Systems,TechnomicPublishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。用于受控递送治疗性蛋白的许多另外的系统是已知的(参见美国专利5055303；5188837；4235871；4501728；4837028；4957735；5019369；5055303；5514670；5413797；5268164；5004697；4902505；5506206；5271961；5254342和5534496)。
A.治疗方法
可以施用本文公开的抗体、组合物、CAR(和表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米微粒结合物、免疫脂质体和免疫结合物以减缓或抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞的转移，如间皮素阳性癌症。在这些应用中，相受试者施用治疗有效量的组合物，其量足以抑制癌细胞的生长、复制或转移，或者抑制癌症的迹象或症状。合适的受试者可以包括诊断患有表达间皮素的癌症的那些，如，但不限于间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。
本文提供了一种通过向受试者施用本文公开的治疗有效量的间皮素特异性抗体、免疫结合物、CAR(或表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米微粒缀合物、免疫脂质体或组合物来治疗受试者中间皮素阳性癌的方法。本文还提供了一种通过向受试者施用本文公开的治疗有效量的间皮素特异性抗体、免疫结合物、CAR(如表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米微粒缀合物、免疫脂质体或组合物来抑制受试者中间皮素阳性癌的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，间皮素阳性癌是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。在一些示例中，例如与治疗前的体积相比，该方法使肿瘤(例如转移瘤)的体积减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或者甚至100％。在一些示例中，例如与治疗前的体积相比，该方法使肿瘤(例如转移)的大小减小至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或者甚至100％。在一些示例中，与治疗前的数量相比，该方法将转移瘤的数量减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或者甚至100％。在一些示例中，例如与治疗前的数量相比，该方法增加了受试者的预后，如使受试者的寿命增加了至少4个月、至少6个月、至少8个月、至少9个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月。在一些示例中，实现了这些效果的组合。
本文公开的间皮素特异性单克隆抗体、ADC、CAR(例如，表达CAR的CTL)、多特异性(如双特异性或三特异性)抗体、免疫结合物、免疫脂质体或组合物的治疗有效量将取决于疾病的严重程度、疾病类型和患者的一般健康状况。基于抗体的组合物的治疗有效量是提供如临床医生或其他合格观察者所注意到的症状的主观缓解或客观可识别的改善的量。
本文公开的间皮素特异性抗体、ADC、CAR、免疫结合物、多特异性抗体、抗体-纳米微粒结合物、免疫脂质体和组合物的施用还可以伴随其他抗癌剂或治疗性治疗(如肿瘤的手术切除)任意适宜的抗癌基可以与本文公开的抗体、组合物和免疫结合物联合施用。示例性抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂。其他的抗癌治疗包括放射性疗法和其他特异性靶向癌细胞的抗体(如抗PD1、抗PDL1、抗VEGF和抗EGFR抗体)。
烷化剂的非限制性示例包括氮芥(如氮芥、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(如白消安)、亚硝基脲(如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲佐菌素或达卡巴嗪)。
抗代谢物的非限制性示例包括叶酸类似物(如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(如5-FU或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。
天然产物的非限制性示例包括长春花生物碱(如长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(如更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素C)和酶(如L-天冬酰胺酶)。
其他药剂的非限制性示例包括铂配位配合物(如顺式二胺二氯铂II也称为顺铂)、取代脲(如羟基脲)、甲基肼衍生物(如丙卡巴肼)和肾上腺皮质抑制剂(如米托坦)和氨基鲁米特)。
激素和拮抗剂的非限制性示例包括肾上腺皮质激素(如泼尼松)、孕激素(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸孕酮)、雌激素(如己烯雌酚和乙炔雌二醇)、抗雌激素(如和他莫昔芬)和雄激素(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的示例包括阿霉素、苯丙氨酸氮芥、Ara-C、BiCNU、白消安、CCNU、卡铂、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、DTIC、5-FU、氟达拉滨、Hydrea、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、Mithramycin、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其他紫杉烷类，如多西紫杉醇)、Velban、长春新碱、VP-16，而一些较新的药物包括吉西他滨(Gemzar)、赫赛汀、伊立替康(Camptosar、CPT-11)、Leustatin、Navelbine、RituxanSTI-571、Taxotere、Topotecan(Hycamtin)、Xeloda(Capecitabine)、Zevelin和骨化三醇。
可以使用的免疫调节剂的非限制性示例包括AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.)、溴吡胺(Upjohn)、γ干扰素(Genentech)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；遗传学研究所)、IL-2(Cetus或Hoffman-LaRoche)、人免疫球蛋白(Cutter Biological)、IMREG(来自新奥尔良的Imreg，La)、SK&F 106528和TNF(肿瘤坏死因子；Genentech)。
某些类型癌症的另一种常见治疗方法是手术治疗，例如癌症或其一部分的手术切除。治疗的另一个示例是放射疗法，例如向肿瘤部位施用放射性物质或能量(如外照射疗法)以帮助在手术切除之前根除肿瘤或缩小肿瘤。
B.用于诊断和检测的方法
本文提供了用于体外或体内检测间皮素蛋白的方法。例如，公开的单克隆抗体可用于体内肿瘤成像。为了将公开的抗体用作体内诊断试剂，用可放射性同位素、荧光标记或正电子发射放射性核素等可检测部分来标记抗体。作为一个示例，本文公开的单结构域抗体可以与正电子发射放射性核素缀合以用于正电子发射断层扫描(PET)；该诊断过程通常称为免疫PET。虽然全长抗体可以制成良好的免疫PET试剂，但它们的生物半衰期需要在成像前等待几天，这会增加相关的非目标辐射剂量。较小的单结构域抗体具有适合当天成像的生物半衰期。
在其他情况下，在生物样本中检测间皮素表达。样本可以是任意样本，包括但不限于来自活检、尸体解剖和病理标本的组织。生物样本还包括组织切片，例如，为组织学目的而取的冷冻切片。生物样本还包括体液，如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿液。生物样本通常获得自哺乳动物，如人类或非人类灵长类动物。
本文提供了一种通过将来自受试者的样本与本文公开的间皮素特异性单克隆抗体接触来确定受试者是否患有间皮素阳性癌症以及检测抗体与样本的结合的方法。与抗体与对照样本的结合相比，抗体与样本的结合的增加将受试者鉴定为患有间皮素阳性癌。
在另一个实施方案中，提供了通过将来自被诊断患有间皮素阳性癌症的受试者的样本与本文公开的间皮素特异性单克隆抗体接触并检测抗体与样本的结合来确认受试者中间皮素阳性癌症的诊断的方法。与抗体与对照样本的结合相比，抗体与样本结合的增加证实了受试者中间皮素阳性癌的诊断。
在所公开方法的一些示例中，直接标记单克隆抗体。
在其他示例中，该方法进一步包括使特异性结合单克隆抗体的二抗(检测抗体)与样本接触；并检测二抗的结合。与二抗与对照样本的结合相比，二抗与样本结合的增加检测了受试者中的间皮素阳性癌症或确认了受试者中间皮素阳性癌症的诊断。
在一些情况下，癌症是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。
在一些示例中，对照样本是来自没有癌症的受试者的样本。在具体的示例中，样本是血液或组织样本。
在诊断和检测方法的一些实施方案中，结合(例如，特异性结合)间皮素的抗体直接用可检测标记物标记。在另一个实施方案中，结合(例如，特异性结合)间皮素的抗体(一抗)是未被标记的，而可以结合特异性结合间皮素的抗体的二抗或其他分子被标记。如本领域技术人员公知的，选择能够特异性结合一抗的特定种类和类别的二抗。例如，如果一抗是人IgG，则二抗可以是抗人IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者均可商购获得。
抗体或二抗的适宜标记物包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。适宜酶的非限制性示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适宜的辅基复合物的非限制性示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。适宜的荧光材料的非限制性示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制性的示例性发光材料是鲁米诺；非限制性示例性磁性剂是钆，非限制性的示例性放射性标记物包括125I、131I、35S或3H。
在另一个实施方案中，可以通过竞争免疫测定法利用标记有可检测物质标记间皮素蛋白标准品和特异性结合间皮素的未标记抗体来测定生物样本中的间皮素。在该测定中，将生物样品、标记的间皮素蛋白标准品和特异性结合间皮素的抗体结合起来，并测定与未标记抗体结合的标记间皮素蛋白标准品的量。生物样本中的间皮素的量与与特异性结合间皮素的抗体结合的标记间皮素标准蛋白的量成反比。
本文公开的免疫测定和方法可用于多种目的。在一个实施方案中，特异性结合的抗体可用于检测细胞培养物中细胞间皮素的生成。在另一个实施方案中，抗体可用于检测组织样本或血液或血清样本等生物样本中的中间皮素的量。在一些示例中，间皮素是细胞表面间皮素。在其他示例中，间皮素蛋白是可溶的(例如，在细胞培养上清液或体液样本中，如血液或血清样本)。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测血液样本或组织样本等生物样本中的间皮素的试剂盒。例如，为了确认受试者中的癌症诊断，可以进行活检以获得用于组织学检查的组织样本。用于检测间皮素的试剂盒通常包括特异性结合间皮素的单克隆抗体，如本文公开的任意单克隆抗体，并且可以进一步包括可以特异性结合抗间皮素抗体的标记的二抗。在一个具体实施方案中，试剂盒中的抗间皮素抗体本身被标记(例如，用荧光、放射性或酶标记物)。
在一个实施方案中，试剂盒包括披露了结合间皮素的抗体的使用方法的说明资料。说明资料可以以电子形式(如计算机软盘或光盘)或可视形式(如视频文件)书写。试剂盒还可以包括附加组件以有利于试剂盒设计的特定应用。因此，例如，该试剂盒可以另外包括检测标记物的工具(如酶标记的酶底物、检测荧光标记的过滤器组、适宜的二级标记物例，如二级抗体等)。试剂盒还可包括缓冲液和其他常规用于特定方法实践的试剂。
在一个实施方案中，诊断试剂盒包括免疫测定。尽管免疫测定的细节可能随所采用的特定形式而变化，但检测生物样本的中间皮素的方法通常包括使生物样本与抗体接触的步骤，该抗体在免疫反应条件下与间皮素发生特异性反应。使抗体在免疫反应条件下特异性结合形成免疫复合物，直接或间接检测免疫复合物(结合抗体)的存在。
本文公开的抗体还可用于免疫测定，例如但不限于放射免疫测定(RIA)、ELISA或免疫组织化学测定。该抗体还可用于荧光激活细胞分选(FACS)。FACS采用多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道，以及其他更复杂的检测水平，以分离或分选细胞(参见美国专利5,061,620)。如本文所公开的，结合间皮素的任何单克隆抗体都可用于这些测定中。因此，抗体可用于常规免疫测定，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。
提供以下示例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些示例不应被解释为将本公开内容限制为所描述的特定特征或实施例。
实施例
实施例1：结合人和小鼠间皮素的骆驼VHH抗体
本实施例描述了鉴定和表征A101和G8，两种以高亲和力结合人和小鼠间皮素的骆驼(单峰骆驼)单结构域(VHH)单克隆抗体。
抗体A101和G8通过测序淘选从骆驼VHH噬菌体展示文库中分离。进行多克隆噬菌体ELISA以在四轮淘选中的每一轮后评估噬菌体克隆与人和小鼠间皮素的结合。四轮后，噬菌体展示显示出了与人和小鼠间皮素的较强的结合(图1)。VHH克隆A101和G8从噬菌体文库中分离并进行进一步表征。A101和G8的纯度和分子量见图2。A101的核苷酸和氨基酸序列在本文中分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述。G8的核苷酸和氨基酸序列在本文中分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述。
通过ELISA评估A101和G8抗体与人和小鼠间皮素的结合(图3)。R&D间皮素是一种带有His标签但无Fc的单体。Fc-间皮素是一种二价兔Fc融合蛋白。如图3所示，A101和G8抗体结合人和小鼠间皮素蛋白。
为了确定A101和G8结合的间皮素表位，使用全长人间皮素蛋白或间皮素片段进行了竞争性ELISA：片段1(残基296-390)、片段2(残基391-486)和片段3(残基487-598)，编号基于具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的人间皮素(参见Kaneko等人,JBiol Chem 284(6)：3739-3749,2009)。结果证明，A101和G8都结合了片段1和全长间皮素，表明了每个抗体的表位都在N-末端片段1中(图4)。
A101(图5A-5C)和G8(图6A-6C)与细胞表面表达的间皮素的结合通过流式细胞术评估。结合实验包括人间皮瘤癌细胞系M30和H226、人卵巢癌细胞系OVCAR8、人胰腺细胞系Panc3.014、KLM1和T3M4、人胆管癌细胞系KMBC和OZ以及小鼠胰腺癌细胞系PDA95775、CREP133234和CREP133239。使细胞与10μg/ml A101或G8接触，并通过流式细胞术测定抗体与细胞表面的结合。如图5A-5C和6A-6C所示，两种抗体都能够结合所有测试细胞系表面的间皮素。两种抗体均不能结合间皮素阴性细胞系(图11和图12)。
A101和G8用于生成间皮素靶向的CAR T细胞。产生了表达CAR的慢病毒构建体，该CAR包括VHH抗体A101或VHH抗体G8以及截短的人EGFR(huEGFRt)(图7A；也参见上文第IV节)。为了确认载体的成功转导和CAR在T细胞中的表达，用流式细胞术来检测huEGFRt的表达。如图7B所示，转导效率为大约40-50％。
使用表达荧光素酶的A431(间皮素阴性)、H9(间皮素过表达)、KLM1(胰腺癌)和H226(间皮瘤)细胞估基于A101或G8的CAR T细胞对间皮素阳性细胞的杀伤。细胞与A101或G8 CAR转导的T细胞以3.125：1至100：1的E：T比率共培养20小时，并使用基于发光的细胞溶解测定法测量特异性裂解。如图8所示，间皮素靶向的CAR T细胞可诱发所有表达间皮素的细胞(H9、KLM1和H226)的特异性裂解，但不诱发间皮素阴性A431细胞的特异性裂解。
在间皮瘤的小鼠模型中评估基于抗体A101或G8的间皮素靶向的CAR T细胞。NSG小鼠用H266细胞进行腹腔内接种以建立肿瘤(图9A)。在肿瘤细胞接种后第13天，向荷瘤小鼠腹腔内施用模拟T细胞或20×106个CAR T细胞。通过生物发光成像监测肿瘤负荷27天(图9B)。图9C中示出了小鼠中生物发光的定量。A101 CAR T细胞显示出了抗肿瘤活性，并显示出了根除H226异种移植肿瘤的趋势。
实施例2：鉴定人间皮素上的A101和G8结合表位
本实施例描述了对A101和G8骆驼VHH抗体结合的人间皮素表位的进一步分析。
基于如SEQ ID NO：12(图10A)所示的人间皮素氨基酸序列产生人间皮素的若干片段。这些片段包括人间皮素的氨基酸残基296-390(I区)、391-486(II区)和487-581(III区)，以及I区，特别是IAB区(296-359)、IBC区(328-405)、IA区(296-337)、IB区(328-369)和IC区(360-405)内的较小片段。IAB区(296-359)是间皮素结合伴侣MUC16/CA125的结合区(Kaneko等，J Biol Chem 284(6)：3739-3749,2009)。还产生了具有E321A、W321A或Y318A取代的IAB区(269-359)突变体。
A101和G8与每个间皮素片段的结合通过ELISA评估(图10B)。结果表明，A101和G8骆驼单结构域抗体主要结合N末端区I区(296-390)，包括IAB结构域(64个残基，296-359)，这是MUC16结合所需要的区域，表明A101和G8抗体可以阻断MUC16/间皮素相互作用。此外，当酪氨酸残基318突变为丙氨酸(Y318A)时，A101和G8结合丢失。残基318是MUC16结合的关键位点，因此MUC16也不结合Y318A突变体。这些结果表明两种单结构域抗体都结合MUC16/CA125的配体结合位点。
实施例3：表达A101和G8的CAR T细胞的体外和体内活性
本实施例描述了A101和G8 CAR T细胞在异种移植动物模型中间皮素阳性细胞的体外细胞杀伤和间皮素肿瘤的生长抑制。
实施例1中描述了间皮素靶向的CAR的生成。来自健康供体的PBMC用A101或G8 CART细胞转导。西妥昔单抗用以检测细胞表面的CAR。CAR T细胞的转导效率大于60％(图13A)。接下来，使用H9(间皮素过表达细胞系)在CAR T细胞杀伤试验中评估CAR T细胞；KLM1，人胰腺癌系；H226，人间皮瘤系；和A431，间皮素阴性细胞。A101和G8 CAR T细胞均杀死间皮素阳性细胞系(H9、KLM1和H226)，但不杀死间皮素阴性细胞(A431)(图13B)。A101 CAR T细胞在体外表现出比G8 CAR T细胞更好的细胞溶解活性。
在携带人腹膜间皮瘤异种移植物的小鼠中对A101 CAR T细胞进行测试。用2MH226-luc细胞接种7周龄大的雌性NSG小鼠。在第3天，用模拟T细胞或A101 CAR T细胞处理动物(图14B，顶部)。使用IVIS成像系统通过体内生物发光测量评估肿瘤大小。图3中显示了模拟处理的和A101处理的小鼠的生物发光图像。图14A中显示了模拟处理和A101处理的动物的光亮度(底部)。结果表明，A101 CAR T细胞有效地抑制了小鼠H226异种移植瘤的生长。
鉴于所公开的主题的原理可以应用到的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅是本公开的示例并且不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
<120> 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单域抗体
<130> 4239-101800-02
<150> US 62/789,650
<151> 2019-01-08
<160> 12
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸 (A101)
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc acggtgcagg ctggagggtc gctgaaactc 60
gcctgcgcag cctctggatt acccagaacg tacaatgtca tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcaata atttatacta cgactggagc aacatactat 180
cgcgactccg tcaagggccg ggccaccatc tcccaagaca acgccaagaa gtcggtgtct 240
ctccaaatga acagcctgag gcctgaggac acggccatct attactgtgt ggctaggcaa 300
cccaatagtg gtccctggga gtattggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcaa 358
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽 (A101)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Arg Thr Tyr Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ile Ile Tyr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys Ser Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Arg Gln Pro Asn Ser Gly Pro Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸 (G8)
<400> 3
caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacaa cttctggata caccaacagt tacaagtgga tgggctggtt ccgccaggct 120
ccaggacaag agcgcgaggg ggtcgcagtt atttacaccg gtaatgatag gacatactat 180
agtgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccgagaca acgccaagaa tatgatctat 240
ctggacatga cgcgcctgag acctgaggac agcgctgtgt acgagtgtgc catcggacat 300
gatggcgcat ggcgttactg gggccaggga acgcaggtca ccgtctcctc a 351
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽 (G8)
<400> 4
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Tyr Lys
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Thr Gly Asn Asp Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Met Thr Arg Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Glu Cys
85 90 95
Ala Ile Gly His Asp Gly Ala Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 11
<211> 335
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 12
<211> 622
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu
85 90 95
Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro
100 105 110
Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro
115 120 125
Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu
165 170 175
Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu
180 185 190
Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp
225 230 235 240
Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly
245 250 255
Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile
275 280 285
Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser
290 295 300
Gly Lys Lys Ala Pro Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys
305 310 315 320
Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met
325 330 335
Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp
405 410 415
Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr
420 425 430
Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu
435 440 445
Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp
450 455 460
Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala
465 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile
485 490 495
Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser
500 505 510
Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr
515 520 525
Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly
530 535 540
Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg
545 550 555 560
Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu
565 570 575
Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser
580 585 590
Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro
595 600 605
Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
610 615 620

Claims (60)

1.一种特异性结合间皮素的单结构域单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中通过使用Kabat、IMGT或Paratome编号方案或Kabat、IMGT和Paratome编号方案的组合来定义CDR序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体，其中：
所述单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：2的残基31-35、50-66和99-108；
所述单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：2的残基26-33、51-58和97-108；或者
所述单克隆抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：2的残基27-35、47-61和97-108。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体，其中：
所述单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：4的残基31-35、50-66和99-106；
所述单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：4的残基26-33、51-58和97-106；或者
所述单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括SEQ ID NO：4的残基27-35、47-60和98-106。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中：
所述单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少95％的同一性并且包括SEQ IDNO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者
所述单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少95％的同一性并且包括SEQ IDNO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的氨基酸包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4组成。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是骆驼抗体。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体。
10.一种嵌合抗原受体(CAR)，包括权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的CAR，还包括铰链区、跨膜结构域、共刺激信号部分、信号结构域或其任意组合。
12.根据权利要求11所述的CAR，其中所述铰链区包括CD8α铰链区。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的CAR，其中所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。
14.根据权利要求11-13中任意一项所述的CAR，其中所述共刺激信号部分包括4-1BB信号部分。
15.根据权利要求11-14中任意一项所述的CAR，其中所述信号结构域包括CD3ζ信号结构域。
16.一种表达权利要求10-15中任意一项所述CAR的分离的细胞。
17.根据权利要求16所述的分离的细胞，其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或天然杀伤(NK)细胞。
18.一种免疫结合物，包括权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体和效应分子。
19.根据权利要求18所述的免疫结合物，其中所述效应分子是毒素。
20.根据权利要求19所述的免疫结合物，其中所述毒素是假单胞菌外毒素或其变体。
21.根据权利要求20所述的免疫结合物，其中所述假单胞菌外毒素变体是PE38。
22.根据权利要求18所述的免疫结合物，其中所述效应分子是光子吸收剂。
23.根据权利要求18所述的免疫结合物，其中所述效应分子是可检测标记物。
24.根据权利要求23所述的免疫结合物，其中所述可检测标记物包括荧光团、酶活发射性同位素。
25.一种抗体-药物结合物(ADC)，包括与权利要求1-19中任意一项所述单克隆抗体缀合的药物。
26.根据权利要求25所述的ADC，其中所述药物是小分子。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的ADC，其中所述药物是抗微管剂、抗有丝分裂剂和/或细胞毒素剂。
28.一种多特异性抗体，包括权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体和至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其是双特异性抗体。
30.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其是三特异性抗体。
31.根据权利要求28-30中任意一项所述的多特异性抗体，其中所述至少一个另外的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合T细胞受体或天然杀伤(NK)细胞激活受体的组分。
32.一种抗体-纳米微粒结合物，包括与权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体缀合的纳米微粒。
33.根据权利要求32所述的抗体-纳米微粒结合物，其中所述纳米微粒包括聚合物纳米微粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束或泡囊。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的抗体-纳米微粒结合物，其中所述纳米微粒包括细胞毒素剂。
35.一种融合蛋白，其包括权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体和异源性蛋白或肽。
36.根据权利要求35所述的融合蛋白，其中所述异源性蛋白是Fc蛋白。
37.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体、权利要求10-15中任意一项所述的CAR、权利要求18-21中任意一项所述的免疫结合物、权利要求28-31中任意一项所述的多特异性抗体或权利要求35或权利要求36所述的融合蛋白。
38.根据权利要求37所述的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其简并变体。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的分离的核酸分子，其可操作地与启动子连接。
40.一种载体，其包括权利要求37或权利要求38所述的核酸分子。
41.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括在5’至3’方向上：
编码第一粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；
编码权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体的核酸；
编码胞外铰链区的核酸；
编码跨膜结构域的核酸；
编码胞内共刺激结构域的核酸；
编码胞内信号结构域的核酸；
编码自切割2A肽的核酸；
编码第二GMCSFRss的核酸；以及
编码截短的人上皮细胞生长因子受体(huEGFRt)的核酸。
42.根据权利要求41所述的核酸分子，其还包括编码所述第一GMCSFRss的核酸的人延伸因子1α(EF1α)启动子序列5’。
43.一种载体，其包括权利要求41或权利要求42所述的核酸分子。
44.根据权利要求43所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
45.一种分离的细胞，其包括权利要求37-39、41和42中任意一项所述的核酸分子或权利要求40、43和44中任意一项所述的载体。
46.一种组合物，其包括药学上可接受的载体和权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体、权利要求10-15中任意一项所述的CAR、权利要求16、17和45中任意一项所述的分离的细胞、权利要求18-24中任意一项所述的免疫结合物、权利要求25-27中任意一项所述的ADC、权利要求28-31中任意一项所述的多特异性抗体、权利要求32-34中任意一项所述的抗体-纳米微粒结合物或权利要求35或权利要求36所述的融合蛋白。
47.一种治疗受试者中间皮素阳性癌的方法，包括向受试者施用权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体、权利要求10-15中任意一项所述的CAR、权利要求16、17和45中任意一项所述的分离的细胞、权利要求18-24中任意一项所述的免疫结合物、权利要求25-27中任意一项所述的ADC、权利要求28-31中任意一项所述的多特异性抗体、权利要求32-34中任意一项所述的抗体-纳米微粒结合物或权利要求35或权利要求36所述的融合蛋白或权利要求46所述的组合物。
48.一种抑制受试者中肿瘤生长或间皮素阳性癌转移的方法，包括向受试者施用权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体、权利要求10-15中任意一项所述的CAR、权利要求16、17和45中任意一项所述的分离的细胞、权利要求18-24中任意一项所述的免疫结合物、权利要求25-27中任意一项所述的ADC、权利要求28-31中任意一项所述的多特异性抗体、权利要求32-34中任意一项所述的抗体-纳米微粒结合物或权利要求35或权利要求36所述的融合蛋白或权利要求46所述的组合物。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述间皮素阳性癌是实体肿瘤。
50.根据权利要求47-49中任意一项所述的方法，其中所述间皮素阳性癌是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌。
51.一种检测间皮素在样本中的表达的方法，包括：
使所述样本与权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体接触；以及
检测所述抗体与所述样本的结合，从而检测出间皮素在所述样本中的表达。
52.根据权利要求51所述的方法，其中直接标记所述单克隆抗体。
53.根据权利要求51所述的方法，还包括：
使所述单克隆抗体与检测抗体接触；以及
检测所述检测抗体与所述单克隆抗体的结合，从而检测出间皮素在所述样本中的表达。
54.根据权利要求51-53中任意一项所述的方法，其中所述样本是从疑似患有间皮素阳性癌的受试者中获得的。
55.根据权利要求51-54中任意一项所述的方法，其中所述样本是肿瘤活检。
56.一种对患有间皮素阳性癌的受试者进行诊断的方法，包括：
使从所述受试者中获得的样本与权利要求1-9中任意一项所述的单克隆抗体接触；以及
检测所述抗体与所述样本的结合，从而对患有间皮素阳性癌的受试者进行诊断。
57.根据权利要求56所述的方法，其中直接标记所述单克隆抗体。
58.根据权利要求56所述的方法，还包括：
使所述单克隆抗体与检测抗体接触；以及
检测所述检测抗体与所述单克隆抗体的结合，从而对患有间皮素阳性癌的受试者进行诊断。
59.根据权利要求56-58中任意一项所述的方法，其中所述样本是肿瘤活检。
60.根据权利要求56-59中任意一项所述的方法，其中所述间皮素阳性癌是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌。
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