JPH08505623A - 標的細胞への作用物質の輸送法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫療法を初めとする標的細胞への作用物質の輸送法であって、単一特異的結合性蛋白質をある宿主に投与し、そしてそれが標的細胞に結合し、その後に多価抗体を投与してその作用物質を標的細胞へと誘導する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 標的細胞への作用物質の輸送法 説明 発明の背景 細胞障害性細胞はそれらの表面に複数の特異的レセプターを発現し、それらの レセプターによりそれら細胞障害性細胞は正常な自己細胞から変化した細胞もし くは外来性の細胞を識別する。これらのレセプターは標的細胞表面上の構造に対 して多重連結を形成し、それにより細胞障害性細胞と標的細胞との間に安定な複 合体形成を生じる。その後に各細胞障害性細胞はその複合体標的細胞に「致命的 な刺激（ｌｅｔｈａｌ ｈｉｔ）」を与え、そしてその標的細胞から離れ、この ことにより死に行く標的細胞と細胞障害性細胞とが生じ、その細胞障害性細胞は 自由に他の標的に定着し、かつそれを破壊することができる（Ｓｅｇｅｌ，Ｄ． Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．６（１）：８３−９２（１ ９８８）；Ｓｅｇｅｌ，Ｄ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２ ５：１０９９−１１０３（１９８８））。 最近では細胞障害性細胞の天然の認識系を人工的に操作して腫瘍細胞に対する 特異性を含むいずれかの所望される特異性の細胞障害性細胞を作製する方法が開 発されている（Ｓｅｇｅｌ，Ｄ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６７６， ９８０号、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ，Ｂ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１ ６０：１６８６−１７０２（１９８ ４）；Ｐｅｒｅz，Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４−３５６ （１９８５））。細胞障害性細胞を再標的化（ｒｅｔａｒｇｅｒｔｉｎｇ）させ るための方法は架橋結合化ヘテロ二重特異性抗体を利用し、この場合、溶菌に必 要な細胞障害性細胞上のレセプターに対して一つの抗体を作製し、一方で例えば 腫瘍抗原のような標的細胞構造に対して第二抗体を作製する。その細胞障害性細 胞上の適切なレセプターを直接標的細胞に連結させることにより架橋結合形成さ せたヘテロ二重特異的抗体はエフェクター：標的の複合体形成を冗進させ、そし てその細胞障害性細胞にシグナルを送って「致命的な刺激」を与える。抗体のヘ テロ凝集体は化学的架橋結合形成、もしくは２つのハイブリドーマ細胞を融合さ せることにより作製することができる（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｕｐｄａｔｅｓ Ｖｏｌ．２、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ、 Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ、ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｐｐ．１−１２（ １９９２）中のＳｅｇｅｌ，Ｄ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．）。 近年では、細胞障害性細胞を再誘導（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）して望ましく ない腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞を殺すことにかなりの注目が集められて いる。これを実施するための一般的な方法は、その標的細胞上の抗原およびエフ ェクター細胞上のトリガーリング分子（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓｓ）（Ｔ細胞上のＣＤ３のようなもの）に対して二重の特異性を有する二重 特異性抗体を用いることである。このような二重特異性抗体は腫瘍に対してＴ細 胞を標的化（ｔａｒｇｅｔ）するための数々の臨床試験に用いられている（Ｓｅ ｇａｌ、 Ｄ．Ｍ．およびＷｕｎｄｒｌｉｃｈ、Ｊ．Ｒ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉ ｇａｔｉｏｎ ６：８３−９２（１９８８））。 癌のような病理学的症状の治療用の再標的化エフェクター細胞という概念によ り、通常の非標的化免疫療法に勝る幾つかの利点が提供される。しかしながら、 正常細胞に勝る標的化細胞の免疫選択は依然としてつかめていないままである。 免疫療法と組み合わせる放射線療法および／または化学療法のような組み合わせ 型の治療法により選択性の上昇を達成することができる。しかしながら、これら の補足的な療法はしばしば重篤な副作用を伴うことがある。その上、標的化癌細 胞に到達するためには、これらの巨大な架橋結合化抗体が必充実性腫瘍組織中に 侵入して標的化腫瘍細胞に結合する必要がある。 その上、異種抗体（すなわち、治療を受けている宿主以外の種において産生さ れる抗体）に対する宿主の免疫応答が臨床実験で観察されている。これらの応答 は再標的化エフェクター細胞の抗腫瘍性特異性を破壊する可能性がある。その上 、このサイズの未結合の架橋結合化抗体の浄化値ならびに結合後の抗体の浄化値 も問題となっている。 結局のところ、再標的化エフェクター細胞はそれらの人工的後天性腫瘍レセプ ター（ヘテロ二重特異性抗体）を、腫瘍細胞との相互作用、エフェクター細胞分 裂、飲食作用、蛋白質分解的細胞外酵素、もしくは天然の脱落により失うことか ある。宿主内の抗腫瘍活性はエフェクター細胞および標的化用抗体での治療を反 復することにより保持することができる。しかしながら細胞表面腫瘍抗原のよう な意図する標的と相互作用させるのに必要な特異性を有する大容量のヘテロ二重 特異性抗体を産生させるのは高価でありかつ時間の浪費でもある。従って反復治 療用の多 くの異なる腫瘍抗原もしくは細胞表面マーカーを用いる利用法のために大量の臨 床用等級の二重特異性抗体を産生させることが可能であれば有利であろう。発明の要約 本発明は、標的細胞に作用物質を輸送する方法に関する。標的細胞は、一つも しくは複数の天然の標的細胞表面マーカーとの反応性を示す一つもしくは複数の 単一特異的結合性蛋白質により改変する。細胞表面マーカーとの反応性を示す単 一特異的結合性蛋白質は輸送べき作用物質にも結合するある多価抗体上のある部 位により認識され、そしてその部位に結合するある化学的部分で標識するか、融 合させるか、あるいはラベル化する。この作用物質はその多価抗体に結合させて あり、これが次には標識化単一特異的結合性蛋白質に結合し、そしてこの蛋白質 が標的細胞上の細胞表面マーカーに結合する。このようにしてこの作用物質は標 的細胞に輸送すなわち誘導（ｄｉｒｅｃｔ）される。 本明細書において用いられる化学的部分には一般的に、融合させた、そうでな ければ共有結合させたペプチド、単一−もしくは二重特異的結合性蛋白質の配列 内の一つもしくは複数のペプチド、翻訳後修飾もしくは化学的な改変を受けたペ プチド、その蛋白質内に取り込まれるビオチンのような化学的置換基、あるいは その結合性蛋白質内に取り込まれるいずれかの非天然のアミノ酸が含まれる。化 学的部分にはまた、一本鎖のＦｖ（ｓＦｖ）もしくはｓＦｖ融合蛋白質の複数の 可変領域同士を連結させるリンカー、あるいは単一特異的蛋白質のエピトープを 初めとする認識部位との反応性を示すあるアミノ酸配列を含むいずれかの蛋白質 もしくはその一部分、あるいはペブチドも含まれる。 本明細書において用いられる選択性とは、標的化されていない細胞もしくは正 常細胞に対立するものとしての標的化細胞の認識を意味する。本明細書において 用いられる特異性は、結合性分子による抗原もしくはレセプターのような独特な 細胞表面構成成分の認識を意味する。認識部位は、ある化学的部分との反応性を 示すか、会合するか、もしくは結合する結合性分子の一部分を意味する。認識さ れる部位は、ある蛋白質上の結合性部位、ある蛋白質の連続的もしくは不連続的 エピトープ、あるいは化学的もしくは生化学的に添加されるあるペプチドもしく は化学的置換基であることができる。 宿主は、ヒト、家畜動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、マウス、もしくはラ ットを始めとする噛乳類宿主であることができる。単一特異的結合性蛋白質とい う用語は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）’₂断片のような結合性蛋白質断片、Ｆａｂ 融合蛋白質（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８：４７６−４９６（１９８６））、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ ）蛋白質（本明細書においては一本鎖抗体としても引用される）、一本鎖Ｆｖ融 合蛋白質、キメラ抗体蛋白質（例えば、トランスフェクトーマ細胞から得られる 組換え抗体蛋白質（Ｓｈｉｎ，Ｓ．−Ｕ）およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８：４５９−４７６（１９８９）；Ｌｏｖｅ， Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：５１５−５２７ （１９８９））、キメラ一本鎖蛋白質、もしくは一本鎖Ｔ細胞レセプターのよう な他の一本鎖融合Ｆｖアナログ蛋白質を含むことを意図する。好ましい単一特異 的結合性蛋白質は一本鎖抗体である。単一特異的結合性蛋白質という用語はまた 、天然の細胞表面構成 成分との反応性を示す一つを上回る単一特異的結合性蛋白質の混合物（例えば、 数々の異なる細胞表面エピトープとの反応性を示す異なる種類の単一特異的結合 性蛋白質のカクテル）を含むことも意図する。 多価抗体という用語は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体（例えば 、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）、架橋結合化ヘテロ二重特異性全抗体、（ポリクロー ナルもしくはモノクローナルな）架橋結合させたその生物学的機能断片（例えば 、Ｆａｂ断片）、一つを上回る種からの複数の蛋白質を含むキメラ抗体、二重特 異性一本鎖抗体、キメラ一本鎖抗体アナログ、およびホモ二量体ＩｇＧ分子を初 めとするいずれかの多価抗体を含むことを意図する。これらの多価抗体蛋白質は 既知の研究方法により作製することができる。 好ましい態様においては、標的細胞表面マーカーに結合する単一特異的結合性 蛋白質は一本鎖抗体（ｓＦｖ）であり、化学的部分はペプチド標識（例えば、あ るアミノ酸配列）であり、そして多価抗体はヘテロ二重特異性抗体であり、これ がｓＦｖのペプチド標識に結合し、そしてまた標的細胞に輸送されるエフェクタ ー細胞のような作用物質にも結合する。 他の態様においては、標的細胞に作用物質を輸送もしくは誘導する方法は、単 一特異的結合性蛋白質の混合物すなわちカクテルを使用する。このカクテルには 数々の異なる種類の単一特異的結合性蛋白質が含まれており、各種類の結合性蛋 白質は標的細胞上の異なる細胞表面マーカー、エピトープ、もしくは抗原に対し て特異的である。従って、各クラスの標的細胞がそれそれそれ自体の独特な細胞 表面構成成分の特徴を有するために、単一の表面構成成分のみに対する単一特異 的結合性蛋白質の特 異性と比較して、より大きな特異性を有するように標的細胞を改変することがで きる。 本発明は更に、標的細胞誘導化細胞障害性作用物質を用いて選択性を増大させ ることによって標的細胞を破壊するある宿主における免疫療法にも関する。この 免疫療法は２つの概念を必要とするものであり、それらは、化学部分ラベル化単 一特異的結合性蛋白質を用いる標的細胞の特異的改変、および改変化細胞への細 胞障害性作用物質の標的化である。 本明細書に記載される免疫療法は、ある宿主に対して一つもしくは複数の天然 の細胞表面マーカーに結合する単一特異的結合性蛋白質を投与することを含み、 そしてこのようにしてその標的細胞を「改変」する。この単一特異的結合性蛋白 質はペプチドのような化学的部分で標識する。標的細胞の改変の次には、化学的 部分標識化標的細胞に結合し、そしてまた細胞障害性作用物質にも結合する多価 抗体をその宿主に投与する。別法では、細胞障害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）のよ うな細胞障害性作用物質をインビトロで多価抗体でコートすることができ、そし て第一段階の細胞改変の後に再標的化させた（すなわち、輸送のために標的細胞 へと誘導した）ＣＴＬを投与する。標識化単一特異的結合性蛋白質は未処理の全 ヘテロ二重特異性抗体よりも小さいため、未結合標識は、より大きい二重特異性 抗体と比較してかなり早く循環系内に浄化される。このことによりバックグラウ ンドの非特異的結合および標識化単一特異的結合性蛋白質の血清レベルが大幅に 減少する。このように細胞障害性作用物質は、標識化単一特異的結合性蛋白質に よる標的細胞の独特な改変に基づき、高い選択性での標的細胞破壊を行う。 他の態様では、ペプチドで標識化（ある部分でラベル化した）単一特 異的結合性蛋白質と多価抗体との間の結合親和性を変化させるもしくは減少させ る（すなわち、正常な結合親和性よりも低い親和性に引き下げる）。このように 減少させた結合親和性での効率のよい標的化により、ＣＴＬに結合した多価抗体 と改変化標的細胞との間の多重部位接触という利点がもたらされ、そしてそのた め輸送すべき作用物質と標的細胞との間に更に大きな特異的相互作用が生じる。 例えば、改変化標的細胞と多価抗体との間の結合親和性を減少させることにより 、弱い単一部位標的化作用が排除され、そして多重部位相互作用の選択性が増大 して標的細胞への細胞障害性作用物質の結合がかなり有利になる。結合親和性を 減少させるのは、ペプチド標識のアミノ酸配列（もしくは化学的部分の構造）あ るいは多価抗体の配列に、そのペプチド標識についての多価抗体の親和性が減少 するような突然変異を起こすことにより達成することができる。 腫瘍、ウイルス感染細胞、細菌、および他の病理的状態を治療もしくは抑制す るための異なる選択性の２つの独立な結合部位を有する結合性蛋白質の利用が公 認されている。（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｕｐｄａｔｅｓ Ｖｏｌ．２、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ、Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ、 ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｐｐ．１−１２（１９９２）中のＳｅｇ ｅｌ，Ｄ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．）。しかしながら通常の二重特異的抗体（例えば 、架橋結合させた抗体）は大きすぎて容易に充実性腫瘍に侵入することができな い。そのため多価抗体を用いる単一特異的結合性蛋白質を使用する免疫療法的ア プローチは数々の利点を有する。 標的細胞上の特異的表面構成成分に対して標的化させた抗原結合性領域上に標 準化させた複数のエピトープを取り込ませることにより追加的な利点が得られる 。これらの別々な標的化用領域が存在すると有利であり、それは典型的にはそれ らの領域がヘテロ二重特異的抗体と比較すると小さなサイズであることが理由と なっており、そのような領域の結合は、インサイチューで抗原結合性部位を定着 させるすなわち「固定化」して標的定着を冗進させるのに役立つ。 単一特異的結合性蛋白質は充実性腫瘍に侵入し、そして標的部位に付着しない 場合には循環系内に速やかに浄化されるという独特な能力を有する。従ってこれ らの蛋白質は腫瘍免疫療法に極めて適する。また、単一特異的結合性蛋白質が示 す非選択的結合および腎臓を例とする器官での望ましくない沈着は無視できる程 度のものである（Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：３４０２−３４０８（１９９２））。この単一特異的結合性蛋白質はサイ ズが小さく、通常は分子量が５２，０００モルより小さく、そして好ましくは分 子量３０，０００モルであるため、免疫原性が小さく、そしてそのため治療過程 中に宿主の免疫反応を生じることが恐らくほとんど無いものと思われる。また、 この単一特異的結合性蛋白質はサイズが小さいため、蛋白質分解に対する感受性 も低い。従って単一特異的結合性蛋白質がより安定な試薬であるということは道 理にかなっている。 その上、多価抗体により認識される特殊な化学部分を有するどのような単一特 異的結合性蛋白質も合成することができる。従って幾つもの免疫療法の状況にお ける万能利用のために、ある結合部位で特殊なペプチド標識と結合し、そして第 二結合部位で輸送すべき作用物質と結合する 一般的な多価抗体を作製することができる。その上本明細書に記載される免疫療 法は、非ペプチド性多価結合部位により認識されるどのようなものをも標的化す ることができる。従って、細胞障害性リンパ球、放射性同位元素、造影剤、もし くは標的細胞を破壊するための致死剤を標的化することができる。同一ペプチド 標識化単一特異的結合性蛋白質を、その単一特異的結合性蛋白質の構造もしくは 産生方法を再検討しなくともいろいろな養生法もしくは治療法用にテストもしく は使用することができる。更に、ペプチド標識化単一特異的結合性蛋白質はそれ 自体無毒性であるため、組み合わせ式の二段階免疫療法についての治療上の可能 性は、毒性を示す免疫複合体を単独投与する場合に可能となるものよりもはるか に大きくなるはずである（Ｂｏｓｓｌｅｔ，Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ． １７：３５５−３５６（１９９０）；Ｂｏｓｓｌｅｔ， Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：６８１−６８６（１９９ １）。 その上、この免疫治療法の独特な利点は、この方法により、部分標識化単一特 異的結合性蛋白質カクテルに基づく多重部位標的化が可能となることである。例 えば、あるカクテルは各ｓＦｖがそのｓＦｖ蛋白質混合物に共通な標準化化学的 部分を有するｓＦｖ蛋白質の混合物を含むことができるが、それでもなお様々な ｓＦｖ蛋白質はその腫瘍もしくは他の標的細胞上の異なる抗原に結合することが できる。化学的部分との会合についての結合定数が低い抗体を選択する場合には 、多重部位相互作用が必要になるであろう。別法では、正常なものより低い結合 定数は、切断したもしくは突然変異を生じさせたペプチド標識配列を使用するこ とにより達成することができる。Ｋ_a，_intrinsic＝１０³Ｍ^-1を例とす る幾つかの閾値親和性以下では、細胞誘導化細胞障害性作用物質は一つもしくは たとえ２つであっても、そのような数の接点を介しては効率よく結合することが できないが、相互作用の数がもっと多くなると多重部位結合は非常に強力となる ことができる。従って非常に安定な標的：エフェクター複合体が形成される。 その上、細胞誘導化細胞障害性作用物質の選択性は多重部位標的化により増加 する。癌の免疫療法の主な問題点は変異体がその療法を回避すること、あるいは 突然変異が原因で癌細胞上の表面エピトープが消失することである。Ｇｅｏｒｇ ｅ，Ａ．Ｊ．Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ． ４：２７１−３１０（１９８９）。この問題点は、本明細書に記載 されるように多重部位標的化免疫療法の利用により最小限の範囲にとどめられる 。例えば、腫瘍細胞が標的として４つの独特なエピトープを有するものの、唯一 つのエピトープのみを標的化し、そしてその一つのエピトープが突然変異を介し て消失する場合には、消失したエピトープを標的とする単独標的免疫療法を用い ての好結果を生じる治療は阻止される。しかしながら、４つ全てのエピトープを 標的とするであろう多重部位標的化を用いる場合には、一つのエピトープが消失 したとしても、残りの３つのエピトープを治療剤の標的化に利用することができ るため、この治療法は依然として好結果を生じることができる。図面の簡単な既述 図１は、単一特異的結合性蛋白質および多価抗体を用いる免疫療法の概略図で ある。 図２は、Ｕ７．６ ｓＦｖの産生法の概略図である。段階（１）は、 Ｕ７．６ ｓＦｖ遺伝子を生じるためのＶＨとＶＬのＰＣＲ産物の連結を示し、 そして段階（２）は、ｐＨＥＮ１−Ｕ７．６プラスミドを生じるためのＵ７．６ ｓＦｖ遺伝子とｐＨＥＮ１発現ベクターとの組み合わせを示す。 図３Ａは、Ｕ７．６ ｓＦｖのＶＨ領域のＤＮＡ配列（配列番号１）とその予 想アミノ酸配列（配列番号２）である。 図３Ｂは、Ｕ７．６ ｓＦｖのＶＬ領域のＤＮＡ配列（配列番号１）とその予 想アミノ酸配列（配列番号２）である。 図４は、産生および精製中のＵ７．６ ｓＦｖのＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットの結果を示す。 図５は、再変性させたＵ７．６ ｓＦｖのサイズ分析のグラフ表示（上段の曲 線）およびＤＮＰ−リシン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に対する特異 的吸着を示すドット−ブロット分析データ（下段のパネル）である。 図６は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定したＴＮＰ改変化細胞に 対するＵ７．６ ｓＦｖの結合の結果を示す。 図７は、ＴＮＰでコートしたＢ６ＭＣ１細胞に対するＵ７．６ ｓＦｖおよび Ｆａｂの相対的結合度の結果を示す。 図８は、ＴＮＰ改変化細胞に対するＵ７．６ＦａｂおよびＵ７．６ｓＦｖの遊 離のＤＮＰハプテンによる結合阻害の結果を示す。 図９は、ＴＮＰ改変化細胞に対するＵ７．６Ｆａｂ結合のＵ７．６ｓＦｖによ る阻害の結果を示す（■＝１２５ｎｍのＵ７．６、●＝４１．７ｎｍのＵ７．６ 、▲＝１３．９ｎｍのＵ７．６）。 図１０は、Ｋ５６２細胞に対するＯＫＴ９ ｓＦｖの結合の結果を示す。 図１１は、Ｕ７．６ ｓＦｖを用いる溶菌の標的化の結果を示す。 図１２は、活性化ヒトＴ細胞によるＴＮＰ−ＴＦＲトランスフェクト済みＬ細 胞の溶菌の結果を示す。 図１３は、複数の一本鎖Ｆｖ融合蛋白質で改変させた標的細胞に対する細胞障 害性Ｔ−リンパ球の多重部位結合の概略図である。発明の詳細な既述 本発明は、標的細胞に対して作用物質を輸送もしくは誘導する方法に関する。 標的細胞は、一つもしくは複数の天然の標的細胞表面マーカーとの反応性を示す 一つもしくは複数の単一特異的結合性蛋白質により改変する。細胞表面マーカー との反応性を示す単一特異的結合性蛋白質を、ある化学的部分で標識化する、融 合させる、もしくはラベル化し、そしてその化学的部分がある多価抗体上のある 部位により認識されか、もしくはそれと結合し、そして更に輸送すべきある作用 物質とも結合する。このようにしてこの作用物質は標的細胞に輸送もしくは誘導 される。 具体的には、細胞表面マーカーに結合する単一特異的結合性蛋白質を、多価抗 体上の認識部位との会合のための接点もしくはシグナルとして作用する化学部分 で標識化する、もしくはそれでラベル化する。この多価抗体はまた他の結合部位 で、標的細胞に輸送すなわち誘導すべきある作用物質にも結合する。このように してその作用物質を、多価抗体上の認識部位と改変化標的細胞の化学部分との会 合を介して標的細胞に輸送する。 本発明の標的細胞は、望ましくなく、そして除去、抑制、攻撃、およ び／または機能的もしくはその他の点で破壊する必要のある哺乳類宿主内のいず れかの細胞をも含む。標的細胞は具体的には、腫瘍細胞、細菌感染細胞、ウイル ス感染細胞、もしくは自己免疫細胞である可能性がある。 標的細胞は天然の細胞表面構成成分、すなわちマーカーを有する。これらの表 面マーカーには、黒色腫細胞上に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ ）レセプターのような特異的レセプター、あるいは卵巣癌細胞上に発現されるヒ ト癌抗原ＣＡ１２５のような選択的抗原が含まれる。細胞表面マーカーには主要 組織適合性複合体分子（ＭＨＣ IもしくはＭＨＣ ＩＩ）も含まれ、そしてウ イルス感染細胞はそれらの表面にウイルス性抗原を発現することがよくある。ま とめると、細胞の表面構成成分はその具体的な細胞の種類に特有な表面マーカー 特性を示す。 細胞の表面マーカーを使用して、造影剤のような薬剤、他の抗体、および細胞 に輸送すべき薬剤もしくは細胞障害性エフェクター細胞のような細胞障害性作用 物質を誘導することができる。細胞障害性作用物質は、化学療法もしくは放射性 療法に有効な細胞障害剤および放射性ヌクレオチドを含むことができる。例えば 、細胞表面レセプターに結合してリガンド結合を遮断するためのある試薬を設計 することができるし、あるいはある抗体をある細胞表面を介して標的細胞に対し て特異的に結合させることができ、こうして細胞介在性抗体依存的細胞性細胞障 害性用に標的細胞に旗印をつける。しかしながら、天然の細胞表面マーカーに対 して誘導させた薬剤および抗体は完全に標的細胞にとって選択的となる訳ではな く、そのため悪性細胞同様、正常細胞の破壊ももたらす。 本明細書に記載されるように、標的細胞を改変させてその標的細胞に対する標 的細胞誘導化細胞障害性作用物質の選択的結合を増加させる。標的細胞は、一つ もしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性を示す（それらに結合する） 一つもしくは複数の単一特異的結合性蛋白質により改変する。単一特異的結合性 蛋白質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ）’₂抗体断片のような結合性 蛋白質断片であることができ、このような断片は通常の研究方法により調製され る。単一特異的結合性蛋白質は、一本鎖Ｆｖ融合蛋白質（ｓＦｖ）、一本鎖抗体 、キメラ一本鎖蛋白質アナログ、および一本鎖Ｔ細胞レセプターのような他の一 本鎖融合蛋白質であることもできる。好ましい態様においては、標的細胞表面マ ーカーとの反応性を示す単一特異的結合性蛋白質は一本鎖抗体である。図１は、 ペプチド標識化一本鎖抗体により改変した標的細胞の概略図である。ヘテロ二重 特異性抗体がそのペプチド標識に結合しており、このヘテロ二重特異性抗体が更 に細胞障害性Ｔリンパ球に結合する。 ｓＦｖはある抗体分子もしくはＩｇスーパーファミリーの内の他のレセプター 分子のＦｖ部分の遺伝子工学的に作製した一本鎖構築物である。一本鎖抗体分子 の構築は、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＨｕｓ ｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６− ８８（１９９１）、およびＨｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，０９１ ，５１３号において記載されている（これらの教示は引用することにより本明細 書に取り込まれる）。ｓＦｖは柔軟性のあるペプチドスペーサーにより互いに連 結される２つの可変領域ドメインを含む。これらのｓＦｖ分子は、細胞 障害性エフェクター細胞に結合するＦｃ_γレセプターとの相互作用のようなエフ ェクター機能を特定する不変領域の情報は全く保持していないが、抗原特性を決 定するのに必要な全ての情報を含んでいる。これらは分子サイズが小さいために （２５−３０ｋＤ）それらの薬物動態学的特性の多くのものが改善され、充実性 組織内への侵入度が増大し、循環系内での半減期が減少し、そして免疫原性が減 少した（Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：３ ４０２−３４０８（１９９１）；Ｍｉｌｅｎｉｃ，Ｄ．Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃ ａｎｃｅr Ｒｅｓ． ５１：６３６３−６３７１（１９９１））。細胞表面マー カーに結合する一本鎖抗体は、多価抗体上の認識部位との会合用の接点もしくは シグナルとして作用するある化学的部分で標識化もしくはラベル化され、そして そうすることでその多価抗体を標的細胞に誘導する。好ましい態様においては、 この化学的部分は、一本鎖Ｆｖ部分上の１１アミノ残基ｍｙｃ−標識ペプチド配 列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ（配列番号５）のような短いアミノ酸配列を含むペプ チド標識である。 一本鎖Ｆｖ蛋白質は真核生物および原核生物細胞により、そして無細胞溶菌液 内で作製されている。原核生物の発現系により、操作の容易さ、高い産生率、お よび低い経費という観点での多くの利点が提供される。 しかしながら大半の細菌性発現系は不溶性部分含有性形態で組換え蛋白質を産生 してしまい、活性蛋白質を取得するためには複雑な再生法を施す必要がある。別 の方法は、グラム陰性細菌の周辺腔にその蛋白質を誘導することであり、その場 所では数々の細菌性蛋白質が、新規に合成される蛋白質の折り畳みおよび酸化を 援助することができる。このような周辺腔発現系は、ｓＦｖ蛋白質の産生のため に使用されている（Ｇｌｏ ｃｋｓｈｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２ −１３６７（１９９０））。 幾つかの事例においてはｓＦｖ蛋白質を周辺細胞質物質から単離するが、その 一方で他の事例においては増殖培地中に可溶性物質が見いだされることがあり、 これは恐らく細菌の外側の細胞壁の破壊後に周辺細胞質からｓＦｖが放出される ことが原因であると思われる。 以下の実施例１および２は、細菌性周辺細胞質内での２つのペプチド標識化ｓ Ｆｖ蛋白質の産生を詳細に記載しており、これらの内の一つのものはハプテンで あるジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対して誘導させてあり、他方のものはトラ ンスフェリンレセプターに対して誘導させてある。モデル系として抗−ＤＮＰ ｓＦｖを使用して、他の細胞表面構成成分に対する特異性を有する追加的な一本 鎖融合蛋白質を作製することができる。更に、実施例１に記載するように、親和 性精製用に大量の抗原を必要とすることなく、これらのｓＦｖ蛋白質を活性形態 で精製することができる。以下に示す実施例３および４は、ｓＦｖが標的細胞に 特異的に結合し、そして抗−ＣＤ３抗体に結合する際には細胞障害性Ｔ細胞を再 誘導させて標的細胞を殺すのに役立つことを示している。 ハプテンであるＤＮＰに特異的なペプチド標識化ｓＦｖであるＵ７．６ ｓＦ ｖを、実施例１に詳細を示す要領で作製した。ＰＣＲおよびクローニング段階の 概略図を図２に示す。簡便に記載すると、抗−ＤＮＰ抗体Ｕ７．６のＶ領域をＰ ＣＲにより増幅させ、そして始めにｓＦｖとしてクローン化する。Ｖ領域の配列 分析により、ＶＬおよびＶＨドメインは各々ＶＫ ＶＩおよびＶＨ ＩＩ領域フ ァミリーに属することが示された。図３Ａは、ＶＨドメインのＤＮＡ配列（配列 番号１）および演 鐸されるそのアミノ酸配列（配列番号２）を示し、そして図３Ｂは、ＶＬドメイ ンのＤＮＡ配列（配列番号３）および演鐸されるそのアミノ酸配列（配列番号４ ）を示す。ｃＤＮＡからＶ領域を増幅させるのに始めに用いたプライマーは、そ れをＶＫ ＩＶもしくはＶＩおよびＶＨ ＩおよびＩＩファミリーからのＶ領域 に対してアニールさせるように設計してあった。他のＶ領域ファミリー用に設計 されたプライマーはＵ７．６のｃＤＮＡを増幅しなかった（ＶＫ Ｖｂファミリ ーを基にしたプライマーは例外で、このプマイマーはハイブリドーマを産生する のに用いたＭＯＰＣ２１由来の融合パートナーにより産生される異常な状態で再 構成されたカッパー鎖を増幅させることが可能である）。 ペブチド標識化ｓＦｖを構築するために重複伸長技術による遺伝子スプライシ ングを使用することの可能性をテストする目的で、この構築物を作製し直してか ら発現ベクターｐＨＥＮ１内にクローン化させた。この方法は、２回分の連続周 期のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（図２、段階１）およびその後の発現 ベクター内への直接クローニング（図２、段階２）により完全なｓＦｖを迅速に 作製することを考慮している。この方法は、これら２つのＶ領域ドメインの間に いずれの制限部位も導入する必要がないという追加的な利点を有する。新規のＵ ７．６ ｓＦｖ構築物をｐＨＥＮ内のＰｅｌＢリーダー配列とペプチド標識との 間にクローン化させた。 ｓＦｖの産生については、ｐＨＥＮ１ Ｕ７．６を宿す細菌を増殖させ、そし てＩＰＴＧでの誘導化を行った。活性を示す幾らかのｓＦｖ（１００−５００μ ｇ／リットル）を、ＤＮＰセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズへの吸着 およびハプテンでの溶出（図４、レーン５）に より培養上清から直接単離することができた。しかしながら大半のｓＦｖ物質は 不溶性形態で細菌と会合していることが見いだされた。ｓＦｖの収率を上げるた めに細菌を溶菌させ、蛋白質を可溶化させ、そしてその後に、ある緩衝液に対し て透析することにより再生させた（図４、レーン４）。その後にｓＦｖ抗体を親 和性精製した（図４、レーン４）。この方法は細菌が周辺腔内にジスルフィド結 合を形成するということを期待して行ったものであるが、この方法により再現良 く高収率のｓＦｖを取得した。ある典型的な実験においては培養物のリットル当 たり総計４．５ｍｇの活性なｓＦｖが取得された。 ＤＮＰ−結合性ｓＦｖは、実施例１に記載する要領で親和性およびサイズ排除 クロマトグラフィーにより単離した。カラムから回収した様々な分画の活性を決 定する目的で、やはり実施例１に記載する要領で、各分注を遊離ＤＮＰハプテン の存在下もしくは非存在下でＤＮＰビーズと共にインキュベートした。その後に これらのビーズを遠心により取り除き、そして上清を抗−ペプチド抗体でのドッ トブロットによりｓＦｖの存在についてテストした。図５に示すように、ＤＮＰ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズは選択的に単量体蛋白質を除去する （レーンＢ）。この除去作用は１ｍＭのＤＮＰハプテンにより遮断され（レーン Ｃ）、このことによりこの除去作用が特異的なものであることが示された。図５ に示されるように、活性を示しかつ吸着されるＵ７．６ ｓＦｖの大部分のもの が単量体ピーク内に存在し、そして全てとは限らないが大半の単量体蛋白質が活 性を示す。このようにサイズ排除クロマトグラフィーにより、不活性なｓＦｖか ら活性形態を分離する比較的単純な方法が提供される。 Ｕ７．６ ｓＦｖが細胞表面に結合する能力は、実施例３に記載する要領で、 ｓＦｖを検出するためのＦＩＴＣラベル化Ｍｙｃ１ ９Ｅ１０．２を用いるＦＡ ＣＳ分析によりテストした。図６に示すように、Ｕ７．６ ｓＦｖはＴＮＰコー ト化Ｂ６ＭＣ１細胞に結合したがＢ６ＭＣ１細胞単独の場合には結合しなかった 。その上、Ｕ７．６ ｓＦｖとＵ７．６ ＩｇＧから得られるＦａｂとの両方が 、図７に示すように類似する濃度でＴＮＰ−Ｂ６ＭＣ１細胞に結合した。 Ｕ７．６ ｓＦｖとＵ７．６ Ｆａｂとの相対的結合効率を比較する目的で、 ＤＮＰハプテンがこれら２つの分子の結合を阻害する能力を比較した。図８に示 すようにＦａｂとｓＦｖとの両方の結合を比較可能な程度にまでＤＮＰハブテン により阻害したところ、５０％阻害地点が約１０^-8Ｍのハプテンの濃度付近に存 在した。 Ｕ７．６の結合はＵ７．６ ｓＦｖの存在により阻害された（図９）。これら ２つの種の濃度が等モル量である場合には、Ｕ７．６ Ｆａｂの結合は最大値の 約半分であり、このことによりｓＦｖとＦａｂとは細胞表面上のＴＮＰについて 類似する親和性を有することが示唆される。 このｓＦｖ産生法がより広範囲に適用可能であることを証明する目的で、実施 例２に記載する要領でＯＫＴ９抗体のｓＦｖ版を含むある構築物をｐＨＥＮ１中 に作製した。この抗体はヒトトランスフェリンレセプターと反応する。Ｕ７．６ ｓＦｖ中に用いられるものと同一の（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーにより 連結してあるＶＬおよびＶＨドメインに加え、ヘキサヒスチジン配列をＶＨドメ インとペプチド標識との間に挿入し、金属親和性クロマトグラフィーによる精製 を可能にした。ＯＫＴ９ ｓＦｖを刺激化（ｉｎｄｕｃｅｄ）し、そしてＵ７． ６ ｓＦ ｖについて行ったのと同じ要領でグアニジン内で可溶化させ、そしてｓＦｖをＮ ｉ²⁺−ＮＴＡビーズに吸着させ、その後にイミダールで溶出した。その後に精製 済み物質を透析により再生させ、そしてスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ） ７５カラム上で分画化した。単量体ピークに相当する各分画を回収し、そしてＫ ５６２細胞に対する結合についてＦＡＣＳ分析によるテストを行った。図１０に 示すように高レベルのトランスフェリンレセプターを発現するＫ５６２細胞に対 してＯＫＴ９ sＦｖは強固に結合し、そしてこの結合はＯＫＴ９ ＩｇＧによ り阻害された。これらの結果を、ヒトのトランスフェリンレセプター用の遺伝子 でトランスフェクトさせたマウスＬ細胞のＦＡＣＳ分析により実証した。Ｕ７． ６ ｓＦｖとは異なり、いずれのＯＫＴ９ ｓＦｖも剌激後の培養培地中には検 出されなかった。 本発明はまた、標的細胞誘導化細胞障害性作用物質を用いて高い選択性で標的 細胞を破壊するという宿主内での免疫療法にも関する。この免疫療法は２つの概 念を必要としており、それらは、化学的部分標識化単一特異的結合性蛋白質での 標的細胞の改変、および改変済み標的細胞に対する細胞障害性作用物質の高い選 択性での標的化である。 本明細書に記載される免疫療法は、一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカ ーに結合する単一特異的結合性蛋白質をある宿主に投与することを含み、そして そうすることで標的細胞を改変する。標的細胞の改変の次には、改変済み標的細 胞およびある細胞障害性作用物質に結合する多価抗体をその宿主に投与する。別 法では、この作用物質を、宿主に投与する前に多価抗体と複合体形成させること ができる。このようにして細胞障害性作用物質を標的細胞に輸送し、そして高い 選択性でその標的 細胞を破壊する。 好ましい態様においては、この免疫標的化法は一本鎖抗体とヘテロ架橋結合さ せた二重特異性抗体との組み合わせ物を使用し、この場合標的細胞は、一つもし くは複数の細胞表面マーカーに特異的な一つもしくは複数種類の一本鎖抗体によ り改変する。これらの一本鎖抗体は、ヘテロ二重特異性抗体により認識され更に 細胞障害性作用物質にも結合するあるペプチド標識もしくは化学的部分で標識す る。従って、細胞障害性作用物質を、ペプチド標識化（もしくは化学的部分標識 化）一本鎖抗体に対して選択的な様式で結合するヘテロ二重特異性抗体によりそ の標的細胞に輸送する。 他の態様においては、多価抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、もしくは二重特異性ｓＦ ｖである。この多価抗体はヘテロ二重特異性（Ｆａｂ’）₂断片、もしくはホモ 二量体（ＩｇＧ）₂分子（Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｃ．、ｅt ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ ｅｄ． １７６：１１９１−１１９５（１９９２））、もしくはＩｇＭ抗体である こともできる。 それとは逆に、標的細胞を、二重特異性ｓＦｖ、もしくはキメラ一本鎖蛋白質 アナログのような二重特異的結合性蛋白質で改変することができ、そして多価抗 体を化学的部分で改変することができる。このようにして、標的細胞を改変する 二重特異的結合性蛋白質上の認識部位と細胞障害性作用物質に結合する多価抗体 の化学的部分との会合を介して細胞障害性作用物質を誘導して標的細胞に結合さ せる。 例えば、標的細胞をキメラな一本鎖蛋白質アナログで改変することができる（ 米国特許出願第０７／８８１，１０９号、この教示は引用することにより本明細 書に取り込まれる）。このキメラ蛋白質アナログは標 的細胞上の天然の細胞表面マーカーを認識する一つの結合部位と、細胞障害性リ ンパ球に結合するヘテロ二重特異性抗体のような第二の多価抗体と会合する化学 的部分を認識する第二の結合部位とを有することができる。このようにして細胞 障害性リンパ球を標的細胞に輸送する。 別法では、単一特異的結合性蛋白質の化学的部分標識はビオチンであることが でき、これはストレプトアビジン標識化抗−ＣＤ３抗体との反応性を示し、この 抗体が更に細胞障害性リンパ球に結合する。このようにして、ＣＴＬをビオチン −ストレプトアビジン会合により標的細胞に輸送する。 完全な抗原結合部位はモノクローナル抗体もしくは組み合わせライブラリーか ら組換え法により取得することができ、そして二本鎖の５０ｋＤ Ｆａｂ断片も しくは関連するＦａｂ’断片、二本鎖の２５ｋＤ Ｆｖ断片、もしくは２６−２ ７ｋＤの一本鎖Ｆｖに相当する可能性がある。幾つかの事例においては、二本鎖 断片（例えば、Ｆａｂ断片）をモノクローナルもしくはポリクローナル抗体調製 物の酵素消化により単離することができるが、ただし一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）は天 然には存在せず、かつ蛋白質工学の技術を介してのみ作製することができる。こ れらの種全てはＩｇＧ単量体もしくは二量体と比較するとより小さく、そしてＩ ｇＧについては典型的な浄化値半減期が数日間であるのに、これらは生物分散が かなり迅速である。薬物動態的特性は分子サイズに関連して変化し、そのためこ れらの一価結合性蛋白質の分散の半減期はＦａｂについては数分から数時間の範 囲にわたるが、一本鎖Ｆｖについては一時間を下回る時間の範囲内に含まれる可 能性がある。その上、相関する全ＩｇＧの侵入性と比較すると一本鎖のＦｖにつ いては腫瘍侵入性がかなり改 善されることが示されている。（Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃ ｅｒ Ｒｅｓ． ５２：３４０２−３４０８（１９９２））。 従って本明細書に記載するように、この免疫療法は、充実性腫瘍内の悪性細胞 を例とする標的細胞への一次標的化のためにサイズを減少してある結合性蛋白質 を利用している。これらの結合性蛋白質に二次標的（例えば、ペプチド配列もし くは他の化学的部分）を、この二次標的もしくは標識がある多価抗体（例えば、 ヘテロ二重特異性抗体）により認識されるように融合、もしくは複合体形成させ るか、あるいはもともとその蛋白質がそのような特性を併せ持っている。この多 価抗体もやはり細胞障害性作用物質のエピトープもしくはその一部分、あるいは 細胞障害性リンパ球のような特別な細胞の細胞表面マーカーを特異的に認識し、 そしてそれに強固に結合する。 ある態様においては細胞障害性作用物質は細胞障害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ） のようなエフェクター細胞であり、このエフェクター細胞が多価抗体に結合する 。この結合は、ＣＤ３レセプターのようなＣＴＬの表面上に見いだされる「溶菌 亢進性」レセプターを介して生じる可能性がある。（Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｍ．、ｅ ｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１０９９−１１０３（１９８８） ）。また、エフェクター細胞用の表面マーカーは、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ４ ４、および標的化に適する他のエフェクター細胞表面マーカーを含むことかでき る。従って適切な複合体が標的細胞とＣＴＬとの間に形成され、そして結合され た標的細胞への「致命的な剌激」の輸送をＣＴＬに行わせるシグナルの伝達が生 じる。ＣＴＬを標識化標的細胞に直接連結させることにより、多価抗体はエフェ クター：標的複合体の形成を亢進させ、そしてＣ ＴＬに致死的な刺激を輸送させるように誘導するすなわちそのようなシグナルを 送る。 単一特異的結合性蛋白質が標的化細胞障害性を媒介することが可能であること を証明するために、ＯＫＴ３（抗−ＣＤ３）とＭｙｃ１ ９Ｅ１０．２（抗−標 識ペプチド）との間のヘテロ複合体をＵ７．６ ｓＦｖと組み合わせて使用して ＴＮＰコートしたＢ６ＭＣ１標的細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞の標的化を行っ た。実施例４に詳細を記載し、そして図１１に示すように、この組み合わせの免 疫分子はＴ細胞を誘導してＴＮＰ改変化Ｂ６ＭＣ１細胞を溶菌させる。更に実施 例４に記載するように、この標的化は遊離のハプテンにより阻害された。ＴＮＰ でコートしていないＢ６ＭＣ１細胞は溶菌を生じなかった。抗−ＤＮＰ Ｕ７． ６ ｓＦｖ−標識および抗−標識ペブチド×抗−ＣＤ３二重特異性抗体により誘 導される溶菌は、わずかに劣るものの直接的な抗−ＤＮＰ×抗−ＣＤ−３ヘテロ 複合体により観察されるものに匹敵していた。溶菌を生じるためには、標的細胞 上のＵ７．６ ｓＦｖ−標識およびヘテロ二重特異的抗体と、細胞障害性細胞上 のＣＤ３エピトープとの組み合わせを、標識−ペプチド：抗−標識抗体相互作用 により橋渡ししてやる必要があった。 ｓＦｖがこのような再誘導化溶菌に関与する能力を、図１２に示すようにＯＫ Ｔ９ ｓＦｖを用いて立証した。抗−ペプチド×抗−ＣＤ３ヘテロ複合体での組 み合わせに際しては、ＯＫＴ９ ｓＦｖは、ヒトのトランスフェリンレセプター でトランスフェクトさせたマウスのＬ細胞とＨＵＴ１０２細胞の両方の溶菌を誘 導することができたが、ヒトのトランスフェリンレセプターを発現しないＢ６Ｍ Ｃ１細胞の溶菌は誘導でき なかった。もう一度、細胞障害性を誘導するにはｓＦｖとヘテロ複合体との両方 が存在することが必要であり、そして標的をＴＮＰ改変させた場合にはＵ７．６ ｓＦｖを用いても溶菌が観察された。 本明細書に記載される免疫療法は、二重特異性抗体の非標識結合部位により認 識されるいずれの作用物質をも選択的に輸送することができる。従って、ＭＲＩ 造影用のポリマー性ガドリニウム、放射性同位元素複合体、もしくは被包化薬剤 を標的細胞に誘導することができる。 本明細書に記載される免疫療法のある態様においては、標的細胞をペプチド標 識化単一特異的結合性蛋白質の多重部位結合により改変することができる。例え ば、一本鎖抗体の混合物すなわちカクテルを宿主に投与することができる。この カクテルは数々の異なる一本鎖抗体を含み、その各抗体は標的細胞上の異なる細 胞表面マーカーもしくはエピトープに特異的である。従って各クラスの標的細胞 はそれぞれ独自のエピトープ特性を有するために、単独のエピトープのみに対す る抗体を用いる場合と比較してより強い特異性のペプチド標識化ｓＦｖで標的細 胞に旗印を付けることができる。 特異性が増大する他に、単一特異的結合性蛋白質カクテルに基づく多重部位標 的化は単一部位結合を用いる場合と比較して、標的細胞に対する多価抗体の選択 的結合をより一層上昇させることができる。この方法は、不溶性マトリックス上 で切断済み結合性蛋白質を用いる血液からの免疫複合体の選択的除去に類似して いる。（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．６２：８７− ９１（１９９２）；米国特許第５，０８４，３９８号、これらの教示は引用する ことにより本明細書に取り込まれる）。 蛋白質工学の共通の目標は、ある細胞もしくは他の蛋白質に対する組換え体の 結合を亢進させることである。典型的な解決手段は、標的分子に対するそれらの 親和性を増大させるように個々の蛋白質結合部位を改変することに関係する。し かしながら、単純に結合親和性を増加させることが必ずしも結合の特異性を増加 させるとは限らない。結合選択性の有意な上昇は、個々の低い親和性の多重部位 結合相互作用により生じることがある。 ペプチド配列（もしくは化学的部分）標識に対する結合について低い結合定数 （すなわち低い親和性）を有する多価抗体を選択することができる。別法では、 より低い結合定数を、切断した、もしくは変化させたペプチド配列（もしくは化 学的部分のアナログ）を用いることにより達成することができる。このようにし て二重特異性抗体もしくは他の結合性蛋白質の、そのペプチド標識についての親 和性を引き下げることができる。実験的もしくは臨床的条件下では一対一複合体 を全く形成することができないような低い親和性の単一部位接点を作製すること による、この結合親和性の低下により多価抗体と改変化標的細胞との間の多重部 位接触がかなり有利な状態となり、そしてそのため細胞障害性作用物質と標的細 胞との間に高い特異性の強力な相互作用（すなわち、それらの会合もしくは複合 体形成）が生じる。図１３に示すように、ペブチド標識化一本鎖抗体の混合物は 、化学的部分（標識ペプチド）と認識部位（標識ペプチドに結合するヘテロ二重 特異性抗体の一部分）との間の多重部位相互作用を介して標的細胞上のエピトー プ（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を識別するように細胞障害性リンパ球を標的化 する。抗−標識結合部位と標識ペプチドとの間の独特な会合定数を引き下げるこ とによ り、標的化細胞障害性を媒介するための多重部位結合が極端に有利になる。この 多重部位相互作用は更に、多価抗体と標的細胞との間の複合体形成も容易にする 。従って、化学的部分についての多価抗体の結合親和性を引き下げることにより 、多価抗体と標的細胞との間の複合体形成にとっての基本原理としての多重部位 接触が有利になる。 例えばＫ_a，_intrinsic＝１０³を下回るような幾つかの閥値においては、標的 化細胞障害性作用物質（例えば、ＣＴＬ）は、ある宿主内にインビボで存在する 蛋白質濃度および標的細胞レベルの条件下では、一つもしくはたとえ２つであっ ても、そのような数の接点を介しては十分に結合することができないであろう。 しかしながら、多重部位相互作用を用いると結合は非常に強力となることができ る。このような多重部位接触は、十分な密度で定着して多重接触を可能にさせる 単一特異的結合性蛋白質の適切なカクテルを用いて達成する。選択性の上昇は２ つの効果から得ることができる。第一のものは、標的細胞上の複数の異なる抗原 の標識化単一特異的結合性蛋白質カクテルによる結合の効果である。この効果は 、他の非標的細胞上に存在する可能性のある単一のエピトープによるものと比較 してより特異的に標的細胞を特定する標的細胞上の複数のエピトーブの特別な性 質によりもたらされる。従って、細胞障害性作用物質の効果的な標的化のための 複合体形成の基本原理としての多重部位相互作用は、このような標的細胞抗原特 性を利用している。第二のものは、標的細胞上の所定の抗原の表面密度の効果が 、単一のエピトープについてさえも結合の特異性を上昇させることができるとい うことである。このため、例えば所定の抗原の表面発現が非常に低い種類の細胞 は、同一抗原の表面発現が非常に高い悪性細胞から識別することができ、 これは、多価結合は高い抗原密度を有する悪性細胞との相互作用に非常に有利で あることが理由となっている。 近年では、望ましくない腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞を殺すように細胞 障害性細胞を再誘導することにかなりの興味が注がれている。これを行うための 一般的な方法は、標的細胞上の抗原およびエフェクター細胞上のトリガーリング 分子（Ｔ細胞上のＣＤ３のような）に対して二重の特異性を有する二重特異的抗 体を用いることである。 本明細書に記載される免疫療法は他の形態の免疫療法に勝る数々の利点を有し ている。第一に、この方法を用いてｓＦｖ蛋白質のような単一特異的結合性蛋白 質を迅速に同定することができ、このことは組換え二重特異的抗体の設計および 作製に役立つ可能性がある。万能型の二重特異性抗体と一緒にペプチド標識を利 用することにより、細胞障害性作用物質を誘導してｓＦｖコート化標的細胞を破 壊させることが可能であり、このことによりｓＦｖを最大の標的化能力を有する ものについてスクリーニングすることが可能になる。 第二に、数々の臨床状況においては、エフェクター細胞を標的化する間接的な 方法が有利である。このことにより単一のｓＦｖもしくは標的細胞上の一連のエ ピトープに対する複数のｓＦｖのカクテルを、たった一つの万能型二重特異性抗 体と共に使用して、標的−エフェクター細胞複合体の親和性および特異性を増加 させることが可能となる。 その上、ある化学的部分で標識化したＦａｂもしくはｓＦｖ融合蛋白質のよう な単一特異的結合性蛋白質を使用する場合には、この融合蛋白質の後にはヘテロ 二重特異性もしくは四価の（ＩｇＧ）₂二量体抗体が適切な間隔を開けてつなが り、これらの抗体は標識化結合性蛋白質を認 識し、そしてその細胞表面上で２つもしくはそれを上回る数の結合性蛋白質を同 時に架橋結合する。このことにより標的定着が効果的に亢進し、そして最終的な 腫瘍標的化能が改善される。 最後に、二重特異性抗体により認識されるであろうある標的細胞の表面構成成 分が脱落するもしくは分泌される場合には、それは腫瘍から離れた部位で二重特 異性抗体でコートされているエフェクター細胞に結合して不適切な状況でそれら の細胞に毒性因子を放出させるトリガー反応を行う可能性がある。本明細書に記 載される免疫療法におてはこのようなことを回避することが可能であり、それは 、最初に標的細胞上の細胞表面構成成分に対する単一特異的結合性蛋白質を投与 し、そしてその後に存在するいずれの可溶性抗原−結合性蛋白質複合体をも浄化 することが可能となり、それから万能型の二重特異性抗体を投与するためである 。このことにより、エフェクター細胞が標的細胞表面に結合している単一特異的 結合性蛋白質のみに対して確実に誘導され、そしてそのためそのエフェクター細 胞を高い選択性で標的細胞に輸送する。 本発明は、以下に示す実施例により更に詳しくそしてより具体的に説明される であろう。 実施例 実施例１：ペプチド標識化一本鎖融合蛋白質Ｕ７．６ ｓＦｖの作製細胞株およ びベクター 以下に示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株およびベへクターを使用した。ＸＬ１ ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＴＧ１および ＨＢ２１５１（Ｄｒ．Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ、ＬＭＢ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、 より寄贈された）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、およびｐＨＥＮ１（Ｄｒ．Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒより寄贈 された）。オリゴヌクレオチド 本研究において用いるオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅ ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、そして「Ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇ ｅｓ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて作製した。ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いたオリゴヌクレオチドの配列を表に示す（配列 番号６−２０）。 Ｖ領域のＰＣＲ増幅およびＵ７．６ ｓＦｖの作製 ＩｇＧ抗−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体を分泌するマウスハイブリドー マであるＵ７．６（Ｄｒ．Ｚ．Ｅｓｃｈａｒ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ、から寄贈された）からのｍＲＮＡをフ ァストトラック（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ）ｍＲＮＡ単離用キット（ＩｎＶｉｔｒ ｏｇｅｎ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて細胞から調製した。ｃＤＮＡ はＭｏＭｕＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ならびに重鎖および軽鎖用にそれぞれＣＨ １−ＸｂａおよびＣＫＮ１を用いてそのｍＲＮＡから調製した。プライマーを設 計および使用してクローニング用にＶ領域ドメインを増幅し、これを表１に特定 されるＶＫ５’ ｅｘｐおよびＶＫ３’ ＡＬ２（ＶＬドメイン）ならびにＶＨ ＮｏｔおよびＣＨ Ｘｂａｓ（ＶＨドメイン）からなるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ内にクローン化した。ＶＫ’ ＡＬ２は（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３ペプチドリ ンカーをコード化する配列を含む。Ｖ領域ドメインを、適切なプライマーおよび ＧｅｎｅＡｍｐキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社、Ｎｏｒｗａ ｌｋ、ＣＴ）を使用して２５周期のＰＣＲ（９５℃で１分、５０℃で１分、７２ ℃で１分）により増幅させた。得られるＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム で抽出し、そしてエタノール沈殿を行い、２％の低溶解性アガロースゲル（Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｔｏｄｕｃｔｓ社、Ｒｏｃｋｌ ａｎｄ、ＭＥ ）を通す電気泳動を行い、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて精製した。 ＶＬドメンを最初にＳｃａ ＩおよびＮｏｔ Ｉ部位でｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ内に連結させ、そしてＶＨドメインを次にＮｏｔ ＩおよびＸｂａ Ｉ部位内に挿入した。その後に、得られるプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｕ７．６）からの挿入断片素の配列決定を、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａ ｓｅ）キット（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｃｌ ｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて行った。Ｕ７．６ ｓＦｖ構築物のｐＨＥＮ１内へのクローニング Ｕ７．６ ｓＦｖを、ｐｅｌＢリーダー配列を使用する細菌性発現ベクターで あるｐＨＥＮ１内にクローン化させて、周辺腔内への蛋白質の分泌を誘導した（ Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１ −５９７（１９９１））。ｓＦｖを作製するための重複伸長法による遺伝子スプ ライシングを用いる可能性をテストする目的で、我々は４つのプライマーを用い てその構築物を作り直してＵ７．６のＶ領域の増幅を行った。２つの「外側」プ ライマー（Ｕ７．６ Ｌ５’ＳｆｉおよびＵ７．６ Ｈ３’Ｎｏｔ）はｐＨＥＮ １発現ベクター内への挿入に適する制限部位を含んでいた。これらの「重複」プ ライマー（Ｕ７．６ Ｌ３’ｌｉｎｋおよびＵ７．６ Ｈ５’ｌｉｎｋ）はリン カーペプチドから得られる配列を含んでいた。増幅済みＶ領域を次にアニールす ることができるように、これらのプライマーを互いが相補的になるように設計し た。その上、Ｔａｑ酵素は３’末端アデニル化活性を有するため、内側プライマ ーを大半のＰＣＲ産物が保持する末端Ａ構造に相補的なＴ残基になるように設計 した。これらのブライマーを用い、鋳型としてｐＢｌｕｅｓｃｒｕｐｔ Ｕ７． ６を用いてＶ領域を増幅し、そしてその後に０．１−１μｌの産物を一緒に混合 し、そ して外側プライマーのみを用いて再増幅を行った。得られるＰＣＲ産物は完全な ｓＦｖ構築物を含み、これをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そしてエ タノールで沈殿させ、それからＳｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限酵素で切断した 。 切断した産物を２％のアガロースゲルを通して電気泳動し、Ｇｅｎｅｃｌｅａ ｎを用いて精製し、そしてｐＨＥＮ１内に連結させた。ｐＨＥＮ１−Ｕ７．６と 表示されるこのベクターは、その後電気穿孔法によりＴＧ１大腸菌内に挿入し、 これを５０μｇ／ｍｌのアンピリシンおよび１％のグルコースを含む２×ＴＹプ レートで増殖させた。ｓＦｖ蛋白質の産生 ｓＦｖ蛋白質（Ｖ_L−リンカー−Ｖ_H）の産生のためには、プラスミドを大腸菌 のＨＢ２１５１株内に移動させることが必要である。ｐＨＥＮ１内のファージ複 製起点を用いてｐＨＥＮ１ Ｕ７．６プラスミドから得られる一本鎖ＤＮＡを含 むファージを作製した。ｐＨＥＮ１ Ｕ７．６を保持するＴＧ１細胞をアンピリ シンおよびグルコースを含む２×ＴＹ培地内で増殖させた。この株をＶＣＳ Ｍ １３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で感染させ、そしてアンピリ シン、カナマイシン、およびグルコースを含む２×ＴＹ培地内で一晩増殖させた 。その後に、このファージを１／５容量の２０％ポリエチレングリコール６００ ０および２．５ＭのＮａＣｌを用いてその上清から沈殿させ、そしてこれを使用 してＨＢ２１５１細胞を感染させ、そしてこれを２×ＴＹプレート＋アンピシリ ン＋グルコース上で増殖させた。蛋白質を産生することができるコロニーをＩＰ ＴＧを用いる小培養物の刺激化により同定し、細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ 上で流し、そして以下に記載するよう に抗−ｍｙｃペプチド抗体を用いるウエスタンブロットでの探索によりその蛋白 質を同定した。ウエスタンブロット 蛋白質は、製造業者により記載される要領で、Ｐｈａｓｔｇｅｌ系（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ ＬＫＢ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いる１２．５％のゲ ル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この蛋白質をＰｈａｓｔｇｅｌウエ スタンブロット用装置を用いてニトロセルロース上にブロットさせた。その後に これらのブロットを室温で３０分間１％のＢＳＡを含むＰＢＳで遮断し、ＰＢＳ −Ｔｗｅｅｎ内で５回洗浄し、そして２−７μｇ／ｍｌの抗−ペプチド抗体（Ｍ ｙｃｌ ９Ｅ１０．２）を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと共に室温で１時間インキュ ベー卜した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで更に５回洗浄した後にブロットを更に３０− ６０分間、ヤギの抗−マウスＩｇＧと複合体形成させてある０．２μｇ／ｍｌの アルカリホスファターゼと共にインキュベートし、それからＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ での最終５回分の洗浄を行った。これらのブロッ卜を０．１ＭのＮａＨＣＯ₃、 １ｍＭのＭｇＣｌ₂ ｐＨ９，８内の０．５ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾ リウムおよび０．２５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ ン酸（Ｓｉｇｍａ社）を用いて現像した。ｐＨＥＮ Ｕ７．６内でのｓＦｖの剌激化および産生 ｐＨＥＮ１ Ｕ７．６を含むＨＢ２１５１細胞を、アンビリシンおよびグルコ ースを含む２×ＴＹ培地内で増殖させた。中間対数期にある際に細胞を遠心し、 ＬＢブイヨン内で洗浄し、そしてアンピリシンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ ×ＴＹ培地内で再懸濁させた。その後にこの 細胞を震盪させながら室温で一晩、先に記載するように初期の実験で見いだされ 、最高の収率で細胞を産生する条件下でインキュベートした。細胞をペレットに し、そして−２０℃で保存し、そしてこの上清は０．４５μｍのフィルターを通 して濾過した。細胞ペレットからのＵ７．６ ｓＦｖの調製 細胞ペレットを解凍し、そして冷却してある５０ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴ Ａ、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのアルギニン ｐＨ８．０中に再懸濁させ 、そしてビーズビーター（Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ社、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）で破壊した。０．１ｍｍ直径 のガラス製ビーズを添加し、そして細胞を１分間の冷却期間を挟んで３×１分間 パルスした。溶菌後にはｓＦｖ蛋白質が不溶性分画内に見いだされた。遠心後、 この分画を７．５Ｍのグァニジン−ＨＣｌ内に溶かし、そして２５０００ｇの２ ０分間の遠心によりこの溶液の濁りを除去した。その後にこの物質を４０℃で０ ．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４Ｍのアルギニン ｐＨ８．０に対し て透析し、そして活性を示すｓＦｖを親和性クロマトグラフィーにより回収した 。 図４は、産生および精製の際のＵ７．６ ｓＦｖのＳＤＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。試料は、還元条件下でのＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ用に調製し、そして１２．５％のゲル上で泳動を行った。このゲル をクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で染色するか、あるいは ニトロセルロース上にブロットし、そして抗−ｍｙｃペプチド抗体を用いる探索 を行った。レーン１は非刺激化細胞ペレットであり、レーン２は刺激化細胞ペレ ットであり、レー ン３は可溶化およびアルギニンに対する透析後の物質であり、レーン４は再生物 質から親和性精製したＵ７．６であり、レーン５は培養物上清から親和性精製し たＵ７．６ ｓＦｖである。活性Ｕ７．６ ｓＦｖのサイズ分離および親和性精製 再生させたｓＦｖ物質を、０．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４Ｍの アルギニン ｐＨ８．０中でＰｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣ系を用い、２ｍｌ／ 分の流速で、１．６×５０ｃｍのスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に通した。 再生させたｓＦｖについての溶出曲線および３つの検量用蛋白質である、チト クロムＣ（１３ｋＤ）、ヒトのカルボニックアンヒドラーゼ（２９．５ｋＤ）、 およびウシノ血清アルブミン（６７ｋＤ）の溶出容量を図５に示す。各４ｍｌの 分画を回収し、そして活性は、７５０μｌの試料をＤＮＰ−セファロース（Ｓｅ ｐｈａｒｏｓｅ）ビーズと共に１ｍＭのＤＮＰハプテンの存在下もしくは非存在 下でインキュベートすることにより決定した。このビーズをペレットにし、そし て１μｌの上清試料をニトロセルロース上にドットブロットさせ、そしてＭｙｃ １ ９Ｅ１０．２抗体を用いてＵ７，６ ｓＦｖの存在についてアッセイした。 図５の下部は吸着なしでアッセイした分画（レーンＡ）、ＤＮＰ−セファロース （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズでの吸着後（レーンＢ）、もしくは１ｍＭのＤＮ Ｐハプテンの存在下でのＤＮＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズで の吸着後（レーンＣ）のドットブロットの結果を示す。ドットブロットの相対強 度は各ボックス内の記号により示す（＋＋＋、強力；＋＋、強い；＋、弱い；＋ ／−、擬陽性；空欄、陰性）。 図５に示すように、ＤＮＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビ ーズは選択的に単量体蛋白質を除去した（レーンＢ）。この除去作用は１ｍＭの ＤＮＰハプテンにより遮断され（レーンＣ）、このことによりこの作用は特異的 であることが示される。従ってＤＮＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に 結合する活性Ｕ７．６の大部分のものは単量体ピーク内に存在し、そして全てで はないにせよほとんどの単量体蛋白質は活性を示す。従ってサイズ排除グロマト グラフィーにより、不活性ｓＦｖから活性単量体のｓＦｖを分離する比較的単純 な方法が提供される。 Ｕ７．６は更にＤＮＰ−リシン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用い る親和性クロマトグラフィーにより単離した。ｓＦｖは１ｍＭのＤＮＰ ε−ア ミノカプロン酸で溶出し、そしてその後に遊離ハプテンをＤｏｗｅｘ ＡＧ １ −Ｘ８ビーズ（ＢｉｏＲａｄ社、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を含む適切な緩衝液 に対する透析により除去した。親和性精製を行ったｓＦｖをスーパーデックス（ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラムに適用させたところ、これはサイズ決定用標準に より予測されたものと比較するとわずかながら多めの容量に溶出し、このことに よりこの蛋白質は稠密形態に折り畳まれているが自己会合する傾向がわずかに見 られる可能性があることが示唆される。しかしながら、親和性精製以前には、カ ラムから出てきた様々な分画をドットブロットし、そして抗−ｍｙｃペプチド抗 体での探索を行うことにより証明されるように（図５、既述）、大半の再生Ｕ７ ．６ ｓＦｖは排除容積に溶出し、このことは、この実験の再生条件下において はかなりの度合いで凝集体形成が生じることに一致し、このような凝集体は、存 在する活性単量体ｓＦｖをマスクしてしまう。実施例２：ｐＨＥＮ１中のＯＫＴ９ ｓＦｖのクローニング ＯＫＴ９ ｓＦｖ構築物は、Ｕ７．６ ｓＦｖにおいて用いられるものと同一 の（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーにより連結してあるＶＬおよびＶＨドメイ ンからなる。ＯＫＴ９ ｓＦｖ構築物は、ｐＨＥＮ１内へのクローニングに必要 なＳｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を含むＯＫＴ９ ５’ＳＦＩおよびＯＫ Ｔ９ ３’ｈｉｓ ＮＯＴオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅し た。その上、このＯＫＴ９ ３’ｈｉｓ ＮＯＴプライマーは６つのヒスチジン をコードする配列を含んでいた。このＰＣＲ産物を適切な酵素で切断し、そして Ｕ７．６ ｓＦｖについて記載した要領でｐＨＥＮ１内に連結させた。ＯＫＴ９ ｓＦｖの発現および精製 ＯＫＴ９ ｓＦｖをＵ７．６ ｓＦｖと同一の様式で発現させた。刺激化細胞 ペレットを溶菌させ、そして不溶性物質を６Ｍのグアニジン、０．１ＭのＮａＨ₂ ＰＯ₄、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中に溶解した。その後にこれをＮｉ²⁺− ＮＴＡ−アガロースビーズ（Ｑｕｉａｇｅｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ） と混合し、これにＨｉｓ６テイルを２時間４℃で結合させた。このビーズを６Ｍ のグアニジン−ＨＣｌ緩衝液で広範囲にわたり洗浄し、そしてｓＦｖ物質を１０ ０ｍＭのイミダゾールで溶出した。このｓＦｖを０．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥ ＤＴＡ、０．４Ｍのアルギニン ｐＨ８．０に対して透析することにより再生さ せ、そしてＵ７．６ ｓＦｖについて記載した要領でスーパーデックス（Ｓｕｐ ｅｒｄｅｘ）７５カラムに通した。単量体ｓＦｖとして溶出した物質を、その後 に活性ＯＫＴ９ ｓＦｖの存在についてアッセイした。実施例３：ｓＦｖの表面結合 Ｕ７．６およびＯＫＴ９ ｓＦｖの細胞への結合を、ＴＮＰ改変化Ｂ６ＭＣ１ 細胞およびＯＫＴ９により認識されるヒトのトランスフェリンレセプターを発現 するＫ５６２細胞を用いるフローサイトメトリーによりテストした。細胞をｓＦ ｖと共にインキュベートし、洗浄し、そしてＦＩＴＣラベル化Ｍｙｃ１ ９Ｅ１ ０．２（抗−標識ペブチド）抗体で染色し、その後にＣ３０ソフトウエアーを用 いるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析した。細胞を前方および側方光 散乱の両方の場合の生存率についてゲートコントロールし、そして４８８ｎｍで の蛍光を測定した。Ｕ７．６の場合では、ｓＦｖの結合を阻害する特異性はＤＮ ＰハプテンもしくはＵ７．６ Ｆａｂを用いることにより証明された。 図６のパネルＢは、ＴＮＰ−コート化ＭＣ−１細胞に対するＵ７．６ ｓＦｖ の結合を示す。点線はＦＩＴＣ−抗−ペプチド抗体単独で染色した細胞を意味し ；実線は１２５ｎＭのＵ７．６ ｓＦｖと共に予めインキュベートし、そしてそ の後にＦＩＴＣ−抗−ペプチドで染色した細胞を意味する。比べると、パネルＡ は、ＦＩＴＣ抗−マウスＩｇＧ単独（点線）もしくはＵ７．６ Ｆａｂを用い、 次いでＦＩＴＣ−抗−マウスＩｇＧを用いて染色した細胞を示す。パネルＣは、 Ｕ７．６ ｓＦｖがＴＮＰでラベル化していないＭＣ−１細胞に対しては結合し ないことを示す。（点線および実線はパネルＢのものと同様である）。パネルＤ は、Ｕ７．６ ｓＦｖおよびＦａｂの両方がＴＮＰ−ＭＣ−１細胞に対するＦＩ ＴＣ−Ｕ７．６未処理ＩｇＧ抗体の結合を阻害することを示す。間隔が広い点線 および実線は、それぞれ未染色および染色済みＴＮＰ− ＭＣ−１細胞を示す。破線は１３０ｎＭのＵ７．６ Ｆａｂの存在下におけるＦ ＩＴＣ−Ｕ７．６によるＴＮＰ−ＭＣ−１細胞の染色を示し、そして間隔が緻密 な点線は１２５ｎＭのＵ７．６ ｓＦｖの存在下のものである。 図７は、ＴＮＰでコートしたＢ６ＭＣ１細胞に対するＵ７．６ ＦｖおよびＦ ａｂの相対的結合度を示す。ＴＮＰで改変させた細胞を様々な濃度のＵ７．６ ｓＦｖもしくはＵ７．６ Ｆａｂ（黒四角）のいずれかと共にインキュベートし 、その後にＦＩＴＣ Ｍｙｃ１ ９Ｅ１０．２抗体もしくはＦＩＴＣ−ヤギ抗− マウス抗体（黒三角）のいずれかと共にインキュベートした。その後に細胞をＦ ＡＣＳにより分析し、細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。 図８は、ＴＮＰ改変化Ｂ６ＭＣ１細胞に対するＵ７．６ Ｆａｂ結合のＤＮＰ −アミノカプロン酸による阻害を示す。ＴＮＰ改変化Ｂ６ＭＣ１細胞は様々な濃 度のＤＮＰハブテンの存在下において、Ｕ７．６ sＦｖ（黒三角）もしくはＵ ７．６ Ｆａｂ（黒丸）と共にインキュベートした。細胞をＦＩＴＣ−ラベル化 第二抗体で染色し、そして各細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析 により決定した。 図９は、ＴＮＰ改変化細胞に対するＵ７．６ Ｆａｂ結合のＵ７．６ ｓＦｖ による阻害を示す。ＴＮＰ改変化Ｂ６ＭＣ１細胞は、様々な濃度のＵ７．６ ｓ Ｆｖの存在下て１２５ｎＭ、４１．７ｎＭ、もしくは１３．９ｎＭのＵ７．６ Ｆａｂと共にインキュベートした。細胞をＦＩＴＣヤギ抗−マウスＩｇＧで染色 し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析により決定した。Ｕ７．６ Ｆａｂがいずれも存在しない場合のバックグラウンドＭＦＩは４０であった。 図１０は、Ｋ５６２細胞に対するＯＫＴ９ ｓＦｖの結合を示す。間隔の広い 点線はＦＩＴＣ−抗−ペプチドで染色したＫ５６２細胞を意味し、実線はＯＫＴ ９−ｓＦｖプラスＦＩＴＣ−抗−ペプチドを意味する緻密な点線はＯＫＴ９−ｓ ＦｖプラスＦＩＴＣ−抗−ペプチドを意味するが、ただし過剰なＯＫＴ９抗体で 阻害してある。実施例４：再標的化実験 トリニトロフェノール（ＴＮＰ）−改変化Ｂ６ＭＣ１細胞もしくは非改変化細 胞をエフェクターとしてのヒト細胞障害性Ｔ細胞と共に標準的な⁵¹Ｃｒ放出アッ セイに用いて、溶菌を再標的化するＵ７．６ ｓＦｖの能力を実証した。ヒトの 抹消血Ｔ細胞を二重特異性ヘテロ複合体抗体（０．３１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３ ×抗−標識ペプチド、もしくは０．８μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３×抗−ＤＮＰ）を 、Ｐｅｒｅｚ，Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４−３５６（ １９８５）に記載される要領で調製した。標的細胞（ＴＮＰ改変化もしくは非改 変化Ｂ６ＭＣ１細胞、トランスフェリンレセプターでトランスフェクトさせたＬ 細胞、もしくはＨＵＴ１０２細胞）を⁵¹Ｃｒでラベル化し、そして標的細胞とし て使用した。細胞（１×１０⁶／ｍｌ）を４℃下で３０分間、Ｕ７．６もしくは ＯＫＴ９ ｓＦｖのいずれかと共にインキュベートした。その後に１０^-4の標的 細胞を、適切な数のエフェクター細胞、およびある場合には２．５×１０^-4Ｍの 最終濃度の遊離のＤＮＰハプテンを含むマイクロタイタープレートの各ウエルに 添加した。その後にこのプレートを３−４時間、３７℃、５％ＣＯ₂下でインキ ュベートし、そして比溶菌率（ｓｐｅｃｌｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を、Ｐｅｒｅｚ ，Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４−３５６（１９８５）；Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ 、Ｈ．Ｍｅｔｚｇｅｒ（ｅｄ．） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔ ｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ ．２９１−３０１（１９９０）中のＳｅｇｅｌ，Ｄ．Ｍ．、に記載される要領で 決定した。 図１１のパネルＡに示すように、Ｕ７．６ ｓＦｖおよび二重特異的抗体（抗 −ＣＤ３×抗−ｍｙｃ）の両方が存在する場合（黒三角、実線）に、有意な溶菌 が生じ、二重特異性抗体単独（白三角）、Ｕ７．６ sＦｖ単独（黒四角）、も しくはＵ７．６ ｓＦｖ、二重特異性抗体、プラス１ｍＭのＤＮＰハプテン（黒 三角、破線）を含む対照においては溶菌はよりわずかなものであった。陽性対照 として（パネルＢ）、ＴＮＰ−標的細胞は、抗−ＣＤ３×抗−ＤＮＰ二重特異性 抗体（白丸）の存在下ではヒトＴ細胞による溶菌を受けたが、全く抗体が存在し ない場合（白三角）あるいは１ｍＭのＤＮＰ−ハプテンが存在する場合（白丸、 破線）には溶菌は生じなかった。最後に、標的細胞をＴＮＰでコートしていない 場合で（パネルＣ）、抗体が存在しない（白四角）、抗−ＣＤ３×抗−ＤＮＰ（ 白丸）、もしくは抗−ＣＤ３×抗−ｍｙｃ（黒三角）のいずれかの場合には溶菌 は全く生じなかった。 図１２は、活性化ヒトＴ細胞によるＴＮＰ−ＴＦＲ−トランスフェクト済みＬ 細胞の溶菌から得られるデータを示す。白丸破線は、抗体が存在しない場合のエ フェクター細胞および標的細胞を意味する。黒三角は、細胞プラス抗−ＣＤ３× 抗−ペプチドニ重特異性抗体を意味する。白丸は、ＯＫＴ９−ｓＦｖブラス細胞 および二重特異性抗体を意味する。白丸実線は、Ｕ７．６−ｓＦｖプラス細胞お よび二重特異性抗体を意味す る。Ｘ軸はエフェクター細胞：標的細胞比を示す。Ｙ軸は⁵¹Ｃｒ放出により測定 したパーセント比溶菌率を示す。配列表 本明細書と共に送付するのは、要求されるコンピューター解読可能形態での「 配列表」のコピーである。出願者の弁理士は、紙面形態での「配列表」の中身と コンピューター解読可能形態の「配列表」の中身とは同一であることを本明細書 により声明する。等価物 当業者は、日常的な実験と同程度のものを使用して本明細書に記載される発明 の具体的実施例の多くの等価物を認識するであろうし、あるいはそれらを実証す ることが可能であろう。このような等価物は以下に示す請求の範囲に含まれるも のとする。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願者： （Ａ）住所：Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｂ）街路名：３５ Ｓｏｕｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ （Ｃ）市：Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ （Ｄ）州：ＭＡ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：０１７４８ （Ａ）住所：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （Ｂ）街路名：Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｃ）市：Ｂｅｔｈｅｓｄａ （Ｄ）州：ＭＤ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：２０８９２ （ｉｉ）発明の名称：標的細胞に作用物質を輸送する方法 （ｉｉｉ）配列数：２０ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）住所：Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｒｏｏｋ、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｒｅｙｎｏ ｌｄｓ、Ｐ．Ｃ． （Ｂ）街路名：Ｔｗｏ Ｍｉｌｉｔｉａ Ｄｒｉｖｅ （Ｃ）市：Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ （Ｄ）州：ＭＡ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：０２１７３ （ｖ）コンピューター解読可能形態： （Ａ）メディウムの種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０、Ｖ ｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５ （ｖｉ）現行の出願データー： （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理店情報： （Ａ）氏名：Ｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｅ． （Ｂ）登録番号：２２，５９２ （Ｃ）参照／審査番号：ＣＢＭ９２−０２．ＰＣＴ （ｉｘ）電気通信情報： （Ａ）電話：（６１７）９８１−６２４０ （Ｂ）テレファックス：（６１７）９８１−９５４０ （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６０ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１．．３６０ （ｘｉ）配列 （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２０ （Ｂ）配列の種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｘｉ）配列 （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１．．３２７ （ｘｉ）配列 （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０９ （Ｂ）配列の種順：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｘｉ）配列 （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４２ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８３ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５６ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５９ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６２ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号１９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５８ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列 （２）配列番号２０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 16/28 8318−4Ｈ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (71)出願人 ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメ リカ・アズ・リプレゼンテツド・バイ・ ザ・セクレタリー・デパートメント・オ ブ・ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービ シズ アメリカ合衆国ワシントンデイーシー 20892・ボツクス オーテイーテイー，オ フイスオブテクノロジートランスフアー・ ナシヨナルインステイテユーツオブヘルス 内 (72)発明者 ジヨージ，アンドリユー・ジエイ・テイ イギリス・テイダブリユー１ ６ビーダブ リユー・リツチモンドサリイ・カーデイガ ンロード・グレンデイルハウス２ (72)発明者 セガル，デイビツド・エム アメリカ合衆国メリーランド州20850ロツ クビル・イートンオーバールツク５ (72)発明者 ハストン，ジエイムズ・エス アメリカ合衆国マサチユセツツ州02167チ エスナツトヒル・ドリユウロード５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ある宿主内の標的細胞にある作用物質を輸送するための方法であって、 ａ）その標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示す単一特異的結合性蛋白質をその宿主に対して、その単一特異的結合性蛋白 質がその細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その単一特異的結合 性蛋白質はある化学的部分で標識されている段階、ならびに ｂ）その化学的部分との反応性を示す一つの結合部位と、前記作用物質との反 応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体をその宿主に対して、その多価 抗体がその化学的部分標識化標的細胞およびその作用物質に結合し、それにより その標的細胞にその作用物質が輸送される条件下で投与する段階、 を含む前記方法。 ２． 抗体の一つの結合部分が造影剤との反応性を示す、請求の範囲１の方法 。 ３． ある宿主内の標的細胞にある細胞障害性作用物質を輸送するための方法 であって、 ａ）その標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある単一特異的結合性蛋白質をその宿主に対して、その単一特異的結合性 蛋白質がその細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その単一特異的 結合性蛋白質はある化学的部分で標識されている段階、ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位と、ある細胞障 害性作用物質との反応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体をその宿主 に対して、その多価抗体がその化学的部分標識化標的細胞およびその細胞障害性 作用物質に結合し、それによりその標的細胞にその細胞障害性作用物質が輸送さ れる条件下で投与する段階、 を含む前記方法。 ４． 単一特異的結合性蛋白質がある抗体断片である、請求の範囲１もしくは 請求の範囲３の方法。 ５． 抗体断片があるＦａｂである、請求の範囲４の方法。 ６． 単一特異的結合性蛋白質がある一本鎖融合蛋白質である、請求の範囲１ もしくは請求の範囲３の方法。 ７． 一本鎖融合蛋白質がある一本鎖抗体である、請求の範囲６の方法。 ８． 化学的部分標識がある一本鎖融合蛋白質の複数の可変領域同士を連結す るリンカーである、請求の範囲１もしくは請求の範囲３の方法。 ９． 化学的部分標識がその標的細胞に結合している単一特異的結合性蛋白質 のあるエピトープである、請求の範囲１もしくは請求の範囲３の方法。 １０． 化学的部分標識があるペプチド標識である、請求の範囲１もしくは請求 の範囲３の方法。 １１． ペプチド標識がアミノ酸配列（配列番号５）を含む、請求の範囲１０の 方法。 １２． 化学的部分の構造を、その化学的部分についてのある多価抗体の結合親 和性を減少させるような様式で変化させる、請求の範囲１もしくは請求の範囲３ の方法。 １３． ペプチド標識が、そのペプチド標識についてのある多価抗体の結合親和 性を減少させるような様式で変化させてあるアミノ酸配列を含む、請求の範囲１ ０の方法。 １４． 多価抗体があるヘテロ二重特異的抗体である、請求の範囲１、２、およ び３の内のいずれか一つの方法。 １５． ヘテロ二重特異的抗体がある架橋結合化抗体断片である、請求の範囲１ ４の方法。 １６． 架橋結合してある抗体断片があるＦａｂ断片である、請求の範囲１５の 方法。 １７． 多価抗体があるホモ二量体ＩｇＧ分子である、請求の範囲１もしくは請 求の範囲３の方法。 １８． ヘテロ二重特異的抗体の内の一つの結合部位がある細胞障害性リンパ球 上のある細胞表面マーカーとの反応性を示す、請求の範囲１４の方法。 １９． 一つの結合部位が細胞表面マーカーＣＤ３との反応性を示す、請求の範 囲１８の方法。 ２０． 抗体の内の一つの結合部位がある細胞障害性化学物質との反応性を示す 、請求の範囲１４の方法。 ２１． 単一特異的結合性蛋白質が一つを上回る種類の単一特異的結合性蛋白質 の混合物を含み、その各種類の結合性蛋白質がその標的細胞上の異なる細胞表面 マーカーとの反応性を示す、請求の範囲１もしくは請求の範囲３の方法。 ２２． ある宿主における免疫療法であって、 ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーと の反応性を示すある単一特異的結合性蛋白質をある宿主に対して、その単一特異 的結合性蛋白質がその細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その単 一特異的結合性蛋白質はある化学的部分で標識されている段階、ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位と、ある細胞障害性リン パ球との反応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体をその宿主に対して 、その多価抗体がその化学的部分標識化標的細胞およびその細胞障害性リンパ球 に結合し、それによりその標的細胞にその細胞障害性リンパ球が輸送される条件 下で投与する段階、 を含む、前記方法。 ２３． ある宿主内の特異的組織を造影するための方法であって、 ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある単一特異的結合性蛋白質をある宿主に対して、その単一特異的結合性 蛋白質がある細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その単一特異的 結合性蛋白質はある化学的部分で標識されている段階、ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位と、ある造影剤との反応 性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体をその宿主に対して、その多価抗 体がその化学的部分標識化標的細胞およびその造影剤に結合し、それによりその 標的細胞にその造影剤が輸送される条件下で投与する段階、 を含む、前記方法。 ２４． ある宿主内の標的細胞にある作用物質を輸送るための方法であって、 ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある二重特異的結合性蛋白質をある宿主に対して、その二重特異的結合性 蛋白質がその細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その二重特異的 結合性蛋白質はある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位を有する段階、 ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位と、ある作用物質との反 応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体をその宿主に対して、その標識 化多価抗体がその二重特異的結合性蛋白質およびその作用物質に結合し、それに よりその標的細胞にその作用物質が輸送される条件下で投与する段階、 を含む、前記方法。 ２５． 二重特異的結合性蛋白質がある二重特異性一本鎖融合蛋白質である、請 求の範囲２４の方法。 ２６． 二重特異的結合性蛋白質があるキメラ一本鎖Ｆｖ蛋白質アナログである 、請求の範囲２５の方法。 ２７． 宿主内の標的細胞にある作用物質を輸送するための方法であって、 ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示す単一特異的結合性蛋白質をその宿主に対して、その単一特異的結合性蛋白 質がその細胞表面マーカーに結合する条件下で投与するが、その単一特異的結合 性蛋白質はある化学的部分で標識されている段階、 ｂ）ある作用物質との反応性を示す一つの結合部位と、ある化学的部分との反 応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体を提供する段 階、 ｃ）前記多価抗体をその作用物質と、その作用物質がその多価抗体に結合し、 そのため作用物質結合型多価抗体がもたらされる条件下で接触させる段階、なら びに ｄ）その作用物質結合型多価抗体をその宿主に対して、その多価抗体がその化 学的部分標識化標的細胞に結合し、それによりその標的細胞にその作用物質が輸 送される条件下で投与する段階、 を含む、前記方法。 ２８． 標的細胞への作用物質の輸送を誘導するように改変されているある標的 細胞であって、その標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーに 結合する単一特異的結合性蛋白質を含み、その単一特異的結合性蛋白質はある化 学的部分で標識されており、その化学的部分はその化学的部分との反応性を示す 一つの結合性部位と前記作用物質との反応性を示す他の結合性部位とを有するあ る多価抗体上のある部位により認識され、そしてその部位に対して結合し、それ によりその標的細胞へのその作用物質の輸送が誘導される、前記標的細胞。 ２９． 化学的部分の構造を、その化学的部分に対するある多価抗体の結合親和 性を減少させるような様式で変化させる、請求の範囲２８の改変化標的細胞。 ３０． ａ）ある宿主内の標的細胞への輸送のためのある作用性物質、 ｂ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある単一特異的結合性蛋白質（その単一特異的結合性蛋白質がその細胞表 面マーカーに対して結合する条件下において、そしてその単一特異的結合性蛋白 質はある化学的部分で標識されている）、な らびに ｃ）その化学的部分との反応性を示す一つの結合性部位と、前記作用性物質と の反応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体（その多価抗体がその化学 的部分標識化標的細胞およびその作用性物質に結合し、そのことによりその標的 細胞に対してその作用性物質が輸送される条件下において）、 を含む治療法もしくは診断法における利用のための物質。 ３１． 抗体の内の一つの結合部位がある造影剤との反応性を示す、請求の範囲 ３０の物質。 ３２． ａ）ある宿主内の標的細胞への輸送用のある細胞障害性作用物質、 ｂ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある単一特異的結合性蛋白質（その単一特異的結合性蛋白質がその細胞表 面マーカーに結合する条件下において、そしてその単一特異的結合性蛋白質はあ る化学的部分で標識されている）、ならびに ｃ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合性部位およびある細胞障害性 作用性物質との反応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体（その多価抗 体がその化学的部分標識化標的細胞およびその細胞障害性作用性物質に結合し、 そのことによりその標的細胞に対してその作用性物質を輸送する条件下において ）、 を含む細胞障害性治療における利用のための物質。 ３３． 請求の範囲４−２１の内のいずれか一つの追加的特徴を有する、請求の 範囲３０、３１、および３２の内のいずれか一つの物質。 ３４． ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マー カーとの反応性を示すある単一特異的結合性蛋白質（その単一特異的結合性蛋白 質がその細胞表面マーカーに結合する条件下において、そしてその単一特異的結 合性蛋白質はある化学的部分で標識されている）、ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合性部位と、ある細胞障害性リ ンパ球との反応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体（その多価抗体が その化学的部分標識化標的細胞およびその細胞障害性リンパ球に結合し、そのこ とによりその標的細胞に対してその細胞障害性リンパ球が輸送される条件下にお いて）、 を含む免疫療法における利用のための物質。 ３５． ａ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの 反応性を示すある単一特異的結合性蛋白質（その単一特異的結合性蛋白質がその 細胞表面マーカーに結合する条件下において、そしてその単一特異的結合性蛋白 質はある化学的部分で標識されている）、ならびに ｂ）ある化学的部分との反応性を示す一つの結合性部位と、ある造影剤との反 応性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体（その多価抗体がその化学的部 分標識化標的細胞およびその造影剤に結合し、そのことによりその標的細胞に対 してその造影剤が輸送される条件下において）、 を含むある宿主内の特異的組織を造影するのに利用するための物質。 ３６． ａ）ある宿主内の標的細胞への輸送のためのある作用性物質、 ｂ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある二重特異的結合性蛋白質（その二重特異的結合性蛋 白質がその細胞表面マーカーに結合する条件下において、そしてその二重特異的 結合性蛋白質はある化学的部分との反応性を示す一つの結合部位を有する）、な らびに ｃ）ある化学的部分で標識される一つの結合部位と、ある作用性物質との反応 性を示す他の結合部位とを有するある多価抗体（その標識化多価抗体がその二重 特異的結合性蛋白質およびその作用性物質に結合し、そのことによりその標的細 胞にその作用性物質が輸送される）、 を含む治療法もしくは診断法における利用のための物質。 ３７． 二重特異的結合性蛋白質がある二重特異的一本鎖融合蛋白質である、請 求の範囲３６の物質。 ３８． 二重特異的結合性蛋白質があるキメラ一本鎖Ｆｖ蛋白質アナログである 、請求の範囲３７の物質。 ３９． ａ）ある宿主内の標的細胞への輸送のためのある作用物質、 ｂ）ある標的細胞上の一つもしくは複数の天然の細胞表面マーカーとの反応性 を示すある単一特異的結合性蛋白質（その単一特異的結合性蛋白質がその細胞表 面マーカーに結合する条件下において、そしてその単一特異的結合性蛋白質はあ る化学的部分で標識されている）、ならびに ｃ）一つの結合部位を介してその作用物質に結合しておりかつある化学的部分 との反応性を示す他の結合部位を有するある多価抗体（その多価抗体がその化学 的部分標識化標的細胞に結合し、そのことによりその標的細胞にその作用物質が 輸送される）、 を含む、治療法もしくは診断法における利用のための物質。 ４０． 請求の範囲１−２７の内のいずれか一つの方法における利用に適するあ る単一特異的もしくは多重特異的結合性蛋白質および／または ある多価抗体を含む物質。