CN111333732B - 一种靶向人bcma且激活nk细胞的双特异性抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体及其应用，属于基因工程抗体技术领域。本发明利用基因工程技术将抗人BCMA单链抗体2A9与MICA分子胞外1‑3区通过G₄S柔性肽相连接，哺乳动物真核表达体系表达2A9‑MICA。本发明还提供表达和纯化2A9‑MICA双特异性抗体的方法，通过HEK293细胞分泌表达，亲和层析纯化获得目的蛋白。本发明的双特异性抗体2A9‑MICA能够特异性同时结合于多发性骨髓瘤细胞表面的BCMA分子和NK细胞表面的活化型受体NKG2D，重塑NKG2D途径诱导的NK细胞对BCMA阳性骨髓瘤细胞的免疫监视作用，最终达到激活机体自身免疫系统有效杀死BCMA阳性骨髓瘤细胞的目的。

Description

一种靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其 应用

技术领域

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及了一种能同时靶向人B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)和NKG2D受体的双特异性抗体 2A9-MICA。

背景技术

多发性骨髓瘤是一种不可治愈的浆细胞瘤，它在骨髓中会不受控制的大量增殖并干扰血细胞的正常生成，继而引发骨损伤。传统的治疗方法例如抗血管生成药物和蛋白酶抑制剂的使用，虽展现出了很好的疗效，但病患复发率高和药物有效清除率低等问题依旧存在。骨髓瘤细胞表面高度表达的BCMA，它的mRNA 在非造血组织中没有表达，但在B细胞分化为浆细胞和骨髓浆细胞时表达上调，因此，BCMA对浆细胞的限制性表达及其在骨髓瘤细胞的存活和生长中所起的作用，使其成为免疫治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点。

BCMA是由185个氨基酸残基组成的非糖基化的III型整合膜蛋白，属于TNF (tumornecrosis factor,肿瘤坏死因子)受体家族的一名成员(TNFRSF17)，在管理B细胞的成熟及分化成浆细胞的过程中扮演着至关重要的角色。多发性骨髓瘤患者的恶性浆细胞中，BCMA的mRNA普遍呈高度表达的状态，与此同时， BCMA的过表达会引起蛋白激酶B、MAPK和NF-κB信号的产生，从而增强了多发性骨髓瘤细胞的增殖与存活。BCMA有两个配体，BAFF和APRIL。BCMA 与APRIL的结合，提升了浆母细胞与骨髓血细胞的存活能力，同时可以直接上调关键的免疫检查点分子，为创造一个免疫抑制的骨髓微环境提供了良好的条件。这个结合过程还可以激活经典的与非经典的NF-κB信号通路，进一步增加了血管生成和转移因子，黏附和迁移分子，以及生长和存活基因的产生。当BAFF 与BCMA结合后，可活化经典及非经典的NF-κB信号通路和JNK信号通路等，上述信号通路的活化可以使抗凋亡蛋白的表达上调，促凋亡蛋白的表达下调，进而维持多发性骨髓瘤细胞的存活、分化和成熟。

MHC I类分子相关蛋白A(MHC-I molecules related protein A,MICA)是一个含有383个氨基酸的蛋白质分子，它是一种肿瘤相关抗原，被发现表达于多种肿瘤细胞中。MICA为自然杀伤细胞NK细胞活化受体NKG2D的主要功能性配体，当它与NKG2D结合时，可有效刺激效应细胞对靶细胞的细胞裂解作用，传递细胞活化信号，加强了NK细胞的抗肿瘤效应，为免疫系统清除肿瘤细胞创造了良好的条件。而另一方面，肿瘤细胞在增殖过程中，其表面某些MICA分子会脱落至血清中，抑制了机体对肿瘤细胞的免疫监视作用，最终导致免疫逃逸现象的发生。在此过程中，NKG2D虽然仍旧能识别并结合脱落至血清中的游离MICA分子，却不会刺激免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应。

NKG2D与肿瘤细胞表面的MICA的结合可以促进NK细胞靠近肿瘤细胞进而与肿瘤细胞结合，活化的NK细胞会释放毒性颗粒，同时分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ来调节效应细胞的功能。但肿瘤细胞表面的MICA会通过脱落来躲过免疫监视，这样即使NKG2D识别了从肿瘤细胞表面脱落的MICA分子，却不能激活免疫细胞，导致了免疫逃逸现象的发生。反之，若肿瘤细胞表面的相应配体表达上调，则会促进NK细胞结合并杀伤肿瘤细胞。

基于上述理论基础，本发明筛选并获得了具有自主知识产权的抗人BCMA 单链抗体2A9，并将其与MICA通过柔性肽连接，设计新型重组双特异性抗体 2A9-MICA。该双特异性抗体借助2A9单链抗体的靶向性将MICA分子带入肿瘤细胞的附近，通过MICA与NKG2D的结合使得NK细胞聚集到病灶部位，活化的NK细胞杀伤肿瘤细胞以重建肿瘤微环境中的免疫监视和免疫清除作用。为肿瘤免疫的抗体疗法提供新的启发与思路。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种基于抗人BCMA单链抗体 2A9设计的具有抗肿瘤免疫疗效的双特异性抗体蛋白2A9-MICA。

本发明还要解决的技术问题是提供上述双特异性抗体蛋白2A9-MICA在肿瘤免疫治疗中的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体，该双特异性抗体包括抗人BCMA单链抗体和人源MICA胞外1-3区；所述抗人BCMA单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，所述抗人BCMA单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

其中，所述人源MICA胞外1-3区的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示，所述人源MICA胞外1-3区的核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。

其中，所述抗人BCMA单链抗体和人源MICA胞外1-3区之间由柔性肽连接。

作为优选，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，所述双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示。分子量为65kDa，以抗人 BCMA单链抗体2A9与人源MICA分子为基础，运用基因重组等手段，构建成双功能抗体融合蛋白2A9-MICA。

本发明前期利用噬菌体展示技术筛选到了靶向人BCMA的单链抗体2A9。本发明中所述双特异性抗体(2A9-MICA)的完整结构的肽链由2A9重链可变区、 2A9轻链可变区、人源MICA胞外1-3区和和组氨酸标签10×His组成，并且2A9 的轻(重)链可变区域和两种功能蛋白半分子间(rG7S、MICA)通过柔性肽G₄S连接。

本发明单链抗体2A9的特征为特异性靶向BCMA胞外区，亲和力高，具备成为靶向药物开发的潜在弹头药物。本发明双特异性抗体蛋白2A9-MICA的特征为G₄S柔性肽Linker连接2A9与MICA分子，保留了二者原有的亲本活性；哺乳动物细胞表达系统进行蛋白表达，保证融合蛋白的生物活性；利用2A9的靶向性将MICA特异性地展示于BCMA⁺骨髓瘤细胞表面，避免了由于细胞表面 MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸；激活NK细胞并诱导其分泌 IFN-γ、TNF-α等细胞因子，重塑NK细胞对肿瘤细胞的免疫监视功能；体内外实验中，抑制骨髓瘤细胞OPM-2和NCI-H929细胞生长的作用明显。

一种表达载体，包含上述靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体。

一种重组细胞，包含上述靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体。

上述靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中，所述的肿瘤为BCMA高表达的肿瘤。

作为优选，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。

发明进一步说明：

本发明中双特异性抗体基因序列全长1602个核苷酸。含有本发明双特异性抗体2A9-MICA基因的表达载体和转染细胞株均属于本发明的保护范围。扩增本发明双特异性抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述双特异性抗体 2A9-MICA的方法。

本发明中双特异性抗体蛋白2A9-MICA的肽链由2A9重链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、2A9轻链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、人源 MICA分子、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)和10个氨基酸的组氨酸标签 (HHHHHHHHHH)依次组成。

本发明利用overlap PCR(polymerase chain reaction)技术将本实验室筛选获得的BCMA单链抗体的轻链可变区C端与人源MICA胞外1-3区基因辅以柔性肽 G₄S相连接，进行克隆重组，构建抗体融合蛋白2A9-MICA重组载体，通过PEI 瞬时转染HEK293细胞进行发酵表达；使用HisTrap亲和层析柱分离纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测纯化产物为电泳纯，Western Blotting鉴定表达产物表达及装配正确；FCM(flow cytometry)结果揭示了抗体融合蛋白可与多种BCMA⁺肿瘤细胞结合；细胞毒性裂解试验以NK-92为效应细胞，骨髓瘤细胞株OPM-2为靶细胞，结果表明2A9-MICA能有效地介导免疫细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤，而亲本单链抗体不具备上述特征；进一步的流式细胞术和ELISA检测结果说明， 2A9-MICA通过NKG2D途径诱导NK-92细胞脱粒，同时分泌大量细胞因子IFN-γ和TNF-α以更有效地杀伤靶细胞。

本发明涉及的体内实验采用荷人骨髓瘤(RPMI-8226和NCI-H929)裸鼠模型验证2A9-MICA的抗肿瘤活性。给药后通过对皮下移植瘤体积和重量的测定说明，2A9-MICA对裸鼠RPMI-8226和NCI-H929骨髓瘤模型具有明显的生长抑制作用。结果显示其抑瘤作用明显优于对照组。

有益效果：

本发明前期利用噬菌体展示技术筛选到了抗人BCMA的单链抗体2A9，并在此基础上融合了人MICA 1-3区，使之融合表达成为双特异性抗体。双特异性抗体2A9-MICA具备稳定的双重靶向性，其可利用2A9单链抗体的靶向性将 MICA特异性地展示于骨髓瘤细胞表面，避免了由于细胞表面MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸。在体内外试验中，BCMA⁺骨髓癌细胞OPM-2、 NCI-H929和RPMI-8226细胞被2A9-MICA所标记，通过MICA-NKG2D信号通路有效募集并激活NK细胞，诱导其释放穿孔素-颗粒酶，分泌IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子，有效杀伤肿瘤细胞并抑制其生长。2A9-MICA的设计开辟了一种新的骨髓瘤免疫治疗策略，是一种特异性重塑NK细胞对BCMA⁺骨髓癌细胞免疫监视功能的双特异抗体蛋白。

附图说明

图1是基于2A9单链抗体设计的双特异性抗体2A9-MICA重组基因图谱、三维结构模拟图、SDS-PAGE和western blotting鉴定图。图1A是2A9-MICA的基因组成和表达载体。2A9-MICA双特异性抗体的基因大小约1668bp，分别由 VH区、VL区、MICA和组氨酸标签组成，每两个蛋白结构域之间有G₄S柔性肽进行连接。2A9-MICA的重组基因最终导入到表达载体pCMV3中进行表达。图1B是MOE软件预测的2A9-MICA双特异性抗体的空间结构。图1C是 2A9-MICA双特异性抗体分别用anti-His tag抗体和anti-MICA抗体孵育的 western blotting图。图1D是2A9-MICA双特异性抗体的SDS-PAGE电泳图。

图2是2A9-MICA与不同骨髓瘤细胞株的流式结合测定结果图。图2A、图2B、图2C和图2D描述2A9-MICA与NCI-H929、OPM-2和RPMI-8226骨髓瘤细胞系结合，但不与BCMA^-的Raji细胞结合；同时针对同一种骨髓瘤细胞系， 2A9-MICA表现出与2A9相当的结合效率。

图3是2A9-MICA与不同骨髓瘤细胞株的表面等离子共振(SRP)实验结果图。图3A描述为2A9-MICA能够同时结合BCMA和NKG2D的SPR实验结果。图3B 和图3C 描述为2A9和2A9-MICA同BCMA抗原的SPR实验结果，2A9 与BCMA相互作用的亲和力常数K_D为3.456×10^{- 8}M，2A9-MICA与BCMA相互作用的亲和力常数K_D为7.597×10^-8M，2A9-MICA相比2A9的亲和力有所降低，但总体下降幅度不大，仍能保持在10^-8数量级，其亲和力降低的原因与双特异性抗体的分子构象和空间位阻有关。图3D 描述为2A9-MICA同NKG2D的SPR 实验结果，2A9-MICA与NKG2D相互作用的亲和力常数K_D为3.474×10^-6M，其相互作用为细胞因子与细胞受体的结合，故亲和力水平相比抗原抗体结合较低。

图4是2A9-MICA体外抗肿瘤活性实验图。图4A描述为细胞毒实验抗体融合蛋白最佳作用浓度摸索，靶细胞是NK-92时2A9-MICA最佳浓度为20μg/mL；图4B描述为效靶比梯度细胞毒性实验，在2A9-MICA存在的条件下，NK细胞对OPM-2细胞的杀伤作用明显加强，而亲本单链抗体rG7S无显著作用，游离的rMICA更可以抑制上述过程；图4C的数据统计分析进一步验证了2A9-MICA 能够明显增强NK-92细胞对骨髓癌细胞OPM-2的特异性杀伤。图4D是流式检测图，描述NK-92的活化水平与2A9-MICA具有浓度依赖性。图4E和4F是ELISA 检测结果图，描述NK-92细胞中IFN-γ和TNF-α的释放量与2A9-MICA具有浓度依赖性(与rG7S、rMICA相比)。

图5是荷人骨髓瘤RPMI-8226裸鼠移植瘤抑制实验结果图，图5A描述裸鼠皮下移植瘤照片，图5B描述RPMI-8226荷瘤小鼠各组的肿瘤组织重量，图5C 描述RPMI-8226荷瘤小鼠各组相比Vehicle组的抑瘤率，图5D描述RPMI-8226 荷瘤小鼠各给药组的生存期情况，抗体融合蛋白2A9-MICA对裸鼠骨髓瘤移植瘤的生长，相比2A9组、RD treatment组和Vehicle组，均具有显著的抑制作用。

图6是荷人骨髓瘤NCI-H929裸鼠移植瘤抑制实验结果图，图6A描述裸鼠皮下移植瘤照片，图6B描述RPMI-8226荷瘤小鼠各组的肿瘤组织重量，抗体融合蛋白2A9-MICA对裸鼠骨髓瘤移植瘤的生长相Vehicle组，具有显著的抑制作用。

图7是双特异性抗体2A9-MICA与靶向BCMA和PD-1的双特异抗体 JZDE00的竞争性ELISA结合。以BCMA作为固定相，分别以固定浓度的 2A9-MICA和JZDE00同梯度浓度的JZDE00和2A9-MICA竞争性结合BCMA，结果显示二者并不存在显著的竞争关系，提示二者针对BCMA的抗原表位可能不同。

具体实施方案

实施例1：双特异性抗体2A9-MICA的构建

运用overlap PCR技术通过柔性肽G₄S进行基因拼接并添加两端酶切位点， PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。目的基因与pCMV3分别双酶切，酶切后回收目的基因与质粒片段。T4连接酶16℃过夜连接，得到重组质粒pCMV3-2A9 MICA。CaCl₂法将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中进行扩增并保存。结果如图1A所示。

实施例2：双特异性抗体2A9-MICA的表达与纯化

首先将重组质粒pCMV3-2A9 MICA以通过PEI转染试剂转染至HEK293细胞中，次日换液并对细胞进行传代，逐步扩大细胞发酵培养规模，收集细胞培养液，0.22μm滤膜过滤样品后进行Histrap亲和层析纯化，最终大量获得目的蛋白。表达的2A9-MICA蛋白结构模拟如图1B所示。纯化的详细步骤具体为：先用双蒸水冲洗Histrap柱10min，再用Binding Buffer平衡柱子10min，冲洗的流速为 1ml/min。接着，将单链抗体蛋白粗液上柱，控制流速为冲洗流速的一半。收集流出液，上完样后，再用Binding Buffer平衡10min，此间流速为1ml/min。接着，分别用含有20mM，50mM，100mM，250mM，500mM咪唑的Elution Buffer洗脱挂在Histrap柱上的蛋白，每个浓度梯度收满8个1.5ml EP管。最后用双蒸水冲洗Histrap柱10min，再用20％乙醇冲洗10min，保存在4℃环境中。12％ SDS-PAGE蛋白电泳和Western blotting对目的蛋白进行初步验证。结果如图1D 和1C所示。

实施例3：流式细胞术检测2A9-MICA与各种肿瘤细胞株的结合能力

该实验中首先将2×10⁵个NCI-H929、OPM-2、RPMI-8226和Raji细胞重悬于250μlPBS中，制备单细胞悬液。随后向各细胞悬液中加入等体积浓度为500nM 2A9-MICA进行共孵育1h。经PBS洗涤除去未结合的rG7S-MICA后，利用带有 FITC标签的anti-his mAb与各肿瘤细胞孵育，PBS洗涤后流式细胞仪检测结合于细胞表面的融合蛋白，筛选2A9-MICA敏感型肿瘤细胞株。结果如图2A-2D 所示。

实施例4：SPR实验检测2A9-MICA与BCMA的结合能力

该实验运用Fc捕获法进行。首先将CM5芯片放置于Biacore X100生物大分子相互作用仪上，以共价偶联的形式，将anti-human Fc antibody预先偶联与 CM5芯片表面，anti-human Fc antibody蛋白表面游离的-NH₂与芯片表面葡聚糖末端携带的-COOH共价聚合为肽键。接着以50μg/ml的BCMA-Fc蛋白或 NKG2D-Fc蛋白，10μl/min的流速，流过为芯片表面，使之被anti-human Fc antibody捕获成为固定相，接着芯片表面通过梯度浓度的2A9或2A9-MICA蛋白，每轮循环结束后使用3M MgCl₂进行洗脱，最后通过软件分析计算蛋白相互作用的亲和力常数K_D。结果如图3E-3H所示。

实施例5：LDH释放细胞毒性实验检测2A9-MICA在NK细胞对OPM-2 骨髓瘤细胞特异性杀伤过程中的作用

乳酸脱氢酶细胞毒性检测法检测NK-92细胞对靶细胞OPM-2的裂解作用。首先在最高效靶比10:1条件下，浓度倍比稀释添加2A9-MICA，以确定达到最高靶细胞裂解率所需2A9-MICA的最低剂量；设置一系列NK细胞数与靶细胞数效靶比(10:1，5:1，1:1)，检测在不同效靶比下2A9-MICA激活NK细胞对靶细胞的杀伤作用。结果如图4A-4C所示。

实施例6：流式细胞术与酶联免疫法检测2A9-MICA对NK细胞的活化及相关细胞因子释放的影响

在2A9-MICA存在条件下，NK-92细胞与肿瘤细胞(效靶比10:1)共孵育后流式细胞术检测NK-92细胞表面CD107a的表达量，表明rG7S-MICA能够有效激活NK细胞。设置rG7S-MICA浓度梯度(0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)，验证 NK细胞的活化与rG7S-MICA具有剂量依赖性。结果如图4D-4F所示。

实施例7：双特异性抗体2A9-MICA在RPMI-8226荷瘤裸鼠模型上的抗肿瘤活性研究

选用4-5周龄BALB/c雌性裸鼠建立荷人骨髓瘤RPMI-8226裸鼠移植瘤模型。将1×10⁷个对数生长期RPMI-8226细胞重悬于100μl注射用生理盐水中，注射器植入裸鼠左侧腋下，每日观察裸鼠成瘤情况。待裸鼠移植瘤生长至约80mm³后，将荷瘤小鼠随机分组，每组11只，其中5只用于抑瘤实验，另外6只用于生存期实验。每三天进行一次尾静脉给药，其中2A9-MICA的给药剂量为 5.0mg/kg，阴性对照组为PBS，同型对照组为2A9，阳性对照组为RDtreatment (给药剂量：3mg/kg来那度胺，腹腔注射d1-d21；5mg/kg地塞米松，腹腔注射 d1-d4/d9-d12)。在第33天抑瘤组的小鼠以离颈方式处死荷瘤裸鼠并解剖取瘤，对取下来的瘤组织称重并计算抑瘤率。生存期的小鼠停止给药，并开始观察小鼠的生存情况，生存期周期90天，实验结束后绘制小鼠生存期图，结果如图5A-5D 所示。

实施例8：双特异性抗体在NCI-H929荷瘤裸鼠模型上的抗肿瘤活性研究

选用4-5周龄BALB/c雌性裸鼠建立荷人骨髓瘤NCI-H929裸鼠移植瘤模型。将1×10⁷个对数生长期NCI-H929细胞重悬于100μl注射用生理盐水中，注射器植入裸鼠左侧腋下，每日观察裸鼠成瘤情况。待裸鼠移植瘤生长至约80mm³后，将荷瘤小鼠随机分组，每组六只。每三天进行尾静脉给药，其中2A9-MICA的给药剂量为5.0mg/kg，阴性对照组为PBS，阳性对照组为RD treatment(给药剂量：3mg/kg来那度胺，腹腔注射d1-d21；5mg/kg地塞米松，腹腔注射 d1-d4/d9-d12)。在第33天抑瘤组的小鼠以离颈方式处死荷瘤裸鼠并解剖取瘤，对取下来的瘤组织称重并计算抑瘤率。结果如图6所示。

实施例9双特异性抗体2A9-MICA与另一靶向BCMA和PD-1的双特异性抗体JZDE00的竞争性ELISA

JZDE00是本课题组构建的靶向BCMA和PD-1的双特异性抗体，其靶向 BCMA的一端采用的是市售抗体J6M0的可变区。将2A9-MICA和JZDE00分别进行等比浓度梯度稀释，并与固定浓度的JZDE00和2A9-MICA混和。将BCMA 蛋白作为固定相包被于酶标条中，4℃包被过夜。次日用脱脂牛奶封闭2h，预混过的两种双特异性抗体的混合物，37℃孵育2h。充分洗涤后，加入1:5000稀释的小鼠抗His tag抗体，37℃孵育2h。充分洗涤后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠抗H+L抗体，37℃孵育1.5h。充分洗涤后加入显色液显色，待显色出现明显趋势后，加入稀硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD₄₅₀和OD₆₃₀的数值，以二者的差值绘制浓度依赖性曲线。结果如图7所示。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

20 25 30

Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala

35 40 45

Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg

50 55 60

Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly

65 70 75 80

Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala

85 90 95

Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala

180 185 190

Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met

210 215 220

Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gctagcatgg ccgaggtgca gctgcagcag tctggggcag agcttgtgaa gccaggggcc 120

tcagtcaagt tgtcctgcac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatgcactgg 180

gtgaagcaga ggcctgaaca gggcctggag tggattggaa ggattgaccc tgcgaatggt 240

aatactaaat atgacccgaa gttccagggc aaggccacta taacagcaga cacatcctcc 300

aacacagcct acctgcagct cagcagcctg acatctgagg acactgccgt ctattactgt 360

gctagatggg tctactgggg ccaaggcacc actctcaccg tgtcgacagg aggtggtgga 420

agtgacgtcg tgatgaccca gtctccatct tccatgtatg catctctagg agagagagtc 480

actatcactt gcaaggcgag tcaggacatt aatagctatt taagctggtt ccagcagaaa 540

ccagggaaat ctcctaagac cctgatctat cgtgcaaaca gattggtaga tggggtccca 600

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggcaa gattattctc tcaccatcag cagcctggag 660

tatgaagata tgggaattta ttattgtcta cagtatgatg agtttccgta cacgttcgga 720

ggggggacca agctggaaat caagcgc 747

<210> 3

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro

20 25 30

Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln

35 40 45

Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg

50 55 60

Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile

65 70 75 80

Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys

85 90 95

Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr

100 105 110

Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr

115 120 125

Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn

130 135 140

Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met

145 150 155 160

His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Gly Val

165 170 175

Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu

180 185 190

Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr

195 200 205

Pro Arg Asn Ile Ile Leu Thr Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser

210 215 220

His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr

225 230 235 240

Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Arg Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val

260 265 270

Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp

275 280

<210> 4

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccaca gcctgcggta caacctgacc gtcctgtcct gggacggaag cgtccagagc 60

ggctttctgg ctgaggtgca cctggacggc cagcctttcc tgcggtacga ccggcagaaa 120

tgtcgggcta aaccccaggg ccagtgggct gaggatgtcc tgggcaacaa gacatgggac 180

cgggagacca gggacctcac aggcaacggc aaggacctcc ggatgacact ggcccacatc 240

aaggaccaga aggaaggcct gcacagcctg caggagatcc gggtgtgcga aatccacgag 300

gacaactcca cccggtcctc ccagcacttc tactacgacg gcgaactctt cctgtcccag 360

aatctggaga ccgaagagtg gacagtgcct cagagcagca gggcccaaac cctcgccatg 420

aacgtgcgga acttcctgaa ggaggacgcc atgaagacca agacccacta ccatgccatg 480

catgccgact gtctgcagga actgaggagg tacctggagt ccggcgtggt cctcaggagg 540

acagtgcctc ccatggtcaa cgtgacacgg agcgaagcct ccgagggaaa catcaccgtg 600

acctgcaggg cctcctcctt ctaccccagg aacatcatcc tgacctggag gcaagacggc 660

gtgagcctct cccatgacac ccagcagtgg ggcgatgtgc tgcctgacgg caacggcaca 720

taccaaacct gggtggctac ccggatttgt aggggcgaag agcagcggtt cacctgctac 780

atggaacaca gcggaaacca ctccacacac cctgtcccca gcggcaaagt cctggtgctg 840

cagagccact gg 852

<210> 5

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro

50 55 60

Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser

115 120 125

Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala

130 135 140

Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly

165 170 175

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu

195 200 205

Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

210 215 220

Ile Lys Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro His Ser Leu Arg

225 230 235 240

Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe

245 250 255

Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg

260 265 270

Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu

275 280 285

Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly

290 295 300

Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly

305 310 315 320

Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn

325 330 335

Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu

340 345 350

Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg

355 360 365

Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala

370 375 380

Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln

385 390 395 400

Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val

405 410 415

Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile

420 425 430

Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Ile Leu

435 440 445

Thr Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp

450 455 460

Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala

465 470 475 480

Thr Arg Ile Cys Arg Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu

485 490 495

His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu

500 505 510

Val Leu Gln Ser His Trp

515

<210> 6

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccgagg tgcagttgca gcagtctggg gcagagcttg tgaagccagg ggcctcagtc 60

aagttgtcct gcacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatatgca ctgggtgaag 120

cagaggcctg aacagggcct ggagtggatt ggaaggattg accctgcgaa tggtaatact 180

aaatatgacc cgaagttcca gggcaaggcc actataacag cagacacatc ctccaacaca 240

gcctacctgc agctcagcag cctgacatct gaggacactg ccgtctatta ctgtgctaga 300

tgggtctact ggggccaagg caccactctc accgtgtcga caggaggtgg tggaagtgac 360

gtcgtgatga cccagtctcc atcttccatg tatgcatctc taggagagag agtcactatc 420

acttgcaagg cgagtcagga cattaatagc tatttaagct ggttccagca gaaaccaggg 480

aaatctccta agaccctgat ctatcgtgca aacagattgg tagatggggt cccatcaagg 540

ttcagtggca gtggatctgg gcaagattat tctctcacca tcagcagcct ggagtatgaa 600

gatatgggaa tttattattg tctacagtat gatgagtttc cgtacacgtt cggagggggg 660

accaagctgg aaatcaagcg cggatccgga ggtggtggaa gtgagcccca cagcctgcgg 720

tacaacctga ccgtcctgtc ctgggacgga agcgtccaga gcggctttct ggctgaggtg 780

cacctggacg gccagccttt cctgcggtac gaccggcaga aatgtcgggc taaaccccag 840

ggccagtggg ctgaggatgt cctgggcaac aagacatggg accgggagac cagggacctc 900

acaggcaacg gcaaggacct ccggatgaca ctggcccaca tcaaggacca gaaggaaggc 960

ctgcacagcc tgcaggagat ccgggtgtgc gaaatccacg aggacaactc cacccggtcc 1020

tcccagcact tctactacga cggcgaactc ttcctgtccc agaatctgga gaccgaagag 1080

tggacagtgc ctcagagcag cagggcccaa accctcgcca tgaacgtgcg gaacttcctg 1140

aaggaggacg ccatgaagac caagacccac taccatgcca tgcatgccga ctgtctgcag 1200

gaactgagga ggtacctgga gtccggcgtg gtcctcagga ggacagtgcc tcccatggtc 1260

aacgtgacac ggagcgaagc ctccgaggga aacatcaccg tgacctgcag ggcctcctcc 1320

ttctacccca ggaacatcat cctgacctgg aggcaagacg gcgtgagcct ctcccatgac 1380

acccagcagt ggggcgatgt gctgcctgac ggcaacggca cataccaaac ctgggtggct 1440

acccggattt gtaggggcga agagcagcgg ttcacctgct acatggaaca cagcggaaac 1500

cactccacac accctgtccc cagcggcaaa gtcctggtgc tgcagagcca ctgg 1554

Claims (6)

1.一种靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括抗人BCMA单链抗体和人源MICA胞外1-3区；所述抗人BCMA单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.：1所示，所述抗人BCMA单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示

所述人源MICA胞外1-3区的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示，所述人源MICA胞外1-3区的核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。

2.根据权利要求1所述的靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体，所述抗人BCMA单链抗体和人源MICA胞外1-3区之间由柔性肽连接。

3.根据权利要求1所述的靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示。

4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1~3任一所述的靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体。

5.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求1~3任一所述的靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体。

6.权利要求1~3任一所述靶向人BCMA且激活NK细胞的双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。

Images