CN114292337B - 一种可溶性nk-car融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可溶性NK‑CAR融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用，所述融合蛋白包括从氨基端至羧基端由MICA胞外区、单链抗体和人IgG Fc端三部分构成。将编码该蛋白核苷酸序列插入真核表达载体中，转染至HEK293悬浮细胞进行蛋白表达，再通过SPA柱纯化，该蛋白在水溶液中呈二聚体状态，其CD20单链抗体可以结合靶细胞上的CD20抗原，MICA端与NK细胞上的NKG2D受体结合激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用，本发明为开发介导NK细胞和CD8⁺T细胞特异性杀伤肿瘤靶细胞的生物药物与应用奠定基础。

Description

一种可溶性NK-CAR融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶 向杀肿瘤细胞药物中应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种可溶性NK-CAR融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用。

背景技术

近些年，以嵌合抗原受体(CAR)T cells技术和PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫疗法取得了突破性进展，为肿瘤治疗开辟了新的道路。然而越来越多的证据表明一些癌症发展出了多种策略逃避CD8⁺T细胞，这类肿瘤能够优先受到自然杀伤细胞-NK细胞的攻击，NK细胞来源于骨髓中多能造血祖细胞，是一种重要的先天性淋巴细胞，研究表明恶性肿瘤的发生与原发性NK细胞免疫缺陷相关，NK细胞毒性较低的个体中有更高的患癌风险，这说明NK细胞在肿瘤细胞的免疫监视中发挥着重要的作用。到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究都使用为CAR-T细胞设计的CAR结构，虽然这些最初用于T细胞的CARs在应用于NK细胞后也发挥了抗肿瘤活性，但有报道称含有2B4(NK特异性共刺激结构域)的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性显著增强，与携带常规4-1BB的NK细胞相比，细胞增殖更快，能够产生更多的细胞因子，而细胞凋亡更少，这表明NK细胞特异性激活信号影响NK-CAR的性能。此外，有研究表明有NKG2D TM结构域和2B4共刺激结构域的抗肿瘤活性最大。

NKG2D-NKG2D Ligand轴(NKG2D-NKG2D配体轴)是人类NK细胞介导的肿瘤细胞和病毒感染细胞识别的主要激活通路。NKG2D是NK细胞上的一种重要的激活性受体，NKG2D以同源二聚体形式表达在NK细胞表面，胞质区不含ITAM基序，而是与胞质区内含传递活化信号基序(YXXM)的DAP10同源二聚体结合传导活化信号，招募p85 PI3激酶和Vav-1-Grb2复合物，从而启动一系列程序使NK细胞活化，释放穿孔素、颗粒酶或者通过产生IFN-γ等细胞因子发挥调节效应杀伤肿瘤细胞。

NKG2D能结合多种配体，其中MICA和MICB是研究最多的NKG2D配体，MICA是一种应激性表达蛋白，正常情况下表达在上皮细胞，成纤维细胞，角质形成细胞，内皮细胞和单核细胞上。在病毒感染或肿瘤等应激条件下也能诱导MICA的表达(如在上皮肿瘤，黑素瘤)，肝癌和一些造血恶性肿瘤中也检测到MICA的表达。当人巨细胞病毒感染减低细胞表面的MICA表达后，该病毒感染的靶细胞逃避宿主NK细胞的杀伤。在病毒感染和肿瘤转化期间，NK细胞杀伤功能的降低与NKG2D配体表达水平的降低相关；另外，可溶性NKG2DL，如可溶性的MICA分子(sMICA),与NKG2D受体结合后阻断了NK细胞的活化性受体NKG2D直接对靶细胞的接触杀伤。因此，设计一种融合蛋白来直接介导NK细胞对特异性靶细胞的免疫杀伤。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)；利用MS-Ig特异性结合抗原特异性靶细胞的能力，解决现有技术的CAR技术需要跨膜结构和胞内信号传导结构域，并且需要通过基因技术表达到NK细胞膜上的缺陷；本发明获得的可溶性NK-CAR融合蛋白，为没有跨膜结构和胞内信号转导结构域但实现了NK-CAR功能的重组可溶性蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述可溶性NK-CAR融合蛋白的制备方法；

本发明的再一目的在于提供上述可溶性NK-CAR融合蛋白在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)，所述融合蛋白包括从氨基端至羧基端由MICA胞外区、单链抗体(ScFv)和人IgG Fc端三部分构成；所述单链抗体可以结合靶细胞上的特异性抗原，MICA端与NK细胞上的NKG2D受体结合激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用，本发明为开发NK细胞免疫疗法的药物并应用于肿瘤疾病临床治疗奠定基础。

作为优选的实施方式，所述MICA胞外区为NKG2D受体结合的MICA胞外区，由MICA信号肽和MICA蛋白序列组成。

所述融合蛋白在水溶液中呈二聚体状态；所述融合蛋白通过Fc端之间形成二硫键，使蛋白在自然条件下呈二聚体状态。

所述的单链抗体(ScFv)为抗肿瘤细胞表面特异性抗原的单链抗体；

所述肿瘤为B细胞性淋巴瘤时，作为优选的实施方式，所述单链抗体为抗CD20单链抗体(ScFv)；所述抗CD20单链抗体可以结合靶细胞上的CD20抗原，MICA端与NK细胞上的NKG2D受体结合激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用，本发明为开发NK细胞免疫疗法的药物并应用于肿瘤疾病临床治疗奠定基础。并根据需要，该单链抗体可更换为针对其他靶抗原的单链抗体。

所述IgG Fc端优选为人IgG Fc端。

上述的可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)，其具体的氨基酸序列由依次排列的以下组分组成：MICA信号肽氨基酸序列、MICA蛋白氨基酸序列、单链抗体(ScFv)重链氨基酸序列、连接氨基酸序列、单链抗体(ScFv)轻链氨基酸序列、IgG Fc氨基酸序列。

所述MICA信号肽氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

所述MICA蛋白氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示；

所述单链抗体(ScFv)重链氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示；

所述连接氨基酸序列优选为(GGGGS)3Linker。

所述单链抗体(ScFv)轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示；

所述IgG Fc氨基酸序列，优选为人源IgG Fc氨基酸序列。

上述的可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)，其具体的核苷酸序列由依次排列的以下组分组成：MICA信号肽核苷酸序列、MICA蛋白核苷酸序列、单链抗体(ScFv)重链核苷酸序列、连接核苷酸序列、单链抗体(ScFv)轻链核苷酸序列、IgG Fc核苷酸序列、终止密码子。

所述MICA信号肽核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示；

所述MICA蛋白核苷酸序列，如SEQ ID NO.6所示；

所述单链抗体(ScFv)重链核苷酸序列，如SEQ ID NO.7所示；

所述连接核苷酸序列优选为(GGGGS)3Linker对应的核苷酸序列。

所述单链抗体(ScFv)轻链核苷酸序列，如SEQ ID NO.8所示；

所述IgG Fc核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示。

上述可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)的制备方法，包括步骤如下：

(1)MS-Ig-pCMV5.1重组质粒构建：人工合成可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)核苷酸序列，通过分子克隆技术将可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)核苷酸序列插入pCMV5.1质粒；

(2)MS-Ig蛋白的表达：大量提取MS-Ig-pCMV5.1重组质粒，将MS-Ig-pCMV5.1重组质粒转染HEK293悬浮细胞，表达后将细胞离心，收集上清；

(3)MS-Ig蛋白的纯化：将(2)中收集的上清通过SPA柱，SPA与MS-Ig蛋白的Fc端具有生物亲和作用，可将MS-Ig吸附在柱子上，吸附完成后，用酸性洗脱液将柱子上吸附的蛋白洗脱下来，加入中和液，再对蛋白进行浓缩。

上述可溶性NK-CAR融合蛋白(MS-Ig)在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用。

作为优选的实施方式，可溶性NK-CAR融合蛋白介导NK细胞杀伤靶细胞的应用，包括但不限于，其CD20单链抗体可以结合靶细胞上的CD20抗原，MICA端与NK细胞上的NKG2D受体结合，激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用。

本发明实施例中具体以B细胞淋巴瘤细胞表面抗原CD20的单链抗体ScFv为代表，设计了一种可溶性NK-CAR，将MICA的胞外结构域与CD20分子的ScFv连接，并在羧基端加上人IgG1 Fc片段构成MS-Ig可溶性嵌合受体蛋白。作为一种可溶性CAR，MS-Ig的CD20分子的单链抗体ScFv部分与B淋巴瘤细胞表面的CD20分子结合；MICA胞外结构域部分可与NK上的NKG2D受体结合激活NK细胞发挥杀伤靶细胞作用，Fc部分使可溶性蛋白形成二聚体稳定结构，该嵌合受体蛋白与传统意义上的CAR不同的是，MS-Ig无跨膜结构和胞内信号转导结构域，信号转导通路可直接通过MICA与NKG2D结合而激活；且MS-Ig不用通过基因技术表达在NK细胞膜上，但能实现NK-CAR功能的可溶性融合重组蛋白。

本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下的有益效果：

1.本发明的优势在于首次提出可溶性NK-CAR概念，与传统意义上的CAR不同的是，可溶性NK-CAR融合蛋白MS-Ig无跨膜结构和胞内信号转导结构域，信号转导通路可直接通过MICA与NKG2D结合而激活，激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用，为开发介导NK细胞和CD8⁺T细胞特异性杀伤肿瘤靶细胞的生物药物与应用奠定基础。

2.本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc，其优势之一在于方便蛋白纯化，相较于His蛋白标签，表达后的上清无需透析，经过简单稀释可直接上柱吸附，节约生产时间。

3.本发明在本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc，降低了体内用药的免疫原性。

4.本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc,能延长作为体内使用药物的代谢半衰期。

附图说明

图1为本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白的序列结构示意图。

图2为本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白的免疫印迹结果示意图；

图3为本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白的考马斯亮蓝染色结果示意图；

图4为本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白介导NK cell对Daudi的杀伤结果示意图。

图5为本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白的制备方法及应用的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术的CAR技术需要跨膜结构和胞内信号传导结构域，并且需要通过基因技术表达到NK细胞膜上的缺陷；本发明获得的可溶性NK-CAR融合蛋白，为无跨膜结构和胞内信号转导结构域但能实现NK-CAR功能的可溶性融合重组蛋白。

实施例一：pCMV5.1-MS-Ig重组质粒的构建

MICA胞外区核苷酸序列在IPD-IMGT/HLA Database查询所得，抗CD20单链抗体序列为本实验室保存，IgG Fc核苷酸序列为PubMed查询所得。如图1所示，将上述序列按先后顺序进行拼接，重组序列交由华大基因合成。将合成好的序列和pCMV5.1质粒同时进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶，切胶回收酶切后的重组序列和空质粒载体对应条带，用T4连接酶进行连接，连接产物转化至DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞中，涂抗性板筛选阳性单克隆，酶切验证重组质粒，送公司测序，选择测序正确的单克隆进行质粒提取并保种pCMV5.1-MS-Ig重组质粒。

其中：所述MICA胞外区由MICA信号肽和MICA蛋白序列组成；所述MICA信号肽核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示；所述MICA蛋白核苷酸序列，如SEQ ID NO.6所示；所述MICA信号肽氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示；所述MICA蛋白氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

所述抗CD20单链抗体序列，包括单链抗体(ScFv)重链核苷酸序列、连接核苷酸序列和单链抗体(ScFv)轻链核苷酸序列；其中：所述单链抗体(ScFv)重链核苷酸序列，如SEQID NO.7所示；所述连接核苷酸序列为(GGGGS)3Linker对应的核苷酸序列；所述单链抗体(ScFv)轻链核苷酸序列，如SEQ ID NO.8所示；所述单链抗体(ScFv)重链氨基酸序列，如SEQID NO.3所示；所述单链抗体(ScFv)轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示；所述IgG Fc核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示。

实施例二：可溶性NK-CAR MS-Ig的表达

复苏并大量培养HEK293悬浮细胞，同时大量提取pCMV5.1-MS-Ig重组质粒，将PEI和质粒按体积比3:1的比例混合，25℃孵育15min，按1μg/ml质粒终浓度进行转染，转染7天后将细胞离心，取上清用免疫印迹验证重组蛋白表达。结果如图2所示，该融合蛋白两个单体的Fc端之间形成二硫键，使蛋白在自然条件下呈二聚体状态，在蛋白变性后，二硫键被破坏，蛋白恢复成单体。“Denatured PAGE”对应的是蛋白经加热变性后跑10％的还原性胶的免疫印迹结果，“Natural PAGE”对应的是蛋白未经变性，在天然状态下跑5％的非还原性胶的免疫印迹结果，“IB”为相应的检测抗体。

实施例三：可溶性NK-CAR MS-Ig的纯化

吸取适量SPA微球填料装入蛋白纯化柱，先用公司配套平衡液以30ml/min流速平衡柱子，将上述表达后收集的细胞培养上清用平衡液按1:4比例进行稀释，置于冰上，并以2ml/min的流速将上清过柱，过柱后，用平衡液以30ml/min流速清洗柱子，清洗柱子完毕后，加入酸性洗脱液(pH2.3～2.6)以2ml/min的流速进行洗脱，用收集管进行收集，收集管事先加入适量中和液使收集后的蛋白洗脱液pH值恢复至7.4。将洗脱之后的蛋白溶液用蛋白超滤管进行浓缩，并使蛋白的溶剂置换为PBS，检测浓缩好的蛋白浓度，并于-80℃保存。结果如图3所示，同实施例二中的方法相似，蛋白变性后分别跑还原性胶和非还原性胶，然后进行考马斯亮蓝染色，蛋白天然状态下的分子量约为变性后的2倍，说明MS-Ig天然状态下为二聚体结构。

实施例四：可溶性NK-CAR MS-Ig可介导NK细胞杀靶细胞

可溶性NK-CAR MS-Ig可有效与CD20+靶细胞上的CD20抗原发生特异性结合，该结合可被抗CD20抗体所阻断；可溶性NK-CAR MS-Ig亦可有效和NK细胞上的NKG2D受体结合，该结合可被rMICA(重组MICA蛋白)和NKG2D-Ig所阻断。将MS-Ig固相化，可有效活化NKG2D信号通路并激活NK细胞，使其表达活化表面标志CD107a并分泌IFN-γ。在MS-Ig存在的情况下，NK细胞可有效杀伤CD20+靶细胞，结果如图4所示，在MS-Ig蛋白终浓度为1μg/ml，效靶比(E:T)为10:1的条件下，用流式分别验证了加(+)或不加(-)NKL细胞、MS-Ig、rMICA和NKG2D-Ig的情况下，Daudi细胞的凋亡(7-AAD+)情况，结果表明只有NKL和MS-Ig同时存在下，Daudi细胞才会被杀伤，且杀伤作用能够被rMICA和NKG2D-Ig削弱，充分说明MS-Ig具有特异性介导NK细胞杀伤靶细胞的作用。

本发明所述可溶性NK-CAR融合蛋白的制备方法及应用的示意图如图5所示。

本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下的有益效果：

1.本发明的优势在于首次提出可溶性NK-CAR概念，与传统意义上的CAR不同的是，可溶性NK-CAR融合蛋白MS-Ig无跨膜结构和胞内信号转导结构域，信号转导通路可直接通过MICA与NKG2D结合而激活，激活NK细胞发挥特异性杀伤靶细胞作用，为开发介导NK细胞和CD8⁺T细胞特异性杀伤肿瘤靶细胞的生物药物与应用奠定基础。

2.本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc，其优势之一在于方便蛋白纯化，相较于His蛋白标签，表达后的上清无需透析，经过简单稀释可直接上柱吸附，节约生产时间。

3.本发明在本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc，降低了体内用药的免疫原性。

4.本发明在融合蛋白MS-Ig羧基端加入人IgG Fc,能延长作为体内使用药物的代谢半衰期。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种可溶性NK-CAR融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe

1 5 10 15

Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala

20

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro

20 25 30

Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln

35 40 45

Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg

50 55 60

Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile

65 70 75 80

Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys

85 90 95

Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr

100 105 110

Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr

115 120 125

Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn

130 135 140

Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met

145 150 155 160

His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val

165 170 175

Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu

180 185 190

Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser

210 215 220

His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr

225 230 235 240

Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Glu Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val

260 265 270

Pro Ser

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Glu Gly Arg Met Asp Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu

1 5 10 15

Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly

20 25 30

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg

35 40 45

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

50 55 60

Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

65 70 75 80

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

85 90 95

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr

100 105 110

Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly

115 120 125

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 5

<211> 69

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60

gctgctgct 69

<210> 6

<211> 822

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagccccaca gtcttcgtta taacctcacg gtgctgtccg gggatggatc tgtgcagtca 60

gggtttctcg ctgaggtaca tctggatggt cagcccttcc tgcgctgtga caggcagaaa 120

tgcagggcaa agccccaggg acagtgggca gaagatgtcc tgggaaataa gacatgggac 180

agagagacca gggacttgac agggaacgga aaggacctca ggatgaccct ggctcatatc 240

aaggaccaga aagaaggctt gcattccctc caggagatta gggtctgtga gatccatgaa 300

gacaacagca ccaggagctc ccagcatttc tactacgatg gggagctctt cctctcccaa 360

aacctggaga ctgaggaatg gacaatgccc cagtcctcca gagctcagac cttggccatg 420

aacgtcagga atttcttgaa ggaagatgcc atgaagacca agacacacta tcacgctatg 480

catgcagact gcctgcagga actacggcga tatctaaaat ccggcgtagt cctgaggaga 540

acagtgcccc ccatggtgaa tgtcacccgc agcgaggcct cagagggcaa cattaccgtg 600

acatgcaggg cttctggctt ctatccctgg aatatcacac tgagctggcg tcaggatggg 660

gtatctttga gccacgacac ccagcagtgg ggggatgtcc tgcctgatgg gaatggaacc 720

taccagacct gggtggccac caggatttgc gaaggagagg agcagaggtt cacctgctac 780

atggaacaca gcgggaatca cagcactcac cctgtgccct ct 822

<210> 7

<211> 384

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atagaaggac gaatggacca ggcctacctg caacagagcg gggctgaact ggtgaggccg 60

ggtgcttcag tgaagatgag ctgcaaggcg agcggctaca ccttcacctc ttacaatatg 120

cactgggtga agcagacccc caggcagggg ctggagtgga tcggcgccat ctaccccggc 180

aacggcgaca ccagctataa tcagaagttc aagggcaagg ccaccctcac cgtggacaag 240

agcagcagta ccgcctacat gcagctgagc agcctgacca gcgaggacag cgccgtgtac 300

ttctgcgcca gggtggtgta ctacagcaac agctattggt acttcgacgt gtggggcacc 360

ggcactaccg tgacagtgtc cggc 384

<210> 8

<211> 318

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagatcgtgc tgagccaatc acccgctatc ctgagcgcca gtcccggcga gaaggtgacc 60

atgacttgca gggccagtag cagcgtgagc tatatgcatt ggtatcagca gaagcccggc 120

agcagcccca agccctggat ctatgccccc agcaacctcg ccagcggcgt gcccgccagg 180

tttagcggca gcggctctgg cacgagttat tccctgacaa tcagccgcgt ggaggccgag 240

gacgctgcca catattactg ccagcagtgg agcttcaatc cacccacatt cggagctggc 300

accaagctgg agctgaag 318

<210> 9

<211> 675

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 60

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 120

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 180

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 240

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 300

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 360

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 420

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 480

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 540

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 600

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 660

ctgtctcccg ggaaa 675

Claims (5)

1. 一种可溶性NK-CAR融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括从氨基端至羧基端由MICA胞外区、单链抗体和人IgG Fc端三部分构成；

所述MICA胞外区为NKG2D受体结合的MICA胞外区，由MICA信号肽和MICA蛋白序列组成；

所述MICA信号肽氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

所述MICA蛋白氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示；

所述融合蛋白在水溶液中呈二聚体状态；所述融合蛋白通过Fc端之间形成二硫键，使蛋白在自然条件下呈二聚体状态；

所述的单链抗体为抗肿瘤细胞表面特异性抗原的单链抗体；

所述肿瘤为B细胞性淋巴瘤时，所述单链抗体为抗CD20单链抗体；

所述可溶性NK-CAR融合蛋白的氨基酸序列由依次排列的以下组分组成：MICA信号肽氨基酸序列、MICA蛋白氨基酸序列、单链抗体重链氨基酸序列、连接氨基酸序列、单链抗体轻链氨基酸序列、IgG Fc氨基酸序列；

所述单链抗体重链氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示；

所述连接氨基酸序列为（GGGGS）3 Linker；

所述单链抗体轻链氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示；

所述IgG Fc氨基酸序列，为人源IgG Fc氨基酸序列。

2.权利要求1所述的可溶性NK-CAR融合蛋白的编码核酸，其特征在于：所述可溶性NK-CAR融合蛋白的编码核酸的核苷酸序列由依次排列的以下组分组成：MICA信号肽核苷酸序列、MICA蛋白核苷酸序列、单链抗体重链核苷酸序列、连接核苷酸序列、单链抗体轻链核苷酸序列、IgG Fc核苷酸序列、终止密码子。

3.根据权利要求2所述的可溶性NK-CAR融合蛋白的编码核酸，其特征在于：所述MICA信号肽核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示；

所述MICA蛋白核苷酸序列，如SEQ ID NO.6所示；

所述单链抗体重链核苷酸序列，如SEQ ID NO.7所示；

所述连接核苷酸序列为（GGGGS）3 Linker对应的核苷酸序列；

所述单链抗体轻链核苷酸序列，如SEQ ID NO.8所示；

所述IgG Fc核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示。

4.权利要求1-3任一项所述可溶性NK-CAR融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：

（1）MS-Ig-pCMV5.1重组质粒构建：人工合成可溶性NK-CAR融合蛋白MS-Ig核苷酸序列，通过分子克隆技术将可溶性NK-CAR融合蛋白核苷酸序列插入pCMV5.1质粒；

（2）MS-Ig蛋白的表达：大量提取MS-Ig-pCMV5.1重组质粒，将MS-Ig-pCMV5.1重组质粒转染HEK293悬浮细胞，表达后将细胞离心，收集上清；

（3）MS-Ig蛋白的纯化：将（2）中收集的上清通过SPA柱，SPA与MS-Ig蛋白的Fc端具有生物亲和作用，可将MS-Ig吸附在柱子上，吸附完成后，用酸性洗脱液将柱子上吸附的蛋白洗脱下来，加入中和液，再对蛋白进行浓缩。

5.权利要求1-3任一项所述可溶性NK-CAR融合蛋白在制备介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用。

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