CN111349165B - 抗人msln单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人msln单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111349165B
CN111349165B CN202010447170.XA CN202010447170A CN111349165B CN 111349165 B CN111349165 B CN 111349165B CN 202010447170 A CN202010447170 A CN 202010447170A CN 111349165 B CN111349165 B CN 111349165B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
msln
monoclonal antibody
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010447170.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111349165A (zh
Inventor
张军锋
郭志刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Landun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Landun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Landun Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Landun Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010447170.XA priority Critical patent/CN111349165B/zh
Publication of CN111349165A publication Critical patent/CN111349165A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111349165B publication Critical patent/CN111349165B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗人MSLN单克隆抗体及其应用，其是以人源MSLN为靶点，基于噬菌体展示技术，开发的特异性、高亲和力的单链抗体。相对于现有技术，本发明成功制备了抗人MSLN单克隆抗体，该抗体特异性好，亲合力较高，并可结合细胞表面表达的人源MSLN，该抗人MSLN单克隆抗体是肿瘤治疗的潜在药物。

Description

抗人MSLN单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体技术领域，特别涉及一种抗人MSLN单克隆抗体及其应用。
背景技术
间皮素（mesothelin，MSLN）是位于细胞表面的40KD的糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上。间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，被弗林蛋白酶（成对碱性氨基酸蛋白酶，furin）样转化酶水解为两条链，C端约40KD的膜结合蛋白即为成熟的间皮素，N端约30KD称之为巨核细胞促进因子（MPF）的片断脱落并释放出细胞外。MPF和膜锚MSLN均为N-糖基化，MPF可在体外促进巨核细胞克隆的形成，膜锚MSLN可以与MUC16互作，在细胞粘附过程中起重要作用，因此目前靶向治疗中均选择膜锚MSLN做为靶点，故目前MSLN专指MSLN的C端40KD片段，即膜锚MSLN。
在正常情况下，MSLN仅低表达于胸膜、腹膜、心包膜等间皮组织中，在其它组织中不表达，表达谱极窄。但在癌变组织中，MSLN的强表达却极其普遍，目前已在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、食道癌和转移性三阴性乳腺癌等多种实体瘤肿瘤组织中检测到很高的表达量。就癌细胞系而言，已知MSLN高表达于HO-8910、HEY-T30、OVCAR3（特别是HO-8910）三种卵巢癌细胞系、转移胰腺癌细胞系 AsPC1和宫颈癌细胞系Hela中，在SKOV3、3AO二种卵巢癌细胞系和肺腺癌细胞系A549极低表达，而在人肝癌细胞系Huh7不表达。
MSLN的生物学功能至今尚不清楚，与癌症关系亦不明确，究竟是癌症发生后MSLN表达随之上升还是MSLN上升促进了癌症的发生。据报道MSLN过表达会引起金属蛋白酶9的过表达，从而促进肿瘤细胞的迁移和浸润。MSLN也能通过与CA125相互作用介导细胞粘附，在肿瘤腹膜转移的侵袭过程中发挥重要作用，且能够促进肿瘤细胞抗死亡。在临床实践中，血清MSLN已被作为诊断卵巢癌和间皮瘤的检测指标。
MSLN在正常细胞中几乎不表达（仅低表达于胸膜、腹膜、心包膜）而在多种癌组织中强烈表达的特点，使其成为靶向治疗的良好靶点，决定了以其做为靶点的靶向治疗天然具有脱靶效应低的潜在优势。比如MSLN在60-90%的肺癌组织中表达，其中20%表达量较高，但在正常肺组织中不表达，且MSLN高表达的肺腺癌预后较差，提示MSLN是治疗肺癌的一个潜在靶标。实验证实，以MSLN为靶点的CART经尾静脉回输荷瘤小鼠后，皮下接种高表达MSLN的肺腺癌组织造成的肿瘤体积增长明显被抑制。
鉴于以MSLN为靶点的靶向治疗展现出的效果明显、可能的脱靶效应低的特点，以MSLN为靶点的治疗方案向多个方向展开研发，包括重组单克隆抗体药、抗体偶联药物、疫苗和过继性免疫细胞治疗等，其中由美国国立癌症研究所研发的Amatuximab单抗已完成治疗恶性间皮瘤的二期临床试验。
就目前研发中的抗体而言，虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC)。由此可见，利用传统杂交瘤技术获得强CDC效应的靶向MSLN的抗体是一件困难的事情。比如传统方法获得的抗体组织穿透力差、治疗效果不足、免疫原性强、需要人源化改造、稳定性差、运输和保存要求高、研发和使用费用高。总之，已有的传统抗体尽管为疾病的治疗/检测起到了极其重要的作用，但其不足之处亦很明显。
针对MSLN靶点，目前临床药物有14个，研发最快的Amatuximab单抗（MORAb- 009）完成二期临床试验。就其抗体类型来说，这14个抗体中，有些为人-鼠嵌合抗体，有些为人源化抗体，均来源于小鼠，采用杂交瘤技术获得。就靶向MSLN的抗体而言，目前尚未有全人源ScFv抗体研发的公开报道，而基于噬菌体展示技术的靶向MSLN的抗体筛选方案目前亦未见公开报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明公开了一种基于噬菌体展示技术筛选的抗人MSLN单克隆抗体及其应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种抗人MSLN单克隆抗体，所述抗体为单链结构，抗人MSLN单克隆抗体的抗原结合部位包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方案，所述抗人MSLN单克隆抗体包括信号肽和抗原结合部位，包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方案，所述抗人MSLN单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
所述的抗人MSLN单克隆抗体的制备方法，是采用噬菌体展示文库筛选的方法。具体的方法如下：
以商品化的重组人MSLN His标签蛋白和噬菌体展示天然全人源scFv抗体库为起始材料。将MSLN His标签蛋白包被在免疫管上，用全人源scFv抗体库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与MSLN His标签蛋白结合的噬菌体洗脱下来。如此反复3次，每次改变MSLN His标签蛋白包被量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体。侵染宿主菌后涂布固体培养基平板，将获得的结合能力强的噬菌体单克隆化，利用单克隆培养上清进行ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。将ELISA阳性克隆的上清与MSLN超量表达的CHO-K1或野生型的CHO-K1细胞孵育，进行phage流式细胞术鉴定。对phage流式阳性的克隆建立编码序列（本发明一种实施方案），将信号肽、单链抗体即抗原结合部位、人源IgG1 Fc，同框阅读，构建哺乳动物表达载体。大量转染HEK293细胞，利用proteinA亲和层析柱从上清中纯化获得融合蛋白，并对其与MSLN结合特性进行流式细胞术鉴定。
一种编码上述的抗人MSLN单克隆抗体的核苷酸序列。
一种载体，含有所述的核苷酸序列。
一种宿主细胞，含有所述的核苷酸序列或所述的载体。
一种试剂盒，包括所述的抗人MSLN单克隆抗体。
所述的抗人MSLN单克隆抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测MSLN在样品中的存在或其水平。
所述的抗人MSLN单克隆抗体在制备抗癌或癌症检测试剂、产品或药物中的应用。
本发明以人源MSLN为靶点，开发特异性、高亲和力全人源ScFv抗体。ScFv抗体为人工构建的抗体，仅含有人源抗体的重链和轻链可变区，二者之间通过柔性肽连接，这种只有可变区的人工抗体具有完全的抗原结合能力。相比于传统抗体，其具有体积小和较强的组织穿透力、能够结合特殊抗原表位、低免疫原性等特点，因此对于治疗受血脑屏障阻碍和目前CART效果差、效应分子难以进入的实体瘤等靶向治疗具有特殊意义。同时本发明中采用的抗体筛选技术为噬菌体表面展示，以已构建好的通用全人源scFv抗体库为起始材料，筛选流程大大缩短，比传统杂交瘤方法节约90%的时间。以本发明的抗体为基础，可以开发单克隆抗体药、抗体偶联药物、CART免疫疗法等癌症治疗用药或者癌症诊断用检测剂。与在研的靶向MSLN的抗体类药物相比，由于本发明为全人源抗体无需进行后期的人源化改造且由于分子较少降低了生产的难度，大大节省了开发时间和成本。
有益效果：相对于现有技术，本发明成功制备了抗人源MSLN单克隆抗体，该抗体特异性好，亲合力较高，并可结合细胞表面表达的人源MSLN，该抗人MSLN单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的潜在药物。
附图说明
图1：phage粗培液与人源MSLN结合ELISA检测结果；图中可以看出，本发明的单克隆抗体ELISA读值明显高于对照，结果为阳性，在ELISA水平具有结合人源MSLN蛋白的功能。
图2：人源MSLN抗体过表达CHO-K1细胞系转染中使用的载体结构示意图，MCS为多克隆位点，靶基因插入此位置。
图3：proteinA纯化抗人源MSLN抗体SDS-PAGE检测。
图4：人源MSLN与单克隆phage上清结合流式检测结果；图中左侧、右侧柱形图分别代表与野生型CHO-K1、MSLN超表达CHO-K1细胞株结合信号。
图5：人源MSLN与纯化的单克隆抗体结合流式检测结果；图中左侧、右侧柱形图分别代表与野生型CHO-K1、MSLN超表达CHO-K1细胞株结合信号。
图6：人源MSLN单克隆抗体与MSLN结合的有效中浓度（EC50）检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明。
（1）噬菌体展示抗体文库淘选
1）宿主菌TG1活化：制备mini agar培养基平板[1×M9盐，2%葡萄糖，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，1mM维生素B1]，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱。
2）包被：按50ug/ml的浓度稀释人源MSLN蛋白（购自Acro Biosystem）于0.1MNaHCO3（pH8.6）中，取1.5ml加入到免疫管中，4℃包被过夜。包被液去干净后，用封闭液[0.01M PBS缓冲液（pH7.4），2% 脱脂奶粉]孵育1小时，结束后用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）洗4次。
3）结合：取1011pfu噬菌体病毒颗粒，加入到免疫管中的1.5ml MPBS溶液中[0.01MPBS缓冲液（pH7.4），2% 脱脂奶粉]，室温孵育1小时。液体去干净后用PBST溶液[0.01M PBS缓冲液（pH7.4），0.1% Tween-20]洗8次，再用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）洗8次。
4）洗脱：用1ml 100mM三乙胺反复冲洗免疫管10分钟，加入0.5ml中和液[1M Tris-Cl(pH7.6)]混匀，暂时保存于4℃。
5）测滴度：取2ul、0.2ul（原液用2×YT培养基稀释10倍后取2ul）、0.02ul（原液用2×YT培养基稀释100倍后取2ul）洗脱液，与0.2ml对数中期（OD600=0.5）的TG1混匀，室温孵育30min，均匀涂于2×YT-GA100[含2%葡萄糖，100ug/ml氨苄青霉素]平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度。
6）噬菌体扩增：按1:100的比例，接种过夜培养的TG1菌液于20ml 2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期（OD600=0.5），加入洗脱液，室温或37℃孵育30分钟。加入辅助噬菌体，室温或37℃再孵育30分钟，加入氨苄青霉素至工作浓度100ug/ml、卡那霉素至工作浓度50ug/ml。37℃，220rpm振荡培养过夜。6000rpm离心10分钟，去除菌体，上清中加入1/5体积的2.5M NaCl/20% PEG8000，冰浴2小时。10000rpm离心10min得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2ml 0.01M PBS缓冲液（pH7.4）液重悬沉淀，如上文测滴度。
7）重复步骤2）-6)两次，第一次重复MSLN蛋白的包被浓度调为30ug/ml，第二次重复调为15ug/ml，洗涤次数可增加，其余不变。
（2）单克隆ELISA
1）0.5ug/ml人源MSLN蛋白4℃过夜包被的酶标板，封闭液处理2h，并用PBS缓冲液洗涤4次。
2）从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体，室温或37℃孵育30分钟，加入氨苄青霉素至工作浓度100ug/ml、卡那霉素至工作浓度50ug/ml。37℃，220rpm振荡培养过夜。6000rpm离心10分钟，去除菌体。
3）取50ul或5ul上清，以MPBS溶液为介质，补足100ul，加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，PBS缓冲液洗4次。
4）用含1%脱脂奶粉的PBS缓冲液稀释HRP标记抗M13噬菌体抗体，取100ul加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，PBS缓冲液洗4次。
5）加入100ul TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100ul 1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。结果如图1所示，该单克隆抗体ELISA读值明显高于对照，结果为阳性，在ELISA水平具有结合人源MSLN蛋白的功能。
（3）人源MSLN单抗制备及流式检测
1）从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，液体振荡培养过夜，按质粒提取法提取噬菌粒（phagemid），测序获得抗原结合部位的核酸序列。
2）化学合成scFv抗体融合基因序列，即人源IL10的信号肽、单链抗体（即抗原结合部位）、人源IgG1 Fc的编码序列连接，同框阅读，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码的抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3）将以上核酸片段按序插入到真核表达载体pLOE-puroR的MCS区（图2），以合成N端为信号肽、中段为单链抗体（scFv）、C端为Fc标签的融合蛋白。
4）制备无菌无毒内素的质粒，按转染试剂要求，转染HEK293细胞，收集上清。
5）用proteinA亲和柱纯化出上清中的抗体，SDS-PAGE检测抗体表达情况，如图3所示，成功制备出融合的抗体蛋白。
6）流式检测细胞结合能力
①未表达MSLN中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1细胞和强烈表达人源MSLN的中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1细胞用0.25%的胰酶充分消化，血清终止消化，离心收集细胞，PBS缓冲液轻轻吹打制备单细胞悬液。
②10ml PBS缓冲液洗涤细胞1次，1000rpm离心5min,再用1ml PBS缓冲液悬浮细胞，细胞计数。
③取2.5×105个细胞于1.5ml离心管中，离心收集细胞。
④加入200μl步骤（2）3）中的phage上清或100ul 10ug/ml步骤（3）5）中的纯化抗体，混匀，室温孵育30min。
⑤离心收集细胞，用1ml PBS缓冲液洗涤细胞1次。
⑥若为phage检测，加入100ul 1000倍稀释的抗M13噬菌体抗体，孵育30min，PBS缓冲液洗一次，加入100ul 500倍稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG，室温下避光反应20min；若为纯化抗体检测，加入50μl 100倍稀释的APC标记山羊抗人IgG Fc片段的二抗（2.5μl/2.5×105，可与人IgG结合）混匀，室温下避光反应20min。
⑦用1ml PBS缓冲液洗涤细胞1次，1000rpm离心8min，去除上清液。
⑧加入200μl PBS缓冲液重悬成单细胞悬液，用流式细胞仪上机检测。如图4所示，相比未表达MSLN的中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1，超表达MSLN的中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1信号明显增强，柱形图右移，该phage上清可与细胞表面的MSLN结合。同理，用纯化的抗体检验，无噬菌体蛋白参与的纯粹的抗体可与细胞表面的MSLN结合，结果如图5所示。
7）ELISA法检测制备抗体的EC50
①包被： 4℃下，用1ug/ml的MSLN蛋白（购自Acro Biosystem）溶液过夜包被酶标板。去除包被液后，用封闭液[0.01M PBS缓冲液（pH7.4）, 2% 脱脂奶粉]孵育1小时，结束后用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）洗3次。
②配制抗体梯度浓度液：以20ug/ml为起始浓度，按1/2浓度递减，配置16个浓度梯度，获得的梯度浓度液中最小浓度为0.000625ug/ml。
③结合：将梯度浓度液100ul加入到酶标板中，室温孵育45min。液体去干净后用PBST溶液[0.01M PBS缓冲液（pH7.4），0.1% Tween-20]洗3次，再用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）洗1次。
④二抗结合：将HRP标记抗人Fc抗体工作液（购自Jackson ImmunoResearch）加入到酶标板中，每孔100ul。室温孵育30min。去除液体后用PBST溶液[0.01M PBS缓冲液（pH7.4），0.1% Tween-20]洗3次，再用0.01M PBS缓冲液（pH7.4）洗1次。
⑤显色反应：每孔加入100ul TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100ul 1M硫酸溶液终止反应，在酶标仪上读取OD450。结果如图6所示，该单克隆抗体与MSLN结合的有效中浓度EC50为0.05026ug/ml，结合能力极强。
序列表
<110> 南京蓝盾生物科技有限公司
<120> 抗人MSLN单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
130 135 140
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln
145 150 155 160
Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
180 185 190
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
35 40 45
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Asp Met Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Pro Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Leu Thr
145 150 155 160
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
165 170 175
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg
195 200 205
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
210 215 220
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
260
<210> 3
<211> 495
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
35 40 45
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Asp Met Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Thr Pro Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Leu Thr
145 150 155 160
Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr
165 170 175
Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg
195 200 205
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
210 215 220
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His
260 265 270
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
340 345 350
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggcccagctg 60
cagctgcagg agagcggagg cggcctggtg cagccaggaa gaagcctgag actgtcctgc 120
gccgccagcg gcttcacctt cgacgactac gccatgcact gggtgagaca ggcccccggc 180
aaaggcctgg agtgggtgtc tggcatttct tggaacagcg gcagcatcgg ctacgccgac 240
agcgtgaaag gcagatttac catcagcaga gacaacgcta agaactcact gtacctgcag 300
atgaacagcc tgagggccga ggacacagcc ctgtactatt gcgccaagga catgggatca 360
agcggctggt acaccccact ggactactgg ggacagggaa ccaccgtgac cgtgagcagc 420
ggaggaggag gatctggagg cggcggaagc ggcggaggag gatcaagcag cgagctgacc 480
caggaccctg ccgtgagcgt ggccctggga cagaccgtga gaatcacatg ccagggagac 540
agcctgagga gctattatac aagttggtac cagcagaaac ccggacaggc ccccgtgctg 600
gtgatctatg gaaaaaacaa cagacccagc ggcatccccg acagattcag cggcagcagc 660
agcggcaaca ccgccagcct gaccatcacc ggcgcccagg ccgaggacga ggccgactac 720
tactgcaaca gcagagacag cagcggcaac cacgtggtgt tcggcggcgg caccaaggtg 780
accgtgctgg agcccaaatc tgctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 840
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900
atctcccgga cccccgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 960
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1140
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1200
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1488

Claims (8)

1.一种抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人MSLN单克隆抗体的抗原结合部位序列为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人MSLN单克隆抗体包括信号肽和抗原结合部位，包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人MSLN单克隆抗体包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1-3任一所述的抗人MSLN单克隆抗体的多核苷酸。
5.一种载体，含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，含有权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体。
7.一种试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN单克隆抗体。
8.权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN单克隆抗体在制备癌症检测产品中的应用。
CN202010447170.XA 2020-05-25 2020-05-25 抗人msln单克隆抗体及其应用 Active CN111349165B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010447170.XA CN111349165B (zh) 2020-05-25 2020-05-25 抗人msln单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010447170.XA CN111349165B (zh) 2020-05-25 2020-05-25 抗人msln单克隆抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111349165A CN111349165A (zh) 2020-06-30
CN111349165B true CN111349165B (zh) 2020-09-01

Family

ID=71191745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010447170.XA Active CN111349165B (zh) 2020-05-25 2020-05-25 抗人msln单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111349165B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022242703A1 (zh) * 2021-05-19 2022-11-24 江苏先声药业有限公司 抗msln抗体及其应用
CN117412991A (zh) * 2021-06-18 2024-01-16 南京再明医药有限公司 抗人msln人源化抗体及其应用
CN113527515A (zh) * 2021-07-14 2021-10-22 南京蓝盾生物科技有限公司 一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体及其应用
WO2023131276A1 (zh) * 2022-01-06 2023-07-13 原启生物科技(上海)有限责任公司 靶向msln的抗原结合蛋白及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109021106A (zh) * 2018-08-30 2018-12-18 浙江蓝盾药业有限公司 一种人源化cd70抗体ld70及其制备方法与应用
CN110698562A (zh) * 2019-10-31 2020-01-17 浙江蓝盾药业有限公司 抗人msln单克隆抗体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109021106A (zh) * 2018-08-30 2018-12-18 浙江蓝盾药业有限公司 一种人源化cd70抗体ld70及其制备方法与应用
CN110698562A (zh) * 2019-10-31 2020-01-17 浙江蓝盾药业有限公司 抗人msln单克隆抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定;陈书成等;《细胞与分子免疫学杂志》;20071231;第23卷(第3期);第246-248页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111349165A (zh) 2020-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111349165B (zh) 抗人msln单克隆抗体及其应用
CN109096395B (zh) 阻断型cd47纳米抗体及其用途
CN107216389B (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其编码序列和用途
CN110698562B (zh) 抗人msln单克隆抗体
KR20220058592A (ko) 항 vegf 단일 도메인 항체 및 이의 응용
CN113173995B (zh) 一种结合冠状病毒的双特异性抗体
CN113461812A (zh) 人源化新冠病毒中和性抗体nCoV-00D及其应用
CN108884153B (zh) 与aimp2-dx2蛋白质特异性结合的抗体
CN113061192B (zh) 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用
CN110964118A (zh) 一种双特异性融合抗体及其在肿瘤免疫治疗中的应用
CN107987172A (zh) 一种抑制肿瘤血管新生的peptibody多表位疫苗及其应用
CN110627904B (zh) 抗人gpc3单克隆抗体
CN112480250B (zh) 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用
WO2022011717A1 (zh) 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
WO2023116751A1 (zh) 抗人血管生成素3纳米抗体及其应用
CN114591988B (zh) 一种激活肿瘤免疫的基因修饰干细胞制备方法
CN110885377B (zh) 抗cd47/vegf双特异性抗体及其应用
KR101930019B1 (ko) 표피 성장 인자 수용체 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도
CN114380907B (zh) 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用
CN110878123A (zh) 一种抗tk1原核重组单链抗体及制备方法
KR20230101087A (ko) Prox1 단백질에 중화 활성을 갖는 결합 분자
CN117980341A (zh) 抗trop2单域抗体及其应用
KR101302218B1 (ko) Ｂ형 간염바이러스의 표면항원 ｐｒｅＳ１에 특이적인단일클론항체
WO2013097470A1 (zh) 二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用
CN113461825A (zh) 一种抗pd-l2纳米抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PP01 Preservation of patent right

Effective date of registration: 20230207

Granted publication date: 20200901

PP01 Preservation of patent right